Khóa luận Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus

61 trang yendo 9210

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_su_dung_tinh_bot_lam_chat_bao_ve_trong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh DS. Trần Văn Thái Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh và DS. Trần Văn Thái, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Mai Hương
MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn lactic 2 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic 2 1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3 1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic 5 1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic 5 1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa 6 1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ 7 1.2.4. Alginat 9 1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa 11 1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 11 1.3.1. Lý thuyết đông khô 11 1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 12 1.3.3. Tinh bột 13 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG 15 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Chủng vi sinh vật 15 2.1.2. Hóa chất 15 2.1.3. Môi trường 15 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của 16 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên 17 liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nhân giống 17 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3. Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha 17 đông tụ 2.3.4. Phương pháp đông khô 18 2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của 21 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 3.1.1. Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi 21 thay đổi nồng độ alginat 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi 25 nang sau đông khô 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của 29 nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên 29 liệu đông khô probiotic 3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu 33 đông khô probiotic dạng vi nang 3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36
tinh bột trong quá trình bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 1. Kết luận 40 2. Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Am : Amylose Ap : Amylopectin ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ B. infantis : Bifidobacterium infantis Bifidobacterium spp. : Các loài thuộc chi Bifidobacterium C (Cytosine) : Xitozin Cfu (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc ĐK : Đông khô E. faecium : Enterococcus faecium G (Guanine) : Guanin IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn Sữa thế giới Kl/tt : Khối lượng/thể tích LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus L. amylophilus : Lactobacillus amylophilus L. amylovorus : Lactobacillus amylovorus L. brevis : Lactobacillus brevis L. kefir : Lactobacillus kefir MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS MT : Môi trường PE (Polyethylene) : Polyetylen TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 16 3.1 Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus 22 ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat 3.2 Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa 26 Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ tinh bột 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô 31 3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô 34 3.5 Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 37 3.6 Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 5 1.2 Cấu trúc của acid alginic 10 1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10 3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23 3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào 27 nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông 31 khô 3.5 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau 35 đông khô 3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên 39 liệu trong thời gian bảo quản
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm [58] Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật là các yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [46]. Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp. Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong những phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp bảo vệ chế phẩm khỏi độ ẩm chứ không bảo vệ chúng khỏi các yếu tố khác của môi trường [40]. Vì vậy, phương pháp vi nang hóa đã được nghiên cứu, ứng dụng giúp cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật mất đi. Ngoài ra, sử dụng các tá dược bảo vệ cũng là một trong những phương pháp khả thi và đang được áp dụng rộng rãi. Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô. 2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản.
2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn lactic 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) có thể được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram dương, gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat [26]. Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa bị chua các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobacteriaceae (ngày nay gọi là Lactobacterium). Năm 1873, J. Lister lần đầu tiên phân lập được một loài vi khuẩn đặt tên là Bacterium lactis (hay còn gọi là Lactococcus lactis) và ngành công nghiệp lên men nhờ VK lactic đã được hình thành từ năm 1881. Những nghiên cứu quan trọng trong sự phân loại VK lactic đã cho thấy có nét tương tự giữa VK lactic từ sữa chua và VK lactic trong các sản phẩm chứa acid lactic khác như rượu vang, các sản phẩm muối chua và các loại VK lactic có ích trong đường ruột [60]. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [26]. Có 2 cách chính để phân loại LAB. Cách phân loại thứ nhất dựa trên hình thái, chia LAB làm 2 nhóm chính là trực khuẩn và cầu khuẩn. Cách phân loại thứ 2 dựa trên kiểu lên men lactic, chia LAB làm 2 nhóm chính là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình (homofermentative LAB) và nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentative LAB) [26].  Lên men đồng hình Trong lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic, chiếm khoảng 90 - 98%, các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ. Quá trình phân giải glucose, acid lactic được tạo ra theo con đường EMP (con đường Embden - Mayerhoff - Parnas) [5]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình là các chi Streptococcus và Lactococcus [30].  Lên men dị hình: Trong lên men dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành, bên cạnh
3 acid lactic còn có một lượng đáng kể các sản phẩm khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol, CO2 [26] [30] [52]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình là chi Leuconostoc và một số loài thuộc chi Lactobacillus như các loài L. brevis, L. kefir [5] [30] Vi khuẩn lactic có thể tồn tại ở dạng các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi. Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá đa dạng: có thể là hình cầu hoặc hình que, đường kính các loại cầu khuẩn lactic thường từ 0,5 - 1,5µm, trực khuẩn 1 - 8µm. LAB hầu hết không di động, catalase âm tính, tỉ lệ G+C thấp dưới 50% [52]. LAB là các vi khuẩn ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài dao động từ 28 đến 45oC [5]. Nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp từ 4,5 - 6,8; pH tối ưu của chúng là từ 3,5 - 5. LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbon là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh bột như L. amylophilus và L. amylovorus [5]. LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, rau quả ), thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [52]. LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men. Các vi khuẩn lactic sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra acid lactic và các loại acid hữu cơ khác làm giảm pH, chống lại hiện tượng thối rữa rau quả, thịt cá, sữa; đồng thời làm tăng hương vị, tăng thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn [26]. Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với rất nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư [52] 1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. L. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus,
4 là chi lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [24]. L. acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9µm, dài 1,5 - 6,0µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC [2] [12] [51]. L. acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật, 8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [8]. L. acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng như tổng hợp các vitamin. Ngoài ra, chúng có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin [8]. L. acidophilus ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi khuẩn gây bệnh [8] [12]. Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh. Hơn nữa, L. acidophilus còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất định đến sự lão hóa [8] [12]. L. acidophilus tạo ra môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh vật lên men đường ruột và ngược lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Ngoài ra, L. acidophilus cũng có tác dụng hoạt hóa đại thực bào nhưng mức độ yếu hơn Bifidobacterium bifidum [38]. Tuy nhiên, khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men (trong bảo quản), nồng độ oxy hòa tan (oxy khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ (trong bảo quản), độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô Trong đó, nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau thời gian bảo quản, lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [32]. Hiện nay, L. acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu hóa như Antibio, Lacbio pro, Kidlac để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa
5 do dùng kháng sinh dài ngày, hoặc các trường hợp tiêu chảy, đầy bụng, khó tiêu, trẻ kém ăn, chậm lớn Hình 1.1: Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic 1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic a. Khái niệm Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG) để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6]. b. Đặc điểm Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp thành bảo vệ vững chắc. Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng [32] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào. Vi nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [59]. Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang là một đặc điểm quan trọng. Màng phải có độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi nang
6 cũng là đặc điểm cần lưu ý. Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó. Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt [6] [32]. 1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa a. Ưu điểm Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng lớn tế bào sống. Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các chất ức chế trong môi trường lên men. Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [16] [59]. Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại. Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [16] [59]. Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau. Vi nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [6] [59].
7 Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản phẩm. Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [16] [32]. b. Nhược điểm Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm. Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào. Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym không mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [6] [59]. Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch đều là các nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều này khá nghiêm trọng vì như thế vi sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang. Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó. 1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ a. Nguyên tắc Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang. Từ dung dịch keo trong một dung môi thích hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ
8 (coacervat). Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [4] [15]. b. Phân loại Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức hợp [4] [15]. Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol ), thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [55]. Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4] [15] [55]. Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do tương tác giữa các polyme [4]. Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường) Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo. Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược
9 chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ [45]. 1.2.4. Alginat a. Cấu tạo, nguồn gốc Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid. Alginat được sản xuất từ tảo nâu Phaeophyta, trong tảo các acid chủ yếu ở dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca) [42]. b. Tính chất Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [42]. Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat. Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [18] [29]. Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III; sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+ ) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được [42].
10 Hình 1.2: Cấu trúc của acid alginic Hình 1.3: Cấu trúc phân tử Ca-alginat c. Ưu, nhược điểm của vật liệu bao vi nang alginat Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm. Alginat là vật liệu an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với Calci clorid [32]. Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao. Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [18] [29]. Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm. Độ bền của gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị một và các chất tạo phức với ion Calci. Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài. Ngoài ra, trong quá trình vi nang hóa, cần phải khuấy để phân phối đều tế bào được vi gói nên khá tốn kém [18] [29]. d. Ứng dụng của alginat Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào vi sinh vật sống. Muối Natri của alginat tan trong nước được phối hợp với các tế bào vi sinh vật sống, sau đó nhỏ giọt vào dung dịch Calci clorid sẽ tạo thành hạt gel Ca-alginat bao bọc tế bào sống bên trong. Ngoài ra, alginat cũng được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào và cố định enzym [22] [37].
11 Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã, tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong viên giải phóng kéo dài, tá dược độn trong viên nang. Ngoài ra, Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất của nhũ tương, hỗn dịch trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ [42] 1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa Vi nang hóa là một trong những phương pháp mới và hiệu quả nhất đang được nghiên cứu và áp dụng để cải thiện khả năng tồn tại của vi sinh vật trong chế phẩm probiotic. Sheu và Marshall (1993) đã nghiên cứu quá trình đông lạnh sữa, vi khuẩn lactobacilli trong sữa được vi gói trong nang Calci alginat cho thấy khả năng sống sót tăng hơn 40% so với khi ở dạng tự do [53]. Kebary và cộng sự (1998) cũng báo cáo rằng vi nang hóa Bifidobacterium bifidum và B. infantis sử dụng alginat hoặc kappa-carrageenan đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong sữa đông lạnh trong suốt thời gian lưu trữ (-20ºC trong 10 tuần) [35]. Khalida và cộng sự (2000) đã báo cáo, vi nang hóa L. acidophilus và Bifidobacterium spp. trong nang Calci alginat phối hợp tinh bột cải thiện khả năng sống sót của VSV trong sữa chua sau khi bảo quản trong 8 tuần ở 4ºC [36]. Tại Việt Nam, Đỗ Quốc Cường (2009) đã tiến hành vi gói L. acidophilus trong nang gelatin – alginat và cho thấy khả năng tồn tại của của VK ở dạng vi nang trong môi trường dạ dày nhân tạo tốt hơn dạng tự do [1]. Quách Thu Trang (2010) đã báo cáo, L. acidophilus trong hạt vi nang Calci alginat có sử dụng sữa gầy làm tá dược bảo vệ cho tỉ lệ sống sót sau đông khô và sau 4 tuần bảo quản ở 4ºC cao hơn đáng kể so với không vi nang hóa [9]. Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang lưu hành trên thị trường: Probiocap (chứa L. acidophilus) của viện Rosell/Lallemand The Americas, Canada; Cernivet (chứa E. faecium SF 68) của Cerbios-Pharma; Geneflora (chứa Lactobacillus sporogenes) của công ty America’s Bio-Plus [32] 1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 1.3.1. Lý thuyết đông khô
12 Đông khô được định nghĩa là một quy trình tạo sự ổn định mà trong đó vật cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật (dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau đó là quá trình khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị ngăn cản vi sinh vật phát triển hoặc xúc tác các phản ứng hóa học [39] [41]. Đông khô từ nhiều năm nay đã được sử dụng để ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật trong thời gian bảo quản. Nhờ đông khô, tế bào vi sinh vật được bảo vệ trong hàng thập kỷ mà không suy giảm số lượng sống sót. Ưu điểm lớn nhất của đông khô vi sinh vật là ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật và làm quá trình vận chuyển, bảo quản trở nên dễ dàng hơn [14] [41]. Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng cũng là một trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotic. Đặc biệt, giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây áp lực cho thành tế bào vi khuẩn. Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ bị tổn thương. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay đổi hình thái tự nhiên của lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [25]. Cũng có tài liệu cho rằng việc hình thành phân tử đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây phá vỡ màng tế bào [39]. 1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật Một trong những phương pháp để tăng số lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tá dược bảo vệ. Các tá dược này được thêm vào nhằm mục đích bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật trong quá trình làm khô. Khả năng bảo vệ phụ thuộc vào bản chất của tá dược. Ngoài ra, nồng độ tá dược cũng đóng vai trò quan trọng giúp tăng khả năng sống sót của VSV [31] [39]. Các tá dược thường dùng trong đông khô vi sinh vật gồm: nhóm carbohydrat (sucrose, trehalose ), nhóm polyme (gelatin, polyethylen glycol, tinh bột ), nhóm protein (sữa gầy, trypsin ), nhóm polyol/alcohol (mannitol, glycerol ), nhóm
13 amino acid (natri glutamat, proline ), các chất chống oxy hóa (ascorbic acid, natri thiosulfat ), và một số chất khác (natri acetat ) [41]. 1.3.3. Tinh bột a. Cấu tạo, nguồn gốc Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau cellulose. Người ta thấy tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả. Walton đã sưu tầm trên 300 nghiên cứu về tinh bột, tất cả đều cho thấy tinh bột của mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap) [11] [27]. Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose. Các gốc glucose trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2.000 đơn vị glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000. Ap có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh [10]. Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap khoảng 5×105 - 1×106. Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và Ap cũng không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4. Nước ta có nguồn nguyên liệu tinh bột rất đa dạng và phong phú. Trong đó, sắn là loại cây lương thực có sản lượng cao và tinh bột sắn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp dược phẩm, thực phẩm Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên cứu này. b. Tính chất Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan. Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose. Trong môi trường kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn. Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng lên, tăng thể tích. Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột. Trên 55 - 70ºC, các hạt tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể
14 gây nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phần tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch. Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt hồ hóa [10] [27]. c. Ưu điểm Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh học. Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [17]. Tinh bột là tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [21]. Tinh bột thường được sử dụng để ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [40]. d. Ứng dụng Tinh bột là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41]. Trong quá trình vi nang hóa tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của hạt vi nang sau đông khô và giúp tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và bảo quản [21]. L. acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có thể được lựa chọn trong vi nang hóa L. acidophilus. Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm.
15 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương). 2.1.2. Hóa chất Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc Pepton Ấn Độ Natri acetat Trung Quốc Cao thịt Merk-Đức Natri citrat Trung Quốc Cao nấm men Merk-Đức Alginat Ấn Độ K2HPO4 Trung Quốc Calci clorid Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam Natri clorid Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc 2.1.3. Môi trường MRS lỏng (MT1): Glucose 20g Natri acetat 5g Pepton 10g K2HPO4 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vừa đủ 1.000ml pH 6,8-7,0 Môi trường MRS thạch (MT2): MT2=MT1 + thạch (25g thạch/1.000ml môi trường). 2.1.4. Máy móc, dụng cụ Máy móc
16 Bảng 2.2. Các máy móc dùng trong nghiên cứu Tên thiết bị Nguồn gốc Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo) Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo) Tủ lạnh sâu Đức Tủ lạnh LG Hàn Quốc Thiết bị đông khô Đức Máy li tâm Đức Nồi hấp tiệt khuẩn ALP- Nhật Cân phân tích Đức (Satorious) Cân kỹ thuật Đức (Satorious) Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus) Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) Máy lắc (Vortex) Trung Quốc Dụng cụ Bình nón 250, 1.000ml Giá rửa hạt Cốc có mỏ Ống nghiệm Ống đong Pipet chia vạch Ống li tâm Pipet tip ( Đầu côn) Bơm tiêm Pipetman (Pipet Eppendorf) Đĩa petri đường kính 9cm 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô  Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat.  Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô.
17 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản  Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic.  Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang.  Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nhân giống Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3). Hòa tan, phân tán hết các thành phần. Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C. Cấy giống vào những ống nghiệm trên. Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C [7]. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3). Hòa tan, phân tán hết các thành phần. Đong 100ml môi trường vào bình nón dung tích phù hợp. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C. Cấy giống vào những bình nón trên, mỗi bình 1 ống giống 10ml. Ủ các bình nón đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C. 2.3.3. Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha đông tụ Chuẩn bị hỗn dịch gel chứa vi khuẩn: Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37±1°C trong 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt
18 trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ dịch, thu sinh khối. Pha dung dịch Natri alginat, hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Tạo hỗn dịch Ca-alginat chứa VK: Phân tán sinh khối vào dung dịch Natri alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút. Tạo hỗn dịch Ca-alginat-tinh bột chứa VK: Phân tán tinh bột đã hấp tiệt trùng, sấy khô và sinh khối vào dung dịch Natri alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút. Chuẩn bị dung dịch hóa rắn: Pha dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Tiến hành tạo vi nang: Hỗn dịch gel chứa vi sinh vật được nhỏ qua một kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm) xuống dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt) tạo thành các hạt hình cầu. Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sau đó vớt lấy hạt, rửa hạt ba lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã hấp tiệt trùng và làm nguội. Tiến hành cân khối lượng hạt và đếm số lượng VSV trong 1g hạt ướt. 2.3.4. Phương pháp đông khô Chuẩn bị mẫu: - Các mẫu hạt vi nang (phương pháp nêu trong mục 2.3.3) được dàn đều vào các đĩa petri đã làm sạch và tiệt khuẩn, đậy kín, sau đó đem đi tiền đông ở -80°C cho đông rắn hoàn toàn rồi tiến hành làm khô trong máy đông khô. - Các mẫu tạo nguyên liệu dạng bột: Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37°C trong 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút. Các ống li tâm được lấy khỏi máy, loại phần dịch. Phần sinh khối còn lại được thêm dung dịch tá dược độn đã tiệt khuẩn và để nguội. Phân tán đều sinh khối trong dung dịch tá dược độn bằng máy lắc. Đổ hỗn dịch thu được vào các đĩa petri (đã làm sạch và hấp tiệt khuẩn), đậy kín, sau đó đem đi tiền đông ở -80°C cho đông rắn hoàn toàn rồi tiến hành làm khô trong máy đông khô.
19 Tiến hành: Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80°C trong 24 giờ, sau đó được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở điều kiện khoảng -54°C, 0,055mbar trong 24 giờ. Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, cân khối lượng hạt khô và tiến hành đếm số lượng tế bào được gói trong 1g hạt. Mẫu được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE, đậy kín, để trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4°C. 2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus. Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm. Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy. Chờ máy gia nhiệt đến khi máy hiện kết quả. Đọc, ghi lại số liệu hàm ẩm của mẫu hiện trên màn hình. 2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV Chuẩn bị: Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3). Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình ra khỏi nồi hấp và phân phối môi trường lên các đĩa petri (đã rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô). Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng. Chờ thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín. Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C. Xác định số lượng VSV trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy: - Mẫu nguyên liệu dạng hạt vi nang: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500
20 vòng/phút trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất. - Mẫu nguyên liệu dạng bột: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g nguyên liệu rồi cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng đến khi mẫu phân tán đồng nhất. Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều. Sau đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng. Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C. Sau 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc trong các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300). Số lượng VSV trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: × + × + × = × × Trong đó: X: số VSV có trong 1g hạt hoặc 1 ml dịch nuôi cấy. n An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10 . m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g).
21 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh, sử dụng tinh bột như một tá dược độn có khả năng cải thiện tính chất cơ học và sinh học của hạt vi nang Ca-alginat sau đông khô [57]. Các thí nghiệm dưới đây nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của hạt nguyên liệu tạo thành sau đông khô và lựa chọn nồng độ alginat và tinh bột phù hợp nhất để tạo vi nang. 3.1.1. Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat  Mục tiêu: Khảo sát thể chất của các dạng vi nang tạo thành sau đông khô với các nồng độ alginat khác nhau và lựa chọn nồng độ alginat thích hợp nhất.  Tiến hành: Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat ở các nồng độ khác nhau có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 1: Dung dịch alginat 1%. Mẫu 4: Dung dịch alginat 1% + tinh bột 10%. Mẫu 2: Dung dịch alginat 2%. Mẫu 5: Dung dịch alginat 2% + tinh bột 10%. Mẫu 3: Dung dịch alginat 3%. Mẫu 6: Dung dịch alginat 3% + tinh bột 10%. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng bột với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Mẫu 7: Không thêm tinh bột. Mẫu 8: Thêm tinh bột 10% (kl/tt). Các dung dịch và tá dược thêm vào đều được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115 ºC trong 20 phút. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4).
22  Kết quả: Thể chất của các mẫu sau đông khô được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat Tá dược Dạng NL Thể chất sau đông khô Thể chất đồng nhất, màu vàng nhạt, nhẹ, xốp, kết Alginat 2% Bột thành mảng, rất khó làm nhỏ. Để ngoài môi trường 30 phút, mẫu hút ẩm, rất khó lấy ra khỏi đĩa. Thể chất đồng nhất, màu trắng, nhẹ, xốp, kết thành Alginat 2% mảng, rất khó làm nhỏ. Để ngoài môi trường 30 Bột +TB 10% phút, mẫu vẫn giữ nguyên thể chất, dễ lấy ra khỏi đĩa. Thể chất đồng nhất, màu vàng nhạt, nhẹ, xốp, dễ lấy ra khỏi đĩa, dễ làm nhỏ. Để ngoài môi trường 30 Alginat 1% phút, mẫu hút ẩm, nhưng vẫn dễ lấy khỏi đĩa hơn Alginat 2% Hạt dạng bột. Hạt nhỏ, nhăn nhúm, không cầu, không Alginat 3% đều. Nồng độ alginat càng thấp hạt càng nhỏ, nhăn và kém cầu hơn. Thể chất đồng nhất, màu trắng, dễ lấy ra khỏi đĩa, Alginat rất dễ làm nhỏ. Để ngoài môi trường 30 phút, mẫu 1%+TB 10% vẫn giữ nguyên thể chất, dễ lấy khỏi đĩa. Hạt cứng, Alginat Hạt giảm xốp, đồng đều, kích thước lớn hơn, giữ được 2%+TB 10% dạng cầu và giảm nhăn nhúm hơn so với không Alginat thêm TB. Nồng độ alginat càng thấp hạt càng nhỏ 3%+TB 10% và nhăn nhúm hơn.
23 Hình 3.1: Vi nang Hình 3.2: Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô  Nhận xét: Các mẫu đông khô Lactobacillus acidophilus tạo nguyên liệu dạng bột, các mẫu tạo thành đều có hạn chế là thể chất xốp, kết thành mảng, rất khó làm nhỏ thành dạng bột mịn. Mẫu đông khô với tá dược là dung dịch alginat 2%, nguyên liệu tạo thành lớp mỏng, bám dính vào đĩa petri. Sau 30 phút, mẫu hút ẩm rất khó lấy ra khỏi đĩa gây thất thoát nguyên liệu. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2013) [3]. Khi thêm tinh bột, nguyên liệu ít hút ẩm, không dính đĩa, dễ lấy ra hơn. Mẫu đông khô với nguyên liệu dạng hạt vi nang đã cải thiện hơn về thể chất so với dạng bột. Nói chung dạng hạt ít hút ẩm nên tương đối dễ lấy khỏi đĩa hơn. Nguyên nhân có thể do dạng vi nang tạo thành lớp màng bao làm giảm diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường hơn ở dạng bột, ngoài ra lớp màng này cũng góp phần ngăn ẩm từ môi trường khuếch tán vào mẫu. Các mẫu dạng hạt dễ làm nhỏ hơn vì không có cấu tạo dạng mảng. Các hạt vi nang sử dụng alginat không thêm tinh bột, hạt tạo thành màu vàng nhạt, nhẹ, có thể chất xốp. Nhìn chung, các hạt nhỏ, nhăn nhúm, không cầu, không đều. Khi thêm tinh bột, thể chất hạt được cải thiện rõ ràng. Hạt cứng hơn, giảm xốp, rất dễ làm nhỏ, hạt ít hút ẩm nên dễ lấy ra
24 khỏi đĩa. Hạt có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt hạt giảm nhăn nhúm và giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp. Tiến hành tạo hạt bằng kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm), với các nồng độ alginat khác nhau có hoặc không thêm tinh bột. Với nồng độ alginat 1% hoặc 2% (có hoặc không thêm tinh bột), hỗn dịch có độ nhớt vừa phải, khả năng nhỏ giọt tương đối dễ dàng. Tuy nhiên, hạt tạo thành sau đông khô ở nồng độ 1% thể chất kém hơn. Khi không thêm tinh bột, hạt nhỏ, nhăn nhúm, kém cầu và kém đều hơn so với ở nồng độ 2%. Khi phối hợp tinh bột, hạt ở nồng độ 1% vẫn nhăn nhúm và kém đều hơn nồng độ 2%. Với nồng độ alginat 3% không phối hợp tinh bột, khả năng nhỏ giọt rất khó do hỗn dịch có độ nhớt cao. Khi thêm tinh bột, hầu như không thể nhỏ được và hạt tạo thành có kích thước rất lớn. Do đó, ta lựa chọn nồng độ alginat 2% phối hợp với tinh bột để tiến hành tạo hạt cho thể chất tốt nhất. Mẫu đông khô sử dụng alginat để tạo nguyên liệu dạng bột có thể chất xốp, khó làm nhỏ có thể giải thích: Alginat thực chất là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic (G) và acid β-D- mannuronic (M) [42]. Trong quá trình hấp tiệt khuẩn, do tác động của nhiệt độ cao (>70ºC) nên các chuỗi polyme này một phần bị đề polyme hóa, làm giảm độ nhớt của dung dịch polyme trước khi kết hợp với sinh khối. Vì vậy, nguyên liệu sau đông khô sử dụng alginat không có cấu trúc mảng dài mà chỉ có cấu trúc dạng mảng xốp, ngắn. Cấu trúc dạng chuỗi polyme làm nguyên liệu khó làm nhỏ thành dạng bột mịn. Khi phối hợp tinh bột như một tá dược độn rắn, thể chất của nguyên liệu dạng hạt được cải thiện là do: các hạt vi nang Ca-alginat có cấu trúc bên trong dạng đường viền trong đó các mạng lưới hydrogel tạo thành các lớp đồng tâm dày đặc tại bề mặt với khoảng trống ở giữa các mạng lưới (Rastello De Boisseson và cộng sự, 2004; Nussinovitch và Zvitov-Marabi, 2008) [43] [48]. Khi xảy ra quá trình gel hóa, cấu trúc đường viền kết hợp với liên kết ngang có hướng tỏa tròn từ bề mặt về lõi bên trong hạt tạo thành các hạt vi nang có dạng hình cầu. Sự thăng hoa của nước ở
25 thể đá từ mạng lưới hydrogel alginat trong quá trình đông khô để lại khoảng trống trong cấu trúc hạt và trên bề mặt hạt vi nang (Sriamornsak và cộng sự, 2007; Tal, Van Rijn và Nussinovitch, 1997) [54] [56]. Kết quả là tạo ra một số đặc tính không mong muốn, chẳng hạn như hình dạng méo mó, bề mặt hạt thô, kích thước không đều, độ bền cơ học kém và độ xốp cao. Khi thêm tinh bột, cấu trúc bên trong của các hạt ít xốp vì các hạt tinh bột chiếm khoảng không gian kẽ giữa các lớp đồng tâm. Chúng cũng giúp hỗ trợ cấu trúc mạng gel làm tăng độ bền cơ học của hạt. Việc bổ sung tá dược độn tinh bột còn giúp bề mặt hạt sau đông khô nhẵn, phẳng. Dù vậy, chất lượng bề mặt cũng phụ thuộc vào tính chất của tá dược độn. Theo Rassis, Saguy, Nussinovitch (2002) và Zohar – Perez, Chet, Nussinovitch (2004), sử dụng tá dược độn với kích thước hạt càng nhỏ thì bề mặt vi nang tạo thành càng nhẵn hơn [47] [61]. 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô Việc phối hợp tinh bột với alginat đã được chứng minh cải thiện đáng kể thể chất vi nang tạo thành sau đông khô. Tuy nhiên, ta cũng cần lựa chọn nồng độ tinh bột phù hợp để tạo vi nang dễ dàng và cho thể chất vi nang tốt nhất.  Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến một số đặc tính của hạt vi nang tạo thành sau đông khô và lựa chọn nồng độ tinh bột phù hợp nhất để tạo vi nang.  Tiến hành: Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% và các nồng độ khác nhau của tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 1: Tinh bột 0% (không thêm tinh bột). Mẫu 2: Tinh bột 2%. Mẫu 5: Tinh bột 8%. Mẫu 3: Tinh bột 4%. Mẫu 6: Tinh bột 10%.
26 Mẫu 4: Tinh bột 6%. Mẫu 7: Tinh bột 20%. Các dung dịch và tá dược thêm vào đều được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115 ºC trong 20 phút. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy mẫu ra khỏi đĩa petri, bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE kín ở 4ºC. Tiến hành đo đường kính, hàm ẩm (phương pháp nêu trong mục 2.3.5) và so sánh thể chất của các mẫu ngay sau đông khô. Mỗi thí nghiệm, tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả: Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu sau đông khô được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ tinh bột Nồng độ Khả năng giữ độ cầu, Đường kính trung Hàm ẩm sau đông tinh bột giảm nhăn nhúm bình (mm) khô (%) 0% + 1,50 4,87 2% ++ 1,55 3,93 4% +++ 1,84 3,87 6% ++++ 2,01 3,75 8% +++++ 2,05 2,70 10% ++++++ 2,11 2,03 20% ++++++ 2,58 1,82
27 3 6 2.5 5 ) m ) m 2 4 ( % ( h n m í 1.5 3 ẩ k g m n à ờ 1 2 H ư Đ 0.5 1 0 0 0% 2% 4% 6% 8% 10% 20% Nồng độ tinh bột Đường kính Hàm ẩm sau đông khô Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô  Nhận xét: Tiến hành tạo vi nang Ca-alginat-tinh bột với các nồng độ tinh bột tăng dần từ 2% đến 10% bằng kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm) ta thấy: Hỗn dịch gel có độ nhớt phù hợp, quá trình tạo vi nang tương đối dễ dàng. Các mẫu đông khô với nồng độ tinh bột càng cao, hạt vi nang tạo thành sau đông khô càng giữ được độ cầu và giảm nhăn nhúm, thể chất của hạt cứng và giảm xốp. Khi tăng nồng độ tinh bột từ 2% đến 10%, hàm ẩm của hạt giảm dần (từ 3,93% xuống 2,03%), kích thước hạt tăng dần (đường kính từ 1,55 lên 2,11mm) và hạt tạo thành đồng đều hơn do giảm hiện tượng co rút của hạt trong quá trình đông khô. So sánh với mẫu đông khô không sử dụng tinh bột tiến hành trong cùng điều kiện, ta thấy: hạt vi nang không chứa tinh bột có thể chất xốp, nhăn, không cầu, không đều, kích thước nhỏ (đường kính 1,50mm), hàm ẩm cao (4,87%). Với nồng độ tinh bột 10%, vi nang tạo thành giữ được độ cầu, bề mặt ít nhăn nhúm nhất. Hạt vi nang tạo thành có màu trắng, đường kính khoảng 2,11mm, kích thước tương đối đồng đều. Hạt cứng, giảm xốp, cấu trúc hạt bền vững, tạo lớp vỏ bảo vệ vi sinh vật tốt. Độ ẩm của hạt vi nang ở nồng độ này thấp (2,03%). Độ ẩm có
28 liên quan đến khả năng sống sót của VSV sau đông khô, tỉ lệ sống sót của VSV càng cao khi độ ẩm càng thấp. Trong quá trình tạo vi nang, nồng độ tinh bột càng cao thì hỗn dịch gel càng sánh nhớt, quá trình nhỏ giọt càng trở nên khó khăn. Khi tăng nồng độ tinh bột trên 10%, hỗn dịch gel có độ nhớt cao, không thích hợp để tạo vi nang. Tại nồng độ tinh bột 20%, hạt vi nang tạo thành giữ được độ cầu, bề mặt tương đối nhẵn tuy nhiên không có sự cải thiện độ cầu rõ rệt hơn so với khi sử dụng ở nồng độ 10%. Hạt cứng, hàm ẩm rất thấp (1,82%). Tuy nhiên, nồng độ tinh bột cao khiến hỗn dịch gel nhớt, dễ gây tắc kim, hầu như không thể nhỏ giọt và vi nang tạo thành có kích thước rất lớn (đường kính 2,58mm) ảnh hưởng đến thẩm mỹ của sản phẩm. Từ những kết quả trên, ta lựa chọn nồng độ tinh bột 10% để tiến hành tạo vi nang. Kết quả nghiên cứu có thể được giải thích như sau: Quá trình đông khô làm thăng hoa các phân tử nước dẫn đến giảm kích thước của hạt. Mức độ co rút của hạt càng cao thì kích thước hạt càng giảm. Mức độ co rút của hạt phụ thuộc vào nồng độ tinh bột. Nồng độ tinh bột càng tăng thì mức độ co rút càng giảm, kích thước hạt sau đông khô càng tăng. Đường kính của các hạt vi nang trước đông khô của các mẫu với nồng độ tinh bột khác nhau là tương đương nhau (khoảng 3mm). Khi tăng dần nồng độ tinh bột từ 2% lên 20%, đường kính của hạt vi nang sau đông khô tăng dần từ 1,55 lên 2,58mm. Nguyên nhân do có sự tương tác giữa các phân tử tinh bột và alginat cùng khả năng tương thích tốt của chúng [23]. Các phân tử tinh bột hỗ trợ cấu trúc mạng gel và ngăn chặn sự sụp đổ hoặc co rút của cấu trúc hạt trong quá trình đông khô [21]. Việc bổ sung tá dược độn không tan có hiệu quả kiểm soát mức độ co rút, kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu trước đó (Rassis, Saguy và Nussinovitch, 2002; Zohar - Perez, Chet và Nussinovitch, 2004) [47] [61]. Hình dạng của các hạt alginat được đại diện bằng yếu tố cầu thể. Trước đông khô, hình dạng của tất cả các hạt alginat đều cầu bất kể nồng độ tinh bột. Sau đông khô, hình dạng của các hạt là không đều. Các hạt có nồng độ tinh bột tăng dần từ 2% lên 10% có độ cầu tăng dần. Quá trình đông khô xảy ra hiện tượng thăng hoa của các phân tử nước làm biến dạng cấu trúc hạt, sự biến dạng này dẫn đến thay đổi
29 hình dạng các hạt, hiện tượng cũng được quan sát thấy trong các nghiên cứu trước đó (Rassis và cộng sự, 2002; Zohar - Perez và cộng sự, 2004) [47] [61]. Việc bổ sung tinh bột góp phần duy trì độ cầu của hạt sau đông khô. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ tinh bột trên 10% (ở 20%) không cho thấy cải thiện hơn nữa độ cầu của hạt. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Eng-Seng Chan và cộng sự, 2011[21]. Một nghiên cứu tương tự chứng minh rằng, việc sử dụng chất độn không hòa tan khác chẳng hạn như cao lanh, bentonit (Ribeiro, Barrias Barbosa, 2004; Zohar - Perez và cộng sự, 2004) [50] [61] cũng giúp duy trì độ cầu của hạt sau đông khô. Nguyên nhân có thể giải thích tương tự là do tá dược độn có khả năng hỗ trợ, làm bền vững cấu trúc mạng gel, bảo vệ cấu trúc vi nang trong quá trình đông khô. Vật liệu đông khô rất nhạy cảm với độ ẩm. Sự nhạy cảm này có thể dẫn đến sự giảm nhanh chóng tế bào sống sót khi lưu trữ trong điều kiện không thuận lợi. Các hạt không thêm tinh bột có độ ẩm cao nhất (4,87%), việc bổ sung tinh bột nói chung làm giảm tỷ lệ hấp thụ ẩm và lượng nước ở trạng thái cân bằng. Độ ẩm cao của hạt Ca-alginat có thể là do bản chất ưa nước của alginat (Rhim, 2004; Olivas và cộng sự, 2008) [44] [49]. Tuy nhiên, khi phối hợp với tinh bột, độ ẩm của hạt giảm so với khi không thêm tinh bột. Nồng độ tinh bột càng cao thì độ ẩm của hạt càng thấp. Tại nồng độ tinh bột 20%, độ ẩm của hạt là 1,82%. Nguyên nhân có thể do cấu trúc của tinh bột chứa các vùng vô định hình và các vùng tinh thể. Khu vực vô định hình chủ yếu là amylose và khu vực tinh thể chủ yếu là amylopectin. Chính cấu trúc đặc biệt này đã đem lại những tính chất hóa học đặc trưng của tinh bột, giúp giải thích sự giảm độ ẩm của hạt vi nang khi có sự phối hợp tinh bột. Ngoài ra, hạt tinh bột cũng chứa một lượng nhỏ chất béo giúp ngăn chặn sự hấp thụ độ ẩm [21]. Kết luận: Nồng độ alginat 2% và tinh bột 10% cho nguyên liệu có thể chất tốt nhất được lựa chọn để tạo vi nang trong những thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic
30 Để được coi là có tác dụng bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus acidophilus thì trước tiên tinh bột phải cho thấy khả năng cải thiện được lượng vi sinh vật sống sót sau quá trình đông khô ít nhất là so với các mẫu nguyên liệu đông khô không sử dụng tinh bột ở cùng điều kiện. Vì vậy, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành nhằm xác định số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu ngay sau quá trình đông khô.  Mục tiêu: Đánh giá ảnh hưởng của tinh bột lên lượng VSV sống sót trong mẫu nguyên liệu probiotic sau đông khô, so sánh với mẫu không sử dụng tinh bột và mẫu đông khô VSV với nước cất.  Tiến hành: Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng bột với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch tá dược bảo vệ khác nhau như sau (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Mẫu 1: Nước cất. Mẫu 2: Dung dịch alginat 2%. Mẫu 3: Dung dịch alginat 2% + tinh bột 10%. Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 4: Không thêm tinh bột. Mẫu 5: Thêm tinh bột 10%. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy hết mẫu ra khỏi đĩa, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong các mẫu trên bằng phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu trong mục 2.3.6). Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả:
31 Số lượng VSV Lactobacillus acidophilus có trong 1ml dịch nuôi cấy trước đông khô đạt 1,42×109 VSV/1ml. Kết quả các mẫu được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3: Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô Tá dược bảo Alginat Alginat 2% Alginat Alginat 2% Nước cất vệ 2% + TB 10% 2% + TB 10% Dạng nguyên Bột Bột Bột Hạt Hạt liệu Lượng VSV sau ĐK 9,02×105 2,79×107 7,92×107 1,04×108 3,16×108 (cfu/ml) Tỉ lệ VSV so với mẫu nước 1 30,93 87,80 115,30 350,33 cất (lần) ) 8.5 g / 8 U F 7.5 C g l 7 ( V 6.5 S V 6 g n 5.5 ợ ư 5 l ố 4.5 S 4 Nước cất Alginat Alginat-TB Alginat Alginat-TB (bột) (bột) (bột) (hạt) (hạt) Mẫu nguyên liệu đông khô Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông khô  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, việc phối hợp tinh bột làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với khi không thêm tinh bột. Với nguyên liệu dạng bột, khi sử
32 dụng tá dược bảo vệ alginat, lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 2,79×107 cfu/ml gấp 30,93 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2013) [3]. Khi thêm tinh bột, lượng VSV sống sót cao hơn đạt 7,92×107 cfu/ml gấp 87,80 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Khi tạo nguyên liệu dạng bột, lượng VSV sống sót sau đông khô khi thêm tinh bột đạt 3,16×108 cfu/ml tăng hơn so với mẫu không thêm tinh bột chỉ đạt 1,04×108 cfu/ml. Ngoài ra, tạo nguyên liệu dạng hạt không chỉ cải thiện về mặt thể chất mà còn tăng khả năng sống sót VSV sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột. Trong cùng điều kiện và sử dụng các tá dược độn giống nhau, với nồng độ và thể tích như nhau thì lượng VSV sống sót sau đông khô của dạng hạt vi nang đều lớn hơn so với dạng bột. Khi sử dụng alginat phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu dạng vi nang cho kết quả bảo vệ VSV trong đông khô tốt nhất. Lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 3,16×108 cfu/ml gấp 350,33 lần so với mẫu nguyên liệu dạng bột sử dụng nước cất. Như vậy, việc tạo nguyên liệu dạng vi nang đã góp phần làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột và việc phối hợp tinh bột cũng góp phần bảo vệ VSV trong quá trình đông khô. Kết quả trên có thể giải thích như sau: Đông khô là phương pháp loại nước được sử dụng rộng rãi để bảo quản tế bào. Tuy nhiên, đã có một số báo cáo liên quan đến việc tác dụng phụ của đông khô trên cấu trúc và chức năng của tế bào, cuối cùng dẫn đến giảm lượng tế bào sống sót [25]. Một trong số các tác động của quá trình đông khô là sự biến tính protein và tổn thương tế bào và màng tế bào. Quá trình vi nang hóa tạo ra lớp màng bao bảo vệ tế bào VSV khỏi điều kiện bất lợi của môi trường trong quá trình đông khô. Vì vậy, nguyên liệu dạng vi nang cải thiện khả năng sống sót của tế bào VSV hơn so với nguyên liệu ở dạng bột. Tuy nhiên, Champagne và các cộng sự (1992) đã phát hiện ra rằng chỉ sử dụng mạng lưới hydrogel Ca- alginat không đủ để bảo vệ các tế bào đóng gói [20]. Vì vậy, việc phối hợp tá dược để tăng khả năng bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô là cần thiết. Sau đông khô, tế bào đóng gói trong vi nang không sử dụng tinh bột có tỉ lệ sống thấp đạt 1,04×108 cfu/ml. Trong khi đó, sử dụng tinh bột làm tăng lượng tế bào
33 đóng gói sống sót sau đông khô lên 3,16×108 cfu/ml. Việc sử dụng phối hợp tinh bột giúp cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic trong hạt vi nang sau đông khô, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Eng-Seng Chan và cộng sự (2011); M.J. Martin và cộng sự (2013) [21] [40]. Sự khác biệt về khả năng sống sót của tế bào đóng gói hạt Ca-alginat có và không sử dụng tinh bột sau đông khô có thể do các nguyên nhân sau: - Các hạt không sử dụng tinh bột có mức độ co rút cao hơn, gây ra các tác động vật lý lên tế bào. Ngoài ra, hạt không phối hợp tinh bột có độ xốp cao hơn nên diện tích tiếp xúc của tế bào với môi trường trong quá trình đông khô cao hơn. Chính sự tiếp xúc này là nguyên nhân làm giảm lượng tế bào sống sót, kể từ khi có báo cáo rằng xác suất tử vong trong đông khô tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc (Bozo Glu và cộng sự, 1987) [19]. - Việc bổ sung các chất độn tạo môi trường có mật độ dày đặc làm tăng khả năng bảo vệ các tế bào chống lại các yếu tố ảnh hưởng của quá trình đông khô. - Tinh bột cũng là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41]. Ngoài ra, hạt vi nang có sử dụng tinh bột có độ ẩm sau đông khô thấp hơn giúp VSV ổn định hơn trong quá trình bảo quản. 3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang Hiệu quả điều trị của chế phẩm probiotic thường phụ thuộc vào lượng vi sinh vật sống có trong chế phẩm. Liên đoàn Sữa quốc tế (IDF) đã đề nghị cần tối thiểu 107 tế bào vi sinh vật sống vào thời điểm tiêu thụ mỗi gam sản phẩm [28] [34]. Vì vậy, chỉ tiêu vi sinh vật dự kiến của nguyên liệu probiotic ngay sau đông khô là khoảng 1010 cfu/g. Để đảm bảo yêu cầu trên, ta tiến hành tạo chế phẩm đông khô dạng vi nang với lượng sinh khối đầu vào khác nhau và lựa chọn lượng sinh khối phù hợp để tạo nguyên liệu.  Mục tiêu:
34 Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối đến chất lượng của nguyên liệu sau đông khô và lựa chọn lượng sinh khối phù hợp để tiến hành tạo nguyên liệu.  Tiến hành: Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối của các thể tích dịch lên men khác nhau và 100ml hỗn dịch alginat 2% phối hợp tinh bột 10% như sau (phương pháp nêu trong mục 2.3.3). Mẫu 1: Sinh khối của 100ml dịch lên men. Mẫu 2: Sinh khối của 200ml dịch lên men. Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy hết mẫu ra khỏi đĩa, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong các mẫu trên bằng phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu trong mục 2.3.6). Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.  Kết quả: Kết quả các mẫu được thể hiện trong bảng 3.4. Bảng 3.4: Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô Thời điểm Tiêu chí đánh giá Mẫu 1 Mẫu 2 Khối lượng sinh khối (g) 1,58 3,28 Trước Tổng khối lượng hạt (g) 77,28 79,26 ĐK Lượng VSV trong 1g hạt (cfu/g) 6,83×109 1,36×1010 Sau Lượng VSV trong 1g hạt (cfu/g) 6,42×109 1,43×1010 ĐK Hàm ẩm (%) 2,06 1,95
35 14 ) g / 12 u f c 9 0 10 1 . ( 8 V S Trước đông khô V 6 g Sau đông khô n ợ ư 4 l ố S 2 0 100ml 200ml Thể tích dịch lên men (ml) Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau đông khô  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, khi ta thay đổi lượng sinh khối, giá trị hàm ẩm của các mẫu thay đổi không đáng kể. Hàm ẩm của các mẫu vi nang phối hợp 10% tinh bột đều tương đối thấp, khoảng 1,95 – 2,06% (dưới 5%). Hàm ẩm của mẫu phụ thuộc vào quá trình đông khô và lượng tá dược độn rắn thêm vào chứ không phụ thuộc vào lượng sinh khối đầu vào. Khi ta tăng gấp đôi thể tích dịch nuôi cấy (từ 100ml lên 200ml), khối lượng sinh khối thu được cũng tăng (từ 1,58 lên 3,28g). Lượng vi sinh vật được vi gói trong 1g hạt trước đông khô tăng (từ 6,83×109 lên 1,36×1010 cfu/g), sau đông khô tăng (từ 6,42×109 lên 1,43×1010 cfu/g). Từ kết quả trên cho thấy, khi ta tăng thể tích dịch nuôi cấy nghĩa là tăng số lượng vi sinh vật đầu vào để tạo nguyên liệu dạng vi nang. Kết quả là số lượng tế bào được vi gói tăng lên trong cùng điều kiện thực nghiệm, do đó hiệu quả vi gói cao hơn. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền (2012) [13]. Khi tăng thể tích dịch nuôi cấy lên 200ml, thì khối lượng sinh khối ban đầu là 3,28g, lượng vi sinh vật trong 1g hạt sau đông khô là 1,43×1010 cfu/g đạt yêu cầu của nguyên liệu probiotic đề ra, hàm ẩm của hạt là
36 1,95% (dưới 5%). Vì vậy, ta tiến hành vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô với thể tích dịch nuôi cấy ban đầu là 200ml bằng phương pháp như đã nêu trên. Kết quả trên có thể giải thích như sau: Acid alginic có cấu trúc là một heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid. Tuy nhiên, chúng không liên kết một cách ngẫu nhiên mà tạo thành 3 loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau tạo thành đoạn mạch GGGG có dạng gấp nếp, block homopolymemannuronic gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau tạo thành đoạn mạch MMMM có dạng dải hẹp và block liên hợp MGMG. Khi có mặt ion Ca2+ ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp song song nhau, đoạn mạch GGGG gấp nếp như vỉ trứng, khoảng không gian các vỉ xếp lên nhau như chỗ đặt quả trứng. Các ion khớp vào các khoảng trống này liên kết với các nhóm carboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn song song hình thành khoang rỗng có cấu tạo không gian ba chiều [42]. Trong cùng điều kiện thể tích cũng như nồng độ alginat và Ca2+, số lượng hạt vi nang tạo thành cũng như khoang trống trong mỗi hạt là tương đương nhau. Khi ta tăng số lượng vi sinh vật đầu vào, chúng bị giam giữ hết trong các khoang rỗng nên lượng tế bào được vi gói cũng tăng, hiệu quả vi gói tăng. Tuy nhiên, khi lượng tế bào đã đủ lớn để lấp đầy tất cả các khoang thì dù có tăng thêm lượng vi sinh vật đầu vào, hiệu quả vi gói cũng không tiếp tục tăng lên được nữa. Lúc này, nếu muốn tăng hiệu quả vi gói cần thay đổi một số yếu tố như nồng độ alginat, nồng độ Ca2+ Mục tiêu của nghiên cứu này là lựa chọn lượng sinh khối thích hợp để tạo nguyên liệu sau đông khô chứa khoảng 1010 cfu/g, vì vậy ta lựa chọn thể tích dịch lên men đầu vào là 200ml để tiết kiệm sinh khối. 3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản Một trong những yêu cầu quan trọng của nguyên liệu probiotic là phải giữ được thể chất cũng như lượng vi sinh vật sống phù hợp trong quá trình bảo quản. Hàm ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sống sót của vi khuẩn lactic [32], vì
37 vậy cần thiết phải tiến hành đánh giá hàm ẩm và lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản.  Mục tiêu: Theo dõi hàm ẩm và lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu probiotic trong thời gian bảo quản.  Tiến hành: Tạo mẫu nguyên liệu vi nang từ sinh khối của 200ml dịch lên men (phương pháp như trong thí nghiệm 3.2.2). Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Nguyên liệu sau khi lấy ra khỏi đĩa petri được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE kín ở 4ºC. Tiến hành đo hàm ẩm và xác định số lượng vi sinh vật sống sót tại các thời điểm: ngay sau đông khô, sau 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần (làm 3 lần để lấy kết quả trung bình).  Kết quả: Kết quả đo hàm ẩm của mẫu được thể hiện trong bảng 3.5. Bảng 3.5: Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Sau Sau 1 Sau 2 Sau 4 Sau 8 Sau 12 Thời gian ĐK tuần tuần tuần tuần tuần Hàm ẩm (%) 2,03 2,99 2,38 2,65 2,86 3,24 Hàm ẩm tăng so với mẫu 0 0,96 0,35 0,62 0,83 1,21 ngay sau ĐK (%)  Nhận xét: Từ kết quả thu được ta thấy, trong quá trình bảo quản, hàm ẩm của mẫu nói chung là tăng dần (từ 2,03% lên 3,24%), nguyên nhân là do ẩm của không khí khuếch tán qua bao bì và được sản phẩm hấp thụ. Hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu tương đối ổn định theo thời gian, sau 12 tuần, ở điều kiện bảo quản, hàm ẩm của mẫu tăng 1,21% so với mẫu ngay sau đông khô, đạt 3,24% (<5%). Khả năng hút ẩm của mẫu có thể giải thích là do cấu trúc đặc biệt của tinh bột có chứa các vùng vô định hình và các vùng tinh thể làm cho hạt vi nang tinh bột ít hút ẩm trong điều kiện bảo quản. Ngoài ra, hạt vi nang tinh bột có cấu tạo ít xốp, tinh bột tạo lớp màng bảo
38 vệ vững chắc và hạt tinh bột cũng chứa một lượng nhỏ chất béo có thể là nguyên nhân giúp ngăn chặn sự hấp thụ ẩm của hạt [21]. Trong quá trình bảo quản, hàm ẩm của mẫu sau 1 tuần tăng mạnh, sau đó lại giảm. Nguyên nhân có thể một phần là do sai số của thiết bị đo. Tuy nhiên, nguyên nhân chính có thể được giải thích là do tinh bột có cấu trúc xốp, nên khi tiếp xúc với độ ẩm không khí thì khả năng hút ẩm của tinh bột là khá lớn. Khi độ ẩm tương đối của không khí là 75% thì khả năng hút ẩm của tinh bột là 10,33%, còn khi độ ẩm tương đối của không khí là 100% thì khả năng hút ẩm của tinh bột lên đến 20,92% [11]. Do đó, trong quá trình lấy mẫu ra chuẩn bị đo hàm ẩm, khi tiếp xúc với độ ẩm cao của không khí, hạt tinh bột có thể hút ẩm làm cho hàm ẩm của mẫu nguyên liệu tăng mạnh. Hàm ẩm của mẫu phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tương đối của không khí và thời gian mẫu tiếp xúc với môi trường. Chính vì khả năng hút ẩm cao của tinh bột khi tiếp xúc với không khí nên nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có sử dụng tinh bột làm tá dược độn rắn cần bảo quản kín trong bao bì ngăn khuếch tán của ẩm và không khí. Lượng vi sinh vật sống của mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản được thể hiện trong bảng 3.6. Bảng 3.6: Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Thời Sau 1 Sau 2 Sau 4 Sau 8 Sau 12 Sau ĐK gian tuần tuần tuần tuần tuần Lượng VSV 1,48×1010 1,15×1010 5,99×109 2,94×109 1,18×109 3,78×108 sống sót (cfu/g)  Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, số lượng vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu giảm dần trong quá trình bảo quản. Lượng vi sinh vật ngay sau đông khô đạt 1,48×1010 cfu/g. Sau 12 tuần, số lượng vi sinh vật sống giảm xuống 3,78×108 cfu/g, nhưng vẫn đạt trên 108 cfu/g. Như vậy, với sự phối hợp 10% tinh bột, ta đã tạo thành công
39 nguyên liệu đông khô dạng vi nang với thể chất thích hợp và lượng vi sinh vật phù hợp. Sau 3 tháng, nguyên liệu vẫn giữ được độ ổn định và đạt các yêu cầu của nguyên liệu probiotic. 12 3.5 ) g / 3 U 10 F ) C 2.5 8 % g ( l ( 2 m V 6 ẩ S 1.5 m V à 4 g 1 H n ợ 2 ư 0.5 l ố S 0 0 Ngay sau 1 tuần 2 tuần 4 tuần 8 tuần 12 tuần đông khô Thời gian bảo quản Hàm ẩm Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản Lượng vi sinh vật giảm dần trong quá trình bảo quản có thể được giải thích như sau: Khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, độ ẩm Trong đó, do Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn kị khí không bắt buộc (vi hiếu khí) nên nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò đáng kể trong việc hạn chế sự sống sót của vi khuẩn [32]. Trong quá trình bảo quản, oxy và ẩm từ môi trường khuếch tán qua bao bì nên thời gian bảo quản càng dài thì lượng vi sinh vật càng giảm.
40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau: - Việc phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất của nguyên liệu đông khô dạng vi nang. Khi phối hợp tinh bột, hạt vi nang có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt hạt giảm nhăn nhúm và giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp. Hạt cứng, giảm xốp, rất dễ làm nhỏ, ít hút ẩm. Ta lựa chọn nồng độ alginat 2% và tinh bột 10% để tạo hạt cho thể chất tốt nhất. - Phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu đông khô dạng vi nang làm tăng lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô so với khi không sử dụng tinh bột trong cùng điều kiện. Tiến hành tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus dạng vi nang sử dụng alginat 2%, tinh bột 10% và sinh khối của 200ml dịch lên men. Nguyên liệu được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ PE kín tại 4ºC và theo dõi độ ổn định. Sau 12 tuần, hàm ẩm của nguyên liệu là 3,24% và lượng vi sinh vật trong nguyên liệu là 3,78×108 (cfu/g) vẫn đạt tiêu chuẩn nguyên liệu đông khô probiotic. 2. Kiến nghị - Tiếp tục theo dõi độ ổn định của nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột trong thời gian bảo quản về các chỉ tiêu độ ẩm và số lượng vi sinh vật - Đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột trong môi trường dạ dày nhân tạo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Quốc Cường (2009), Nâng cao chất lượng sữa chua bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Trường Đại Học Kỹ thuật công nghệ TP HCM, TP HCM. 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Hoa (2013), Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacilus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội. 4. Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề về bào chế hiện đại, NXB y học, Hà Nội. 5. Biền Văn Minh, Kiều Hữu Ảnh, Phạm Ngọc Lan, Đỗ Thị Bích Thủy (2008), Giáo trình điện tử Vi sinh vật học công nghiệp, Huế. 6. Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế và sinh dược học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 7. Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng. 8. Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Trần Cát Nông, Võ Thị Mại (2002), "Nghiên cứu phối hợp Bifidobacterium bifidum với Lactobacillus acidophilus trong sản xuất chế phẩm loạn khuẩn đường ruột", Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, 6, pp. 142-144. 9. Quách Thu Trang (2010), Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp vi nang hóa bằng alginat tới tỉ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội.
10. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm quốc Thăng, NguyễnThị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên (2000), Hoá sinh công nghiệp, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 11. Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (1999), Hóa học thực phẩm, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 13. Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh, Lê Thị Thu Hiền (2012), "Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định trên chất mang alginat trong lên men sản xuất calci lactat", Tạp chí hóa học, 50(5A), pp. 117-121. Tài liệu tiếng Anh 14. Abadias M., Benabarre A., Teixido N., Usall J., Vinas I. (2011), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiology, 65, pp. 173-182. 15. Agnihotri N., et al. (2012), "Microencapsulation - a novel approach in drug delivery: a review", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp. 1-20. 16. Amir Mortazavian, Seyed Hadi Razavi, Mohammad Reza Ehsani, Sara Sohrabvandi (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian journal of biotechnology, 5(1), pp. 1-17. 17. Anindya Kishore Maiti, Amal Kumar Dhara, Arunabha Nanda (2012), "Preparation and Evaluation of Starch coated Alginate Microsphere of Diclofenac potassium", International Journal of PharmTech Research, 4(2), pp. 630-636.
18. Arnauld J.P., Laroix C., Choplin L. (1992), "Effect of agitation rate on cell release raye and metabolism during continues fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp. casei", Biotech Tech, pp. 261-265. 19. Bozoglu T.F., Ozilgen M., Bakir U. (1987), "Survival kinetics of lactic acid starter cultures during and after freeze-drying", Enzyme and Microbial Technology, 9, pp. 531–537. 20. Champagne C.P., Morin N., Couture R., Gagnon C., Jelen P., Lacroix C. (1992), "The potential of immobilized cell technology to produce freeze- dried, phageprotected cultures of Lactococcus lactis", Food Research International, 25(6), pp. 419-427. 21. Chan Eng-Seng, et al. (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate Polymers, 83, pp. 225-232. 22. Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), "Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Food, 1, pp. 319-323. 23. Gislene Mari Fujiwara, et al. (2013), "Production and characterization of alginate-starch-chitosan microparticles containing stigmasterol through the external ionic gelation technique", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 49(3), pp. 537-546. 24. Gomes A.M.P., Malcata F.X. (1990), "Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp. 139-157. 25. Guergoletto Karla Bigetti (2012), "Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications", Food Industrial Processes-Methods and Equipment, pp. 227-247.
26. Halász Anna (2007), "Lactic Acid Bacteria", Food Quality and Standards, 3, pp. 70-82. 27. Harry W. Leach, L.D. MeCowen, Thomas J. Schoch (1959), "Swelling and Solubility Patterns of Various Starches", In Structure of grannle, 56, pp. 534- 543. 28. Hekmat S., et al. (1992), "Survival of Lactobacillus and Bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food", Journal of Dairy Science, 75, pp. 1415–1422. 29. Jankowski T., Zielinska M. (1997), "Encapsulation of lactic and bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnol Technol, pp. 31-34. 30. José Luis Parada, Carolina Ricoy Caron, Adriane Bianchi P. Medeiros, Carlos Ricardo Soccol (2007), "Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Purification, Properties and use as Biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), pp. 521-542. 31. Kaewkaukul Naparat (1998), Development of mixed culture Lactobacillus products, Thesis of master of science, Mahidol University, Thailand. 32. Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications", Horizon Scientific Press, pp. 39-48. 33. Kailasapathy Kaila, James Chin (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp", Immunology and Cell Biology, 78, pp. 80-88. 34. Kailasapathy Kaila, Sultana K. (2003), "Survival and b-D-galactosidase activity of encapsulated and free Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in ice cream", Australian Journal of Dairy Technology, 58(3), pp. 223–227. 35. Kebary K.M.K., Hussein, S.A., Badawi , R.M. (1998), "Improving viability of bifidobacteria and their effect on frozen milk", Egyptian J. Dairy Sci. , 26, pp. 319-337.
36. Khalida S., et al. (2000), "Encapsulation of probiotic bacteria with alginate- starch and evaluation of survival in simulated gastro-intestinal conditions and in yoghurt", Int. Food Microbiol, 62, pp. 47-55. 37. Latha Sabikhi, Dabu R., D.K. Thompkinson, Suman Kapila (2008), "Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions", Food Bioprocess Technol, 3, pp. 586-593. 38. Laurent Verschuere, Geert Rombaut, Parich Sorgeloos, Willy Verstraete (2000), "Probiotic bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), pp. 655-671. 39. Lim Chi Minh, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B. Ariff (2009), "Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form", Food Bioprocess Technol, 2, pp. 431-436. 40. Martin M.J., Lara-Villoslada F., Ruiz M.A., Morales M.E. (2013), "Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716", Food Science and Technology, 53, pp. 480-486. 41. Morgan C., Vesey G. (2009), Freeze-Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia, pp. 162-173. 42. Murtaza G., et al. (2011), "Alginat microparticles for biodelivery: a review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp. 2726-2737. 43. Nussinovitch A., Zvitov-Marabi R. (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food Hydrocolloids, 22, pp. 364- 372. 44. Olivas G.I., Barbosa-Canovas G.V. (2008), "Alginate–calcium films: Water vapor permeability and mechanical properties as affected by plasticizer and relative humidity", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 41, pp. 359– 366.
45. Patil J.S., et al. (2010), "Ionotropic gelation and polyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particulate sustained, modulated drug delivery system: a review", Digest Journal of Nanomaterial and Biostructures, 5(1), pp. 241-248. 46. Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol, Indu Pal Kaur (2011), "Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer", Food Funct, 3, pp. 83-90. 47. Rassis D.K., Saguy I.S., Nussinovitch A. (2002), "Collapse, shrinkage and structural changes in dried alginate gels containing fillers", Food Hydrocolloids, 16, pp. 139-151. 48. Rastello De Boisseson, et al. (2004), "Physical alginate hydrogels based on hydrophobic or dual hydrophobic/ionic interactions: Bead formation, structure, and stability", Journal of Colloid and Interface Science, 273, pp. 131-139. 49. Rhim J. (2004), "Physical and mechanical properties of water resistant sodium alginate films", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 37, pp. 323–330. 50. Ribeiro C.C., Barrias C.C., Barbosa M.A. (2004), "Calcium phosphate– alginate microspheres as enzyme delivery matrices", Biomaterials, 25, pp. 4363–4373. 51. Robert S. Breed, Murray E.G.D., Nathan R. Smith (1957), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Baillierek Tilldall and Cox Ltd., The United States of America, pp. 541-552. 52. Savadogo Aly, Ouattara Cheik A.T., Bassole Imael H.N., Traore S. Alfred (2006), "Bacteriocins and lactic acid bacteria - a minireview", African Journal of Biotechnology, 5(9), pp. 678-683. 53. Sheu T.Y., Marshall, R.T. (1993), "Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gels", J. Food Sci. , 58, pp. 557-561.
54. Sriamornsak P., Thirawong N., Cheewatanakornkool K., Burapapadh W., Sae-Ngow W. (2007), "Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) as a tool for studying the ultrastructure during bead formation by ionotropic gelation of calcium pectin", International Journal of Pharmaceutics, 352, pp. 115-122. 55. Swarbrich J., et al. (2007), Encyclopedia of pharmaceutical technology, Informa Healthcare, NewYork, pp. 2315-2327. 56. Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A. (1997), "Improvement of structural and mechanical properties of denitrifying alginate beads by freeze-drying", Biotechnology Progress, 13, pp. 788-793. 57. Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A. (1999), "Improvement of mechanical and biological properties of freeze-dried denitrifying alginate beads by using starch as a filler and carbon source", Appl Microbiol Biotechnol, 51, pp. 773- 779. 58. Vilaichone R.K., Mahachai V., Tumwasorn S., Nunthapisud P., Kullavanijaya P. (2002), "Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study", Chotmaihet Thangphaet, 85, pp. 79-84. 59. Vivek K.B. (2013), "Use of encapsulated probiotic in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277-209X (Online), 3(1), pp. 188-199. 60. Wood B.J., Holzapfel W.H.N. (1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academic and Professional, London UK. 61. Zohar-Perez, C. Chet I., Nussinovitch A. (2004), "Irregular textural features of dried alginate-filler beads", Food Hydrocolloids, 18, pp. 249-258.
PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chất lượng dự kiến của nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có kết hợp tinh bột chứa Lactobacillus acidophilus 1. YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1. Tính chất: Hạt vi nang màu trắng, hình cầu, tương đối đồng đều, đường kính khoảng 2mm. 1.2. Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của Lactobacillus acidophilus. 1.3. Kim loại nặng: Không quá 20 phần triệu. 1.4. Nước: Không quá 5,0%. 1.5. Định lượng: Chế phẩm phải chứa Lactobacillus acidophilus không dưới 108 cfu/g. 1.6. Độ nhiễm khuẩn: - Tổng số Enterobacteria và vi sinh vật Gram âm: không quá 500 cfu/g; - Nấm men và nấm mốc: không quá 100 cfu/g; - Không được có: E. coli, Salmonella sp., P. aeruginosa và S. aureus trong 1g. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Tính chất: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính: 2.2.1. Thuốc thử: Theo DĐVN III. 2.2.2. Cách thử: Sau khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thạch đặc ta thu được các khuẩn lạc đặc trưng (mô tả trong mục định lượng). Lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang ống nghiệm chứa 5,0 ml môi trường MRS lỏng đã tiệt khuẩn và làm nguội. Ủ ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C. a. Sự phát triển của vi sinh vật: Vi sinh vật phát triển tốt trong điều kiện kị khí.
b. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1.000 lần: Vi sinh vật bắt màu tím, hình que, xếp thành đôi, chuỗi ngắn hoặc đứng đơn độc (Trực khuẩn Gram dương). c. Phản ứng catalase: Li tâm 2ml hỗn dịch sinh khối thu được ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch, thu sinh khối. Thêm vào sinh khối khoảng 2ml dung dịch oxy già 3%, phải không thấy có bọt khí nổi lên (phản ứng catalase âm tính). d. Định danh vi sinh vật bằng kit API 50 CH: - Nguyên tắc: Mỗi vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus có khả năng lên men carbon hydrat khác nhau. Môi trường API 50 CHL chứa chất dinh dưỡng thích hợp và chất chỉ thị tía bromocresol. Mỗi giếng của kit API 50 CH chứa một loại carbon hydrat khác nhau. Nếu vi sinh vật lên men carbon hydrat trong giếng thì sinh acid lactic và làm giảm pH môi trường, kết quả là làm đổi màu của môi trường. - Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 0,048M vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 0,18M vừa đủ đến vạch, trộn đều. Độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 2 khi đo ở bước sóng 625nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18M làm mẫu trắng, phải nằm trong khoảng 0,32 - 0,40. Độ đục chuẩn chỉ dùng trong vòng 3 tháng kể từ ngày pha. - Hỗn dịch gốc: Li tâm hỗn dịch vi sinh vật nuôi cấy trong 24 giờ trong môi trường MRS lỏng như đã mô tả ở trên với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng cách thêm 5ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vào, đồng nhất hóa bằng máy lắc. Tiếp tục li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch và thu sinh khối. Thêm 1ml nước cất vô trùng, phân tán đều sinh khối bằng máy lắc. - Môi trường API 50 CHL (BioMérieux, Pháp): Công thức:
Polypepton 10,0g Cao nấm men 5,0g Tween 80 1,0ml Dikali hydrophosphat 2,0g Natri acetat 5,0g Diamoni citrat 2,0g Magie sulfat 0,20g Mangan sulfat 0,05g Bromocresol tía 0,17g Nước cất vừa đủ 1.000ml pH sau tiệt trùng 6,7-7,1 - Tiến hành: Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 5ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 2 (so sánh bằng mắt thường). Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên. Cho vào 10ml môi trường API 50 CHL số giọt hỗn dịch gốc gấp đôi số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Nhỏ khoảng 20µl môi trường API 50 CHL đã cấy vi sinh vật vào các giếng của kit, bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 49, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng. Sau đó nhỏ dung dịch dầu parafin vô trùng lên trên bề mặt giếng và ủ ở 37±1°C. Đọc kết quả sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. - Cách đọc kết quả: Giếng âm tính nếu có màu tím giống giếng chứng âm tính số 0. Giếng dương tính nếu môi trường trong giếng chuyển từ màu tím sang màu vàng. Riêng giếng số 25, nếu môi trường chuyển từ tím sang đen là dương tính. Ghi kết quả vào phiếu theo dõi kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm. 2.3. Kim loại nặng: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 7.4.7. Dùng 1,0g chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp 3.
Dùng 2,0ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu. 2.4. Nước: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 6.6. 2.5. Định lượng: 2.5.1. Thuốc thử: Theo DĐVN III. Công thức môi trường MRS lỏng: Glucose 20g Natri acetat 5g Pepton 10g K2HPO4 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1.000ml pH 6,8-7,0 Môi trường MRS đặc = Môi trường MRS lỏng + thạch agar (25g/1.000ml môi trường). 2.5.2. Cách thử: Phương pháp pha loãng liên tục. - Chuẩn bị: Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng. Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình ra khỏi nồi hấp và phân phối môi trường lên các đĩa Petri đã rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô. Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng. Chờ thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín. Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C. - Phá hạt: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang Ca-alginat-tinh bột cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn, phân tán đồng nhất.
- Đếm số lượng tế bào: Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều. Sau đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng. Cấy trải lên mỗi đĩa Petri 0,5ml dịch trong các ống tại ba nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C. Sau 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa Petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc của các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300). - Tính kết quả: Số lượng VSV trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức: × + × + × = × × Trong đó: X: số VSV có trong 1g hạt. n An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10 . m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g). 2.6. Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 10.7. 3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN Nguyên liệu được đóng gói kín, ghi nhãn đầy đủ và bảo quản ở 4°C.