›

Khóa luận Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI

pdf 54 trang thiennha21 18/04/2022 5170
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_lua_chon_quy_trinh_tach_chiet_dna_tong_so_va_buoc.pdf

Nội dung text: Khóa luận Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ THU THẢO LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  NGUYỄN THỊ THU THẢO LỰ A CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUY ỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH2014.Y Người hướng dẫn : PGS.TS. Đinh Đoàn Long Lời cảm ơn ThS. Phạm Thị Hồng Nhung Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các thầy cô, bạn Hà Nội - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Đoàn Long và ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người tận tình chỉ bảo giúp tôi thực hiện đề tài khóa luận, tôi xin cảm ơn ThS. Đỗ Thị Lệ Hằng đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi về kỹ năng thực hành thí nghiệm. Các thầy, cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu (Bộ Y Tế) đã không quản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường. Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này. Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Thu Thảo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GBSSI Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch Synthase) H.nepalensis Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) H.helix Hedera helix L. CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide Mini CTAB Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984 CTAB cải tiến Elias và cộng sự, 2004 Kit Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) DNA Axit deoxyribo Nucleic (Deoxyribonucleic acid) dNTP Deoxyribonucleotit 5’ triphosphate ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal transcribed spacer) Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bp Cặp bazơ (base pair) OD Mật độ quang học (Optical Density) NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu 18 Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu 26 Bảng 3.2. Chỉ số OD260/280 của các mẫu nghiên cứu 27 Bảng 3.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR 29 Bảng 3.4. Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu 31 Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae 8 Hình 1.2. Hình ảnh cho mẫu lá Dây Thường Xuân 9 Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam. 9 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A 10 Hình 1.7. Giải trình tự theo phương pháp Sanger 15 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA theo bộ kit 22 Hình 2.3. Nguyên lí hoạt động màng silica 22 Hình 2.4. Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit 24 Hình 3.1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% 25 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI. 28 Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI. 28 Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI 28 Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% 30 Hình 3.6. So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera 32 Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood 35 Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Parsimony 35 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đa dạng di truyền 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Phân loại học sinh vật 3 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam 4 1.1.4. Mã vạch DNA 5 1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt 7 1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 8 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân 8 1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý 9 1.2.3. Thành phần hóa học 10 1.2.4. Tác dụng dược lý 10 1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 13 1.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 13 1.3.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR 14 1.3.3. Giải trình tự gen 15 1.3.4. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1. Đối tượng 18 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 18 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 19 2.4. Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1. Tách chiết DNA tổng số 19 2.4.2. Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR 23 2.4.3. Tinh sạch và giải trình tự 24 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen 24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1. Tách chiết DNA tổng số 25 3.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 3.2.1. Tối ưu quy trình PCR 27 3.2.2. So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình 29 3.3. Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại 31 3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, địa hình núi chiếm phần lớn giúp hình thành thảm thực vật đa dạng và phong phú. Từ xa xưa, y học cổ truyền Việt Nam đã biết sử dụng các nguồn dược liệu như là một công cụ để chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống. Do vậy, nguồn cây dược liệu quý là tài sản vô giá dùng để sản xuất thành các sản phẩm thuốc, dược liệu có giá trị kinh tế cao [7]. Chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được ghi nhận tổng cộng có 16 loài với đặc điểm hình thái chung dạng dây leo. Loài Dây Thường Xuân có tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch được báo cáo xuất hiện tại một số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất chính có tác dụng chống ung thư là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [36]. Ngoài ra, H.nepalensis đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, cụ thể có khả năng chống lại một số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn, ung thư, [27, 50]. Với tiềm năng như vậy, song đến nay các nghiên cứu về H.nepalensis tương đối ít. Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân ở Việt Nam nào được tiến hành, trong khi nhu cầu phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam nói chung đang ngày một tăng cao. Công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen cây trồng là bước nghiên cứu quan trọng quyết định tới thành công trong chọn tạo giống. Những hiểu biết đầy đủ về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của nguồn gen Dây Thường Xuân thực sự cần thiết trong công tác bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý. Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chính trong công tác chọn tạo giống. Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắc lực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: giải trình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể, hệ gen nhân, [12]. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI) là chỉ thị DNA đã được sử dụng thành công để xây dựng cây phát sinh chủng loại của họ Araliaceae ở châu Á [39]. Nhưng chỉ thị GBSSI có phải là chỉ thị tốt để đánh giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam là một câu hỏi chưa có lời giải. Để có thêm thông tin di truyền c ủ@a loài School này, bướ cof đầ uMedicine tiên và cũng r ấandt quan Pharmacy, VNU 1
  10. trọng là tách chiết được DNA tổng số từ tế bào một cách hiệu quả. Có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật được công bố nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá được phương pháp nào là hiệu quả nhất đối với mẫu lá khô Dây Thường Xuân. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu được quy trình tách chiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứng PCR, cung cấp những thông tin và hiện trạng di truyền của loài này góp phần vào chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI” với 2 mục tiêu như sau: 1. Xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lá khô của loài Dây Thường Xuân. 2. Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đa dạng di truyền 1.1.1. Khái niệm Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là sự giàu có về nguyên liệu di truyền trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường. Do vậy, đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái. Đa dạng di truyền là đa dạng ở cấp độ phân tử, đề cập đến sự biến đổi các đặc điểm di truyền giữa các cá thể trong loài và cả trong quần thể. Mỗi loài có chứa những gen riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể có thể thích nghi được với môi trường sống thay đổi. Với các áp lực như: chọn lọc nhân tạo, môi trường sống khắc nhiệt, một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơ hội cao hơn trong việc sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường giúp duy trì nòi giống có alen đó trong cơ thể. Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệ nhờ sự thành công của những cá thể này. Vì vậy, đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể. Đa dạng sinh học dù trong phạm vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ đa dạng di truyền. Và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất về sự khác biệt giữa các loài. Tuy nhiên, đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm đúng mức mặc dù các loại đa dạng này chính là nền tảng cho sự đa dạng của sinh giới [4]. 1.1.2. Phân loại học sinh vật Phân loại học sinh vật là sự sắp xếp các sinh vật theo các đơn vị phân loại (taxon) phù hợp dựa trên những đặc điểm giống nhau của chúng. Đồng thời, hệ thống phân loại có thể giúp dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, giúp ta hiểu rõ được quá trình tiến hóa của sinh vật. Một ý nghĩa thực tiễn quan trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi tên khác nhau ở các vùng đất khác nhau [11]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan, nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp mới: giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của một đoạn gen đặc trưng được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài. Phương pháp này đặc biệt có ích trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị. Các dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tạo thành hệ thống dữ liệu mã vạch DNA. Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan như ty thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như protein, enzym. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzym), giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism), [12] đã giúp giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài. 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học, được biết đến như một trung tâm đa dạng sinh học của thế giới @với cácSchool hệ sinh ofthái Medicinetự nhiên phong andphú và Pharmacy, VNU 4
  13. đa dạng. Trong đó, đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng 7.500 chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống và cá sống ở nước ngọt; khoảng trên 11.000 loài sinh vật biển. Đặc biệt, một bộ phận lớn của các giống thực vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ở nước ta, nên tiềm năng phát triển và đem lại giá trị kinh tế rất cao [6]. Với số lượng 500 loài nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý, hiếm và là nơi có nguồn đa dạng sinh học phong phú, nhưng những sản phẩm từ dược liệu quý của nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng. Điển hình trong số đó là chi Hedera, phân bố trên thế giới trên 16 loài nhưng chỉ có 2 loài H.nepalensis (Dây Thường Xuân, xuất hiện tại một số tỉnh miền núi phía Bắc) và H.helix (Thường Xuân) được chứng minh là có tác dụng dược lý trong phòng và điều trị bệnh. Mặc dù có những tiềm năng dược lý song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.nepalensis, đặc biệt là các nghiên cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen ở Việt Nam. Chưa kể đến, việc phân loại và định danh Dây Thường Xuân dựa vào đặc điểm hình thái có thể dễ gây nhầm lẫn do đặc điểm xẻ thùy của lá cây (phần hay được thu hái làm thuốc) có mức độ phân hóa lớn. Vậy nên, phân tích đa dạng di truyền và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về nguồn gen góp phần giải quyết nhu cầu khai thác hiệu quả và quản lý bền vững nguồn tài nguyên dược liệu. 1.1.4. Mã vạch DNA Mã vạch DNA là một khái niệm tương đối mới nhằm cung cấp nhận dạng loài nhanh chóng, chính xác và tự động hóa, bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn của hệ gen như một mã vạch đặc trưng để nhận diện. Mã vạch DNA có tiềm năng trong phân loại học và trong các ngành khoa học khác như là khoa học pháp y, công nghệ sinh học, công nghiệp thực phẩm, giúp cung cấp cái nhìn sâu hơn để nhận diện, phân định ranh giới giữa các loài và góp phần nhận diện các mẫu vật chưa xác định được thuộc loài nào [28]. Ước tính có khoảng 300.000 loài thực vật trên thế giới, việc phân loại và xác định chính xác một số lượng lớn các loài như vậy vẫn đang còn là một thách thức ngay cả với các chuyên gia phân loại. Hơn nữa, phân loại từng loài dựa trên chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, giải phẫu) mất rất nhiều thời gian và công sức, lại chỉ phù hợp ở từng giai đoạn sống, giớ i@ tính School cụ thể của ofloài, Medicine nhiều cá thể s ẽand không Pharmacy, VNU 5
  14. nhận định được. Sự xuất hiện của mã vạch DNA đã có tác động tích cực đến phân loại học giúp đáp ứng tốt những hạn chế của phương pháp truyền thống trước kia và ngày càng trở nên phổ biến, có ý nghĩa trên quy mô toàn cầu [28]. Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là tính đặc hiệu cao dễ sử dụng. Một mã vạch DNA lý tưởng cần đáp ứng các tiêu chí sau: Một là, nó phải đủ độ đột biến phân biệt giữa các loài khác nhau và phải có vùng bảo tồn để nhận diện được giữa những cá thể thuộc cùng một loài [34,15]. Hai là, phổ biến trong các loài để có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. Ba là, đoạn DNA đủ ngắn (khoảng 700 bp hoặc nhỏ hơn [19]) chứa đủ thông tin phát sinh gen để dễ dàng định danh các loài cho nhóm phân loại của nó một cách nhanh chóng. Cuối cùng, các vị trí mồi được bảo tồn cao, khuếch đại và giải trình tự DNA có độ tin cậy cao. Năm 2004, hiệp hội mã vạch cho cuộc sống (barcode of life) được thành lập nhằm mục đích xác định một công cụ mã vạch chính xác, đáng tin cậy cho nghiên cứu về phân loại thực vật và động vật. Năm 2006, Hebert và các cộng sự của ông đã đề xuất sử dụng gen ti thể cytochrom oxyase tiểu đơn vị 1 (CO1) như là một trình tự mã vạch chung cho động vật. Và kể từ đó, đã có hàng loạt ấn phẩm minh chứng sự hữu ích của nó trong phân loại các loài động vật [32]. CO1 không chỉ chứa vùng trình tự được bảo tồn cao trong một loài mà còn chứa đủ biến dị phục vụ nghiên cứu phân biệt giữa các nhóm riêng biệt trong một loài. Ghi nhận về CO1 còn cho biết khả năng phân biệt nhiều mẫu động vật cùng tổ tiên và thậm chí có hiệu suất cao ngay cả với những mẫu đã lưu trữ qua thời gian dài. Đối với mã vạch DNA ở thực vật, gen lục lạp được xem là mã vạch có độ tin cậy cao trong xác định các loài thực vật do sự biến đổi rất chậm của hệ gen ty thể. Có một số mã vạch thường được sử dụng cho thực vật như: matK, RbcL, TrnH- psbA. Gen matK có tốc độ tiến hóa cao, chiều dài phù hợp và sự khác biệt rõ ràng giữa các vùng cũng như tỷ lệ chuyển đổi thấp [31]. Tuy nhiên, để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen matK thì sử dụng một cặp mồi đơn thường không đem lại hiệu quả cao. Các loài khác nhau yêu cầu cặp mồi khác nhau, hiệu suất nhân dòng các loài cũng khác nhau. Gen matK có thể phân biệt được >90% trong các loài phong lan, tuy nhiên lại chưa đến 49% trong họ hạt nhục đậu khấu [47]. Gen rbcL được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phát sinh gen với hơn 50.000 trình tự có sẵn trong Genbank. Những lợi thế của gen này là dễ dàng khuếch đại trình tự và là một mã vạch DNA tốt trong phân loại thực vật ở cấp độ gia đình và chi, nhưng lại không hiệu quả ở cấp độ loài [19]. trnH @-psbA School hiện đang of là mãMedicine vạch được sửand dụng Pharmacy, VNU 6
  15. phổ biến, với những ưu điểm như thiết kề mồi đơn giản, chỉ sử dụng một cặp mồi đơn để khuếch đại gen, nằm giữa 2 vùng trình tự bảo tồn cao là đoạn trình tự không mã hóa có tỷ lệ biến đổi cao [33]. Tuy nhiên độ dài chuỗi trình tự TrnH-psbA ngắn trong chi Solidago có thể là nhược điểm của mã vạch này khi không cung cấp đủ biến dị cho phân tích phân loại. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật. Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi vùng sao chép nội bộ (Internal Transcribed Spacer, ITS) và vùng gen nhân có số lượng bản sao thấp như gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI cũng được sử dụng trong việc phân loại thực vật và cho hiệu quả cao. Hiện nay hệ thống mã vạch DNA cho thực vật vẫn chưa hoàn chỉnh. Tuy nhiên, với các trình tự mã vạch DNA này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học [5]. 1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt Quan tâm đến việc sử dụng các gen nhân có số lượng bản sao thấp để phân tích phát sinh thực vật đã phát triển nhanh chóng, đặc biệt khi mà các chỉ thị phổ biến như DNA lục lạp và DNA ribosom không thể tạo ra các giả thuyết phát sinh gen mạnh. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule Bound Starch Synthase I, GBSSI), hay gen waxy chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào. Những đoạn exon của GBSSI có tốc độ thay thế nucleotit tương đối chậm nên có vai trò là vùng bảo tồn, trong khi đó những đoạn không được mã hóa inton lại có tỷ lệ thay thế nucleotit khá cao cung cấp các dấu hiệu phát sinh gen ở các bậc phân loại [45]. Hiện tại, dữ liệu về gen GBSSI vẫn chưa được hiểu đầy đủ, và còn cần nghiên cứu thêm. GBSSI là một chỉ thị còn mới trong nghiên cứu phân tử để nghiên cứu phát sinh loài với kích thước gen khoảng 4 kb, bao gồm 13 intron trong Solanum tuberosum và có khả năng là một nguồn thông tin hữu ích về thực vật học [39, 21]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae. Mũi tên chỉ vị trí cặp mồi nhân dòng [39] 1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân * Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Hoa hồng Rosidae Bộ Hoa tán Apiales Họ Nhân sâm Araliaceae Chi Hedera Cho đến ngày nay, chi Hedera đã ghi nhận tổng cộng 16 loài với đặc điểm hình thái chung dây leo, mọc thành một lớp bao phủ mặt đất với chiều cao từ 6-10 cm, có thể leo cao tới 30 m [20]. Hedera có thể leo được là nhờ hệ thống rễ mọc ký sinh có thể tạo ra chất bám dính. Lá cây thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, phiến lá phân thùy, dài 5-10 cm, rộng 3-8 cm, gân chân vịt. Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lông sao. Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng, lá bắc rất nhỏ, dài có 5 răng nhỏ, tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa, nhị 5, bầu 5. Quả hạch tròn, mọng dài từ 5-9 mm, đường kính 6-9 mm, trọng lượng trung bình khoảng 281,5 mg, trái của nó chứa từ 2-5 hạt, quả khi chín có màu đen [1, 17]. * Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis H.nepalnensis K.Koch là loài có dây leo có thể dài tới 20 m, có nhiều rễ mọc ký sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa mọc dấu ở cành thành tán tròn hoặc tán ngù, mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000-3000 m [3]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. Hình 1.2. Cây Dây Thường Xuân [53] 1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý Hedera nepalensis K. Koch thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có nguồn gốc từ Nepal, Bhutan cũng như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Myanmar và Việt Nam ở độ cao khoảng 1000-3000 m [51]. Tại Việt Nam Dây Thường Xuân được tìm thấy ở một số vùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn Hình 1.3 [2]. Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam [2] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. 1.2.3. Thành phần hóa học Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thành phần hóa học chủ yếu trong lá và thân của H.nepalensis K. Koch là saponin. Trong đó, hai hợp chất chính có tác dụng chống ung thư hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A đã được T. Li và cộng sự phân lập bằng phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp quang phổ vào năm 2015 [36]. Ngoài ra, các hợp chất phenolic và phenolic có khả năng chống oxy hóa cũng được phát hiện trong H.nepalensis khi định tính bằng phương pháp so màu với quercetin và axit gallic. Để định lượng các hợp chất trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được sử dụng. Hai hợp chất catechin và caffeic cũng được tìm thấy trong phân đoạn etyl acetate của H.nepalensis. Các phân tích hóa sinh đã chứng minh trong Dây Thường Xuân còn có chứa các nhóm chất khác như: carbohydrate, protein, alkaloid, tanin, terpenoid và các hợp chất phytosterol [22, 41, 30, 42]. Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [26] 1.2.4. Tác dụng dược lý 1.2.4.1. Theo y học cổ truyền Bộ phận dùng: rễ, thân, lá và quả tươi hoặc phơi khô. Về tính vị quy kinh: Dây Thường Xuân có vị đắng, tính mát thường có tác dụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng; quả vị ngọt, tính ấm được dùng để trừ phong huyết. Công dụng: Chữa đơn sưng: chế rượu với lá thường xuân giã nhỏ, gạn lấy dịch uống, phần bã còn lại được đắp vào @ ch Schoolỗ sưng đau. ofKhi Medicine gặp vấn đề về mandụn l ởPharmacy, VNU 10
  19. thì lấy thân hoặc rễ cây sắc thuốc hoặc ngâm với rượu uống. Sắc hoặc ngâm rượu với quả Dây Thường Xuân có công dụng chữa huyết bế trong bụng, giúp giảm các triệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già [2]. Ở Ấn Độ, lá cây còn có thể dùng làm thuốc chườm nóng trị sưng hạch, quả dùng hãm uống tác dụng trị thấp khớp [3]. 1.2.4.2. Theo y học hiện đại Tác dụng chống đái tháo đường: Một nghiên cứu đã được thực hiện trên chuột mắc bệnh tiểu đường nhằm đánh giá hiệu quả của dịch chiết thô H.nepalensis. Hiệu quả được đánh giá dựa trên nồng độ glucose đo bằng máy đo đường huyết, sau đó so sánh các thông số giữa chuột được điều trị và không được điều trị. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra H.nepalensis làm giảm đáng kể mức đường huyết theo thời gian và làm phục hồi chức năng gan [26]. Nghiên cứu khác cũng chỉ ra H.nepalensis chứa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4). Một trong số cơ chế của thuốc chống đái tháo đường hiện nay dựa trên nguyên lý ức chế DPP-4, đây là một enzym phá hủy incretins. Incretins là hóc-môn tự nhiên do cơ thể tiết ra lượng lớn sau bữa ăn, với vai trò điều chỉnh lượng đường huyết thông qua kích thích tuyến tụy tiết insulin. Khi ức chế enzym DPP-4 sẽ làm tăng nồng độ và kéo dài thời gian tác dụng của incretins, làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon trong tuần hoàn, dẫn đến giảm glucose máu. Do đó, H.nepalensis được đánh giá có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường [44]. Tác dụng chống oxy hóa: Nghiên cứu của Samia Inayatullah và cộng sự về tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol H.nepalensis thử nghiệm trong môi trường nước và lipid. Khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu trong nước bằng cách sử dụng xét nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và gốc ABTS (2,2’- azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate). Trong khi hoạt tính chống oxy hóa trong lipid được xác định bằng đánh giá chỉ số ôi hóa (TBARS - Thiobarbituric Acid Reactive Substances). Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế diệt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xác định. Sau đó, khả năng chống oxy hóa xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng thích hợp. Nghiên cứu đưa ra kết quả hàm lượng gốc DPPH là 26,7 ± 0,2 (mM TE/g); ABTS là 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); TBARS là 393 ± 3,4 (mmol TE/g). Trong đó, mM TE/g là µmol đương lượng chất chuẩn Trolox (Trolox Equivalent - @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. TE) trên 1 g chất khô. Hai hợp chất chính trong dịch chiết thô của H.nepalensis có chất có khả năng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [36]. Nghiên cứu khám phá các chất chống oxy hóa tự nhiên bao gồm nghiên cứu các hợp chất polyphenolic và khả năng chống oxy hóa của H.nepalensis cũng đã được thực hiện. Nguyên liệu sử dụng là dịch chiết thô và các dịch chiết phân đoạn của nó thu trong dung môi: n-hexan, ethyl acetate và nước. Tổng hàm lượng flavonoid và phenolic được định tính bằng phương pháp so màu sử dụng quercetin và axit gallic. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) để phát hiện các hợp chất flavonoid. Theo đó, hàm lượng flavonoid là 2,4 ± 0,164 QE /100 mg (đương lượng quercetintrên mỗi gram dịch chiết) và hàm lượng phenolic là 12,90 ± 0,15 mg GAE/100 mg (GAE/g - đương lượng acid galic trên mỗi gram dịch chiết). Tác dụng chống oxy hóa được đánh giá bằng khả năng dọn sạch nhóm hydro peroxide (H2O2). Các chiết suất thô cũng như phân đoạn của H.nepalensis cho thấy khả năng chống oxy hóa cao với chỉ số IC50 từ 31,19 đến 200 µg/mL. Trong đó, dịch chiết ethyl acetate được cho là có khả năng chống oxy hóa cao nhất, dịch chiết n-hexan thấp hơn và sau cùng là dịch chiết với nước [35]. Tác dụng chống ung thư: Laila Jafri và cộng sự đã thực hiện phân tích các đặc tính hóa học và gây độc tế bào ung thư trong ống nghiệm của cây. Xét nghiệm hóa trị ung thư trong ống nghiệm được thực hiện bằng xét nghiệm nitrite, xét nghiệm NFB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase 1 (QR1). Tiềm năng gây độc tế bào được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư: MCF-7, MDA-MB-231 và xét nghiệm sulforhodamine B (SRB). Kết quả xét nghiệm hóa trị ung thư cho thấy các dịch chiết phân đoạn n-hexan và ethyl acetate của cây được thử nghiệm có tiềm năng ngăn ngừa ung thư. Dịch chiết thô và các phần dịch chiết phân đoạn của nó đã ức chế sự tăng trưởng của ba dòng tế bào ung thư hơn 60%, giá trị IC50 của lupeol thay đổi từ 2,32 đến 10,2 μM. Định lượng lupeol dựa trên HPLC-DAD trong các mô thực vật khác nhau đã được chứng minh rằng lá của H.nepalensis là một nguồn lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) [29]. Hai hợp chất chống ung thư chính là hederagenin 3-O-α-L- arabinopyranoside (IC50 = 13,69 ± 1,29 g/mL) và pulsatilla saponin A (IC50 = 2,80 ± 0,94 g/mL) có vai trò chính cho các hoạt động chống ung thư của H.nepalensis K. Koch, được nghiên cứu bởi T.Li và cộng sự. Các hợp chất được phát hiện thông qua các phương pháp sắc ký hóa học và phương @ School pháp quang of ph Medicineổ. Thực hiện phân and lậ pPharmacy, VNU 12
  21. các thành phần chống ung thư và thử nghiệm các hoạt động ức chế tăng trưởng của chúng trên tế bào ung thư phổi A549 ở người. Kết quả cho thấy chiết xuất ethanol 95% của H.nepalensis K. Koch đã ngăn chặn đáng kể sự phát triển tế bào A549 phụ thuộc vào liều [36]. Tác dụng giảm đau: Với phương pháp thử nghiệm Hot Plate, được sử dụng trong nghiên cứu phản ứng đau cơ bản và trong thử nghiệm hiệu quả của thuốc giảm đau bằng cách quan sát phản ứng với cơn đau do nhiệt. H.nepalensis cho kết quả về khả năng giảm đau lên tới 59,1% so với morphine là 80% (p < 0,01) [25]. Thử nghiệm sự đau đớn để đánh giá hiệu quả giảm đau ngoại vi được đặc trưng bởi sự giải phóng các chất trung gian giảm đau nội sinh chẳng hạn như axit arachidonic, cyclooxygenas. Có thể nhận định rằng các polyphenol có mặt trong cây có vai trò chính trong hoạt động giảm đau. Tác dụng kháng viêm: Để xác định khả năng chống viêm, dịch chiết thô của H.nepalensis ở nồng độ hiệu quả nhất (200 mg/kg) được đánh giá bằng cách sử dụng mô hình với histamin. Sự ức chế phù tối đa được phát hiện ở 90 phút. Mẫu đối chứng dương được thực hiện với chlorpheniramine maleate. Tỷ lệ phần trăm ức chế của chlorpheniramine maleate là 77% và của H.nepalensis là 63,5% (p < 0,01). Kết quả cho thấy rằng dịch chiết của H.nepalensis giúp làm giảm đáng kể tình trạng viêm do histamine tạo ra [25]. 1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 1.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Tách chiết axit deoxyribonucleic (DNA) tổng số là quá trình tách DNA khỏi protein, và các vật liệu tế bào khác có trong tế bào bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp vật lí và hóa học. Tách chiết DNA lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1869 bởi Friedrich Miescher. Đây có thể là một trong những phần tốn nhiều công sức nhất trong phân tích DNA. Các phương pháp tách chiết có thể yêu cầu ủ qua đêm, hoàn thành trong vài phút hoặc vài giờ phụ thuộc vào từng quy trình [43]. Các quá trình tách chiết DNA đòi hỏi xử lý cẩn thận nhằm ngăn chặn nhiễm mẫu và nhiễm chéo. Tiêu chuẩn chung đối với các phương pháp phân lập DNA là: lượng DNA phân lập đủ nhiều, độ tinh sạch cao, ít đứt gãy phù hợp cho các quy trình phân tích tiếp theo. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. Khả năng chiết xuất DNA chất lượng cao là rất quan trọng để nghiên cứu di truyền phân tử của một sinh vật. Khác với tế bào động vật, ở thực vật có vách tế bào dày đồng thời các chất polysacarit và tannin rất khó để loại bỏ vì chúng khó tách khỏi DNA. Hơn nữa, phân lập DNA từ các mô thực vật đòi hỏi sự tham gia của carbohydrate và enzym đảm bảo ly giải thành tế bào [46]. Hầu hết các chất gây nhiễm giống như polysacarit, polyphenol và các hợp chất hữu cơ khác khó phát hiện có thể ảnh hưởng đến chất lượng DNA và ức chế phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) [38]. Bước đột phá đầu tiên trong phân lập DNA vào năm 1980 với ứng dụng của cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) được nghiên cứu bởi M.G.Murray and W.F.Thompson [40]. Đến nay, sử dụng hóa chất CTAB để tách chiết DNA được sử dụng trong nhiều loài thực vật. Kỹ thuật dựa trên khả năng tạo kết tủa chọn lọc DNA với CTAB. CTAB là chất tẩy cation, ở nồng độ muối cao có khả năng tạo kết tủa với DNA, khi đó các tạp chất trong hỗn hợp không tạo được kết tủa sẽ được loại bỏ [40]. Kết tủa DNA với CTAB sau đó sẽ được hòa tan với muối nồng độ thấp (NaCl 1N). Ngoài phương pháp tách bằng hóa chất CTAB, các bộ kit thương mại được sử dụng với ưu điểm tiết kiệm thời gian, tách DNA có độ tinh sạch cao nhờ nguyên lí trao đổi ion trên màng silica. Trong quá trình tách chiết DNA thực vật, không có phương pháp tách chiết nào được chứng minh là tối ưu nhất. Năng suất DNA khác nhau giữa các loài khác nhau và mô tùy thuộc vào kích thước bộ gen, số lượng tế bào và tuổi của từng mẫu [46, 50]. Để đánh giá phương pháp tách chiết DNA, cần đánh giá không chỉ dựa trên nồng độ và độ tinh sạch của DNA thu được, mà còn dựa trên khả năng phân lập thành công các đoạn gen đích sử dụng kỹ thuật PCR. 1.3.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một thành phần không thể thiếu và là kỹ thuật chính của sinh học phân tử. Sử dụng enzym DNA polymerase có khả năng liên kết với khuôn để tổng hợp phân tử DNA mới từ phân tử DNA khuôn ban đầu với nguyên liệu là các dNTP. Trong phản ứng PCR có sự thay đổi nhiệt liên tục theo chu kỳ, một chu kỳ thường gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính với nhiệt độ cao (94-980C) tác động làm mạch DNA tách thành hai mạch; giai đoạn gắn mồi nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện thuận lợi để mồi gắn vào được sợi DNA khuôn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc nhiều yếu tố như đặc tính mồi, trình tự mồi, ; giai đoạn kéo dài: Trong bước này DNA polymerase sẽ tổng hợp chuỗi DNA mới có trình tự bổ sung với DNA mạch khuôn @ bSchoolằng cách thêm of cácMedicine dNTPs từ h ỗandn hợ pPharmacy, VNU 14
  23. thành phần phản ứng theo chiều từ 5’-3’. Sản phẩm được tạo thành sẽ là nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo. Số lượng sản phẩm phân tử DNA tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sau n chu kỳ sẽ tạo thành 2n phân tử DNA [49]. 1.3.3. Giải trình tự gen Hình 1.5. Giải trình tự theo phương pháp Sanger Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự sắp xếp của bốn loại nucleotit trên phân tử DNA. Nguyên tắc dựa trên phương pháp Sanger – kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng 2’, 3’dideoxynucleotit (ddNTP) đã mất nhóm C3’-OH. Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotit mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên nucleotit không được gắn thêm vào chuỗi, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Trong thí nghiệm của Sanger theo mô tả Hình 1.5, 4 ống nghiệm tách biệt chứa sẵn đoạn mồi, DNA khuôn, dNTP, mỗi ống nghiệm chỉ bổ sung 1 loại ddNTP đã được đánh dấu phóng xạ, sau đó thực hiện phản ứng tổng hợp. Sản phẩm tổng hợp điện di trên gel polyacrylamide. Đặc điểm của những đoạn DNA này là hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’, kích thước sai khác nhau 1 nucleotit. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. Phương pháp giải trình tự gen thủ công theo Sanger được ứng dụng rất rộng rãi, Tuy nhiên để giải trình tự DNA ở hệ gen lớn, đa số đều thực hiện phương pháp giải trình tự tự động. Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTP được gắn chất phát quang khác nhau cho mỗi loại. Nguồn sáng Argon của máy giải trình tự kích thích các ddNTP, đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotit và được hiển thị bằng một đỉnh. Trình tự đọc được trên máy tự động thường dài khoảng 600 đến 1.000 bp. Ưu điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các bước, tốc độ đọc và mức độ chính xác rất cao [9, 10]. 1.3.4. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại Phương pháp Ma trận khoảng cách - Distance Matrix Đây là một nhóm các thuật toán được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứu tiến hóa. Được bắt đầu sử dụng từ những năm 1990, các thuật toán này giúp xác định mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu hiệu hình thái. Trong đó thuật toán UPGMA (Unweighted pair group with arthmetic) phân tích tất cả các dấu hiệu qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền thấp nhất. Nhìn chung các thuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phân tích nhanh, phù hợp để xử lí một lượng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài nhưng không phản ánh được sự tiến hóa của mỗi gen [10]. Phương pháp Tiết kiệm tối đa - Maximum Parisimony Dựa trên nguyên tắc sinh học là đột biến hiếm khi xảy ra, thuật toán này cho rằng: cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất trên tất cả các cây tiến hóa có thể giữa các taxon được phân tích. Do vậy cây tiến hóa thu được từ phương pháp này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu [10].Chỉ số tin cậy cho từng nhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ được coi là có độ tin cậy khi giá trị này đạt trên 70% [52]. Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tính toán nhanh và được cho là khách quan nhất vì không đưa ra bất kì một giả định nào về quá trình tiến hóa. Phương pháp Hợp lý tối đa - Maximum Likelihood Đây là một phương pháp xác suất thuần túy thường được dùng để kiểm chứng lại các cây tiến hóa đã xây dựng bởi các phương pháp khác. Phương pháp này đánh giá một giả thiết tiến hóa bằng @ xây School dựng tất cả ofcác Medicinecây tiến hóa trên and cơ s ởPharmacy, VNU 16
  25. giả thiết đó rồi xác định cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy ra cao nhất qua việc phân tích các yếu tố tiến hóa. Chẳng hạn, về đại thể tần số đột biến đồng hoán cao hơn khoảng 3 lần so với các đột biến dị hoán [10]. Đây được coi là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn cả so với các phương pháp khác. Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thông tin theo phương pháp này chậm và không khả thi khi phân tích một lượng dữ liệu lớn. Phương pháp này cũng cho ra cây tiến hóa có độ tin cậy khi giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt trên 70% ở mỗi nhánh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng 9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài Hedera nepalensis thu nhập tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc. Các mẫu được lấy bởi nhóm nghiên cứu tại Viện Dược liệu, chi tiết thể hiện trong Bảng 2.1. Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc. 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm. Bảng 2.1. Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu TT Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ địa lý mẫu 1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E 2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 4 H4 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì, 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E Hà Giang 5 H5 TT. Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 6 H6 TT. Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E 9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E 10 HH Vườn Thực vật Hoa Nam, Trung Quốc 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ ngày 15/6/2018 – 25/04/2019. Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của Bộ mônY Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nộ i.@ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.3.1. Hóa chất Hóa chất để tách chiết DNA tổng số: bộ kit Dneasy Plant Mini (Qiagen, Đức), bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ), hóa chất phân lập DNA theo quy trình CTAB, CTAB cải tiến mua từ Merck bao gồm: CTAB 3% (Tris 1M pH 8, EDTA, NaCl, nước khử ion); TE (Tris 1M pH 8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol. Hóa chất thực hiện kỹ thuật PCR: dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion Polymerase (Thermo Scientific), cặp mồi đặt tổng hợp từ hãng Phusa Biochem (Việt Nam) đã được sử dụng trong một số nghiên cứu khác trên thế giới [23], có trình tự như sau: Mồi xuôi F: 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’; mồi ngược R: 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’ Hóa chất điện di: Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA, Affymetrix), 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder (Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific), Tris base (Bio basic), axit acetic (Merck). 2.3.2. Trang thiết bị Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản). 2.4. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1. 2.4.1. Tách chiết DNA tổng số DNA được phân lập bằng 4 phương pháp là phương pháp sử dụng Mini- CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng. Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau: Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới. Bước 2: Bổ sung thêm 388 µL đệm CTAB 3% đã ủ ấm ở 65oC và bổ sung 12 µL β-mercaptoethanol. Bước 3: Ủ mẫu ở 65oC trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần. Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phòng, bổ sung 200 µL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích). Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút. Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới. Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tích 24:1) và 80 µL CTAB 3%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 9: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới có sẵn 140 µL isopropanol đã làm lạnh ở -20oC. Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống. Để ở -20oC trong 60 phút. Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi. Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều. Bước 13: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ. Bước 14: Hòa tan DNA tủa trong 100 µL đệm TE và 2 µL RNase. Bước 15: Bảo quản mẫu ở -20oC. Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau: Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới. Bước 2: Bổ sung thêm 800 µL đệm CTAB 3% đã ủ ấm ở 65oC. Ủ mẫu ở 65oC trong 60 phút (cứ 15 phút đảo mẫu một lần). Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phòng, bổ sung 500 µL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích). Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút. Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 5: Hút 500 µL phần dịch bên trên và chuyển sang ống eppendorf mới. Bước 6: Bổ sung 500 µL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tích 24:1) và 200 µL CTAB 3%. Bước 7: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 8: Hút 500 µL từ từ phần dịch bên trên (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới có sẵn 350 µL isopropanol đã làm lạnh ở -20oC. Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống. Để ở -20oC trong 30 phút. Bước 10: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút. Bước 12: Hòa tan DNA tủa trong 150 µL đệm. Bước 13: Bảo quản mẫu ở -20oC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. Với sự phát triển của khoa học, đã có thêm nhiều phương pháp mới được xây dựng giúp việc phân lập DNA đạt hiệu suất cao như sử dụng bộ dụng cụ thương mại đến từ các hãng. Một số bộ Mini Kit thường được ứng dụng trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật như: DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Nguyên lý phương pháp tách DNA tổng số theo bộ kit dựa trên sự thay đổi môi trường pH làm tăng ái lực của DNA và gắn DNA lên màng silica (Hình 1.6). Theo đó, các mẫu thực vật được ly giải, loại bỏ tạp, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh sạch như mô tả trong quy trình ở Hình 1.7. Ngoài ra, axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có thể được đưa vào để bảo vệ DNA chống lại quá trình oxy hóa và biến tính. RNA có thể được loại bỏ bằng cách sử dụng RNase. Hình 1.6. Nguyên lí hoạt động màng silica [58] Hình 1.7. Sơ đồ mô tả quy trình tách@ chiSchoolết DNA sofử d ụMedicineng cột thu silica and Pharmacy, VNU 22
  31. Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm: Bước 1: Ly giải DNA: thành tế bào thực vật được phá vỡ nhờ đệm ly giải và các muối chaotropic (muối hoạt động bề mặt) làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước. Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein, RNASE để loại bỏ RNA. Bước 3: Gắn DNA lên bề mặt hạt silica: nhờ muối hoạt động hoặc cồn sẽ phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh, cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm [37, 16]. Bước 4: Rửa giải: Giúp loại bỏ tạp chất còn xót trên màng silica gel, ethanol để loại bỏ muối dư. Sau bước này trên màng silica gel chỉ còn gắn DNA sẽ được làm khô cột bằng ly tâm để chắc chắn đã loại bỏ ethanol. Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước Kiểm tra và định lượng DNA Kiểm tra sự có mặt của DNA thực hiện bằng cách điện di sản phẩm tách trên gel agarose 1.2% trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100 V. Điện di mẫu 4 µL sản phẩm tách trộn với 1 µL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X. Các băng DNA được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại. Định lượng nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết bằng cách đo chỉ số OD260/280 (tỷ lệ hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280 nm). Thông thường giá trị OD260/280 khoảng 1.8-2.0 có thể xem DNA tách chiết được là tinh sạch. 2.4.2. Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA. Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương. Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất. Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. 3' - 5' (đây là hoạt tính enzyme cắt mạch DNA từ tận cùng đầu mút theo chiều 3' - 5'). Khi bắt gặp một cặp base bổ sung không chính xác, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều đi của nó và cắt bỏ base không ăn khớp. Sau khi cắt đi base, polymerase có thể lắp lại chính xác base cần thiết và tiếp tục tái bản DNA. Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE, sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm. 2.4.3. Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trình tự chúng tôi tiến hành thu 20 µL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự. Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu. Cách đọc kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp tử. Hình 2.2. Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit 2.4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dùng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, đối với những pic ở đầu và cuối chuỗi thường nhiễu, không rõ ràng sẽ được loại bỏ khỏi chuỗi. Phân tích phát sinh loài được tiến hành với trình tự DNA bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm Mega X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại. Phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân có thể tham khảo trình tự các vùng gen được công bố trên Genbank. Vùng trình tự tham khảo phân tích gồm các loài thuộc chi Hedera và 2 loài thuộc chi Merrilliopanax. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách chiết DNA tổng số Kết quả điện di DNA tổng số từ 10 mẫu nghiên cứu (Hình 3.1) cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi được DNA tổng số thành công với 4 quy trình tách chiết. DNA tổng số từ các mẫu hiện hình với một băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, cho thấy DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác. Hình 3.1. Kết quả DNA tổng số điện di trên gel agarose 1,2% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. Từ mẫu lá khô H.nepalensis được phân lập DNA bằng phương pháp Mini- CTAB, phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit thể hiện ở Bảng 3.1 cho ta thấy rằng nồng độ DNA tổng số có nồng độ dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μL. Cụ thể, phương pháp Mini-CTAB thu hồi được lượng DNA nhiều nhất, trung bình là 437,4 ng/μL. Theo quy trình CTAB cải tiến thu được nồng độ DNA trung bình là 237,7 ng/μL. Tách chiết DNA tổng số từ DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit thu hồi nồng độ DNA trung bình với số lượng lần lượt là 13,7 và 10,6 ng/μL, giá trị này thấp hơn so với quy trình tách sử dụng CTAB và CTAB cải tiến hơn 20 lần. Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu Tên mẫu GeneJET DNeasy Quy trình Quy trình Mini Kit Plant Mini CTAB cải Mini-CTAB Kit tiến H1 6,2 7,3 203,5 361,8 H2 11,7 24,2 215,5 207,2 H3 7,8 25,6 314,6 364,5 H4 11,2 21,9 201,7 536,7 H5 12,4 6,0 251,3 513,5 H6 4,1 9,1 374,7 679,3 H15 17,2 13,3 207,5 402,5 H16 10,7 15,5 57,4 674,5 H21 15,3 14,3 158,3 423,6 HH 9,2 9,4 392,1 210,6 Giá trị 10,6 ± 7,1 13,7 ± 3,9 273,6 ± 100,8 437,4 ± 165,8 trung bình Về mặt lý thuyết, khi kết quả đo OD260/280 trong giới khoảng từ 1,8-2,0 chứng tỏ DNA thu được tinh sạch cao, dưới 1,8 nghĩa là DNA còn lẫn nhiều protein (hay nói cách khác là độ tinh sạch thấp). Độ tinh sạch nồng độ DNA thu được trong nghiên cứu đánh giá thông qua chỉ số hấp thụ quang OD260/280 dao động từ 1,8 đến 2,0. Kết quả này cho thấy DNA đảm bảo độ tinh sạch ở cả 4 phương pháp tách chiết. Kết quả nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày trong Bảng 3.2. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Bảng 3.2. Chỉ số OD260/280 của các mẫu nghiên cứu Tên mẫu GeneJET DNeasy Quy trình Quy trình Mini Kit Plant Mini CTAB cải Mini-CTAB Kit tiến H1 2,02 2,27 2,01 1,77 H2 2,07 2,08 1,83 1,98 H3 2,21 2,26 1,89 2,17 H4 2,15 2,36 1,90 2,02 H5 2,15 2,14 1,71 1,51 H6 1,95 2,12 1,83 1,97 H15 2,34 1,99 1,76 1,63 H16 1,37 1,92 1,79 1,54 H21 1,67 2,67 1,79 1,88 HH 1,81 2,47 1,89 2,14 Giá trị 1,97 ± 0,23 2,23 ± 0,15 1,84 ± 0,09 1,86 ± 0,24 Trung bình 3.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR 3.2.1. Tối ưu quy trình PCR Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi Trong phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR có hiệu suất cao. Vì vậy, dựa vào khuyến cáo của hãng chúng tôi tiến hành tối ưu nhiệt độ trong dải nhiệt bao gồm 8 nhiệt độ khác nhau: 48,2; 50,3; 52,0; 53,8; 55,7; 57,5; 59,2 và 61,6oC; hai mẫu đối chứng luôn được thực hiện bao gồm: một mẫu đối chứng âm, một mẫu chứng dương. Theo như kết quả điện di sản phẩm tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho gen GBSSI thể hiện trong Hình 3.2, cho thấy: ở nhiệt độ từ 48,2oC đến 59,2oC đều lên băng sáng có kích thước khoảng 700 bp, trong đó tại khoảng nhiệt 48,2oC đến 50,3oC có thêm một băng không đặc hiệu bên dưới (kết quả rất mờ, in trên giấy không thấy). Gắn mồi ở 52oC đến 57,5 oC cho băng sản phẩm điện di sáng, đặc hiệu, kích thước phù hợp với lý thuyết (~700 bp). Vì vậy khoảng nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI là từ 52 oC đến 57,5 oC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI. Làn M: Thang chuẩn GeneRuler 100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi (0C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương Kết quả tối ưu nồng độ DNA Nồng độ DNA tối ưu với dải theo cấp số nhân: 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 ng/µL. Hình 3.3 thể hiện kết quả điện di sản phẩm tối ưu nồng độ DNA. Các băng đều sáng, đặc hiệu từ nồng độ 6,25 đến 200 (ng/µL), trong đó có hai băng ở nồng độ 25 (ng/µL) và 50 (ng/µL) cho băng đặc hiệu và sáng nhất. Từ kết quả chúng tôi lựa chọn nồng độ DNA khuôn tối ưu nhất cho phản ứng PCR là 25 (ng/µL). Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI. Làn M: Thang chuẩn GeneRuler 100 bp; Kí hiệu trên các làn: nồng độ DNA (ng/µL); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương Kết quả tối ưu nồng độ mồi: Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI. Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trên các làn: nồng độ mồi (µM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng âm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Nồng độ tối ưu mồi gen GBSSI bao gồm: 0,1; 0,3 và 0,9 µM, Hình 3.4 là kết quả điện di sản phẩm của tối ưu nồng độ của mồi cho gen GBSSI, cho thấy ở nồng độ 0,3 µM thu các băng sáng, đặc hiệu và ổn định nhất nên chọn nồng độ hoạt động tối ưu của mồi là 0,3 µM. 3.2.2. So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích Điều kiện hoạt động (25 µL) (chu trình nhiệt) Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98oC – 30 giây Đệm 5x 1x 5,0 *Lặp lại 35 chu kỳ: o dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5 - Biến tính: 98 C – 10 giây - Gắn mồi: 55,1oC – 30 giây Phusion polymerase 0,02 u/ µL 0,25 - Kéo dài chuỗi: 72oC – 30 2u/ µL giây o Mồi xuôi 0,3 µM 0,75 *Tổng hợp cuối 72 C – 10 phút Mồi ngược 0,3 µM 0,75 *Giữ sản phẩm ở 4oC. DNA khuôn 1,0 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. C D Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau. Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. marker, Làn (-): đối chứng âm. Làn H: sản phẩm PCR từ các mẫu có kí hiệu tương ứng DNA được chúng tôi tiến hành PCR gen GBSSI với 10 mẫu sử dụng DNA khuôn thu được từ 4 qui trình tách chiết DNA khác nhau. Trong đó, quy trình Mini- CTAB cho 3/10 mẫu lên băng là những mẫu H3, H4, H21 (Hình 3.5 A). Quy trình CTAB cải tiến cho hiệu quả nhân dòng gen cao hơn 5/10 mẫu bao gồm mẫu: H2, H3, H4, H6, HH (Hình 3.5 B). Trong khi đó, PCR từ DNA thu được từ cả 2 bộ kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit có 9/10 mẫu lên với băng sáng rõ thể hiện trong Hình 3.5 C và D. Như vậy, hiệu quả nhân dòng gen thông qua PCR từ các mẫu DNA thu được từ kit cao hơn so với mẫu DNA thu được từ quy trình Mini- CTAB và CTAB cải tiến. 3.3. Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại Đã xác nhận được trình tự vùng gen GBSSI của 9/10 mẫu nghiên cứu, có chiều dài khoảng 618 bp. Để nghiên cứu đa hình di truyền gen GBSSI, chúng tôi tiến hành so sánh 9 mẫu nghiên cứu với 15 trình tự của các loài khác trong chi Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4. Bảng 3.4. Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu TT Tên loài/thứ Mã số TT Tên loài/thứ Mã số Genbank Genbank 1 H. algeriensis HQ234505.1 9 H. maroccana HQ234567.1 2 H. azorica HQ234513.1 10 H. nepalensis AY204084.1 3 H. canariensis HQ234518.1 11 H. pastuchovii HQ234576.1 4 H.caucasigena HQ234539.1 12 H. rhombea AY204072.1 5 H. colchica HQ234524.1 13 H. sinensis HQ234572.1 6 H. cypria HQ234526.1 14 M. chinensis AY204086.1 7 H. helix HQ234541.1 15 M. listeri AY204085.1 8 H. hibernica HQ234549.1 Phân loại H.nepalensis và H.sinensis hiện vẫn còn nhiều vấn đề tranh cãi. H.helix và H.nepalensis khác biệt di truyền như thế nào cũng là một câu hỏi cần lời giải. Chính vì vậy, chúng tôi tiên hành so sánh 9 trình tự của các mẫu trong nghiên cứu này với các trình tự đã được công bố trên genbank của H.nepalensis, H.sinensis, H.helix. Kết quả đối chiếu @trình School tự nucleotit of vùng Medicine gen nghiên candứu th ểPharmacy, VNU 31
  40. hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix được thể hiện trong Bảng 3.5. Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu nghiên cứu tương đồng 99.7%, sai khác ở 8/618 nucleotit.Phân làm 3 nhóm, nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 100% giống nhau; nhóm II gồm H3 và HH với 3 nucletit khác biệt với nhóm I ở vị trí 13, 421 và 603 và nhóm III gồm H16, H21 với 1 vị trí nucleotit khác với nhóm I lần lượt tại vị trí 243 và 263. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Hình 3.6. So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [1] H1, H2, H4, H5, H6 - 3 1 1 2 268 268 [2] H3,HH 0.017 - 3 3 3 267 267 [3] H16 0.000 0.017 - 1 3 268 268 [4] H21 0.000 0.017 0.000 - 3 268 268 [5] H.nepalensis.AY204084.1 0.006 0.013 0.006 0.006 - 268 268 [6] H.helix.HQ234541.1 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 - 0 [7] H.sinensis.HQ234572.1 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 - 9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis (AY204084.1) sai khác thấp nhất 2/565 nucleotit với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6 đến 5/565 nucleotit với các mẫu H3, HH. Trình tự của H.helix và H.sinensis trên có sự khác biệt lớn với 9 mẫu nghiên cứu (khác 268/618 với mẫu H1) và H.nepalensis (268/565 nucleotit). Kết hợp với kết quả về khoảng cách di truyền và ở Bảng 3.5 nhận thấy: khoảng cách di truyền giữa các mẫu H.nepalensis ở Việt Nam cho gen GBSSI là không cao. Sự khác biệt di truyền lớn nhất nằm ở mẫu H.helix và H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền đều là 1,91. Hầu như không có sự khác biệt di truyền giữa các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21, H.nepalensis. Chín mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công. Phân tích gen cho thấy có 8 nucleotit sai khác giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp. 3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI Trước khi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại, mô hình tiến hóa đặc trưng cho GBSSI được tính toán bằng phần mềm Mega X. Mô hình tối ưu được xác định là mô hình 3 tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma là thích hợp nhất (BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45), phân tích boostrap với 1000 lần lấy lại mẫu. Mức độ tin cậy được đánh giá theo giá trị bootstrap như sau: mức độ tin cậy cao: >85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: <65%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood của đoạn gen GBSSI. Cây được vẽ theo tỷ lệ, với chiều dài nhánh được đo bằng số lần thay thế mỗi vị trí. Đầu các nút là chỉ số bootstrap thể hiện mức độ tin cậy của nhánh Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Maximum Parsimony trên khung đọc gen GBSSI, bootstrap 1000 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. Với mô hình tính toán, cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) được thể hiện trong Hình 3.7 Kết quả cho thấy, trong 9 mẫu phân tích, chỉ số bootstrap ở các nhánh ở cây thu được có mức độ tin cậy cao (99%). Các mẫu nghiên cứu chia làm 2 nhóm, ngoài HH thì các mẫu còn lại đều cùng tách nhánh với mẫu H.nepalensis, phù hợp với phân loại hình thái. Cây tiến hóa được xây dựng bằng phương pháp Maximum Parsimony được thể hiện ở Hình 3.8 Trên cây, có 17/23 chỉ số bootstrap đạt dưới 70%, các nhóm đều được phân tách các nhánh tương đối giống với cây xây dựng xây dựng bẳng phương pháp Maximum Likelihood (ML). Cây chia làm 2 nhóm lớn với chỉ số bootstrap là 100%. Nhóm I bao gồm H.rhombea, Merrilliopanax chinensis, Merrilliopanax listeri và mẫu HH chỉ số boostrap đạt 89,5%. Nhóm II bao gồm các mẫu nghiên cứu H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, H.nepalensis. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu là khô Dây Thường Xuân từ các quy trình tách chiết khác nhau Các loài thực vật khác nhau cho kết quả thu hồi DNA khác nhau với cùng một phương pháp tách chiết. Vì vậy, không có phương pháp tách chiết nào được cho là tối ưu với tất cả các loài thực vật. Tế bào thực vật khó thu hồi DNA hơn so với các tế bào động vật bởi có lớp thành cellulose bao quanh nên việc phân lập DNA từ các mô thực vật đòi hỏi sự tham gia của các carbohydrat và enzym giúp cho sự ly giải thành tế bào. Bên cạnh đó, sự hiện diện của các polysacharit, polyphenol và các hợp chất thứ cấp khác nhau trong tế bào đặc biệt là các tế bào trưởng thành gây ra trở ngại lớn cho quá trình khuếch đại gen bằng PCR [18]. Do đó, bước đầu tiên trong quy trình phân tích di truyền là chọn phương pháp tách chiết thích hợp nhất với từng loài nghiên cứu. Trong phân tích thực vật, nồng độ DNA cao không phải tiêu chí được ưu tiên hàng đầu mà là độ tinh sạch của DNA. Mẫu DNA phục vụ cho phản ứng PCR yêu cầu độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm protein, polyphenol. Chúng tôi đã lựa chọn 4 phương pháp tách chiết DNA vì những ưu điểm của từng phương pháp, cụ thể như sau. Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) Tách chiết DNA sử dụng CTAB với dung dịch đệm chứa thành phần Tris - HCl 1 M pH 8, EDTA 0,25 M pH 8, NaCl 5 M, những chất này giúp hiệu quả tách chiết DNA cao bởi những một số lí do. Một là, DNA thực vật ổn định ở pH 8.0, trong quá trình phá vỡ, ly giải tế bào axit ở không bào và gian bào sẽ tiếp xúc và làm giảm tính bền của DNA. Vì vậy, Tris - HCl 1 M pH 8 có trong quy trình tách giúp ổn định DNA. Hai là, EDTA là một chelate hấp thụ các ion dương như Mg2+ nhờ đó hạn chế kích hoạt Dnase (loại enzym nuclease thủy phân DNA sợi đơn hoặc sợi đôi). NaCl đã sử dụng để loại bỏ polysacarit và polyphenol trong quá trình tách chiết DNA. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ phương pháp Mini-CTAB cũng đã được báo cáo cung cấp DNA chất lượng trong nghiên cứu đa dạng nguồn gen họ Nhân sâm như nghiên cứu về nguồn gen Đảng sâm tại Việt Nam của tác giả Phạm Thanh Huyền [8], phân loài L.Allium dựa trên chỉ thị ISSR [48]. Bằng cách sử dụng quy trình tách chiết DNA tổng số như trên chúng tôi thu được DNA có nồng độ trung bình cho 10 mẫu nghiên cứu là 437,4 ng/μL, chỉ số OD260/280 trung bình là 1,86. Kết quả về số lượng và chất @ lượng School DNA tách of chiết Medicine được tốt, khả and năng Pharmacy, VNU 37
  46. nhân dòng gen GBSSI cho kích thước đúng như dự đoán, các băng sáng rõ không có băng phụ cho hiệu suất rất thấp chỉ có 3/10 (30%) mẫu nhân dòng đoạn gen đích thành công. Như vậy, mặc dù nồng độ DNA tách chiết thu được là nhiều nhất, nhưng tồn dư nhiều tạp chất khiến DNA tách chiết không đủ chất lượng cho phản ứng PCR. Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) Quy trình CTAB cải tiến khác với Mini-CTAB bởi bổ sung Rnase và mercaptoethanol với mục đích loại RNA và phenol có trong sản phẩm tách chiết. Kết quả nồng độ DNA và chỉ số OD260/280 thu được lần lượt là 237,7 ng/μL và 1,84, tương đương với quy trình Mini-CTAB. Tuy nhiên, CTAB cải tiến lại hiệu quả cao hơn khi thực hiện khuếch đại đoạn gen GBSSI với 5/10 mẫu thành công lớn hơn 3/10 mẫu theo quy trình Mini-CTAB. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu so sánh 2 quy trình đã được thực hiện trên chi Hành (L.Allium roseum) thuộc họ Nhân Sâm (Aliaceae). Theo đó, quy trình CTAB cải tiến với quy trình bổ sung mercaptoethanol được đánh giá là hiệu quả hơn với chỉ số OD260/280 là 1,804 ± 0,031 so với giá trị 1.667 ở quy trình Mini-CTAB [24]. Kết quả nồng độ DNA tách chiết từ quy trình CTAB cải tiến có nồng độ DNA giảm (xấp xỉ 50%) so với quy trình Mini-CTAB, phản ứng PCR hiệu quả hơn cho thấy chất lượng DNA được cải thiện hơn. Quy trình tách DNA theo bộ kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Ngày nay, sử dụng kit thương mại trong tách chiết DNA là lựa chọn hàng đầu bởi hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng thao tác, hạn chế được việc sử dụng các hóa chất độc hại và có thể ứng dụng trên một số lượng lớn các mẫu, các loài khác nhau. Chúng tôi so sánh thử nghiệm 2 bộ kit đến từ các hãng nổi tiếng là DNeasy Plant Mini Kit từ Đức và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit từ hãng Thermo của Mỹ. Kết quả nồng độ DNA thu được chênh lệch đáng kể (thấp hơn 20 lần) so với quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến, nhưng DNA tổng số có chất lượng tốt thể hiện trong kết quả phản ứng khuếch đại đoạn gen GBSSI. Bộ Dneasy hiệu quả nhất về thời gian nhưng có giá thành cao nhất trong số các phương pháp được thử nghiệm, kit DNeasy có giá thành gấp 3 lần so với kit Thermo, trong khi hiệu suất nhân dòng đoạn gen GBSSI chiếm 9/10 mẫu tương đương với kết quả khi sử dụng bộ kit Thermo. Các kit thương mại có ưu điểm tuy nồng độ DNA thu hồi không cao nhưng @ có Schoolkhả năng lo ofại b ỏMedicine hiệu quả các tạandp chấ tPharmacy, VNU 38
  47. như các polysacharit, protein, Điều này cũng giải thích tại sao hiệu quả nhân dòng gen bằng PCR của DNA thu từ kit cao hơn hẳn quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến. Chính vì vậy, tại thời điểm hiện tại kit Thermo là bộ kit tách chiết hiệu quả và kinh tế nhất cho mẫu lá khô Dây Thường Xuân. Chất lượng DNA được đánh giá không chỉ dựa vào độ tinh sạch và nồng độ DNA thu được mà còn dựa vào khả năng nhân dòng thành công đoạn gen đích trong phản ứng PCR. Dựa vào nghiên cứu của Adam F. Green và cộng sự trong nghiên cứu gen GBSSI trên chi Hedera, chúng tôi lựa chọn mồi GBSSI 10F và GBSSI – 11R và sản phẩm thu được trên các mẫu nghiên cứu của chúng tôi kích thước khoảng 700 bp. Sản phẩm PCR đoạn gen GBSSI trong nghiên cứu của Adam F. Green dài khoảng 540 bp và chỉ thị này được chứng minh hữu ích trong phân loại một số loài trong họ đoạn gen GBSSI [23]. 4.2. Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân Khi so sánh hai phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên hai phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum parsimony), hợp lý tối đa (Maximum Likelihood) trên khung đọc gen GBSSI đều cho kết quả khá tương đồng nhau. So sánh giữa hai phương pháp xây dựng cây phát sinh loài cho thấy phương pháp Maximum Likelihood có chỉ số boostrap cao (99%), phương pháp Maximum parsimony có 6/23 nhánh đạt chỉ số boostrap cao (chiếm 26%) chỉ số tin cậy ở gốc nhánh. Các kết quả đều cho thấy mẫu H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21 là loài H.nepalensis. Dựa vào kết quả cây phát sinh có thể nhận thấy, loài H16 khác loài H.nepalensis được công bố trên ngân hàng Genbank tại 3 vị trí nucleotit số 243 (T=>C), vị trí 369 (A=>T) và vị trí 368 (A=>C); loài H21 khác tại 3 vị trí là vị trí nucleotit số 263 (T=>C), vị trí 368 (A=>T) và vị trí 269 (A=>C). Đặc biệt loài H3 có 5 vị trí khác biệt tại nucleotit thứ 13, 368, 369, 420, 603. Như vậy, các vị trí này có thể là các vị trí đặc trưng riêng cho loài H.nepalensis Việt Nam hoặc đây có thể là các vị trí có liên quan đến việc hình thành thứ loài mới tại Việt Nam. Nghiên cứu của chúng tôi đã góp phần bổ sung số liệu của phân loại một số loài thuộc chi Hedera. Cụ thể, phân loại được loài H.nepalensis tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc, Việt Nam với những loài H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis, H.Hibernica. Từ đó, có thể bước đầu kết luận rằng, GBSSI là một chỉ thị hữu ích giúp phân loại loài H.nepalensis với các loài khác trong chi @Hedera. School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  48. Loài Dây thường xuân với tên khoa học là Hedera nepalensis K. Koch được mô tả và đặt tên theo hệ thống phân loại lần đầu tiên bởi tác giả K. Koch vào năm 1853. Năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là Hedera sinensis vào cùng loài H.nepalensis, và cho rằng loài Hedera nepalensis K. Koch là một tên đồng danh của Hedera sinensis. Tuy nhiên đến năm 2002, Jun Wen khi nghiên cứu về đặc điểm hình thái và di truyền của chi Hedera trên thế giới đã cho rằng loài Hedera nepalensis có 2 thứ H.nepalensis var.sinensis và H.nepalensis var.nepalensis. Theo hình thái, thứ H.nepalensis var.nepalensis và thứ var.sinensis được phân biệt dựa trên hai đặc điểm bao gồm số lượng thùy (5 trong var.nepalensis và 3 trong var.sinensis) và số lượng thùy bên (nhiều trong var.nepalensis và hầu như không có trong var.sinensis). Tuy nhiên, một số mẫu của H. nepalensis var.sinensis cho thấy sự thay đổi về số lượng thùy lá (từ 3 đến 5). Sự trùng lặp xảy ra giữa H.nepalensis var.nepalensis và var.sinensis vì các đặc điểm được sử dụng để phân biệt giữa chúng không nhất quán [14]. Để giải quyết khó khăn trong phân loại hình thái, phân tích dựa trên các chỉ thị di truyền là công cụ hữu ích và có độ chính xác cao. Trong phân tích đa dạng di truyền, hai thứ loài này được phân biệt bởi sự khác biệt ở mức độ đa dạng. Và theo cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi chỉ thị GBSSI, có thể nhận thấy H.nepalensis và H.sinensis tách làm 2 nhánh với mức độ tin cậy cao ở nhánh H.nepalensis (99%). Qua đó, có thể kết luận sơ bộ rằng chỉ thị phân tử GBSSI có khả năng giải quyết khó khăn trong phân loại hình thái 2 loài này. Để cung cấp thêm thông tin về đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân, các chỉ thị phân tử khác như chỉ thị ITS (gen nhân) hay matK (gen lục lạp), cũng cần được khảo sát. Cho đến nay, đã có rất nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát triển chỉ thị DNA khác nhau phục vụ cho nghiên cứu và chọn lọc ở thực vật. Mỗi kỹ thuật đều có những ưu và nhược điểm. Đối với nghiên cứu đa dạng di truyền, các chỉ thị cần có một số đặc điểm như: phải là chỉ thị đơn giản và nhanh về mặt kỹ thuật, giá thành rẻ, cần lượng mẫu và DNA ít, cho nhiều thông tin, có thể lặp lại trong các nghiên cứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm lượng thông tin cao), không cần biết trước thông tin về genome và cơ thể [12]. Dữ liệu trình tự từ GBSSI đã được sử dụng để suy luận sự phát sinh chủng loại cho họ Nhân sâm (Araliaceae). Vùng khuếch đại bao gồm exon 10 và 11 cùng với intron ở giữa. Mức độ biến đổi dưới loài là thấp (-2%) so với mức độ giữa các chi (4-5%) trong họ Araliaceae châu Á. Phân tích phát sinh loài với gen GBSSI phần @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  49. lớn phù hợp với các phân tích trước đây dựa trên chỉ thị ITS (DNA ribosom) và dữ liệu ndhF (DNA lục lạp) [23]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
  50. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu thu được, tôi rút ra một số kết luận chính như sau: DNA được phân lập bằng GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) có hiệu quả cao hơn so với phương pháp Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) và DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức). Gen GBSSI đã được nhân dòng thành công và cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên chỉ thị này bước đầu cho thấy các mẫu Dây tường xuân thu thập tại một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam thuộc loài H.nepalensis. 2. Kiến nghị Hướng đến chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu tại Việt Nam, giúp đưa nguồn dược liệu chất lượng tốt tạo thành thành phẩm thuốc phục vụ cộng đồng trong phòng và điều trị bệnh hiệu quả, tôi có một số kiến nghị như sau: - Mở rộng nghiên cứu phân tích đa dạng nguồn gen dựa trên một số chỉ thị khác như chỉ thị DNA lục lạp, chỉ thị DNA ribosom để cung cấp thêm thông tin về quan hệ di truyền và tiến hóa của nguồn gen. - Tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học để tìm hoạt chất có hoạt tính dược lý kết hợp với nghiên cứu đa dạng nguồn gen để lựa chọn giống cây có chất lượng tốt nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 42
  51. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân(2003),Danh lục các loài thực vật Việt Nam tập 2,NXB. Nông nghiệp,Hà Nội, 2. Đỗ Huy Bích(2007),Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,660-661. 3. Võ Văn Chi(1999),Cây cỏ có ích ở Việt Nam,Nhà xuất bản Giáo Dục,711. 4. Nguyễn Anh Diệp, Ninh Trần, Nguyễn Xuân Quỳnh(2007),Nguyên tắc phân loại sinh vật,NXB Khoa học và Kĩ thuật, 5. Hoàng Đăng Hiếu(2012),"Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh",12-14. 6. Nguyễn Hiếu(2017),"Đa dạng sinh học ở Việt Nam, thực trạng và thách thức",4-17. 7. Lê Thị Thanh Hương(2016),"Nghiên cứu tri thức và kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của các dân tộc thiểu số ở tỉnh thái nguyên để bảo tồn và phát triển bền vững",VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology,32(1),55-64. 8. Phạm Thanh Huyền,Đoàn Đinh Long(2017),"Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD- PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam",Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,33(1),32-39. 9. Võ Thị Thương Lan(2007),Một số vấn đề của sinh học phân tử,NXB Đại học Quốc gia Hà Nội,86-88. 10. Đinh Đoàn Long,Đỗ Lê Thăng(2009),Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào,NXB Đại học Quốc gia Hà Nội,Hà Nội,325-355. 11. Trần Đức Lương,Đặng Thanh Ngọc(2018),"Thực trạng và xu hướng phát triển của phân loại học sinh vật",KH&CN nước ngoài,2(62-64. 12. NguyễnĐức Thành(2014),"Các kĩ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật",Tạp chí sinh học,36( 265-294. Tiếng Anh 13. Abdel-Dayem, Rasool M. S, Elgharbawy I, Nagel A. A , Aldhafer P(2018),"Faunistic inventory and zoogeographical analysis of the ground beetles (Coleoptera, Carabidae) of Garf Raydah Nature Reserve, Southwestern of Saudi Arabia, and description of a new species of Paussinae",Zootaxa,4514(3),341-371. 14. Ackerfield J,Wen J(2002),"A morphometric analysis of Hedera L.(the ivy genus, Araliaceae) and its taxonomic implications",Adansonia,24(2),197- 212. 15. Adamowicz SJ, Chain FJ, L. Clare E., DeinerK., al et(2016),"From Barcodes to Biomes: Special Issues from the 6th International Barcode of Life Conference",Genome,59(11),5-9. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. 16. Barisik Murat(2014)," Size Dependent Surface Charge Properties of Silica Nanoparticles",J. Phys. Chem. C,118(4),1836–1842. 17. Carlos,Herrera M(1987),"Vertebrate‐dispersed plants of the Iberian Peninsula: a study of fruit characteristics",Ecological monographs,57(4),305-331. 18. Cota-Sánchez, Remarchuk K, Ubayasena K(2006),"Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue. Plant Molecular Biology Reporter",24(161-167. 19. Cowan RS, Chase M W, Kress WJ, Savolainen(2006),"300,000 Species to Identify: Problems, Progress, and Prospects in DNA Barcoding of Land Plants",Taxon,55(3),611. 20. Elizabeth,Czarapata J(2005),"Invasive plants of the upper Midwest: an illustrated guide to their identification and control,"Univ of Wisconsin Press,43 - 45. 21. Feike, Richard G V, Anne S P, Evert, J Will(1991),"Sequence of the structural gene for granule-bound starch synthase of potato (Solarium tuberosum L.) and evidence for a single point deletion in the amf allele",Molecular and General Genetics MGG,228(2-2),240-248. 22. Ghias Uddin Ashfaq Ahmad Khan, Muhammad Alamzeb, Saqib Ali, Mamoon-Ur-Rashid Anwar Sadat, Muhammad Alam, Abdul Rauf, Wali Ullah (2012),"Biological screening of ethyl acetate extract of Hedera nepalensis stem",African Journal of Pharmacy and Pharmacology,6(42),2934-2937. 23. Green A F, Ramsey Tara S, Justin Ramsey(2011),"Phylogeny and biogeography of ivies (Hedera spp., Araliaceae), a polyploid complex of woody vines",Systematic Botany,36(4),1114-1127. 24. Guetat A,Mirza B(2009),"A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from Allium roseum L. (Alliaceae)",8(17),4020- 4024. 25. Hammad I, Ammara R, Haq Ihsan-ul, Jafri Laila, Ullah Nazif, Dilshad Erum, et al.(2017),"Five Indigenous Plants of Pakistan with Antinociceptive, Anti- Inflammatory, Antidepressant, and Anticoagulant Properties in Sprague Dawley Rats",Evid Based Complement Alternat Med. ,2017(1-10. 26. Hashmi W, Ismail H, Mehmood F, Bushra Mirza(2018),"Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ+ AlCl 3 induced rats model",DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,26(2),179-190. 27. Hashmi Waleed Javed, Ismail Hammad, Mehmood Furrukh, Mirza Bushra(2018),"Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ+ AlCl 3 induced rats model",DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,26(2),179-190. 28. Hebert P D, ACywinska, Ball S L, deWaard J R(2003),"Biological identifications through DNA barcodes",Proc Biol Sci,270(1512),313-321. 29. Jafri L, Saleem S, Kondrytuk T P, Haq I U, Ullah N, Pezzuto J M, et al.(2016),"Hedera nepalensis K. @ Koch: School A Novel of Source Medicine of Natural and Cancer Pharmacy, VNU
  53. Chemopreventive and Anticancerous Compounds",Phytother Res,30(3),447- 453. 30. Jafri Laila,Saleem Samreen(2017),"In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K. Koch",Arabian Journal of Chemistry,10(2),3699-3706. 31. Jia Min Xiang,A Hickey Donal(2007),"Assessing the effect of varying sequence length on DNA barcoding of fungi",Molecular Ecology Notes,7(3),365-373. 32. Jian G, Liangb Dong, Wanga Yunfei, Luc Charles, Wua Xifeng(2004),"Effects of N-acetyl transferase 1 and 2 polymorphisms on bladder cancer risk in Caucasians",Genetic Toxicology and Evironmental Mutagenesis, 97-104. 33. Kress W J,Erickson L D(2007),"A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region",PLoS one,2(6),508. 34. Kress W J, Kenneth J Wurdack, Elizabeth A Zimmer, Weigt A L, Janzen H(2005),"Use of DNA barcodes to identify flowering plants",Proceedings of the National Academy of Sciences,102(23),8369-8374. 35. Laila J, Samreen S, Ihsan-ul-Haq, Ullah Nazif, Mirza Bushra(2017),"In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K. Koch",Arabian Journal of Chemistry,10(2),3699-3706. 36. Li T, Pan H, Feng Y, Li H, Zhao Y(2015),"Bioactivity-guided isolation of anticancer constituents from Hedera nepalensis K. Koch",South African Journal of Botany,100(87-93. 37. Liu Lingling, Guo Zilong, Huang Zhenzhen, Zhuang Jiaqi, Yang Wensheng(2016),"Size-selective separation of DNA fragments by using lysine-functionalized silica particles",Scientific Reports,6(22029. 38. Merlo D J,Kemp J D(1976),"Effect of polysaccharides on kinetics of DNA",Plant Physiol,58(1522-1526. 39. Mitchell A,Wen J(2004),"Phylogenetic Utility and Evidence for Multiple Copies of Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) in Araliaceae",Taxon,53( 29-41. 40. Murray M G,William W F Thompson(1980),"Rapid isolation of high molecular weight plant DNA",Nucleic acids research,8(19),4321-4326. 41. Nida M B A, Shumaila B, Sadiq A(2012),"Biological screening of Hedera nepalensis",Medicinal Plants Research,6(39),5250-5257. 42. Paul D, Prenzler S L, Hassan K O(2012),"Bioprospecting traditional Pakistani medicinal plants for potent antioxidants",Food Chemistry,132(222- 229. 43. Ralf,Dahm(2008),"Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research",Human genetics,122(6),565-581. 44. S. Saleem, L. Jafri, I. ul Haq, al et(2014),"Plants Fagonia cretica L. and Hedera nepalensis K. Koch contain natural compounds with potent @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory activity",J Ethnopharmacol,156(26-32. 45. Sang T(2002),"Utility of low-copy nuclear gene sequences in plant phylogenetics",Crit Rev Biochem Mol Biol,37(3),121-47. 46. Scott O R,Bendich A J(1985),"Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues",Plant molecular biology,5(2),69-76. 47. Steven G N,Subramanyam R(2009),"Testing plant barcoding in a sister species complex of pantropical Acacia (Mimosoideae, Fabaceae)",Molecular ecology resources,9(172-180. 48. Treu R, Holmes D S, Smithn B M(2001),"Allium ampeloprasum var. babingtonii (Alliaceae): an isoclonal plant found across a range of habitats in SW England",Plant ecology,155(2),229-235. 49. Waters D L,Shapter F M(2014),"The polymerase chain reaction (PCR): general methods",Methods Mol Biol,1099(65-75. 50. Jian Gua Dong Liangb , Yunfei Wanga, Charles Luc, Xifeng Wua(2004),"Effects of N-acetyl transferase 1 and 2 polymorphisms on bladder cancer risk in Caucasians",Genetic Toxicology and Evironmental Mutagenesis, 97-104. 51. Bashir Amad Nida Munir, Shumaila Bashir, Sadiq Azam, Ibrar Khan, Mohammad Ayub(2012),"Biological screening of Hedera nepalensis",Medicinal Plants Research,6(39),5250-5257. 52. Hill D M, Bull J J (1993) “An empirica test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phy ogentic ana ysis”Systematic Biology, 42 (2), 182-192. WEB 53. Ngày truy cập 01/05/2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU