›

Khóa luận Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 - Acetat trong dược liệu Trạch tả (Alisma plantago - aquatica) trồng tại Việt Nam

pdf 71 trang thiennha21 18/04/2022 3000
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 - Acetat trong dược liệu Trạch tả (Alisma plantago - aquatica) trồng tại Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_phuong_phap_dinh_tinh_va_dinh_luong_aliso.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 - Acetat trong dược liệu Trạch tả (Alisma plantago - aquatica) trồng tại Việt Nam

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐỖ THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐỖ THỊ THU TRANG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ALISOL A & ALISOL B 23 – ACETAT TRONG DƢỢC LIỆU TR ẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica) TRỒNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Phƣơng 2. Ths. Nguyễn Thúc Thu Hƣơng Hà Nội 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và Ths. Nguyễn Thúc Thu Hƣơng (Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, ĐHQGHN) là những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và anh Lê Ngọc Duy – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018 Sinh viên Đỗ Thị Thu Trang @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.3. Bộ phận dùng 3 1.1.4. Thành phần hóa học. 3 1.1.5. Một số tác dụng dược lý 7 1.2. Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat 9 1.2.1. Tổng quan về alisol A 9 1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat 11 1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả 13 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 13 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước 14 1.3.3. Tiêu chuẩn về dược liệu Trạch tả trong một số Dược điển 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. 16 2.1.2. Hóa chất và dung môi 17 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu 17 2.2. Nội dung nghiên cứu. 17 2.2.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng. 17 2.2.2. Định lượng AA bằng HPLC. 17 2.2.3. Phân tích mẫu thực 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng. 18 2.3.2. Định lượng AA bằng HPLC 19 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. 2.3.3. Phân tích mẫu thực 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Định tính AA và AB23 bằng TLC 23 3.1.1. Định tính AB23 23 3.1.2. Định tính AA 24 3.1.3. Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng 25 3.2. Định lượng AA bằng HPLC 27 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh 27 3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28 3.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng 30 3.3. Ứng dụng phương pháp 35 3.4. Bàn luận 35 3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Trạch tả ở Việt Nam 35 3.4.2. Xây dựng phương pháp định tính 36 3.4.4. Phương pháp định lượng 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tên tiếng Việt tắt AA Alisol A Alisol A ACN Acetonitrile Acetonitril AB23 Alisol B 23 - acetate Alisol B 23 - acetat Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà Hóa AOAC Chemists phân tích EtOH Ethanol Ethanol High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC chromatography cao kl/kl Khối lượng/ khối lượng LOD Limid of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limid of Qualification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectrometry Phổ khối RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S/N Signal/Noise Tín hiệu/nhiễu đường nền STT Số thứ tự TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng UV- Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại - khả kiến VIS v/v Volume/volume Thể tích/thể tích @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định 13 lượng AA và AB23 trong Trạch tả 2 Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển 14 Hồng Kông 3 Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả 16 4 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28 5 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 29 6 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết 29 7 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 31 8 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích 32 pic của AA 9 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại 33 10 Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 34 11 Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu 35 Trạch tả @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ Trang 1 Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả 2 2 Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả 3 3 Hình 1.3 Công thức một số triterpenoid trong thân 4 rễ Trạch tả 4 Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân 5 rễ Trạch tả 5 Hình 1. 5 Công thức một số sequiterpenoid trong 6 thân rễ Trạch tả 6 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA 9 7 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23 11 8 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại 16 Viện Dược liệu 9 Hình 3.1. Khảo sát định tính AB23 23 10 Hình 3.2 Khảo sát định tính AA 24 11 Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu 26 Trạch tả 12 Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số 26 mẫu Trạch tả 13 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động 28 14 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 30 15 Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của 31 phương pháp HPLC - UV 16 Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD 32 17 Hình 3.9 Đường chuẩn của AA 33 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., tên đồng danh (Alisma plantago – aquatica). Thuộc họ Trạch tả Alismataceae. Bộ phận dùng làm thuốc là thân rễ khôn đã cạo sạch vỏ. Trạch tả là một trong những vị thuốc quý đã được sử dụng lâu đời trong nền Y học cổ truyền Việt Nam và Trung Hoa với các tác dụng: lợi tiểu, hạ mỡ máu, tăng cường miễn dịch, kháng viêm, giảm đường huyết Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong Trạch tả là các hợp chất triterpenoids, trong đó có alisol A và alisol B 23 - acetat. AB23 đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng Alisol A ngoài hướng tác dụng chủ yếu trên tế bào viêm gan còn có tác dụng khác như kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch Ở Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả thường được sử dụng theo Dược điển Việt Nam IV, tuy nhiên các tiêu chuẩn còn hạn chế, chưa đáp ứng được yêu cầu đánh giá nên chất lượng dược liệu Trạch tả trên thị trường chưa được đảm bảo. Các nghiên cứu về phân tích thành phần hóa học trên thế giới hầu hết đều sử dụng alisol B 23 - acetat làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả. Tuy nhiên, ngoài alisol B 23 - acetat thì alisol A cũng chiếm hàm lượng lớn, có nhiều tác dụng quý với tiềm năng nghiên cứu, phát triển để ứng dụng trong điều trị. Vì vậy, alisol A cũng là một thành phần quan trọng, có thể sử dụng làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả. Từ những thực tiễn trên, nhằm xây dựng một phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính và định lƣợng alisol A và alisol B 23 - acetat trong dƣợc liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng tại Việt Nam” với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 – acetat trong dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam. - Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu Trạch tả. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  10. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) 1.1.1. Tên khoa học Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ Alismataceae, chi Alisma, có tên khoa học đồng nghĩa khác là Alisma plantago – aquatica. Ở Việt Nam, Trạch tả còn được gọi là thủy đề, mã đề nước [4]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, cao 40-50 cm. Thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, nạc, màu trắng, lá có cuống dài, bẹ to mọc ốp vào nhau, xòe ra như hình hoa thị, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, mép nguyên lượn sóng, gân lá 5-7 hình cung. Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài có khi đến 1m thành chùy có nhiều vòng hoa xếp thành tầng nhỏ dần về phía ngọn, mỗi tầng phân nhánh thành những chùy nhỏ; hoa lưỡng tính, màu trắng hay hồng, đài có 3 răng màu lục, tồn tại đến khi thành quả; tràng hoa 3 cánh có 1 cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm; nhị 6 – 9, dẹt, bầu nhiều ô xếp thành một vòng, mỗi ô có một noãn, vòi nhụy mảnh dễ rụng. Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại. Mùa hoa quả: tháng 10 – 12. Chi Alisma L. có khoảng 10 loài, phân bố rải rác từ vùng nhiệt đới đến vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm. Trạch tả có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam Hiện đã biết có hai loài được dùng làm thuốc là Trạch tả (A. plantago – aquatica L.) và loài A. canaliculatum. Ở Việt Nam, Trạch tả chỉ thấy trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương, Hưng Yên [4]. Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả [57,58] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. 1.1.3. Bộ phận dùng Dược liệu Trạch tả là thân rễ của cây Trạch tả: Thân rễ thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng. Loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài và rửa sạch, phơi hay sấy khô. Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]. Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56] 1.1.4. Thành phần hóa học. Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ. Theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây, các terpenoid được coi là thành phần chính trong Trạch tả [17]. Với hợp chất đặc trưng là triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat). Ngoài ra, Trạch tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa. Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả còn ít. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. 1.1.4.1. Các triterpenoid Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong rễ Trạch tả. Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc. Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả [30]. Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31]. Alisol O (7) và alisol P (8) được phân lập năm 2008 [53]. Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]. Hợp chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 (1) AA OH OH OH OH H O (2) alisol A 24 – acetat OH OH OH OH O O (5) alisol E OH OH OH OH H O Hợp chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 (3) alisol B O H OH H H OH (4) AB23 O H OH H H OAc (6) alisol C 23 – acetat O H OH H O OAc (7) alisol O (8) alisol P (9) alisol Q 23 – acetat Hình 1.3 Công thức một số triterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.2. Các diterpenoid @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định. Năm 1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi Nakajima và cộng sự [32]. Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ Trạch tả [13]. (10) kaurane-2,12-dione (11) oriediterpenol (12) oriediterpenoside Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.3. Các sequiterpenoid Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm: guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane. Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]. Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D (16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B (18), C, D) [45] [46]. Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol (20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32]. Năm 2001, orientalol E (21) thuộc nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. (13) alismol (14,17,18,19) Hợp chất R1 R2 R3 R4 (14) Alismoxide CH3 OH OH CH3 (17) Orientalol A OH OH OH CH3 (18) Sulfoorientalol B HSO3 OH OH CH3 (19) 10-O-methyl-alismoxit OCH3 OH OH OCH3 H ợp chất (15) Germaraerane C (16) Germaraerane D (20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol (21) orientalol E Hình 1. 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.4. Các hợp chất khác Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein, calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24]. Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39]. Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]. Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như: dulcitol, daucosterol [44], alismin [36]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. 1.1.5. Một số tác dụng dƣợc lý  Lợi tiểu Trạch tả đã được sử dụng lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa với mục đích điều trị thiểu niệu. Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết EtOH Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg làm tăng đáng kể lượng nước tiểu nhưng thấp hơn hydroclothiazid [40,41]. Nghiên cứu trên chuột Sprague- Dawley cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg) nhưng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại làm giảm đáng kể lượng nước tiểu [9]. Tương tự, khi khảo sát với các dịch chiết khác, cho thấy: Dịch chiết n- butanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) làm tăng lượng nước tiểu. Dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800 mg/kg) làm giảm lượng nước tiểu [7]. Điều đó cho thấy tác động sinh học trên thận của các dịch chiết Trạch tả ở các hàm lượng khác nhau là khác nhau, nên liều lượng sử dụng cần được chú ý nhiều hơn trong các ứng dụng lâm sàng. Gần đây, nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2017) nhằm đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu. Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần thích hợp nhất trong hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate (7.2: 0.6: 2.8: 3.0: 6.4) [52].  Hạ Lipid máu. Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley cho thấy tác dụng hạ lipid máu khi dùng alisol A 24-acetat liều 425 mg/kg [16]. Nghiên cứu gần đây trên chuột tăng lipid máu cho thấy Trạch tả liều 2,26 g/kg/ngày làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, nhưng làm tăng nồng độ HDL huyết thanh. Từ đó, người ta cho rằng Trạch tả làm giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì làm tăng quá trình chuyển hóa cholesterol [10]. Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. ở liều 10 lần so với liều sử dụng trên người có ý nghĩa điều trị với chứng xơ vữa động mạch, khi làm giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL [35]. Nhìn chung, Trạch tả có thể làm giảm cholesterol trên chuột để dự phòng tăng lipid máu. Tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế để ứng dụng trong điều trị lâm sàng.  Hạ đƣờng huyết. Từ lâu đời, Trạch tả đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại protostane có hoạt tính hạ đường huyết thông qua cơ chế ức chế hoạt động α- glucosidase và thúc đẩy sự hấp thu glucose, mà không làm tăng adipogenesis như thiazolidinediones [23]. Tuy nhiên, các thử nghiệm mới được thực hiện trên in vitro và cần được nghiên cứu sâu hơn trên cơ thể người để ứng dụng trong lâm sàng.  Ức chế hình thành sỏi thận Tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận đã được chứng minh bằng các nghiên cứu dược lý hiện đại trên chuột. Nghiên cứu cho thấy khi cho một nhóm chuột được điều trị trong 4 tuần với 0,5 mL/kg triterpenoids thì hàm lượng canxi trong mô thận, lượng canxi bài tiết trong nước tiểu 24h, creatinin huyết thanh và nồng độ ure trong máu giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng [6,29]. Nghiên cứu bởi Cao và cộng sự cũng cho thấy, khi sử dụng 1 mL/ngày các thành phần có hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm giảm sự hình thành canxi oxalate ở thận [5].  Tăng cƣờng miễn dịch Tác động của Trạch tả trên hệ miễn dịch đã được đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol Trạch tả liều 50 mg/kg, 200 mg/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus. Những kết quả chỉ ra rằng dịch chiết Trạch tả có ảnh hưởng trên các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III [20]. Nghiên cứu bởi Lee và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết EtOH 70% của Trạch tả ức chế đáng kể 5 – lipoxygenase, chất xúc tác quá trình sản xuất leukotriene từ bạch cầu ưa base ở chuột và sự giải phóng β-hexosaminidase @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. bởi các tế bào kháng nguyên RBL-2H3. Nó cũng làm suy yếu phản ứng quá mẫn muộn ở chuột [21].  Chống viêm Hoạt động chống viêm của Trạch tả mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây. Khi cho chuột uống dịch chiết Trạch tả liều 0,3 g/kg hoặc 1,2 g/kg trong 14 ngày, sau đó gây tồn thương phổi bằng cách tiêm lipopolysaccharide (0,01 g/kg). Nhận thấy có sự cải thiện tổn thương phổi cấp đáng kể do tác động ức chế sự xâm nhập của bạch cầu trung tính, ức chế sự biểu hiện gen COX – 2, IL – 1B [14]. Nghiên cứu khác bởi Kim và cộng sự (2013) cũng cho kết quả, chiết xuất Trạch tả giúp tăng tỷ lệ sống sót ở chuột ngay cả với liều độc lipopolysaccharide [19].  Chống khối u Trong nghiên cứu của Fong và cộng sự (2007) cho thấy tác dụng ức chế hiệp đồng tăng lên khi kết hợp dịch chiết Trạch tả 25 mg/mL với thuốc chống ung thư: actinomycin D, puromycin, paclitaxel, vinblastine và doxorubicin, trên quá trình biểu hiện P-glycoprotein [12]. AB23 được coi như ứng cử viên tiềm năng cho việc đảo ngược hiện tượng đa kháng thuốc trên bệnh nhân ung thư [41]. 1.2. Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat 1.2.1. Tổng quan về alisol A 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA Công thức phân tử: C30H50O5 Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy – 4,4,8,10,14 – pentamethyl – 17 – [(2R, 4S, 5R) – 4,5,6 – trihydroxy – 6 – @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one. Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 910C. - Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol. 1.2.1.2. Tác dụng dược lý.  Chống virus viêm gan B. Nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra một số dẫn xuất tiềm năng chống lại HBV. 40 dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát trong ảnh hưởng chống virus viêm gan B in vitro. Và thu được 14 chất tiềm năng [50]. Hợp chất 6a cho hoạt tính cao chống lại sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt (IC50= 0,024 mM), kháng nguyên HBV e (IC50=0,028 mM) (SIHBsAg >108, SIHBeAg > 93) [49]. AA 6a Thử nghiệm khác trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao chống lại sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV với giá trị IC50 tương ứng là 0,0048, 0,0044, 0,014 mM, kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng 0,011, 0,012, 0,018 mM; SIHBsAg > 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156. Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F=40,9%) [51]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. A1: R = Ac A23: R = A24: R =  Kháng khuẩn. Nghiên cứu gần đây bởi Ma và cộng sự (2016) cho thấy AA có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus với giá trị MIC là 12,5-100mg/mL [25].  Tăng cƣờng miễn dịch. Nghiên cứu đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 cho thấy AA hàm lượng 0,05mmol/kg, 0,2mmol/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus [20]. 1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat 1.2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23 Công thức phân tử: C32H50O5 Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3- [(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo- 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl] acetate. Tên thông thường: alisol B 23 - acetat Tính chất: Dạng bột, màu trắng. Trọng lượng phân tử: 514,747 g/mol. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. 1.2.2.2. Một số tác dụng dƣợc lý.  Trên thận. Nghiên cứu bởi Chen và cộng sự cho thấy trên những bệnh nhân thận mãn tính có sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/ -catein dẫn đến tổn thương các tế bào biểu mô ống thận, đã được cải thiện khi sử dụng AB23 [8].  Chống viêm gan. Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột. NASH được gây ra bằng cách cho chuột ăn chế độ thiếu methionine và choline trong 4 tuần. Sau đó mẫu máu và gan được thu thập. Kết quả chỉ ra khi điều trị với AB23 làm giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó làm giảm nguy cơ viêm, xơ gan [28]. Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng bảo vệ của AB23 chống lại độc tính gan và ứ mật gây ra bởi 17α-ethinylestradiol (EE). AB23 làm giảm tổng hợp acid mật thông qua việc ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1, làm tăng chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1 [26]. AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17].  Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng. Năm 2016, Zhang và cộng sự đã tiến hành xét nghiệm MTT cùng với việc phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ung thư buồng trứng sau khi điều trị với AB23. Kết quả cho thấy AB23 ức chế đáng kể biểu hiện của cả ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, giảm mức độ biểu hiện của các protein CDK4, CDK6 và cyclin D, ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1. AB23 ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư buồng trứng [48].  Các tác dụng khác: Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21], ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian P- glycoprotein [41] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. 1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng AA và AB23 trong Trạch tả 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong Trạch tả TLTK Đối tƣợng phân tích Điều kiện phân tích [55] AA, alisol A 24- - Dung môi chiết: MeOH acetate và AB23 - Phương pháp chiết: Siêu âm - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 × 250mm; 5µm ) + Pha động: ACN:W (65:35) + Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút + Nhiệt độ cột: 35OC + Thể tích tiêm mẫu: 10µL [54] Alisol A 24-acetate - Dung môi chiết: ACN và AB23 - Phương pháp chiết: Siêu âm - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 × 250mm; 5µm ) + Pha động: ACN:W (65:35) + Bước sóng phát hiện: 208 nm + Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút + Nhiệt độ cột: 25OC [22] AB23 - Dung môi chiết: ACN - Phương pháp chiết: Siêu âm - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 × 250mm; 5µm ) + Pha động: ACN:W (75:25) + Bước sóng phát hiện: 215 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. 1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Trạch tả còn rất ít. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập và xác định được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]. 1.3.3. Tiêu chuẩn về dƣợc liệu Trạch tả trong một số Dƣợc điển Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam Dược điển Trung Quốc (2015) quy định sử dụng HPLC để định lượng AB23 trong thân rễ Trạch tả. Quy trình xử lý mẫu như sau: 0,5 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 25 ml ACN trong 30 phút. Hệ dung môi pha động sử dụng là ACN:W (73:27, v/v), detector UV ở bước sóng 208nm, cột C18. Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23 tính theo mẫu khô kiệt [9]. Dược điển Hồng Kông cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong 30 phút. Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Pha động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải: Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông Thời gian W ACN 0-10 100 0 10-45 100 - 0 0 - 100 45-60 0 100 Dược điển Hồng Kông cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082% alisol B monoacetat [38]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Trong chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV), chưa có quy định về chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính, chỉ có các quy định về các tiêu chí thông thường: độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid. Vì vậy, chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV) chưa đánh giá chính xác được chất lượng dược liệu Trạch tả Việt Nam cũng như mẫu nhập khẩu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 3/2018. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả tại một số cơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã xây dựng. Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu 1 M1 Vũ Thị Bình 30 Lãn Ông 2 M2 Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông 3 M3 Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông 4 M4 Tú Anh 60 Lãn Ông 5 M5 Phan Thị Tý 63A Lãn Ông 6 M6 Hòa Hưng 69A Lãn Ông 7 M7 Ninh Bình @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. 2.1.2. Hóa chất và dung môi Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%. Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%. Các dung môi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết của hãng Merck. Các dung môi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết phân tích. 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Cân phân tích (Sartorius, BP-221S). Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M). Tủ sấy (Memmert, ULM 500). Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45). Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15- LC). Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5). Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu): Bơm LC- 20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL- 20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Shimadzu. Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm. 2.2. Nội dung nghiên cứu. 2.2.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng. - Khảo sát hệ dung môi pha động. 2.2.2. Định lƣợng AA bằng HPLC. 2.2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng. - Khảo sát pha động. - Khảo sát quy trình xử lý mẫu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. + Dung môi chiết + Tỷ lệ dung môi chiết. + Thời gian chiết. 2.2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. - Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp. - Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn. - Tính thích hợp hệ thống. - Độ lặp lại. - Độ đúng. 2.2.3. Phân tích mẫu thực Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính AA và AB23; định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng.  Chuẩn bị mẫu: Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với 30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng [38]. Dung dịch đối chiếu: - Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH. - Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH.  Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254. - Pha động: Để tìm được hệ dung môi phù hợp, cho các vết tách biệt nhau trên bản mỏng và Rf của AA và AB23 trong khoảng 0,2 – 0,8. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên các hệ sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. + Định tính AA: Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1) Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1) Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) + Định tính AB23: Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1) Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1) - Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol. 2.3.2. Định lƣợng AA bằng HPLC 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử: Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm chính xác khoảng 25 ml EtOH. Đem siêu âm trong 30 phút. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm. Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc AA bằng cách cân chính xác khoảng 5 mg chuẩn AA, hòa tan trong chính xác khoảng 5 ml MeOH được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn trung gian có khoảng nồng độ thích hợp. 2.3.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải với pha động gồm ACN (kênh A) phối hợp với H2O (kênh B) theo các tỷ lệ khác nhau. Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (RS) và hệ số kéo đuôi của pic (AS). RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau. 2.3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu. - Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là EtOH, hỗn hợp MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. - Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết: Từ dung môi chiết phù hợp, tiến hành chiết với các thể tích dung môi khác nhau để lựa chọn được thể tích chiết tối ưu. - Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút, 90 phút. 2.3.2.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.  Tính chọn lọc: Tính chọn lọc: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn và mẫu phân tích thêm chuẩn. Pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn với các pic tạp. Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng với chương trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic. Thời gian lưu AA của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng phải tương đương nhau. Pic AA trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu.  Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu, có ý nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3. Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10. Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích. N: Nhiễu đường nền.  Khoảng tuyến tính: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích. Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ. Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích. Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2. Theo đó 0,99 ≤ R2≤ 1. Tính thích hợp hệ thống: Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích pic của AA có RSD ≤ 2%.  Độ lặp lại (độ chụm): Độ lặp lại (độ chụm): Là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%). Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 3,7 đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu ≥ 0,1%. RSD (%) = .100 ̅ ∑ ̅ SD = √ Trong đó: : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. ̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. : Số lần thử nghiệm.  Độ đúng: Độ đúng: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của các kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận đúng. Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết. Thêm vào mẫu Trạch tả đã được xác định hàm lượng AA một lượng chính xác chất chuẩn (2 mức thêm chuẩn) sao cho tổng nồng độ của AA trong mẫu thêm chuẩn nằm ở ba mức thấp, trung bình và cao trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độ thu hồi được tính theo công thức: R(%) = .100% Trong đó: R: Độ thu hồi (%). Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/mL). Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/mL). Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (µg/mL). Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,1 – 1% là 95 – 105% [3]. 2.3.3. Phân tích mẫu thực Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng AA trong mẫu Trạch tả. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Định tính AA và AB23 bằng TLC  Chuẩn bị mẫu: mẫu thử và mẫu đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.3.1. Ký hiệu: T: Mẫu thử C: Mẫu đối chiếu AA C’: Mẫu đối chiếu AB23  Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch thử, dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai, để khô bản mỏng ngoài không khí rồi phun dung dịch thuốc thử, sấy bản mỏng ở 105 oC trong vòng 5 phút. Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử. 3.1.1. Định tính AB23  Khảo sát hệ dung môi pha động: Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động: Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1) Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1) Kết quả: Sắc ký đồ định tính AB23 trong Trạch tả được trình bày như hình 3.1. Hình 3.1. Khảo sát định tính AB23 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366. Quan sát dưới ánh sáng thường. Nhận xét: Kết quả định tính TLC cho thấy với 3 hệ dung môi khảo sát chất AB23 cho vết có giá trị Rf nằm trong khoảng 0,16 – 0,6. Tuy nhiên không thấy vết AB23 tương ứng (cùng giá trị Rf và cùng mầu sắc với vết AB23 chuẩn) xuất hiện trong mẫu thử. Điều này chứng tỏ các mẫu Trạch tả nghiên cứu không có thành phần AB23. Chúng tôi lựa chọn hệ dung môi A để định tính thành phần AB23 trong các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường. 3.1.2. Định tính AA  Khảo sát hệ dung môi pha động: Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động: Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1) Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1) Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) Kết quả: Sắc ký đồ định tính AA trong Trạch tả được trình bày như hình 3.2. Hình 3.2 Khảo sát định tính AA Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366. Quan sát dưới ánh sáng thường. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. Nhận xét: Trong các hệ dung môi khảo sát, nhận thấy hệ dung môi B cho Rf của AA trong khoảng 0,4; vết tách biệt khỏi các vết khác. Vì vậy chúng tôi chọn hệ dung môi pha động hexan: aceton (1,5:1) (v/v) để triển khai sắc ký.  Kết luận: Sau quá trình khảo sát và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định tính AB23 và AA bằng sắc ký lớp mỏng theo các điều kiện dưới đây: - Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck). - Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 1 mg chất chuẩn AB23, AA tương ứng hòa tan trong khoảng 2 ml methanol. - Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với 30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng. - Dung môi khai triển: Định tính AB23: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v) Định tính AA: hexan: aceton (1,5:1) (v/v) - Cách tiến hành: Đưa lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch thử và 5 μl dung dịch chất đối chiếu. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí ở nhiệt độ phòng và phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 105 oC trong vài phút. Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 và ánh sáng thường. Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết đạt được trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu. 3.1.3. Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi đã tiến hành định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường theo phương pháp đã xây dựng trong mục 3.1.1. và 3.1.2. và thu được kết quả trong hình 3.3 và 3.4. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu Trạch tả Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366 Quan sát dưới ánh sáng thường - M1 – M7: Các mẫu thử dược liệu Trạch tả, lần lượt từ M1 – M7. - C: Mẫu chất đối chiếu AB23. - C’: Mẫu chất đối chiếu AA. Nhận xét: Trên sắc ký đồ của các mẫu M1 – M7 có vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AA. Trong khi đó, không thấy xuất hiện vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AB23. Như vậy, có thể tạm kết luận sơ bộ các mẫu dược liệu Trạch tả trồng và thu thập trên thị trường ở Việt Nam không có hoặc chứa rất ít AB23. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. 3.2. Định lƣợng AA bằng HPLC Từ kết quả thu được trong mục 3.1.3. Nhận thấy có thể lựa chọn alisol A làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả. Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng alisol A trong dược liệu Trạch tả. 3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [22,54,55] để định lượng AA trong Trạch tả, cột C18 thường được sử dung. Để phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện có chúng tôi sử dụng cột Eclipse XDB-C18 (4,6mm x 250nm, 5µm). 3.2.2. Khảo sát hệ dung môi pha động. Một số điều kiện sắc ký cố định: - Cột Elipse XDB – C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) - Pha động: Acetonitril (ACN) và nước (H2O) - Bước sóng phát hiện: 210 nm - Tốc độ dòng: 1 ml/ phút - Nhiệt độ cột: 25 oC - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Tiến hành khảo sát pha động là hệ dung môi ACN : H2O và thay đổi tỷ lệ giữa 2 thành phần theo 3 chương trình dung môi: - Chương trình dung môi 1: ACN : H2O (80:20) - Chương trình dung môi 2: ACN : H2O (70:30) - Chương trình dung môi 3: ACN : H2O (60:40) Kết quả thu được trong hình 3.5. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động Với chương trình dung môi 1 và 2 ta thấy AA được rửa giải sớm (tR = 5,045 và 6,508). Với chương trình dung môi 2, pic AA rửa giải muộn hơn (tR = 9,676) và đã tách hoàn toàn khỏi các pic khác, pic gọn, cân đối với hệ số kéo đuôi AS = 1,262. Độ phân giải của pic AA với các pic liền kề RS > 2,5. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chương trình dung môi 3 cho phương pháp định lượng AA trong Trạch tả. 3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.3.1. Khảo sát dung môi chiết Trên cùng một nền mẫu phân tích, chúng tôi tiến hành chiết theo quy trình dự kiến. Sử dụng dung môi chiết là EtOH và MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau. Với mỗi loại dung môi, phân tích lặp lại 3 lần bằng HPLC ở điều kiện đã xây dựng như trên, tính kết quả trung bình. Thu được kết quả như sau: Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết Diện tích pic Hàm lƣợng AA % Dung môi (g) (mAU.s) (kl/kl) MeOH 1,0068 1592957 0,352 EtOH 1,0055 1524386 0,338 MeOH 80% 1,0044 1781743 0,395 MeOH 60% 1,0304 1820019 0,393 MeOH 40% 1,0023 1564096 0,347 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Nhận xét: Khi sử dụng hỗn hợp dung môi chiết là MeOH 80% (v/v), hàm lượng AA thu được là cao nhất. Do đó chúng tôi sử dụng dung môi này để chiết AA khỏi nền mẫu phân tích. 3.2.3.2. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết. Thực hiện chiết siêu âm theo quy trình trong mục 2.3.2.1. Với sự thay đổi thể tích dung môi chiết MeOH 80% ở ba mức: 25ml, 50ml, 100ml. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Thể tích dung Diện tích pic Hàm lƣợng AA % (g) môi chiết (ml) (mAU.s) (kl/kl) 25 1,0098 1680383 0,370 50 1,0147 811828 0,356 100 1,0218 410738 0,358 Với kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết như trên, chúng tôi nhận thấy chiết với 25 ml MeOH 80% cho hàm lượng AA cao nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thể tích dung môi chiết cho AA là 25 ml. 3.2.3.3. Khảo sát thời gian chiết Trên cùng một nền mẫu, tiến hành chiết siêu âm với 25ml MeOH 80% với thời gian chiết thay đổi: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút và 90 phút. Quy trình tương tự như mục 2.3.2.1. Phân tích lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết Diện tích pic Hàm lƣợng AA % (g) (phút) (mAU.s) (kl/kl) 10 1,0006 1569966 0,349 30 1,0385 1767704 0,379 40 1,0251 1772650 0,385 60 1,0523 1827462 0,387 90 1,0153 1788354 0,392 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. Nhận xét: Với kết quả khảo sát thời gian chiết như trên, chúng tôi nhận thấy hàm lượng AA đo được trong mẫu tăng khi thời gian chiết mẫu tăng. Tuy nhiên, khi tăng thời gian chiết mẫu lên 40 phút thì hàm lượng AA thay đổi không đáng kể. Do đó chúng tôi lựa chọn quy trình chiết siêu âm 30 phút để chiết AA ra khỏi nền mẫu. 3.2.3.4. Quy trình xử lý mẫu đƣợc lựa chọn Dựa vào kết quả khảo sát dung môi chiết, tỷ lệ dung môi chiết và thời gian chiết, chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau đây cho phương pháp định lượng AA trong thân rễ Trạch tả. Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm chính xác 25 ml MeOH : H2O (80:20, v/v) Siêu âm 30 phút Lọc Dịch chiết Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 3.2.4. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng 3.2.4.1. Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích 3 mẫu: mẫu trắng, dung dịch AA chuẩn, dung dịch mẫu thử với chương trình khảo sát trong mục 3.2.2 ta thu được kết quả đánh giá bằng sắc ký đồ tương ứng như hình 3.7. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp Trên sắc ký đồ cho thấy, thời gian lưu của AA ở mẫu thử và mẫu chuẩn là tương đương nhau, pic AA không bị trùng với các pic khác chứng tỏ phương pháp và hệ thông sắc ký có độ đặc hiệu cao. 3.2.4.2. Tính thích hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống được đánh giá theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.2.4. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn AA có nồng độ 104,2 µg/ml. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 9,678 1283269 2 9,679 1280012 3 9,675 1278786 4 9,683 1279265 5 9,681 1277919 6 9,676 1266351 Trung bình 9,679 1277600 RSD (%) 0,028 0,415 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc lần lượt là 0,028% (< 2%) và 0,415% (< 2%), cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định của phép phân tích định lượng AA. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. 3.2.4.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Phân tích mẫu thử đã được xác định nồng độ AA, sau đó pha loãng dần đến khi trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tại thời gian lưu của AA xác định được tỷ lệ S/N = 3 – 4. Từ đó tìm được LOD. Mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Datafile Name:LOD-0.1667-20ul-002.lcd Sample Name:thu Sample ID:01 mAU -0.050 210nm,4nm -0.075 -0.100 -0.125 -0.150 -0.175 /2154 -0.200 -0.225 -0.250 -0.275 -0.300 -0.325 -0.350 -0.375 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD Tại nồng độ 0,17 µg/ml, tỷ lệ S/N = 3 – 4. Với kết quả này chúng tôi xác định: Giới hạn phát hiện: LOD = 0,17 µg/ml. Giới hạn định lượng: LOQ = LOD x 3,3 = 0,51 µg/ml. 3.2.4.4. Xây dựng đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy tuyến tính Chuẩn bị một dãy dung dịch AA chuẩn có nồng độ tăng dần từ 4,17 µg/ml đến 416,8 µg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện đã khảo sát trong mục 3.2.2. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ AA được trình bày trong bảng 3.5. Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AA Nồng độ Diện tích pic (µg/ml) (mAU.s) 416,80 5215845 208,40 2604167 104,20 1282397 41,68 520244 20,84 255642 10,42 124380 4,17 50459 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. 6000000 5000000 y = 12779x - 6729.6 4000000 R² = 1 3000000 2000000 1000000 Diện tích pic (mAU.s) pic tích Diện 0 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 Nồng độ AA (µg/ml) Hình 3.9 Đường chuẩn của AA Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 12779x – 6729,6 (R² = 1) Ký hiệu: x: nồng độ alisol A (µg/ml) y: diện tích pic (mAU.s) Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R. Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.7 có R2 = 1 > 0,99 cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng AA. 3.2.4.5. Độ lặp lại Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1,0 g dược liệu. Xử lý mẫu giống như mục 3.2.3.4. để thu được dịch tiêm sắc ký. Tiến hành làm lặp lại 6 lần trên mẫu dược liệu số 3. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại Lần Độ ẩm(%) Diện tích pic Hàm lƣợng (mAU.s) AA (%) 1 1,0035 1703356 0,373 2 1,0089 1786034 0,389 3 1,0122 1763457 0,383 10,757 4 1,0239 1753679 0,376 5 1,0785 1831679 0,373 6 1,0133 1706688 0,370 Trung bình 0,377 RSD (%) 1,89 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. Hàm lượng trung bình của AA trong mẫu Trạch tả 3 là 0,377% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,89% < 3,7% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao. 3.2.4.6. Độ đúng Mẫu thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu nền (mẫu dược liệu 1) và thêm một lượng AA chuẩn, cho vào ống ly tâm 50 ml rồi thực hiện theo quy trình đã khảo sát. Tiến hành thêm chuẩn ở ba mức: 1,8 mg, 3,6 mg và 5,4 mg bằng cách pha một dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml rồi hút thể tích tương ứng chuẩn cho vào mẫu thử. Quy trình xử lý mẫu thực hiện như mục 3.2.3.4. Mẫu nền: cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xây dựng. Mỗi mức thêm chuẩn được làm lặp lại 4 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.7. Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp Nồng Nồng Nồng Diện tích độ Độ Nồng độ độ mẫu mẫu thêm thêm thu Trung độ thực thêm thêm chuẩn chuẩn hồi bình (µg/ml) chuẩn chuẩn (mAU.s) tìm lại (%) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 1,0009 138,92 70,6 2609934 212,07 73,15 103,6 104,3 1,0078 138,86 2621026 212,97 74,11 105,0 1,0135 141,04 2625467 213,33 72,29 102,4 1,0096 138,83 2630363 213,73 74,90 106,1 1,0679 146,14 141,1 3568567 289,96 145,56 101,9 102,6 1,0235 141,21 3489512 283,54 142,33 100,9 1,0291 141,93 3559845 289,25 147,32 104,4 1,0189 145,19 3581156 290,98 145,80 103,3 1,0202 142,75 211,7 4311834 350,35 207,61 98,1 99,1 1,0078 141,26 4328735 351,73 210,46 99,4 1,0091 139,70 4302392 349,59 209,88 99,1 1,0101 138,21 4299297 349,34 211,13 99,7 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng AA trong thân rễ Trạch tả bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có giá trị từ 99,1% - 104,3%, đáp ứng yêu cầu của AOAC (95 – 105%). Vậy phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao. 3.3. Ứng dụng phƣơng pháp Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường, mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Hàm lượng % AA trong dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức: Trong đó: C: nồng độ AA trong dung dịch mẫu thử (µg/mL). m: khối lượng mẫu dược liệu đem phân tích (g). d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%). Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu Trạch tả Tên Độ ẩm (%) Diện tích píc Hàm lƣợng trung mẫu (mAU.s) bình (kl/kl) % 1 M1 1,0039 11,074 1036639 0,229 ± 0,006 2 M2 1,0483 12,025 1556182 0,332 ± 0,005 3 M3 1,0785 13,598 1532730 0,323 ± 0,005 4 M4 1,0151 12,547 1173971 0,260 ± 0,003 5 M5 1,0982 10,968 1839687 0,369 ± 0,004 6 M6 1,0322 11,945 1156186 0,250 ± 0,006 7 M7 1,0091 10,575 1716191 0,374 ± 0,004 Với 7 mẫu định lượng cho thấy, Trạch tả được trồng tại Ninh Bình có chứa hàm lượng AA cao nhất (0,374 %). Các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường có chứa hàm lượng AA dao động 0,23 – 0,38 %. 3.4. Bàn luận 3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu Trạch tả ở Việt Nam Trạch tả là một loại dược liệu quý, được sử dụng lâu đời trong nền YHCT Trung Quốc và nước ta để điều trị một loạt các bệnh liên quan đến khó tiểu, phù, tiểu đường, viêm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. Ngày nay, do nhu cầu sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược cho mục đích chăm sóc sức khỏe ngày càng tăng cao khiến cho dược liệu Trạch tả được sử dụng với khối lượng khá lớn. Trạch tả hiện là một trong những dược liệu đang được trồng ở nhiều vùng tại Việt Nam như Ninh Bình, Hưng Yên, đặc biệt tỉnh Ninh Bình đang có dự án xây dựng chỉ dẫn địa lý cho cây trạch tả trồng tại vùng này. Tuy nhiên, phần lớn dược liệu Trạch tả trên thị trường Việt Nam chưa được kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu không đạt chất lượng, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh và gây tổn thất lớn về kinh tế. Vì vậy, công tác kiểm tra, đánh giá dược liệu Trạch tả là rất quan trọng. Trong khi đó, DĐVN IV tuy đã có chuyên luận Trạch tả nhưng chưa được viết chi tiết, chưa xây dựng phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất chính. Qua tham khảo, Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc đều sử dụng AB23 làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm dược liệu Trạch tả. Tuy nhiên, qua quá trình khảo sát nhận thấy dược liệu Trạch tả trồng và hiện có trên thị trường Việt Nam không có hoặc có rất ít hoạt chất này. Trong khi đó, AA lại có trong tất cả các mẫu nên có thể sử dụng làm ―maker‖ để kiểm soát chất lượng dược liệu Trạch tả. 3.4.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính Trên thực tế có thể sử dụng phương pháp HPLC để kết hợp định tính và định lượng AA và AB23 trong thân rễ Trạch tả. Tuy nhiên trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi chọn định tính bằng TLC, vì phương pháp TLC có ưu điểm hơn so với HPLC là rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu và thời gian phân tích, trang thiết bị đơn giản hơn. Qua đó có thể áp dụng để định tính nhanh các mẫu dược liệu trên thị trường. Phương pháp định tính mà chúng tôi xây dựng đã sử dụng hệ dung môi đơn giản và thuốc thử hiện màu nhạy, phổ biến trong nhiều phòng phân tích kiểm nghiệm ở Việt Nam. Chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu theo một quy trình dễ thực hiện và tốn ít thời gian. Kết quả sắc ký đồ thu được đã cho vết của AA và của AB23 có màu dễ nhận biết và giá trị Rf phù hợp. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. Với các điều kiện phân tích dự kiến, chúng tôi nhận thấy phương pháp đã xây dựng đáp ứng đầy đủ các yêu cầu cần thiết của một phương pháp định tính. 3.4.3. Quy trình xử lý mẫu định lƣợng Xử lý mẫu là bước đóng vai trò quan trọng trong phân tích định lượng giúp loại bỏ tạp và tách lấy chất ra khỏi dược liệu. Sau khi tham khảo một số tài liệu, căn cứ tính chất của AA cũng như khảo sát các điều kiện, chúng tôi đã lựa chọn được một quy trình xử lý mẫu mang lại hiệu suất cao và phù hợp với điều kiện hiện có. Phương pháp chiết siêu âm là một phương pháp đã được sử dụng phổ biến, đặc biệt là trong chiết xuất hoạt chất từ dược liệu do tính đơn giản và hiệu suất chiết cao. Các nghiên cứu chiết hiện có đã sử dụng một trong các dung môi: methanol, ethanol, hỗn hợp MeOH : H2O, hỗn hợp ACN : H2O. Tuy nhiên, với mục đích ứng dụng rộng rãi, phù hợp với quy mô của nhiều phòng kiểm nghiệm, và qua quá trình khảo sát, chúng tôi thấy rằng chiết siêu âm 1 lần với 25 ml MeOH 80% trong 30 phút là hợp lý về kinh tế, an toàn với môi trường và giảm được lượng dung môi sử dụng. 3.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng Sử dụng phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm như chọn điều kiện phân tích linh động, độ chọn lọc cao, độ nhạy cao, kết quả tương đối chính xác, quy trình tiến hành đơn giản. AA là hợp chất có khả năng hấp thụ tại bước sóng trong vùng tử ngoại nên có thể sử dụng detector UV-VIS để phân tích. Với các điều kiện sắc ký đã thiết lập, pha động chỉ gồm có acetonitril và nước, chương trình rửa giải đẳng dòng đơn giản, vì vậy có thể triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm của Việt Nam. Các chỉ tiêu thẩm định đã được tiến hành gồm có: tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp. Các tiêu chí thẩm định đều đạt theo yêu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. cầu của AOAC, khoảng tuyến tính rộng cho phép định lượng AA trong các đối tượng đa dạng. 3.4.5. Kết quả phân tích mẫu thân rễ Trạch tả Do chưa có tiêu chuẩn cho AA và AB23 trong dược liệu Trạch tả và đề tài mới chỉ áp dụng trên 7 mẫu thực, nên chúng tôi bước đầu kết luận các mẫu đều chứa AA và hàm lượng AA trong dược liệu Trạch tả trong khoảng 0,23% đến 0,38%. Tuy nhiên, qua thử nghiệm định tính, cả 7 mẫu đều không chứa AB23. Trong các mẫu phân tích, mẫu dược liệu Trạch tả trồng và thu hái tại Ninh Bình có hàm lượng AA cao nhất. Nguyên nhân các mẫu thân rễ Trạch tả không định tính thấy AB23 có thể là do quy trình xử lý sơ bộ mẫu không tốt hoặc do các yếu tố thuộc về giống, vùng trồng, thời gian thu hái, quá trình sơ chế bảo quản dược liệu. Để có thể đánh giá một cách khách quan hơn cần định tính, định lượng AA và AB23 trên cỡ mẫu Trạch tả lớn hơn, để kiểm soát chặt chẽ hơn nữa chất lượng các mẫu dược liệu Trạch tả đang có trên thị trường, kịp thời phát hiện được dược liệu giả, dược liệu kém chất lượng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để định tính và định lượng AA và AB23 có trong thân rễ Trạch tả, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Đã xây dựng được quy trình định tính AA và AB23 trong thân rễ Trạch tả bằng phương pháp TLC. - Xử lý mẫu theo quy trình đơn giản. - Khảo sát và tìm được các điều kiện tối ưu cho phân tích sắc ký, với các hóa chất được sử dụng rộng rãi trong phân tích. Định tính AB23: Pha động là hệ dung môi petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v). Định tính AA: Pha động là hệ dung môi hexan: aceton (1,5:1) (v/v). Thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% trong EtOH. 2. Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng AA trong thân rễ Trạch tả bằng phương pháp HPLC.  Đã khảo sát và tối ưu hóa được điều kiện sắc ký AA bằng phương pháp HPLC. Các điều kiện sắc ký bao gồm: - Pha tĩnh: Cột Eclipse XDB – C18 (4,6mm 250mm; 5µm) - Bước sóng phát hiện: 210 nm. - Tốc độ dòng: 1 ml/ phút. - Nhiệt độ cột: 25 oC - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Pha động: ACN : H2O (60:40, v/v).  Đã khảo sát và đưa ra quy trình xử lý mẫu tối ưu cho hiệu suất chiết AA cao nhất.  Đã thẩm định phương pháp với các tiêu chí đạt yêu cầu của AOAC: - Tính chọn lọc cao với AA, tính phù hợp hệ thống cao. - Xây dựng được đường chuẩn từ 4,17 μg/ml đến 416,80 μg/ml, giới hạn phát hiện 0,17 μg/ml và giới hạn định lượng 0,51 μg/ml. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  48. - Độ lặp lại có RSD < 2% và độ thu hồi trong khoảng 95 – 105%.  Đã áp dụng phương pháp để phân tích các mẫu thực. Đã định tính AA và AB23 trên 7 mẫu thân rễ Trạch tả khác nhau. Cả 7 mẫu đều cho kết quả âm tính với mẫu đối chứng AB23. Đã định lượng trên 7 mẫu thân rễ Trạch tả trên. Hàm lượng AA dao động từ 0,23 – 0,38%. Kiến nghị 1. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính và định lượng AA và AB23 trong nhiều mẫu dược liệu Trạch tả hiện có trên thị trường và nhằm tiêu chuẩn hóa dược liệu này trong dược điển. 2. Tiếp tục khảo sát và hoàn thiện thêm các điều kiện tối ưu để tăng tính chính xác của phương pháp. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  49. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ y tế (2009) "Dược điển Việt Nam IV", NXB Y học Hà Nội pp. 920. 2. Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006), "Nghiên cứu thành phần hóa học cây Trạch tả Alisma plantago - quatica L. var. orientalis Samuelsson", Tạp chí dược học - 8/2006, pp. 7-10. 3. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, el al. (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật", Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, pp. 4. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, pp. Tiếng Anh 5. Cao ZG, Wu W, et al. (2005), "Inhibition of the three constituents from Alisma orientalis on the formation of urinary calcium oxalate calculus in vitro", Chinese Journal of New Drugs, 14, pp. 166-168. 6. Cao Zheng-Guo, Liu Ji-Hong, et al. (2006), "Effect of Active Constituents of Alisma Orientalis on Bikunin Expression in a Rat Urolithiasis Model", 中國現代醫學雜誌, 16(11), pp. 1601-1605. 7. Chen Dan-Qian, Feng Ya-Long, et al. (2014), "Diuretic and anti- diuretic activities of fractions of Alismatis rhizoma", Journal of ethnopharmacology, 157, pp. 114-118. 8. Chen Lin, Chen Dan-Qian, et al. (2017), "Role of RAS/Wnt/β-catenin axis activation in the pathogenesis of podocyte injury and tubulo- interstitial nephropathy", Chemico-biological interactions, 273, pp. 56-72. 9. Chinese pharmacopoeia The (2010), "alismatis rhizoma", pp. 23 -24. 10. Dan Hong, Wu Juan, et al. (2011), "Hypolipidemic effects of Alismatis rhizome on lipid profile in mice fed high-fat diet", Saudi medical journal, 32(7), pp. 701-707. 11. Feng Ya-Long, Chen Hua, et al. (2014), "Diuretic and anti-diuretic activities of the ethanol and aqueous extracts of Alismatis rhizoma", Journal of ethnopharmacology, 154(2), pp. 386-390. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. 12. Fong W-F, Wang C, et al. (2007), "Reversal of multidrug resistance in cancer cells by Rhizoma Alismatis extract", Phytomedicine, 14(2-3), pp. 160-165. 13. Guoping Peng, Fengchang Lou (2002), "Isolation and identification of diterpenes from Alisma orientalis Juzep", Acta pharmaceutica sinica, 37(12), pp. 950-954. 14. Han Chang Woo, Kwun Min Jung, et al. (2013), "Ethanol extract of Alismatis Rhizoma reduces acute lung inflammation by suppressing NF-κB and activating Nrf2", Journal of Ethnopharmacology, 146(1), pp. 402-410. 15. Hu Xue Yan, Guo Yuan Qiang, et al. (2008), "A new triterpenoid from Alisma orientalis", Chinese Chemical Letters, 19(4), pp. 438-440. 16. IMAI YOSHIO, MATSUMURA HARUKI, et al. (1970), "Hypocholesterolemic effect of AA-24-mono-acetate and its related compounds in rats", The Japanese Journal of Pharmacology, 20(2), pp. 222-228. 17. Jiang Zhi-Yong, Zhang Xue-Mei, et al. (2006), "A new triterpene and anti-hepatitis B virus active compounds from Alisma orientalis", Planta medica, 72(10), pp. 951-954. 18. Jin Hong-Guang, Jin Qinglong, et al. (2012), "A new triterpenoid from Alisma orientale and their antibacterial effect", Archives of pharmacal research, 35(11), pp. 1919-1926. 19. Kim Kyun Ha, Kwun Min Jung, et al. (2013), "Therapeutic effect of the tuber of Alisma orientale on lipopolysaccharide-induced acute lung injury", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013, pp. 20. Kubo Michinori, Matsuda Hideaki, et al. (1997), "Studies on Alismatis rhizoma. I. Anti-allergic effects of methanol extract and six terpene components from Alismatis rhizoma (dried rhizome of Alisma orientale)", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 20(5), pp. 511-516. 21. Lee Je Hyeong, Kwon Oh Song, et al. (2012), "The rhizomes of Alisma orientale and alisol derivatives inhibit allergic response and @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. experimental atopic dermatitis", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 35(9), pp. 1581-1587. 22. Lee Sang Myung, Kang Jong Seong, et al. (2004), "Quality evaluation of alismatis rhizoma by high performance liquid chromatography", Archives of pharmacal research, 27(4), pp. 460-464. 23. Li Qin, Qu Haibin (2012), "Study on the hypoglycemic activities and metabolism of alcohol extract of Alismatis Rhizoma", Fitoterapia, 83(6), pp. 1046-1053. 24. Lining Cai, Hongshu Wang, et al. (1996), "The constituents from the rhizoma of Alisma orientalis (Sam) Juzep", Natural Product Research and Development, 8(1), pp. 5-9. 25. Ma Qingjuan, Han Li, et al. (2016), "Structures and biological activities of the triterpenoids and sesquiterpenoids from Alisma orientale", Phytochemistry, 131, pp. 150-157. 26. Meng Qiang, Chen Xinli, et al. (2015), "Protective effects of AB23via farnesoid X receptor-mediated regulation of transporters and enzymes in estrogen-induced cholestatic liver injury in mice", Pharmaceutical research, 32(11), pp. 3688-3698. 27. Meng Qiang, Chen Xinli, et al. (2014), "AB23promotes liver regeneration in mice after partial hepatectomy via activating farnesoid X receptor", Biochemical pharmacology, 92(2), pp. 289-298. 28. Meng Qiang, Duan Xing-ping, et al. (2017), "AB23protects against non-alcoholic steatohepatitis in mice via farnesoid X receptor activation", Acta Pharmacologica Sinica, 38(1), pp. 69. 29. MI Qi-wu, CAO Zheng-guo, et al. (2005), "Effects of active fraction of Alisma orientaleon osteopontin expression in renal tissue of urolithiasis model rat with calcium oxalate stone [J]", Chinese Traditional and Herbal Drugs, 12, pp. 028. 30. Murata T, Shinohara M, et al. (1968), "New triterpenes of alisma plantago-aquatica L. Var. Orientale Samuels", Tetrahedron Letters, 9(1), pp. 103-108. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. 31. Murata Tadakazu, Imai Yoshio, et al. (1970), "Biological-active triterpenes of Alismatis rhizoma. I. Isolation of the alisols", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 18(7), pp. 1347-1353. 32. Nakajima Yoshijiro, Satoh Yohko, et al. (1994), "Terpenoids of Alisma orientale rhizome and the crude drug alismatis rhizoma", Phytochemistry, 36(1), pp. 119-127. 33. Oshima Yoshiteru, Iwakawa Tsuneo, et al. (1983), "Alismol and alismoxide, sesquiterpenoids of Alisma rhizomes", Phytochemistry, 22(1), pp. 183-185. 34. Peng Guoping, Lou Fengchang (2001), "Chemical studies on Alisma orientalis Juzep", Natural Product Research and Development, 13(3), pp. 1-3. 35. Qin JG, Wang YH, et al. (2007), "Effect of Alismaceae on regulating the expression of liver basal membrane heparan sulfate proteoglycan in ApoE-knock out atherosclerosis mice", Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 4, pp. 027. 36. Shao Biao, Wang Shaoyun, et al. (2011), "A novel lectin from fresh rhizome of Alisma orientale (Sam.) Juzep", Process biochemistry, 46(8), pp. 1554-1559. 37. SHIMIZU Noriko, OHTSU Sadanori, et al. (1994), "A glucan with immunological activities from the tuber of Alisma orientale", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 17(12), pp. 1666-1668. 38. Standards The Hong Kong chinese Materia Medica (2009), Polygoni Cupsidati Radix, pp. 244-245 39. Tomoda M, Gonda R, et al. (1993), "An immunologically active polysacchardide from the tuber of Alisma orientale", Pharmacol Lett, 3(4), pp. 147. 40. ToMoDA Masashi, GONDA Ryoko, et al. (1994), "Characterization of an acidic polysaccharide having immunological activities from the tuber of Alisma orientale", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 17(5), pp. 572-576. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. 41. Wang Cheng, Zhang Jin-Xia, et al. (2004), "Reversal of P- glycoprotein-mediated multidrug resistance by Alisol B 23-acetate", Biochemical pharmacology, 68(5), pp. 843-855. 42. Wang LX, Wu QN, et al. (2008), "Basic study of diuretic active compounds in Rhizoma Alismatis", West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 23(6), pp. 670-672. 43. WU Xiao-yan, CHEN Chao, et al. (2010), "Effects of aqueous extract of rhizoma alismastis on diuretic activity and kidney medulla AQP2 expression in normal rats [J]", Journal of Clinical Medicine in Practice, 21, pp. 001. 44. Xian PENG, Li TAN, et al. (1999), "Studies on the constituents from the Rhizoma of Alisma orientalis", J of Chinese Sci, 8(3), pp. 173. 45. YOSHIKAWA Masayuki, FUKUDA Youich, et al. (1993), "Sulfoorientalols a, b, c, and d, four new biologically active sesquiterpenes, from Alismatis rhizoma", Chemical and pharmaceutical bulletin, 41(6), pp. 1194-1196. 46. YOSHIKAWA Masayuki, HATAKEYAMA Shoko, et al. (1993), "Crude drugs from aquatic plants. I. On the constituents of Alismatis Rhizoma.(1). Absolute stereostructures of alisols E 23- acetate, F, and G, three new protostane-type triterpenes from Chinese Alismatis Rhizoma", Chemical and pharmaceutical bulletin, 41(11), pp. 1948-1954. 47. Zhang C, Zhou A, et al. (2009), "Chemical constituents of Alisma orientalis and their immunosuppressive function", Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 34(8), pp. 994-998. 48. Zhang Le-Le, Xu Yu-Lian, et al. (2016), "Effects of AB23on ovarian cancer cells: G1 phase cell cycle arrest, apoptosis, migration and invasion inhibition", Phytomedicine, 23(8), pp. 800-809. 49. Zhang Quan, Jiang Zhi-Yong, et al. (2008), "Anti-HBV agents. Part 1: Synthesis of AA derivatives: A new class of hepatitis B virus @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. inhibitors", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 18(16), pp. 4647-4650. 50. Zhang Quan, Jiang Zhi-Yong, et al. (2009), "Anti-HBV agents. Part 2: Synthesis and in vitro anti-hepatitis B virus activities of AA derivatives", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 19(8), pp. 2148-2153. 51. Zhang Quan, Jiang Zhi-Yong, et al. (2009), "Anti-HBV agents. Part 3: Preliminary structure–activity relationships of tetra-acylAA derivatives as potent hepatitis B virus inhibitors", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 19(23), pp. 6659-6665. 52. Zhang Xue, Li Xiao-Yan, et al. (2017), "Diuretic activity of compatible triterpene components of Alismatis rhizoma", Molecules, 22(9), pp. 1459. 53. Zhao Ming, Xu Li-Jia, et al. (2008), "Alisolide, alisols O and P from the rhizome of Alisma orientale", Phytochemistry, 69(2), pp. 527-532. Tiếng Trung 54. 文红梅, 彭国平, et al. (1998), 泽泻药材的质量标准研究 Ⅰ—泽泻中 2 种泽泻醇的 HPLC 测定法. 55. 谢普, 毕开顺, et al. (2010), "泽泻的双波长 HPLC 指纹图谱研究", 中 草药, (10), pp. 1712-1715. Webside 56. ALISMA 57. 58. ạch_tả @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Phụ lục 5: Sắc ký đồ định lƣợng mẫu thử @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Sắc ký đồ khảo sát với dung môi chiết ethanol Dataf ile Name:EtOH-20ul-001.lcd Sample Name:Etoh Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 170 160 150 140 130 120 110 100 90 Alisol A/1524386 Alisol 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Sắc ký đồ khảo sát với dung môi chiết methanol Dataf ile Name:MeOH-20ul-001.lcd Sample Name:Meoh Sample ID:02 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 100 A/1592957 Alisol 75 50 25 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  57. Sắc ký đồ khảo sát với dung môi chiết methanol 80% Dataf ile Name:MeOH-80-20ul-001.lcd Sample Name:Meoh 80 Sample ID:03 mAU 210nm,4nm 225 200 175 150 125 Alisol A/1781743 Alisol 100 75 50 25 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Sắc ký đồ khảo sát với dung môi chiết methanol 60% Dataf ile Name:MeOH-60-20ul-001.lcd Sample Name:MeOh 60 Sample ID:04 mAU 210nm,4nm 225 200 175 150 125 Alisol A/1714439 Alisol 100 75 50 25 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  58. Sắc ký đồ khảo sát với dung môi chiết methanol 40% Dataf ile Name:MeOH-40-20ul-001.lcd Sample Name:thu Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 100 A/1564098 Alisol 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  59. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi chiết với 25ml MeOH 80% Dataf ile Name:25ml-20ul-002.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 225 210nm,4nm 200 175 150 125 Alisol A/1680383 Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi chiết với 50 ml MeOH 80% Dataf ile Name:50ml-20ul-002.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 110 100 90 80 70 60 Alisol A/811828 Alisol 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi chiết với 100ml MeOH 80% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  60. Dataf ile Name:100ml-20ul-002.lcd Sample Name:02 Sample ID:02 mAU 210nm,4nm 55 50 45 40 35 30 Alisol A/410738 Alisol 25 20 15 10 5 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Phụ lục 3: Khảo sát thời gian chiết @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  61. Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trong 10 phút Datafile Name:T10-20ul-001.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 Alisol A/1569966Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trong 30 phút Datafile Name:T30-20ul-002.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 225 200 175 150 125 Alisol A/1767704Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trong 40 phút @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  62. Datafile Name:T40-20ul-003.lcd Sample Name:02 Sample ID:02 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 Alisol A/1772650Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trong 60 phút Datafile Name:T60-20ul-004.lcd Sample Name:03 Sample ID:03 mAU 210nm,4nm 225 200 175 150 125 Alisol A/1827462Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trong 120 phút @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  63. Datafile Name:T120-20ul-005.lcd Sample Name:04 Sample ID:04 mAU 225 210nm,4nm 200 175 150 125 Alisol A/1788354Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  64. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 4.168µg/ml Dataf ile Name:alisolA-4.168-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:08 mAU 210nm,4nm 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Alisol A/50459 Alisol 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 10.42 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-10.42-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:07 mAU 210nm,4nm 13 12 11 10 9 8 7 Alisol A/124308 Alisol 6 5 4 3 2 1 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 20.84 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  65. Dataf ile Name:alisolA-20.84-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:06 mAU 27.5 210nm,4nm 25.0 22.5 20.0 17.5 15.0 Alisol A/255642 Alisol 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 41.68 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-41.68-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:05 mAU 210nm,4nm 55 50 45 40 35 30 Alisol A/520244 Alisol 25 20 15 10 5 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 104.2 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  66. Dataf ile Name:alisolA-104.2-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:04 mAU 210nm,4nm 130 120 110 100 90 80 70 Alisol A/1282397 Alisol 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 208.4 µg/ml Dataf ile Name:alisolA-208.4-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:03 mAU 210nm,4nm 275 250 225 200 175 150 Alisol A/2604167 Alisol 125 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ 416.8 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  67. Dataf ile Name:alisolA-416.8-ug-ml-20ul-001.lcd Sample Name:std Sample ID:02 mAU 210nm,4nm 550 500 450 400 350 300 Alisol A/5215845 Alisol 250 200 150 100 50 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Phụ lục 5: Sắc ký đồ định lƣợng mẫu thử @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  68. Sắc ký đồ định lượng mẫu M1 Dataf ile Name:T1-20ul-001.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 130 120 110 100 90 80 70 Alisol A/1036639 Alisol 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M2 Dataf ile Name:T2-20ul-002.lcd Sample Name:01 Sample ID:01 mAU 210nm,4nm 75 70 65 60 55 50 45 40 Alisol a/556182 Alisol 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  69. Dataf ile Name:T3-20ul-003.lcd Sample Name:02 Sample ID:02 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 100 A/1532730 Alisol 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M4 Dataf ile Name:T4-20ul-004.lcd Sample Name:03 Sample ID:03 mAU 210nm,4nm 200 175 150 125 100 A/1473971 Alisol 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  70. Dataf ile Name:T5-20ul-005.lcd Sample Name:04 Sample ID:04 mAU 210nm,4nm 110 100 90 80 70 60 Alisol a/839687 Alisol 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M6 Dataf ile Name:T6-20ul-006.lcd Sample Name:05 Sample ID:05 mAU 210nm,4nm 150 140 130 120 110 100 90 80 Alisol A/1156186 Alisol 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min Sắc ký đồ định lượng mẫu M7 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  71. Dataf ile Name:T7-20ul-007.lcd Sample Name:06 Sample ID:06 mAU 210nm,4nm 225 200 175 150 125 Alisol A/1746494 Alisol 100 75 50 25 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min @ School of Medicine and Pharmacy, VNU