Khóa luận Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

48 trang thiennha21 18/04/2022 2321

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_tac_dung_chong_ngung_tap_tieu_cau_in_vi.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y – DƯỢC LÊ THỊ THANH HOA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở, các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em trong thời gian qua, giúp em hoàn thành chương trình học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Vũ Thị Thơm, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ những ngày đầu tiên của đề tài, truyền cho em nhiều động lực và kiến thức quý báu giúp em hoàn thành khoa luận một cách tốt nhất. Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsaiet K.M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí giúp em hoàn thành nội dung nghiên cứu này. Cảm ơn Khoa xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực hiện thí nghiệm. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, đặc biệt là mẹ em đã luôn quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này. Lần đầu viết khóa luận, mặc dù rất cố gắng nhưng khó tránh được sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Thanh Hoa © School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa AA Acid arachidonic ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphat ATP Adenosin triphotphat CADP Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) CEPI Collagen Epinephrin COX-1 Cyclooxygenase 1 CT Thời gian lấp kín (Closure time) EtOH Alcol etylic GP Glycoprotein IC 50 Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) LC 50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) MDA Malondialdehyde MPA Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation) FPA Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet aggregation) NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) SVD Sâm vũ diệp TTH Tam thất hoang TXA2 Thromboxan A2 vWF Von-Willerbrand AUC Diện tích dưới đường cong HMWK Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen) PDGF Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor) CTAP Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue activating peptid) © School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin 26 của Sâm vũ diệp Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin 27 Sâm vũ diệp Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin 27 Sâm vũ diệp Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin 29 Tam thất hoang Bảng 3.5 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin 30 Tam thất hoang Bảng 3.6 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin 30 Tam thất hoang © School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Sâm vũ diệp 3 Hình 1.2 Tam thất hoang 3 Hình 1.3 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng 7 Hình 1.4 Cấu trúc của tiểu cầu 9 Hình 1.5 Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP 11 Hình 1.6 Quá trình ngưng tập tiểu cầu 12 Hình 1.7 Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp 19 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang 20 Hình 2.3 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu 22 Hình 2.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP 23 Hình 2.5 Chỉ số Slope 24 Hình 2.6 Chỉ số diện tích dưới đường cong – AUC 25 Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp 28 Hình 3.2 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Tam thất hoang 31 © School of Medicine and Pharmacy, VNU
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Thực trạng và phân bố 4 1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 4 1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.2. Sinh lý học tiểu cầu 6 1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu. 7 1.2.2. Chức năng tiểu cầu 9 1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu 13 1.3.1. Thời gian máu chảy 13 1.3.2. Đo sức bền mao mạch 13 1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu 14 1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa 14 1.3.5. Co cục máu đông 14 1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu 15 1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Kết quả 26 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầ u© c ủSchoola Sâm vũ diofệp Medicine and Pharmacy, 26 VNU 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang 29
3.2. Bàn luận 32 3.2.1. Mô hình nghiên cứu 32 3.2.2. Kết quả nghiên cứu 33 3.2.4. Hạn chế của nghiên cứu 35 Kết luận 36 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO © School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, huyết khối là một trong ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất thế giới, là nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp [41]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy yếu tố có vai trò quan trọng bậc nhất đối quá trình hình thành huyết khối là tiểu cầu. Sau khi được kích hoạt, tiểu cầu thực hiện quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích các chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục máu đông, dẫn đến hình thành huyết khối [23]. Trên lâm sàng, các thuốc kháng tiểu cầu là liệu pháp lý tưởng. Một số thuốc kháng tiểu cầu hiện có như: aspirin, clopidogrel, prasugrel, và dipyridamol được sử dụng rộng rãi trong dự phòng và điều trị huyết khối, bên cạnh những lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu còn một số tác dụng phụ như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu. Những hạn chế trên thúc đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mới mạnh hơn và ít tác dụng phụ hơn. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng là đối tượng được quan tâm nghiên cứu [41]. Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam thất Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được xác định là loài cây quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng rất cao ở Việt Nam. Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang dùng làm thuốc bổ như các loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15]. Một số loài thuộc chi Panax được nghiên cứu khá đầy đủ về dược lý, hóa học và độc tính. Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học hai loài cây này còn hạn chế. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ, lá của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có chứa saponin (chất có khả năng chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36]. Giai đoạn trước của đề tài, đã chứng minh được Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam © Schoolthất hoang ofcó tácMedicine dụng ức ch andế ngưng Pharmacy, tập VNU tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5 1
mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n-hexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL [19]. Saponin cũng là thành phần chính của phân đoạn n-butanol, tuy nhiên butanol là một dung môi hữu cơ, có ít nhiều độc tính nên trong sản xuất công nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất. Để khắc phục hạn chế này, nhóm nghiên cứu của PGS. Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) và Nguyễn Hữu Tùng (Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đã đưa ra một quy trình chiết cao giàu saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang là 20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp là 14,44±0,14 % [8, 27]. Liệu cao này có còn hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu không? Và tác dụng của nó so với phân đoạn n-butanol như thế nào? Để trả lời những câu hỏi này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)”, với mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp 1.1.1. Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất. Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20]. Sâm vũ diệp là cây thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hằng năm để lại. Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi vào mùa khô. Lá kép chân vịt, mọc vòng ba cái một, mang 3-7 lá chét mỏng, không lông, mép có răng đôi cạn hay sâu dạng thùy. Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 cái thành tán đơn trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa cỡ 1 cm. Qủa mọng, khi chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4]. Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất, Thổ tam thất. Tên khoa học: Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có một thân mang lá. Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25]. Hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau. Điểm khác biệt nhất là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, còn Tam thất hoang thì không [20]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hình 1.1. Sâm vũ diệp Hình 1.2. Tam thất hoang 3
1.1.2. Thực trạng và phân bố Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J. Botany. Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, Sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng 23 độ vĩ Bắc) [21, 53]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được hai nhà khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica Sinica. Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc (phía bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt nước biển. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [20]. Tại Việt Nam cho đến nay, các kết quả nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn và một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa của tỉnh Lào Cai [10, 20, 21]. Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ. Tuy nhiên gần đây Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [10]. 1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Sách đỏ Việt Nam năm 2007 ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc. Thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá, nụ, hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [4]. Sâm vũ diệp vị đắng, nhạt, tính hàn, có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu. Dược liệu từ Sâm vũ diệp là thân rễ, rễ củ dùng cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm nhất là đối với phụ nữ sau sinh đẻ; còn có tác dụng kích thích sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh. Ở Vân Nam (Trung Quốc), người ta dùng rễ củ chữa thổ huyết, chảy máu © mũi, School đòn ngã of tổ nMedicine thương, thương and tổ Pharmacy,n bên VNU trong gây đau lưng [4]. 4
Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 công bố cao Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng độ 25, 50, 100 µg/mL [13]. Năm 2009, nghiên cứu của Viện Dược liệu chỉ ra rằng phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa – lipid peroxidation, dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cảm ở liều 44-176 mg/kg trên chuột [14]. Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm cho thấy Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2- 5 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n- hexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL) [19]. 1.1.4. Thành phần hóa học 1.1.4.1. Sâm vũ diệp Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy có nhiều saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran. Hai saponin mới đã được phân lập là bipinnatifidusoside F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Trung Quốc. Saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam- Hàn Quốc phân lập và xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp, được thu hái ở Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết, bao gồm: narcissiflorine methyl ester (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8), momordinIIe (9), và stipuleanoside R2 methyl ester (10) [40]. Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Sâm vũ diệp, kết quả là đã phân lập được một hỗn hợp saponin (11) bao gồm: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11A) và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-D- glucopyranosyl)-N-(1,3,4-trihydroxytridec ©-8 -Schoolen-2-yl) heptacosanamid of Medicine (12), and dichaccarid: Pharmacy, VNU saccharose (13), saponin: 28-desglucosylchikusetsusapnin IV (14) từ phân đoạn chiết ethyl acetat thân rễ Sâm vũ diệp. Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên được công 5
bố phân lập từ cây này [9]. Năm 2017, rễ Sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Lào Cai đã được nhóm nghiên cứu Khoa Y Dược xác định được 3 cấu trúc hóa học trên cơ sở phân tích quang phổ và so sánh với chất tham khảo, bao gồm: Stigmast-5-en-3-ol hay còn gọi là β-sitosterol (1), acid oleanolic (2) và daucosterol (3) từ phân đoạn cao chiết etyl acetate của cao chiết tổng ethanol Sâm vũ diệp [11]. Trong ba chất phân lập được thì oleanolic acid là sapogenin của các saponin khung olean có ý nghĩa trong đánh giá hàm lượng tổng saponin có trong Sâm vũ diệp [10]. 1.1.4.2. Tam thất hoang Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất hoang được công bố. Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ra rằng phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ Tam thất hoang [43]. Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [36]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu Tam thất hoang thu hái ở Việt Nam trong đó có 1 chất mới là spinasaponin A methyl ester (1) [33]. Năm 2013, nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin nữa đều là các saponin khung oleanan [38]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất khác từ Tam thất hoang gồm 2 polyacetylen mới (stipudiol và stipuol), 1 polyacetylen đã biết (3R,9R,10R)- panaxytriol và các hợp chất khác: spathulenol (serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [48]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất hoang vẫn còn mới mẻ. Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng [14]. Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [13]. 1.2. Sinh lý học tiểu cầu Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhấ t,© không School có nhân, of Medicineđường kính 3 -and4 µm, Pharmacy, được VNU sản xuất từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt đầu từ tế bào nguồn dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo nên. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000 tiểu cầu. Số 6
lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 109/L [18, 29]. Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20-22 °C, lắc liên tục [18]. 1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu. Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng Khu ngoại vi Khu ngoại vi gồm lớp màng tiểu cầu kết nối với hệ thống các ống mở. Màng tiểu cầu gồm hai lớp lipid bao quanh tiểu cầu. Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein quan trọng đóng vai trò như các receptor bề mặt liên quan đến quá trình đông máu [52]. Glycoprotein Ib (GPIb): là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố wWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen. Đây là bước đầu tiên trong hoạt động đông cầm máu của tiểu cầu [18, 29]. Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa): là protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion canxi, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu [18, 29]. Ngoài ra, các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserine (PS) có vai trò quan trọng trong quá trình đông máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứng enzym tiểu cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu và là chất chủ vận mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểu cầu. Màng tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [17, 52]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hình 1.3. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29] 7
Hệ thống các kênh mở gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ thống kênh này [18]. Hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường đi vào trong tế bào chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi chúng bị hoạt hóa [7]. Khu sol-gel Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi gồm các vi ống và vi sợi. Vi ống nằm sát màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị kích thích [52]. Vi sợi gồm các sợi actin có liên hệ chặt chẽ với các vi ống và tham gia vào hoạt động tạo giả túc của tiểu cầu [52]. Ngoài ra khu sol-gel còn chứa glycogen [28]. Khu bào quan Khu bào quan gồm có các loại hạt và thành phần tế bào như các lysosom, ty thể Những bào quan này tham gia vào quá trình trao đổi chất, là nơi dự trữ enzym và một lượng lớn các chất khác có vai trò quan trọng với chức năng tiểu cầu [18, 23]. Hạt đặc chứa một số chất như ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamin, canxi, magie, pyrophosphat, nucleotid khác. Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích [18]. Hạt γ-gamma (Túi lysosome) chứa enzym như galactosidase, fucosidase, hexosaminidase, glucuronidase. Hạt α chứa nhiều protein dính như fibrin, fibronectin, vWF, thrombospondin, thromboglobulin, vitronectin; Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor - PDGF); Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (CTAP: connective tissue activating peptid); Yếu tố 4 tiểu cầu; Yếu tố đông máu: yếu tố V, kininogen, fibrinogen, yếu tố XI, protein S, chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen. Hạt λ: làm tan cục máu đông trong giai đoạn sau của sự hồi phục mạch [18, 37]. Khu vực màng Khu vực màng gồm hệ thống ống dày đặc gắn với canxi một cách chọn lọc, đóng vai trò là nơi dự trữ canxi của tiểu cầu. Đây cũng là nơi tổng hợp men cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu [52]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
Hình 1.4. Cấu trúc của tiểu cầu [29] 1.2.2. Chức năng tiểu cầu Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29]. 1.2.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn, khi khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu nhanh chóng trải qua các quá trình thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà kết quả cuối cùng là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương. Quá trình chuyển đổi tiểu cầu bất hoạt thành tiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều dọc liên tục nhưng có thể được chia thành các bước: bám dính, kết tập, phóng thích các chất [7, 18, 23, 35]. Giai đoạn bám dính Tiểu cầu dính vào các bề mặt lạ những tổ chức dưới nội mạc bộc lộ khi mạch máu bị tổn thương (in vivo) hoặc bề mặt ống nghiệm thủy tinh, lam kính (in vitro) [17]. Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động bởi oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu. Tế bào nội mô còn chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kích hoạt ADP. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp dưới nội mô, lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin, lamilin [7, 41, © 52] School. Yếu tố vWFof Medicine tạo điều kiện and cho s ựPharmacy, bám VNU dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên 9
màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [7, 35]. Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [7, 12]. Giai đoạn ngưng tập Là hiện tượng tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính. Hiện tượng dính đã hoạt hóa tiểu cầu, tạo điều kiện cho tiểu cầu ngưng tập [18]. Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, TSP, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [7, 29, 35]. Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin , trong đó ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [17, 29]. Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu không ngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thoái hóa ATP thành ADP. Trong trường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứ©ng School này bị ức ofchế Medicinedẫn đến tiểu candầu bị ngưngPharmacy, VNU tập [23]. 10
Hình 1.5. Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP [23] Acid arachidonic hoạt hóa ngưng tập tiểu cầu làm hoạt hóa phospholipid, giải phóng acid arachidonic. Acid arachidonic hoạt hóa men cyclooxygenase (có trong hệ thống dày đặc) tạo prostaglandin và thromboxan A2 (thromboxan A2 có tác dụng kích thích ngưng tập tiểu cầu). Thrombin gây ngưng tập tiểu cầu qua cơ chế tác động lên yếu tố V có trên bề mặt tiểu cầu. Bởi vậy khi dùng men trypsin để thủy phân yếu tố V thì tiểu cầu không còn ngưng tập được nữa [23]. Adrenalin và noradrenalin gây ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế gián tiếp thông qua việc phóng thích ADP và trực tiếp kích thích sự ngưng tập qua vai trò của acid arachidonic [23]. Sự ngưng tập do ristocetin xảy ra do sự kích thích yếu tố von-Willebrand gắn với tiểu cầu tại vị trí của receptor GPIb. Vì vậy, nếu thiếu một trong hai yếu tố này thì tiểu cầu không ngưng tập [18, 23]. Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A khuếch đại cùng với ADP cho phản ứng của tiểu cầu, ngoài ra serotonin có thể đóng vai trò gây đông máu, làm tăng việc lưu giữ protein đông máu như fibrinogen, thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [7]. Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Qúa trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trò quan trọng nhất [23]. Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [23] Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bị ngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích của tiểu cầu. Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sự biến đổi về hình thái và sinh hóa của ti ể©u c ầSchoolu. Cụ thể làof n hMedicineững thay đổi vandề hình Pharmacy, thái: VNU tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại. Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP, 11
serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố III tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid và một số men khác. Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương. Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau, khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện, mở rộng cho khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của tiểu cầu. Hình 1.6. Quá trình ngưng tập tiểu cầu [35] Hiện tượng dính hoạt hóa tiểu cầu, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng quả cầu nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám dính. Tiểu cầu ngưng tập, cùng lúc với quá trình này, bên trong tế bào chất của tiểu cầu xảy ra hiện tượng giải phóng hạt, các chất chứa bên trong hạt sẽ được giải phóng ra môi trường bên ngoài qua hệ thống kênh mở và thực hiện vai trò sinh học của chúng [7, 18, 23]. 1.2.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Ngay khi hiện tượng bám dính b©ắt Schoolđầu, tiểu cofầu thayMedicine đổi hình anddạng vàPharmacy, chế VNU tiết chất tham gia quá trình khởi động đông máu HMWK, yếu tố này cùng với 12
kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đông máu. Một lượng nhỏ thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang TF (tissue factor) như: nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mô, lượng thrombin này không có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng đủ để hoạt hóa tiểu cầu. Sau đó, tiểu cầu hoạt hóa liên kết các yếu tố đông máu bởi các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII chống lại sự phân cắt bởi hoạt tính protein C. Yếu tố XIa liên kết với thụ thể GPIb trên bề mặt tiểu cầu và hoạt hóa yếu tố IX. Yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Sự phối hợp của các yếu tố đông máu trên bề mặt tiểu cầu dẫn đến hình thành thrombin, vì vậy một cục máu đông ổn định fibrin được hình thành. Ngoài ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng 20 % yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [7]. 1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu Hiện nay, có rất nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu như: đo thời gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, đo độ dính tiểu cầu, đo độ ngưng tập tiểu cầu 1.3.1. Thời gian máu chảy Nguyên lý là khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời hệ thống cầm máu bắt đầu hoạt động. Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành mạch và của tiểu cầu. Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian để cầm được máu dài hơn. Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương mạch máu và đo thời gian từ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [16]. Nguyên lý của phương pháp Duke là dùng kim chủng tạo một vết thương nằm ngang ở vùng giữa dái tai và đo thời gian máu chảy [12]. Trị số bình thường từ 2 – 4 phút [12, 23]. Nguyên lý của phương pháp Ivy là đo thời gian máu chảy của các vết thương ở mặt duỗi cẳng tay, dưới 1 áp suất đã định [12]. Trị số bình thường: 4-8 phút [12, 23]. Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23] 1.3.2. Đo sức bền mao mạch Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo © Schoolhơi nhanh. ofĐế Medicinem số nốt xuấ tand huyế tPharmacy, ngay VNU dưới vùng dưới da nếp khuỷu. Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính. Sức bền 13
mao mạch giảm gặp trong một số bệnh lý: Giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng, viêm thành mạch do độc tố. Trong bệnh von-Willebrand, bệnh rối loạn chức năng tiểu cầu. Ngoài ra còn có thể gặp ở người già, thiếu vitamin C, do thể tạng hoặc có tính gia đình [16, 23]. 1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu Có rất nhiều phương pháp đếm tiểu cầu, nhưng phổ biến nhất hiện nay ở các bệnh viện là đếm tiểu cầu bằng máy dựa trên nguyên lý trở kháng hoặc laser. Trị số bình thường của tiểu cầu là 150.000 - 300.000/mm3. Số lượng tiểu cầu giảm gặp trong: xuất huyết do giảm tiểu cầu có nguyên nhân miễn dịch, suy tuỷ xương, leucemie cấp, sốt xuất huyết. Số lượng tiểu cầu tăng gặp trong: tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát [16, 23]. 1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu. Bình thường tiểu cầu bắt màu đỏ tím, không có nhân nhưng có các hạt màu đỏ và đứng thành cụm nếu máu chưa qua chống đông. Độ tập trung tiểu cầu tăng trong: tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát. Độ tập trung tiểu cầu giảm gặp trong: Suy tuỷ xương, leucemie cấp [16, 23]. 1.3.5. Co cục máu đông Có nhiều phương pháp khác nhau, tuy nhiên trong lâm sàng thường dùng kỹ thuật của Budtz-Olzen. Đây là xét nghiệm đơn giản nhưng khá đặc hiệu. Đánh giá sự co cục máu bằng cách quan sát cục máu đông sau 2 giờ. Nguyên lý của phương pháp: máu ra khỏi thành mạch sẽ bị đông, máu đông là máu chuyển thành dạng rắn nhờ hình thành các sợi fibrin. Mạng lưới sợi fibrin ôm lấy các thành phần hữu hình rồi co rút lại tạo nên cục máu đông tách rời khỏi phần huyết thanh. Cục máu đông co được là nhờ vai trò của tiểu cầu và của fibrin [16, 23]. Cục máu co hoàn toàn: phản ảnh tình trạng bình thường của fibrrinogen và tiểu cầu (cả số lượng và chất lượng). Cục máu không co (không tạo thành cục máu tách riêng rõ ràng với huyết thanh) hay cục máu co không hoàn toàn (phần huyết thanh tách ra ít dưới 30% máu) hoặc co cục máu nhưng còn nhiều hồng cầu tự do trong huyết thanh) là thể hiện bất thường của tiểu cầu (số lượng hoặc chất lượng) và/hoặc các fibrrinogen. Mức độ bất © School of Medicine and Pharmacy, VNU thường càng nặng thì cục máu càng không co. 14
Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu, lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23]. 1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu Trên in vivo sử dụng phương pháp Borchrevink. Nguyên lý là đo độ dính tiểu cầu qua việc lấy máu để đếm tiểu cầu trực tiếp tại vết thương vào các thời điểm cách đều nhau. Trị số bình thường: 20-40 %. Trên in vitro có 3 phương pháp (phương pháp Salzman, Bowie, Hellem). Nguyên lý là đo độ dính tiểu cầu sau khi cho máu hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh [23]. Độ dính tiểu cầu giảm trong: bệnh Von – Willebrand, trong một số bệnh lý rối loạn chức năng tiểu cầu, dùng một số thuốc giảm đau, sau truyền Dextran. Độ dính tiểu cầu tăng trong: bệnh lý huyết khối, tiểu đường, hút thuốc lá, cũng có thể gặp trong những trường hợp sau mỗ, sau sinh, sau một sang chấn nào đó (đặc biệt sau cắt lách, ) [23]. 1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu Có rất nhiều kỹ thuật để đo độ ngưng tập tiểu cầu nhưng chủ yếu dựa trên nguyên lý sau: Mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ của tiểu cầu có trong huyết tương đó. Bởi vậy khi cho thêm một chất gây ngưng tập tiểu cầu nào đó (ADP, adrenalin) vào dung dịch huyết tương giàu tiểu cầu, hiện tượng ngưng tập tiểu cầu sẽ xãy ra. Nồng độ tiểu cầu dưới dạng những phân tử riêng biệt sẽ giảm dẫn đến mật độ quang học tăng. Ghi nhận một số hình ảnh của quá trình thay đổi của mật độ quang sẽ biết được đặc điểm của quá trình ngưng tập tiểu cầu [2, 3, 23, 50]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hình 1.7. Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu (PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu) 15
Nguyên lý của phương pháp đo quang: thiết bị đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng phương pháp quang học là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định. Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu. Khi đo, sử dụng một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 0 %. Đồng thời sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100 %. Khi cho chất kết tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, ristocetin vào huyết tương giầu tiểu cầu sẽ xẩy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám vì vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ ngưng tập tiểu cầu. Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [24, 37, 50, 51]. 1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối. Trong nhiều bệnh lý, sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồm: hiện tượng dính, ngưng tập, phóng thích ra các yếu tố/thành phần nội tiểu cầu đó là những cơ sở sinh lý, sinh hóa và cơ học quyết định cho sự hình thành huyết khối. Bởi vậy, hiện nay liệu pháp kháng tiểu cầu ngày càng được quan tâm đúng mức hơn trong việc điều trị dự phòng và chống sự hình thành huyết khối [23]. Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế quá trình kết dính, hoạt hóa, ngưng tập, nhằm ngăn ngừa, hạn chế tắc mạch [18]. Điều trị chống ngưng tập tiểu cầu có thể tấn công lên các mục tiêu trên con đường của quá trình ngưng tập tiểu cầu [26]. Hiện nay có nhiều thuốc kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau được sử dụng như: Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel, Prasugrel 1.4.1. Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi. Cơ chế tác dụng: Aspirin ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1) dẫn đến ngăn cản sự tạo thành Thromboxan A2 (TXA2), nhờ đó mà ức chế ngưng tập tiểu cầu. Sự ức chế này là rất mạnh và tồn tại suốt đời sống tiểu cầu đó, vì tiểu cầu không thể tổng hợp thêm men mới được nữa. Bên cạnh đó, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông, là PGI2 của tế bào nội mạc mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC. Tuy nhiên tác dụng này không mạnh bằng tác dụng ức chế men ©cyclooxygenase School of và Medicine tác dụng này andcũng khôngPharmacy, VNU kéo dài vì tế bào nội mạc có thể tổng hợp ra men mới [22, 23]. Aspirin có thể ức chế ngưng tập tiểu cầu với các chất kết tập như collagen, ADP, epinephrin. 16
1.4.2. Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin) Ticlopidin: cơ chế tác dụng ức chế NTTC của Ticlopidin là do Ticlopidin tưong tác với glycoprtein IIb/IIIa receptor của fibrinogen làm ức chế sự gắn fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu. Ngoài ra, thuốc còn làm tăng prostaglandin D2 và E2 góp phần chống đông vón tiểu cầu và tăng thời gian chảy máu [1, 22]. Ngày nay Ticlopidine ít sử dụng hơn vì có một số tác dung̣ phu ̣quan trọng như giảm bacḥ cầu haṭ (có thể gây tử vong), suy tủ y và tắc mât.̣ Clopidogrel: bản thân Clopidogrel là tiền thuốc không có hoaṭ tính kháng tiểu cầu. Sau khi đươc̣ hấp thu ở ruôt,̣ khoảng 85 % lương̣ thuốc hấp thu đươc̣ chuyển hóa bởi các enzym esterase thành những chất không có hoaṭ tính và 15% đươc̣ chuyển hóa bởi hê ̣ enzym cytochrome P-450 (hai bước) ở gan thành chất có hoaṭ tính ứ c chế thu ̣ thể P2Y12 trên bề măṭ tiểu cầu, làm ADP không gắn đươc̣ vào thu ̣thể của nó dẫn tới không hoaṭ hoá đươc̣ tiểu [1, 22, 39]. Prasugrel: là thuốc mới nhất thuôc̣ nhóm Thienopyridin. Sau khi vào ống tiêu hóa, prasugrel bi ̣thủ y phân nhanh chóng bởi esterase trong ruôṭ và máu thành chất chuyển hóa trung gian. Chất này laị đươc̣ biến thành chất chuyển hóa có hoaṭ tính bởi enzym cytochrome P450 (môṭ bước), chất chuyển hóa có hoaṭ tính của prasugrel ứ c chế không hồi phuc̣ thu ̣ thể P2Y12 của tiểu cầu. Như vậy Prasugrel khắc phục được nhược điểm của Clopidogrel nên Prasugrel có tác dung̣ ứ c chế kết tâp̣ tiểu cầu manḥ hơn, nhanh hơn và ổn đinḥ hơn so vớ i clopidogrel [1]. Thuốc ứ c chế P2Y12 không thuôc̣ nhó m thienopyridin Ức chế trưc̣ tiếp có hồi phuc̣ thu ̣ thể P2Y12 của tiểu cầu. Đây là thuốc đầy triển vọng qua nghiên cứu PLATO (Study of Platelet Inhibition and Patient Outcomes) [1]. 1.4.3. Cá c thuố c ứ c chế thụ thể Glycoprotein IIb/IIIa củ a tiểu cầu Abciximab, Eptifibati và Tirofiban. Các thuốc này ứ c chế glycoprotein IIb/IIIa se ̃ ứ c chế những liên kết chéo bằng fibrin giữa các tiểu cầu do đó ức chế hình thành huyết khối [1, 22]. 1.4.4. Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu Dipyridamol: Ức chế sự vỡ ra của AMP vòng do phosphodiesterase do đó là tăng nồng độ APM vòng, ngăn cản sự ngưng tập, phóng xuất và kết dính tiểu cầu[1, 22]. Thuốc có tác dụng chống ngưng ©tập School tiểu cầu nhưng of Medicine không làm kéoand d àiPharmacy, thời VNU gian chảy máu [23]. 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu Đối tượng Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm 2016 được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem. bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Phần dưới mặt đất được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ và bảo quản trong túi nilon. Mẫu được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp sau khi được sơ chế, làm khô, xay nhỏ được chiết bằng EtOH 50 % với tỷ lệ dung môi : dược liệu là 7:1, ở nhiệt độ 90 °C. Chiết 2h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 % thu được cô dưới áp suất giảm đến khi tạo thành cao lỏng (1:1). Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp còn nhiều tạp chất bao gồm các hợp chất ít phân cực, dầu béo và các thành phần saccarid tan trong nước. Loại bỏ các tạp chất ít phân cực, thân dầu: dùng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan theo tỷ lệ 1:1 qua 3 lần. Cất loại thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng. Lớp nước sau chiết lỏng-lỏng chứa toàn lượng saponin đã được loại dầu béo và tạp chất thân dầu. Loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước: sử dụng sắc ký hấp phụ bằng resin diaion HP-20, rửa giải bằng EtOH 96 %. Dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi dưới áp xuất giảm đến cao đặc, đem sấy chân không tại 55-60 °C trong 24 giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các phân đoạn chiết cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp được tiến hành tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS. Nguyễn Hữu Tùng cung cấp (Hình 2.1) [27]. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
Hình 2.1. Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp [27] Mẫu toàn cây tươi Tam thất hoang thu hái ở Sa Pa - Lào Cai ngày 26 tháng 10 năm 2015 được giám định tên khoa học là Tam thất hoang- Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng. Thân rễ Tam thất hoang rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ, thu được bột thô. Bột thô Tam thất hoang chiết với EtOH 50 %, tỷ lệ dung môi : dược liệu là 10:1, ở nhiệt độ 90 °C, Chiết 1h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 % thu được, được cô dưới áp suất giảm, tạo cao lỏng (1:20). Quá trình loại tạp được áp dụng phương pháp chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải bằng EtOH 80 %. Thu dịch rửa giải EtOH 80 %, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc, đem sấy chân không tại 55-60 °C trong 24 © School of Medicine and Pharmacy, VNU giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao tam thất hoang, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng. Các quy 19
trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang được tiến hành tại khoa Hóa thực vật, viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp (Hình 2.2) [8]. Bột thô tam thất hoang Kiểm nghiệm dược liệu - Chiết EtOH 50 % - Dung môi/dược liệu (10/1) - To = 90oC - Chiết 1h/lần 3 lần / mẻ. Dịch chiết cồn 50% Cô dưới áp suất giảm Cao lỏng 1:20 Cột resin D101, EtOH 80% Kiểm tra TLC Dịch rửa giải - Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Sấy chân không tại 55-60oC, 24 h Cao giàu hoạt chất Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở Hình 2.2. Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang [8] Vật liệu nghiên cứu: xylanh 10 mL, 20 mL, kim lấy máu 20 G, ống nghiệm chống đông citrate, ống nghiệm sạch, ống đo mẫu, viên khuấy từ, đầu côn, micropipet, găng tay, máy ly tâm, máy đo độ ngưng tập tiểu cầu chronolog, ADP, dung môi (DMSO - Dimethyl sulfoxide ©), Schoolthuốc thử of(cao Medicine dược liệu), thuandốc chPharmacy,ứng VNU dương (aspirin – Aspegic 100mg). 20
Thu thập mẫu máu Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức chúng tôi đã tiến hành thu thập máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh. Tuân thủ theo tuyên bố Helsinki về đạo đức nghiên cứu với đối tượng nghiên cứu là con người. Người tham gia nghiên cứu cần được biết về lý do, mục đích của nghiên cứu, các lợi ích, cũng như rủi ro của nghiên cứu, và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu. Người tình nguyện đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau: Tiêu chuẩn lựa chọn: người tình nguyện khoẻ mạnh, 20-25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin. Tiêu chuẩn loại trừ: có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lương̣ > 450 mL trong vòng 28 ngày trước. Tất cả các nghiên cứu được thực hiện vào buổi sáng với các tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu. Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp đo độ đục của Born: đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [34]. Chuẩn bị mẫu Lấy 10-15 ml máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3,8 % (1:10); người tình nguyện phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu, có số lượng tiểu cầu từ 200-400 G/L, hematocrit bình thường. Lắc đều để đảm bảo máu được chống đông hoàn toàn. Ly tâm ở tốc độ 500 vòng trong 10 phút, lấy phần nổi là huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho vào ống falcon vô khuẩn có nút và giữ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, ly tâm số huyết tương còn lại ở tốc độ cao 3000 vòng trong 10 phút, được huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP). Pha Stock cao chiết giàu saponin của Tam thất hoang và Sâm vũ diệp nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10 %, Cao chiết phân đoạn giàu saponin của Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở các phân đoạn được hoà tan trong dung môi DMSO, sau đó được pha loãng trong nư©ớ cSchool muối sinh of lý Medicineđể đạt nồng đ andộ cuố iPharmacy, cùng VNU trong dung dịch nghiên cứu là 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6 mg/mL. Dùng DMSO 0,1 % làm chứng âm. Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm 21
2017 đã lần lượt thử Aspirin với các liều 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL, 1 mg/mL thì nhận thấy với liều 1 mg/mL cho tác dụng tối ưu và đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu như mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn liều này làm liều chứng dương. Tiến hành đo mẫu trên máy Chrono - Log CA – 560 Cho 450 µl huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) + 50 µl DMSO 0,1 % vào cuvet thuỷ tinh không chứa bi khuấy từ. Chia lần lượt 450 µl huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào cuvet thuỷ tinh chứa bi khuấy từ. Thêm lần lượt vào mỗi cuvet 50 µl hóa chất gồm DMSO 0,1 %, Aspirin (1 mg/mL), các phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg/mL. Ủ trong 5 phút ở 37 °C. Nhấc ống vào vị trí đo (01 ống nghèo tiểu cầu, 01 ống giàu tiểu cầu vào các vị trí tương ứng trên máy). Cho 5 l chất kết tập ADP vào ống giàu tiểu cầu. Chờ máy chạy và đo mẫu tự động, đọc và ghi lại kết quả gồm: phần trăm NTTC tối đa (MPA), tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút được biểu diễn thông qua chỉ số Slope, diện tích dưới đường cong được biểu diễn dưới dạng AUC (Area under the aggregation curve). Lặp lại thí nghiệm 7 lần ở mỗi nồng độ. Quy trình thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3. © School of Medicine and Pharmacy, VNU Hình 2.3. Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu 22
Ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP Hình 2.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP Sử dụng chất kết tập ADP 5 µL: ADP bám vào receptor ADP trên bề mặt tiểu cầu, làm giải phóng Canxi nội bào, kích thích giải phóng acid arachidonic từ màng phospholipid; dẫn tới thay đổi hình dạng tiểu cầu từ hình đĩa sang dạng hình cầu gai, tạo đáp ứng nguyên phát, sau đó có đáp ứng thứ phát bởi việc giải phóng hạt đặc thông qua hệ thống kênh mở (chất adenine nucleotide, serotonin, thromboxan được chứa trong hạt đặc của tiểu cầu). Đáp ứng này được gọi là sóng ngưng tập nguyên phát và thứ phát [5, 6, 37, 50]. Qúa trình này được chia thành 5 giai đoạn: 1- Trước khi đưa chất kết tập ADP vào cuvet. 2- Chất kết tập được thêm vào, đồ thì dạng đỉnh nhọn. 3- Ánh sáng truyền qua cuvet giảm, tiểu cầu thay đổi hình dạng (kết quả của việc ADP bám vào tiểu cầu). 4- Tăng ánh sáng truyền qua cuvet, tạo sóng ngưng tập nguyên phát. 5- Nếu kích thích không đủ mạnh, tiểu cầu sẽ không ngưng tập được (dữ liệu không hiển thị được). Nếu đủ ©mạ nh,School sẽ taọ ofsóng Medicine ngưng tập thandứ phát Pharmacy, của VNU ADP – ngưng tập tăng lên. Sự uốn cong nhẹ ở cuối giai đoạn 4 (mũi tên) cho 23
thấy sự khởi đầu của sóng ngưng tập thứ phát; giải phóng 1 số thành phần trong tiểu cầu như: fibrinogen, serotonin, thromboxan và ADP, làm tăng đáp ứng ngưng tập [37, 50]. Các thông số nghiên cứu Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation – MPA) được biểu diễn qua chỉ số Amplitude. Độ ngưng tập tiểu của các mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa theo độ ngưng tập tiểu cầu của DMSO: coi độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) của DMSO là 100 %, MPA (%) của Aspirin và cao giàu Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở các nồng độ được tính theo công thức: % ủ 푠 𝑖 𝑖푛 ℎ표ặ á 푛ồ푛𝑔 độ MPA (%) = 100 % [31] % ủ 푆 0,1 % Bên cạnh độ ngưng tập tiểu cầu tối đa MPA, thì tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là một chỉ số được quan tâm nhằm đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập, giai đoạn tiểu cầu được hoạt hóa. Slope được xác định bằng cách vẽ một đường tiếp tuyến với đường ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu biến dạng (giai đoạn 4) [37, 50]. Hình 2.5. Chỉ số slope Mức độ NTTC được thể hiện thông © School qua chỉ sofố di Medicineện tích dưới andđường Pharmacy, cong VNU (Area under the aggregation curve – AUC) tính từ thời điểm sau khi tiểu cầu biến dạng đến khi tiểu cầu ngưng tập tối đa. Đây là chỉ số quan trọng nhất vì nó phụ 24
thuộc vào cả tốc độ thay đổi ngưng tập (slope) và phần trăm ngưng tập tối đa (giai đoạn 4, 5) [30, 39]. Hiện nay, ba chỉ số này luôn được các nhà lâm sàng quan tâm trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của người bệnh, và rất có giá trị trong phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu. Hình 2.6. Chỉ số diện tích dưới đường cong - AUC Phương pháp phân tích số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng Test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett’T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lô. Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp 3.1.1.1. Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC) Bảng 3.1. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Sâm vũ diệp Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô P so với lô dùng DMSO dùng Aspirin 1 DMSO 0,1 % 7 255,05±20,90 >0,05 2 Aspirin 1 mg/mL 7 222,78±14,39 >0,05 3 SVD 0,1 mg/mL 7 271,36±32,21 >0,05 >0,05 4 SVD 0,2 mg/mL 7 267,37±25,24 >0,05 >0,05 5 SVD 0,4 mg/mL 7 259,60±27,72 >0,05 >0,05 6 SVD 0,8 mg/mL 7 213,78±21,50 >0,05 >0,05 7 SVD 1,6 mg/mL 7 145,93±12,76 >0,05 >0,05 pANOVA <0,05 (SVD: Sâm vũ diệp) Nhận xét: cao giàu saponin Sâm vũ diệp ở tất cả các mức liều đều không làm thay đổi mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Tuy nhiên, dựa vào kết quả bảng 3.1, có thể thấy Sâm vũ diệp mức liều 0,8 mg/mL và 1,6 mg/mL (AUC tương ứng là 213,78±21,50; 145,93±12,76) làm giảm mức độ NTTC so với lô chứng DMSO (AUC là 255,05±20,90). © School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
3.1.1.2. Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) Bảng 3.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin Sâm vũ diệp P so với lô P so với lô Lô Thuốc dùng N MPA (%) dùng DMSO dùng Aspirin 1 DMSO 0,1 % 7 100 0,05 0,05 0,05 >0,05 6 SVD 0,8 mg/mL 7 79,41±3,37 0,05 7 SVD 1,6 mg/mL 7 55,56±4,22 0,05 pANOVA Medicine 0,05 and Pharmacy, VNU (SVD: Sâm vũ diệp) 27
Nhận xét: Tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp ở tất cả các mức liều không có sự khác biệt so với lô chứng DMSO (p>0,05). 3.1.1.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation - FPA) Hình 3.1. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp (A: DMSO; B: Aspirin 1 mg/mL; C: Sâm vũ© diSchoolệp 0,1 mg/mL; of MedicineD: Sâm vũ diệ pand 0,2 mg/mL Pharmacy,; VNU E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL) 28
Nhận xét: Từ hình 3.1 cho thấy, cao giàu saponin của Sâm vũ diệp ở mức liều 0,8 mg/mL có tác dụng làm giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối tương đương với Aspirin 1 mg/mL, mức liều 1,6 mg/mL có tác dụng giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối mạnh hơn chứng dương Aspirin 1 mg/mL, lô chứng âm DMSO không có tác dụng đó. Tiểu cầu sau khi ngưng tập tối đa, có xu hướng phục hồi. Có nghĩa là sau khi kết tập một thời gian (5 phút) thì Aspirin, phân đoạn cao giàu saponin của Sâm vũ diệp có xu hướng phân rã ngưng tập, độ ngưng tập tiểu cầu tiếp tục giảm, thể hiện ở xu hướng đi lên ở phía cuối đồ thị ngưng tập. 3.1.2. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang 3.1.2.1. Ảnh hưởng của cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC) Bảng 3.4. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Tam thất hoang P so với lô P so với lô Lô Thuốc dùng N AUC dùng DMSO dùng Aspirin 1 DMSO 0,1 % 7 255,05±20,90 >0,05 2 Aspirin 1 mg/mL 7 222,78±14,39 >0,05 3 TTH 0,1 mg/mL 7 270,83±30,82 >0,05 >0,05 4 TTH 0,2 mg/mL 7 232,71±30,07 >0,05 >0,05 5 TTH 0,4 mg/mL 7 204,70±19,81 >0,05 >0,05 6 TTH 0,8 mg/mL 7 149,89±15,46 0,05 7 TTH 1,6 mg/mL 7 67,84±15,38 <0,05 <0,05 pANOVA <0,05 (TTH: Tam thất hoang) Nhận xét: Cao giàu saponin của Tam thất hoang ở mức liều 0,8 và 1,6 mg/mL làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu một cách rõ rệt so với lô chứng DMSO. Trong đó, mức liều 1,6 mg/mL còn có hiệu quả làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu mạnh hơn Aspirin (p<0,05). (AUC của DMSO là 255,05±20,90, Aspirin 1 mg/mL là 222,78±14,39, Tam thất hoang 0,8 và 1,6 mg/mL lần lượt là 149,89±15,46 ; 67,84±15,38). © School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
3.1.2.2. Ảnh hưởng của cao giàu saponin Tam thất hoang đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa Bảng 3.5. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin Tam thất hoang P so với lô P so với lô Lô Thuốc dùng N MPA (%) dùng DMSO dùng Aspirin 1 DMSO 0,1% 7 100 0,05 0,05 >0,05 5 TTH 0,4 mg/mL 7 78,17±5,40 >0,05 >0,05 6 TTH 0,8 mg/mL 7 59,05±2,72 0,05 7 TTH 1,6 mg/mL 7 35,76±3,28 0,05 (TTH: Tam thất hoang) 30
Nhận xét: Tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút của cao giàu saponin của Tam thất hoang ở tất cả các mức liều không có sự khác biệt so với lô chứng DMSO (p>0,05). 3.1.2.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Tam thất hoang Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation - MPA) Hình 3.2. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Tam thất hoang (A: DMSO; B: Aspirin 1 mg/mL; C: Tam © th Schoolất hoang 0,1 of mg/mL;Medicine D: Tam and thất hoangPharmacy, VNU 0,2 mg/mL; E: Tam thất hoang 0,4 mg/mL; F: Tam thất hoang 0,8 mg/mL; G: Tam thất hoang 1,6 mg/mL) 31
Nhận xét: Từ hình 3.2 cho thấy, cao giàu saponin của Tam thất hoang ở mức liều 0,8 mg/mL có tác dụng ức chế phần trăm ngưng tập điểm cuối tương đương với chứng dương Aspirin 1 mg/mL, mức liều 1,6 mg/mL có tác dụng ức chế phần trăm ngưng tập điểm cuối mạnh hơn chứng dương Aspirin 1 mg/mL, lô chứng âm DMSO không có tác dụng đó. Tiểu cầu sau khi ngưng tập tối đa, có xu hướng phục hồi. Có nghĩa là sau khi ngưng tập một thời gian (5 phút) thì Aspirin, phân đoạn cao giàu saponin của Tam thất hoang có xu hướng phân rã ngưng tập, độ ngưng tập tiểu cầu tiếp tục giảm, thể hiện ở xu hướng đi lên ở phía cuối đồ thị ngưng tập. 3.2. Bàn luận 3.2.1. Mô hình nghiên cứu Sử dụng phương pháp đo quang của Born để đo độ ngưng tập tiểu cầu (Light Transmission Agrregometry – LTA). Đây được coi là tiêu chuẩn vàng để đánh giá chức năng ngưng tập tiểu cầu và được sử dụng phổ biến hiện nay [49, 51]. Có nhiều loại chất kết tập như: ADP, Collagen, acid arachidonic, ristocetin, TRAP [29]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất kết tập là ADP, vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP cũng tham gia vào nhiều phản ứng khác ở tiểu cầu như làm thay đổi hình dạng, bài tiết, tạo thromboxane A2, hoạt hóa GPIIb/IIIa, ADP cũng có trong hạt đặc của tiểu cầu và được bài tiết khi tiểu cầu trở nên hoạt hóa, làm tăng đáp ứng ngưng tập [17]. Có thể đánh giá thêm với chất kết tập khác như collagen, ristocetin nhưng do hạn chế về kinh phí nên chỉ đánh giá trên ADP. Aspirin là thuốc kháng tiểu cầu phổ biến. Có nhiều loại thuốc kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau như : Clopidogrel, Prasugrel, Ticlodipin Tuy nhiên, Aspirin với ưu điểm không cần chuyển hóa qua gan nên chúng tôi sử dụng làm chứng dương trong nghiên cứu in vitro này. Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm 2017 đã lần lượt thử Aspirin với các liều 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL, 1 mg/mL thì nhận thấy với liều 1 mg/mL cho tác dụng tối ưu và đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu như mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn liều này làm liều chứng dương. Theo nghiên cứu của Wan Zaidah Abdullah năm 2013 về ảnh hưởng của Aspirin đến tiểu cầu với chất kết tập là ADP 10 µl, gây ngưng tập tiểu cầu 71-88 % [42]. Kết quả này cũng khá tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi (Aspirin © gây School ngưng tofập 75,53±Medicine4,03 % andvới ch Pharmacy,ất kết VNU tập ADP 5 µL). 32
3.2.2. Kết quả nghiên cứu Kết quả cho thấy cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu rõ ở hai mức liều 0,8 và 1,6 mg/mL, trong đó cao giàu saponin Tam thất hoang có tác dụng rõ nhất, tác dụng trên cả mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) và phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA). Đặc biệt, với liều 1,6 mg/mL, cao giàu saponin Tam thất hoang còn có tác dụng mạnh hơn Aspirin 1 mg/mL trên cả mức độ NTTC và phần trăm NTTC tối đa. Cao giàu saponin Sâm vũ diệp ở tất cả các mức liều đều không làm thay đổi mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Tuy nhiên, dựa vào kết quả bảng 3.1, có thể thấy Sâm vũ diệp mức liều 0,8 mg/mL và 1,6 mg/mL làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu so với lô chứng DMSO (AUC của DMSO là 255,05±20,90, Aspirin là 222,78±14,39, Sâm vũ diệp 0,8 và 1,6 mg/mL tương ứng là 213,78±21,50; 145,93±12,76. Trong nghiên cứu của Rosio năm 2014 về tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của dịch chiết cà chua, chứng âm nước muối sinh lý có AUC là 385±23,2 [45], trong nghiên cứu của chúng tôi, chứng âm DMSO có AUC là 255,05±20,90. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy mức liều 0,8 và 1,6 mg/mL cao giàu saponin của Tam thất hoang làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách rõ rệt so với lô chứng DMSO. Trong đó, mức liều 1,6 mg/mL còn có hiệu quả làm giảm AUC mạnh hơn Aspirin (p<0,05). AUC là thông số quan trọng nhất vì nó phụ thuộc vào cả tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút (Slope) và tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA); có ý nghĩa trong quyết định lựa chọn thuốc sử dụng trên lâm sàng. Còn MPA và Slope thường có ý nghĩa trong các nghiên cứu. Giảm ngưng tập tiểu cầu dẫn tới giảm AUC [30]. Có thể thấy cao giàu saponin Tam thất hoang có tác dụng làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) tốt hơn Sâm vũ diệp. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) là độ NTTC lớn nhất đo dược trong 1 khoảng thời gian thích hợp kể từ khi cho chất khích tập vào, FPA (Final platelet aggregation) là độ NTTC đo được tại thời điểm cuối của nghiên cứu. Nếu tiểu cầu ngưng tập ổn định thì MPA=FPA [47]. Kết quả từ hình 3.1 và 3.2 cho thấy, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL sau khi tiểu cầu ngưng tập tối đa thì có xu hương hồi phục (đường cong ngưng tập đi lên), phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối nhỏ hơn phần trăm © School ngưng tập of tiểu Medicine cầu tối đa (FPA<M and Pharmacy,PA). VNU Trong khi lô chứng DMSO không có tác dụng đó. Có nghĩa là sau khi ngưng tập một thời gian (5 phút) thì Aspirin, phân đoạn cao giàu saponin của Sâm vũ diệp và 33
Tam thất hoang có xu hướng phân rã ngưng tập, độ ngưng tập tiểu cầu tiếp tục giảm, thể hiện ở xu hướng đi lên ở phía cuối đồ thị ngưng tập. Hiệu quả hồi phục NTTC ở liều 0,8 mg/mL tương đương với Aspirin; mức liều 1,6 mg/mL còn có khả năng phục hồi mạnh hơn Aspirin. Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế NTTC một cách rõ rệt so với lô chứng DMSO (bảng 3.2), hiệu quả ức chế NTTC tương đương với Aspirin 1 mg/mL. Nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL của cao giàu saponin của Tam thất hoang có tác dụng ức chế NTTC so với lô chứng DMSO. Mức liều 0,8 mg/mL có hiệu quả ức chế NTTC tối đa tương đương với Aspirin. Thậm chí, ở mức liều 1,6 mg/mL còn ức chế mạnh hơn so với Aspirin 1 mg/mL (bảng 3.5). Như vây, cao giàu saponin của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở mức liều 0,8 và 1,6 mg/mL đều có tác dụng ức chế NTTC. Có thể thấy Tam thất hoang có hiệu quả ức chế mạnh hơn Sâm vũ diệp. Nghiên cứu tổng quan năm 2006 của Cengiz Beyan tiến hành trên máu của 31 người khỏe mạnh với chất kết tập ADP 5 µl, phần trăm NTTC tối đa có giá trị trong khoảng 60-118 % [32], nghiên cứu của Emine Arzu Kose (2013) là 61±10 % [46] trong nghiên cứu này của chúng tôi, lô chứng DMSO gây ngưng tập 55±10,61 % (giá trị chưa chuẩn hóa), kết quả này khá phù hợp với các nghiên cứu trên. Theo nghiên cứu của Lê Thị Tâm (2017), phân đoạn n-butanol của Sâm vũ diệp có tác dụng ở mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL tương đương 11,6-23,0-46,1-115,2 mg dược liệu khô/mL. Tam thất hoang có tác dụng ở mức liều 5 mg/mL tương đương 75,9 mg dược liệu khô [19]. Trong nghiên cứu này, Tam thất hoang nồng độ 0,8-1,6 mg/mL tương đương 3,89-7,78 mg dược liệu khô/mL, Sâm vũ diệp nồng dộ 0,8-1,6 mg/mL tương đương 5,55-11,1 mg/mL dược liệu khô [27]. Mặc dù dung môi chiết khác nhau nhưng vẫn có thấy thấy hiệu quả chống NTTC rất tốt của cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở mức liều thấp, cho thấy khả năng chống NTTC là do saponin gây ra. Theo nghiên cứu của AikJiang Lau năm 2009, Tam thất (Panax notoginseng) mức liều 1,5 mg/ml gây ngưng tập 43 % [31], khá tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi (Tam thất hoang ở mức liều 1,6 mg/mL gây ngưng tập 35,76±3,28 %, Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL gây ngưng tập 55,56±4,22 %). Một cách khác để định lượng ngưng tập tiểu cầu là đánh giá tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút, được biểu diễn thông qua chỉ số Slope. Kết quả từ bảng 3.3 và 3.6 cho thấy tốc độ thay đổi ngưng tập tiểu cầu trong 1 phút của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở tất cả các mức liều không © School có sự khác of biệt Medicine so với lô chứng and DMSO. Pharmacy, VNU Slope phản ánh giai đoạn đáp ứng ngưng tập tiên phát [37]. Vì vậy, các mức liều trên của Tam thất hoang và Sâm vũ diệp không làm thay đổi giai đoạn tiểu cầu biến 34
dạng và đáp ứng ngưng tập tiên phát gây ra bởi ADP (không làm ảnh hưởng đến pha hoạt hóa tiểu cầu). Cũng thuộc nghiên cứu trên 31 người khỏe mạnh năm 2006 của Cengiz Beyan, giá trị Slope trong khoảng 79-176 [32]. Gía trị Slope của lô chứng trong nghiên cứu của Emine Arzu Kose (2013) là 74,83±26,76 [46], nghiên cứu của Rosio năm 2014 với chứng âm là nước muối sinh lý có Slope là 71±6,0 [45]. Slope của lô chứng DMSO 0,1 % trong nghiên cứu này là 75,00±6,14, phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trên. Chất kết tập ADP sau khi được đưa vào, bám vào receptor ADP trên bề mặt tiểu cầu, làm giải phóng canxi nội bào, kích thích giải phóng acid Arachidonic từ màng phospholipid làm thay đổi hình dạng tiểu cầu từ hình đĩa sang dạng hình cầu gai, tạo đáp ứng ngưng tập nguyên phát (có thể phục hồi), sau đó có đáp ứng thứ phát (ngưng tập không phục hồi) bởi việc giải phóng hạt đặc thông qua hệ thống kênh mở (adenine nucleotide, serotonin, thromboxan được chứa trong hạt đặc của tiểu cầu) [37, 50]. Như vậy có thể giả thiết rằng, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang không làm thay đổi quá trình tiểu cầu thay đổi hình dạng và ngưng tập tiên phát, mà tác động đến quá trình giải phóng một số chất làm tăng tác dụng ngưng tập có trong hạt đặc (ức chế giải phóng hạt đặc). Hoặc sau giai đoạn ngưng tập tiên phát, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang tác động làm tiểu cầu đã ngưng tập được phục hồi. Kết hợp hai giả thuyết trên, ta thấy phân đoạn cao giàu saponin của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL ức chế độ ngưng tập tiểu cầu tối đa, giảm diện tích dưới đường cong ngưng tập và có xu hướng làm giảm NTTC điểm cuối, thúc đẩy quá trình phân rã các ngưng tập đã được hình thành. 3.2.4. Hạn chế của nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ khảo sát trên một chất kết tập là ADP nên mới đánh giá được tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu theo con đường ADP. Còn các đích tác dụng khác (như collagen, acid arachidonic, ristocetin ) chưa được tiến hành nên có thể bỏ sót tác dụng trên các đích này. Thiết bị Chrono- Log-560 dùng trong nghiên cứu này không trích xuất được độ ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (thông số quan trọng để đánh giá khả năng phục hồi ngưng tập tiểu cầu). Nghiên cứu chưa tiến hành cho thuốc thử ủ với máu toàn phần của các tình nguyện viên sau đó làm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi để xem ảnh hưởng của thuốc đến các chỉ số huyết học và chưa ©đán Schoolh giá được ofIC50. Medicine and Pharmacy, VNU 35
Kết luận Qua quá trình nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của dịch chiết phân đoạn giàu saponin dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, chúng tôi rút ra kết luận sau: Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở mức liều: 0,8 mg/mL, 1,6 mg/mL. Ở 2 mức liều đó, cao giàu saponin Sâm vũ diệp làm giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tối đa và giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu điểm cuối. Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp không ảnh hưởng đến giai đoạn thay đổi hình dạng và đáp ứng ngưng tập tiên phát của tiểu cầu mà tác động đến quá trình phục hổi ngưng tập tiên phát và ức chế giai đoạn giải phóng hạt đặc của tiểu cầu. Cao giàu saponin của Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở mức liều: 0,8 mg/mL, 1,6 mg/mL. Ở 2 mức liều đó, cao giàu saponin Tam thất hoang làm giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tối đa, giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu (diện tích dưới đường cong) và giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu điểm cuối. Cao giàu saponin của Tam thất hoang không ảnh hưởng đến giai đoạn thay đổi hình dạng và đáp ứng ngưng tập tiên phát của tiểu cầu mà tác động đến quá trình phục hổi ngưng tập tiên phát và ức chế giai đoạn giải phóng hạt đặc của tiểu cầu. © School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
Đề xuất Tiến hành nghiên cứu tiếp theo với chất kết tập khác như: collagen, acid arachidonic, ristocetin để đánh giá đầy đủ hơn các đích tác dụng của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. Đặc biệt là collagen vì đây là chất kết tập mạnh nhất được sử dụng trong lâm sàng; đồ thị ngưng tập với chất kết tập là collagen phản ánh bước kết dính tiểu cầu với sợi collagen (pha lag chậm khoảng 1 phút) và sau đó ngưng tập do hoạt hóa tiểu cầu (thay đổi hình dạng và sau đó là giải phóng hạt). Sử dụng thiết bị hiện đại hơn như: CS-2500 (cho kết quả về độ ngưng tập tối đa - điểm cuối, diện tích dươí đường cong, vận tốc tối đa, thời gian cho vận tốc tối đa, góc vận tốc tối đa, thời gian pha lag) và thiết bị NTTC Lumiaggregometer để đánh giá quá trình giải phóng adenine nuclotide từ hạt đặc tiểu cầu. Tiến hành nghiên cứu in vivo trên mô hình gây huyết khối để đánh giá hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. . © School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bệnh viện đa khoa Cái Nước, Thuốc kháng kết tập tiểu cầu, tại trang web 2. Bệnh viện Trung ương quân đội 108 (2016), "Các xét nghiệm đánh giá chức năng cầm – đông máu". 3. Bộ Y tế (2012), Quy trình kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh chuyên ngành Huyết học – Truyền máu – miễn dịch – di truyền. 4. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, NXB Y học, 700. 5. Đỗ Tiến Dũng (2018), Platelet Aggregation Testing and Clinical Application. 6. Đỗ Tiến Dũng (2018), Xét nghiệm chức năng tiểu cầu. 7. Nguyễn Quang Đông (2015), Nghiên cứu chất lượng và một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng khối tiểu cầu, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội. 8. Đỗ Thị Hà (2018), Quy trình chiết cao giàu saponin từ tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K. M. Feng). 9. Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi và các cộng sự (2015), "Thành phần hóa học cặn chiết ethyl acetat Sâm vũ diệp", Tạp chí Dược liệu(2), 86-93. 10. Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp (Panax Bipinnatifidius Seem) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai, Khoa Y-Dược ĐHQGHN. 11. Đỗ Văn Hào, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Thu Thủy và các cộng sự (2017), "Thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai", Tạp chí Khoa học Y Dược ĐHQGHN, 33(2), 50-55. 12. Kỹ thuật xét nghiệm cầm máu kỳ đầu, tại trang web medicare.health.vn. 13. Trần Công Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của 2 loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 8(2), 93-94. 14. Trần Công Luận (2008), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lí của tam thất hoang – Panax stipuleanatus Tsai et Feng, họ Araliaceae", Tạp chí Dược liệu, 14(2), 99-102. © School of Medicine and Pharmacy, VNU
15. Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược liệu, 14(1), 17-23. 16. Nguyên lí và ý nghĩa một số xét nghiệm đông máu thông thường, Diễn đàn xét nghiệm đa khoa, tại trang web xetnghiemdakhoa.com. 17. Nguyễn Thị Nữ (2005), Nghiên cứu ngưng tập tiểu cầu và một số yếu tố đông máu ở bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipid máu, Luận văn Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội. 18. Đỗ Trung Phấn (2006), Bài Giảng Huyết Học Truyền Máu, NXB Y Học, Hà Nội, 235-247. 19. Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) trên in vitro, Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học, Khoa Y Dược ĐHQGHN. 20. Nguyễn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), 71-76. 21. Nguyễn Tập (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái cây Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), 177-181. 22. Mai Tất Tố và Vũ Thị Trâm (2012), Dược lí học, Tập 2, NXB Y học, 122-124. 23. Nguyên Anh Trí (2008), Đông máu ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y học. 24. Quách Hữu Trung (2014), Nghiên cứu tình trạng kháng aspirin ở bệnh nhân có yếu tố nguy cơ tim mạch cao Luận án tiến sĩ y học, Viện Nghiên Cứu Khoa Học Y Dược Lâm Sàng 108. 25. Nguyễn Thị Minh Tú (2012), "Nghiên cứu xây dựng qui trình tách chiết, tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học thuộc nhóm Saponin của bã hạt cây Du trà và thử nghiệm trong bảo quản một số loại quả có múi". 26. Trần Văn Tú (2009),Bài giảng Điều trị chống tiểu cầu, tại trang web thankinh.edu.vn. 27. Nguyễn Hữu Tùng (2018), Hoàn thiện quy trình chiết cao giàu saponin từ Sâm vũ diệp. 28. Bùi Đình Việt (2014), Tổng quan về các dược liệu có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, Đại học Dược Hà N ©ội. School of Medicine and Pharmacy, VNU 29. Phạm Quang Vinh (2013), Huyết học – truyền máu cơ bản, NXB Y học, 105-109.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH 30. Hanke AA, Roberg K, Monaca E et al (2010), "Impact of platelet count on results obtained from multiple electrode platelet aggregometry (Multiplate)", Eur J Med Res, 15(5), 214-9. 31. Lau AJ, Toh DF, Chua TK et al (2009), "Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax notoginseng: comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax ginseng and Panax quinquefolium", J Ethnopharmacol, 125(3), 380-6. 32. Beyan C, Kaptan K và Ifran A (2006), "Platelet count, mean platelet volume, platelet distribution width, and plateletcrit do not correlate with optical platelet aggregation responses in healthy volunteers", J Thromb Thrombolysis, 22(3), 161-1644. 33. Liang C, Ding Y, Nguyen HT et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett, 20(23), 7110-5. 34. Born GV (1962), "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal", Nature, 194, 927-9. 35. Versteeg HH, Heemskerk JW, Levi M et al (2013), "New fundamentals in hemostasis", Physiol Rev, 93(1), 327-58. 36. Zou Kun Zhu Shu Katsuko Komatsu và Yichang (2002), "Analysis of Saponins of Panax Stipuleanatus by Using HPLC and APIMS/MS Techniques", Journal of University of Hydraulic and Electric Engineering, 24(4), 355-358. 37. Zhou L và Schmaier AH (2005), "Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field", Am J Clin Pathol, 123(2), 172-83. 38. Chun Liang, Yan Ding, Seok Bean Song và các cộng sự (2013), "Oleanane- triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-kappaB", J Ginseng Res, 37(1), 74-9. 39. Brooks MB, Divers TJ, Watts AE et al (2013), "Effects of clopidogrel on the platelet activation response in horses", Am J Vet Res, 74(9), 1212-22. 40. Nguyễn Hữu Tùng, Trần Hồng Quang, Nguyễn Thị Thanh Ngân và các cộng sự (2011), "Oleanolic triterpene © School saponins of from Medicine the roots and of PanaxPharmacy, VNU bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), 1417-20.
41. Gross PL và Weitz JI (2009), "New antithrombotic drugs", Clin Pharmacol Ther, 86(2), 139-46. 42. Wan Zaidah Abdullah và Sanada Abu Bakar (2013), "Aspirin Effects on Platelets Using Whole Blood Tested by Platelet Aggregometry: A Comparative Study for Test Validation in a Clinical Hemostasis Laboratory", Laboratory QA, 44(1). 43. Yang Chongren, Jiang Zhidong, Zhou Jun et al (1985), "Two new oleanolic acidtype saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 103-108. 44. Wang DQ, Fan J, Feng BS et al (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus(Seem.)", Yao Xue Xue Bao, 24(8), 593-9. 45. "Effect of Tomato Industrial Processing (Different Hybrids, Paste, and Pomace) on Inhibition of Platelet Function In Vitro, Ex Vivo, and In Vivo" (2014), JOURNAL OF MEDICINAL FOOD, 17(4), 505–511. 46. Kose Emine, Nevruz Oral, Honca Mehtap et al (2013), "In Vitro Effect of Dexmedetomidine on Platelet Aggregation", REVISTABRASILEIRA DE ANESTESIOLOGIA. 47. David Gurney (2016), "Platelet function testing: from routine to specialist testing", Journal British Journal of Biomedical Science, 73(1), 10-20. 48. Chun Liang, Yan Ding, Jeong Ah Kim et al (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells", Bulletin of the Korean Chemical Society, 32(9), 3513-3516. 49. Cattaneo M (2009), "Results of a Worldwide Survey on the Assessment of Platelet Function by Light Transmission Aggregometry: a Report from the Platelet Physiology Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis ", J Thromb Haemost, 7(6), 1029. 50. Platelet Function Testing: Light Transmission Aggregometry [LTA], tại trang web haemostasis.com/Platelets/platelet_function_testing_lta.html. 51. "Principles of platelet aggregation in clinical trials", JAVA clinical Research. 52. Anjali A Sharathkumar và Amy Shapiro (2008), "Platelet function disorders", World Federation of Hemophilia© School. of Medicine and Pharmacy, VNU 53. Zhu Suying, Duan Chengli và Xiao Fenghui ((2005), "The diurnal variations of photosynthesis in Panax stipuleanatus", Journal of Yunnan Agricultural.