›

Khóa luận Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

pdf 62 trang thiennha21 18/04/2022 2860
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_dinh_luong_eurycomanone_trong_re_cay_ba_benh_euryc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC TRẦN THỊ THU PHƢƠNG ĐỊNH LƢỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC TRẦN THỊ THU PHƢƠNG ĐỊNH LƢỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội - 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc thực hiện tại bộ môn Hóa dƣợc và Kiểm nghiệm thuốc thuộc Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội. Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 5 năm học vừa qua. Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy cô bộ môn Hóa dƣợc và Kiểm nghiệm thuốc đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin phép bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hữu Tùng đã nhiệt tình, tận tâm hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em hoàn thành tốt nhất khóa luận này. Em cũng xin cảm ơn dƣợc sỹ Nguyễn Thị Huệ (QH.2012.Y) và các bạn cùng nhóm nghiên cứu Thùy, Phƣợng, Chuyên và tập thể lớp Dƣợc học khóa 2 (QH.2013.Y) đã luôn sát cánh, động viên, cổ vũ tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận này một cách tốt nhất. Qua đây, em cũng cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận. Mặc dù đã nỗ lực, cố gắng hết sức mình để hoàn thành khóa luận, song do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên không thể tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự cảm thông và góp ý tận tình của các thầy cô để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2018 Sinh viên Trần Thị Thu Phƣơng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril DAD Diode array detector Detector mảng điốt HPLC High performace liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography IL Interleukin Interleukin LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng LPS Lipopolysaccharide MeOH Methanol Methanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối TN Thí nghiệm UV Ultra violete VIS Visible @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ảng 1.1. Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh 5 ảng 3.1. hƣơng trình chạy dung môi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh. 20 ảng 3.2. Tính thích hợp hệ thống 23 ảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eurycomanone 24 ảng 3.4. Kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp 25 ảng 3.5. Kết quả độ đúng của phƣơng pháp 26 ảng 3.6. Kết quả định lƣợng eurycomanone trong rễ bá bệnh. 27 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 3 Hình 1.2. Cấu trúc chung nhóm quasinoid 9 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của eurycomanone. 9 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa các đại lƣợng thời gian của HPLC 13 Hình 2.1. Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 17 Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn 21 Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 22 Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu) 22 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone 24 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 HƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Phân bố và sinh thái 4 1.1.3. Thu hái, chế biến 4 1.1.4. Thành phần hóa học 4 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý 6 1.1.6. Tính vị và công năng 7 1.1.7. Một số bài thuốc dân gian từ cây bá bệnh 8 1.2. Tổng quan về nhóm quassinoid 8 1.2.1. Khái quát chung và quassinoid 8 1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại 8 1.3. Tổng quan về eurycomanone 9 1.3.1. Công thức hóa học 9 1.3.2. Tính chất lí hóa 10 1.3.3. Tác dụng sinh học của Eurycomanone 10 1.3.4. Một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone bằng HPLC 10 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPL 13 1.4.1. Nguyên tắc HPLC 13 1.4.2. Một số thông số đặc trƣng 13 1.4.3. Thẩm định phƣơng pháp HPL 15 HƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1. Nguyên liệu 17 2.1.2. Dung môi, hóa chất 17 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.1.3. Máy móc, dụng cụ 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17 2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh 18 2.2.2. Phƣơng pháp phân tích bằng HPLC 18 2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 19 HƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. KẾT QUẢ 20 3.1.1. Quy trình chiết rễ cây bá bệnh 20 3.1.2. Xây dựng quy trình định lƣợng 20 3.2. Thảo luận 28 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 28 3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích eurycomanone bằng HPLC 28 3.2.3. Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bá bệnh 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 30 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là đất nƣớc nhiệt đới gió mùa với nguồn cây thuốc vô cùng phong phú. Từ lâu nay nhân dân ta đã sử dụng rất nhiều cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc. Ngày nay, với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học, kĩ thuật nên có rất nhiều dƣợc liệu tiềm năng đã, đang và sẽ đƣợc nghiên cứu rộng rãi. Trong đó, cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.), họ Thanh thất (Simaroubaceae) đƣợc nhân dân ta sử dụng khá nhiều với một số công dụng nhƣ vỏ dùng chữa những trƣờng hợp ăn uống không tiêu, đau lƣng, quả dùng chữa lị. Ở ampuchia, ngƣời ta dùng rễ chữa ngộ độc, say rƣợu, trị giun. Lá còn đƣợc dùng để tắm trị ghẻ, lở ngứa. Ngoài ra bá bệnh còn đƣợc biết đến với công dụng tăng cƣờng sinh lực, hỗ trợ điều trị yếu sinh lí ở nam giới, kích thích ham muốn [14,15,32]. Hơn nữa, bá bệnh đã đƣợc chứng minh là có tính chống viêm, chống sốt rét, chống oxy hóa [11,21,22,28,32,45], điều trị tiểu đƣờng [32], là một ứng cử viên tiềm năng điều trị ký sinh trùng đƣờng ruột Blastocystis [17]. Trên thế giới, bá bệnh đƣợc đƣợc đánh giá là một dƣợc liệu có hiệu lực điều trị tốt và đem lại hiệu quả kinh tế rất cao. Bá bệnh còn đƣợc gọi là Sâm Malaysia vì đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc bổ sức khỏe và chống lão hóa [34,45]. Nhóm quassinoid, nhóm hợp chất chính trong bá bệnh bao gồm một số chất nhƣ eurycomanone, eurycomalactone, eurycomanol, eurycolactone đƣợc báo cáo là góp phần vào tính chất chữa bệnh tăng sức mạnh cơ bắp, sức bền, giảm lo lắng, căng thẳng, diệt vi trùng sốt rét Plasmodium falcifarum đã kháng thuốc [1,2,21,32], phòng ngừa và điều trị loãng xƣơng ở nam giới do thiếu androgen [19]. Trong đó, eurycomanone là hợp chất chính mang lại hiệu quả cao trong tác dụng chữa bệnh của cây. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về eurycomanone – một marker chính của cây bá bệnh còn rất hạn chế. Ngoài ra khả năng nhân giống kém cộng với tốc độ sinh trƣởng chậm và việc khai thác rễ không hợp lí đã khiến cho nguồn dƣợc liệu này cạn kiệt. Ngoài ra, trong dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận định lƣợng eurycomanone trong bá bệnh. Bên cạnh đó, việc kiểm nghiệm bá bệnh cũng nhƣ các chế phẩm bá bệnh chủ yếu là thực phẩm chức năng vẫn chƣa đƣợc thực hiện. Trên cơ sở đó và cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn có của phòng thí nghiệm bộ môn Hóa dƣợc và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dƣợc, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. Đại học Quốc gia Hà Nội đề tài “Định lƣợng eurycomanone trong cây bá bệnh (Eurycoma longifoila) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC” đã đƣợc tiến hành. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu bá bệnh cũng nhƣ việc quản lí các sản phẩm từ bá bệnh trên thị trƣờng. Các mục tiêu của đề tài: 1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng eurycomanone bằng HPLC và thẩm định phƣơng pháp phân tích. 2. Xác định hàm lƣợng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  11. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 1.1.1. Đặc điểm thực vật Theo phân loại thực vật học thì bá bệnh thuộc: Giới: Plantae Ngành: Magnolio phyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Sapindales Họ: Simaroubaceae Chi: Eurycoma Loài: E.longifolia Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack., họ Thanh thất Simaroubaceae) còn đƣợc gọi là bách bệnh, mật nhơn, mật nhân, hậu phác nam, Tongkat Ali (Malaysia), Antong sar (Campuchia), Tho nan (Lào), Pasak Bumi hoặc Bedara Pahit (Indonesia) [45]. Hình 1.1. Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) [ ] Cây nhỡ, cao 2-8 m, cao nhất 15-18 m [39] ít phân cành, có lông ở nhiều bộ phận. Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, gồm 21-25 lá chét không cuống, mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dƣới có lông màu trắng xám, cuống lá màu nâu đỏ. Lá non có lông mịn, lá trƣởng thành @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  12. không có lông. Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép hoặc chùy rộng, cuống hoa có lông màu gỉ sắt, hoa có màu đỏ nâu, đài hoa đƣợc chia thành năm thùy hình tam giác có tuyến ở lƣng, tràng hoa năm cánh hình thoi cũng có tuyến, nhị năm có lông dày và hai vảy ở gốc, đầu nhụy rời. Chỉ nhị màu đỏ và có lông. Hoa và bao hoa phủ đầy lông. Nụ hoa nhỏ, hình trứng. Quả hạch, hình trứng, nhẵn, có rạch dọc, khi chín có màu vàng đỏ, chứa một hạt. Trên mặt hạt có nhiều lông ngắn. Quả non màu xanh, có lông sét nâu, quả già chuyển màu hồng nhạt, thịt quả mềm, ngọt, ăn đƣợc. Quả chín màu đỏ tƣơi chuyển sang đỏ nâu, trơn nhẵn [1,2]. 1.1.2. Phân bố và sinh thái Bá bệnh gặp chủ yếu ở các nƣớc Đông Nam Á: Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia Loài này còn xuất hiện ở Nam Trung Quốc và Ấn Độ. Cây mọc phổ biến ở nƣớc ta đặc biệt là miền Trung, Tây Nguyên [1,2]. Cây thƣờng mọc hoang trong các rừng thƣa, dƣới tán các cây gỗ lớn. Cây có thể chịu đƣợc bỏng nên mọc ở những cánh rừng khá nguyên sinh, rừng thú sinh. Cây mọc ở vùng đồi thì có khá thấp trong khi những cây mọc dƣới tán rừng thì cao hơn 5-7 m. Bá bệnh ra nhiều hoa quả nhƣng lƣợng cây con đƣợc tái sinh từ hạt thì không nhiều do quả rụng vào mùa mƣa lũ bị cuốn trôi. Tuy nhiên, khả năng tái sinh cao vì dễ dàng bắt gặp chồi của nó sau khi bị chặt phá. Dù vậy, nhƣng bá bệnh là cây quý, cần đƣợc bảo tồn và phát triển. 1.1.3. Thu hái, chế biến Có thể dùng toàn cây để làm thuốc nhƣng chủ yếu là rễ trụ của cây trên 5 tuổi. Rễ càng đắng thì đƣợc coi là càng có giá trị. Sau khi thu hoạch rễ, rửa sạch, thái lát, phơi khô thu đƣợc dạng gỗ màu vàng ngà, vị đắng đặc biệt. 1.1.4. Thành phần hóa học - Trong vỏ và gỗ bá bệnh, ngƣời ta đã chiết đƣợc một số hợp chất sau [1]: Các hợp chất quassinoid, có khoảng 150 loại: Eurycomalactone, longilactone, eurycomanol, Eurycomanone, 5,6 – dehydro – eurycomalactone Từ rễ đã phân lập đƣợc 3 quassinoid: Eurycomanol, 2-O-β-D glucopyranosid và 13β,18-dihydroeurycomanol. Các hợp chất triterpen: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, melianon Các alkaloid loại canthin-6-on đƣợc phân lập từ vỏ và gỗ: 9,10-dimethoxy-6-on, 10-hydroxy-9-methoxy-canthin-6-on, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  13. Ngoài ra còn có alkaloid carbolin. Từ vỏ cây bách bệnh ở miền Đông Nam ộ Việt Nam đã xác định đƣợc thành phần 2 chất đắng: eurycomalacton (chiếm tỷ lệ cao nhất) và 2,6 dimethoxybenzoquinon (một sắc tố màu vàng). Ngoài ra còn campestrol và β-sitosterol [1,2]. - Trong rễ và lá cây bá bệnh đã xác định đƣợc một số hợp chất sau [37] ảng 1.1. Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh Bộ phận Dung môi Thành phần hóa học chiết Rễ Nƣớc - Quassinoids: Eurycolactones A-E,eurycomalides A-B, eurycomalactone, 6α - hydroxyeurycomalactone, 7α - Hydroxyeurycomalactone, eurycomanone, 13α(21)-epoxyeurycomanone, 12,15diacetyl-13α(21)-epoxyeurycomanone, 12-acetyl-13,21dihydroeurycomanone, 15-acetyl13α(21)-epoxyeurycomanone, 3,4εdihydroeurycomanone, 13,21dihydroeurycomanone, eurycomanol - Canthin-6-one alkaloids - Triterpene - Một số khác: Natri, Kali Methanol - Quassinoids: Eurycolactones A-F,eurycomalides A-B, eurycomalactone, 6α-hydroxyeurycomalactone, 6-hydroxy5,6-dehydroeurycomalactone, 5,6dehydroeurycomalactone, eurycomanone, 13β,21-dihydroxyeurycomanol, 14,15β- dihydroxyklaineanone - Triterpenes: eurylene, hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol Ethanol Quassinoids: eurycomanone, longilactone, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  14. 50% 13,21dihydroeurycomanone, eurycomalactone, 13α(21)epoxyeurycomanone Lá Ethanol Quassinoids: lonilactone, 6-dehydro lonilactone,11- dehydroklaineanone 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý Một số tác dụng dƣợc lý của bá bệnh đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh nhƣ sau: Cao chiết từ bá bệnh có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét trên thí nghiệm nuôi cấy in vitro [1,2,11,21,28,32]. Nghiên cứu trên in vitro và in vivo cho thấy dịch chiết rễ bá bệnh có khả năng chống ung thƣ dòng tế bào K-562 [16]. Cao chiết methanol rễ tơ và rễ tự nhiên cây Bá bệnh có khả năng ức chế (quá trình) sản xuất cytokine gây viêm IL-6 kích thích bởi LPS (1 µg/ml) ở dòng tế bào của ngƣời THP-1 [12]. Bá bệnh có tác dụng tăng dục, hoạt tính kích thích sinh dục nam và lƣợng nội tiết tố sinh dục nam trong huyết tƣơng có một mối tƣơng quan với nhau [1,15]. Thân và rễ bá bệnh làm tăng lƣợng testosteron nhiều hơn thân cây [1]. Bá bệnh còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus [20,22,32]. Một chế phẩm thuốc gồm 3 dƣợc liệu: bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ có độc tính cao và độc tính trƣờng diễn rất thấp. Thuốc có tác dụng lợi mật rõ rệt và không làm thay đổi thành phần của mật ở chuột lang. Thuốc làm tăng thải trừ BSP của gan thỏ so với đối chứng [1]. Chế phẩm thuốc này có tác dụng làm chậm quá trình hƣ biến của gan chuột cống trắng gây nên do carbon tetreclorid. Nó cũng làm tăng tái tạo của tế bào gan chuột nhắt trắng trong mô hình gây thƣơng tổn gan thực nghiệm [1]. Áp dụng trên bệnh nhân có chỉ định điều trị lợi mật, chế phẩm gồm bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ đã làm giảm bilirubin máu một cách có ý nghĩa [1]. Một số quassinoid nhƣ eurycomanol, eurycomalactone có tác dụng làm giảm lipopolysaccharide gây ra sốt ở chuột sau 1 giờ và có khả năng mạnh hơn aspirin. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  15. Nghiên cứu in vitro và in vivo đều chứng minh bá bệnh có tác dụng chống ung thƣ tiền liệt tuyến ở ngƣời [13]. Dịch chiết nƣớc từ rễ cây mật nhân có khả năng kháng oxi hoá nhƣng hoạt lực tƣơng đối yếu [9,12,22]. Trên cơ địa động vật giảm năng sinh dục cao rễ bách bệnh đều thể hiện tác dụng làm tăng hàm lƣợng testosteron huyết, tăng trọng lƣợng của cơ quan sinh dục đực và tác dụng này thể hiện rõ trên động vật bình thƣờng ở liều cao. Trên hai mô hình chuột bình thƣờng và chuột bị gây giảm năng sinh dục, hàm lƣợng protein toàn phần trong huyết tƣơng tăng và có khuynh hƣớng làm tăng trọng lƣợng cơ nâng hậu môn, nhƣng không làm tăng thể trọng cơ thể [10]. Tác dụng tăng cƣờng chức năng sinh dục cho nam giới là tác dụng chủ yếu nhất, đƣợc sử dụng nhiều nhất, đƣợc dùng sớm nhất, đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Trong vòng 20 năm (1994-2014) đã có trên 200 công trình nghiên cứu về tác dụng này của bá bệnh. Ở Lào, bá bệnh đƣợc dùng để chữa bệnh cao huyết áp, dùng cho phụ nữ sau sinh [23]. Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi đã gây loãng xƣơng. Thực hiện đồng thời 2 nhóm. Một nhóm cho uống Eurycoma longifolia và một nhóm sử dụng testosterone thì thấy sau 6 tuần cả 2 nhóm đều cho hiệu quả ngăn chặn sự mất canxi ở chuột. Vì thế bá bệnh có tiềm năng điều trị loãng xƣơng ở ngƣời thiếu hụt androgen [33]. Năm 2006, Đại học Dƣợc Hà Nội đã nghiên cứu tác dụng dƣợc lý cây bá bệnh. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, Trịnh Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hải Hà nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống trắng với dịch chiết nƣớc rễ cây bá bệnh. Kết quả cho thấy với liều 10 mg/kg thể trọng thì trọng lƣợng các cơ quan sinh dục, tinh hoàn, túi tinh đều tăng. 1.1.6. Tính vị và công năng Theo y học cổ truyền, bá bệnh có tính mát, vị đắng, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi thấp, lợi tiểu, lƣơng huyết, chỉ lỵ dùng để chữa tiểu tiện ra máu, ăn không tiêu, đầy hơi, chƣớng bụng Rễ chữa ngộ độc và tẩy giun. Lá chữa ghẻ lở. Theo kinh nghiệm dân gian, ngƣời dân còn lấy rễ cây làm thuốc hạ sốt, nhanh lên da non ở chỗ da bị nhiễm trùng, tổn thƣơng. Ở ampuchia, ngƣời ta dùng rễ để chữa vàng da. Ở Malaysia và Indonesia thì bá bệnh đƣợc biết đến là thần dƣợc kích dục nam giới, điều trị tăng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  16. huyết áp, đau mỏi cơ bắp, nâng cao sức khỏe. Theo kinh nghiệm dân gian Indonesia, nƣớc sắc lá hoặc vỏ thân bá bệnh là vị thuốc cổ truyền tốt nhất chữa sốt rét. Hiệu lực tƣơng đƣơng viên nén cloroquin trong điều trị sốt rét [1]. 1.1.7. Một số bài thuốc dân gian từ cây bá bệnh [1] Bài 1: Chữa phong tê, liệt nửa ngƣời Bá bệnh 4 g, rễ xấu hổ 8 g, dây đau xƣơng 8 g, đậu chiều 8 g, trâu cổ 8 g, rễ đinh lăng 8 g, hồ tiêu trắng 5 g, quế chi 5 g, gừng sống 3 g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nƣớc còn 100 ml, uống 2 lần trong ngày. Bài 2: Tƣ bổ âm huyết thang, chữa âm huyết suy kém, tê bại nửa ngƣời bên phái, nóng ran Bách bệnh 6 g, đậu đen 12 g, hà thủ ô đỏ 12 g, dây gùi 8 g, huyết rồng 8 g, rau muống biển 8 g, rễ nhàu 8 g, rễ ô môi 8 g, rễ cỏ xƣớc 8 g, tang chi 8 g, dây kí ninh 2 g. Sắc nƣớc uống. Bài 3: Bá ứng tiêu hạ tán, chữa đau bụng, ăn không tiêu, đầy hơi chƣớng bụng Bá bệnh 50 g, vỏ quýt 100 g, hoắc hƣơng 100 g, củ bồ bồ 100 g, dây mơ 100 g, dây rơm 100 g, cam thảo nam 100 g, hậu phác 100 g, củ sả 50 g, củ gấu 50 g, tiêu lốt 50 g. Các vị tán nhỏ, ngày uống 12 gam (ngƣời lớn), trẻ em thùy theo tháng tuổi mà quy định liều. 1.2. Tổng quan về nhóm quassinoid 1.2.1. Khái quát chung và quassinoid Quassinoid là một triterpenoid thứ cấp, giàu oxy có vị đắng, là thành phần chính trong họ Thanh thất Simaroubaceae. an đầu, chúng đƣợc gọi là Quassin. Các nghiên cứu về quassinoid cho thấy đây là loại hợp chất giàu tiềm năng trong điều trị các bệnh nhƣ tác dụng kháng khối u, kháng virus, kháng viêm, kháng amib, sốt rét, kháng vi trùng lao, chán ăn [35,42] Ngoài ra, trong một nghiên cứu, rất nhiều quassinoid có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ phổi, tế bào ung thƣ cổ tử cung [24] và bảo vệ dạ dày [36]. 1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại Đến nay đã có khoảng 150 chất thuộc nhóm quassinoid đƣợc chiết xuất, phân lập và mô tả cấu trúc. Có thể chia thành 5 khung chính nhƣ sau 18-, C19-, C20-, C22- và C25-quassinoid. Có một số tác giả còn gọi tên các khung là khung laurycolactan (C18), khung cedrolidan (C19), khung quassolidan (C20), khung picrolemman (C22) và khung simarolidan (C25-quassinoid). Trong đó, thƣờng thấy @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  17. nhóm chức chứa oxy nhƣ ceton, ester, lacton, hydroxy, methoxy. Nhóm 20 thấy nhiều nhất với 76% nhóm chức chứa oxy. Nhóm C19 chiếm 19%, C18 chiếm 3%, còn C22 và C25 chiếm rất ít, khoảng 1% [24]. Hình 1.2. Cấu trúc chung nhóm quasinoid 1.3. Tổng quan về eurycomanone 1.3.1. Công thức hóa học Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của eurycomanone. Công thức phân tử: C20H24O9 [42]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  18. Vị trí: eurycomanone thuộc C20-quassinoid Tên khoa học: (1 β, 11 β, 12 α, 15 β) -1,11,12,14,15-pentahydroxy-11,20- epoxypicrasa-3,13 (21)-diene-2,16-dion. Phân tử lƣợng: 408,02 g/mol [42]. 1.3.2. Tính chất lí hóa Eurycomanone là chất rắn, màu trắng, không mùi, điểm cháy -20◦ , điểm nóng chảy 251-253oC [42]. Tỉ trọng 1,6 g/cm3. 1.3.3. Tác dụng sinh học của Eurycomanone Eurycomanone là thành phần có hoạt tính góp phần vào tác dụng sinh học của bá bệnh. Eurycomanone là một trong những quassinoid chính của rễ cây mật nhân, có khả năng làm tăng nội tiết tố testosterone và lƣợng tinh dịch ở chuột đực, có tác dụng chống lại estrogen trong cơ thế chuột trƣởng thành. Theo công bố vào năm 2008, eurycomanone còn có khả năng gây độc tế bào đối với các tế bào ung thƣ, có khả năng gây độc tế bào đối với dòng tế bào gây ung thƣ phổi 54, dòng tế bào K và có hoạt tính chống sốt rét khá mạnh [9]. Trong một nghiên cứu tiến hành trên 126 ngƣời Nhật Bản ở độ tuổi trung niên đƣợc thực hiện trong 4 tuần. Có 2 nhóm, 1 nhóm uống dịch chiết thân rễ bá bệnh 200 mg/ngày, 1 nhóm dùng giả dƣợc thì thấy uống dịch chiết đó giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch ở cả nam và nữ trong độ tuổi trung niên [25]. Một thử nghiệm lâm sàng khác đã nhấn mạnh và chứng minh đƣợc vai trò của eurycomanone nhƣ một chất chống lại các rối loạn về sức khỏe tình dục của nam giới bao gồm rối loạn chức năng cƣơng dƣơng, vô sinh, ham muốn tình dục thấp hay những ảnh hƣởng đến hormon nam. Eurycomanone là một tiềm năng làm mới sức sống tình dục, tăng cƣờng khả năng sinh dục cho nam giới [26]. Eurycomanone ức chế sự biểu hiện của dấu hiệu khối u ung thƣ phổi bằng cách ức chế sự gia tăng tế bào ung thƣ phổi [27,46] và gây độc các dòng tế bào ung thƣ vú (M F-7) [45]. Ngoài ra, eurycomanone còn có tác dụng sinh học là chống sốt rét Plasmodium falciparum [28,41,42,45]. 1.3.4. Một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone bằng HPLC Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bao gồm cả phƣơng pháp truyền thống cũng nhƣ phƣơng pháp hiện đại. HPLC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  19. là một trong những phƣơng pháp hiện đại đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay. Dƣới đây là một vài nghiên cứu định lƣợng eurycomanone. a. Định lượng eurycomanone trong rễ cây Tongkat Ali (Eurycoma longifoila) [31] - Cột: Dionex C18 (5 µm x 4,6 mm x 50 mm) và Acclaim Polar C18 (5 µm x 4,6 mm x 250 mm) - Detector: UV (254 nm) - Pha động: nƣớc tinh khiết (A), methanol (B) và acetonitrile (C) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Nhiệt độ cột: 37oC - Đƣờng chuẩn: R2 = 0,8923 b. Định lượng eurycomanone trong rễ Eurycoma longifolia bằng RP-HPLC [30] - Cột: SPE C18 - Pha động: Nƣớc tinh khiết (A), methanol (B) và acetonitril (C) - Detector: UV (254 nm) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Nhiệt độ cột: 20oC - Độ tuyến tính: nồng độ 5-50 µg/ml, R2 = 0,997. - LOD = 2,7 µg/ml, LOQ = 9,1 µg/ml - Thời gian lƣu có RSD < 2,5%, diện tích pic có RSD < 5% c. Sử dụng RP-HPLC để kiểm định eurycomanone trong cây bá bệnh và chế phẩm bá bệnh [38] - Cột: Phenomenex, Luna C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Pha động: N ( ) và acid formic trong nƣớc 0,1% (B) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Detector: UV (254 nm). Eurycomanone hấp thụ mạnh nhất trong khoảng 248-255 nm. - Độ tuyến tính: 0,1-50 µg/ml - LOD = 0,29 ± 0,1 µg/ml, LOQ = 0,887 ± 0,30 µg/ml d. Định lượng eurycomanone trong cây bá bệnh và chế phẩm bằng HPLC- DAD/ELSD [29] - Cột: Kinetex EVO C18 100 Å (150 × 4,6 mm; 3 μm) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  20. - Pha động: 0,02% trifluoroacetic acid ( ) và acetonitrile ( ) - Nhiệt độ cột: 30◦C - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Detector: UV (254 nm) - Độ tuyến tính: phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = 1827,4x + 5,928 với R2 = 0,9991. - LOD = 0,04 mg/ml và LOQ = 0,11 mg/ml - Độ lặp lại có RSD = 0,53%. e. Phát hiện và định lượng eurycomanone trong các chế phẩm [40] - Cột: Xbridge (Supelcosil 5 µm, 250×4,6 mm) - Pha động: isocratic và acetonitrile (86:14) - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Độ tuyến tính: 0,01325-0,5 mg/ml, R2 = 0,999 - LOD = 0,0227 mg/ml, LOQ = 0,069 mg/ml f. Dùng HPLC để định lượng một số thành phần trong cây bá bệnh [41] - Cột: Metaphase KR I00-5-C18 (5 µm, 250 x 4,6 mm) - Pha động: isocratic trong Me N và nƣớc (26: 74) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Detector: UV (238 m) g. Dùng HPLC để phân tích eurycomanone [43] - Cột: Phenomenex C18 (250 mm × 4,6 mm × 4 µm) - Pha động: acetonitrile và 0,05% orthophosphoric acid (24:76, v/v) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Detector: UV (245 nm) - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Độ tuyến tính: R2 = 0,971 h. Định lượng eurycomanone trong Tongkat Ali [44] - Cột: Synerg 4u Fusion-RP80A (150 x 4,60 mm, 4 µm) - Pha động: Acid phosphoric 0,05% và ACN (85:15) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Detector: UV (254 nm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  21. 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 1.4.1. Nguyên tắc HPLC HPLC là một kĩ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học vừa có tính chất lí học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc kí giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan theo từng lớp qua chất nhồi cột từ đầu cột đến cuối cột. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố, vì thế có những chất tan bị giữ lâu, có chất bị lƣu giữ ít. Đây chính là cơ sở của sự tách các chất của phƣơng pháp HPLC. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ. 1.4.2. Một số thông số đặc trƣng a. Thời gian lưu Hình 1.4. Mối quan hệ giữa các đại lượng thời gian của HPLC R là thời gian lƣu của 1 cấu tử từ khi vào cột đến khi tách khỏi cột. t0 là thời gian chết là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột hay thời gian để một chất không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột. t’R là thời gian lƣu thực của 1 cấu tử @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  22. Vậy t’R = tR – t0 . b. Hệ số dung lượng k’ Hệ số dung lƣợng k’ đƣợc định nghĩa theo công thức sau: k’ = = – = – 1 Nếu k’ ~ 0 thì tR ~ t0, chất ra rất nhanh, cột không có khả năng tách chất. Nếu k’ càng lớn tức tR càng lớn thì chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích lâu. Khoảng k’ lí tƣởng là 2-5 nhƣng khi phân tích một hỗn hợp chất thì có thể chấp nhận k’ thuộc 1-20. c. Hệ số chọn lọc Hệ số chọn lọc đƣợc tính theo công thức: α = Hệ số chọn lọc đặc trƣng cho khả năng tách 2 chất của cột. α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Quy ƣớc B là chất bị lƣu giữ lâu hơn nên α > 1 Để tách riêng hai chất thƣờng chọn 1,05 α 2 d. Hiệu năng (Số đĩa lí thuyết) Hiệu năng của cột đặc trƣng cho khả năng tách sắc kí của các cấu tử trên cột và đƣợc tính theo công thức sau: N = 16( ) Với : W là chiều rộng ở đáy pic. N là số đĩa lí thuyết. e. Hệ số bất đối (AF) Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ và đƣợc tính nhƣ sau: AF = Trong đó : W1/20 là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: là khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Trong phép định lƣợng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2 Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  23. 1.4.3. Thẩm định phƣơng pháp HPLC Thẩm định phƣơng pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phƣơng pháp đó đáp ứng đƣợc các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose). Kết quả của thẩm định phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để đánh giá chất lƣợng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phƣơng pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy. Các thông số thẩm định bao gồm: a. Độ đặc hiệu Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Tính đặc hiệu thƣờng liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích. b. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính. Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ số hồi quy tƣơng quan. Đƣờng chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đƣờng chuẩn mắc những sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất chính xác của kết quả. Điều đầu tiên để kiểm soát đƣợc sự chính xác của các nồng độ chuẩn khi xây dựng đƣờng chuẩn là cần đảm bảo độ chính xác của chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà sản xuất) về hàm lƣợng, độ tinh khiết. Một quy trình HPL thông thƣờng dùng định lƣợng phải có hệ số tƣơng quan tuyến tính của đƣờng chuẩn R2 > 0,999. c. Độ đúng và độ lặp lại Độ lặp lại là một khái niệm định tính và đƣợc biểu thị định lƣợng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ lặp lại càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  24. Độ đúng của phƣơng pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng. Muốn xác định độ đúng cần phải tìm đƣợc giá trị đúng, có nhiều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phƣơng pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận) và phƣơng pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại). d. Giới hạn phát hiện (LOD) Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc lớn hơn độ không đảm bảo đo của phƣơng pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc. Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền. Thông thƣờng lấy S/N=3 e. Giới hạn định lượng (LOQ) LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. LOQ chỉ áp dụng cho các phƣơng pháp định lƣợng. Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu: Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đƣờng nền. ách tính toán hoàn toàn tƣơng tự nhƣ trong phần tính LOD. LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng thƣờng lấy S/N = 10. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  25. CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu rễ cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.). Mẫu đƣợc cung cấp bởi PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng, khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Mẫu tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại Khoa Y Dƣợc, ĐHQGHN. Hình 2.1. Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 2.1.2. Dung môi, hóa chất - Chất chuẩn Eurycomanone (Wako chemical, Nhật Bản; độ tinh khiết 97%) - Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC. - cid formic 0,1%/ nƣớc đƣợc pha từ acid formic P (Merk, Đức) - Methanol dùng cho HPL (Merk Đức). - Nƣớc cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV. 2.1.3. Máy móc, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 Technologies - Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức - Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm - Cân phân tích 4 chữ số. - Các dụng cụ thông thƣờng khác trong phòng thí nghiệm: ình định mức, pipet, ống đong, tủ sấy 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  26. 2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh Để chiết xuất thành phần có hoạt tính sinh học eurycomanone từ rễ cây bá bệnh, chúng tôi đã tham khảo nhiều nguồn tài liệu. Có thể chiết xuất eurycomanone bằng mathanol, ethanol và nƣớc. Chiết bằng methanol cho hiệu suất cao nhất [39]. Vì thế chúng tôi đã lựa chọn quy trình chiết xuất bá bệnh đƣợc tiến hành nhƣ sau: - Phƣơng pháp chiết: siêu âm - Dung môi chiết: Methanol - Số lần chiết: 3 - Thời gian chiết: 30 phút/lần. 2.2.2. Phƣơng pháp phân tích bằng HPLC a. Lựa chọn điều kiện sắc ký Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp HPL để tách, định tính, định lƣợng eurycomanone từ rễ cây bá bệnh. húng tôi đã khảo sát các điều kiện sau: - Cột sắc ký: Tiến hành trên cột sắc ký Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) - Pha động: Tham khảo từ nhiều nguồn tài liệu kết hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, chúng tôi đã khảo sát thành phần dung môi với tỉ lệ và tốc độ dòng khác nhau. - Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 2 loại detector UV, D D để đảm bảo vừa phát hiện đƣợc đƣợc chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất. b. Thẩm định phương pháp Độ đặc hiệu Chuẩn bị 2 mẫu: mẫu trắng là dung dịch MeOH và mẫu eurycomanone chuẩn pha trong MeOH. So sánh các pic trên các sắc ký đồ thu đƣợc từ việc phân tích các mẫu trên. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn eurycomanone pha trong MeOH có nồng độ từ 18,75–200 μg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan R. Độ lặp lại (độ chụm) Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch chuẩn eurycomanone, xác định kết quả định lƣợng theo đƣờng chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  27. định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tƣơng đối giữa giá trị của các lần định lƣợng. Độ đúng Độ đúng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ eurycomanone vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch sau: 1. Dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp. 2. Dung dịch thử: dung dịch dịch chiết rễ cây bá bệnh pha trong MeOH. 3. Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lƣợng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lƣợng eurycomanone có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng. Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính đƣợc phần trăm tìm lại so với lƣợng chuẩn thêm vào mẫu thử. 2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2013 - Giá trị trung bình: = ∑ ∑ - Độ lệch chuẩn: S = √ - Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD = x 100% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  28. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. Quy trình chiết rễ cây bá bệnh Thực hiện đồng thời trên 6 mẫu độc lập, mỗi mẫu là 100 mg dƣợc liệu rễ cây bá bệnh phơi khô. Với mỗi mẫu, cắt nhỏ vụn và thêm 5 ml MeOH rồi đem siêu âm trong 30 phút. Gạn dịch chiết và lặp lại 2 lần nhƣ trên. Gộp các dịch chiết với nhau, sau đó sấy ở 50oC đến khối lƣợng không đổi. 3.1.2. Xây dựng quy trình định lƣợng a. Điều kiện sắc ký Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký sử dụng hệ thống HPL gilent 1260 Infinity nhƣ sau: - Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) - Pha động: (acid formic 0,1%/nƣớc): B (ACN) - Detector D D: bƣớc sóng 244 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl - Nhiệt độ buồng cột: 20 ± 0,8oC - Dung môi pha mẫu: MeOH. ảng 3.1. Chương trình chạy dung môi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh. Thời gian (phút) %A %B 0 90 10 5 90 10 10 70 30 14 70 30 18 0 100 28 0 100 30 90 10 35 90 10 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  29. Kết quả là chúng tôi thu đƣợc sắc ký đồ của dung dịch chuẩn eurycomanone với điều kiện sắc ký nhƣ trên. Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn b. Thẩm định phƣơng pháp phân tích Chuẩn bị dung dịch + Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn eurycomanone, hòa tan và định mức trong bình định mức 10 ml bằng MeOH đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 μg/ml (ppm). Từ dung dịch chuẩn 1000 ppm tiến hành pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 18,75 – 25 – 37,5 – 50 – 100 – 200 ppm. + Dung dịch thử: Cắn chiết dƣợc liệu eurycomanone đƣợc tiến hành nhƣ mục 3.1.1 pha trong MeOH. + Dung dịch mẫu trắng: MeOH. Độ đặc hiệu Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích eurycomanone theo chƣơng trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lƣu và phổ UV của pic eurycomanone trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của eurycomanone (tR = 10,117 phút) (hình 3.3). Vậy phƣơng pháp phân tích eurycomanone xây dựng đƣợc có độ đặc hiệu cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  30. Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu) Tính thích hợp hệ thống Chuẩn bị một mẫu dung dịch eurycomanone chuẩn nồng độ 200 μg/ml. Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện nhƣ ở mục trên. Xác định các thông số sau mỗi lần tiêm: thời gian lƣu, diện tích pic, hệ số bất đối và số đĩa lý thuyết của eurycomanone trên sắc ký đồ. Kết quả đƣợc thực nghiệm đƣợc trình bày ở bảng sau. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  31. ảng 3.2. Tính thích hợp hệ thống Thí Thời gian Diện tích pic Hệ số bất Số đĩa lý nghiệm lƣu (phút) (mAU.s) đối thuyết 1 10,174 928,21710 1,17 24387 2 10,141 910,82135 1,20 22722 3 10,150 905,16760 1,20 23741 4 10,130 921,32361 1,20 23479 5 10,129 928,43359 1,19 23147 6 10,131 973,97461 1,17 24196 TB 10,1425 927,98964 1,188 23612 RSD (%) 0,172 2,628 1,239 2,668 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của thời gian lƣu và diện tích pic trong các phép thử lần lƣợt là 0,172% và 2,628% đều nhỏ hơn 5%, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 1,17 đến 1,2) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 23612 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Nhƣ vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định tính, định lƣợng eurycomanone. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 18,75 – 25 – 37,5 – 50 – 100 – 200 μg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tƣơng ứng. Lập phƣơng trình hồi quy tuyến tính, hệ số tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tƣơng ứng trên sắc ký đồ bằng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu (bảng 3.3). Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc thể hiện trong (hình 3.4). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  32. ảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eurycomanone Thí nghiệm Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 1 18,75 105,56374 2 25 124,20921 3 37,5 184,61858 4 50 245,84999 5 100 499,05692 6 200 973,97461 Phƣơng trình hồi quy y = 4,8425x + 7,4895 Hệ số tƣơng quan R2 = 0,9997 Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của eurycomanone 1200 1000 y = 4.8425x + 7.4895 R2 = 0.9997 800 600 400 200 Diện Diện tíchpic (mAU.s) 0 0 50 100 150 200 250 Nồng độ Eurycomanone (ppm) Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  33. Kết quả bảng 3.3 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát 18,75 – 200 µg/ml có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone với hệ số tƣơng quan rất cao (R2 = 0,9997), độ tuyến tính chặt. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lƣợng eurycomanone. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện: Tiến hành pha loãng mẫu phân tích eurycomanone đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu đƣợc có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định đƣợc là giới hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp ứng với từng chất. Giới hạn định lƣợng (LOQ): giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp đƣợc xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD. Kết quả phân tích cho thấy phƣơng pháp có giới hạn phát hiện với eurycomanone là 4,6875 µg/ml, tƣơng ứng có giới hạn định lƣợng là 15,46875 µg/ml. Độ lặp lại Tiến hành định lƣợng 6 mẫu dung dịch chuẩn eurycomanone nồng độ 200 µg/ml và chạy sắc ký với điều kiện nhƣ mục 3.1.2. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tƣơng đối giữa giá trị của các lần định lƣợng. Kết quả xác định độ lặp lại đƣợc trình bày trong bảng sau. ảng 3.4. Kết quả độ lặp lại của phương pháp Thí Nồng độ Diện tích pic Nồng độ tính toán nghiệm eurycomanone (mAU.s) (µg/ml) chuẩn (µg/ml) 1 200 928,21710 190,129 2 200 910,82135 186,537 3 200 905,16760 185,369 4 200 921,32361 188,705 5 200 928,43359 190,174 6 200 973,97461 199,577 Trung bình 190,082 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  34. RSD (%) 2,65 Kết quả cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại chấp nhận đƣợc, với giá trị RSD (%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn eurycomanone là 2,65% nhỏ hơn 5%. Độ đúng Xác định độ đúng bằng phƣơng pháp thêm chuẩn.  Dung dịch thử  Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu cao dƣợc liệu 17,5 µg eurycomanone chuẩn. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký nhƣ quy trình đã đƣợc trình bày ở mục 3.1.2. Lặp lại thực nghiệm 6 lần khác nhau. Dựa vào đƣờng chuẩn xây dựng, tính đƣợc lƣợng eurycomanone trong các mẫu. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5. ảng 3. . Kết quả độ đúng của phương pháp Thí nghiệm Mẫu đã Mẫu thêm Tổng lƣợng Tỷ lệ thu có (µg) vào (µg) tìm lại (µg) hồi (%) 1 70,37 17,5 18,01 102,91 2 70,03 17,5 17,28 98,74 3 69,17 17,5 17,88 102,17 4 68,74 17,5 16,96 96,91 5 72,13 17,5 18,13 103,60 6 72,65 17,5 16,8 96,00 Trung bình 100,055 RSD (%) 3,26 Kết quả cho thấy phƣơng pháp có độ đúng tốt: - Độ đúng trung bình cao: 100,055% - Độ lệch chuẩn tƣơng đối là 3,26% (nhỏ hơn 5%) - Tỷ lệ thu hồi mỗi lần đều nằm trong khoảng 96,00% đến 103,60% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  35. 3.1.3. Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu rễ cây bá bệnh Chuẩn bị mẫu phân tích eurycomanone: Với lƣợng cắn thu đƣợc sau khi chiết tiến hành hòa tan bằng MeOH. Siêu âm, lọc qua màng lọc kích thƣớc 0,2 micro trƣớc khi tiêm vào hệ thống HPLC. Điều kiện sắc ký: nhƣ mục 3.1.2. - Xác định thời gian lƣu, diện tích pic tƣơng ứng với thời gian lƣu của eurycomanone trên sắc ký đồ thu đƣợc. - Áp dụng đƣờng chuẩn hồi quy tuyến tính vừa thu đƣợc và phƣơng pháp nội suy để phân tích hàm lƣợng eurycomanone trong mẫu dƣợc liệu sử dụng trong nghiên cứu đề tài cho kết quả ở bảng 3.6. ảng 3.6. Kết quả định lượng eurycomanone trong rễ bá bệnh. TN Khối Khối Khối lƣợng Hàm lƣợng Hàm lƣợng lƣợng lƣợng Diện tích pic eurycomanone eurycomanone eurycoman dƣợc cao eurycomanone trong cao trong cao one trong liệu (mg) dƣợc liệu (mAU.s) (µg) (%) (mg) khô (%) 1 100,3 11,8 832,56195 70,37 0,596 0,0773 2 102,1 11,7 830,89344 70,03 0,599 0,0755 3 103,1 12,5 705,67241 69,17 0,553 0,0739 4 102,9 11,3 703,61052 68,74 0,608 0,0736 5 101,5 12,1 598,95185 72,13 0,596 0,0782 6 102,3 11,5 601,45629 72,65 0,632 0,0782 Trung bình 0,597 0,0761 RSD(%) 3,92 2,76 Kết quả: Hàm lƣợng eurycomanone trong cao rễ bá bệnh và trong rễ cây bá bệnh lần lƣợt là 0,597% và 0,0761%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  36. 3.2. Thảo luận 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Ngày nay, do nhu cầu sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dƣợc cho mục đích chăm sóc sức khỏe ngày càng tăng cao khiến cho dƣợc liệu bá bệnh đƣợc sử dụng với khối lƣợng khá lớn. Tuy nhiên phần lớn dƣợc liệu chƣa đƣợc kiểm soát dẫn đến tình trạng dƣợc liệu giả mạo hoặc không đạt chất lƣợng làm ảnh hƣởng sức khỏe ngƣời bệnh và gây tổn thất lớn về kinh tế. Vì vậy, công tác kiểm tra, đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu bá bệnh là rất quan trọng. 3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích eurycomanone bằng HPLC Với điều kiện phòng thí nghiệm cũng nhƣ những trang thiết bị hiện có của Khoa Y Dƣợc, chúng tôi tham khảo các tài liệu đã đƣợc công bố và xây dựng phƣơng pháp phân tích eurycomanone trong dƣợc liệu cây bá bệnh bằng phƣơng pháp HPL nhƣ sau: - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) + Pha động: (acid formic 0,1%/nƣớc) : B (ACN) với chƣơng trình chạy nhƣ bảng 3.1 và 3.2 + Detector D D: bƣớc sóng 244 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 10 μl + Nhiệt độ buồng cột: 20 ± 0,8◦C + Dung môi pha mẫu: MeOH - Đƣờng chuẩn: y = 4,8428x + 7,4895, R2 = 0,9997, khoảng nồng độ 18,75 – 200 µg/ml. - Độ lặp lại: RSD = 2,65%, n =6 - Độ đúng: 100,055% với RSD = 3,26% - Giới hạn phát hiện: 4,6875 µg/ml - Giới hạn định lƣợng: 15,46875 µg/ml Kết quả cho thấy phân tích eurycomanone bằng HPLC với điều kiện sắc ký nhƣ trên cho độ tin cậy cao. Phƣơng pháp này có thể đƣợc ứng dụng để phân tích định tính và định lƣợng eurycomanone trong bá bệnh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  37. 3.2.3. Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bá bệnh Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) là dƣợc liệu quý, đang đƣợc nghiên cứu và phát triển. Trong đó việc đánh giá chất lƣợng, phân tích thành phần hoạt chất trong bá bệnh có ý nghĩa vô cùng quan trọng và cần thiết. Trên cơ sở các tài liệu thu thập đƣợc đến hiện tại của tôi cho thấy ở nƣớc ta chƣa có công bố nào phân tích cụ thể định lƣợng hàm lƣợng eurycomanone trong cây bá bệnh. Sử dụng phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng chúng tôi đã tiến hành định lƣợng một số mẫu bá bệnh và thu đƣợc kết quả trong bảng 3.6. Eurycomanone – marker chính của cây bá bệnh có hàm lƣợng trong cao và trong rễ mà chúng tôi tính toán đƣợc lần lƣợt là 0,597% và 0,0761% tƣơng đƣơng 5,97 mg/g cao và 761 µg/g rễ bá bệnh chứng tỏ trong rễ bá bệnh chứa lƣợng khá lớn eurycomanone tạo tiền đề cho các nghiên cứu chiết xuất, phân lập eurycomanone phục vụ cho chăm sóc sức khỏe con ngƣời. Tham khảo tài liệu số [38], theo tiêu chuẩn Malaysia thì hàm lƣợng eurycomanone trong cao Eurycoma longifolia nằm trong khoảng 0,8% – 1,5%. Xét kết quả mà chúng tôi thực hiện, hàm lƣợng eurycomanone mà chúng tôi khảo sát từ mẫu phân tích là 0,597% thấp hơn tiêu chuẩn Malaysia. Vì thế đây là là tiền đề để chúng tôi tối ƣu hóa quá trình chiết xuất để có thể thu đƣợc nhiều hơn eurycomanone. Bên cạnh đó tài liệu cũng chỉ ra trong chiết xuất ethanol, tỷ lệ eurycomanone cao hơn giới hạn cho phép trên của tiêu chuẩn Malaysia, nhƣng ở dạng sáp dính. Với chiết xuất nƣớc, thì năng suất cao hơn so với chiết bằng ethanol và cao thu đƣợc dƣới dạng bột. Ngoài ra, chiết xuất bằng nƣớc sẽ dễ dàng và khả thi hơn chiết bằng ethanol. Để thuận tiện cho sản xuất sản phẩm thƣơng mại thì dạng bột tối ƣu và tiện lợi hơn. hiết xuất eurycomanone bằng nƣớc có thể sẽ là một định hƣớng để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu dƣợc liệu tiềm năng này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  38. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau một quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả đáp ứng mục tiêu của đề tài nghiên cứu đã đề ra nhƣ sau: 1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng eurycomanone và thẩm định đƣợc phƣơng pháp HPL về các mặt: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đặc hiệu. Kết quả là phƣơng pháp có độ chính xác và độ đặc hiệu cao. Trong khoảng nồng độ khảo sát eurycomanone có mối tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic. - Phƣơng pháp có tính chọn lọc với eurycomanone, pic của eurycomanone tách riêng ra khỏi các pic khác. - Có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ eurycomanone trong khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9997. - Phƣơng pháp có độ đúng cao. 2. Đã định lƣợng đƣợc thành phần eurycomanone trong bá bệnh bằng phƣơng pháp HPL –DAD. Kết quả định lƣợng: hàm lƣợng eurycomanone trong cao rễ bá bệnh và trong rễ bá bệnh lần lƣợt là 0,597% và 0,0761% tƣơng đƣơng 5,97 mg/g cao và 761 µg/g rễ bá bệnh. KIẾN NGHỊ Đây là những nghiên cứu bƣớc đầu phân tích định tính, định lƣợng eurycomanone trong bá bệnh. Chúng tôi tiếp tục phát triển kết quả và thực hiện những nghiên cứu tiếp theo bao gồm: 1. Khảo sát các thành phần quassinoid trong bá bệnh đƣợc trồng ở những nơi khác nhau. 2. Áp dụng phƣơng pháp này để định lƣợng eurycomanone có trong một số chế phẩm chứa bá bệnh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  39. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đỗ Huy ích, Đặng Quang hung, ùi Xuân hƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr. 116-118. [2] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr.412-413. [3] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107- 113, tr. 216-250. [4] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 79-82, 84-110. [5] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234 - 242. [6] Thái Phan Quỳnh Nhƣ (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế. [7] Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, 173-222. [8] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 19-47. [9] Trần Ý Đoan Trang (2014), ―Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ rễ cây mật nhân (E. Longifolia) và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm‖, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật. [10] Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trần Công Luận, Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thanh Hồng Vân (2012), ―Khảo sát tác dụng hƣớng sinh dục nam từ dịch chiết cồn của rễ bách bệnh (Eurycoma Longifolia Jack) trên chuột nhắt trắng (Mus musculus)‖, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 16(1), tr. 186-191. [11] Chu Hoàng Hà, Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  40. Nguyễn Đình Trọng (2012), ―Nghiên cứu khả năng tạo rễ tơ của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes‖, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50, tr. 166. [12] Chu Hoàng Hà, Hoàng Thị Thu Hằng, Chu Nhật Huy, Nguyễn Trung Nam, Phạm Bích Ngọc, Trần Thu Trang (2017), ―Khảo sát một số hoạt tính sinh học trong cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia Jack)‖, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ tập 33(2), tr. 67-73 Tài liệu tiếng Anh [13] Bin Seng Low, Hai Qiu Ma, Kind Leng Tong, Kit Lam Chan, Pooi Fong Wong, Sazaly bu akar (2015), ―The In Vitro and In Vivo Anti-Cancer Activities of a Standardized Quassinoids Composition from Eurycoma longifolia on LNCaP Human Prostate ancer ells‖, PLOS ONE, pp. 1-21 [14] Mohd Ismail Bin Mohd Tambi, M. Kamarul Imran (2010), ―Eurycoma longifolia Jack in managing idiopathic male infertility‖, Asian Journal of Andrology, 12, pp. 376-380. [15] Annie A. George, Azreena Abas, Jay K. Udani, Michael N. Pakdaman, Mufiza Musthapa (2014), ―Effects of a Proprietary Freeze-Dried Water Extract of Eurycoma longifolia (Physta) and Polygonum minus on Sexual Performance and Well-Being in Men: A Randomized, Double-Blind, Placebo- ontrolled Study‖, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp. 1- 10 [16] Abdelhamid Zaki, Aman Shah Abdul Majid, Amin Malik Shah Abdul Majid, Chan Kit-Lam, Dan Ji, Narazah Mohd Yusoff, Omar Saeed Ali Al-Salahi., Shah Kamal Khan Jamal Din, Wan Zaidah Abdullah (2014), ― nti-Tumor Activity of Eurycoma longifolia Root Extracts against K-562 Cell Line: In Vitro and In Vivo Study‖, PLOS ONE, 9(1), pp. 1-13 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  41. [17] Norhaniza Aminudin, Sonal Girish, Suresh Kumar (2015), ―Tongkat li (Eurycoma longifolia): a possible therapeutic candidate against Blastocystis sp.‖, Parasites & Vectors, 8, pp. 332-339 [18] Kit-Lam Chan, Nowroji Kavitha, Rahmah Noordin, Sreenivasan Sasidharan (2012), ―In vitro nti-Toxoplasma gondii Activity of Root Extract/Fractions of Eurycoma longifolia Jack‖, Complementary and Alternative Medicine, 12, pp. 91-99 [19] Ahmad Nazrun Shuid, Mohd Azri Abd Jalil, Norliza Muhammad (2012), ―Role of Medicinal Plants and Natural Products on Osteoporotic Fracture Healing‖, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp. 1-7 [20] Cin Kong, Man-Wah Tan, Noorsaadah Abd Rahman, Sheila Nathan, Wageeh A Yehye (2014), ―Discovery of potential anti- infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model‖, Complementary and Alternative Medicine, 14, pp. 4-21 [21] Adlin Afzan, Mohd Isa Wasiman, Mohd Ridzuan Mohd Abd Razak, Noor Rain Abdullah, Nur Fasihah Amir Jalaluddin, Rosnani Ali, Siti Habsah Shiekh Zahari, Zakiah Ismail (2014), ―Effect of selected local medicinal plants on the asexual blood stage of chloroquine resistant Plasmodium falciparum‖, Complementary and Alternative Medicine, 14, pp. 492-505 [22] Chantragan Srisomsap, Chutima Kaewpiboon, Jisnuson Svasti Wanchai Assavalapsaku, Kriengsak Lirdprapamongkol, Pakorn Winayanuwattikun, Preecha Puwaprisirisan, Tikamporn Yongvanich (2012), ―Studies of the in vitro cytotoxic, antioxidant, lipase inhibitory and antimicrobial activities of selected Thai medicinal plants‖, Complementary and Alternative Medicine, 12, pp. 217-225. [23] Hugo de oer, Vichith Lamxay (2009), ―Plants used during pregnancy, childbirth and postpartum healthcare in Lao PDR: A comparative study of the rou, Saek and Kry ethnic groups‖, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  42. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 5, pp. 25-35 [24] Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Hyun-Jeong Ko, Jae-Hyoung Song, SeonJu Park, Nanyoung Kim, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem, Seung Hyun Kim (2014), ―Five new quassinoids and cytotoxic constituents from the roots of Eurycoma longifolia‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24(16), pp. 3835- 3840 [25] Annie George, Azreena Binti Abas, Katsuiku Hirokawa , Kiminori Mohri, Masanori Utsuyama, Naoko Suzuki, Tsuyoshi Takara (2016), ―Immunomodulation in Middle-Aged Humans Via the Ingestion of Physta® Standardized Root Water Extract of Eurycoma longifolia Jack — A Randomized, Double-Blind, Placebo- ontrolled, Parallel Study‖, Phytotherapy Research, 30(4), pp. 627-635. [26] Ahmad Nazrun Shuid, Hnin Ei Thu, Isa Naina Mohamed, Putri Ayu Jayusman, Zahid Hussain (2017), ―Eurycoma Longifolia as a potential adoptogen of male sexual health: a systematic review on clinical studies‖, Chinese Journal of Natural Medicines, 15(1), pp. 0071-0080 [27] Chin-Hoe Tehc, Kit-Lam Chanc, Meng-Hooi Shub, Pooi-Fong Wonga, Sazaly AbuBakar, Wei-Fun Cheong (2012), ―Eurycomanone suppresses expression of lung cancer cell tumor markers, prohibitin, annexin 1 and endoplasmic reticulum protein 28‖, Phytomedicine, 19(2), pp. 138-144. [28] Hooi Hoon Ang, Joon Wah Mak, Kit Lam han (1995), ―Effect of 7-day daily replacement of culture medium containing Eurycoma longifolia Jack constituents on the Malaysian Plasmodium falciparum isolates‖, Journal of Ethnopharmacology, 49(3), pp. 171-175. [29] Benjamin Mutschlechnera, Hermann Stuppnera, Stefan Schwaigera, Thi Van nh Tran (2017), ―Development of a selective HPLC-DAD/ELSD method for the qualitative and quantitative assessment of commercially available Eurycoma @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  43. longifolia products and plant extracts‖, Fitoterapia, 124(2018), pp. 188-192. [30] Hafizan Juahir Norashikin Saim, Nor Nasriah Zaini, Rozita Osman (2016), ―Development of hromatographic Fingerprints of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) Roots Using Online Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography (SPE-L )‖, Molecules, 21, pp. 583-593. [31] Mardiana Saaid, Norashikin Saim, Nor Nasriah Zaini, Rozita Osman (2016), ― An experimental design method for the extraction of eurycomanone from Tongkat Ali (Eurycoma longifolia) roots using pressurised liquid extraction (PLE)‖, Malaysian Journal of Analytical Sciences, 20(2), pp. 342-350 [32] A.A. Karim, Rajeev hat (2010), ―Tongkat li (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance‖, Fitoterapia, 81, pp. 669–679 [33] Ahmad Nazrun Shuid, Hnin Ei Thu, Isa Naina Mohamed, Zahid Hussain (2017), ―Eurycoma Longifolia as a potential alternative to testosterone for the treatment of osteoporosis: Exploring time- mannered proliferative, differentiative and morphogenic modulation in osteoblasts‖, Journal of Ethnopharmacology, 195, pp. 143-158 [34] Shawn M. Talbott (2013), ―Human Performance and Sports Applications of Tongkat Ali (Eurycoma longifolia)‖, Nutrition and Enhanced Sports Performance, 53, pp. 501-505 [35] Akira Murakami, Guy Balansard, Hajime Ohigashi, Hiromu Kawanaka, Masanori Kawanaka, Monique Gasquet, Riad Elias, Suratwadee Jiwajinda a, Vilai Santisopasri (2003), ― orrigendum to ―In vitro anti-tumor promoting and anti-parasitic activities of the quassinoids from Eurycoma longifolia, a medicinal plant in Southeast sia‖‖, Journal of Ethnopharmacology, 82, pp. 55-58 [36] Adrian Martin Pohlit a, Ellen Cristina Costa Silva, Fernando Queiróz Cunha, Peter Sol Reinach, Rangel Leal Silva, Rodrigo César das Neves Amorim, Sílvio Manfredo Vieira, Thiago Mattar @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  44. unha (2014), ―Gastro-protective effects of isobrucein B, a quassinoid isolated from Picrolemma sprucei‖, Fitoterapia, 95, pp. 8-15. [37] Nursyazura inti Khari (2014), ― Quality control analysis, standardization and stability studies of Eurycoma Longifolia and effect of its saponin content on solubility and toxicity of eurycomanone‖, Luận văn tiến sĩ khoa học UNIVERSITI SAINS MALAYSIA. [38] Abdalrahim FA Aisha, Nursyazura Khari, Zhari Ismail (2014), ―Reverse Phase High Performance Liquid hromatography for the Quantification of Eurycomanone in Eurycoma longifolia Jack (Simaroubaceae) Extracts and their ommercial Products‖, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 13(5), pp. 801-807 [39] Ahmad Ziad bin Sulaiman, Azilah binti Ajit, Husam Eldin Elhag bugabr Elhag (2016), ― Review on the Exraction Methods of Extracts and Phytochemicals from Eurycoma longifolia (Tongkat li Jack)‖, The National Conference for Postgraduate Research, pp. 253-259. [40] Aini Norhidayah, Jaya Vejayan, Mashitah Mohamed Yusoff (2015), ―Detection and Quantification of Eurycomanone Levels in Tongkat li Herbal Products‖, Journal of Applied Sciences, 15(7), pp. 999-1005 [41] Chee-Yan Choo, Hideji Itokawa, Hiroshi Morita, Kit-Lam Chan (1998), ―High Performance Liquid hromatography in Phytochemical Analysis of Eurycoma longifolia‖, Original Paper, pp. 741-745 [42] H. Yusuf, Mustofa, M. Agus Wijayanti, P. Budi Setia Asih, R. Asmah Susidarti, Sofia, Suryawati (2013), ― New Quassinoid of Four Isolated Compounds from Extract Eurycoma longifolia Jack Roots and Their In-Vitro Antimalarial ctivity‖, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 4(3), pp. 728-734. [43] Adnan Ripina, Arshad Ahmada, Mardawani Mohamada, Mohamad Wijayanuddin Alia (2013), ―Effect of Extraction Process Parameters on the Yield of Bioactive Compounds from the Roots of Eurycoma Longifolia‖, Jurnal Teknologi, 60, pp. 51- 57. [44] Ahmad Ziad Bin Sulaiman, He Yuhaia (2015), ―Optimization Of Eurycomanone Yield Using Response Surface Methodology By @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. Water Extraction‖, Journal of Advanced & Applied, pp. 1-20. [45] Hye Hyun Yoo, Kevin Choe, Shaheed Ur Rehman (2016), ―Review on a Traditional Herbal Medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its Traditional Uses, Chemistry, Evidence- ased Pharmacology and Toxicology‖, Molecules, 21, pp. 1-31. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. PHỤ LỤC Phụ lục 01: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống. Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính. Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng MeOH. Phụ lục 04: Sắc ký đồ cao bá bệnh. Phụ lục 05: Độ đồng nhất pic. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. Phụ lục 01: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính Hình PL2.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 18,75 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. Hình PL2.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 25 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. Hình PL2.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 37,5 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. Hình PL2.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 50 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  57. Hình PL2.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 100 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  58. Hình PL2.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 200 µg/ml @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  59. Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  60. Phụ lục 04: Sắc ký đồ cao bá bệnh @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  61. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  62. Phụ lục 0 : Độ đồng nhất pic @ School of Medicine and Pharmacy, VNU