›

Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 2600
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_cua_tam_that_hoang_panax_stipu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC HỒ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HĨA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC HỒ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HĨA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khĩa : QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ THỊ THƠM 2. PGS. TS. DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG Hà Nội - 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến tồn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ mơn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ mơn Y - Dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hồn thành khĩa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cơ đã giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Em xin bày tỏ sự tri ân và lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã luơn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hồn thành khĩa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cơ Bộ mơn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cơ Bộ mơn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em trong quá trình hồn thành khĩa luận. Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học cơng nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 lồi cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13- 18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Bộ mơn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luơn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hồn thành khĩa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khĩ tránh khỏi thiếu sĩt, em rất mong nhận được ý kiến đĩng gĩp của thầy cơ để khĩa luận thêm hồn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Hồ Thị Thu Hà 3
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích ACh Acetylcholin BH4 Tetrahydrobiopterin CaM Camodulin CD Cụm biệt hĩa (Cluster of differentiation) cGMP GMP vịng (Cyclic guanosine monophosphate) COX Cyclooxygenase COX-1 Cyclooxygenase-1 COX-2 Cyclooxygenase-2 eNOS Endothelial nitric oxide synthase FAD Flavin adenine dinucleotide FMN Flavin mononucleotide GTP Guanosine-5'-triphosphate Tế bào nội mơ tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein HUVEC endothelial cell) ICAM - 1 Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1) iNOS Inducible nitric oxide synthase LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) LPS Lipopolyshaccharide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate nNOS Neuronal nitric oxide synthase NO Nitric oxide NOS Nitric oxide synthase 4
  5. Thuốc chống viêm khơng steroid (Non-steroidal anti- NSAIDs inflammatory drugs) NST Nhiễm sắc thể Yếu tố tăng trưởng cĩ nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth PDGF factor) PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandine E2 PGI2 Prostacyclin PS27 Cao giàu saponin Tam thất hoang PSBt Cao chiết bằng dung mơi n - butanol Tam thất hoang PSnH Cao chiết bằng dung mơi n - hexan Tam thất hoang PST Cao tổng chiết bằng dung mơi ethanol 70% Tam thất hoang PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain RT-PCR reaction) Ser Serine sGC Guanylyl cyclase hịa tan (Soluble guanylyl cyclase) Thr Threonin TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M.Feng) VCAM-1 Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion molecule) 5
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. 2 Feng) Hình 1.2 Cấu trúc hĩa học các chất 1–15 phân lập từ Panax 3 stipuleanatus Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch 5 Hình 1.4 Cấu trúc của eNOS 9 Hình 1.5 Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hĩa eNOS 11 Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội 12 mạc Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin 15 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19 Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuơi và hệ thống ghi 20 - Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2 23 Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang 25 Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang 25 Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng 26 hợp NO Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 27 hiện protein eNOS phosphoryl hĩa Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 28 hiện mARN COX-2 Hình 3.6 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 29 hiện protein COX-2 6
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các dạng của NOS 8 Bảng 3.1 Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cơ lập 24 7
  8. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Sinh thái và phân bố 2 1.1.3. Thành phần hĩa học 3 1.1.4. Tác dụng dược lý 4 1.1.5. Cơng dụng 4 1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 5 1.2.1. Nội mạc mạch máu 5 1.2.2. eNOS 6 1.3. Tổng quan về viêm và COX-2 14 1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm 14 1.3.2 COX – 2 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1. Nguyên liệu 18 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 19 2.2. Dung mơi, hĩa chất và thiết bị 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cơ lập 21 2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hĩa 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1. Kết quả 24 8
  9. 3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cơ lập 24 3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hĩa 26 3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 28 3.2. Thảo luận 30 3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cơ lập 30 3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hĩa 31 3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 9
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mơ mỏng nằm lĩt mặt trong của lịng mạch [1]. Các tế bào này cĩ khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn mạch quan trọng và cĩ nhiều vai trị trong điều hịa chức năng sinh lý của mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mơ Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đĩ cĩ quá trình phosphoryl hĩa eNOS [41,69]. Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67]. Rối loạn chức năng nội mạc cĩ liên quan đến NO, phosphoryl hĩa eNOS và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp [24,37]. Trong những năm gần đây, sự điều hịa eNOS thơng qua quá trình phosphoryl hĩa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi Panax L., ở nước ta cây chỉ cĩ ở vùng núi cao thuộc dãy Hồng Liên Sơn [9]. Nghiên cứu bước đầu về thành phần hĩa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất hoang cĩ chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các lồi thuộc chi Panax L. đã được chứng minh cĩ tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa [39,73] và chống viêm [32,45,58]. Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về lồi này vẫn cịn hạn chế. Điều này đặt ra câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang cĩ những tác dụng kể trên hay khơng? Để làm sáng tỏ điều đĩ, tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hĩa và một số cơ trơn cơ lập” với ba mục tiêu: 1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cơ lập của khí quản, bàng quang và thể hang. 2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa và sự tổng hợp NO. 3. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của gen COX-2 và protein COX-2. 1
  11. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang Tam thất hoang cĩ tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay cịn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]. 1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, cĩ nhiểu vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khĩm thường cĩ 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá. Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vịng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, cĩ cuống ngắn, hình thuơn hay mác thuơn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ơ. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2]. Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11] 1.1.2. Sinh thái và phân bố Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất cĩ nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra hoa tháng 4 – 5, cĩ quả tháng 5 – 9. Cho đến nay, trên tồn thế giới, lồi này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hồng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]. 2
  12. 1.1.3. Thành phần hĩa học Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]. Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]. Năm 2002, nhĩm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]. Năm 2010, nhĩm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đĩ cĩ một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhĩm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngồi ra 3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2). Hình 1.2. Cấu trúc hĩa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45] Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Cơng Luận và cộng sự chỉ ra trong TTH ngồi saponin cịn cĩ thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố vi lượng [5,6]. 3
  13. 1.1.4. Tác dụng dƣợc lý Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 – 11, hình 1.2) nhĩm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người (HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dịng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]. Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]. Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thơng qua kích hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Cơng Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH cĩ tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin tồn phần của TTH cĩ tác dụng chống oxy hĩa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg [5]. Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả TTH cĩ tác dụng chống đơng và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]. 1.1.5. Cơng dụng Sách đỏ Việt Nam (2007) cĩ ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều cĩ cơng dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống cĩ tác dụng kích thích tiêu hĩa, an thần”. TTH cĩ tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati [2]. 4
  14. 1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 1.2.1. Nội mạc mạch máu 1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc Về giải phẫu học từ trong ra ngồi, thành động mạch cĩ cấu tạo gồm 3 lớp áo đồng tâm: Lớp áo ngồi là lớp vỏ xơ, cĩ các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mơ (Hình 1.3) [3]. Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1] Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết cũng cĩ một lớp tế bào nội mơ lợp mặt trong lịng mạch. Lớp nội mơ thuộc biểu mơ lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mơ hình đa giác dẹt, cĩ phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lịng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào nội mơ liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]. 1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu Nội mạc mạch máu cĩ vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự lưu thơng dịng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hịa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hĩa và duy trì sự hằng định nội mơi [30]. Các tế bào nội mơ thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]. Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm sốt sự di chuyển của các chất hịa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dịng máu với các mơ xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đĩ là hàng rào máu – mơ [65]. Rối loạn tính thấm nội mạc cĩ thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết. 5
  15. Các tế bào nội mơ cĩ khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực cĩ nguồn gốc nội mơ/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hĩa plasminogen mơ), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hĩa plasminogen), yếu tố Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mơ), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mơ); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch: VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng cĩ nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38]. Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn và các hội chứng viêm [26,27]. 1.2.2. eNOS 1.2.2.1. Nitric oxide Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự cĩ mặt của nội mơ nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phĩng của một chất được gọi là yếu tố giãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR). Năm 1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đĩ là nitric oxide (NO) [25]. Ngày nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đĩng vai trị tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41]. NO tham gia điều hịa nhiều quá trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập tiểu cầu, chuyển hĩa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69]. 6
  16. Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30 Dalton, khơng màu và nhiệt độ nĩng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của NO cĩ một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO cĩ khả năng phản ứng với các nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nĩ. Mặt khác, NO tan kém trong nước, cĩ thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hịa các quá trình sinh lý. Tuy nhiên, chất này khơng bền cĩ thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị chuyển hĩa nhanh trong cơ thể [25]. Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thơng qua các enzym - NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2 . NOS là enzym xúc tác cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69]. Ở động vật cĩ vú, NOS cĩ ba dạng chính, mã hĩa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai - để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2 , phản ứng này được tạo điều kiện bởi - enzym NO2 reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và - nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO2 đĩng vai trị quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đĩ hoạt động của NOS bị giới hạn. - Trong cơ thể NO được chuyển hĩa bằng quá trình oxy hĩa để hình thành nên NO2 - và NO3 . Quá trình này cĩ thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một - phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hĩa, NO kết hợp với superoxid (O2 ) để hình thành nên peroxynitrit (ONOO-) [25,69]. 7
  17. Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69] NOS - 1 NOS – 2 NOS - 3 Tên phổ nNOS iNOS eNOS biến (Neuronal NOS) (Inducible NOS) (Endothelial NOS) Neuron thần kinh và Nhiều loại tế bào hệ Tế bào nội mơ một số tế bào khác. thống miễn dịch như đại thực bào khi đáp Tế bào ứng với biểu hiện lipopolysaccharid (LPS), cytokin và các chất khác. Gen NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc Ở hệ thần kinh trung Tham gia vào sinh lý Tham gia vào ương: cĩ liên quan bệnh của quá trình nhiều chức năng đến quá trình học tập viêm và hệ thống tim mạch quan Chức năng và ghi nhớ; kiểm sốt miễn dịch trọng: Giãn mạch, và các quá huyết áp trung ương. ức chế các quá trình sinh Ở hệ thần kinh ngoại trình như kết tập học vi: Chất dẫn truyền tiểu cầu, kết dính thần kinh, giãn cơ trơn bạch cầu, tăng sinh và mạch của tế bào cơ trơn thành mạch. 1.2.2.2. eNOS eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO sản xuất tại nội mơ bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều hịa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu hiện chủ yếu trong tế bào nội mơ, ngồi ra enzym này cũng được phát hiện trong tế bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuơi của nhau thai người và trong tế bào biểu mơ ống thận LLC-PK1 [69,70]. 8
  18. Cấu trúc gen và protein eNOS được mã hĩa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36); cĩ cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70]. Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, cĩ dạng homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]: - Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide). - Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4 (Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin. - Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM). Hình 1.3. Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29] Phosphoryl hĩa eNOS Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đĩ là cơ chế phụ thuộc Ca2+ và khơng phụ thuộc Ca2+: Cơ chế phụ thuộc Ca2+: eNOS là một enzym phụ thuộc Ca2+/CaM. Khi nồng độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nĩ trên eNOS. CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thơng qua FAD và FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hĩa O2 từ đĩ oxi hĩa L- arginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69]. Phosphoryl hĩa eNOS: Phosphoryl hĩa eNOS là một biến đổi sau dịch mã, được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS. Mặc dù hoạt động của eNOS phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ nhưng đây khơng phải là yếu tố duy nhất cần 9
  19. cho sự điều hịa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của dịng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ thuộc vào sự phosphoryl hĩa và khử phosphoryl hĩa eNOS [41]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sự phosphoryl hĩa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hĩa Ser1177, Ser617 và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hĩa tại Thr495 và Ser114 làm giảm chức năng eNOS. Sự phosphoryl hĩa eNOS cĩ thể được điều hịa bởi nhiều yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mơ mạch máu (VEGF), bradykinin, insulin, estrogen làm hoạt hĩa các enzym khác nhau như serin/ threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II), AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl hĩa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41]. Ngồi ra, hoạt động của eNOS cịn được điều khiển bởi sự tương tác với các protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của caveolae tại tế bào nội mơ, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS [59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều hịa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào nội mơ khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và “shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS với 2 protein này đều là những cơ chế điều hịa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+. 10
  20. Hình 1.5. Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hĩa eNOS. Các vị trí eNOS phosphoryl hĩa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bị [41] (VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mơ mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vịng; S-1-P: sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: high- density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; ) 1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc a. Điều hịa trương lực mạch máu Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hĩa guanylyl cyclase hịa tan (sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP vịng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hĩa các protein kinase G (PKG), thúc đẩy quá trình phosphoryl hĩa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+ nội bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhĩm chuột bị xĩa bỏ gen eNOS [47]. b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu NO kiểm sốt sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch. NO làm giảm sự biểu hiện của protein hĩa hướng động bạch cầu mono MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch cầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hĩa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội mơ hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu. Sự kết dính bạch cầu là 11
  21. sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO cĩ thể bảo vệ chống sự hình thành xơ vữa động mạch [69]. Rối loạn tính tồn vẹn của hàng rào nội mơ cĩ thể khởi phát các sự kiện của tiền viêm. NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mơ gây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS - reactive oxygen species) và angiotensin II. Điều này cĩ thể gĩp phần vào tác dụng chống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64]. c. Ức chế sự kết tập tiểu cầu NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu vào thành mạch [68,72]. d. Kiểm sốt sự tăng sinh của cơ trơn mạch NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh của tế bào cơ trơn thành mạch. Tác dụng này cĩ thể thơng qua trung gian cGMP [14,51]. Bên cạnh đĩ NO cịn ngăn chặn sự giải phĩng của yếu tố tăng trưởng cĩ nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn. NOS cũng quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dịng chảy trong bệnh mạn tính [22]. Hình 1.6. Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52] 12
  22. 1.2.2.4. Vai trị của eNOS phosphorayl hĩa và NO trong một số bệnh lý a. Xơ vữa động mạch Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16]. Quá trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO kèm theo đĩ là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1. Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO cĩ thể ức chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch. Do vậy, eNOS cĩ thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt tính của eNOS thơng qua thay đổi sự phosphoryl hĩa eNOS đang được quan tâm đáng kể vì những vai trị sinh lý bệnh của nĩ [41]. b. Nhồi máu cơ tim Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi máu ở chuột bị loại bỏ eNOS khơng thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trị cĩ lợi của NO và eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55]. c. Tăng huyết áp Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động mạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ. NO và eNOS cĩ vai trị quan trọng giãn mạch gây hạ áp. Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhĩm chuột bị xĩa bỏ gen eNOS [47]. d. Stress oxy hĩa Stress oxy hĩa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và phá hủy các ROS. Stress oxy hĩa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn đến rối loạn chức năng nội mơ. Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mơ [41]. Bên cạnh đĩ, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hĩa eNOS cịn liên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạn cương dương, Alzheimer Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOS phosphoryl hĩa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]. 13
  23. 1.3. Tổng quan về viêm và COX-2 1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm cĩ thể gây ra các tổn thương, hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4]. Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nĩng, đỏ, đau. Quá trình này cĩ sự tham gia của nhiều chất trung gian cĩ hoạt tính như histamin, bradykinin, prostaglandin, leucotrien. Trong đĩ, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố đĩng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3]. PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo khơng bão hịa được giải phĩng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2. Acid arachidonic được oxi hĩa bởi cyclooxygenase (COX) hay cịn được gọi là prostaglandin G/H synthase để hình thành nên PGG2 và sau đĩ là PGH2. PGH2 khơng bền bị chuyển hĩa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7). Cĩ 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đĩ là: prostaglandin E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α) [33,61]. Trong đĩ, PGE2 đĩng vai trị quan trọng trong viêm vì nĩ tham gia vào tất cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm. Cụ thể, PGE2 gây giãn mạch, làm tăng dịng máu đến mơ viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien, PGE2 làm tăng tính thấm của thành mạch gây thốt dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện. Đau là kết quả PGE2 làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau. Cuối cùng, PGE2 được xem như một chất trung gian gây sốt. Trong viêm, các PG cịn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36]. Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX. Enzym này cĩ 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase – 2). COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận. Ngược lại, COX-2 là một enzym cảm ứng, nĩ khơng biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất thấp trong các mơ bình thường; dưới kích thích của các yếu tố tiền viêm, hormon và 14
  24. yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây viêm và tham gia vào bệnh lý viêm. Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của các thuốc chống viêm khơng steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu hiện nay [44]. Hình 1.7. Sinh tổng hợp prostaglandin [33] (Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzym prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS) 1.3.2. COX – 2 COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX. Enzym này xúc tác cho hai bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36]. Ở người, gen mã hĩa cho COX-2 nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63]. COX-2 là enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm. Sự tăng biểu hiện của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mơ hình viêm khớp ở động vật cũng như trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75]. 15
  25. 1.3.2.1. COX-2 trong một số bệnh lý a. Xơ vữa động mạch Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch gây ra hẹp, loét, xơ cứng lịng mạch. Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ. Quá trình viêm xảy ra bên trong các mảng xơ vữa đĩng gĩp cho bệnh sinh của bệnh [35]. Một số nghiên cứu cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa. Trong mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào, bạch cầu mono, tế bào nội mơ. Enzym này cĩ thể tham gia vào xơ vữa động mạch theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hĩa các chất hĩa hướng động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28]. Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 cĩ thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54]. Từ đĩ, cĩ thể thấy được vai trị của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch. Tuy nhiên, các chất ức chế chọn lọc COX-2 cũng cĩ thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35]. b. Sinh mạch và ung thư Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy ra trong suốt quá trình phát triển của phơi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư. Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian gây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35]. Sự tăng tổng hợp PGE2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng khơng phải là COX-1 cũng đã được quan sát thấy trong mơ ung thư đại trực tràng khi so sánh với mơ lành [48,71]. Ngồi ra, cả hai loại NSAIDs tác dụng khơng chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mơ hình động vật [50]. Từ đĩ cĩ thể gợi ý được vai trị quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35]. c. Suy thận Các PG đặc biệt là PGE2 và PGI2 đĩng vai trị quan trọng trong chức năng thận người trưởng thành. PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ống thận; kiểm sốt sự giải phĩng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai. Ở thận vai trị của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chức năng sinh lý và bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN 16
  26. COX-2 và protein COX-2 cũng như hoạt tính của enzyme này tăng lên. Sự tăng biểu hiện của COX-2 cĩ liên quan đến sự sản xuất angiotensin II, tăng natri, tăng huyết áp cầu thận và viêm ống thận [62]. Bên cạnh đĩ, các chất ức chế chọn lọc trên COX-2 cũng cho thấy tác dụng làm chậm sự xơ hĩa cầu thận và protein niệu trên chuột bị cắt bỏ một phần thận gợi ý vai trị cĩ lợi của các chất này trong suy thận [49]. 1.3.2.2. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 Các thuốc chống viêm khơng steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drugs - NSAIDs) được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng. Tuy nhiên ngồi những tác dụng dược lý mà chúng mang lại như hạ sốt, giảm đau, chống viêm thì các NSAIDs cũng kèm theo nhiều tác dụng phụ đặc biệt là trên hệ tiêu hĩa như viêm loét dạ dày tá tràng gây ra do sự ức chế khơng chọn lọc của chúng trên enzym COX-1 là enzym chịu trách nhiệm trong việc tạo ra các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường. Chính vì vậy, xu hướng mới là tạo ra các NSAIDs cĩ tác dụng chọn lọc trên enzym COX-2 để giảm các tác dụng phụ mà vẫn duy trì được tác dụng chống viêm của nĩ. Một số thuốc tác dụng chọn lọc trên COX-2 hiện nay như rofecoxib, celecoxib, valdecoxib [10,36]. Ngồi ra, các nghiên cứu về vai trị của COX-2 trong một số bệnh lý cũng tạo ra các hướng mới trong tác dụng cĩ thể cĩ khác của các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 như chống ung thư [48]. Tuy nhiên, một trong những tác dụng phụ đáng chú ý nhất của các thuốc này là tăng nguy cơ trên các bệnh tim mạch. Chính vì vậy, việc sử dụng các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 cũng cần đặc biệt thận trọng trên các bệnh nhân tim mạch [10]. 17
  27. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Thân rễ Tam thất hoang được thu hái tại Hồng Su Phì, Hà Giang vào tháng 08/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Tam thất hoang - Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Quy trình chiết xuất các phân đoạn của Tam thất hoang được tiến hành theo sơ đồ dưới (Hình 2.1 và 2.2). Các phân đoạn dịch chiết dược liệu được tiến hành tại khoa Hĩa thực vật, Viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp. Các phân đoạn được nghiên cứu bao gồm: Cao tổng (ký hiệu: PST); phân đoạn n-hexan (ký hiệu: PSnH); phân đoạn diclomethan (ký hiệu: PS DCM); phân đoạn n-butanol (ký hiệu: PSBt) và cao giàu saponin (ký hiệu: PS27) Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18
  28. Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu  Cơ trơn cơ lập của bàng quang, thể hang và khí quản Chuột cống trắng khỏe mạnh chủng Wistar, trọng lượng từ 150 – 250 g được sử dụng trong nghiên cứu này. Chuột được nuơi trong điều kiện thống mát với chu kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối và khơng hạn chế về thức ăn nước uống. Mọi quy trình nghiên cứu trên động vật thực nghiệm trong nghiên cứu này tuân theo hướng dẫn chăm sĩc và sử dụng động vật của Học viện Quân Y. Quy trình cơ lập cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang chuột: - Gây mê chuột bằng ketamin 25 mg/kg. - Bộc lộ bàng quang, thể hang và khí quản. - Tách lấy các cơ quan trên cho vào cốc chứa dịch nuơi Tyrode ở nhiệt độ khoảng 37 °C. - Phẫu tích loại bỏ tồn bộ tổ chức liên kết bám ở các đoạn cơ trơn. 19
  29. - Dùng 2 mĩc kim loại để mĩc 2 đầu dải cơ trơn và cho vào bình nuơi đã chứa sẵn dung dịch nuơi Tyrode (15 ml) được ổn định nhiệt độ 37 °C và cung cấp đủ oxy. Một mĩc được gắn cố định dưới đáy bình và mĩc cịn lại được nối với đầu đo áp lực của hệ thống Powerlab để ghi sự biến đổi lực co của đoạn cơ trơn (Hình 2.3). Hình 2.3. Phƣơng pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuơi và hệ thống ghi  Tế bào nghiên cứu Tế bào đại thực bào RAW 264.7 sử dụng cho nghiên cứu biểu hiện của COX-2 và tế bào HUVEC (tế bào nội mơ tĩnh mạch rốn người/ human umbilical vein endothelial cell) dùng cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD). Tế bào được nuơi cấy ở điều kiện nhiệt độ 37 °C, CO2 5 %, trong mơi trường cĩ chứa 10 % huyết thanh bào thanh bị (Fetal bovine serume - FBS), penicillin (100 units/ml) và streptomycin (100 µg/ml). Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế bào được nuơi đến mật độ 80 – 90 % và chịu khơng quá 20 lần phân chia tế bào. 2.2. Dung mơi, hĩa chất và thiết bị  Dung mơi, hĩa chất - Acetylcholin được mua từ Sigma-Aldrich và được pha với nước cất theo tỷ lệ 1:103, 1:104 và 1:105. 20
  30. - Dung dịch nuơi Tyrode (Thành phần gồm: NaCl: 139,2 mM; KCl: 2,7 mM; CaCl2: 1,8 mM; MgCl2: 0,49 mM; NaHCO3: 11,3 mM; Na2HPO4: 0,4 mM; glucose: 5,5 mM). - Nghiên cứu biểu hiện của eNOS và COX-2: Bộ dụng cụ kiểm tra, chuẩn hĩa chất, kháng thể, các dung mơi được mua từ Promega, Sigma-Aldrich và Santa Cruz.  Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống bình nuơi cơ lập gồm 4 bình nuơi, với hệ thống ổn nhiệt và cung cấp oxy liên tục cho các bình nuơi. - Hệ thống ghi Powerlab 8.0 của cơng ty Austruments, Úc. - Máy đo mật độ quang Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific). - Máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems). - Máy chụp Western blot Odyssey Fc Imager (LI-COR Biosciences). 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cơ lập Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang trên cơ trơn cơ lập được tiến hành tại Bộ mơn Sinh lý học, Học viện Quân Y. Quy trình thử thuốc như sau: - Cơ trơn sau khi cơ lập và được gắn vào bình nuơi, đặt một lực tác động cơ sở tương đương 2 g lên đoạn cơ trơn cơ lập và chờ 30 phút để hoạt động của cơ trơn ổn định. - Nhỏ vào bình nuơi 0,15 ml dung dịch acetylcholin với nồng độ tăng dần từ 1:103 đến 1:105. Khi cĩ sự thay đổi lực co cơ rõ ràng trên đồ thị, tiến hành chuyển sang thử tác dụng của dược liệu. - Nhỏ 0,15 ml dung dịch mỗi loại dịch chiết dược liệu vào bình nuơi cơ lập từ nồng độ 0,5 mg/ml đến nồng độ 2 mg/ml. Trong nghiên cứu này, chúng tơi thử 4 phân đoạn dược liệu (Cao tổng, phân đoạn n-hexan, phân đoạn diclomethan và phân đoạn n-butanol) với 3 mức liều: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml. Mỗi phân đoạn dược liệu được thử 2 lần. - Theo dõi sự giãn cơ trơn của cơ quan cơ lập trên đồ thị và đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dược liệu tới sự giãn cơ trơn cơ lập. 21
  31. 2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hĩa  Phân tích RT – PCR cho mARN của COX-2 ARN tồn phần được phân lập từ tế bào bằng cách sử dụng bộ Kit miRNeasy Mini Kit (Qiagen, #217004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức độ biểu hiện của mARN được phân tích bằng máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems) sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Xanh (Qiagen, # 204156) và các cặp mồi xét nghiệm từ Qiagen: cặp mồi Ptgs2 (COX-2, QT00165347) cĩ trình tự mồi xuơi 5’-GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3’ và mồi ngược 5’- GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3’; cặp mồi Mm_GADPH (QT01658692) cĩ trình tự mồi xuơi 5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′ và mồi ngược 5′- CTCCACGACGTACTCAGCG-3′.  Phân tích Western blotting - Sau khi nuơi cấy, các tế bào được thu gom và rửa bằng PBS (Phosphate buffer saline, thành phần gồm NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM và KH2PO4 1,8 mM). - Ly giải tế bào bằng 100 µl dung dịch đệm gồm NaCl 120 mM, Tris 40 mM (pH 8), NP40 0,1% trong đá ở thời gian 30 phút. - Ly tâm tốc độ 13.000 vịng/ phút trong 20 phút. Phần dung dịch phía trên được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford. - Ủ phần dung dịch chứa protein ở 95 °C trong 5 phút và điện di trên gel SDS - polyacrylamid 10%. - Chuyển protein trong gel sang màng nitrocellulose. - Ủ với kháng thể đơn dịng sơ cấp chuột chống COX-2 cho nghiên cứu biểu hiện của COX-2 hoặc phosphoryl-eNOS cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa và beta-actin. Để phát hiện kháng thể sơ cấp, các màng được tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase (Beverly, MA). Trong các phân tích Western blot, beta-actin được sử dụng như là protein chứng cho biểu hiện của các protein khác. - Cuối cùng, protein được phát hiện bằng cách sử dụng chất tăng cường hĩa phát quang cho phát hiện các băng protein đích trên màng nitrocellulose (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). 22
  32.  Đo quang sản phẩm NO Lượng NO trong mơi trường nuơi cấy tế bào được xác định gián tiếp thơng - qua ion NO2 (nitrit) bằng cách sử dụng thuốc thử Griess (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA). NO cĩ thời gian bán hủy ngắn, trong cơ thể NO bị chuyển - - hĩa thành NO2 và NO3 (nitrat) do vậy để phân tích chính xác lượng NO tổng số - - được tạo ra ta phải theo dõi cả nồng độ NO2 và NO3 . Thuốc thử Griess gồm sulfanilamid và N-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid (NED). Đầu tiên, - sulfanilamid sẽ phản ứng với NO2 tạo thành muối diazoni. Sau đĩ muối này sẽ phản ứng với NED để hình thành nên hợp chất azo màu hồng và cĩ cực đại hấp thụ ở bước sĩng 540 nm (Hình 2.4). - Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2 Mơi trường tế bào HUVEC (100 µl) sau khi được ủ 24 giờ với 30 µg/ml dịch chiết dược liệu, được ủ tiếp với enzym nitrit reductase trong 1 giờ ở 37 ° C để khử - - NO3 thành NO2 . Thêm thuốc thử Griess 100 µl sau đĩ và mẫu được đem đo mật độ quang ở bước sĩng 540 nm.  Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ mơn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển (Department of Experimental Medical Science, Faculty of Medicine, Lund University, Sweden).  Xử lý kết quả - Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lơ bằng test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lơ. Sự khác biệt giữa các lơ được coi là cĩ ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. - Hình ảnh điện di protein được xử lý bằng phần mềm Image J 1.49u để đưa ra dữ liệu định lượng cho kết quả protein trên bản điện di. 23
  33. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cơ lập Để xác định tác dụng co giãn trên các hệ cơ trơn cơ lập, chúng tơi đã tiến hành thử trên 4 phân đoạn của Tam thất hoang gồm cao tổng (PST); phân đoạn n- hexan (PSnH); phân đoạn diclomethan (PS DCM) và phân đoạn n-butanol (PSBt) thu được kết quả ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cơ lập Thuốc Liều thử Cơ trơn khí Cơ trơn bàng Cơ trơn thể thử (mg/ml) quản quang hang 0,5 ± - - PST 1 + + - 2 ++ + + 0,5 - - - PSBt 1 - + - 2 + ++ + 0,5 - ± ± PSnH 1 - ± ± 2 + ± ± 0,5 ± ± ± PS DCM 1 ± ± ± 2 ± ± ± (-) khơng giãn; (±) tác dụng khơng rõ ràng; (+) giãn nhẹ; (++) giãn rõ Nhận xét: Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng (PST) và phân đoạn n-butanol (PSBt) của TTH gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí quản và cơ trơn bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn này bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn rõ từ nồng độ 2 mg/ml. Phân đoạn n-hexan (PSnH) và phân đoạn diclomethan (PS DCM) hầu như khơng thể hiện tác dụng trên các hệ cơ trơn này ở tất cả các nồng độ. 24
  34.  Một số hình ảnh giãn cơ trơn của các phân đoạn TTH Hình 3.1. Sự giãn cơ trơn khí quản của phân đoạn tổng Tam thất hoang Nhận xét: Hình 3.1 cho thấy khí quản co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:104 và giãn khơng rõ ràng ở liều PST 0,5 mg/ml, giãn nhẹ ở liều 1 mg/ml và giãn rõ từ liều 2 mg/ml. Hình 3.2. Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của phân đoạn tổng Tam thất hoang Nhận xét: Hình 3.2 cho thấy bàng quang co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:104 và sau đĩ giãn bắt đầu từ liều PST 1 mg/ml. 25
  35. 3.1.2. Tác dụng trên eNOS phosphoryl hĩa Tác dụng giãn cơ trơn cĩ thể do NO được giải phĩng từ hệ thống tế bào nội mơ mạch máu tạo ra. Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành thí nghiệm đo nồng độ NO được giải phịng từ tế bào nội mơ sau khi ủ với các dịch chiết Tam thất hoang. Tế bào HUVEC sau khi ủ với nhiều phân đoạn dịch chiết khác nhau (30 µg/ml) của Tam thất hoang trong 24 giờ, lượng NO trong mơi trường nuơi cấy được xác định - gián tiếp qua NO2 bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Griess. Kết quả thu được ở hình 3.3.  Tác dụng của tam thất hoang trên sự tổng hợp NO: Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng hợp NO (Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5). Trong đĩ: (*): p 0,05). 26
  36.  Tác dụng trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa Việc tăng sản xuất NO cĩ liên quan gì tới việc hoạt hĩa eNOS bằng cơ chế phosphoryl hĩa hay khơng. Kết quả thí nghiệm phân tích hàm lượng protein eNOS được phosphoryl hĩa được trình bày ở hình 3.4. (A) (B) Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện protein eNOS phosphoryl hĩa (p-eNOS: Protein eNOS phosphoryl hĩa) Nhận xét: Các băng của protein β-actin giữa các nhĩm khá đồng đều và rõ nét (hình 3.4.A). Phân tích định tính kết quả Western blot cho thấy tất cả các phân đoạn TTH đều làm tăng biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hĩa so với nhĩm chứng, trong đĩ phân đoạn tổng (PST) và cao giàu saponin (PS27) làm tăng sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hĩa rõ nhất, thể hiện ở những băng đậm, rõ nét hơn so với băng của nhĩm chứng (hình 3.4.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần mềm Image J (hình 3.4.B) cũng cho kết quả phân đoạn tổng (PST) và cao giàu saponin TTH (PS27) làm tăng tỷ lệ protein eNOS phosphoryl hĩa/ β-actin lần lượt 27
  37. 6,73 và 9,61 lần so với nhĩm chứng. Như vậy kết quả Western blot tương đồng với kết quả định lượng sản phẩm NO. 3.1.3. Tác dụng trên gen COX-2 và protein COX-2 Bên cạnh các tác dụng trên co giãn mạch, các hoạt tính về chống viêm của các dịch chiết cũng được thử nghiệm trên tế bào đại thực bào. COX-2 được biết là một trong các protein liên quan tới đáp ứng viêm của tế bào. Biểu hiện mARN phản ánh gián tiếp sự biểu hiện của protein COX-2. Tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm bằng LPS (Lipopolysaccharid) 1 µg/ml rồi ủ cùng với các dịch chiết các phân đoạn của TTH (nồng độ 30 µg/ml) trong 24 giờ. Kết quả phân tích mARN và protein COX-2 được trình bày lần lượt ở hình 3.5 và hình 3.6.  Tác dụng trên sự biểu hiện gen COX-2: Hình 3.5. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện mARN COX-2 (Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5); (*): p 0,05). 28
  38.  Tác dụng trên sự biểu hiện protein COX-2: (A) (B) Hình 3.6. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện protein COX-2 Nhận xét: Phân tích Western blot cho protein COX-2 cũng cho kết quả tương đồng với phân tích biểu hiện mARN COX-2: nhĩm tế bào được ủ với LPS làm tăng biểu hiện của protein COX-2 so với nhĩm chứng (băng đậm, rõ nét hơn so với nhĩm đối chứng). Các tế bào đã được kích thích gây viêm bằng LPS được ủ với dịch chiết dược liệu, các phân đoạn TTH khơng làm thay đổi nhiều sự biểu hiện của protein COX-2 so với nhĩm LPS (kích thước và độ đậm của các băng khơng thay đổi nhiều, hình 3.6.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần mềm Image J hình 3.6.B cũng cho kết quả tương tự. Phân đoạn n-hexan, phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol cĩ làm giảm biểu hiện của protein COX-2 nhưng mức độ giảm rất ít so với nhĩm LPS. Tuy nhiên, trong phân tích này các băng protein β-actin giữa các nhĩm khơng đồng đều, các băng khơng rõ nét; điều này cĩ thể gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. 29
  39. 3.2. Thảo luận Chi Panax L. là một chi thuốc quý với nhiều lồi đã được khẳng định giá trị sử dụng như Nhân sâm (Panax ginseng), Tây dương sâm (Panax quinquefolium), Tam thất (Panax notoginseng), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) Nghiên cứu về thành phần hĩa học của các lồi cây này đều chỉ ra saponin là thành phần chính [76]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi Panax L., là cây thuốc cĩ giá trị, ở nước ta cây chỉ cĩ ở vùng núi cao thuộc dãy Hồng Liên Sơn [9]. Nghiên cứu bước đầu về thành phần hĩa học cho thấy trong rễ và lá của tam thất hoang cĩ chứa saponin khung oleanan với hàm lượng cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [6]. Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về lồi này vẫn cịn hạn chế. Mặt khác, saponin trong các lồi thuộc chi Panax L. đã được chứng minh cĩ tác dụng giãn cơ trơn, tăng sự tổng hợp NO [39,73] và chống viêm [32,45,58]. Chính vì vậy, chúng tơi chọn đối tượng nghiên cứu là Tam thất hoang và tiến hành đề tài này với mong muốn làm rõ tác dụng của tam thất hoang trên cơ trơn cơ lập và biểu hiện của eNOS, COX-2 từ đĩ nâng cao giá trị sử dụng cho lồi cây này. 3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cơ lập Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của TTH gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí quản và cơ trơn bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn này bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn mạnh từ nồng độ 2 mg/ml. Các phân đoạn n- hexan (PSnH) và diclomethan (PS_DCM) hầu như khơng thể hiện tác dụng trên các hệ cơ trơn này ở tất cả các nồng độ. Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Tâm (2016) cho kết quả cả phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của TTH đều cho tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [7]. Mặc dù nghiên cứu của chúng tơi đánh giá trên một tác dụng khác nhưng đều cho thấy phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol TTH là 2 phân đoạn cĩ hoạt tính sinh học cao, cĩ thể chứa các thành phần hĩa học cĩ tiềm năng. Gợi ý những nghiên cứu sâu hơn trên 2 phân đoạn này. Liên quan đến tác dụng trên cơ trơn, chúng tơi nghiên cứu ở 3 mức liều là 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml. Đây là những mức liều đã được nghiên cứu về tác dụng chống đơng và chống kết tập tiểu cầu in vitro trước đĩ [7,11]. Theo nghiên cứu của Choi Y. D (1998) dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc P.ginseng bắt đầu gây 30
  40. giãn cơ trơn thể hang thỏ khi kích thích gây co bằng phenylephrin (5 x 10-6 M) tại liều 1 mg/ml và gây giãn cực đại tại liều 40 mg/ml, tác dụng phụ thuộc nồng độ [20]. Tương tự, theo Kim Sun Ouck (2008), dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc P.ginseng (chiết bằng dung mơi ethanol 50 %) bắt đầu gây giãn cơ trơn âm đạo thỏ từ liều 1 mg/ml và gây giãn trên 85 % tại liều 20 mg/ ml (p < 0,05) [42]. Nghiên cứu của Wen Fei Chiou (2000) cũng cho thấy ginsenosid tổng của P. ginseng (dịch chiết n-butanol) gây giãn thể hang thỏ được kích thích gây co bằng phenylephrin (3 -6 x 10 M) theo phương thức phụ thuộc liều từ 1 – 20 mg/ml với EC50 là 3,65 ± 0,27 mg/ml [18]. Nghiên cứu của chúng tơi tuy tiến hành trên đối tượng cơ trơn khác, yếu tố kích thích gây co cũng như dược liệu khác nhưng cho kết quả khá tương đồng với các nghiên cứu trên. Tuy nhiên, chúng tơi mới chỉ dừng lại ở bước đầu đánh giá định tính sơ bộ tác dụng của các phân đoạn TTH với khoảng liều hẹp. Nghiên cứu của Jang H. A và cộng sự (2012) cho kết quả saponin của P.ginseng gây giãn cơ trơn bàng quang và niệu đạo đoạn tiền liệt trên cả in vitro và in vivo [12]. Theo một nghiên cứu khác của Tamaoki J. và cộng sự (2000) ginsenosid của P.ginseng gây giãn cơ trơn phế quản người theo phương thức phụ thuộc liều [39]. Tác dụng gây giãn cơ trơn của saponin cũng đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khác [18,73]. Trong nghiên cứu của chúng tơi, n-butanol là dung mơi hịa tan tương đối chọn lọc các saponin, phân đoạn n-butanol thể hiện tác dụng gây giãn cơ trơn tốt hơn phân đoạn n-hexan và diclomethan. Như vậy, saponin cĩ thể là thành phần cho tác dụng gây giãn cơ trơn của TTH. Những kết quả nghiên cứu trên cho chúng tơi những đánh giá sàng lọc ban đầu về tác dụng TTH trên cơ trơn. Tác dụng giãn cơ trơn của TTH cĩ thể liên quan đến sự giải phĩng NO. Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng saponin của một số lồi thuộc chi Panax L. cĩ tác dụng gây giãn cơ trơn thơng qua cơ chế tăng giải phĩng NO [39,73]. Do vậy, chúng tơi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết TTH trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa và tổng hợp NO, đồng thời để đánh giá vai trị của saponin, ngồi các phân đoạn trên thì chúng tơi tiến hành thêm với cao giàu saponin của TTH. 3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hĩa Theo kết quả ở hình 3.3 và 3.4, phân đoạn tổng và cao giàu saponin của TTH cĩ tác dụng tăng sản phẩm NO và tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa so với nhĩm chứng trên tế bào HUVEC ở nồng độ 30 µg/ml. Trong đĩ, cao giàu saponin TTH thể hiện tác dụng mạnh hơn phân đoạn tổng TTH. 31
  41. Nghiên cứu sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hĩa và sự tổng hợp NO cho kết quả khá tương đồng với nhau. Điều này cho thấy được vai trị quan trọng của eNOS phosphoryl hĩa trong điều hịa hoạt động của eNOS và tổng hợp NO. Theo Kim Young Mi và cộng sự (2007) dịch chiết nước của Hồng sâm Hàn Quốc (P. ginseng) ở nồng độ 500 µg/ml cĩ tác dụng tăng sản xuất NO so với nhĩm chứng trên tế bào HUVEC (p 0,05), nhưng so với 2 phân đoạn cịn lại là phân đoạn n-hexan và phân đoạn diclomethan thì phân đoạn n- butanol lại cho tác dụng mạnh hơn. Theo Trần Cơng Luận (2009), trong phân đoạn chiết bằng ethanol 70 % của TTH cĩ chứa các nhĩm hợp chất: saponin, polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic và các acid amin; trong đĩ hàm lượng saponin tổng là 6,14 % [6]. Điều này đặt ra cho chúng tơi 2 giả thiết: 1) Đĩng gĩp cho tác dụng của TTH trên sản xuất NO và biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa cĩ thể cĩ sự tham gia của các thành phần khác ngồi saponin; 2) Cĩ thể hàm lượng saponin trong phân đoạn n-butanol thấp hơn cao giàu saponin nên chưa đủ để gây tác dụng ở liều thử. Đây là vấn đề mà chúng tơi chưa giải thích được trong nghiên cứu này do vậy cần cĩ thêm các nghiên cứu khác để làm sáng tỏ. 32
  42. NO và eNOS đĩng vai trị quan trọng trong sự giãn cơ trơn thành mạch. Kết hợp với kết quả nghiên cứu trên cơ trơn cĩ thể thấy cơ chế gây giãn cơ trơn của TTH cĩ liên quan đến sự giải phĩng NO và hoạt hĩa eNOS. Nghiên cứu của Tamaoki J và cộng sự (2000) cũng đã chứng minh rằng tác dụng gây giãn cơ trơn phế quản của ginsenosid từ P. ginseng thơng qua cơ chế tăng giải phĩng NO [39]. Theo Kim Sun Ouck và cộng sự (2008), tác dụng giãn cơ trơn âm đạo thỏ của dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc cĩ thể thơng qua nhiều cơ chế trong đĩ bao gồm qua trung gian NO [42]. Những nghiên cứu này củng cố thêm giả thiết mà chúng tơi đặt ra. Trong nghiên cứu của chúng tơi TTH thể hiện tác dụng giãn cơ trơn, tăng giải phĩng NO và biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa. Các nghiên cứu trước cho thấy TTH cĩ tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu, kéo dài thời gian đơng máu in vitro gợi ý tiềm năng của TTH trong điều trị các bệnh tim mạch [7,11]. 3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 Theo kết quả ở hình 3.5 và 3.6, tất cả phân đoạn TTH đều khơng ức chế sự biểu hiện của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm bằng LPS ở liều 30 µg/ml. Chống viêm là tác dụng được nghiên cứu khá phổ biến của các lồi thuộc chi Panax L. Theo Bak Min Ji và cộng sự (2012), dầu P.ginseng được chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn ở mức liều 10 - 100 µg/ml làm ức chế biểu hiện của mARN và protein COX-2 trên tế bào RAW 246.7 được kích thích gây viêm bằng LPS (p < 0,05) [57]. Theo Seo Jin Joung và cộng sự (2005), dịch chiết lên men giàu ginsenosid Rg3 và Rh2 của P.ginseng ức chế biểu hiện protein COX-2 trên tế bào RAW 246.7 ở mức liều 2 µg/ml; 10 µg/ml (p < 0,05) và 50 µg/ml (p < 0,001) [40]. Trên TTH, nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự (2013), cho thấy 3 chất araloside a methyl ester, 3-O-b-D-xylopyranosyl (1 2)-b-D-glucopyranosyl-28-O- b-D-glucopyranosyl oleanolic acid và chikusetsusaponin IVa được phân lập từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam sử dụng dung mơi chiết methanol (MeOH) ức chế sự biểu hiện của COX-2 trên tế bào HepG2 (tế bào ung thư gan) khi kích thích bằng TNF-α 10 ng/ml (Tumor necrosis factor alpha – yếu tố hoại tử mơ alpha) và tác dụng phụ thuộc nồng độ; ở nồng độ 10 µM là giảm sử biểu hiện mARN COX-2 lần lượt 30, 17 và 2 lần so với nhĩm chứng [45]. Nghiên cứu của chúng tơi cho kết quả âm tính trên sự ức chế biểu hiện của COX-2 ở tất cả các phân đoạn ở liều 30 µg/ml. Sự khác nhau về kết quả này cĩ thể do Chun Liang và cộng sự nghiên cứu trên chất tinh 33
  43. khiết cịn nghiên cứu của chúng tơi dùng phân đoạn thơ. Hơn nữa, hai nghiên cứu sử dụng 2 dịng tế bào khác nhau (tế bào đại thực bào RAW 246.7 và tế bào ung thư gan HepG2) cũng như yếu tố kích thích gây viêm khác nhau (LPS và TNF) nên dẫn đến kết quả khác nhau. Hạn chế của nghiên cứu Nghiên cứu của chúng tơi cịn một số hạn chế như sau: Nghiên cứu tác dụng gây giãn cơ trơn của các phân đoạn Tam thất hoang cịn mang tính chất định tính với khoảng liều hẹp và số lần lặp lại ít. Chúng tơi mới chỉ đánh giá được trên cơ trơn cơ lập của bàng quang, khí quản và thể hang mà chưa đánh giá được trên cơ trơn thành mạch là một trong những vị trí cĩ liên quan đến NO nội mạc và eNOS. Thành phần hĩa học trong các phân đoạn dịch chiết chưa được nghiên cứu đầy đủ gây khĩ khăn trong việc biện luận kết quả nghiên cứu. 34
  44. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua quá trình nghiên cứu chúng tơi đã rút ra một số kết luận sau: 1. Phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của Tam thất hoang gây giãn cơ trơn khí quản, cơ trơn bàng quang và cơ trơn thể hang của chuột khi kích thích gây co bằng acetylcholin theo phương thức phụ thuộc liều, tác dụng bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml, giãn rõ ở liều 2 mg/ml. 2. Phân đoạn tổng và cao giàu saponin của Tam thất hoang làm tăng sản phẩm NO và tăng sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hĩa trên tế bào HUVEC ở mức liều 30 µg/ml. 3. Ở liều 30 µg/ml, các phân đoạn của Tam thất hoang khơng ức chế biểu hiện của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm bằng lipopolysaccharid 1 µg/ml. Đề xuất Qua quá trình nghiên cứu chúng tơi đưa ra một số đề xuất sau: 1. Nghiên cứu tác dụng của phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol và cao giàu saponin Tam thất hoang trên cơ trơn thành mạch để xây dựng khoảng liều phụ thuộc và đánh giá cơ chế gây giãn cơ trơn. 2. Nghiên cứu xác định thành phần các chất cĩ mặt trong các phân đoạn như phân đoạn n-butanol, phân đoạn tổng và cao giàu saponin để cĩ thể đánh giá kết quả rõ ràng hơn. 35
  45. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Trịnh Bình (2013), Mơ - Phơi, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 101-111. [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 700. [3] Phạm Thị Minh Đức (2011), Sinh lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 173, 335-336. [4] Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh và Miễn dịch - Phần Sinh lý bệnh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 113-125. [5] Trần Cơng Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hĩa học và một số tác dụng dược lý của 2 lồi Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 8(2), 93 - 94. [6] Trần Cơng Luận và cộng sự (2009), "Nghiên cứu thành phần hĩa học của 2 lồi Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus. Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 1(14), 17-23. [7] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khĩa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội. [8] Nguyễn Tập (2005), "Các lồi thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), 71-76. [9] Nguyễn Văn Tập và cộng sự (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), 177-180. [10] Mai Tất Tố (2012), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, 264-274. [11] Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017), Nghiên cứu tác dụng chống đơng máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khĩa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội.
  46. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [12] Jang H. A, Cho S. et al. (2012), "The relaxant effect of ginseng saponin on the bladder and prostatic urethra: an in vitro and in vivo study", Urol Int, 88(4), 463-469. [13] Wendy K. A., Chris E. C. et al. (2001), "Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition", Biochemical journal, 357(Pt 3), 593–615. [14] Garg U. C., Hassid A. (1989), "Nitric oxide-generating vasodilators and 8- bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells", J Clin Invest, 83(5), 1774–1777. [15] Liang C., Ding Y. et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(23), 7110-7115. [16] Wann-Hansson C., Hallberg I. R. et al. (2005), "Healthrelated quality of life after revascularization for peripheral arterial occlusive disease: long-term follow-up", J Adv Nurs, 51(3), 227-235. [17] Redmond E. M., Cahill P. A (2016), "Vascular endothelium - Gatekeeper of vessel health", Atherosclerosis, 248, 97-109. [18] Wen Fei Chiou, Woan Ching Jan et al. (2000), "Non major ginsenosides contribute to the relaxation of panax ginseng in rabbit corpus cavernosum ", J Chin Med, 11(4), 197-204. [19] Yang Chongren, Zhidong Jiang et al. (1985), "Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 103- 108. [20] Choi Y. D, Xin Z. C et al. (1998), "Effect of Korean red ginseng on the rabbit corpus cavernosal smooth muscle", Int J Impot Res, 10(1), 37-43. [21] Funk C. D (2001), "Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology", Science, 294(5548), 1871-1875. [22] Rudic R. D., Shesely E. G. et al. (1998), "Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling", The Journal of Clinical Investigation, 101(4), 731-736.
  47. [23] Salvado M. D., Alfranca A. et al. (2012), "Prostanoids in tumor angiogenesis: therapeutic intervention beyond COX-2", Trends Mol Med, 18(4), 233-243. [24] Dinh Q. N., Drummond G. R et al. (2014), "Roles of Inflammation, Oxidative Stress, and Vascular Dysfunction in Hypertension", Biomed Res Int. [25] John Alexander Donald (2015), "Nitric Oxide", Handbook of Hormones, Elsevier, 603-e103A-604. [26] Dierk H. E., Ernesto L. S. et al. (2004), "Endothelial Dysfunction", J Am Soc Nephrol, 15(8), 1983-1992. [27] Galley H. F., Webster N. R. (2004), "Physiology of the endothelium", British journal of anaesthesia, 93(1), 105-113. [28] Linton M. F., Fazio S. (2004), "Cyclooxygenase-2 and inflammation in atherosclerosis", Curr Opin Pharmacol, 4(2), 116-123. [29] Mount P. F., Kemp B. E. et al. (2007), "Regulation of endothelial and myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation", Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 42(2), 271-279. [30] Michel Félétou (2011), "Multiple Functions of the Endothelial Cells", The Endothelium - Part 1: Multiple Functions of the Endothelial Cells—Focus on Endothelium-Derived Vasoactive Mediators, Morgan & Claypool Life Sciences. [31] García-Cardeđa G., Fan R. et al. (1998), "Dynamic activation of endothelial nitric oxide synthase by Hsp90", Nature, 392(6678), 821-824. [32] Li S. H, Chu Y (1999), "Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax notoginseng", Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20(6), 551-554. [33] Aaron N. Hata., Richard M. Breyer (2004), "Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation and immune modulation", Pharmacology & Therapeutics, 103, 147-166. [34] Fleming I., Busse R. (2003), "Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase", American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 284(1), R1-12.
  48. [35] Gomez I., Foudi N. et al. (2013), "The role of prostaglandin E2 in human vascular inflammation", Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 89(2-3), 55-63. [36] Clària J (2003), "Cyclooxygenase-2 Biology", Current Pharmaceutical Design, 9(27), 2177-2190. [37] Davignon J, Ganz P. (2004), "Role of Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis", Circulation, 109(23 Suppl 1), III27-32. [38] Herrmann J., Lerman A. (2001), "The endothelium: dysfunction and beyond", J Nucl Cardiol, 8(2), 197-206. [39] Tamaoki J., Nakata J. et al. (2000), "Ginsenoside-induced relaxation of human bronchial smooth muscle via release of nitric oxide", British Journal of Pharmacology, 130(8), 1859-1864. [40] Seo Jin Young, Lee Jun Ho et al. (2005), "Effect of a fermented ginseng extract, BST204, on the expression of cyclooxygenase-2 in murine macrophages", International immunopharmacology, 5(5), 929-936. [41] Kolluru G. K., Siamwala J. H. et al. (2010), "eNOS phosphorylation in health and disease", Biochimie, 92(9), 1186-1198. [42] Sun‐Ouck Kim, Kim Min Kyung et al. (2008), "The effect of Korean red ginseng extract on the relaxation response in isolated rabbit vaginal tissue and its mechanism", The journal of sexual medicine, 5(9), 2079-2084. [43] Zou Kun Zhu Shu Katsuko Komatsu (2002), "Analysis of Saponins of Panax Stipuleanatus by Using HPLC andAPIMS/MS Techniques [J]", Journal of University of Hydraulic and Electric Engineering/yichang, 4. [44] Chen L., Yang G. et al. (2013), "Prostanoids and inflammatory pain", Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 104, 58-66. [45] Chun L., D. Yan et al. (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of ginseng research, 37(1), 74. [46] Chun L., Yan Ding et al. (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and Their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells", Korean Chemical Society, 32(9), 3513-3516.
  49. [47] Huang P. L., Huang Z. et al. (1995), "Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase", Nature, 377(6546), 239-242. [48] Kargman S. L., et al (1995), "Expression of prostaglandin G/H synthase-1 and -2 protein in human colon cancer", Cancer Res, 55, 2556-2559. [49] Wang J. L., Cheng H. F. et al. (2000), "A selective cyclooxygenase-2 inhibitor decreases proteinuria and retards progressive renal injury in rats", Kidney Int, 57(6), 2334-2342. [50] Fischer S. M., Hawk E. T. et al. (2011), "Coxibs and other nonsteroidal antiinflammatory drugs in animal models of cancer chemoprevention", Cancer Prev Res (Phila), 4(11), 1728-1735. [51] Hogan M., Cerami A. et al. (1992), "Advanced glycosylation endproducts block the antiproliferative effect of nitric oxide. Role in the vascular and renal complications of diabetes mellitus", J Clin Invest, 199, 1110–1115. [52] Khazaei M., Moien-Afshari F. et al. (2008), "Vascular endothelial function in health and diseases", Pathophysiology, 15(1), 49-67. [53] Kim Y. M., Namkoong S. et al. (2007), "Water Extract of Korean Red Ginseng Stimulates Angiogenesis by Activating the PI3K/Akt-Dependent ERK1/2 and eNOS Pathways in Human Umbilical Vein Endothelial Cells", Biol. Pharm. Bull, 30(9), 1674-1679. [54] Raval M., Frank P. G. et al. (2010), "Celecoxib combined with atorvastatin prevents progression of atherosclerosis", J Surg Res, 163(2), e113-122. [55] Scherrer-Crosbie M., Ullrich R. et al. (2001), "Endothelial nitric oxide synthase limits left ventricular remodeling after myocardial infarction in mice", Circulation, 104(11), 1286-1291. [56] Zeiher A. M., Fisslthaler B. et al. (1995), "Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human endothelial cells", Circulation Research, 76(6), 980-986. [57] Bak Min Ji, Hong Soon Gi et al. (2012), "Red ginseng marc oil inhibits iNOS and COX-2 via NFκB and p38 pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages", Molecules, 17(12), 13769-13786.
  50. [58] Li Y. N., Wu Y. L. et al. (2008), "Interaction between COX-2 and iNOS aggravates vascular lesion and antagonistic effect of ginsenoside", J Ethnopharmacol, 119(2), 305-311. [59] Feron O., Belhassen L. et al. (1996), "Endothelial nitric oxide synthase targeting to caveolae. Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac myocytes and endothelial cells", Journal of Biological Chemistry, 271 22810–22814. [60] Jack R., Lancaster Jr. (2015), "Nitric oxide: a brief overview of chemical and physical properties relevant to therapeutic applications", Future science OA, 1(1). [61] Emanuela Ricciotti, A. FitzGerald Garret (2011), "Prostaglandins and Inflammation", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31(5), 986–1000. [62] A. Rios, Vargas-Robles H. et al. (2012), "Cyclooxygenase-2 and kidney failure", Prostaglandins Other Lipid Mediat, 98(3-4), 86-90. [63] Bakhle Y. S., Botting R. M. (1996), "Cyclooxygenase-2 and its regulation in inflammation", Mediators of Inflammation, 5(5), 305–323. [64] Dimmeler S., Zeiher A. M. (1996), "Nitric oxide an endothelial cell survival factor", Cell Death Differ, 6(10), 964–968. [65] Irie S., Tavassoli M. (1991), "Transendothelial transport of macromolecules: The concept of tissue blood barriers", Cell Biol Rev, 25(4), 317–321. [66] Nadaud S., Bonnardeaux A. et al. (1994), "Gene structure, polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene", Biochemical and Biophysical research communications, 198(3), 1027-1033. [67] Curtis M. Steyers, Francis J. Miller (2014), "Endothelial Dysfunction in Chronic Inflammatory Diseases", Int J Mol Sci, 15(7), 11324–11349. [68] Alheid U., Frưlich J. C. et al. (1987), "Endothelium-derived relaxing factor from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human platelets", Thrombosis Research, 47(5), 561-571. [69] Fưrstermann U., Sessa William C. (2012), "Nitric oxide synthases: regulation and function", European Heart Journal, 33(7), 829–837.
  51. [70] Kenneth K. W. (2002), "Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Activity and Gene Expression", New York Academy of Sciences, 962(1), 122-130. [71] Kutchera W. et al (1996), "Prostaglandin H synthase 2 is expressed abnormally in human colon cancer: evidence for a transcriptional effect", Proc Natl Acad Sci USA 93(10), 4816-4280. [72] Radomski M. W., Palmer R. M. et al. (1987), "The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide", Br J Pharmacol, 92(3), 639-646. [73] Chen X., Lee T. J. (1995), "Ginsenosides-induced nitric oxide-mediated relaxation of the rabbit corpus cavernosum", Br J Pharmacol, 115(1), 15-18. [74] Ahn H. Y, Hong S. Y et al. (2013), "Panax ginseng extract rich in ginsenoside protopanaxatriol offers combinatorial effects in nitric oxide production via multiple signaling pathways", Springerplus, 2(1), 96. [75] Kang R. Y., Freire-Moar J. et al. (1996), "Expression of cyclooxygenase- 2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis", Br J Rheumatology, 35, 711-718. [76] Yang W. Z., Hu Y. et al. (2014), "Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity", Phytochemistry, 106, 7-24.