›

Khóa luận Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá húng quế ocimum basilicum trên một số loài vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp

pdf 61 trang thiennha21 18/04/2022 3130
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá húng quế ocimum basilicum trên một số loài vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfnghien_cuu_hoat_tinh_khang_khuan_cua_tinh_dau_la_hung_que_oc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá húng quế ocimum basilicum trên một số loài vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp

  1. LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI PHƢƠNG LÊ LƢƠNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI QU Ả NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ N LÝ VÀ CUNG VÀ CUNG N LÝ HÚNG QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG HÔ HẤP Ứ NG THU Ố KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC C KHÓA 2013 TPHCM – 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ HÚNG QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG HÔ HẤP Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi TPHCM – Năm 2018
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Sinh viên LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
  4. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn bộ Quý Thầy Cô của Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khoảng thời gian em học ở đây. Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi, người thầy trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm luận văn, luôn giúp đỡ em về mặt lý thuyết, lẫn những kỹ năng thực hành chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Em xin cám ơn Bộ môn Hóa sinh – Độc chất, Bộ môn Vi sinh - Kí sinh trùng và Bộ môn Dƣợc liệu đã tạo điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận. Em xin cám ơn cô Nguyễn Hữu Phƣơng Thảo, Võ Thị Nhàn của Bộ môn Vi sinh - Kí sinh trùng đã luôn nhiệt tình, chỉ bảo giúp đỡ, để em có thể học hỏi nhiều kiến thức mới, thu được nhiều kinh nghiệm quý giá và cũng như đã tạo điều kiện để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Xin gửi lời cám ơn tới các bạn Phạm Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Lê Nguyễn Khắc Tùng. Cảm ơn mọi người đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cuối cùng con xin cám ơn ba mẹ, những người thân đã luôn yêu thương, chăm sóc và luôn tạo điều kiện để em an tâm học hành và thực hiện khóa luận trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn. LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
  5. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC HÌNH IV DANH MỤC BẢNG V ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ HÚNG QUẾ 3 1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố 3 1.1.2. Thành phần hóa học 5 1.1.3. Một số nghiên cứu về các tác dụng khác nhau của O.basilicum ngoài khả năng kháng khuẩn 6 1.1.4. Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của O.basilicum ở Việt Nam và trên thế giới 7 1.1.5. Một số phƣơng pháp chiết tinh dầu 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 10 1.2.1. Vi sinh vật gây bệnh và tình trạng đề kháng kháng sinh 10 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đƣờng hô hấp 11 1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 14 1.3.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên thạch 14 1.3.2. Phƣơng pháp pha loãng 15 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 16 2.1.1. Đối tƣợng thử nghiệm 16 2.1.2. Hóa chất 17 2.1.3. Môi trƣờng thử nghiệm 18 2.1.4. Thiết bị dụng cụ 18 i
  6. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Phƣơng pháp thu hái xử lý dƣợc liệu 19 2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 21 2.2.3. Xử lý số liệu thống kê 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. HIỆU SUẤT CHIẾT TINH DẦU 26 3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 26 3.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn 26 3.2.2. Xác định MIC và MBC 28 3.3. BÀN LUẬN 33 3.3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu 33 3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn 34 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 4.1. KẾT LUẬN 36 4.2. ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: BẢNG KẾT QUẢ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC PHỤ LỤC 4: ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ MIC ii
  7. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BHA Brain heart infusion agar Môi trƣờng thạch BHI BHI Brain heart infusion broth Môi trƣờng lỏng BHI CFU Colony Forming Unit Số đơn vị hình thành khuẩn lạc DMSO Dimethyl sulfoxid Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl E. coli, EC Escherichia coli Escherichia coli FTC Ferric thiocyanate Phƣơng pháp Ferric thiocyanate GAS Liên cầu tan huyết nhóm A Group A beta-hemolytic Streptococci Streptococci MBC Minimum Bactericidal Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Concentration MHA Mueller – Hinton Agar Thạch Mueller – Hinton MHBA Mueller – Hinton Blood Agar Thạch máu Mueller – Hinton MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration MRSA, MR Methicilin-resistant Staphylococcus aureus kháng methicillin Staphylococcus aureus MSSA, MS Methicilin-sensitive Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin Staphylococcus aureus O.basilicum Ocimum basilicum Húng quế P.aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseu S.aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus S. pyogenes, Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes Pyo S.pneumoniae, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Pneu WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới iii
  8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hai loại lá húng quế 4 Hình 1.2. Cây Húng quế 5 Hình 1.3. Hoa Húng quế 5 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Linalool 6 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Cineole 6 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Estragole 6 Hình 2.1. Húng quế lá lớn và húng quế lá nhỏ 16 Hình 2.2. Hai loại lá Húng quế 17 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19 Hình 2.3. Mô hình chƣng cất lôi cuốn 21 Hình 2.4. Bộ chƣng cất tinh dầu 21 Hình 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế MRSA của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn (LN: lá nhỏ, LL: Lá lớn) 28 Hình 3.2. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế S.pyogenes của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn (1: lá lớn, 2: lá nhỏ) 28 iv
  9. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các vi khuẩn ƣu tiên của WHO cho nghiên cứu và phát triển các kháng sinh mới [48] 11 Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng 17 Bảng 2.2. Danh sách thiết bị 18 Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế 23 Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu từ hai loại lá Húng quế 26 Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ (mm) 27 Bảng 3.3. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá nhỏ 30 Bảng 3.4. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá lớn 31 Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ 32 Bảng 3.6. Kết quả MBC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ 33 v
  10. Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ HÚNG QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG HÔ HẤP Lê Lƣơng Phƣơng Nghi Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi Mở đầu: Các cây dƣợc liệu thuộc họ Lamiaceae hiện đang đƣợc nghiên cứu khá nhiều về hoạt tính kháng khuẩn và cho nhiều kết quả đáng mong đợi, một trong các cây đáng quan tâm đó là Ocimum basilicum. Do đó chúng tôi chọn đề tài này nhằm cốt yếu tìm hiểu khả năng ức chế của tinh dầu này đối với một số vi sinh vật gây bệnh. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu trên hai loại húng quế là húng quế lá lớn và lá nhỏ sau đó tinh dầu đƣợc li trích bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc và đƣợc khảo sát trên sáu chủng vi khuẩn chuẩn (ATCC): Escherichia coli, Staphylococcus aureus kháng methicillin, Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes và Streptococcus pneumoniae. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của tinh dầu, phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch đƣợc sử dụng nhằm sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn đƣợc sử dụng để xác định giá trị MIC và xác định giá trị MBC trên các chủng vi khuẩn chuẩn bằng phƣơng pháp trải đĩa. Kết quả: Hàm lƣợng tinh dầu vào khoảng 0,49% (lá lớn) và 0,51% (lá nhỏ) tính trên trọng lƣợng tƣơi. Cả hai loại tinh dầu đều ức chế các chủng thử nghiệm ngoại trừ Pseudomonas aeruginosa. Tinh dầu lá nhỏ cho hoạt tính ức chế ở nồng độ thấp, đặc biệt trên hai loài thuộc chi Streptococcus, điển hình Streptococcus pyogenes bị ức chế với MIC là 2.5l/ml. Tinh dầu lá lớn cũng cho hoạt tính ức chế tốt trên các chủng nghiên cứu nhƣng hoạt tính yếu hơn lá nhỏ, điển hình Streptococcus pyogenes bị ức chế với MIC là 5l/ml. Kết luận: Cả hai loại tinh dầu đều cho khả năng ức chế vi khuẩn tốt trên cả vi khuẩn Gram dƣơng cũng nhƣ Gram âm. So với các nghiên cứu khác, nghiên cứu của đề tài cho khả năng ức chế vi khuẩn rất tốt trên các chủng Streptococcus pyogenes và Streptococcus pneumoniae (2 chủng phổ biến gây bệnh đƣờng hô hấp), tuy nhiên qua phân tích thống kê chỉ có sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu húng quế đối với hai chủng trên. Từ khóa: Ocimum basilicum, tinh dầu, kháng khuẩn, Gram (-), Gram (+), MIC, MBC.
  11. Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 – 2018 ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL EXTRACT OF OCIMUM BASILICUM L. LEAVES ON A VARIETY OF PATHOGENIC BACTERIA RELATED TO RESPIRATORY TRACT LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI SUPERVISOR: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi Introduction: The medicinal plants of the Lamiaceae family are currently being studied extensively for their antimicrobial activity and for many expected results, one of the most conspicuous plants is Ocimum basilicum. Therefore, the aim of this study was to determine the inhibitory ability of this essential oil on some pathogenic microorganisms. Materials and methods: This study researched on two types of basil is large leaves and small leaves. The oil was extracted by steam distillation, then it would be tested on six standard bacterial isolates: Escherichia coli, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Methicillin- sensitive Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae. To investigate the antimicrobial properties, the solid diffusion method was used to screen the antibacterial activity, the dilution method in media was used to determine the MIC value, and MBC value was conducted by the disk spread method. Results: The results showed that the oil content of Ocimum basilicum was about 0,49% for large leaves and 0,51% for small leaves on fresh weight. In terms of antimicrobial activity, both essential oils could inhibit all the strains tested except for Pseudomonas aeruginosa. In particular, small leaf oil gave the inhibitory activity even at low concentrations, especially on the Streptococcus species, typically Streptococcus pyogenes was inhibited at MIC concentrations of 2,5l/ml. In addition, large leaf oil also showed very good inhibitory activity on the strains studied but weaker than the small one, typically Streptococcus pyogenes was inhibited at MIC concentrations of 5μl/ml. Conclusion: Both types of oil showed good inhibitory activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, especially on Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae (two common strains related to respiratory disease), the analysing of statistics showed the significant distinction of antimicrobial activity of basil oil to only this two strains. Key words: Ocimum basilicum essential oil, Gram (-), Gram (+), antibacterial activity, MIC, MBC.
  12. ĐẶT VẤN ĐỀ Giữa thế kỉ 16, Antony van Leeuwenhoek (1632 – 1723) hoàn thiện kính hiển vi và khám phá ra thế giới vi sinh vật. Những năm sau đó, nhiều nhà khoa học đã chứng minh vi sinh vật là nguyên nhân của các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên đến trƣớc thế kỉ 20, việc chữa trị các bệnh nhiễm trùng chủ yếu vẫn dựa vào kinh nghiệm dân gian. Năm 1928, Alexander Flemming tìm ra kháng sinh đầu tiên từ chủng nấm Penicillium notatum. Việc phát hiện penicillin và các kháng sinh sau đó trở thành cứu cánh cho điều trị bệnh nhiễm trùng trong một thời gian dài. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, hiện tƣợng đề kháng kháng sinh ngày càng phát triển phức tạp đƣa nhân loại bƣớc vào thời kỳ hậu kháng sinh [6]. Nhiễm trùng đƣờng hô hấp là loại bệnh phổ biến nhất trong các bệnh nhiễm trùng. Những chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp thƣờng là chủng gây nhiều đề kháng nhất với kháng sinh và có khả năng gây bùng phát dịch bệnh cao. Nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ em trên toàn thế giới. Khoảng ba phần tƣ kháng sinh điều trị cho bệnh nhân ngoại trú dành cho các bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp, đặc biệt là đối với viêm xoang do vi khuẩn cấp tính cho ngƣời lớn và viêm tai giữa do vi khuẩn cấp tính cho trẻ em. Việc lạm dụng nhiều thuốc kháng sinh cho nhiễm trùng hô hấp mắc phải cộng đồng và bệnh viện làm tăng nguy cơ mức độ kháng kháng sinh. Sự xuất hiện của vi khuẩn methicillin- resistant Staphylococcus aureus mắc phải cộng đồng và các chủng vi sinh vật đa kháng thuốc (ví dụ: Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa) trong bệnh viện tăng thách thức trong việc điều trị thành công những ca nhiễm trùng này [18]. Nghiên cứu để tìm ra các kháng sinh mới bằng con đƣờng tổng hợp hóa học đang không theo kịp với sự đề kháng của chúng. Để chống lại sự đề kháng của vi sinh vật, đòi hỏi có những cấu trúc hóa học mới phức tạp hơn và các hợp chất tự nhiên có trong cây cỏ là một trong những nguồn cấu trúc đó [3], [14]. Trong những năm gần đây, các loại tinh dầu và chiết xuất thảo dƣợc thu hút đƣợc rất nhiều sự quan tâm từ các ngành khoa học nhờ vào tiềm năng lớn của chúng nhƣ nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên và các hợp chất hoạt tính sinh học [12]. Một số 1
  13. nghiên cứu cũng đã đƣợc thực hiện để khám phá tiềm năng của một số tinh dầu để điều trị các bệnh truyền nhiễm nhƣ biện pháp thay thế dƣợc phẩm tiêu chuẩn [13]. Húng quế (Ocimum basilicum L.), là một thành viên của họ Lamiaceae, là một loại thảo mộc phát triển hàng năm ở nhiều khu vực trên thế giới. Trong số hơn 150 loài thuộc chi Ocimum, húng quế là loài chính để thu hoạch tinh dầu và chúng đƣợc trồng thƣơng mại ở nhiều quốc gia [39]. Các bộ phận của cây Ocimum basilicum, các hợp chất và tinh dầu chiết đƣợc cho thấy tiềm năng lớn trong việc kháng khuẩn điển hình nhƣ nghiên cứu của Moghaddam và cs. (2011), Patil và cs. (2011) [33], [36]. Hoạt tính kháng khuẩn của các loài tinh dầu mặc dù có cùng nguồn gốc từ một loài thực vật nhƣng có thể khác nhau, điều này có thể là do kiểu gen quy định các đặc điểm về hình thái giống cây trồng khác nhau cho hoạt tính kháng khuẩn khác nhau. Do đó đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá húng quế Ocimum basilicum trên một số loài vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp” đƣợc thực hiện với những mục tiêu chính sau: - Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn các chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ. - Xác định giá trị MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và MBC (Minimum Bactericidal Concentration) của tinh dầu trên các chủng vi khuẩn chuẩn. 2
  14. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ HÚNG QUẾ 1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố 1.1.1.1. Danh pháp, vị trí phân loại Tên gọi: Tên khoa học: Ocimum basilicum L. Tên tiếng Anh: Sweet basil (Anh), basilic aux sauces (Pháp) Tên khác: Húng chó, Húng giổi, Rau é, É tía, É quế Giới thực vật: Plantae Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan: Magnoliophyta Phân lớp Hoa Môi: Lamiidae Bộ Hoa Môi: Lamiales Họ Bạc hà: Lamiaceae Chi: Ocimum Loài: Ocimum basilicum [49] 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây mọc quanh năm, cỏ đứng, cao 0,5-1,2m, rất phân nhánh, toàn cây có mùi thơm. Thân non màu xanh có phớt tía hoặc màu tía, rất ít lông. Lá đơn, mọc đối ch o chữ thập. Phiến lá hình trứng nhọn ở đầu và đáy phiến hình nêm men dần xuống cuống, kích thƣớc 3-8 x 2-5cm, màu xanh lục, mặt trên đậm hơn mặt dƣới, bìa có răng cƣa cạn ở 2/3 phía trên, nhiều đốm tuyến. Gân lá hình lông chim, nổi r ở mặt dƣới, 6-8 cặp gân phụ hơi cong lên ở m p lá, có ít lông tơ ngắn. Cuống lá màu xanh nhạt, hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, dài 2-5cm, ít lông ngắn. Cụm hoa ở ngọn cành kiểu chùm xim bó hoặc chùm xim biến dạng hình tháp. Kiểu chùm xim bó: 2 xim co 6 hoa mọc đối tạo thành vòng giả, khoảng cách giữa hai vòng giả 0,5-2cm, các vòng giả tạo thành chùm dài 10-30cm. Kiểu chùm xim biến dạng hình tháp do phía dƣới trục hoa phân nhánh phức tạp. Hoa nhỏ, không đều, lƣ ng tính, mẫu 5. Cánh hoa 3
  15. màu trắng hồng, rìa màu hồng. Quả bế tƣ, màu đen, hình trứng ngƣợc, dài khoảng 1,2mm, đựng trong đài tồn tại [5].  Phân biệt hai loại lá húng quế Húng quế lá lớn: kích thƣớc 6-8 x 2-3cm, gân lá hình lông chim, 6-8 cặp gân phụ hơi cong lên ở m p lá, có ít lông tơ ngắn. Bìa mép lá có răng cƣa cạn, không nhún. Húng quế lá nhỏ: kích thƣớc 3-4 x 1-2cm, gân lá hình lông chim nhƣng không có cặp gân phụ. Bìa mép lá có răng cƣa cạn nhƣng nhún nhiều hơn so với lá lớn. A B Hình 1.1. Hai loại lá húng quế A: Húng quế lá lớn B: Húng quế lá nhỏ 1.1.1.3. Phân bố Húng quế là một loài rau gia vị thuộc họ Hoa môi, có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Quốc nhƣng hiện nay chúng đƣợc trồng ở nhiều nƣớc ôn đới và nhiệt đới thuộc Châu Âu và Châu Á nhƣ Pháp, Ý, Ấn Độ, Thái Lan và Việt Nam. Trên thế giới có nhiều loại húng quế, nhƣng húng quế Việt Nam có mùi dịu nhẹ hơn. Ở Việt Nam, húng quế có ở nhiều tỉnh. Cây ƣa sáng và ẩm, sinh trƣởng mạnh trong mùa mƣa ẩm, thích hợp với đất phù sa và đất thịt. Mùa ra hoa thƣờng vào tháng 7-9 [1]. 4
  16. Hình 1.2. Cây Húng quế Hình 1.3. Hoa Húng quế 1.1.2. Thành phần hóa học Húng quế hiện nay là một loại cây chuyên dùng để sản xuất tinh dầu. Phần trên mặt đất của cây Húng quế chứa tinh dầu có hàm lƣợng cao nhất lúc cây đã ra hoa. Lƣợng tinh dầu chứa trong cây húng quế khá cao là 0,5-1,7%, trong tinh dầu có linalool (60%), cineole, estragole (methyl-chavicol) cùng một số chất khác nhƣ Germacrene D, Tau-cadinol, δ-Gurjunen, δ-Cadinene Ngoài tinh dầu, trong lá và hoa còn chứa protein, carbonhydrat và một lƣợng nhỏ Vitamin A và Vitamin C. Cho tới nay ngƣời ta đã khám phá hơn 140 hợp chất khác nhau, trong đó có trên 30 hợp chất monoterpen, khoảng 20 carboxylic acid, 11 aldehyd mạch thẳng, khoảng 20 hợp chất có mùi thơm và khoảng 20 hợp chất khác [1]. 5
  17. Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Linalool Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Cineole Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Estragole 1.1.3. Một số nghiên cứu về các tác dụng khác nhau của O.basilicum ngoài khả năng kháng khuẩn  Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa 6
  18. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết methanol từ Ocimum gratissimum và Ocimum basillicum đƣợc nghiên cứu với nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp làm sạch các gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), làm sạch hydrogen peroxi, phƣơng pháp Ferric thiocyanate (FTC) Khả năng chống oxy hóa của O.basilicum đƣợc cho là yếu hơn O.gratissimum. Theo phƣơng pháp DPPH, phần trăm làm sạch các gốc tự do phụ thuộc vào nồng độ. Cao chiết acetone và ethanol của O.basilicum đƣợc thƣc hiện ở nồng độ 50, 100, 250 và 500µg/ml. Theo phƣơng pháp FTC, cao chiết ethanol của O.basilicum ở nồng độ 500µg/ml cho 75,87%, khả năng kháng khuẩn gần với α-tocopherol (500µg/ml) 82,14% theo tham chiếu [20].  Nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm Cao chiết từ hạt O.basilicum trong phân đoạn ete dầu mỏ (400mg/kg) và ethanol (400mg/kg) đƣợc sử dụng để điều trị kháng viêm do histamin và prostaglandin (PGF2-a) gây ra ở 60 con chuột chia làm 10 nhóm. Ức chế đáng kể tình trạng phù nề ở chân do histamine và PGF2-a đã chứng minh rằng hạt O.basilicum có hoạt tính kháng viêm tiềm năng [35]. Kết quả ghi nhận rằng các chất chiết xuất methanol thô ức chế các cytokine tiền viêm và các chất trung gian. Qua nghiên cứu cho thấy các chất chiết xuất có hoạt tính chống viêm [40]. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của O.basilicum ở Việt Nam và trên thế giới  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới có nhiều nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của O.basilicum khá tốt. Theo một nghiên cứu của Moghaddam và cộng sự tại Iran, tinh dầu chiết xuất từ lá O.basilicum bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc cho hoạt tính kháng khuẩn tốt trên các vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng bao gồm E.coli, P.aeruginosa, Bacillus cereus, S.aureus. Kết quả MIC đối với Bacillus cereus dao động từ 36-18μg/ml S.aureus 18μg/ml, E.coli và P.aeruginosa là 18-9μg/ml [33]. Theo một nghiên cứu khác của Patil và cộng sự tại Ấn Độ, khả năng kháng khuẩn của các cao chiết ethanol, methanol và hexane của húng quế bằng phƣơng pháp đĩa 7
  19. giấy khuếch tán và phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng thạch cho thấy hoạt tính kháng khuẩn rất tốt trên các chủng Gram (-) và Gram (+). Trong đó cao chiết hexan cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất [36].  Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Tại Việt Nam, thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên O.basilicum cũng đã đƣợc tiến hành và cho kết quả rất tốt. Theo một nghiên cứu thực hiện trên húng quế của tác giả Ánh đƣợc trồng và thu hoạch tại Tiền Giang cho thấy tinh dầu O.basilicum có thể ức chế đƣợc một số chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nhƣ E.coli, Salmonella typhmumrium, Shigella, Bacillus cereus, MRSA ngoại trừ P.aeruginosa [1]. Ở một nghiên cứu khác, tinh dầu húng quế (O.basilicum) đƣợc phối hợp với một số loại tinh dầu khác nhƣ tinh dầu quế (Oleum cinnamomum), tinh dầu sả chanh (Cymbopogon flexuosus) và bạc hà (Mentha Arvensis) đƣợc cung cấp bởi công ty cổ phần tinh dầu Việt Nam nhằm thử khả năng kháng nấm trên hai chủng sinh vật Saccharomyces cerevisiae M1 đƣợc phân lập từ nho đỏ Ninh Thuận và Aspergillus niger L2 đƣợc phân lập từ bơ Đắc Lắc. Chủng vi sinh vật đƣợc giải trình tự và định danh tại công ty Nam Khoa. Hoạt tính kháng nấm đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch. Nghiên cứu cho thấy các loại tinh dầu quế, sả chanh, húng quế và bạc hà dạng đơn và kết hợp đều cho khả năng ức chế S.cerevisiae M1 và A.niger L2 hiệu quả. Tinh dầu có thể ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm A.niger L2. Hỗn hợp tinh dầu húng quế - bạc hà có hiệu quả hơn khi từng loại tinh dầu của chúng tác động dạng đơn [2]. 1.1.5. Một số phƣơng pháp chiết tinh dầu  Phƣơng pháp trích ly sử dụng dung môi hữu cơ (Maceration extraction) Phƣơng pháp này phân tách tinh dầu dựa vào tính chất tinh dầu tan tốt trong các dung môi không phân cực (thƣờng sử dụng dung môi là các hydrocarbon nhƣ n- hexane, có nhiệt độ sôi thấp để dễ loại bỏ). Ƣu điểm: Phƣơng pháp này sử dụng ở điều kiện nhiệt độ phòng, do đó tinh dầu sẽ không bị biến tính. 8
  20. Nhƣợc điểm: Do sử dụng dung môi hữu cơ nên cần thêm một bƣớc loại dung môi ở điều kiện chân không (thƣờng phải sử dụng máy cô quay chân không) nên tăng chi phí về mặt thiết bị. Ngoài ra, nếu quá trình sau không loại hết dung môi ra khỏi sản phẩm thì sẽ ảnh hƣởng rất nhiều tới chất lƣợng sản phẩm và một số loại dung môi độc đối với ngƣời sử dụng và ảnh hƣởng tới môi trƣờng.  Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc Thông thƣờng tinh dầu có nhiệt độ sôi khá cao, ví dụ nhƣ cineole thành phần chính có trong rất nhiều loại tinh dầu nhƣ khuynh diệp, tràm gió có nhiệt độ sôi là 176,4oC. Tuy nhiên, do nó không tan trong nƣớc nên nó sẽ tạo thành một hỗn hợp hai chất lỏng không tan và hỗn hợp này có nhiệt độ sôi nhỏ hơn 1000C (nhiệt độ sôi của nƣớc ở điều kiện bình thƣờng). Do nó không tan trong nƣớc và nhẹ hơn nƣớc nên sau khi ngƣng tụ hỗn hợp nƣớc và tinh dầu sẽ tách thành hai lớp và có thể phân tách đƣợc bằng phƣơng pháp chiết. Ƣu điểm: thực hiện dễ dàng ở mọi điều kiện, thiết bị dễ lắp ráp và vận hành đơn giản, giá thành rẻ. Nhƣợc điểm: Không thích hợp cho một số loại tinh dầu có thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao. Nó tiêu tốn rất nhiều năng lƣợng cho quá trình hóa hơi nƣớc, ngoài ra thời gian chƣng cất thƣờng khá lâu từ 4-6 giờ.  Phƣơng pháp ép lạnh Phƣơng pháp p lạnh là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng cho các bộ phận có chứa tinh dầu trong các túi tinh dầu, hàm lƣợng tinh dầu cao, dễ bị p bể nhƣ bƣởi, cam, chanh. Ƣu điểm: Phƣơng pháp này đơn giản, cho tinh dầu nguyên chất, giá thành sản xuất tƣơng đối rẻ. Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này lẫn màu và mùi của nguyên liệu, nhiều tạp (phần không phải tinh dầu), không thể thực hiện đƣợc với các loại tinh dầu trong gỗ, hoa, Thời gian sử dụng của các loại tinh dầu này cũng khá ngắn.  Phƣơng pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn 9
  21. Đây là phƣơng pháp tiên tiến nhất hiện nay, do thu tinh dầu chất lƣợng cao với hiệu suất cao, loại bỏ đƣợc nhiều tạp chất. Thƣờng sử dụng CO2 siêu tới hạn nhƣ một dung môi để đẩy tinh dầu ra khỏi dƣợc liệu, ở nhiệt độ khoảng 350C dung môi đƣợc bơm qua dƣợc liệu dƣới áp lực 8000 psi, ở điều kiện này CO2 trở thành lớp sƣơng mù dày hoặc hơi nƣớc. Qua việc giải phóng áp lực trong cả hai quá trình, CO2 siêu tới hạn thoát ra ở dạng khí, để lại tinh dầu đằng sau. Ƣu điểm: Tinh dầu không bị biến tính, dễ dàng tách ra khỏi dung môi hoàn toàn Nhƣợc điểm: Hệ thống phức tạp, giá thành tinh dầu cao gấp nhiều lần các loại tinh dầu đƣợc chiết xuất bằng các phƣơng pháp khác. Theo các thực nghiệm bằng phƣơng pháp này các chất nhƣ nhựa, sáp b o cũng bị lôi cuốn theo chứ không riêng chỉ có tinh dầu [26], [37]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 1.2.1. Vi sinh vật gây bệnh và tình trạng đề kháng kháng sinh Việc phát minh ra nhiều loại kháng sinh đã giúp con ngƣời đối phó với bệnh nhiễm trùng dễ dàng hơn. Tuy nhiên, vi khuẩn càng tiếp xúc với kháng sinh nhiều thì càng gia tăng sự đề kháng thuốc và dẫn đến giảm hiệu lực của thuốc. Đơn cử nhƣ penicillin đƣợc chính thức đƣa vào sử dụng trên lâm sàng vào năm 1940, tuy nhiên, đến năm 1962 đã xuất hiện chủng đề kháng tại Anh. Vancomycin – kháng sinh đƣợc dùng để điều trị các chủng S.aureus đề kháng – đƣợc các nhà khoa học tin rằng gần nhƣ không thể phát sinh chủng đề kháng trên lâm sàng. Nhƣng đến năm 1979 đã xuất hiện chủng đề kháng [16]. Tiến hành khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa Hồi sức tích cực và chống độc - Bệnh viện Cấp cứu Trƣng Vƣơng. Kết quả cho thấy, S.aureus còn khá nhạy với oxacillin (72,7%) và vancomycin (60,7%). P.aeruginosa kháng cao với imipenem (50%). E.coli kháng hầu hết các loại kháng sinh nhƣng vẫn còn nhạy với imipenem và meropenem [4]. Danh sách những chủng vi khuẩn đề kháng nhiều loại kháng sinh và cần thiết tìm kiếm kháng sinh mới để điều trị do WHO đề nghị đƣợc trình bày trong Bảng 1.1. 10
  22. Bảng 1.1. Danh sách các vi khuẩn ƣu tiên của WHO cho nghiên cứu và phát triển các kháng sinh mới [48] Mức độ ƣu tiên Chủng vi khuẩn Khẩn cấp Acinetobacter baumannii, kháng carbapenem Pseudomonas aeruginosa, kháng carbapenem Enterobacteriaceae, kháng carbapenem, sản xuất ESBL Cao 1. Enterococcus faecium, vancomycin-resistant 2. Staphylococcus aureus kháng methicillin, kháng vancomycin 3. Helicobacter pylori, kháng clarithromycin 4. Campylobacter spp., kháng fluoroquinolone 5. Salmonella, kháng fluoroquinolone 6. Neisseria gonorrhoeae, kháng cephalosporin, kháng fluoroquinolone Trung bình 1. Streptococcus pneumoniae, không kháng penicillin 2. Haemophilus influenzae, kháng ampicillin 3. Shigella spp., kháng fluoroquinolone 1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đƣờng hô hấp Hiện nay, nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính chiếm 20-40% bệnh nhân ngoại trú và 12-35% số bệnh nhân nội trú trong các bệnh viện đa khoa. Nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp trên bao gồm viêm mũi họng, viêm họng, viêm amydal và viêm tai giữa chiếm 87,5% tổng số ca nhiễm khuẩn. Phần lớn các bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp trên cấp tính là do virus gây ra. Cảm lạnh thông thƣờng là do virus trong hầu hết các trƣờng hợp và không cần sử dụng tác nhân kháng khuẩn trừ các ca nhiễm phức tạp nhƣ viêm tai giữa cấp tính với tràn dịch, viêm amydal, viêm xoang và nhiễm trùng đƣờng hô hấp dƣới. Hầu hết các trƣờng hợp viêm mũi xoang là do virus và do đó không cần điều trị bằng thuốc kháng sinh. Các vi khuẩn phổ biến nhất gây viêm xoang là S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis, S.aureus và S.pyogenes. Khoảng 15% số ca nhiễm có thể do liên cầu tan huyết β nhóm A (GAS) gây ra [25]. 11
  23. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp:  Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm hiếu khí hình que thuộc họ Pseudomonadaceae. Nó là tác nhân gây bệnh cơ hội và nguyên nhân chính gây ra nhiễm trùng hô hấp bệnh viện và đƣợc xem là tác nhân gây bệnh thách thức nhất trên toàn cầu vì tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao [24]. Do nhu cầu dinh dƣ ng thấp của P.aeruginosa nên chúng dễ dàng phát triển và tăng sinh trong môi trƣờng bệnh viện. Chúng đề kháng với nhiều tác nhân kháng khuẩn và chỉ vài kháng sinh có hiệu quả chống lại P.aeruginosa. Ở Mỹ, theo báo cáo của hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia, P.aeruginosa đứng thứ hai trong số tất cả các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến bệnh viêm phổi. Tỷ lệ P.aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam.  Methicilin-sensitive Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dƣơng có hình cầu và sắp xếp thành cụm đƣợc mô tả là “dạng hình trái nho”. Trên môi trƣờng dinh dƣ ng, các khuẩn lạc thƣờng có màu vàng. Những sinh vật này có thể phát triển hiếu khí hoặc kỵ khí. Trong số nhiều bệnh nhiễm trùng mà S.aureus gây ra, viêm phổi là một trong những trƣờng hợp nổi bật nhất, ƣớc tính khoảng 50.000 ca nhiễm tụ cầu khuẩn mỗi năm chỉ riêng ở Hoa Kỳ [28]. Là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi do thở máy thở, S.aureus từ lâu đã gây cản trở môi trƣờng chăm sóc đặc biệt trong bệnh viện [22]. Hơn nữa, tác nhân gây bệnh này ngày càng đƣợc công nhận là nguyên nhân hàng đầu của viêm phổi mắc phải do cộng đồng, khả năng lây nhiễm trên diện rộng đối với ngƣời lớn và trẻ em khỏe mạnh [29]. Methicilin-resistant Staphylococcus aureus Việc quản lý lâm sàng bệnh viêm phổi tụ cầu ngày càng khó khăn là do một nửa số chủng S.aureus hiện đang đƣợc phân loại là S.aureus kháng methicillin (MRSA), chứa các gen khiến các chủng này không nhạy cảm với một nhóm kháng sinh mạnh. Các quan sát lâm sàng gần đây đã ghi nhận rằng tỷ lệ tử vong do viêm phổi MRSA 12
  24. có thể vƣợt quá 50%, qua đó có thể xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh do sinh vật này gây ra [7]. Chi phí y tế trực tiếp ƣớc tính để điều trị bệnh nhân viêm phổi do S. aureus vƣợt quá 35,000$, gây ra gánh nặng đáng kể cho nền kinh tế [38]. Những rủi ro kết hợp của dịch tễ học thay đổi và sức đề kháng thuốc rộng rãi giữa các chủng S.aureus đòi hỏi sự phát triển của các chiến lƣợc mới để phòng ngừa và điều trị bệnh.  Streptococcus pneumoniae Bệnh phế cầu khuẩn là một bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Streptococcus pneumoniae gây ra . Những vi khuẩn này có thể gây ra nhiều loại bệnh nhƣ: viêm phổi (nhiễm trùng phổi), nhiễm trùng tai, viêm màng nhĩ và nhiễm khuẩn huyết. Vi khuẩn phế cầu khuẩn lan truyền qua ho, hắt hơi và tiếp xúc gần gũi với ngƣời bị nhiễm bệnh. Các triệu chứng của bệnh phế cầu khuẩn phụ có thể bao gồm sốt, ho, khó thở, đau ngực Trong trƣờng hợp nặng, bệnh phế cầu khuẩn có thể gây mất thính giác, tổn thƣơng não và tử vong. Hàng năm có khoảng 2,6 triệu trẻ em vào khoảng 5 năm tuổi chết do viêm phổi chủ yếu, khoảng một nửa trong số này tử vong là do S.pneumoniae hoặc kết hợp với nhiễm trùng đƣờng hô hấp do virus, suy dinh dƣ ng hoặc nhiễm HIV. Phế cầu khuẩn là một phần của hệ vi sinh vật tồn tại trong mũi và họng, đặc biệt là ở trẻ em và dễ dàng truyền nhiễm thông qua nƣớc bọt từ ngƣời này sang ngƣời khác đặc biệt nguy cơ này tăng cao khi bị lây nhiễm từ bệnh nhân nhiễm trùng đƣờng hô hấp. Nhiều nghiên cứu đã ghi lại việc nhiễm phế cầu ở đƣờng mũi họng thƣờng xảy ra ở độ tuổi nhỏ và là bệnh phổ biến nhất trong số các bệnh ở trẻ em tại các nƣớc phát triển và nƣớc đang phát triển [34].  Streptococcus pyogenes Nhiễm trùng đƣờng hô hấp trên là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất ở trẻ em. Viêm họng do Streptococcus là khá phổ biến ở trẻ em trong các trung tâm chăm sóc trẻ em. Sự truyền nhiễm xảy ra khi tiếp xúc trực tiếp hay hít phải vi sinh vật qua các giọt nƣớc bọt [27]. Thời kỳ ủ bệnh liên cầu khuẩn gây viêm họng ngắn từ hai đến năm ngày. Triệu chứng bao gồm ban đỏ, phù nề và sƣng họng, ngoài ra có thể 13
  25. amydal mở rộng và có màu trắng xám [41]. Nếu không xử lý kịp thời, thì tốc độ truyền nhiễm của GAS khoảng 35% trong gia đình hoặc trƣờng học. Điều kiện sống đông đúc có thể tăng sự truyền nhiễm của GAS và có thể gây bùng phát thành dịch. Việc trì hoãn điều trị hoặc không đáp ứng đƣợc điều trị liên cầu khuẩn viêm họng có thể gây ra các biến chứng nghiêm trọng tiếp theo, chẳng hạn nhƣ sốt thấp khớp cấp tính và viêm cầu thận cấp tính. 1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT Hai phƣơng pháp chính dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh vật là phƣơng pháp khuếch tán trên thạch và phƣơng pháp pha loãng [8], [9], [10]. 1.3.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên thạch  Phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán Thƣờng áp dụng với các chất không thể khuếch tán trong bản thạch. Đây là thử nghiệm đi trƣớc thử nghiệm MIC. Là phƣơng pháp hay dùng để làm kháng sinh đồ. Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng một lớp huyền dịch vi khuẩn. Chất thử sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế. Ƣu điểm: nhanh, gọn, thực hiện dễ dàng. Nhƣợc điểm: Nếu chất thử không khuếch tán vào bản thạch sẽ cho kết quả sai lệch.  Phƣơng pháp đục lỗ Nguyên tắc: Dùng đĩa thạch đã đƣợc tráng sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đến đáy hộp. Cho dung dịch thử vào các lỗ tròn, chất thử sẽ khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo vùng ức chế quanh chỗ đục lỗ (vòng vô khuẩn). Ƣu điểm: Có thể thực hiện với hầu hết mọi chất. Nhƣợc điểm: Cần thăm dò để tìm ra dung dịch đệm và môi trƣờng để chất thử nghiệm khuếch tán tốt nhất. Phƣơng pháp này cũng đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm. Đối với các phƣơng pháp trên, chất thử đƣợc coi là có tính kháng khuẩn 14
  26. nếu có vòng ức chế rõ ràng. Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại bằng phƣơng pháp pha loãng. 1.3.2. Phƣơng pháp pha loãng  Phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng lỏng Nguyên tắc: Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trƣờng lỏng đã pha sẵn chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đƣa vi khuẩn thử nghiệm vào. Đem ủ ở 35 – 37oC trong vòng 16 – 20 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng lỏng (môi trƣờng sẽ trong), ngƣợc lại, nếu có sự tăng trƣởng của vi khuẩn, môi trƣờng sẽ đục. Ƣu điểm: Nhanh gọn, dễ thực hiện. Nhƣợc điểm: Chỉ áp dụng đƣợc với các chất dễ tan trong nƣớc.  Phƣơng pháp pha loãng trong thạch Nguyên tắc: Pha loãng chất thử vào môi trƣờng thạch đun chảy, đổ vào hộp petri. Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ từ 16 – 24 giờ. Nếu có khóm vi khuẩn mọc lên thì chất thử không có tác dụng, nếu vi khuẩn không mọc thì chất thử có tác dụng ức chế. Trƣờng hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm, kiểm tra các yếu tố có thể ảnh hƣởng tới kết quả thử nghiệm (chất nhũ hóa, dung môi hòa tan, nhiệt độ môi trƣờng, ). Ƣu điểm: Có thể sử dụng cho các chất khó tan, không tan trong môi trƣờng. Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này đòi hỏi kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên bản thạch và phƣơng pháp này đòi hỏi số lƣợng vi khuẩn mỗi lần chấm là nhƣ nhau. 15
  27. CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng thử nghiệm 2.1.1.1. Dƣợc liệu Húng quế sử dụng trong nghiên cứu của đề tài đƣợc trồng ở Khánh Hòa. Hai loại húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trồng cùng thời điểm và thu hoạch từ lúc cây bắt đầu ra hoa (sau 35 ngày trồng [43]) vào tháng 7/2018. Các cây đƣợc trồng tự nhiên không có phân bón, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu hay các thuốc tƣơng tự cũng nhƣ hóa chất. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng trong đề tài bao gồm lá tƣơi và hoa (nếu có), tất cả đều dùng ở dạng tƣơi. Hai loại lá húng quế đƣợc thể hiện trong hình 2.1 và 2.2. Hình 2.1. Húng quế lá lớn và Húng quế lá nhỏ 16
  28. A B Hình 2.2. Hai loại lá Húng quế A: Húng quế lá lớn B: Húng quế lá nhỏ 2.1.1.2. Vi sinh vật Các thử nghiệm đƣợc thực hiện trên 6 chủng vi khuẩn tiêu chuẩn, đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành nhƣ sau: Escherichia coli ATCC 35218 Staphylococcus areus ATCC 29213 (MSSA) Staphylococcus areus ATCC 33591 (MRSA) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Streptococcus pyogenes ATCC 19625 2.1.2. Hóa chất Danh sách hóa chất sử dụng trong đề tài đƣợc trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng STT Hóa chất Nhà sản xuất Nƣớc sản xuất Tiêu chuẩn 1 Nƣớc cất Cemaco Việt Nam Công nghiệp 2 DMSO Merck Đức Công nghiệp 3 Tween 80 Merck Đức Công nghiệp 17
  29. 2.1.3. Môi trƣờng thử nghiệm Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: môi trƣờng Brain Heart Infusion Agar (BHA) và môi trƣờng Brain Heart Infusion Broth (BHI). Môi trƣờng pha loãng vi khuẩn: nƣớc muối sinh lý 0.85% và 0.05% Tween 80. Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn (khuếch tán kháng sinh trong thạch từ đĩa giấy và kháng sinh đồ xác định MIC): môi trƣờng Mueller–Hinton Agar (MHA) (Merck) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với các chủng S.pyogenes và S.pneumoniae. Tất cả môi trƣờng sau khi pha xong đƣợc hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Môi trƣờng đã hấp tiệt trùng nhƣng chƣa sử dụng đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 2 – 8°C. 2.1.4. Thiết bị dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành. Danh sách các thiết bị sử dụng đƣợc trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Danh sách thiết bị STT Thiết bị Model 1 Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV110 2 Tủ sấy Memmert WBU 45 – UM 500 3 Kính hiển vi Optica ANHG 10609 4 Cân điện tử Sartorius Practum 2102 – 1S 5 Tủ cấy vô trùng Esco AVC-4A1 6 Máy vortex Labnet 3412EU 7 Tủ ấm Heraeus 8 Máy đo quang phổ UV – 1280 GeneQuant 9 Bếp đun bình cầu 1 lít 1108 – 150 Glassco 10 Bộ chƣng cất tinh dầu 18
  30. Dụng cụ: đĩa petri Φ 40mm, Φ 60mm, Φ 90mm; que cấy, tăm bông tiệt trùng, đĩa giấy Whatman 6mm, que trải tam giác, đèn cồn và các dụng cụ thủy tinh thông thƣờng trong phòng thí nghiệm. Dụng cụ dùng trong thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đƣợc hấp tiệt khuẩn ở 121oC trong 20 phút, sấy ở nhiệt độ 80oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng cho nguội trƣớc khi sử dụng. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo các bƣớc nhƣ Sơ đồ 2.1. Húng quế lá nhỏ Húng quế lá lớn Thu hoạch sau 35 ngày trồng Chiết xuất bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc Tinh dầu Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán Xác định MIC bằng phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng thạch Xác định MBC bằng phƣơng pháp trải đĩa Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.1. Phƣơng pháp thu hái xử lý dƣợc liệu Dƣợc liệu sau khi thu hoạch, đƣợc rửa sạch để loại bỏ bụi bám dính và rửa lại bằng nƣớc cất, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ vừa phải 19
  31. và đƣợc dùng để chiết tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trong vòng 3 giờ bằng bộ chƣng cất tinh dầu. Sau đó, tinh dầu sẽ đƣợc lấy ra và cho vào eppendorf bảo quản trong tủ lạnh 2-8oC.  Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng đa số với quy mô phòng thí nghiệm. Chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc là một trong các phƣơng pháp đặc biệt của phƣơng pháp chƣng cất đối với các dƣợc liệu nhạy cảm với nhiệt độ nhƣ tinh dầu, nhựa, hydrocacbon, không hòa tan trong nƣớc và có thể bị phân hủy tại điểm sôi của chúng. Bản chất cơ chế của chƣng cất hơi nƣớc cho ph p một hợp chất hoặc hỗn hợp của các hợp chất đƣợc chƣng cất ở nhiệt độ thấp hơn đáng kể so với điểm sôi của thành phần riêng lẻ. Tinh dầu chứa các chất có điểm sôi lên tới nhiệt độ từ 200°C trở lên, nhờ hơi nƣớc hoặc khi nƣớc sôi các chất có thể bay hơi ở nhiệt độ gần 100°C ở áp suất khí quyển. Nguyên liệu sử dụng trong phƣơng pháp là dƣợc liệu tƣơi hoặc đôi khi sấy khô đƣợc đặt trong bình cầu có dung tích 1000ml có dẫn qua ống sinh hàn. Khi đến nhiệt độ sôi nƣớc đi qua dƣợc liệu dƣới áp suất có thể làm mềm các tế bào và cho ph p tinh dầu thoát ra theo hơi nƣớc dƣới dạng hơi. Nhiệt độ của hơi nƣớc phải đủ cao để làm bay hơi dầu, nhƣng không quá cao để không phá hủy dƣợc liệu hoặc làm kh t tinh dầu. Khi chúng đƣợc giải phóng, những giọt tinh dầu nhỏ bay hơi và cùng với các phân tử hơi nƣớc, đi qua ống hứng tinh dầu. Khi hơi nƣớc nguội đi, nó ngƣng tụ thành nƣớc. Tinh dầu tách lớp và nổi trên mặt chất lỏng [37]. Tiến hành: Dƣợc liệu sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, đem đi cân và ghi nhận kết quả để tính hiệu suất. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ cho vào bình cầu dung tích 1000ml cùng với 500ml nƣớc cất, lƣợng nƣớc vừa đủ ngập dƣợc liệu. Lắp ráp hệ thống sinh hàn hoàn chỉnh. Thời gian quá trình chƣng cất khoảng 3 giờ. Sau đó lấy lớp tinh dầu nổi phía trên mặt chất lỏng cho vào eppendorf và bảo quản trong tủ lạnh. Mô hình thực hiện phƣơng pháp chứng cất lôi cuốn đƣợc thể hiện trong hình 2.3 và 2.4. Hiệu suất chiết tinh dầu tính theo công thức: 20
  32. ƣợ ầ đƣợ Hiệu suất chiết tinh dẩu: ƣợ á đ ế Ống sinh hàn Ống hứng tinh dầu Tinh dầu Nƣớc Bình cầu Bếp đun Hình 2.3. Mô hình chƣng cất lôi cuốn Hình 2.4. Bộ chƣng cất tinh dầu hơi nƣớc 2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.2.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn Tinh dầu đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn trình bày ở mục 2.1.1.2, theo phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán, đƣợc qui định tại hƣớng dẫn M44 – A và M02 – A11 của CLSI [23], [30]. 2.2.2.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng thử nghiệm Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là Mueller–Hinton Agar (MHA) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae. Sau khi pha và hấp tiệt trùng, môi trƣờng đƣợc cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4mm. Thể tích môi trƣờng khoảng 6.5ml/đĩa đối với đĩa Φ 60mm và để thực hiện trên hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae và 21
  33. 20ml/đĩa đối với đĩa Φ 90mm với các chủng vi khuẩn thƣờng. Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 4 – 8°C. Khi sử dụng, nếu đĩa ƣớt, để đĩa trong tủ ấm tối đa 30 phút cho đĩa khô hoàn toàn. 2.2.2.1.2. Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn Các chủng vi khuẩn chuẩn sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch BHA và BHA bổ sung 5% máu cừu đối với chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ. Chọn 3-5 khóm vi khuẩn giống nhau tách rời, dùng vòng cấy vô trùng lấy các khóm cho vào ống chứa dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85% có thêm 0,05% Tween 80 và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 625nm. Giá trị này tƣơng đƣơng với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi pha xong phải sử dụng trong vòng 30 phút. 2.2.2.1.3. Chuẩn bị chất thử Tinh dầu đƣợc tẩm lên các đĩa giấy đƣờng kính 6mm với lƣợng là 3l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 60mm, 7l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 90mm. 2.2.2.1.4. Tiến hành khảo sát Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn. Trải vi khuẩn lên môi trƣờng thử nghiệm bằng que bông. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải theo đƣờng zic-zac sát nhau đến giữa đĩa petri, sau đó xoay mặt thạch 600 rồi tiếp tục trải zic-zac nhƣ lần trên, rồi xoay tiếp 600 và trải các đƣờng sát nhau nhƣ vậy đến khi huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải đều trên toàn bộ mặt thạch. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn đƣợc trải đều. Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu lên bề mặt môi trƣờng bằng kẹp vô trùng. Sau khi đặt đĩa dùng kẹp nhấn nhẹ đĩa xuống mặt thạch để đảm bảo đĩa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa giấy, phải ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 35 – 37°C trong 24 giờ. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. 2.2.2.1.5. Đọc kết quả 22
  34. Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng tròn ức chế đồng nhất. Đo và ghi nhận đƣờng kính vòng ức chế kể cả đƣờng kính của đĩa tẩm tinh dầu bằng thƣớc kẹp có độ chia nhỏ nhất là 0,01mm. Khả năng kháng mạnh hay yếu đƣợc đánh giá sơ bộ bằng giá trị đƣờng kính vòng ức chế theo Bảng 2.3 [47]. Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế Đƣờng kính vòng ức chế vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật > 14 Mạnh 10 – 14 Vừa 7 – 9 Yếu 6 Không kháng 2.2.2.2. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) Tinh dầu có tác động ức chế sẽ đƣợc thử nghiệm tìm MIC bằng phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn [45], [46]; mỗi thử nghiệm thực hiện lặp lại 6 lần. 2.2.2.2.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm Tƣơng tự với mục 2.2.2.1.2. Sau đó, huyền dịch trên tiếp tục đƣợc pha loãng 10 lần để đạt mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với 107 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi đƣợc pha chế phải đƣợc sử dụng ngay trong vòng 30 phút. 2.2.2.2.2. Môi trƣờng Môi trƣờng tốt nhất để thực hiện phƣơng pháp pha loãng môi trƣờng thạch xác định MIC là MHA (Mueller-Hinton Agar). Chất thử nghiệm đƣợc hút chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO 1%. Chuẩn bị sẵn 1 dãy gồm 11 đĩa petri Φ 40mm vô trùng và đánh số từ 1 đến 10 ở đáy đĩa; đĩa số 11 đƣợc ký hiệu là đĩa chứng và không cho chất thử vào. Tiến hành pha loãng trong môi trƣờng thử nghiệm sao cho tạo thành dãy có nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trƣớc. Đối với hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae, khi tiến hành pha loãng cho thêm vào mỗi ống 5% máu cừu. Khoảng nồng độ cần pha phụ thuộc vào MIC dự đoán của chất thử. Sử dụng máy vortex để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trƣờng. Đổ vào đĩa petri và chờ thạch đông. 23
  35. 2.2.2.2.3. Tiến hành khảo sát Chấm 1µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt đƣợc mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Các đĩa thạch đƣợc để ngửa để dịch cấy trên các điểm cấy thấm hoàn toàn lên mặt thạch khoảng 10-15 phút. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. 2.2.2.2.4. Đọc kết quả Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại. 2.2.2.3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 2.2.2.3.1. Môi trƣờng Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là BHA bổ sung 5% máu cừu đối với S.pyogenes và S.pneumoniae và BHA đối với các chủng vi khuẩn còn lại. 2.2.2.3.2. Tiến hành khảo sát Trên các đĩa thạch đã thực hiện MIC, chọn các đĩa có nồng độ nhƣ sau: 1 đĩa ngay nồng độ MIC và 2 đĩa có nồng độ gấp 2, gấp 4 lần MIC. Dùng dao đầu nhọn đã tiệt trùng cắt phần thạch đã chấm vi khuẩn trên các đĩa đƣợc chọn làm MBC. Sau đó cho vào mỗi eppendorf 100µl nƣớc muối sinh lý có thêm 0,05% Tween 80, vortex kỹ. Hút huyền dịch trong eppendorf cho vào đĩa môi trƣờng đã đƣợc hấp tiệt trùng sẵn. Dùng que trải thủy tinh tam giác phân tán đều huyền dịch trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch hoàn toàn khô. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C, nếu có vi khuẩn thì chúng sẽ mọc thành các khóm trên mặt thạch. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. 2.2.2.3.3. Đọc kết quả Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ. Tính số khóm trung bình trên một hộp thạch ở cùng nồng độ. MBC là nồng độ mà tại đó diệt 99,9% vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có tổng số khóm dƣới 10, nồng độ của đĩa thạch này là MBC của chất thử đối với vi 24
  36. khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại. 2.2.3. Xử lý số liệu thống kê Đề tài sử dụng phần mềm phân tích xử lý số liệu thống kê MINITAB 18.1. Mục đích của đề tài khi sử dụng xử lý thống kê đó là đánh giá sự khác biệt của hai loại lá húng quế. Tất cả các thí nghiệm đƣợc thực hiện sáu lần cho mỗi loài vi khuần đối với phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn để xác định nồng độ MIC và trải đĩa để xác định MBC. Kết quả sau sáu lần thực hiện đƣợc xử lý bằng Nonparametrics test với phƣơng pháp Mann-Whitney để xem xét và phân tích ý nghĩa thống kê sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn giữa húng quế lá nhỏ và húng quế lá lớn. Kết quả có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05, điều này có nghĩa là có sự khác biệt đáng kể về hoạt tính kháng khuẩn của hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn. 25
  37. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. HIỆU SUẤT CHIẾT TINH DẦU Kết quả hiệu suất chiết tinh dầu của hai loại lá húng quế đƣợc trình bày ở Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu từ húng quế lá nhỏ không chênh lệch nhiều so với lá lớn. Điều này cho thấy rằng bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc thì lƣợng tinh dầu có trong lá nhỏ (0,6ml) thu đƣợc xấp xỉ so với lá lớn (0,5ml). Từ kết quả cho thấy rằng sự khác biệt này không đáng kể có thể là do hai loại húng quế đều đƣợc trồng trên cùng một khu vực có khí hậu giống nhau, điều kiện chăm sóc giống nhau dẫn đến hàm lƣợng tinh dầu thu từ hai loại cây không khác biệt. Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu từ hai loại lá Húng quế Lƣợng tinh dầu Lƣợng mẫu (g) Hiệu suất (%) (ml) 100,91 0,5 0,495 Lá lớn 101,73 0,5 0,491 100,34 0,5 0,498 Trung bình 100,93 ± 0,69 0,5 ± 0,0 0,495 ± 0,004 119,33 0,6 0,502 Lá nhỏ 119,18 0,6 0,503 111,30 0,6 0,539 Trung bình 117,27 ± 4,59 0,6 ± 0,0 0,51 ± 0,021 3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 3.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn Kết quả đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu O.basilicum đƣợc trình bày ở Bảng 3.2. Kết quả cho thấy hai loại tinh dầu O.basilicum đều có khả năng ức chế trên các chủng vi khuẩn: E.coli, MRSA, MSSA, S.pyogenes, S.pneumoniae, riêng trên P.aeruginosa cho tác động ức chế rất yếu (7mm đối với cả hai loại). Trong đó, khả năng ức chế vi khuẩn của húng quế lá nhỏ gần nhƣ tƣơng đƣơng với húng quế lá lớn đối với chủng S.pyogenes, S.pneumoniae và P.aeruginosa. 26
  38. Húng quế lá nhỏ cho khả năng ức chế tốt nhất trên MRSA và đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn là lớn nhất trong tất cả các chủng 13mm; sau đó là S.pneumoniae với đƣờng kính vùng ức chế là 11mm. Tác động ức chế đối với hai chủng vi khuẩn trên đều ở mức trung bình. Tinh dầu húng quế cho tác dụng ức chế tốt sau hai chủng trên là E.coli, MSSA và S.pyogenes với đƣờng kính vùng ức chế lần lƣợt là 10mm, 9,5mm và 10mm. Mặc dù cả ba chủng vi khuẩn đều bị ức chế nhƣng tác động ức chế này khá yếu. Riêng đối với S.pyogenes và S.pneumoniae không có sự khác biệt về đƣờng kính vòng ức chế trên cả hai loại húng quế. Đối với húng quế lá lớn tác động ức chế cũng tốt nhất trên MRSA và S.pneumoniae với vùng ức chế cả hai vi khuẩn là 11mm, tƣơng tự nhƣ húng quế lá nhỏ và cho tác động ức chế ở mức trung bình. Tác động ức chế trên E.coli, MSSA, S.pyogenes cũng ở mức khá yếu với đƣờng kính vòng ức chế lần lƣợt là 8,5mm, 8,5mm và 10mm. So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn cho thấy húng quế lá nhỏ cho đƣờng kính vòng ức chế lớn hơn so với lá lớn đối với các chủng E.coli, MRSA, MSSA (giá trị p = 0,004 < 0,05), đối với các chủng còn lại không có sự khác biệt đáng kể giữa húng quế lá nhỏ và lá lớn. Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ (mm) EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu Lá nhỏ 10 ± 0,4 13 ± 1,8 9,5 ± 0,7 7 ± 0,0 10 ± 0,0 11 ± 0,0 Lá lớn 8.5 ± 0,4 11 ± 0,4 8,5 ± 0,0 7 ± 0,0 10 ± 0,0 11 ± 0,0 EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae (p<0,05) 27
  39. Hình 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế MRSA của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn (LN: lá nhỏ, LL: Lá lớn) Hình 3.2. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế S.pyogenes của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn (1: lá lớn, 2: lá nhỏ) 3.2.2. Xác định MIC và MBC 3.2.2.1. Xác định nồng độ MIC Kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trình bày trong Bảng 3.3, 3.4, 3.5. Kết quả cho thấy cả hai loại tinh dầu đều có khả năng ức chế vi khuẩn tốt ngay cả ở nồng độ thấp. Nồng độ MIC càng thấp điều đó chứng tỏ vi khuẩn càng nhạy cảm với loại tinh dầu đang thử nghiệm. So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các 28
  40. chủng vi khuẩn cho thấy húng quế lá nhỏ có hoạt tính kìm khuẩn mạnh hơn so với lá lớn đối với các chủng E.coli (p=0,009), S.pyogenes, S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05), đối với các chủng còn lại không có sự khác biệt giữa húng quế lá nhỏ và lá lớn. Đối với lá nhỏ, nồng độ MIC đạt giá trị thấp trên các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae là 2,5l/ml. Trên chủng MRSA và MSSA nồng độ MIC cũng khá thấp nhƣng độ nhạy cảm yếu hơn so với ba chủng trên với các giá trị lần lƣợt là 5l/ml và 10l/ml. Đối với lá lớn, tƣơng tự nhƣ lá nhỏ cả ba chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae đều cho hoạt tính ức chế cao nhất so với các chủng còn lại, tuy nhiên nồng độ MIC cao hơn so với lá nhỏ với 5l/ml. Nồng độ MIC không khác biệt giữa hai chủng vi khuẩn MRSA và MSSA, ngoài ra MRSA nhạy cảm yếu hơn so với lá nhỏ (10l/ml). Đối với MSSA thì giá trị MIC không khác nhau giữa hai loại tinh dầu. Riêng P.aeruginosa chỉ bị ức chế khi nồng độ MIC đạt giá trị cao nhất trên cả hai loại tinh dầu với 80l/ml. Kết quả MIC cho thấy sự tƣơng đồng với kết quả xác định đƣờng kính vùng ức chế. Tóm lại, tác động ức chế sự tăng trƣởng vi khuẩn của hai loại tinh dầu lá lớn và lá nhỏ có sự khác biệt đáng kể trên các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae. Cụ thể tinh dầu húng quế lá nhỏ có tác động ức chế vi khuẩn tốt hơn lá lớn. Tinh dầu húng quế cũng có tác động ức chế mạnh nhất trên các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae; trung bình trên MRSA, MSSA và yếu nhất trên P.aeruginosa. 29
  41. Hình 3.3. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá nhỏ Nồng độ (l/ml) 80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 Vi khuẩn EC (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) MR (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) MS (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) PSEU (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) PNEU (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) PYO (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) Kí hiệu: (-)Không mọc (+)Mọc EC: Escherichia coli PSEU: Pseudomonas aeruginosa MSSA: Staphylococcusaureus nhạy cảm với methicillin PYO: Streptococcus pyogenes MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin PNEU: Streptococcus pneumoniae 30
  42. Hình 3.4. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá lớn Nồng độ (l/ml) 80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 Vi khuẩn EC (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) MR (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) MS (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) PSEU (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) PNEU (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) PYO (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) Kí hiệu: (-) Không mọc (+) Mọc EC: Escherichia coli PSEU: Pseudomonas aeruginosa MSSA: Staphylococcusaureus nhạy cảm với methicillin PYO: Streptococcus pyogenes MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin PNEU: Streptococcus pneumoniae 31
  43. Hình 3.5. Tổng hợp kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ Nồng độ tinh dầu EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu (l/ml) Lá nhỏ 2,5 5 10 80 2,5 2,5 Lá lớn 5 10 10 80 5 5 EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae (p<0,05) 3.2.2.2. Xác định nồng độ MBC Kết quả MBC cùa hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trình bày trong Bảng 3.6. Từ kết quả MBC, ghi nhận đƣợc cả hai loại tinh dầu đều cho tác động kháng khuẩn mạnh nhất đối với S.pyogenes (với giá trị MIC bằng MBC). Tác động kháng khuẩn của lá nhỏ tốt hơn lá lớn trên chủng S.pyogenes với giá trị MBC là 2,5l/ml trên lá nhỏ và 5l/ml trên lá lớn. Tinh dầu húng quế cho tác động diệt khuẩn tốt thứ hai sau chủng vi khuẩn trên là S.pneumoniae ở nồng độ MBC là 5l/ml với lá nhỏ và tác động của tinh dầu lá lớn yếu hơn với giá trị MBC là 10l/ml. Đối với chủng E.coli dù nhạy cảm đối với hai loại tinh dầu nhƣng tinh dầu húng quế chỉ cho hoạt tính diệt khuẩn khi ở nồng độ 10l/ml và hoạt tính này không có sự khác biệt giữa hai loại tinh dầu. Cả hai loại húng quế chỉ cho tác động diệt khuẩn trên MSSA khi ở nồng độ 20l/ml. Riêng đối với P.aeruginosa, tinh dầu chỉ có tác động ức chế cũng nhƣ diệt khuẩn ở nồng độ cao. So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn cho thấy không có sự khác biệt về hoạt tính diệt khuẩn đối với tất cả chủng vi khuẩn ngoại trừ hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05). Tóm lại, tinh 32
  44. dầu húng quế đều có tác động diệt khuẩn tốt trên hầu hết các chủng vi khuẩn thử nghiệm cho giá trị MBC ≤ 4MIC [19], và tác động kháng khuẩn yếu trên P.aeruginosa với nồng độ cao 80l/ml. Hình 3.6. Kết quả MBC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ Nồng độ tinh dầu EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu (l/ml) Lá nhỏ 10 20 20 80 2,5 5 Lá lớn 10 20 20 80 5 10 EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae (p<0,05) 3.3. BÀN LUẬN 3.3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu Theo nhƣ nghiên cứu của Heyland và cs. (2006) [21], Dachler và cs. (1999) [15], và Marquard và cs. (2002) [31], hàm lƣợng tinh dầu húng quế phụ thuộc trên nhiều yếu tố nhƣ kiểu gen và giống cây trồng, thời tiết, khí hậu, ngày gieo và thời gian thu hoạch. Nghiên cứu của Heyland và cs. cũng báo cáo về sự đa dạng trong hiệu suất chiết tinh dầu húng quế nằm trong khoảng 0,04% đến 0,7%, trong khi nghiên cứu của Dachler và cs. giá trị này từ 0,5% đến 1,5%. Trong nghiên cứu của đề tài, thì hiệu suất chiết của húng quế lá nhỏ và lá lớn lần lƣợt là 0,51% và 0,49%; kết quả này nằm trong khoảng hiệu suất chiết nhƣ các nghiên cứu trên đã nêu ra. Theo nghiên cứu của Eleni và cs. (2011) [44] cũng thực hiện khảo sát trên một loại húng quế lá lớn và lá nhỏ, nhìn chung, hiệu suất chiết của hai loại tinh dầu không có khác biệt đáng kể (húng quế lá lớn 1,67%; húng quế lá nhỏ 1,66%). Hiệu suất chiết tinh dầu húng quế (còn gọi là năng suất khai thác tinh dầu) đƣợc đánh giá quan trọng trên thị trƣờng quốc tế bởi một sản phẩm đƣợc chấp nhận về mặt thƣơng mại khi năng suất tinh dầu của nó cao hơn 0,4% [21], [31]. 33
  45. 3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu O.basilicum có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn nhƣng khả năng kháng khuẩn là khác nhau đối với mỗi chủng. Tinh dầu húng quế cho hoạt tính kháng khuẩn tốt trên nhiều chủng vi sinh vật khác nhau [33]. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu O.basilicum trên các chủng vi khuẩn Gram (+) tốt hơn so với Gram (-). Ở một số nghiên cứu khác, Silveiravà cs. (2012) [42], trên một số chủng vi khuẩn nhƣ trong đề tài cho thấy khả năng kháng của O.basilicum tốt hơn trên Gram (-). Trong đề tài của chúng tôi, nồng độ MIC của E.coli và MSSA lần lƣợt là 2,5l/ml và 5l/ml (trên lá nhỏ) cao gấp đôi so với kết quả MIC của Silveira là 1,25l/ml và 2,5l/ml; ngoài ra nồng độ MIC của MSSA cũng cao hơn so với E.coli. Khi so sánh kết quả của đề tài với nghiên cứu Mehdizadeh và cs. (2016) [32] trên hai chủng này thì lại cho kết quả ngƣợc lại; giá trị MIC của MSSA (0,62l/ml) thấp hơn so với E.coli (10l/ml). Nhƣng đối với P.aeruginosa thì kết quả của đề tài cho khả năng ức chế rất yếu so với kết quả từ nghiên cứu của Silveira không cho hoạt tính ức chế vi khuẩn. Kết quả từ đề tài chúng tôi cho thấy khả năng ức chế khá tốt trên các chủng vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae với kết quả MIC lần lƣợt là 2,5l/ml và 5l/ml (trên lá nhỏ). Qua kết quả nghiên cứu của đề tài, khi so sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn cho thấy húng quế lá nhỏ có hoạt tính kìm khuẩn mạnh hơn so với lá lớn đối với các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05), đối với các chủng còn lại không có sự khác biệt giữa húng quế lá nhỏ và lá lớn. Khi so sánh hoạt tính diệt khuẩn của hai loại húng quế trên tất cả chủng vi khuẩn thì không có sự khác biệt đáng kể giữa hai loại húng quế, ngoại trừ hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae % (giá trị p = 0,03 < 0,05) có sự khác biệt đáng kể. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài và khi so sánh với các nghiên cứu khác cho thấy sự khác biệt của hàm lƣợng các hợp chất trong dƣợc liệu và phƣơng pháp chiết xuất 34
  46. có thể ảnh hƣởng đến hoạt động kháng khuẩn. Đầu tiên, trong quá trình chiết xuất, thời gian và nhiệt độ không ổn định có thể làm bay hơi tinh dầu và các hợp chất chứa trong tinh dầu húng quế cho hoạt tính kháng khuẩn. Thứ hai, trong tinh dầu húng quế có chứa khá nhiều hợp chất bay hơi, điều này ảnh hƣởng đến khả năng khuếch tán của tinh dầu trên mặt thạch dẫn đến việc ức chế vi khuẩn của tinh dầu khi thực hiện phƣơng pháp khuếch tán trên thạch cho đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn nhỏ. Ngoài ra khi thực hiện khảo sát tác động diệt khuẩn, các chủng vi khuẩn đều cho giá trị MBC bằng hoặc gấp hai lần so với giá trị MIC, riêng đối với chủng E.coli chuẩn, do đặc tính của chủng là kháng betalactam dẫn đến tinh dầu húng quế chỉ cho tác dụng diệt khuẩn với giá trị MBC (10l/ml) cao gấp 4 lần so với MIC (2,5l/ml) [19]. 35
  47. CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt đƣợc mục tiêu đề ra với những kết quả sau: Xác định đƣợc nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu của hai loại tinh dầu: Tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn đều có hoạt tính kháng khuẩn. Cả hai loại húng quế đều cho tác động ức chế và diệt khuẩn mạnh nhất trên hai loài thuộc chi Streptococcus, là nguyên nhân phổ biến gây bệnh đƣờng hô hấp với giá trị MBC bằng với giá trị MIC lần lƣợt là 2,5l/ml (lá nhỏ) và 5l/ml (lá lớn) đối với S.pyogenes; 5l/ml (lá nhỏ) và 10l/ml (lá lớn) đối với S.pneumoniae. Trên các chủng E.coli, MRSA và MSSA, cả hai loại húng quế cho hoạt tính diệt khuẩn thấp hơn so với hai chủng trên. Cả hai loại húng quế đều cho khả năng kháng khuẩn rất yếu đối với P.aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn có sự khác biệt đáng kể trên hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05), tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể trên các chủng còn lại. 36
  48. 4.2. ĐỀ NGHỊ Do thời gian có hạn, đề tài chỉ thực hiện một số mục tiêu và đạt đƣợc kết quả nhƣ trên. Trong thời gian sắp tới, chúng tôi đề nghị tiến hành thêm những nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, cũng nhƣ hoạt chất có tác động kháng khuẩn – kháng nấm của tinh dầu húng quế. 2. Thử nghiệm tính kháng khuẩn của cao toàn phần và cao phân đoạn từ húng quế trên các chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác và các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ ngƣời bệnh. 3. Nghiên cứu thêm các hoạt tính sinh học nhƣ hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng nấm của tinh dầu húng quế cũng nhƣ các loài trong chi Ocimum. 37
  49. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Ánh H T, (2009), Nghiên cứu bước đầu khả năng kháng khuẩn của các loại tinh dầu li trích từ cây Húng quế (Ocimum basilicum L) và cây Húng cây (Mentha arvensis L)- ĐH Nông Lâm TP.HCM, pp. 2. Liêu Thùy Linh, Ngô Nguyễn Nhật Hà, Phan Thị Kim Liên, Hà T T M, et al, (2017), "Khảo sát ảnh hƣởng của tinh dầu quế, sả chanh, húng quế, bạc hà và tác dụng kết hợp của chúng tới Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger", Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường ĐH Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh (1982-2017), pp. 127-134. 3. Đỗ Tất Lợi, (2011), Các cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, pp. 4. Thịnh B N, Phạm Anh Tuấn P T H G, Nguyễn Hồng Trƣờng, (2013), "Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa Hồi sức tích cực và chống độc", pp. 5. Trần Lê Anh Thùy, Trƣơng Thị Đẹp, (2011), "Đặc điểm hình thái và giải phẫu các loài của chi Ocimum họ Bạc hà (Lamiaceae) ở Việt Nam", Y Học TP Hồ Chí Minh, 15 (1), pp. 378-385. Tài liệu tiếng Anh 6. Abbasi J, (2016), "Infectious disease expert sees threat from colistin-resistant superbug", Jama, 316 (8), pp. 806-807. 7. Athanassa Z, Siempos I, Falagas M, (2008), "Impact of methicillin resistance on mortality in Staphylococcus aureus VAP: a systematic review", European Respiratory Journal, 31 (3), pp. 625-632. 8. Badarinath A, Rao K M, Chetty C M S, Ramkanth S, et al, (2010), "A review on in-vitro antioxidant methods: comparisions, correlations and considerations", International Journal of PharmTech Research, 2 (2), pp. 1276-1285.
  50. 9. Balekar N, Katkam N G, Nakpheng T, Jehtae K, et al, (2012), "Evaluation of the wound healing potential of Wedelia trilobata (L.) leaves", Journal of Ethnopharmacology, 141 (3), pp. 817-824. 10. Balekar N, Nakpheng T, Srichana T, (2014), "Wedelia trilobata L.: A phytochemical and pharmacological review", Chiang Mai Journal of Science, 41 (3), pp. 590-605. 11. Bell S, Smith D, (1976), "Quantitative throat-swab culture in the diagnosis of streptococcal pharyngitis in children", The Lancet, 308 (7976), pp. 61-63. 12. Bozin B, Mimica-Dukic N, Simin N, Anackov G, (2006), "Characterization of the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the entire oils", Journal of agricultural and food chemistry, 54 (5), pp. 1822-1828. 13. Celiktas O Y, Kocabas E H, Bedir E, Sukan F V, et al, (2007), "Antimicrobial activities of methanol extracts and essential oils of Rosmarinus officinalis, depending on location and seasonal variations", Food Chemistry, 100 (2), pp. 553-559. 14. Cowan M M, (1999), "Plant products as antimicrobial agents", Clinical microbiology reviews, 12 (4), pp. 564-582. 15. Dachler M, Pelzman H, (1999), "Arznei-und Gewürzpflanzen: Anbau–Ernte– Aufbereitung", Österreichischer agrarverlag, klosterneuburg, pp. 141-143. 16. Elisha I L, Jambalang A R, Botha F S, Buys E M, et al, (2017), "Potency and selectivity indices of acetone leaf extracts of nine selected South African trees against six opportunistic Enterobacteriaceae isolates from commercial chicken eggs", BMC complementary and alternative medicine, 17 (1), pp. 90. 17. Epidemiology C f D C B o, Division C f D C Q, Division C f P S Q, (1991), Health information for international travel, US Department of Health, Education, and Welfare, Public Health Service, Center for Disease Control, Bureau of Epidemiology, pp.
  51. 18. File T M. Introduction to Respiratory Tract InfectionsNetter’s Infectious Diseases. Elsevier, pp. 126 19. Gatsing D, Tchakoute V, Ngamga D, Kuiate J-R, et al, (2015), "In vitro antibacterial activity of Crinum purpurascens Herb. leaf extract against the Salmonella species causing typhoid fever and its toxicological evaluation", Iranian Journal of Medical Sciences, 34 (2), pp. 126-136. 20. Gülçin İ, Elmastaş M, Aboul‐ Enein H Y, (2007), "Determination of antioxidant and radical scavenging activity of Basil (Ocimum basilicum L. Family Lamiaceae) assayed by different methodologies", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 21 (4), pp. 354-361. 21. Heyland K-U, Hanus H, (2006), Ölfrüchte, Faserpflanzen, Arzneipflanzen und Sonderkulturen, Handbuch des Pflanzenbaus Band 4, Stuttgart, Eugen Ulmer KG, ISBN 978-3-8001-3203-4, pp. 346-349. 22. Hidron A I, Edwards J R, Patel J, Horan T C, et al, (2008), "Antimicrobial- resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006–2007", Infection Control & Hospital Epidemiology, 29 (11), pp. 996-1011. 23. Hiremath S, Kolume D, Muddapur U, (2011), "ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ARTEMISIA VULGARIS LINN.(DAMANAKA)", International Journal of Research in Ayurveda & Pharmacy, 2 (6), pp. 24. Hugbo P, Olurinola P, (1992), "Resistance of pseudomonas aeruginosa to antimicrobial agents: implications in medicine and pharmacy", Nig J Pharm Sci, 4 pp. 1-10. 25. Jain N, Lodha R, Kabra S, (2001), "Upper respiratory tract infections", The Indian Journal of Pediatrics, 68 (12), pp. 1135-1138. 26. Kaufmann B, Christen P, (2002), "Recent extraction techniques for natural products: microwave‐ assisted extraction and pressurised solvent extraction",
  52. Phytochemical Analysis: An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques, 13 (2), pp. 105-113. 27. Kim S J, (2000), "Bacteriologic characteristics and serotypings of Streptococcus pyogenes isolated from throats of school children", Yonsei Med J, 41 (1), pp. 56-60. 28. Klevens R M, Morrison M A, Nadle J, Petit S, et al, (2007), "Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States", Jama, 298 (15), pp. 1763-1771. 29. Kollef M H, Shorr A, Tabak Y P, Gupta V, et al, (2005), "Epidemiology and outcomes of health-care–associated pneumonia: results from a large US database of culture-positive pneumonia", Chest, 128 (6), pp. 3854-3862. 30. Leber A L, (2016), Clinical microbiology procedures handbook, ASM Press Washington, DC, USA:, pp. 31. Marquard R A, Kroth E, Bingel S, Cergel S, et al, (2002), nb u und u lit ts nforderungen usgew hlter rzneipfl nzen II, Buchedition Agrimedia GmbH, pp. 26-33. 32. Mehdizadeh T, Hashemzadeh M, Nazarizadeh A, Neyriz-Naghadehi M, et al, (2016), "Chemical composition and antibacterial properties of Ocimum basilicum, Salvia officinalis and Trachyspermum ammi essential oils alone and in combination with nisin", Research Journal of Pharmacognosy, 3 (4), pp. 51- 58. 33. Moghaddam A M D, Shayegh J, Mikaili P, Sharaf J D, (2011), "Antimicrobial activity of essential oil extract of Ocimum basilicum L. leaves on a variety of pathogenic bacteria", Journal of Medicinal Plants Research, 5 (15), pp. 3453- 3456. 34. O’Brien K, Nohynek H, (2003), "World Health Organization Pneumococcal Vaccine Trials Carriage Working G. Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus Pneumoniae", Pediatr Infect Dis J, 22 (2), pp. e1-11.
  53. 35. Pankaj R, Sunil S, Milind P, (2010), "Anti-inflammatory potential of the seeds of Ocimum basilicum Linn. in rats", Asian Journal of Bio Science, 5 (1), pp. 16- 18. 36. Patil D D, Mhaske D K, Wadhawa G C, (2011), "Antibacterial and Antioxidant study of Ocimum basilicum Labiatae (sweet basil)", Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 2 pp. 104-112. 37. Rao V P, Pandey D. Extraction of essential oil and its applications, 2007. 38. Rubin R J, Harrington C A, Poon A, Dietrich K, et al, (1999), "The economic impact of Staphylococcus aureus infection in New York City hospitals", Emerging infectious diseases, 5 (1), pp. 9. 39. Sajjadi S E, (2006), "Analysis of the essential oils of two cultivated basil (Ocimum basilicum L.) from Iran", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 14 (3), pp. 128-130. 40. Selvakkumar C, Gayathri B, Vinaykumar K S, Lakshmi B S, et al, (2007), "Potential anti-inflammatory properties of crude alcoholic extract of Ocimum basilicum L. in human peripheral blood mononuclear cells", Journal of health science, 53 (4), pp. 500-505. 41. Shet A, Kaplan E, (2004), "Addressing the burden of group A streptococcal disease in India", The Indian Journal of Pediatrics, 71 (1), pp. 41-48. 42. Silveira S, Anildo I, Jr A, Gerson I, et al, (2012), "Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from selected herbs cultivated in the South of Brazil against food spoilage and foodborne pathogens", Ciência Rural, 42 (7), pp. 1300-1306. 43. Singh S, Singh M, Singh A K, Kalra A, et al, (2010), "Enhancing productivity of Indian basil (Ocimum basilicum L.) through harvest management under rainfed conditions of subtropical north Indian plains", Industrial crops and products, 32 (3), pp. 601-606.
  54. 44. Wogiatzi E, Papachatzis A, Kalorizou H, Chouliara A, et al, (2011), "Evaluation of essential oil yield and chemical components of selected basil cultivars", Biotechnology & Biotechnological Equipment, 25 (3), pp. 2525-2527. 45. CLSI, (2009), Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Eighth Edition, pp. 46. Menon T, Umamaheswari K, Kumarasamy N, Solomon S, et al, (2001), "Efficacy of fluconazole and itraconazole in the treatment of oral candidiasis in HIV patients", Acta tropica, 80 (2), pp. 151-154. 47. Muanza D, Kim B, Euler K, Williams L, (1994), "Antibacterial and antifungal activities of nine medicinal plants from Zaire", International Journal of Pharmacognosy, 32 (4), pp. 337-345. 48. Organization W H, (2017), "Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics", Geneva: World Health Organization, pp. Tài liệu Internet 49. Trƣơng Thị Đẹp (2011), Ocimum basilicum L, truy cập ngày 30/8/2018.
  55. PHỤ LỤC 1: BẢNG KẾT QUẢ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ Lần thực Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo hiện 1 9,5 9,5 11,5 6 9 11 2 10 10,5 14 6 9 11 3 9,5 9,5 14 6 9 11 Lá nhỏ 4 10 10,5 11,5 6 9 11 5 10 9,5 11,5 6 9 11 6 9,5 10,5 14 6 9 11 1 8 8,5 11 6 9 11 2 8,5 9 11 6 9 11 3 8,5 8,5 11 6 9 11 Lá lớn 4 8,5 8,5 11 6 9 11 5 8 9 11 6 9 11 6 8,5 9 11 6 9 11 PL-1
  56. PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC Lần thực Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo hiện 1 5 5 10 80 2,5 2,5 2 2,5 5 10 80 2,5 2,5 3 2,5 5 10 80 2,5 2,5 Lá nhỏ 4 2,5 5 10 80 2,5 2,5 5 2,5 5 10 80 2,5 2,5 6 5 5 10 80 2,5 2,5 1 5 5 10 80 5 5 2 10 10 10 80 5 5 3 10 10 10 80 5 5 Lá lớn 4 10 10 10 80 5 5 5 5 5 10 80 5 5 6 10 10 10 80 5 5 PL-2
  57. PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC Lần thực Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo hiện 1 10 20 20 80 2,5 5 2 10 20 20 80 2.5 2,5 3 10 20 20 80 2,5 5 Lá nhỏ 4 10 20 20 80 5 5 5 10 20 20 80 2,5 5 6 10 20 20 80 2,5 5 1 10 20 20 80 5 10 2 10 20 20 80 5 10 3 10 20 20 80 10 10 Lá lớn 4 10 20 20 80 5 5 5 10 20 20 80 5 10 6 10 20 20 80 5 10 PL-3
  58. PHỤ LỤC 4: ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT A B C PL-4
  59. D E F A: E.coli B: MRSA C: MSSA D : P.aeruginosa E: S.pyogenes F: S.pneumoniae 1: Lá lớn; LL: Lá lớn 2: Lá nhỏ; LN: Lá nhỏ PL-4
  60. PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ MIC A B A: Lá lớn B: Lá nhỏ E: Ecoli; R: MRSA; S: MSSA; P: P.aeruginosa PL-5
  61. A B A: Lá lớn B: Lá nhỏ Y: S.pyogenes N: S.pneumoniae PL-5