›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc

pdf 49 trang thiennha21 18/04/2022 2460
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_saponin_cua_than_re_sam_vu_d.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ THUỲ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HÀ NỘI - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ THUỲ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC Khoá: QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. NGUYỄN HỮU TÙNG 2. ThS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH HÀ NỘI - 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên, với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên bộ môn Hoá dƣợc và Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời thầy đã hết lòng chỉ bảo, hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, nhất là Ths. Nguyễn Thị Hoàng Anh, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm khoá luận. Và tôi cũng xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dƣợc trƣờng Đại học y dƣợc Thái Nguyên, chị Huệ và các bạn Phƣợng, Chuyên, Phƣơng- Khoa Y Dƣợc trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi giúp đỡ động viên tôi trong học tập và cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Đặng Thị Thuỳ
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1 - Tổng quan 2 1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp 2 1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng 2 1.1.4. Phân bố và sinh thái 3 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý 3 1.1.7. Thành phần hoá học 4 1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký 6 1.2.1. Sắc ký cột 6 1.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 7 1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc 9 1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 9 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) 10 Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 11 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 11 2.2.1. Dung môi, hoá chất 11 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 12 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 12 2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu 12 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học 12 2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 12 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận 13 3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD 13 3.1.1. Chiết xuất và phân lập 13 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM 15 3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc 16 3.2.1. Hợp chất số 1 16 3.2.2. Hợp chất số 2 19
  5. 3.3. Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 22 Chƣơng 4 - Bàn luận 23 4.1. Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết 23 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất 24 4.3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC 24 Chƣơng 5 - Kết luận và kiến nghị 25 5.1. Kết luận 25 5.2. Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance DEPT DEPT IR Infrared HPLC High performance liquid chromatography 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance MS Mass spectrum NMR Nuclear magnetic resonance Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet VIS Visible
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách đƣợc từ thân rễ 5 SVD Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại 11 Sapa, Lào Cai 15/07/2016 Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng 14 Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân 15 đoạn BuOH Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập đƣợc sau khi 15 phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH Hình 6. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 1 19 Hình 7. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 2 22 Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập đƣợc 1 23 (A), 2 (B) và cao butanol của SVD
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD 5 Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất 16 số 1 Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất số 2 19
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là vùng đất của nhiều các loài thảo dƣợc quý đặc biệt là các loài thuộc chi sâm. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc quý thuộc chi Sâm (Panax) đang đƣợc sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ các loài khác cùng chi. Gần đây sâm vũ diệp đƣợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm ở một số địa phƣơng nhƣ Hà Giang và Lào Cai [1; 13]. Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp đã đƣợc sử dụng làm thuốc bổ và có mặt trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc. Ở Việt Nam và thế giới, tổng quan tài liệu thấy rằng không có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của dƣợc liệu sâm vũ diệp. Vì vậy, việc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hoá học và tác dụng sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dụng loại dƣợc liệu quý này hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn. Năm 2017 vừa qua, nhóm nghiên cứu của Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc Gia Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hoá học của thân rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sapa, Lào Cai với 3 hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn ít phân cực ethyl acetat [7; 8]. Tiếp nối nghiên cứu trên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng ở Tây Bắc”. Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hoá học, từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhƣ định tính định lƣợng cũng nhƣ nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài sâm này. Mục tiêu của đề tài bao gồm: 1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất saponin chính ở phân đoạn n-butanol của thân rễ của sâm vũ diệp. 2. Xác định cấu trúc hoá học của các saponin phân lập đƣợc 3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Đề tài này là một phần trong đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc Chƣơng trình Tây Bắc “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18. 1
  10. Chƣơng 1 - Tổng quan 1.1. Tổng quan chung về sâm vũ diệp 1.1.1. Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp còn có tên khác là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc ti ết nhân sâm, tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử thất, tam thất lá lông chim, hƣơng sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa họ c là Panax bipinnatifidus Seem. [ 1; 12]. Một số tên đồng danh của SVD: Aralia bipinnatifida (Seem.) C. B. Clarke ; Aralia quinquefolia (L.) Dec. et Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li ; Panax pseudoginseng Wall. var. major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall . spp. Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [ 12]. 1.1.2. Vị trí phân loại [2] Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Nhân sâm (Panax L.) 1.1.3. Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng Cây thân thảo sống nhiều năm. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lạ i. Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thƣờng đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thƣờng lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dƣơng lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái mọc vòng. Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thuỳ khô ng đều, mép có răng cƣa, có lông. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ng ọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 20 - 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2-3 ô. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt. Hạt hình cầu hoặc gần 2
  11. cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [ 1; 5; 12; 13]. B ộ ph ận dùng: dƣợc liệu là thân rễ SVD [1]. 1.1.4. Phân bố và sinh thái Trong tự nhiên SVD phân bố ở Trung Qu ốc , Ấn Độ , Nepan (vùng cận Hymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nƣớc ta. Sapa ở Việt Nam cũng là điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam. Năm 1973, cây đã đƣợc phát hi ện ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa , ở độ cao 1600 m. Hiện nay vùng phân bố của Sâm vũ diệp đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây đƣợc coi là cực hiếm . Gần đây SVD đã đƣ ợc thuần hoá và bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệ m ở một số địa phƣơng ở Hà Giang , Lào Cai. Đây là một loài quý hiếm và đang đứng trƣớc nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam [1; 13]. SVD là loài thân thảo ƣa bóng và đặc biệt ƣa ẩm, thƣờng mọc rải rác hay tập trung dƣới tán rừng ẩm, gần nhƣ quanh năm có sƣơng mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 từ phần đ ầu mầm rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc một vài chồi thân (tuỳ thuộc vào số lƣợng đầu mầm ở rễ). Chồ i này thƣờng sinh trƣởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt đƣợc chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụ m hoa. Quả xanh quan sát đƣợc vào cuối tháng 4-6, đến tháng 7 quả đã chín và rụ ng xuống quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kỳ có lƣợng mƣa lớn tháng 7-8 nên hạt giống thƣờng bị cuốn trôi, ảnh hƣ ởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9 -10, toàn bộ phần thân trên mặt đ ất tàn lụi qu a mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ khá rõ. Đó là dấu hiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]. 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý SVD có tác dụng gây động dục, hƣớng sinh dục, liều thấp có tác dụng làm giảm thời gian ngủ do phenobarbital, tăng sức dẻo dai cho cơ thể và tán huyết [1]. Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc ho ạt tính diệt tế bào ung thƣ từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Qu ốc, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện ho ạt tính ức chế s ự phát triển của các tế bào ung thƣ [ 24]. Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngƣng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [15]. 1.1.6. Tính vị và công dụng 3
  12. Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ. Theo đông y, SVD có tác dụng bổ, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau đẻ. SVD còn đƣợc dùng cầm máu, tán ứ, tiêu sƣng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thƣơng mau lành. Rễ cây SVD còn đƣợc ngâm rƣợu rồi chiết dƣới dạng tinh sâm dùng rất tốt, có tác dụng kích thích sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao, cao này pha với nƣớc hoặc rƣợu để uống cũng có tác dụng nhƣ rễ. Ở Trung Quốc, SVD là thuốc chữa hƣ lao thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thƣơng [1; 5]. 1.1.7. Thành phần hoá học Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2 [1]. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố 13 saponin từ lá của loài sâm vũ diệp Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dãy núi Tần Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc. Trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside F1 và F2 và 11 saponin đã biết trƣớc đó gồm ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside và majoroside F1. Cấu trúc của hai saponin mới đã đƣợc xác định là dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24 zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D- glucopyranoside (bipinnatifidusoside F1) và dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20 (S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)- beta-D-glucopyranoside (bipinnatifidusoside F2) [26]. Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã chỉ ra rằng trong thân rễ của SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen, saponin cùng với acid béo, acid amin. Đồng thời bằng cách thuỷ phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu đƣợc acid oleanolic [9; 10]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập đƣợc 10 saponin khung oleanan từ dịch chiết MeOH của rễ cây SVD (hình 1), bao gồm 3 hợp chất mới bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết bao gồm nacrissiflorine methyl este (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9) và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25]. 4
  13. Hình 1. Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách được từ rễ SVD Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của thân rễ SVD. Các hợp chất đó là β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol [7]. Bảng 1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD STT Hợp chất TLTK 1 Chikusetsusaponin IV [25] 2 Zingibrosid R1 [26] 3 Ginsenoside Ro [26] 4 Ginsenoside F1 [26] 5 Ginsenoside F2 [26] 6 Ginsenoside F3 [26] 7 Ginsenoside Rb1 [26] 8 Ginsenoside Rd [26] 9 Ginsenoside Rg1 [26] 10 Ginsenoside Rg2 [26] 11 Ginsenoside Rb3 [26] 5
  14. 12 Ginsenoside Re [26] 13 24-S-pseudoginsenoside F11 [26] 14 Panasenoside [26] 15 Majoroside F1 [26] 16 Bipinnatifidusoside F1 [26] 17 Bipinnatifidusoside F2 [26] 18 Bifinoside A [25] 19 Bifinoside B [25] 20 Bifinoside C [25] 21 Nacrissiflorine methyl este [25] 22 Pseudoginsenoside RP1 methyl este [25] 23 Pseudoginsenoside RT1 methyl este [25] 24 Stipuleanoside R1 [26] 25 Stipuleanoside R2 methyl este [26] 26 Mormordin IIe [25] Nhƣ vậy cho tới hiện tại đã có 26 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ SVD Nhận xét chung: qua các nghiên cứu về thành phần hoá học của SVD chúng tôi thấy rằng saponin chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong thân rễ SVD. Do đó chúng tôi lựa chọn nghiên cứu thành phần saponin , cụ thể là ở phân đoạn n-butanol (phân đoạn giàu saponin nhất). 1.2. Tổng quan các phƣơng pháp sắc ký 1.2.1. Sắc ký cột Pha tĩnh là những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 µm), đƣợc nạp trong cột thuỷ tinh. Mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thuỷ tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột đƣ ợc hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Phƣơng pháp này thƣờng làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy sắc ký cột cũng có ƣu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ dễ kiếm, có thể triển khai với một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn. Các bƣớc thực hiện sắc ký cột gồm: 6
  15. + Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc , hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lƣợng phân tử lớn sẽ có tính phân cự c mạnh hơn phân tử kia , nó bị pha tĩnh giữ laị trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so vớ i phân tử tuy có tính phân cực. + Lựa chọn dung môi: Mẫu sắc ký đƣợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10 cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch ( A). Mỗi bản mỏng đƣợc triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực. + Nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho ch ất hấp thụ dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp phụ đạt đƣợc chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bình trống để bên dƣới cột, dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất. + Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng rắn thì hoà tan chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi. Loại dung môi cho khởi đầu sắc ký. + Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣ ợc hứng b ằng ống thuỷ tinh. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng [4; 6; 16;18]. 1.2.2. Sắc ký l ớp m ỏng (TLC) - Nguyên tắc: D ựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh. Ch ấ t cần phân tích đƣợc hấp phụ (hoặc phân bố hoặc trao đổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Các thành phần sau khi đƣợc phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp đƣợc lƣu giữ trên pha tĩnh. Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thƣờng (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bƣớc sóng 254 nm, 366 nm 7
  16. hoặc phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề m ặt bản mỏng thiết bị densitometer ( một thiết bị đo cƣờng độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hặc khả kiến của chất cần phân tích). Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phƣơng pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích. - Các đại lƣợng đặc trƣng + Hệ số lƣu giữ Rf Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lƣu giữ Rf. Trị s ố c ủa nó đƣợc tính bằng tỷ lệ gi ữ a khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: (1) Trong đó: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) (đo trên cùng đƣờng đi của vết) có giá trị dao động giữa 0 và 1 + Hệ số lƣu giữ tƣơng đối : (2) Trong đó: là đƣờng đi của chất phân tích (cm) là đƣờng đi của chất chuẩn (cm) (giá trị càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất) [4; 6; 16; 17]. 1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a. Nguyên tắc của HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha đ ộng dƣới áp suất cao. Pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất r ắn dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một ch ất mang đã đƣợc liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion ho ặc phân loại theo kích cỡ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố củ a chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thu ộc vào yếu tố đó . Các chất sau khi ra khỏi cột s ẽ đƣợc phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. 8
  17. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ b. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC - Định tính: dựa vào thời gian lƣu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử - Xác định tạp chất: dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu thử, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lƣu của tạp chất khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện - Định lƣợng: dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diên tích pic của nó [4; 14; 18]. 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc 1.3.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) a. Nguyên tắc Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính đƣợc đặt trong từ trƣờng, khi thay đổi từ trƣờng sẽ dẫn đến hấp thụ năng lƣợng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng là số chẵn nhƣng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng và số thứ tự nguyên tử là những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng hƣởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó. b. Các đại lƣợng đặc trƣng - Độ chuyển dịch hoá học: sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn đƣợc gọi là độ chuyển dịch hoá học (δ). ( ) ( ) (3) Trong đó: δ: độ chuyển dịch hoá học νmau: tần số của mẫu phân tích νTMS: tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane νmay: tần số làm việc của máy - Hằng số tƣơng tác spin 9
  18. Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội đƣợc biểu hiện bằng Hz, đặc trƣng cho sự tƣơng tác gọi là hằng số tƣơng tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào tƣơng quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tƣơng tác. - Diện tích dƣới tín hiệu Diện tích dƣới tín hiệu tỷ lệ vớ i số lƣợ ng proton cho tín hiệu đó. Đƣờng cong tích phân diện tích dƣới tín hiệu cho biết số lƣợng tƣơng đối của proton cho tín hiệu. c. Ứng dụng của phổ NMR Bằng cách xác đ ịnh độ chuyển dịch hoá học δ, hằng số tƣơng tác J và diện tích dƣới tín hiệu ngƣời ta có th ể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại phổ khác nhƣ IR, MS từ đó xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ [3 ; 4; 17]. 1 .3 .2. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) a. Nguyê n tắc Dùng chùm điện tử có năng lƣợng trung bình (50-100 eV) để bắn phá phân tử -3 -6 hữu cơ ở môi trƣờng chân không cao (10 - 10 mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành các mảnh. Các ion đƣợc tạo thành trong buồng ion hoá, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trƣớc khi đến detector . Tín hiệu tƣơng ứng với các ion sẽ đƣợc thể hiệ n bằng một số vạch (pic) có cƣờng độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. b. Ứng dụng - Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neuron trong nhân đó nên khối lƣ ợ ng nguyên tử khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu. - Đ ịnh tính: + Phân tích kh ối phổ có thể cho rất chính xác khối lƣợng các ion phân tử M+, + + (M+1) , (M+2) , đây là các đ ặ c trƣng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cƣờng độ của chúng cùng với khối lƣợng của các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích. + Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thƣ viện phổ có trong máy hoặc ph ổ nghiên cứu với ph ổ chất đối chi ếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu. - Xác định công thức cấu tạo : để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều 10
  19. mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và phổ IR. - Định lƣợng: phân tích định lƣợng khối phổ tƣơng tự nhƣ các kỹ thuật khác dùng cách thiết lập đƣờng chuẩn hoặc thêm đƣờng chuẩn cùng với độ cƣờng độ vạch phổ để xác định nồng độ [3; 4; 17]. Chƣơng 2 - Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc liệu (DL-150716) đƣợc lƣu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu- Viện Dƣợc liệu. Hình 2. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Dung môi, hoá chất Dung môi dùng trong chiết xuất phân lập nhƣ ethanol (EtOH), methanol (MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), n- butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và đƣợc cất lại trƣớc khi dùng. Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 µm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thƣờng Kiesel 60 F254 và pha đảo TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức). 11
  20. Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất. Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk, Đức, nƣớc cất dùng cho phân tích. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ - Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất quay cực - Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy - Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS) - Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một và hai chiều , sử dụng dung môi CDCl 3 /CD 3OD , chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS) - Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu - Phƣơng pháp chiết mẫu: chiết hồi lƣu đơn giản với dung môi ethanol 70 %/nƣớc - Phƣơng pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng lỏng Quy trình: Thân rễ sâm vũ diệp đƣợc chiết hồi lƣu 3 lần với ethanol 70 % ở 70ºC. Tiến hành lọc loại bỏ bã dƣợc liệu, gộp dịch lọc, sử dụng máy cô quay chân không dƣới áp suất giảm tại 50ºC thu đƣợc cao khô. Cao khô này đem phân tán trong nƣớc rồi lắc lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực khác nhau (ete, ethyl acetat và butanol), thu đƣợc các phân đoạn tƣơng ứng. 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm: - Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thƣờng và pha đảo - Sắc ký lớp mỏng: để theo dõi quá trình phân lập, kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập 2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các phƣơng pháp phổ bao gồm: phổ khối lƣợng (ESI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so sánh dữ liệu phổ thu đƣợc với các dữ liệu phổ đã đƣợc công bố trong các tài liệu tham khảo. 12
  21. 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Việc phân tích định tính, dấu vân tay của một thành phần trong một mẫu hỗn hợp nhiều thành phần nhƣ cao chiết dƣợc liệu, phân đoạn dịch chiết, dựa trên thông số thời gian lƣu của một chất sẽ cố định, đặc trƣng cho thành phần đó trong điều kiện sắc ký xác định. Chƣơng 3- Kết quả thực nghiệm và bàn luận 3.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD 3.1.1. Chiết xuất và phân lập Mẫu thân rễ sâm vũ diệp (500 g) (hàm ẩm là 7,81%) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ đƣợc ngâm chiết bằng dung môi ethanol 70% 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết hồi lƣu trong 3 giờ. Các dịch chiết ethanol thu đƣợc đƣợc lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol. Hoà tan cao chiết trong nƣớc cất (500 ml) và chiết phân bố lần lƣợt bằng ether, ethyl aceate và n-BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml). Các dịch chiết phân đoạn đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc phân đoạn tƣơng ứng Ê-te (5,82 g), EtOAc (2,70 g) và n- BuOH (21,7 g). Hình 3. Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng 13
  22. Tiếp theo phân đoạn BuOH đƣợc tiến hành phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi silica gel (Φ 85 mm x 80 mm) với hệ dung môi rửa giải là gradient của CH2Cl2- MeOH (5:1 → 0:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 ml) thu đƣợc 4 phân đoạn ký hiệu là B1-B4. Phân đoạn B2 (4,3 g) đƣợc tiếp tục phân lập sắc ký cột pha thuận silica gel (Φ 45 mm x 350 mm) với hệ dung môi rửa giải là CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1), v/v/v, 1500 ml) thu đƣợc 4 phân đoạn nhỏ (B2.1-B2.4) và tiếp tục từ phân đoạn B2.2 (920 mg) sử dụng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 mm x 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1), v/v, 1400 ml) thu đƣợc hợp chất số 2 (bột màu trắng, 100 mg). Cuối cùng từ phân đoạn B4 (5,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 nm x 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1600 ml) thu đƣợc hợp chất số 1 (bột màu trắng ngà, 180 mg). Tóm tắt quá trình phân lập nhƣ hình 5 14
  23. Phân đoạn BuOH (21,7 g) Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm) CH Cl -MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL/PĐ) 2 2 B1 B2 B3 B4 840 mg 4,3 g 3,7 g 5,1 g 1. SKC Silica gel (Φ45 mm × SKC pha đảo C18 350 mm) CHCl -MeOH-H O (Φ50 mm × 350 mm) 3 2 (3:1:0,1, v/v/v, 1500 mL) MeOH-H2O 2. SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × (1:1, v/v, 1600 mL) 350 mm) MeOH-H2O (1:1, v/v, 1400 mL) Chất số 2 Chất số 1 Bột màu trắng, 100 mg Bột màu trắng, 180 mg Hình 4. Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM Chất số 1 và số 2 sau khi phân lập đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi methanol: nƣớc=2:1; thu đƣợc sắc ký đồ bản mỏng nhƣ hình 6 Hình 5. Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phân lập được sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 % /EtOH Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử, SKĐ của cả 2 hợp chất đều thấy xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trƣng cho 15
  24. các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf lần lƣợt là 0,30 và 0,34. Vì vậy sơ bộ kết luận hai hợp chất phân lập đƣợc là những chất tinh khiết. 3.2. Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc 3.2.1. Hợp chất số 1 Chất số 1 (Stipuleanoside R2): chất bột màu trắng 25 Góc quay cực: [α]D =+7,5 (c=0,2; MeOH); Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H]- tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử là M= 1088 Phổ 1H-NMR (MeOD; 500 MHz) và 13C-NMR (MeOD; 125 MHz), DEPT: xem bảng 2 Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất số 1 * a,b a,c Vị trí C δC δC DEPT δH (độ bội, J=Hz) Aglycon 1 39,8 39,8 CH2 2 26,9 27,0 CH2 3 90,7 90,8 CH 4 40,1 40,7 C 5 57,0 57,0 CH 6 19,3 19,3 CH2 7 33,9 34,0 CH2 8 40,7 40,2 C 9 49,1 49,2 CH 10 37,8 37,9 C 11 24,5 24,5 CH2 12 123,8 123,8 C 5,27 (br s) 13 144,7 144,8 C 14 42,9 42,9 C 15 28,8 28,9 CH2 16 23,9 24,0 CH2 17 48,0 48,0 C 18 42,5 42,6 CH 19 47,2 47,3 CH2 20 31,5 31,5 C 16
  25. 21 34,9 34,9 CH2 22 33,1 33,2 CH2 23 28,5 28,5 CH3 0,95(s) 24 17,0 17,0 CH3 0,93(s) 25 16,0 16,0 CH3 0,81(s) 26 17,7 17,7 CH3 0,85(s) 27 26,3 26,3 CH3 1,17(s) 28 178,0 178,1 COOR 29 33,4 33,5 CH3 1,05(s) 30 24,0 24,0 CH3 0,96(s) Đƣờng GlcA 1’ 106,3 106,4 CH 4,01 (d, J = 1,0 Hz) 2’ 76,4 76,4 CH 3’ 81,9 82,0 CH 4’ 79,3 79,4 CH 5’ 78,1 78,1 CH 6’ 176,5 176,4 COOH Đƣờng Glc I 1’’ 104,5 104,4 CH 4,92 (d, J = 8,0 Hz) 2’’ 75,5 75,6 CH 3’’ 78,3 78,3 CH 4’’ 71,0 71,1 CH 5’’ 78,3 78,3 CH 6’’ 62,4 62,4 CH2 Đƣờng Ara 1’’’ 108,3 108,3 CH 5,19 (br s) 2’’’ 82,1 82,1 CH 3’’’ 75,3 75,3 CH 4’’’ 87,1 87,1 CH 5’’’ 62,4 62,4 CH2 Đƣờng Glc II 1’’’’ 95,7 95,7 CH 5,40 (d, J = 8,0 Hz) 2’’’’ 73,9 73,9 CH 3’’’’ 77,9 77,9 CH 17
  26. 4’’’’ 71,4 71,1 CH 5’’’’ 78,6 78,7 CH 6’’’’ 62,2 62,2 CH2 a b *c của chất stipuleanosid R2 đo trong CD3OD [27]; Đo trong MeOD, 125 MHz, c500 MHz. Hợp chất 1 đƣợc phân lập dƣới dạng bột màu trắng, có năng suất quay cực 25 riêng [α] D=+7,5 (c=0,2; MeOH). Hợp chất này phản ứng với H2SO4 10 % trong điều kiện hơ nóng thấy xuất hiện màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trƣng cho các dẫn xuất triterpene. Từ số liệu phổ 13C NMR và DEPT thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử C bậc 4 cùng 1 nhóm COOR. Phổ 13C-NMR của 1 mang các đặc điểm của một saponin có phần aglycon là một triterpene khung oleanan đặc trƣng của các saponin chính đã đƣợc công bố từ sâm vũ diệp [25]. Phổ 1H-NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81; 0,85; 0,93; 0,95; 0,96; 1,05; 1,17 (7 tín hiệu CH3, s, CH3-25, 26, 24, 23, 30, 29, 27), một nối đôi ở C-12/C-13 với sự có mặt của tín hiệu tại [δ 5,27 (1H, br s, H-12)]. Ngoài ra trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hƣởng trong vùng từ δ 3,0-4,0 đặc trƣng cho sự có mặt của các nhóm oxymetin và oxymethylen của 4 phân tử đƣờng. Bốn phân tử đƣờng bao gồm một đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose [Ara(f)] đƣợc nhận biết bởi các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,01 (1H, d, J=1,0 Hz, H-1’), 4,92 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1”), 5,19 (1H, br s, H-1”’), 5,40 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1”’’). Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu cuả 53 tín hiệu nguyên tử carbon, trong đó có 23 tín hiệu đƣợc xác định thuộc bốn đơn vị đƣờng [GluA, 2 Glc và Ara(f)] [19]. Và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid với một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi đặc trƣng C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) [23; 25]. Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của 1 xuất hiện pic ion tại - 1087 [M-H] phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M=1088). Từ những dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR trong tài liệu đã đƣợc công bố [22] cho phép xác định cấu trúc hoá học của 1 là stipuleanoside R2 (Hình 6), một saponin chƣa đƣợc công bố từ sâm vũ diệp. Tuy nhiên dạng methyl ester của stipuleanoside R2 đã đƣợc công bố từ sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trƣớc đây [25]. 18
  27. Hình 6. Cấu trúc hóa học của chất số 1 3.2.2. Hợp chất số 2 Thể chất: bột màu trắng 25 = Góc quay cực: [α]D +16 (c 0,3, MeOH) Phổ ESI-MS: m/z 964 [M+Na]+, tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử là M= 940 1 13 Phổ H-NMR (CD3OD; 400 MHz) và C-NMR (CD3OD; 100 MHz): xem bảng 3 Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất số 2 * a,b a,c Vị trí C δC δC δH (độ bội, J=Hz) Aglycon 1 39,7 38,5 2 26,9 27,0 3 91,2 89,6 3,22 (m) 4 40,1 39,1 5 57,0 55,3 6 19,3 18,1 7 33,9 32,3 8 40,7 39,1 9 49,1 48,2 10 37,8 36,2 19
  28. 11 24,5 24,6 12 123,8 122,2 5,22 (br s) 13 144,8 143,2 14 42,9 41,3 15 28,9 27,3 16 23,9 22,4 17 48,0 46,8 18 42,6 41,0 19 47,2 46,1 20 31,5 31,5 21 34,9 33,3 22 33,1 31,9 23 28,4 26,8 0,91(s) 24 16,9 14,4 0,88(s) 25 15,9 15,3 0,75(s) 26 17,7 16,0 0,81(s) 27 26,3 25,4 1,22(s) 28 178,0 176,4 29 33,4 31,8 1,11(s) 30 23,9 22,9 1,00(s) Đƣờng GlcAMe 1’ 106,9 105,3 4,35 (d, J = 7,6Hz) 2’ 73,9 74,5 3’ 75,1 76,4 4’ 78,7 77,0 5’ 75,9 76,4 6’ 171,1 170,9 OCH3 53,0 53,0 Đƣờng Ara 1’’’ 109,2 107,4 5,03 (br s) 2’’’ 82,9 81,2 3’’’ 78,5 74,2 4’’’ 86,6 85,4 5’’’ 62,4 61,5 20
  29. Đƣờng Glc 1’’ 95,7 94,1 5,38 (d, J = 8,0 Hz) 2’’ 75,0 73,5 3’’ 78,4 76,8 4’’ 71,1 69,5 5’’ 78,3 77,0 6’’ 63,0 60,8 a *c của chất araloside A methyl ester đo trong CD3OD [27]; Đo trong CD3OD, b100 MHz, c400 MHz. Hợp chất 2 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng từ phân đoạn BuOH. Tƣơng tự chất 1, phổ 1H và 13C-NMR của 2 mang đặc trƣng của một saponin có phần aglycon là acid oleanoic với các tín hiệu ở nối đôi ở C-12/C-13 [δ 122,2 (C-12), 143,2 (C- 13) và 5,22 (1H, br s, H-12)], một nhóm oxymethin tại δ 89,6 (C-3) và một nhóm carbonyl carboxylic tại δ 176,4 (C-28) mà tại đó các phân tử đƣờng tạo liên kết trên cơ sở phân tích độ dịch chuyển hoá học [23; 25]. Điểm khác nhau của chất 2 so với chất 1 là phần đƣờng, các tín hiệu trên phổ NMR của chất 2 cho thấy sự có mặt của 3 đơn vị đƣờng với một GluA, một Glc và một Ara(f) bởi 3 tín hiệu proton anomeric [δ 4,35 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1’), 5,03 (1H, br s, H-1’’), 5,38 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1”’)] [19]. Phân tử đƣờng GluA có nhóm COOCH3 (δ 53,0). Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của 2 xuất hiện tín hiệu tại m/z 946 phù hợp với ion phân tử [M+Na]+ của C48H76O18 (M=940). Bằng các phân tích trên kết hợp với việc so sánh với số liệu công bố trong tài liệu tham khảo [21; 22] của araloside A methyl ester cho phép khẳng định hƣợp chất 2 chính là araloside A methyl ester (Hình 7), một saponin chƣa đƣợc công bố từ sâm vũ diệp. 21
  30. Hình 7. Cấu trúc hoá học của chất số 2 3.3. Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Tham khảo các tài liệu [11] chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích định tính 2 saponin phân lập đƣợc nhƣ sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 µm) - Detector DAD phát hiện ở bƣớc sóng 203 nm - Tốc độ dòng: 0,8 ml/min - Thể tích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ: 25 ºC - Dung môi pha mẫu: Methanol - Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chƣơng trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A). Pha mẫu chất sạch 1 và 2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg mỗi chất rồi pha thành dung dịch gốc tƣơng ứng với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng thành dung dịch có nồng độ 500 ppm dùng cho sắc ký HPLC. Pha mẫu cao saponin tổng: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 50,0 mg cao n-butanol sâm vũ diệp rồi hoà tan trong methanol với nồng độ 50,0 mg/ml, siêu âm 10 phút rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm 22
  31. Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập được 1 (A), 2 (B) và cao butanol của SVD Kết quả phân tích HPLC minh hoạ trên hình 3.5 cho thấy chất 1 và chất 2 là các hợp chất tự nhiên có trong SVD với thông số thời gian lƣu tƣơng ứng của chúng trong dung dịch butanol đƣợc chuẩn bị tại thời điểm sắc ký với điều kiện chiết xuấ t chuẩn thƣờng quy. Chất số 1 có thời gian lƣu là 15,565 phút và chất số 2 là 16,577 phút. Tƣơng quan diện tích pic trên sắc ký đồ HPLC cho thấy hai hợp chất phân lậ p đƣợc là hai saponin chính trong thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa đặc biệt là stipuleanoside R2. Hai hợp chất này có thể coi là chất đánh dấu hoá học của SVD. Chƣơng 4 - Bàn luận 4.1. Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết Phƣơng pháp chiết : chiết hồi lƣu đơn giản , nhiệt độ 70ºC với dung môi ethanol thu đƣợc cắn toàn phần. Ƣu điểm của phƣơng pháp chiết hồi lƣu là làm tăng tốc độ chiết, hoạt chất trong dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt. Dung môi chiết: EtOH 70% có khả năng chiết đƣợc hầu hết các hoạt chất trong dƣợc liệu, giá phải chăng, dễ tìm, ít độc hại và có thể chiết ở nhiệt độ cao. Đề tài sử dụng sắc ký cột pha thƣờng và sắc ký cột pha đảo . Đây là các phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để phân lập các chất ở Việt Nam, chất hấp phụ dễ kiếm, tiến hành đơn giản hơn so với các phƣơng pháp phân lập khác. 23
  32. Từ cao chiết toàn phần phân đoạn lần lƣợt bằng phƣơng pháp chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol thu đƣợc các cắn phân đoạn với khối lƣợng ether (1,26%), EtOAc (0,59%), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu. Sau khi chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần để loại b ỏ một số tạp ch ất không cần thiết, lựa chọn phân đoạ n BuOH để tiến hành phân lập do đây là phân đoạn giàu saponin nhất 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất Trong đề tài này chúng tôi đã phân lập đƣợc hai hợp chất chƣa đƣợc công bố từ SVD tại Việt Nam là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester dựa trên dữ li ệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộ ng hƣởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT ). Tuy nhiên dạng methyl ester của hợp chất stipuleanosid R2 đã đƣợc công bố có trong SVD trong nghiên cứu trƣớc đó [25], còn hợp chất araloside A methyl ester cũng đã đƣợc tìm thấy trong các loài khác thuộc chi sâm [21, 22]. Kết quả phân tích HPLC cũng cho thấy hai hợp chất phân lập đƣợc là hai saponin chính trong thân rễ sâm vũ diệp thu hái tại Sa Pa đặc biệt là stipuleanosid R2, hợp chất này có thể coi là chất đánh dấu hóa học của sâm vũ diệp. Nhƣ vậy, với hai hợp chất saponin phân lập đƣợc đã có góp phần ý nghĩa vào cơ sở dữ liệu về hóa th ực vật và tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu sâm vũ diệp cũng nhƣ làm cơ sở cho các nghiên c ứu hoạt tính sinh học, tác dụng dƣợc lý của đối tƣợng này. Qua nghiên cứu này và theo các tài liệu công bố có thể thấy thành phần saponin của sâm vũ diệp thuộc nhóm oleanane giống với các saponin của tam thất hoang [22 ; 25 ; 27] . Các nghiên cứu hoạt tính sinh học đã công bố cho thấy stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester có tác dụng gây độc tế bào và hạ đƣờng huyết [20; 22 ; 28] . 4.3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC Tham khảo một số tài liệu [11] kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc chƣơng trình sắc ký cho hai hợp chất saponin phân lập đƣợc nhƣ sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 µm) - Detector DAD phát hiện ở bƣớc sóng 203 nm - Tốc độ dòng: 0,8 ml/min - Thể tích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ: 25 ºC - Dung môi pha mẫu: Methanol 24
  33. - Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chƣơng trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A). Với điều kiện sắc ký nhƣ trên , các chất nghiên cứu trong mẫu thử chu ẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD đều đƣợc tách tƣơng đối tốt, pic cân đối, thờ i gian lƣu hợp lý. Từ chƣơng trình sắc ký chúng tôi đã xây dựng đƣợc đối vớ i hai hợp chất trên cho phép phân tích định tính cũng nhƣ định lƣợng hai hợp chất này trong SVD. Việc này rất có ý nghĩa để phân tích hàm lƣợng saponin trong SVD, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc liệu SVD. Nếu chỉ nhìn bằng mắt thƣờng thì không phải lúc nào chúng ta cũng phân biệt đƣợc một cách chính xác các loài sâm vũ diệp và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng) và sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grush) do hình thái của chúng dƣờng nhƣ rất giống nhau. Vì vậy chúng ta chỉ có thể dựa vào việc so sánh các thành phần hoá học của các loài này. Đề tài này cũng chỉ ra rằng hai saponin chính stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester phân lập đƣợc từ sâm vũ diệp đều có cấu trúc khung oleanan , khác với Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grush ) thành phần saponin chủ yế u có cấu trúc khung dammarane [5]. Do đó bộ dữ liệu “dấu vân tay HPLC ” rất có ý nghĩa khi cần xác định nhanh mẫu SVD, hoặc phân biệt các loài có hình thái tƣơng tự, chống nhầm lẫn dƣợc liệu và trong thực tế khi ngu ồn cung cấp chất đối chiếu chƣa ổn định thì đây là phƣơng pháp lựa chọn thay cho các phƣơng pháp cần chất đối chiếu để đánh giá. Tuy nhiên mục tiêu này chúng tôi chƣa đạt đƣợc hoàn toàn do thời gian thực hiện hạn chế. Vì vậy chúng tôi sẽ tiếp tụ c hoàn thiện mục tiêu này trong thời gian sắp tới. Do nhiều nguyên nhân nhƣ hàm lƣợng các thành phần trong dƣợc liệu SVD biến đổi theo tuổi, theo mùa, nơi trồng trọt, phân bố nên trong một số trƣờng hợp không đạt sự trùng khớp 100% các đỉnh, khi đó sẽ đánh giá sự phù hợ p khi có s ự trùng khớp hầ u hết các đỉnh, trong đó có các đỉnh ch ủ yếu. Chƣơng 5 - Kết luận và ki ến nghị 5.1. Kết luận Qua thời gian nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả theo các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra nhƣ sau : 25
  34. - Đã chiết xuất và phân lập đƣợc hai hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-BuOH của SVD - Đã xác định đƣợc cấu trúc của hai hợp chất phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp vật lý, phƣơng pháp phổ (phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) kết hợp so sánh với dữ liệu công bố trong các tài liệu tham khảo và đã xác định đƣợc đó là stipuleanoside R2 và araloside A methyl ester. Đây là những hợp chất lần đầu tiên đƣợc phân lập trong SVD ở Tây Bắc Việt Nam. - Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp HPLC đối với cả hai chất trên. Kết quả này rất có ý nghĩa trong phân tích định tính, xây dựng dấu vân tay sắc ký và định lƣợng thành phần hoá học, đặc biệt là thành phần saponin của SVD. Mục tiêu ban đầu đề ra chƣa đạt đƣợc nhƣng kết quả bƣớc đầu thu đƣợc này vẫn sẽ là bƣớc nhảy cho các bƣớc tiếp sau để hoàn thiện mục tiêu xây dựng dấu vân tay sắc ký đầy đủ hơn. 5.2. Kiến nghị Đề tài này là một phần trong đề tài cấp nhà nƣớc thuộc chƣơng trình Tây Bắc “ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tgam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M)” của khoa Y Dƣợc đại học Quốc gia Hà Nội. Khoá luận này là một trong những nội dung nghiên cứu về thành phần hoá học của SVD. Với những kết quả đầy tiềm năng và hứa hẹn trên, đề tài này cần tiếp tục nghiên cứu: - Nghiên cứu thành phần hoá học của phân đoạn e-te còn lại hoặc ở các bộ phận khác của cây SVD - Xây dựng dấu vân tay sắc ký hoàn chỉnh phục vụ cho công tác tiêu chuẩn hoá dƣợc liệu SVD 26
  35. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 711 - 714. 2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Thực vật học. 2007, NXB Y học, Hà Nội, tr. 285-286. 3. Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau Đại học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 4. Bộ môn hoá phân tích (2006), Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hoá phân tích II, tr. 17, 99-146, 173-222. 5. Nguyễn Thƣợng Dong (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242. 7. Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng ĐH Quốc Gia, Hà Nội. 8. Đỗ Văn Hào, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đặng Thị Ngần, Đào Thị Hồng Bích, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dƣơng Thị Ly Hƣơng, Nguyễn Hữu Tùng (2017), “Thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33 (2), 50-55. 9. Trần Công Luận, (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr. 1-65. 10. Trần Công Luận, Lƣu Thảo Nguyên và cộng sự (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược liệu, 14(1), tr. 17-23. 11. Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trƣờng ĐH Dƣợc Hà Nội. 12. Nguyễn Văn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), tr. 71-76.
  36. 13. Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr. 177-180. 14. Thái Phan Quỳnh Nhƣ (2001), Phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiêu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế. 15. Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T sai et K. M. Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa y dƣợc, ĐHQGHN. 16. Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 199 – 222; 493 – 685. 17. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (2007), Bộ y tế, Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107 – 113, 216-250. 18. Vụ khoa học và đào tạo (2007), Bộ y tế, Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB y học, tr. 79-82, 84-110. B. Tiếng anh 19. Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp. 1307-1330. 20. Chun Liang, Yan Ding et al. (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-Κb", Journal of Ginseng Research, 37(1), pp. 74-79. 21. Hu M, Ogawa K et al. (1995), "Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata", Phytochemistry, 39, pp. 179-184. 22. Liang C, Ding Y, et al. (2010), "Oleanane –type triterpenoids from Panax stipuleannatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett., 20, pp. 7110-7115. 23. Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp. 1517-1575. 24. Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al. (2016), "In silico identification of anti- cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462. 25. Tung NH, Quang TH et al. (2011), "Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp. 1417- 1420.
  37. 26. Wang D.Q., Feng B.S. et al. (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var. major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp. 633 – 636. 27. Yang W. Z, Hub Y., Wu W. Y., et al. (2014), “Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systemic review of their chemical diversity”, Phytochemistry, 106, pp. 7-24. 28. Yoshikawa M, Murakami T. et al. (1996), "Bioactive saponins and glycosides. VII. On the hypoglycemic principles from the root cortex of Aralia elata Seem.: Structure related hypoglycemic activity of oleanolic acid oligoglycoside", Chem Pharm Bull, 44(10), pp. 1923-1927.
  38. PHỤ LỤC Phụ lục 1 - Phiếu kết quả giám định mẫu Phụ lục 2 - Phổ của hợp chất số 1 (Stipuleanosid R2 ) Phụ lục 2.1. Phổ ESI-MS [M-H]- của chất số 1 Phụ lục 2.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất số 1 Phụ lục 2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT của chất số 1 Phụ lục 2.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) của chất số 1 Phụ lục 3 - Phổ của hợp chất số 2 (araloside A methyl ester) Phụ lục 3.1. Phổ ESI-MS [M+Na]+ của chất số 2 1 Phụ lục 3.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400 MHz) của chất số 2 13 Phụ lục 3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân C-NMR (CD3OD, 100 MHz) của chất số 2 Phụ lục 4. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng trong quá trình phân lập hai hợp chất trên
  39. Phụ lục 1 - Phiếu kết quả giám định mẫu
  40. Phụ lục 2 - Phổ của hợp chất số 1 (Stipuleanosid R2 ) Công thức: C53H84O23 Công thức phân tử
  41. Phụ lục 2.1. Phổ ESI-MS [M-H]- của chất số 1
  42. Phụ lục 2.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (MeOD, 500MHz) của chất số 1
  43. Phụ lục 2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT của chất số 1
  44. Phụ lục 2.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) của chất số 1
  45. Phụ lục 3 - Phổ của hợp chất số 2 (araloside A methyl ester) Công thức: C48H76O18 Công thức phân tử
  46. Phụ lục 3.1. Phổ ESI-MS [M+Na]+ của chất số 2
  47. 1 Phụ lục 3.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400MHz) của chất số 2
  48. C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 176.4341 170.8524 143.1822 122.1970 107.4275 105.2706 94.1235 200 89.5873 85.3639 81.2064 77.0488 76.6866 76.4149 74.5296 73.4923 72.2821 69.4583 61.4643 60.7728 55.3227 150 52.9929 51.3546 50.8030 50.1279 49.7656 49.3046 49.2470 48.8600 48.7942 48.3332 48.2755 48.2179 100 48.1603 47.7486 47.6910 47.6334 47.4029 47.2464 47.1806 46.7854 46.7278 46.3820 46.0856 45.6905 45.1389 50 41.2942 40.9155 39.0714 38.5280 38.1081 36.2475 33.2673 32.3041 31.9336 31.8266 31.5055 29.9083 27.2821 0 26.7799 25.3639 24.6394 22.9270 22.3919 17.7075 16.0445 PPM 15.2706 14.4391 2 số chất của 3 OD, 100 MHz) 100 OD, (CD NMR - C nhân hạt từ hƣởng cộng Phổ 3.3. lục Phụ 13
  49. Phụ lục 4: một số hình ảnh sắc ký lớp mỏng trong quá trình chiết xuất và phân lập