›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dichloromethan loài Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.)

pdf 53 trang thiennha21 18/04/2022 3990
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dichloromethan loài Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_dichlorome.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dichloromethan loài Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI H ỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– Lê Võ Huyền Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN DICHLOROMETHAN LOÀI CÓC KÈN LEO (Derris scandens (Roxb.) Benth.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC –––––––––––––––––––––– Lê Võ Huy ền Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN DICHLOROMETHAN LOÀI CÓC KÈN LEO (Derris scandens (Roxb.) Benth.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠ I HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN TÀI ThS. NGUYỄN THÚC THU HƯƠNG Hà Nội – 2021
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận được thực hiện tại Khoa Hóa Thực vật I – Viện Dược liệu Trung Ương; số 3B, Quang Trung, phường Tràng Tiền, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội; tháng 7 năm 2020 – tháng 6 năm 2021. Với sự trân trọng và sự biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo trường Đại học Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; các anh chị khoa Hóa Thực vật I, viện Dược liệu Trung Ương, đã chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Đặc biệt, em xin trân trọng cảm ơn: TS. Nguyễn Văn Tài – Trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu đã tin tưởng giao đề tài và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình viết khóa luận. CN. Phùng Như Hoa – Nghiên cứu viên, khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu đã quan tâm, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua. Em cũng xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương – Giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kỹ năng, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực tập. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, các anh chị, bạn bè, các em sinh viên tại khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ để em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2021 Sinh viên Lê Võ Huyền Anh
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT Ký hiệu Ý nghĩa 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ) 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Hydro - Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ) CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Dichloromethan d Doublet dd Doublet of doublet DEPT Ditortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (Electronspray Ionization Mas Spectrum ) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPLC điều chế Sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao (Preparative High Performance Liquid Chromatography) IC50 Nồng độ ức chế 50% (50% inhibitory concentration) IR Tia hồng ngoại (Infrared) MeOH Methanol n-BuOH n-Butanol ppm 10-6 (Parts per million) s Singlet t Triplet TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Tia tử ngoại (Ultra violet)
  5. DANH MỤC HÌNH ẢNH, HÌNH VẼ Hình ảnh, hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1 Cấu trúc Rotenone dùng làm thuốc trừ sâu 4 Hình 2 Các bộ phận của cây Cóc kèn leo 6 Một số sản phẩm hỗ trợ điều trị đau xương khớp Hình 3 10 từ Cóc kèn leo Cấu trúc một số isoflavonoid và coumarin được Hình 4 11 phân lập từ loài Cóc kèn leo Cấu trúc hóa học các isoflavon glycosid từ loài Hình 5 12 Cóc kèn leo Cấu trúc hóa học các isoflavonoid từ loài Cóc Hình 6 13 kèn leo Sắc ký đồ HPLC của 3 hợp chất phân lập được từ Hình 7 cao chiết DCM Cóc kèn leo 24 Sắc ký lớp mỏng đối chứng giữa hợp chất 1 và Hình 8 25 β-sitosterol Hình 9 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 27 Sắc ký đồ TLC của hợp chất 3 (1) và Daucosterol Hình 10 đối chiếu (2) ở các hệ dung môi khai triển khác 28 nhau
  6. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Tên bảng biểu Trang So sánh dữ liệu phổ của hợp chất 2 và phổ của Bảng 1 30 Lupalbigenin DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Tên sơ đồ Trang Tóm tắt quy trình chiết các phân đoạn từ dược liệu Sơ đồ 1 20 cây Cóc kèn leo Quy trình phân lập 3 hợp chất tinh khiết từ phân Sơ đồ 2 đoạn DCM 22 Tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân Sơ đồ 3 đoạn DCM 23
  7. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về chi Derris 3 1.1.1 Vị trí phân loại chi Derris 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Derris 3 1.1.3 Thành phần hóa học trong chi Derris 4 1.1.4 Công dụng theo y học cổ truyền của một số loài thuộc chi Derris 4 1.2 Tổng quan về loài Cóc kèn leo (Derris scandens) 5 1.2.1 Đặc điểm thực vật của Cóc kèn leo 5 1.2.2 Tác dụng dược lý của Cóc kèn leo 6 1.2.3 Thành phần hóa học của Cóc kèn leo 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 15 2.2 Nội dung thực hiện 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 16 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất 18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 19 3.1.1. Điều chế các phần chiết từ cây Cóc kèn leo 19 3.1.2 Phân lập các chất trong phần chiết dichloromethan của cây Cóc kèn leo 20 3.2 Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 25 3.2.1 Hợp chất 1 25
  8. 3.2.2 Hợp chất 2 25 3.2.3 Hợp chất 3 28 3.3 Bàn luận 28 3.3.1 β-Sitosterol 29 3.3.2 Daucosterol 29 3.3.3 Lupalbigenin 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
  9. MỞ ĐẦU Bệnh lý về xương khớp là nhóm bệnh lý phổ biến ở Việt Nam và các quốc gia khác trên thế giới. Trong đó viêm khớp đang ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh và xuất hiện ở cả những người trẻ tuổi. Đây là một bệnh lý thường gặp, gây nhiều khó khăn trong sinh hoạt và lao động, là gánh nặng cho gia đình và toàn xã hội. Theo WHO, viêm khớp là một trong mười bệnh khó kiểm soát nhất ở các nước phát triển. Y học hiện đại đưa ra nhiều nguyên nhân như béo phì, chấn thương, lười vận động, thói quen sinh hoạt sai, tuổi tác, Một cách trực tiếp hoặc gián tiếp, những nguyên nhân này tác động đến dịch khớp, mật độ xương. Nó khiến cho khớp bị suy yếu và gây bệnh. Ước tính trên toàn thế giới, 9,6% nam giới và 18,0% phụ nữ trên 60 tuổi có triệu chứng bị viêm xương khớp. Tuy nhiên, căn bệnh này ngày càng được trẻ hóa. 80% những người bị viêm xương khớp sẽ có những hạn chế trong vận động và 25% không thể thực hiện các hoạt động chính hàng ngày của họ trong cuộc sống. Tại Việt Nam theo thống kê, bệnh xương khớp nói chung và bệnh viêm khớp nói riêng luôn là bệnh được đánh giá có số người mắc cao nhất. Năm 2017, có tới trên 35% dân số mắc các vấn đề về xương khớp. Trong đó, thoái hóa khớp gối, thoái hóa đốt sống (20%), viêm khớp dạng thấp (2-5%), và còn lại là bệnh gút, lupus, đau xơ cơ và viêm khớp nhiễm trùng, các bệnh thấp khớp, viêm đa khớp Đối với việc điều trị bệnh viêm khớp thì ngoại trừ viêm khớp do nhiễm khuẩn, phần lớn các bệnh viêm khớp đều được coi là các bệnh mạn tính. Vì vậy, điều trị dứt điểm bệnh viêm khớp gần như là rất khó khăn. Một trong số những phương pháp điều trị được áp dụng là sử dụng thảo dược với tác dụng phòng ngừa, điều trị bệnh viêm khớp. Liệu pháp này đang rất được quan tâm bởi hiệu quả điều trị và an toàn. Theo kết quả khảo sát của các Sở Y tế từ 65 tỉnh của Thái Lan, Cóc kèn leo là một trong 10 vị thuốc được sử dụng phổ biến nhất trong y học cổ truyền để điều trị đau xương khớp [12]. Không chỉ vậy, tác dụng này còn được chứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng so sánh với một số thuốc được sử dụng trong điều trị như diclofenac, 1
  10. naproxen hay ibuprofen. Kết quả chỉ ra Cóc kèn keo cho tác dụng tương tự với các thuốc được dùng để so sánh. Kế thừa các kết quả nghiên cứu đã có kết hợp cùng với nhu cầu của thị trường, Thái Lan đã đưa ra rất nhiều các sản phẩm hỗ trợ điều trị đau xương khớp. Tuy nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học trong cây Cóc kèn leo còn rất hạn chế ở nước ta và trên thế giới. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dichloromethan loài Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.)” với mục tiêu phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học trong phân đoạn dichloromethan. 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Derris 1.1.1 Vị trí phân loại chi Derris Dựa trên hệ thống phân loại của Wildlife Information Liaison Development (WILD) Society (Hiệp hội Phát triển thông tin Động vật hoang dã), chi Derris thuộc [35]: Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp (Subclass): Hoa hồng (Rosidae) Bộ (Order): Đậu (Fabales) Họ (Family): Đậu (Fabaceae) Chi (Genus): Derris 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Derris Trên thế giới, chi Derris (họ Fabaceae) bao gồm khoảng 50 loài, trong đó có 16 loài có thể được tìm thấy ở Thái Lan. Chi Derris phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á. Hình dạng, kích thước, độ dày và đường viền lá là những yếu tố cơ bản để có thể nhận biết các loài thuộc chi Derris. Sắc tố lá non nhiều loài có màu hơi đỏ hoặc hơi nâu. Những sắc tố này dường như không liên quan đến cường độ ánh sáng mặt trời mà cây nhận được. Có thể được tìm thấy ở một số loài như D.trifoliata, D.scandens và P.elliptica. Hoa của các loài Derris tương đối nhỏ (dưới 1,5cm) khi so sánh với các chi khác. Cánh hoa thường có màu trắng, hơi hồng hoặc hơi tía và có mùi thơm. Đài hoa thường có màu hơi đỏ, số ít có màu xanh lục. Các cánh không cong hoặc cuộn ngược 3
  12. về phía đài hoa, ngoại trừ ở loài D.reticulata và D.tonkinensis, các cánh cong rõ rệt. [37] 1.1.3 Thành phần hóa học trong chi Derris 1.1.3.1 Rotenoids Rotenone là một hợp chất tự nhiên có trong nhiều loài thuộc chi Derris. Chất này được sử dụng trên toàn thế giới như một loại thuốc trừ sâu phổ rộng. Trong thú y, rotenone được sử dụng để trị ve, rận trên chó, mèo, ngựa, gà và cá loại gia cầm khác. Rotenone đã được chứng minh là độc hại đối với người, động vật và cá. [29,30] Hình 1: Cấu trúc Rotenone dùng làm thuốc trừ sâu 1.1.3.2 Isoflavones Một số loài của chi Derris được nghiên cứu có hệ thống có chứa nhiều hợp chất isoflavones như scandenon, scandinon, osajin, chandalone có trong D.scandens; các hợp chất robuston, derrubon, 5-hydroxy-7-methoxyisoflavon, robuston methyl ether, derruston, có trong D.robusta, [15] 1.1.3.3 3-phenyl coumarins Một số hợp chất 3-phenyl coumarins được tìm thấy trong một số loài của chi Derris như scandenin, chandalin, lonchocarpenin có trong D.scandens; robustic acid, robustin, robustic acid methyl ether, robustin methyl ether có trong D.robusta. [15] 1.1.4 Công dụng theo y học cổ truyền của một số loài thuộc chi Derris 4
  13. Một số loài của chi Derris được nuôi trồng và sử dụng rễ, lá của chúng như một loại thuốc trừ sâu hoặc chất độc. Một số loài, ví dụ D.scandens (Roxb.) Benth., D.alborubra Hemsl., D.reticulata Craib. và D.thorelii (Gagnep.) Craib. được sử dụng làm thuốc địa phương ở Thái Lan và các nước Đông Nam Á khác. D.elliptica được sử dụng trong y học cổ truyền châu Á trong điều trị bệnh phong và ngứa, như một chất khử trùng và cũng được áp dụng cho áp xe. Nó cũng được sử dụng làm thuốc phá thai, rễ được dùng làm thuốc an thai và thân cây làm thuốc bổ máu ở Thái Lan. [1] Thân cây D.scandens khô được sử dụng trong y học cổ truyền Thái Lan như một loại thuốc long đờm, chống ho, lợi tiểu, chống kiết lỵ và điều trị đối với đau cơ xương khớp. [19] 1.2 Tổng quan về loài Cóc kèn leo (Derris scandens) Tên Việt Nam: Cóc kèn leo Tên khoa học: Derris scandens (Roxb.) Benth. Tên khác: Dalbergia scandens Roxb. [18] 1.2.1 Đặc điểm thực vật của Cóc kèn leo Cóc kèn leo thuộc họ Fabaceae, có tên khoa học là Derris scandens, một số tên khác như Dalbergia scandens (Roxb.), Derris timoriencis (DC), Dalbergia timorienses (DC) hay Millettia littoralis Dunn. Ở Thái Lan loài này được gọi là Jewel Vine hay Tao-WanPriang. Cây dây leo, lá kép, thường có 3-5 (ít khi 7) lá chét xoan dài 5-10cm, rộng 2-4cm, chóp nhọn, gốc tròn, không lông. Hoa mọc thành chùm đứng ở nách lá. Hoa trắng, ửng hồng, dài 12mm, đài hoa có màu trắng. Quả tròn 3-4cm, xám vàng, chứa 1 hạt màu vàng hung. Cóc kèn leo được phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á và Australia [28]. Ở Việt Nam, loài này được phân bố ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long. [3] 5
  14. Hình 2: Các bộ phận của cây Cóc kèn leo 1.2.2 Tác dụng dược lý của Cóc kèn leo Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.) thường được sử dụng trong y học cổ truyền Thái Lan như một loại thuốc long đờm, chống ho, lợi tiểu, chống kiết lỵ và điều trị đối với đau cơ xương khớp [19]. Việc nghiên cứu một cách khoa học và đầy đủ về hoạt tính sinh học của cây Cóc kèn leo đã và đang được các nhà khoa học quan tâm. Các nghiên cứu khác nhau đã cho thấy tiềm năng dược lý khác nhau của loài thực vật này trên cả hai mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo. Y học hiện đại đã chỉ ra một số tác dụng dược lý của D.scandens như: tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm; tác dụng chống oxy hóa; cải thiện tình trạng lão hóa và tổn thương da; tác dụng chống viêm, giảm đau cơ xương khớp; độc tính với một số tế bào ung thư [28]. Tuy nhiên, tác dụng được quan tâm là tác dụng trong điều trị bệnh cơ xương khớp: tác dụng chống viêm, giảm đau xương khớp. 1.2.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 6
  15. Năm 2015, H.Hussain và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của rễ và thân loài Cóc kèn leo. Kết quả tổng thể của nghiên cứu này cho kết luận các chất chiết xuất khác nhau của D.scandens có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống vi khuẩn đáng kể. Nghiên cứu sơ bộ cho thấy scandenin cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh và các đặc tính chống nấm và chống rong kinh thuyết phục. [17] 1.2.2.2 Tác dụng điều hòa miễn dịch Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Chuthaputti A và Chavalittamrong P. đánh giá tác dụng điều hòa miễn dịch của cao chiết ethanol 50% phần thân Cóc kèn leo trên chuột. Sau đó, nhóm nghiên cứu tiếp trục đánh giá độ an toàn trên chuột sau sáu tháng sử dụng cao chiết này. Kết quả chỉ ra rằng, cao chiết ethanol 50% phần thân D.scandens ở các liều được đưa ra không tạo ra bất kỳ độc tính nào ở chuột. [12,27] Thử nghiệm lâm sàng đánh giá độ an toàn của việc sử dụng Derris scandens được thực hiện ở 47 tình nguyện viên khỏe mạnh. Đồng thời có thể đánh giá sơ bộ tác dụng của nó đối với hệ thống miễn dịch. Kết quả cho thấy rằng chiết xuất ethanol D.scandens với liều 400mg/ngày cho những người tình nguyện bình thường trong hai tháng là an toàn và có thể tạo kích thích tiết ra các cytokin giúp điều hòa miễn dịch. [8] 1.2.2.3 Tác dụng hạ đường huyết Năm 2019, Md. Mahbubur và cộng sự nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng hạ đường huyết của chiết xuất từ lá Derris scandens và Thunbergia erecta ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ. Nghiên cứu này cho thấy rằng cả MEDS và METE đều có hiệu lực hạ đường huyết trên mô hình động vật. Do đó, lá của Derris scandens và Thunbergia erecta có thể có hiệu quả trong điều trị bệnh tiểu đường. [24] 1.2.2.4 Tác dụng chống oxy hóa Năm 2019, nhóm nghiên cứu của R.Nooin đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa, chống peroxy hóa và tính an toàn in vitro của dịch chiết cây Cóc kèn leo ở miền Nam Thái Lan. Kết luận được D.scandens được trồng ở miền Nam Thái 7
  16. Lan có đặc tính chống oxy hóa, gây độc cho tế bào Caco-2 và không độc cho tế bào bình thường. Cần thực hiện thêm các mô hình đánh giá an toàn bao gồm cả động vật và con người để tìm ra liều lượng an toàn của D.scandens. [25] 1.2.2.5 Tác dụng chống viêm Năm 2003, P. Laupattarakasem và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao chiết nước (chiết hồi lưu) và cao chiết ethanol 96% (chiết ngâm) phần thân loài D.scandens. Kết quả cao chiết nước liều 500 µg/ml cho tác dụng chống oxy hóa đáng kể (23%). Tác dụng chống oxy hóa của genistein và dẫn xuất isoprenyl tương đương với các chất chống oxy hóa tiêu chuẩn. Như vậy, tác dụng chống viêm của cao chiết nước có thể một phần là do isoflavonoid gây ra [21]. Không chỉ phần thân mà ngay cả phần lá và phần rễ D.scandens cũng đều thể hiện tác dụng chống viêm. Tổng phần trăm ức chế phù trong thời gian sáu giờ của cao chiết lá, cao chiết rễ D.scandens, ovaliflavanon, lupinifolin và indomethacin lần lượt là 47,02 ± 0,69, 35,79 ± 1,02, 24,42 ± 1,40, 11,95 ± 0,84, 38,99 ± 1,45. Cao chiết từ lá và rễ D.scandens thể hiện tác dụng tốt ở mức 400 mg/kg. Hai flavonoid là ovaliflavon và lupinifolin ở liều lựa chọn cho tác dụng ức chế thấp hơn. [14] 1.2.2.6 Tác dụng giảm đau cơ xương khớp Thái Lan với mục tiêu phát triển sản phẩm từ D.scandens, đã tiến hành một số thử nghiệm lâm sàng đánh giá tác dụng và độ an toàn của cao chiết ethanol 50% từ thân loài D.scandens trong điều trị đau xương khớp. Năm 2011, một thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả giảm đau, cải thiện chức năng và độ an toàn của cao chiết ethanol 50% từ thân loài D.scandens so sánh với naproxen trên 107 bệnh nhân viêm xương khớp gối (OA) qua 4 tuần. Kết quả cho thấy việc sử dụng D.scandens có hiệu quả và đảm bảo an toàn trong điều trị viêm khớp gối. [19] Năm 2016, một nghiên cứu lâm sàng khác so sánh hiệu quả và tác dụng phụ giữa cao chiết ethanol 50% từ thân loài D.scandens và diclofenac (NSAID) trong điều trị đau thắt lưng đã được thực hiện. Kết quả cho thấy ở cả hai nhóm đều thấp hơn đáng kể 8
  17. vào ngày thứ 3 và thứ 7; kết quả giảm đau không khác biệt đáng kể giữa hai nhóm điều trị. Nghiên cứu chỉ ra rằng lợi ích của việc điều trị trên bệnh nhân đau thắt lưng với cao chiết 50% ethanol của D.scandens với liều 600 mg/ngày và với diclofenac với liều 75 mg/ngày trong bảy ngày là tương đương. [36] Điều trị kết hợp là một phương pháp rất hiệu quả trong điều trị đau, trong đó việc giảm liều có thể làm giảm tác dụng phụ và vẫn đạt được hiệu quả giảm đau tối ưu. Hiệu quả của việc sử dụng kết hợp cao chiết ethanol 50% từ thân loài D.scandens và diclofenac đã được nghiên cứu trên mô hình chuột bị gây co thắt bụng bởi acid acetic ở các liều khác nhau. Kết quả chỉ ra, tác dụng của giảm đau của cao chiết ethanol 50% và diclofenac phụ thuộc vào liều. Khi sử dụng kết hợp cho thấy hiệu ứng cộng hợp với chỉ số tương tác là 0.89. Từ đó, gợi ý việc sử dụng kết hợp cao chiết ethanol 50% và diclofenac trong điều trị giảm đau. [33] Một thử nghiệm mù đôi, ngẫu nhiên, có kiểm soát được tiến hành tại Bệnh viện Loengnoktha Crown Prince ở tỉnh Yasothon, Thái Lan trên 178 bệnh nhân ngoại trú bị viêm khớp gối nguyên phát. Kết quả chỉ ra không có sự khác biệt về hiệu quả và an toàn trong điều trị viêm xương khớp gối giữa việc sử dụng cao D.scandens và ibuprofen trong điều trị viêm khớp gối qua bảy ngày liên tiếp. [6] Kế thừa các kết quả nghiên cứu đã có kết hợp cùng với nhu cầu của thị trường, Thái Lan đã đưa ra rất nhiều các sản phẩm hỗ trợ điều trị đau xương khớp: Thao Wan Priang Ouay Un Brand Herbs (100 viên x 200 mg) (1), Thao Wan Priang Herbs Khaolaor Brand (100 viên x 600 mg) (2), Thaowan Prieng Derris Scandens 108 mg (100 viên x 108 mg) (3), Thao Wan Priang Capsules (70 viên x 400 mg) (4), Derris scandens Benth. Capsule and Drinks (dạng viên nang và dịch uống) (5) 9
  18. Hình 3: Một số sản phẩm hỗ trợ điều trị đau xương khớp từ Cóc kèn leo 1.2.3 Thành phần hóa học của Cóc kèn leo Các nghiên cứu trước đó về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra một số nhóm chất là dẫn xuất của benzyl, coumarin, flavonoid bao gồm flavon, isoflavon, isoflavon glycosid cùng với steroid và terpen. [28] Tatipaka Hari Babu tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là toàn bộ cây. Từ cao chiết soxhlet n-Hexan, 10 isoflavonoid đã phân lập được là: 4'-O-methyl osajin (1), osajin (2), 4'-O-methyl scandinon (3), derrisisoflavon (4), 4', 5,7-trihydroxy isoflavon (5), scandenon (6), scandinon (7), 4,4'-di-O-methyl scandenin (8), derrisisoflavon D (9), 4'-O-methyl senegalensein (10), scandinon A (11) và scandenin B (12). [5] 1: R1= H, R2= CH3 2: R1= H, R2= H 3: R1= CH3, R2= CH3 7: R1= CH3, R2= H 4: R= CH3 5: R= H 10
  19. 8 6 9 11 10 12 Hình 4: Cấu trúc một số isoflavonoid và coumarin được phân lập từ loài Cóc kèn leo Năm 2002, Vatcharin Rukachaisirikul đã phân lập và xác định cấu trúc của 13 hợp chất từ phân đoạn n-BuOH của dịch chiết nước phần thân D.scandens [31]: Năm isoflavon glycosid sau khi phân lập và xác định cấu trúc đặt tên là derriscandenosides A, E (1, 5) derriscanoside A (6) và derriscanoside B (7) formononetin 7-O-β-glucopyranoside (8) 8-hydroxy-4’,7-dimethoxyisoflavon 8-O-β-glucopyranoside (9) 7- hydroxy-4’,8-dimethoxyisoflavon 7-O-β-glucopyranoside (10) diadzein 7-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-glucopyranoside (11) formononetin 7-O-[α-rhamnopyranosyl- (1→6)]-β-glucopyranoside (12) genistein 7-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-glucopyranoside (13) 11
  20. 8: R = H 10: R = OCH3 1: R = H 9: R = CH3 2: R1 = OH, R2 = R3 = H, R4 = OCH3 4: R = R = H, R = R = OCH 1 3 2 4 3 5: R1 = H, R2 = R4 = OCH3, R3 = OH 3 6: R1 = R2 = R3 = H, R4 = OCH3 7: R1 = R4 = OCH3, R2 = R3 = H 11: R1 = R2 = R3 = H, R4 = OH 12: R1 = R2 = R3 = H, R4 = OCH3 13: R1 = R2 = H, R3 = R4 = OH Hình 5: Cấu trúc hóa học các isoflavon glycosid từ loài Cóc kèn leo Năm 2004, nhóm nghiên cứu của W. Mahabusarakam cũng nghiên cứu thành phần hóa học phần thân D.scandens. Phần thân được chiết lần lượt với aceton và methanol để thu được cao tương ứng. Cao methanol được phân đoạn với EtOAc và nước. Phân đoạn EtOAc được chiết lại bằng dicloromethan cho phần tan và phần cắn không tan. Từ phần tan phân lập được 7 hợp chất là: scandion (1), scandenal (2), scanderon (3), flemichapparin B (4), lupalbigenin (5), flemichapparin C (6), isorobuston (7). Từ phần cắn phân lập được 9 hợp chất là: 5-hydroxy-2’’,2’’- dimethylchromeno [6,7: 5’’,6’’]-2’’’,2’’’ dimethylchromeno - [3’,4’:5’’’,6’’’]isoflavon (8), 12
  21. ulexon A (9), chandalon (10), maackiain (11), isochandalon (12), scandinon (13), derrisisoflavon A (14), santal (15), lupiwighteon (16) Hai hợp chất 3’-methylorobol (17) và genistein (18) được phân lập từ cao aceton. Như vậy, ngoài hợp chất flemichapparin C (coumarin) và scandion (dẫn xuất của benzyl), các hợp chất phân lập được đều là các isoflavonoid. [23] 1 2: R = CHO R1 R2 R3 10: R = prenyl (pre): 3 OH H pre 13 OMe prenyl H 11 4: R = H2 6: R = O 7 16 R1 R2 9 H pre 8 12 pre H R1 R2 15 OMe OH 17 OH OMe 18 OH H R1 R2 R3 R4 5 OH pre H pre 14 OMe pre pre H Hình 6: Cấu trúc hóa học các isoflavonoid từ loài Cóc kèn leo 13
  22. Nhóm nghiên cứu của Nattiya Chaichamnong đã đánh giá hàm lượng của 7 hợp chất genistein, derrisisoflavon A, lupalbigenin, 4′,5,7 trihydroxybiprenylisoflavon, scandenin, scandinon, scanderon và osajin trong các cao chiết nước, ethanol 50% và ethanol 95% của phần lá và phần thân loài D.scandens. Kết quả chỉ ra, 7 hợp chất này gần như không thấy trong các cao chiết lá và cao chiết nước phần thân. Cả 7 hợp chất đều được phát hiện trong các cao chiết ethanol 50% phần thân nhưng một số chất hàm lượng rất thấp. Phân tích cao ethanol 95% phần thân thì hàm lượng các chất cao hơn hẳn. [10] Các nghiên cứu không chỉ chứng minh tác dụng mà còn chỉ ra được độ an toàn khi sử dụng trên bệnh nhân mắc bệnh về xương khớp. Như vậy, có thể thấy, D.scandens thật sự có tiềm năng phát triển thành sản phẩm hỗ trợ và điều trị đau xương khớp thay thế cho các thuốc hiện nay bệnh viêm xương khớp để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe trong nước. Trên thế giới, đặc biệt là Thái Lan, đã có khá nhiều các nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý cũng như các thử nghiệm lâm sàng liên quan đến tác dụng trong điều trị đau xương khớp của D.scandens. Tuy nhiên, trong nước, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của loài này. Để chứng minh loài D.scandens ở Việt Nam cũng có tác dụng đã được chỉ ra theo các nghiên cứu trên thế giới, bước đầu cần chỉ ra sự tương đồng về thành phần hóa học giữa loài D.scandens ở Việt Nam và loài D.scandens trên thế giới. 14
  23. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Phần trên mặt đất cây Cóc kèn leo được lựa chọn và thu hái tại Khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu (huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu). Sau khi thu hái vào tháng 10/2020 tiến hành xử lý mẫu, cắt đoạn nhỏ, phơi sấy và bảo quản trong túi nilon kín. 2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 2.1.2.1 Hóa chất Dung môi chiết và phân đoạn cao chiết: Ethanol (EtOH), dichloromethan (DCM), n-BuOH. Dung môi dùng phân lập và tinh chế: Methanol (MeOH), n-Hexan, Ethyl Acetat (EtOAc), Aceton, Acid Formic, Dichloromethan (DCM), Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: H2SO4 10% trong ethanol. Dung môi dùng cho HPLC: Methanol, Triflorua acetic acid (TFA) đạt tiêu chuẩn HPLC của hãng Merck. Dung môi sử dụng đo cộng hưởng từ: CDCl3 2.1.2.2 Thiết bị và dụng cụ Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như: bình nón, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet, phễu chiết, Bếp điện, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Memmert, tủ sấy Binder-FD115, máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), máy siêu âm Power sonic 405, cột thủy tinh các loại – Viện Dược liệu. 15
  24. Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254nm và 366nm. Máy xác định độ ẩm PRECISA HA60 – Viện Dược liệu. Máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP3 (Stuart-England) – Viện Dược liệu. Cân kỹ thuật PRECISA BJ 610C. Cân phân tích PRECISA 262SMA-FR. 2.2 Nội dung thực hiện Thu thập mẫu nghiên cứu: phần trên mặt đất loài Cóc kèn leo. Mẫu nghiên cứu sau khi được thu hái đem cắt đoạn sau đó phơi khô rồi say nhỏ. Điều chế cao chiết tổng và các cao chiết phân đoạn: Mẫu nghiên cứu được chiết hồi lưu với ethanol 70%, sau đó cất thu hồi dung môi và cô cách thuỷ để thu được cao tổng. Cao tổng được phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng lần lượt với DCM và n-BuOH cho các cao chiết phân đoạn tương ứng. Phân lập, tinh chế các chất: Sử dụng phương pháp sắc ký cột với silica gel pha thường, sephadex LH-20 , phương pháp kết tinh lại, Xác định cấu trúc: Phương pháp so sánh với chất đối bằng sắc ký lớp mỏng, phương pháp phổ NMR và MS 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Mẫu nghiên cứu sau khi đã thu hái, rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ được chiết hồi lưu với ethanol 70% trong 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Lọc thu được dịch chiết. Gộp dịch lọc và cất thu hồi bớt dung môi dưới áp suất giảm, thu được dịch chiết tổng ethanol. Phương pháp chiết lỏng - lỏng: Dịch chiết tổng ethanol được chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: dichloromethan và n-BuOH. Dung môi hữu cơ được cất loại dưới áp suất giảm cho các cao chiết phân đoạn tương ứng. 16
  25. Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ phân đoạn DCM chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Phương pháp sắc ký cột: Sắc ký cột với silicagel pha thường: sử dụng phương pháp nhồi cột ướt với silicagel pha thường (cỡ hạt 40-63 휇m) Sắc ký cột sephadex LH-20 (sắc ký rây phân tử): sử dụng dung môi aceton Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả. Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silicagel là 0.2 mm. Phát hiện vết chất trên bản mỏng: Đèn UV ở 254 nm và thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol, sau đó được hơ nóng ở 135°C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của vệt chất. Phương pháp HPLC điều chế: Với các phân đoạn không thể phân tách bằng sắc ký cột thông thường, sử dụng HPLC điều chế pha đảo để phân tách và tinh chế. Chương trình được lựa chọn: Pha tĩnh là cột Supelco Analytical Discovery ® HS C18 (250×21.2mm; 10휇) Pha động: dung dịch TFA 0,01% và MeOH Chương trình rửa giải như sau: 0-10 phút: 70% MeOH 10-20 phút: 70-80% MeOH 20-30 phút: 80% MeOH 30-45 phút: 80-100% MeOH 17
  26. 45-55 phút: 100% MeOH 55-60 phút: 100-70% MeOH 60-70 phút: 70% MeOH Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm: 20µl Bước sóng phát hiện: 210 và 350 nm Nhiệt độ cột: 25°C 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất - Điểm chảy: Một thông số vật lý quan trọng để có thể so sánh độ tinh khiết của hợp chất. - Phương pháp sử dụng chất đối chiếu: So sánh với chất đối chiếu trên bản mỏng về Rf và màu sắc sau khi sử dụng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH (hơ nóng ở 135°C) - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Hiện nay là kỹ thuật quan trọng trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Các kỹ thuật NMR cho phép xác định số lượng và các dạng hạt nhân có trong các phân tử hữu cơ, các mảnh cấu trúc riêng biệt chứa các nguyên tử C, H, O, N, và cách thức chúng liên kết với nhau. Kỹ thuật phổ khối lượng (MS) cũng là các công cụ quan trọng trong việc xác định chính xác cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân: proton (1H-NMR) (500 MHz), cacbon 13 (13C-NMR) (125 MHz) và DEPT được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer với TMS (tetrametylsilan) sử dụng làm chất chuẩn nội. Độ chuyển dịch hóa học δ được biểu thị bằng ppm, hằng số ghép cặp J tính theo Hz. - Phổ khối lượng (ESI-MS) đươc ghi trên thiết bị AGILENT 1200 series LC- MSD Ion Trap. 18
  27. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 3.1.1. Điều chế các phần chiết từ cây Cóc kèn leo 13.7 kg phần trên mặt đất Cóc kèn leo được chiết hồi lưu với ethanol 70% 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Sau khi lọc, gộp các dịch chiết, cất thu hồi cồn bằng máy cất quay dưới áp suất giảm, thu được 10 lít dịch chiết tổng ethanol. Lấy toàn bộ dịch chiết tổng chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần dichloromethan và n-BuOH (chiết mỗi phân đoạn nhiều lần). Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết các phân đoạn, ký hiệu DS.D và DS.B với khối lượng các cắn thu được lần lượt là 420g và 393g và một phần cao chiết nước có khối lượng 1100g. Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học phân đoạn dichloromethan. Quá trình chiết các phân đoạn từ dược liệu được tóm tắt bằng sơ đồ: 19
  28. D.scandens (13.7kg) Chiết EtOH 70% x 3 lần Dịch chiết Bã Cô thu hồi EtOH 10L dịch chiết tổng EtOH Dichloromethan (DCM) Dịch chiết Dịch chiết nước DCM DCM thu hồi n-Butanol Dịch chiết Cắn nước Cắn DCM n-Butanol (1.1kg) (D) (420g) n-Butanol thu hồi Cắn n-Butanol (B) (393g) Sơ đồ 1: Tóm tắt quy trình chiết các phân đoạn từ dược liệu cây Cóc kèn leo 3.1.2 Phân lập các chất trong phần chiết dichloromethan của cây Cóc kèn leo Phần chiết DCM được phân tách bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel pha thường (cỡ hạt 40 – 63 휇m), sử dụng hệ dung môi rửa giải DCM/MeOH với độ phân cực tăng dần theo tỷ lệ (100:0, 50:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1, v/v) tách thành 127 bình nón x 100ml mỗi bình. Kiểm tra bằng TLC với các hệ dung môi khai triển DCM/MeOH (15:1, 5:1,v/v), thuốc thử H2SO4 (10% trong Ethanol) và gom các bình nón có sự tương đồng trên TLC, thu được 09 nhóm phân đoạn (DS.D.I → DS.D.IX). 20
  29. Phân đoạn DS.D.III (13.9g) được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường, với hệ dung môi n-Hexan/EtOAc, tăng dần độ phân cực (100:0, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1,v/v), tách thành 7 phân đoạn nhỏ (DS.D.III.1 → DS.D.III.7). Hợp chất 1 khối lượng 407mg, thu được bằng cách kết tinh lại trong methanol từ phân đoạn DS.D.III.1. Phân đoạn DS.D.III.5 (1.5g) được khai triển trên cột sephadex LH-20 với aceton và kết tinh lại trong hỗn hợp Aceton và MeOH cho Hợp chất 2 (520mg, tinh thể hình kim màu vàng). Phân đoạn DS.D.VI (9.41g) được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường, với hệ dung môi DCM/MeOH, tăng dần độ phân cực (100:0, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1,v/v), tách thành 3 phân đoạn nhỏ (DS.D.VI.1 → DS.D.VI.3). Hợp chất 3 khối lượng 34mg thu được bằng cách kết tinh lại trong methanol từ phân đoạn DS.D.VI.2. Phân đoạn DS.D.IV (20.36g) được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường, với hệ dung môi n-Hexan/Aceton, tăng dần độ phân cực (100:0, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1,v/v), tách thành 8 phân đoạn nhỏ (DS.D.IV.1 → DS.D.IV.8). Phân đoạn DS.D.IV.7 (346mg) kết tinh lại trong methanol cho chất kết tinh dạng tinh thể màu trắng 32mg (Hợp chất 4). Phân đoạn DS.D.IV.5 (986mg) được khai triển trên cột sephadex LH-20 với aceton thu được chất từ ống nghiệm số 14→16 (46mg) (Hợp chất 5). 21
  30. Sơ đồ 2: Quy trình phân lập 3 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn DCM 22
  31. Sơ đồ 3: Tóm tắt quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM Từ cao chiết phân đoạn DCM của phần trên mặt đất cây Cóc kèn leo, phân lập được 3 hợp chất sạch với độ tinh khiết lớn hơn 95%, trong đó có một chất thu được khối lượng lớn và 2 chất có độ tinh khiết khoảng 70-80% cần tinh chế thêm để thu chất sạch. 23
  32. uV 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0 -25000 -50000 -75000 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 min 350 nm uV 10000000 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 min 210 nm 1. Phân đoạn DS.D 2. Chất sạch (hợp chất 2) kết tinh lại bằng hỗn hợp MeOH - Aceton 3. Phân đoạn DS.D.IV.7 kết tinh lại bằng hỗn hợp Aceton (hợp chất 5 chưa sạch) 4. Phân đoạn DS.D.IV.5 sephadex (hợp chất 4 chưa sạch) Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của 3 hợp chất phân lập được từ cao chiết DCM Cóc kèn leo 24
  33. 3.2 Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 3.2.1 Hợp chất 1 Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 135.6oC Rf = 0.65 (TLC, n-Hexan/Aceton 5:1), không hiện UV 254 nm, màu tím với thuốc thử H2SO4 (2% trong ethanol). TLC đối chiếu với β-sitosterol ở 2 hệ dung môi khai triển khác nhau cho kết quả như sau 1. Hợp chất 1 2. β-sitosterol n-Hexan/EtOAc 6:1 n-Hexan/Aceton 5:1 Hình 8: Sắc ký lớp mỏng đối chứng giữa hợp chất 1 và β-sitosterol Sau khi đo nhiệt độ nóng chảy và chạy sắc ký bản mỏng với chất đối chiếu β- sitosterol, kết luận hợp chất phân lập được là β-sitosterol. Đây là một hợp chất khá phổ biến trong các loài thực vật. 3.2.2 Hợp chất 2 - Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng. - Rf = 0.3 (TLC, n-Hexan/EtOAc = 7:2), hiện UV 254 nm, hiện màu vàng với thuốc thử H2SO4 (10% trong Ethanol) khi hơ nóng trên bếp điện. - Phổ 1H-NMR của hợp chất này chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của hợp chất thuộc nhóm isoflavon 1 tín hiệu proton singlet của vòng A ở δH 6.37 (1H, s, H-8), 1 tín 25
  34. hiệu proton ở δH 7,82 (1H, s, J = 2.0 Hz, H-2) cùng với các tín hiệu proton của vòng B ở δH 7.26 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-2’), 6,84 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 7.26 (1H, dd, J = 8.5; 2.5 Hz, H-6'), từ đó chỉ ra vòng B bị thế ở hai vị trí 3' và 4'. - Ngoài ra, dữ kiện phổ còn chỉ ra sự xuất hiện của hai nhóm dimethylallyl, một nhóm với các tín hiệu proton δH 3.40 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-C1’’), 5.37 (1H, m, H-C2’’), 1.80 (6H, s, H-C4’’ và H-C5’’) và nhóm còn lại ở δH 3.48 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-C1’’’), 5.32 (1H, m, H-C2’’’), 1.86 (3H, s, H-C4’’) 1.80 (3H, s, H- C5’’’). - Dữ liệu quang phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra rằng hợp chất này có 25 carbon, trong đó có một carbon carbonyl, bảy carbon methin, hai carbon methylen, 4 nhóm methyl và 12 nguyên tử carbon bậc bốn. Trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác của hai nhóm methyl δH 1.86 (3H, s, H-C4’’’) 1.80 (3H, s, H-C5’’’) với carbon δC 121.2 (C-2’’’), tương tác giữa proton nhóm methylen δH 3.48 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-C1’’’) với carbon δC 159.8 (C-5), 110.3 (C-6), 161.3 (C-7), 121.2 (C-2’’’) và 128.1 (C-3’’’). Từ đó chỉ ra một nhóm methylallyl gắn vào vị trí C-6. Nhóm methylallyl còn lại được chỉ ra gắn vào vị trí C-3’ do xuất hiện tương tác giữa proton nhóm methylen δH 3.40 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-C1’’) với carbon δC 130.6 (C-2’), 121.8 (C-3’), 154.6 (C-4’), 121.7 (C-2’’) và 135.4 (C-3’’). - Khối lượng phân tử của hợp chất này với công thức phân tử C25H26O5, được chỉ ra từ dữ kiện phổ ESI-MS. Dựa trên các dữ kiện phổ trên kết hợp so sánh tài liệu tham khảo, hợp chất 2 được xác định là Lupalbigenin. - Một số tương tác trên phổ HMBC của Lupalbigenin 26
  35. Hình 9: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 Bảng 1: So sánh dữ liệu phổ của hợp chất 2 và phổ của Lupalbigenin Lupalbigenin Hợp chất 2 Vị 3C-NMR 1H-NMR (CDCl3, 3C-NMR 1H-NMR (CDCl3, trí (CDCl3, 500MHz) (CDCl3, 500MHz) 125MHz) δ (ppm) 125MHz) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) 2 152.3 7.74 (s) 152.5 7.82 (1H, s) 3 123.7 123.8 4 180.9 181.0 5 159.3 159.8 6 111.6 110.3 7 161.7 161.3 8 93.2 6.34 (s) 93.9 6.37 (1H, s) 9 156.0 156.2 10 105.4 106.0 1’ 122.4 123.2 2’ 130.2 7.17 (d. 3.0) 130.6 7.26 (1H, d, J = 2.5 Hz) 3’ 127.9 128.1 4’ 154.7 154.6 5’ 115.5 6.83 (d. 8.0) 115.9 6.84 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6’ 127.8 7.19 (dd. 8.5 2.0) 127.3 7.26 (1H, d, J = 2.5 Hz) 1’’ 28.7 3.37 (t. 8.0) 29.6 3.40 (2H, d, J = 7.0 Hz) 2’’ 122.0 5.35 (t. 7.0) 121.7 5.36 (1H, m) 3’’ 133.3 135.4 27
  36. 4’’ 25.6 1.74 (s) 25.6 1.80 (3H, s) 5’’ 17.7 1.75 (s) 17.8 1.80 (3H, s) 1’’’ 21.4 3.37 (t. 8.0) 21.5 3.48 (2H, d, J = 7.0 Hz) 2’’’ 121.9 5.28 (t. 7.0) 121.2 5.31 (1H, t) 3’’’ 132.6 134.6 4’’’ 25.6 1.69 (s) 25.6 1.80 (3H, s) 5’’’ 17.7 1.80 (s) 17.8 1.86 (3H, s) 3.2.3 Hợp chất 3 Chất bột màu trắng, vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 287-291oC Rf= 0,45 (TLC, DCM/MeOH= 10/1), không hiện UV 254 nm, màu tím với thuốc thử H2SO4 (2% trong ethanol). TLC đối chiếu với Daucosterol ở 3 hệ dung môi khai triển khác nhau cho kết quả như sau: DCM:MeOH 20:1 DCM:MeOH 10:1 DCM:MeOH 7:1 Hình 10: Sắc ký đồ TLC của hợp chất 3 (1) và Daucosterol đối chiếu (2) ở các hệ dung môi khai triển khác nhau Dựa trên các đặc trưng vật lý và kết hợp đối chiếu với daucosterol đã biết bằng TLC trên 3 hệ dung môi khai triển khác nhau, kết luận hợp chất 3 là daucosterol. Đây là hợp chất phổ biến trong thực vật. 3.3 Bàn luận 28
  37. 3.3.1 β-Sitosterol β-Sitosterol là một hợp chất phổ biến, được tìm thấy trong lá, quả, hạt, của nhiều loài thực vật. β-Sitosterol chứa một liên kết đôi dễ bị oxy hóa như cholesterol. Các nghiên cứu trước đây ở người về chế độ ăn không hạn chế đã chỉ ra rằng sterol thực vật (beta hoặc gamma sitosterol) gây giảm cholesterol huyết thanh bằng cách hạn chế lượng cholesterol đi vào cơ thể, có đặc tính chống ung thư và chống xơ vữa. Ngoài ra, β -sitosterol còn có thể liên kết với tuyến tiền liệt giúp làm giảm viêm sưng. [13] Di truyền khuynh hướng cholesterol cao (tăng cholesterol máu gia đình). Dùng β-sitosterol bằng đường uống có thể giúp giảm mức cholesterol toàn phần và cholesterol "xấu" (LDL) ở trẻ em và người lớn bị tăng cholesterol máu gia đình, những người cũng đang theo chế độ ăn ít chất béo và giảm cholesterol. Nhưng β-sitosterol dường như không cho hiệu quả tối ưu như sitostanol hoặc thuốc giảm cholesterol bezafibrat. β-Sitosterol được các nghiên cứu chứng nhận an toàn tuyệt đối đối với hầu hết mọi người khi dùng bằng đường uống, có thể an toàn khi thoa lên da. Nó có thể gây ra một số tác dụng phụ nhẹ, chẳng hạn như buồn nôn, khó tiêu, đầy hơi, tiêu chảy hoặc táo bón. Hiếm gặp hơn, beta-sitosterol có liên quan đến các báo cáo về rối loạn cương dương (ED), mất hứng thú trong quan hệ tình dục và mụn trứng cá. β-sitosterol thường được dùng cùng với chế độ ăn ít chất béo. [39,32] 3.3.2 Daucosterol Daucosterol là hợp chất glucosid của β-sitosterol (cùng nhóm phytosterol). Daucosterol là một chất khá phổ biến ở các loài thực vật bậc cao. Tác dụng nổi bật nhất của phytosterol là ức chế sự hấp thu cholesterol ở đường ruột. Ngoài ra, ở nhiều nghiên cứu daucosterol thể hiện được đặc tính chống ung thư cao hơn β-sitosterol và cisplatin. Thêm vào đó, sự kết hợp của β-sitosterol và daucosterol (1: 1) cho thấy hoạt động chống ung thư tăng lên ở các tế bào A549. [38] 3.3.3 Lupalbigenin 29
  38. Lupalbigenin là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid - nhóm các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh luôn được quan tâm nghiên cứu trên thế giới. Các nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng lupalbigenin cũng là một hợp chất thể hiện tác dụng gây độc tế bào mạnh, đặc biệt đối với bệnh ung thư vú. Lupalbigenin là hoạt chất được nghiên cứu có khả năng chống di căn ung thư và cũng đã được chỉ ra là thành phần chính trong phân đoạn dichloromethan loài D.scandens. [34,38] Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Cóc kèn leo còn rất hạn chế ở trong nước. Ở khuôn khổ các tài liệu đã được tham khảo, hầu như chưa thấy có sự phân tách được các thành phần hóa học của loài D.scandens ở Việt Nam. Trong phạm vi thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã phân lập được 3 hợp chất sạch trong đó có 1 hợp chất thuộc nhóm flavonoid là lupalbigenin và 2 hợp chất phổ biến thuộc nhóm phytosterol. Các kết quả có thể tạo cơ sở phát triển đề tài về sau này bằng việc nghiên cứu, phân lập các hợp chất có hoạt tính ở các phân đoạn khác trong cao chiết Cóc kèn leo, góp phần phát triển thêm những sản phẩm có tác dụnghỗ trợ điều trị đau cơ xương khớp với hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể mở rộng đề tài bằng việc nghiên cứu thêm các phương pháp để làm giàu các chất đã phân lập, nâng cao hiệu suất cũng như tác dụng chữa bệnh từ Cóc kèn leo. 30
  39. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dichloromethan loài Cóc kèn leo (Derris scandens (Roxb.) Benth.) thu được kết quả chính sau: Bằng các phương pháp sắc ký cột và HPLC điều chế, đã phân lập được 3 hợp chất sạch từ cây Cóc kèn leo, trong đó có 2 hợp chất phổ biến là β-Sitosterol và Daucosterol cùng hợp chất thuộc nhóm flavonoid với lượng lớn là Lupalbigenin.  Kiến nghị - Tiếp tục tinh chế hai hợp chất từ phân đoạn DS.D.IV và nghiên cứu phân lập các chất từ các phân đoạn còn lại từ cao DCM cũng như tiếp tục nghiên cứu thành phần hoá học phân đoạn n-butanol - Dựa trên các chất hóa học đã phân lập, cần nghiên cứu đánh giá thêm những tác dụng sinh học mới. Đồng thời nghiên cứu sâu các tác dụng đã được chứng minh để phát triển được những sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng từ loài Derris scandens (Roxb.) Benth. 31
  40. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Đàn, Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, (1985). 2. Trần Thành Đạo, Vũ Thúy Tuyền, Thái Khắc Minh (2019), “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của một số dẫn chất flavonoid”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 23(2), 354-359. 3. Nhóm tác giả Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật. Tài liệu Tiếng Anh 4. Hoang Le Tuan Anh (2017), “Prenylated isoflavonoids isolated from the leave of Cudrania tricuspidata Carr. Bur.”, Journal of Multidisciplinary Engineering Science and Technology (JMEST) ISSN: 2458-94. 5. Babu T. H. et al. (2010), "A new prenylated isoflavone from Derris scandens Benth.", J Asian Nat Prod Res, 12(7): 634-8. 6. Benchakanta, S., Puttiwong, S., Boontan, N., Wichit, M., Wapee, S., Kansombud, S., (2012), "A comparison of efficacy and side effects of knee osteoarthritis treatments with crude Derris scandens and Ibuprofen", J. Thai Tradit. Altern. Med, 10 (2), 115–123. 7. Bors W., W. Heller, C. Michel and M. Saran (1990), “Antioxydant in theapy and priventive medicine”, Plemum press, 165-170. 8. Busarawan Sriwanthana et al. (2009), "The Immunomodulating Activity of Derris scandens Benth. in Normal Healthy Volunteers", Journal of Thai Traditional & Alternative Medicine, 7 (1).
  41. 9. Cai QY., R. O. Rahn and R. W. Zhang (1997), “Dietary flavonoids, quercetin, luteolin and genistein, reduce oxidative DNA damage and lipid peroxidation and quench free radicals”, Cancer letter, 119(1), 99-107. 10. Chaichamnong N et al. "Phosphodiesterase 5 Inhibitors from Derris scandens", Planta Med, 84(15): 1134-1140. 11. Christapher P. V., P. Subramani, M. A. C. Josephine, Z. A. Mohd and V. Murugaiyah (2014), “Review on Polygonum minus Huds., a commonly used food additive in Southeast Asia”, Pharmacognosy Research, 7(1), 1-6. 12. Chuthaputti A and Chavalittumrong P. (1998), “Immunomodulating Activity of Derris scandens Benth”, Thai J.Pharm.Sci, 22(4): 137-148. 13. Farquhar, J.W., Smith, R.E., & Dempsey, M.E. (1956), “The Effect of Beta Sitosterol on the Serum Lipids of Young Men with Arteriosclerotic Heart Disease”, Circulation, 14(1), 77–82. 14. Ganapaty S. et al. (2006), "Anti-Inflammatory Activity of Derris scandens", Journal of Natural Remedies, 6(1): 73-76. 15. Gomes et al. (1981), “Systematic Significance of Flavonoids in Derris and Lonchocarpus”, Biochemical Systematics and Ecology, 9(2-3), 129–147. 16. Harsteen (1983), “Flavonoids – a class of nature products of high pharmacological potency”, Biochem. Pharmacology, 32 (7). 17. H.Hussian et al. “Phytochemical investigation and antimicrobial activity of Derris scandens”, Journal of King Saud University - Science, 27(4), 375–378. 18. J.Linn.Soc et al. (2011), “Derris scandens (Roxb.) Benth.”, Journal of the Linnean Society, Botany 4(Suppl.): 103–104. 1860. 19. Kuptniratsaikul V. et al. (2011), "Efficacy and safety of Derris scandens Benth extracts in patients with knee osteoarthritis", J Altern Complement Med, 17(2):147-53. 20. Laupattarakasem P et al. (2003), "An evaluation of the activity related to inflammation of four plants used in Thailand to treat arthritis", J Ethnopharmacol, 85(2-3):207-15.
  42. 21. Laupattarakasem P et al. (2003), "Anti-inflammatory isoflavonoids from the stems of Derris scandens", Planta Med, 70(6):496-501. 22. Mabry F. J., R.B. Markman and M. B.Thomas (1999), “The systematic identification of flavonoids”, Springer Publisher, Verlag-Berlin HeidelbergNew York, (1999). 23. Mahabusarakam W et al. (2004), "A benzyl and isoflavone derivatives from Derris scandens Benth." Phytochemistry, 65(8):1185-91. 24. Md. Mahbubur et al. (2019), “Evaluation of Hypoglycemic effect of extracts from Derris scandens and Thunbergia erecta leaves in Swiss albino mice”, Research J. Pharm. and Tech. 12(7): July 2019. 25. Nooin R. et al. (2019), “Assessments of antioxidant, antilipid peroxidation, and In- vitro safety of Derris scandens vine extracts from Southern Thailand”, Pharmacognosy research. 26. Polya G. M., B. H. Wang and Boo Ly (1995), “Inhibition of signal regulated protein kinases by plant-derived hydrolysable tannins”, Phytochemistry, 38(2), 307-314. 27. Pranee Chavalittumrong et al. (1999), "Chronic toxicity study of crude extract of Derris scandens ", Songklanakarin Journal of Science and Technology, 21(4): 425-433. 28. Ramya Madhiri et al (2018), “A review oh phytochemistry and pharmacological aspects of Derris scandens (Roxb.) Benth'', Innoriginal:International Journal Of Sciences, 5(3). 29. RC Gupta (2014), “Rotenone”, Encyclopedia of Toxicology (Tái bản lần thứ ba). 30. RC Gupta (2007), “Rotenone”, in Veterinary Toxicology, 2007. 31. Rukachaisirikul V et al. (2002), "Isoflavone glycosides from Derris scandens", Phytochemistry, 60(8):827-34. 32. Soodabeh Saeidnia et al. (2014), “The Story of Beta-sitosterol- A Review”, European Journal of Medicinal Plants 4(5): 590-609.
  43. 33. Tadsanee Punjanon et al. (2018), "The additivity antinociceptive interactions between diclofenac and the Derris scandens extract drug in mice", Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 11(1):314. 34. Tedasen A. et al. (2016). “5,7,40 -Trihydroxy-6,8-diprenylisoflavone and lupalbigenin, active components of Derris scandens, induce cell death on breast cancer cell lines”, Biomedicine & Pharmacotherapy, 81. 235-241. 35. Thothathari.K studies on Leguminosae, “A Taxonomic revision of the genus Derris scandens”, in India Bulletin of botanical survey of India (1961) 3(2);175-200. 36. Yuthapong Srimongkol et al. (2019), "A Study of the Efficacy of Derris scandens (Roxb.) Benth. Extract Compared with Diclofenac for the Alleviation of Low Back Pain", Ministry of Public Heath Vol. 5 No. 1 (2007): January - April 2007. 37. Y.Sirichamorn et al. (2012), “The Genera Aganope, Derris, and Paraderris (Fabaceae, Millettieae) in Thailand”, Systematic Botany, 37(2): pp. 404-436. Trang web tham khảo: 38. 39.
  44. PHỤ LỤC Phổ khối ESI-MS – Hợp chất 2 Phổ DEPT – Hợp chất 2 Phổ 13C-NMR – Hợp chất 2 Phổ 1H-NMR – Hợp chất 2 Sắc ký đồ độ tinh khiết hợp chất 2 Phổ HMBC – Hợp chất 2
  45. Phổ khối ESI-MS – Hợp chất 2
  46. Phổ DEPT – Hợp chất 2
  47. Phổ 13C-NMR – Hợp chất 2
  48. Phổ 1H-NMR – Hợp chất 2
  49. Sắc ký đồ độ tinh khiết hợp chất 2
  50. Phổ HMBC – Hợp chất 2