›

Khóa luận Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

pdf 65 trang thiennha21 18/04/2022 2471
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_chiet_xuat_phan_lap_xac_dinh_cau_truc_mot_so_hop_c.pdf

Nội dung text: Khóa luận Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI (Eclipta alba) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: ĐINH THỊ NGUYỆT ÁNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI (Eclipta alba) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: 1. Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh 2. PGS.TS. Dương Thị Ly Hương Hà Nội – 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu. Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bài luận văn này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Dược Liệu cùng gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Dương Thị Ly Hương, PGS.TS. Đỗ Thị Hà, Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh, TS. Trần Thanh Hà cùng các cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng 3 năm 2019 Sinh viên Đinh Thị Nguyệt Ánh
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Dicloromethan DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DM Dung môi DMSO Dimethyl sulfoxide DL/DM Tỉ lệ dược liệu/dung môi ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (Electronspray Ionization Mass Spectrum) EtOAc Etylacetat HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear Single Quantum Coherence) MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) SKĐ Sắc ký đồ TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra violet- Visible)
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton 19 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin 20 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat 22 Hình 1.1. Cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 3 Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid 5 Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan 5 Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid 6 Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol 6 Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1 7 Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 8 Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen 8 Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi 15 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của Cỏ nhọ nồi 16 Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc 17 Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc 17 Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc 17 Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton) 18 Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) 21 Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất N03 (Methyl gallat) 23
  6. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về họ Cúc (Asteraceae) 2 1.2. Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 2 1.2.1. Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 2 1.2.2. Đặc điểm thực vật Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 3 1.2.3. Thành phần hóa học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 4 1.2.4. Tác dụng sinh học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Đối tượng 12 2.2. Hoá chất, thiết bị 12 2.2.1. Hoá chất 12 2.2.2. Thiết bị 12 2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 13 2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập 13 2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 14 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl acetat 15 3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi 15 3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi 16 3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi 18 3.2.1. Biện luận cấu trúc N01 18 3.2.2. Biện luận cấu trúc N02 20 3.2.3. Biện luận cấu trúc N03 21
  7. 3.3. Bàn luận 23 3.3.1. Về chiết xuất 23 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất 23 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  8. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới rất thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại cây thuốc. Với sự đa dạng, phong phú về cây thuốc đã tạo ra nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý báu cho nước ta. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp như: cảm, sốt, chảy máu, đau bụng, Đó là những bài thuốc được sử dụng rất phổ biến và được truyền lại từ đời này sang đời khác. Tuy nhiên những bài thuốc này mới chỉ dựa trên kinh nghiệm của cha ông ta mà chưa có cơ sở về khoa học. Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã đi sâu vào nghiên cứu làm sáng tỏ các thành phần, cấu trúc, tác dụng, của các loài cây thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Trong các nghiên cứu y dược hiện đại, các hợp chất hữu cơ từ các cây thuốc như flavonoid, saponin, alkaloid, coumarin, . là những nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng để thử hoạt tính sinh học, phục vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là y học. Một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền là cây cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cây cỏ mực. Cỏ nhọ nồi là dược liệu được nghiên cứu rất nhiều cả trong nước và quốc tế như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Thái Lan, với nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng nấm, cầm máu, chống ung thư và sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như: nôn, chảy máu cam, rụng tóc, suy nhược thần kinh, nấm, viêm loét, lở ngứa, ban chẩn, [2] Trước sự đa dạng về cấu trúc lý hóa, hoạt tính sinh học cũng như mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng, để hiểu được rõ hơn về vai trò của từng hợp chất có trong cỏ nhọ nồi và đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc, ta cần tiếp tục tiến hành tách chiết và xác định cấu trúc của các thành phần hóa học đặc biệt và các thành phần chưa được phân lập trong cây, từ đó đặt tiền đề để nghiên cứu thêm về tác dụng, hoạt tính sinh học của các hợp chất này. Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ nhọ nồi, chúng tôi thực hiện đề tài: “Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)” với 2 mục tiêu: 1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Ethyl acetat. 2. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn Ethyl acetat. 1
  9. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae) Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida ), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae ) là họ l ớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23. 000 loài. Chúng thường tập trung chủ yế u ở đ ồng c ỏ và thảm thự c vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệ t đới ẩm v ới độ cao thấp. Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực vật được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trên thế giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8]. Các loài thuộc họ Cúc có các đặ c đi ểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín [1] . Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa th ứ cấp phong phú và đa dạng , s ự phát triển của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ . Nguồn thông tin về các hợp chất này r ất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt của các hợp ch ất hóa học cụ th ể ho ặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ phân loại ở phân họ và c ấp thấp hơn [ 8]. 1.2 T ổng quan về cây Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba) 1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ n ồi (Eclipta alba) Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta alba ho ặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae ) [ 1] , [2 ]. Theo “Từ điển cây thuốc Vi ệt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoli ophyta Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp Cúc: Asteridae Bộ Cúc: Asterales Họ Cúc: Asteraceae Loài: Eclipta alba 2
  10. 1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [2] Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục, đôi khi hơi đỏ tía, phủ lông cứng. Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục – thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở cả hai mặt. Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ở nách lá hoặc ở ngọn cành. Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lông tơ ở mặt lưng. Đế hoa lồi, rộng 1 cm. Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡi nhỏ, màu trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5 thùy. Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen. Hình 1.1. Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [12] Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất. Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô. Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11. Mọc hoang ở chỗ ẩm mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m. Phân bố phổ biến khắp nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á, châu Phi. 3
  11. Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn. Quy kinh vào can và thận. Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc. Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêm gan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da. Còn dùng làm thuốc trong viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc. 1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids, triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol, .Trong lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7- glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol. Rễ chứa hentriacontanol và heptacosanol [15]. Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất n- hexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit triterpenic và wedelolactone [23]. a. Alkaloid Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính sinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine. Năm 1998, M. S. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid. Alkaloid chính được xác định là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)-verazine (2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25β-hydroxyverazine (7) và 25β-hydroxyverazine (8) [4]. 4
  12. 1 R1=R2=H 2 R1=R2=H 6 R1=OH, R2=H 5 R1=OH, R2=H 8 R1=H, R2=OH 7 R1=H, R2=OH 3 4 Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid b. Coumestan Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật. Wedelolactone (9), demethylwedelolactone (10), demethyl-wedelolactone-7- glucosid (11) là các coumestan chính phân lập được từ cỏ nhọ nồi [33]. 9 R=CH3 10 R=H 11 R=Glc Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan 5
  13. c. Flavonoid và Sterol Các flavonoid được tìm thấy trong cỏ nhỏ nồi là apigenin (12), luteolin (13), luteolin-7-glucoside (14) và quercetin (15). Các sterol hiện diện trong cỏ nhọ nồi là phytosterol, glucoside của phytosterol, daucosterol (16), β-sitosterol (17), stigmasterol (18) và stigmasterol-3-O-glycoside (19) [56]. 12 13 R1=H, R2=H 14 R1=Glc, R2=H 15 R1=H, R2=OH Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid 16 R=Glc 18 R=H 17 R=H 19 R=Glc Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol 6
  14. d. Saponin triterpen Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53]. Năm 1997, S. Yahara và cộng sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (21- 24) [55]. Năm 2008, M. K. Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III (26-28) và eclalbasaponin V (29) [40]. 25 20 R1=Glc, R2=H, R3=Ara 28 R1=Glc, R2=Glc 26 R1=Glc, R2=OH, R3=Glc 29 R1=SO3H, R2=H 27 R1=Glc, R2=OH, R3=H Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1 7
  15. 21 R=H 22 R=H 23 R=SO3H 24 R=SO3 Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 e. Dẫn xuất thiophen và polyacetylen Năm 1966, F. Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ nhọ nồi. Cùng năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba. Năm 1985, P. Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34). 30 31 32 33 34 Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen 8
  16. f. Tinh dầu Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2- pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene, phytol, octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid, (Z) -7,11- dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9-tetramethyl-1,4,7- cycloundecatriene. D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc α-terthienyl aldehyd, α- terthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31]. 1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) a. Tác dụng giảm đau, chống viêm Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid toàn phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều 150mg/kg, 250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống. Tác dụng giảm đau này có hiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47]. Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã được nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng. Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường uống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin (10mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) [9]. b. Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta alba và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn. Các nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại Staphylococcus aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18]. Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Hoạt tính kháng nấm in vitro của dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29]. 9
  17. c. Tác dụng bảo vệ gan Dịch chiết ethanol /nước (1:1) củ a Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl 4 và điều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan ( amidopyrine -N- demethylase và glucose -6-phosphatase liên kết màng ). Nghiên cứu cho thấy rằng hoạt động b ảo vệ gan củ a Eclipta alba là sự điều chỉnh m ức độ của các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan . Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8% và 47 ,96 % enzyme lysosomal . Từ dịch chiết methanol của lá , triterpenoid eclabasaponin làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60, 65% lư ợng CCl4 làm tăng enzyme lysosomal trong máu . Coumestan và saponin triterpenoid từ dịch chiết chloroform của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41 % nồng độ CCl4. Eclipta alba được báo cáo là có tác dụ ng bảo vệ đối với tổn thương gan cấp tính do CCl4, bằng cách làm giảm hoại tử, thoái hóa c ủa các tế bào nhu mô gan [48 ], [50]. d. Tác dụng lên thần kinh và chống độc Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng dịch chi ết Eclipta alba với liều 300 mg/kg cho thấy hoạt động của các chất cải thiện kh ả năng hoạt động củ a hệ thần kinh ở chuột [ 51 ]. Chiết xuất ethyl acetate của Eclipta alba và wedelolactone đã chứng minh hoạt tính chống tăng huyết áp và chống lại nọc độc rắn Malaya Pit Viper [ 44]. Hoạt tính chống sốt rét của dịch chiết từ lá Eclipta alba đã được đánh giá là chống lại chủng Plasmodium berghei ANKA ở chuột [10]. e. Hoạt động diều hòa miễn dịch Các nghiên cứu sơ bộ đã cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch của dịch chiế t methanol của Eclipta alba. Wedelolactone và demethylwedelolactone, được phân lập từ Eclipta alba đã chứng minh tác dụng ức chế trypsin. Cả hai hợp chất cho thấy hoạt động mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,9 và 3, 0 μg/ml, tương ứng. Eclipta alba có tác dụng bảo vệ các mô thần kinh có thể là do hoạt động điều hòa miễn dịch củ a Eclipta alba. Do đó, Eclipta alba có thể phục vụ như một bộ điều biến bộ nhớ tiềm năng . Thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính điều hòa miễn dịch của dịch chiết metanol của toàn bộ cây Eclipta alba ở năm mức liều từ 100 đến 500 mg/kg làm tăng đáng kể chỉ số thực bào và hiệu giá kháng thể và tỷ lệ F của chỉ số thực bào và số lượng bạch cầu cũng tăng [32]. 10
  18. f. Hoạt động chống ung thư Dịch chiết methanol của Eclipta alba được đánh giá là hoạt động chống ung thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng. Hoạt động chống ung thư được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số lượng tế bào khối u, số lượng tế bào khối u còn sống, số lượng tế bào khối u không thể sống, thời gian sống trung bình và tăng tuổi thọ trong các mô hình động vật thí nghiệm. Dịch chiết làm tăng tuổi thọ của chuột được điều trị EAC và khôi phục các thông số huyết học so với chuột mang EAC [25]. Coumestans cũng được biết là hoạt động như phytoestrogen. Ở nhiều nước, nó được sử dụng như chế độ ăn uống đóng vai trò là tác nhân phòng ngừa hóa học trong ung thư vú và tuyến tiền liệt. Dasyscyphin-C (saponin) một hợp chất phân lập mới từ Eclipta alba được báo cáo với hoạt tính chống ung thư - gây độc tế bào [40]. g. Ngăn rụng tóc, kích thích mọc tóc Eclipta alba được sử dụng trong các chế phẩm dưỡng tóc vì nó thúc đẩy mọc tóc và duy trì độ đen của tóc. 10% w/v của Eclipta alba là thành phần chính trong việc điều chế công thức thảo dược hỗ trợ cho sự phát triển của tóc. Eclipta Alba là một loại thảo dược phổ biến để kích thích sự phát triển của tóc. Dịch chiết ether và dịch chiết ethanol đã được phối hợp vào dạng kem (nước trong dầu) và bôi tại chỗ trên da bị bong tróc của chuột bạch tạng trong một thử nghiệm. Thời gian cần thiết để bắt đầu phát triển tóc cũng như hoàn thành chu kỳ tăng trưởng tóc được ghi lại. Dung dịch Minoxidil 2% được áp dụng tại chỗ và đóng vai trò chứng dương để so sánh. Kết quả điều trị với dịch chiết ether 2% và 5% tốt hơn so với minoxidi 2% (chứng dương) [46]. h. Tác dụng hạ đường huyết Về tác dụng hạ đường huyết, sử dụng Eclipta alba qua đường uống trong 2 tháng đã được chứng minh là làm giảm glucose máu, glycosylated hemoglobin HbA1c, giảm hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase, và tăng hoạt động của hexokinase gan. Eclipta alba đã được chứng minh có hoạt động trị tiểu đường và lợi tiểu bằng cách tác động lên tuyến tụy nhờ phục hồi và tái tạo hoạt động tế bào β của tụy [8]. 11
  19. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nh ọ n ồi Eclipta alba được thu hái từ tỉnh Thanh Hóa , trong tháng 06/2018. Dược liệu thu về được sấy khô ở nhi ệt độ 50-600C đạt độ ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer để nơi khô ráo, tránh ẩm. 2.2 Hóa chất, thiết bị 2.2.1 Hóa chất - Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dicloromethan, aceton. - Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng đ ể phát hiện viết chất trên bản mỏng. - Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). - Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck). - Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%. 2.2.2 Thiết bị - Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi). - Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml. - Tủ sấy Memmert, Binder-FD115. - Máy siêu âm Power sonic 405. - B ếp điện, bếp cách thủy Memmert. - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array. - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo hàm ẩm. - Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV. 12
  20. - Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dung tích 250ml, 500ml, 1000 ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh , ống đong , ống nghiệm các kích thư ớc, 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập - C ỏ nh ọ n ổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol, sau đó lọc loại bã dược liệu và gộp dịch chiết. Tiếp theo cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc toàn phần. - Cao toàn phần đư ợc phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dầ n n-hexan , ethyl acetat thu được các phân đoạn tương ứng. - P hân lập các hợp chấ t bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong dung môi. Tiến hành quá trình sắc ký cột: + Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải. + Chu ẩn bị c ột: cột sắc ký khô , s ạch, l ắp thẳng đứng trên giá cố định. Nhồi một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc có mỏ , thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí. Đưa t ừ từ hỗn hợp chất nhồi cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí. Sau đó, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột ổ n định. + Nạp mẫu: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều trên mặt cột. Sau đó, đặt một miếng bông lên để bảo vệ b ề m ặt cột. + Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải. - Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng , tiến hành trên bản m ỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. - Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau. Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp. 13
  21. 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc Cấu trúc các hợp chất được xác định thông qua sự kết hợp của các phương pháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý (điểm nóng chảy). Các phương pháp phổ được dùng phổ biến trong xác định cấu trúc là phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance - NMR). - Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3]. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) 1 13 lẻ ( H, C ) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3]. Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cỏ nhọ nồi là: - Điểm nóng chảy. - Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC. 14
  22. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl acetat 3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 700C, mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8. Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suất giảm thu được cao tổng NTP (288,3 g). Phân tán 280g NTP vào 2l nước sau đó lắc phân đoạn với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, 3 lần với mỗi dung môi. Gộp dịch chiết và cô dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan (NH: 20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g) được biểu diễn như Hình 3.1. Bột Cỏ nhọ nồi (2kg) 1. Chiết với MeOH, 700C, 3 lần 2. Lọc lấy dịch 3. Cô quay Cao tổng (NTP) (288,3g) 1. Phân tán cao trong nước 2. Lắc phân đoạn lần lượt với n-hexan (x3), EtOAc (x3) Cao n-hexan (NH) Cao EtOAc (NE) Cao nước (NW) (20,6g) (60,9g) (197,3g) Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi 15
  23. 3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là: NE1-7. Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH (10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4. Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu được hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg). Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiến hành tiến hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu được hợp chất N03 (48 mg). NE (60g) CC: pha thường DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) NE1 NE4 (5,3g) NE7 CC: pha thường DM: DCM/MeOH (10/1) NE4.1 (1,9g) NE4.2 (1,1g) NE4.3 NE4.4 CC: pha thường CC: pha thường DM: DCM/MeOH DM: DCM/MeOH (8/1) (8/1) N03 (48mg) N01 N02 (426mg (112mg) ) Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi 16
  24. N01 NE N01 NE N01 NE UV 254nm UV 366nm TT H2SO4 10%/Ethanol DM: DCM/MeOH: 8/1 Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc N02 NE N02 NE N02 NE UV 254nm UV 366nm TT H2SO4 10%/Ethanol DM: DCM/MeOH: 8/1 Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc N03 NE N03 NE N03 NE UV 254nm UV 366nm TT H2SO4 10%/Ethanol DM: DCM/MeOH: 8/1 Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc 17
  25. 3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi 3.2.1. Biện luận cấu trúc N01 Hợp chất N01: chất bột màu trắng. + 13 1 ESI-MS: m/z 314 [M ]: C16H10O7. Phổ C-NMR, phổ H-NMR và DEPT (Bảng 3.1). Các số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử của hợp chất wedelolacton (Hình 3.3). 1 Phổ H-NMR cho tín hiệu proton của nhóm methoxy ở δH 3,88 (3H, s, H-15). Hai tín hiệu proton ở vị trí para của vòng thơm ở δH 7,35 (1H, s, H-13), 7,16 (1H, s, H-10); Hai tín hiệu ở δH 6,44 (1H, d, J=2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8) là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta. Phổ 13C-NMR của N01 có 16 tín hiệu carbon, trong đó: tín hiệu cacbon cacbonyl của vòng lacton ở δC 164,0; 4 tín hiệu ở δC 99,5; 94,5; 99,6 và 106,0 là tín hiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=), 10 tín hiệu ở 103,3; 161,4, 98,4, 156,3, 164,4, 157,0, 151,2, 146,7, 115,7 là tín hiệu của 10 carbon bậc 4 kề nối đôi. Tín hiệu ở 56,3 là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene. Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3 này tương tác với C7 (δ = 164,4). Tương tác H→C được quan sát thấy trên phổ HMBC cho vị trí chính xác của các proton và carbon trong phân tử của N01 (Bảng 3.1). Từ đây, dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố [42] cấu trúc của chất N01 được xác định là 5,11,12-Trihydroxy-7- methoxycoumestan (Wedelolactone). 8 H3CO 7 8a O O 2 13 3 OH 6 4a 14 12 5 4 OH O 11 9 10 OH 1,8,9 - Trihydroxy-3-methoxycoumestan Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton) 18
  26. Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton Wedelolacton N01 13 13 1 TT C-NMR C-NMR H-NMR (δ ppm, 125 (δ ppm, 125 (δ ppm, DEPT HMBC MHz, MeOD) MHz, 500MHz, [42] MeOD) MeOD, J Hz) 2 159,4 164,0 C 3 102,2 103,3 C 4 155,8 161,4 C 4a 97,2 98,4 C 5 155,3 156,3 C 6,44 (1H, d, C-8; C-4a; 6 93,7 99,5 CH J=2,5 Hz) C-5; C-7 7 162,7 164,4 C 6,59 (1H, d, C-8a; C-6; 8 98,6 94,5 CH J=2,0 Hz) C-7, C-2 8a 157,0 C 9 158,2 151,2 C 10 105,1 99,6 7,17 (1H,s) CH C-14; C-9 11 145,9 146,7 C 12 144,8 145,4 C C-3; C-12; 13 99,4 106,0 7,35 (1H,s) CH C-11; C-9; 14 114,3 115,7 C 15 49,4 56,3 CH3 C-7 19
  27. 3.2.2. Biện luận cấu trúc N02 Hợp chất N02: Chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313-314 oC. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, CH2Cl2/MeOH 9/1,v/v), Hiện màu vàng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%. Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin Quercetin N02 13C-NMR 13C-NMR TT 1H-NMR (δ ppm, 125 (δ ppm, 125 (δ ppm, 500MHz, axeton-d , J DEPT MHz, MHz, axeton- 6 Hz) DMSO-d6) d6) 2 147,5 146,9 C 3 136,5 136,7 C 4 176,5 176,5 C 5 161,0 162,3 C 6 99,5 99,1 6,26 (1H, d, J=2,0 Hz) CH 7 166,0 164,9 C 8 94,5 94,4 6,51 (1H, d, J=2,0 Hz) CH 9 156,7 157,7 C 10 104,0 104,1 C 1’ 123,0 123,7 C 2’ 116,5 115,7 7,82 (1H, d, J=2,0 Hz) CH 3’ 145,7 145,8 C 4’ 148,1 148,3 C 5’ 116,0 116,2 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz) CH 6’ 121,0 121,4 7,69 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) CH 20
  28. Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của chất N02 cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonol. Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó 3 tín hiệu tương tác ABX ở δH 7,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,69 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5') thuộc về vòng thơm B, hai tín hiệu proton tương tác meta ở δH 6,51 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) thuộc về vòng thơm A. Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra chất N02 gồm 15 cacbon với 5 CH nhân thơm ở δC 99,1 (C-6), 94,4 (C-8), 115,7 (C-2'), 116,2 (C-5') và 121,4 (C-6'), 10 C trong đó tín hiệu δC 176,5 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, bốn cacbon có độ chuyển dịch δC 145,8, 148,3, 162,3, 164,9 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3', C-4', C-5, C-7. Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δC 136,7 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl. Dựa vào dữ kiện phổ trên đồng thời so sánh điểm nóng chảy và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó [5], cấu trúc của chất N02 được xác định là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone hay quercetin. OH 4' OH HO 8 O 1' 2 6' 6 4 10 3 OH OH O Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) 3.2.3. Biện luận cấu trúc N03 Hợp chất N03: Chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy là 201-202°C. Hiện màu nâu ở UV 254 nm, không hiện màu ở UV 365 nm. Hiện màu nâu sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%. 21
  29. Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat Methyl gallat N03 TT 13C-NMR 13C-NMR 1H-NMR (δ ppm, 400 (δ ppm, 125 MHz, (δ ppm, 500MHz, DEPT MHz, DMSO-d6) CD3OD) CD3OD) 1 119,8 121,5 C 2 109,0 110,1 7,07 (2H, s) CH 3 146,0 146,4 C 4 138,9 139,7 C 5 146,0 146,4 C 6 109,0 110,1 7,07 (2H, s) CH 7 166,8 169,0 C 8 52,0 52,3 3,83 (3H, s) -OCH3 Phổ 1H-NMR của chất N03 cho một tín hiệu singlet của hai proton trong vòng thơm δH 7,07 (2H, s, H-2 & H-6). Sự có mặt của một metyl este thể hiện qua tín hiệu singlet của proton metyl δH 3,83 (3H, s, H-OCH3) Phổ 13C-NMR của N03 cho tín hiệu của 8 cacbon trong đó tín hiệu của cacbon cacbonyl ở δC 169,0 (C-7), cacbon metyl este δC 52,3. Sáu cacbon thuộ c về vòng thơm xuất hiện trong khoảng chuyển dịch δC 110,1-146,4, trong đó C-1 và C-4 cho tín hiệu tương ứ ng ở δC 121,5; 139,7. Tín hiệu chồng chập của hai cacbon methin C- 2 và C-6 ở δC 110,1 với cư ờng độ mạnh. Tương tự vậy, hai cacbon vòng thơm còn lại C-3 và C-5 xuấ t hi ện ở δC 146,4. Các dữ ki ện phổ trên gợi ý cho ta về cấu trúc một phenolic th ế tetra ở các vị trí 1,3,4,5 của hợp chất N03 trong đó có một metyl este và ba nhóm còn lại là hydroxy. Các tương tác HMBC cho phép xác đ ịnh cụ thể từng vị trí củ a các nhóm chức vào nhân thơm. Từ nhận đ ịnh trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [43 ] cho phép kết luận cấu trúc c ủa hợp chất N 03 là methyl 3,4,5- trihydroxybenzoate hay methyl gallat. 22
  30. CH3 CH O 3 O O O 7 1 HO 3 OH HO OH OH OH Hình 3.8. Cấu trúc của hợp chất N03 (Methyl gallat) 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về chiết xuất Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là MeOH. Phương pháp này được lựa chọn vì đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm. MeOH là dung môi chiết được nhiều nhóm hoạt chất , dễ kiếm ; tuy nhiên MeOH là một dung môi độc. Cao chiết tổng tiếp theo được chiết thành các phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc, để thuận lợi cho quá trình phân tách tiếp theo . 3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp, hiệu quả tách cao và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm. Để lựa chọn phân đoạn, thăm dò hệ dung môi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập, đề tài sử sụng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Với phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, kết quả là đã phân lập được 3 hợp chất N01 , N02 , N03. Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1H-NMR , 13C-NMR , DEPT, HMBC , HSQC và đối chiếu với các tài liệu đã được công bố, đã xác định cấu trúc của các chất trên lần lượt là: wedelolacton, quercetin, methyl gallat . Wedelolacton: Wedelolacton là một coumestan có hàm lượng lớn và đóng vai trò quan trọng trong nhiều tác dụng dược lý của cây cỏ nhọ nồi [31]. Wedelolactone đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm ức chế phospholipase A2, virus viêm gan C RNA-polymerase và các hoạt động Na +, K + -ATPase. Wedelolacton còn 23
  31. được sử dụng như thuốc để kháng lại nọc độc rắn và có khả năng chống oxy hóa [19 ], [33 ], [45], [54 ]. Tác dụng chống viêm được chứng minh thông qua việc ức chế hoạt động IKK , có tiềm năng chống viêm bằng cách ức chế nồng độ IL-1β trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, hen suyễn và sốc nhiễm trùng [38]. Tác dụng chống ung thư của wedelolacton đã được chứng minh. Đầu tiên, wedelolactone đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của carcinosarcoma và tế bào adenoma tuyến yên in vitro [30] và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt in vitro và in vivo [52]. Wedelolactone ức chế sự tăng trưởng và gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư vú MDA-MB-231, do khả năng liên kết với DSDNA, ức chế topoisomerase IIa và ngăn chặn sự t ổng hợp DNA [ 11]. Wedelolacton được nghiên cứu và cho thấy khả năng chống viêm, phòng và chữa bệnh nhiễm trùng nặng . Wedelolactone làm giảm các phản ứng viêm do zymosan gây ra đã được nghiên cứu tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội [17]. Quercetin: Quercetin là một trong những flavonoid nổi tiếng, đã được đưa vào chế độ ăn uống của con người trong một thời gian dài. Việc sử dụng quercetin có rất nhiều lợ i ích sức khỏe, bao gồm chống oxy hóa, chống béo phì, chống viêm , kháng vi -rút, kháng khuẩn và chống ung thư [20], [ 37], [ 41]. Quercetin đã được báo cáo là có tiềm năng mạnh m ẽ trong điều trị ung thư, nó có th ể ức ch ế s ự tăng sinh của các loại t ế bào ung thư khác nhau (ví dụ như tế bào ung thư đại trực tràng, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư tuyến tụy và tế bào ung thư phổi, ) bằng cách tác động đến chu trình tế bào củ a chúng và ngăn chặn chúng phát triển [35], [36], [39], [49]. Chức năng chống ung thư của quercetin được báo cáo liên quan đến khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ c ủa nó [ 16]. Kết quả từ một số nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của quercetin trong việc ức chế các bệnh tim mạch. Đối với bệnh nhân tăng huyết áp, việc sử dụng quercetin ( 730 mg / ngày, 4 tuần) đã được ghi nhận là làm giảm huyết áp tâm thu (giảm 7 mm Hg), huyết áp tâm trương (giảm 5 mm Hg) và áp lực động mạch trung bình (giảm 5 mm Hg) [21]. Trong một nghiên cứu tương tự, huyết áp tâm thu và mức LDL do xơ vữa đã giảm đối với mộ t số đối tượng béo phì có triệu chứng hội chứng chuyển hóa sau khi được sử dụng 150 mg quercetin/ngày trong 42 ngày [22 ]. 24
  32. Methyl gallat: Homer et al. (1990) đã nghiên cứu về khả năng ngăn chặn các hoạt động phân giải protein của một số vi khuẩn như Bacteroides gingivalis, Bacteriodes intermedius và Treponema denticola [27]. Methyl gallat ức chế tăng trưởng E. coli, mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn sản xuất axit lactic [6] và kết hợp hiệp đồng với ciprofloxacin để chống lại Salmonella [14]. Methyl gallat được biết đến như một trong những chất chống oxy hóa [24]. Ngoài ra, methyl gallat còn có tác dụng kháng tiểu cầu [41], bảo vệ DNA khỏi tổn thương do stress oxy [28], giảm stress oxy hóa trong tiểu đường [13]. 25
  33. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đề tài: “Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)” thực hiện các nhiệm vụ về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất từ cây cỏ nhọ nồi. Đề tài đã đạt được các kết quả nghiên cứu sau: 1. Từ phân đoạn ethyl acetat đã chiết xuất và phân lập được 3 hợp chất tinh khiết là N01 (426 mg), N02 (112 mg), N03 (48 mg). 2. Sử dụng các phương pháp đo phổ hiện đại đã xác đinh được N01, N02, N03 lần lượt là wedelolacton, quercetin và methyl gallat. Kiến nghị: - Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ cây Cỏ nhọ nồi. - Xây dựng các phương pháp định lượng của các hợp chất có tác dụng sinh học nổi bật. - Nghiên cứu các hoạt tính sinh học của các chất đã được phân lập để bổ sung thêm về cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Cỏ nhọ nồi. 26
  34. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, 2. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 532-533. 3. Ngô Vân Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học Tập I, NXB Y học. Tiếng Anh 4. Maged S Abdel-Kader, Brian D Bahler, Stan Malone, Marga CM Werkhoven, Frits van Troon, ⊥ David, ‖, Jan H Wisse, Isia Bursuker, Kim M Neddermann, Stephen W Mamber (1998) "DNA-damaging steroidal alkaloids from Eclipta alba from the Suriname rainforest". Journal of natural products, 61 (10), 1202-1208. 5. Pawan K Agrawal (2013) Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier, 6. Y‐J Ahn, C‐O Lee, J‐H Kweon, J‐W Ahn, J‐H Park (1998) "Growth‐inhibitory effects of Galla Rhois‐derived tannins on intestinal bacteria". Journal of applied microbiology, 84 (3), 439-443. 7. J Ananthi, A Prakasam, KV Pugalendi (2003) "Antihyperglycemic activity of Eclipta alba leaf on alloxan-induced diabetic rats". The Yale journal of biology and medicine, 76 (3), 97. 8. Arne Anderberg, B. G. Baldwin, R. Bayer, J. Breitwieser, C. Jeffrey, Michael Dillon, P. Eldenäs, Vicki Funk, Núria Garcia-Jacas, D. J. N. Hind (2007) The families and genera of vascular plants. Volume VIII. Flowering plants. Eudicots. Asterales, 9. G Arunachalam, N Subramanian, GP Pazhani, V Ravich (2009) "Anti- inflammatory activity of methanolic extract of Eclipta prostrata L (Astearaceae)". African journal of pharmacy and pharmacology, 3 (3), 097- 100. 10. S Bapna, S Adsule, S Mahendra Shirshat, S Jadhav, LS Patil, RA Deshmukh (2007) "Anti-malarial activity of Eclipta alba against Plasmodium berghei infection in mice". The Journal of communicable diseases, 39 (2), 91-94. 11. Petr Benes, Lucia Knopfova, Filip Trcka, Alice Nemajerova, Diana Pinheiro, Karel Soucek, Miroslav Fojta, Jan Smarda (2011) "Inhibition of topoisomerase IIα: Novel function of wedelolactone". Cancer letters, 303 (1), 29-38. 12. Francisco Manuel Blanco (1880-1883) Flora de Filipinas,
  35. 13. Eun Ju Cho, Takako Yokozawa, Hyun Young Kim, Naotoshi Shibahara, Jong Cheol Park (2004) "Rosa rugosa attenuates diabetic oxidative stress in rats with streptozotocin-induced diabetes". The American journal of Chinese medicine, 32 (04), 487-496. 14. Jang-Gi Choi, Ok-Hwa Kang, Young-Seob Lee, You-Chang Oh, Hee-Sung Chae, Hye-Jin Jang, Jong Hak Kim, Dong-Hwan Sohn, Dong-Won Shin, Hyun Park (2008) "In vitro activity of methyl gallate isolated from galla rhois alone and in combination with ciprofloxacin against clinical isolates of salmonella". Journal of microbiology and biotechnology, 18 (11), 1848-1852. 15. Ill-Min Chung, Govindasamy Rajakumar, Ji-Hee Lee, Seung-Hyun Kim, Muthu Thiruvengadam (2017) "Ethnopharmacological uses, phytochemistry, biological activities, and biotechnological applications of Eclipta prostrata". Applied microbiology and biotechnology, 101 (13), 5247-5257. 16. Kenneth A Conklin (2000) "Dietary antioxidants during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects". Nutrition and cancer, 37 (1), 1-18. 17. Trinh Tat Cuong, Giang Huy Diem, Tran Trung Doan, Nguyen Quang Huy, Nguyen Phuong, Hoang the Hung (2018) "Wedelolactone from Vietnamese Eclipta prostrata (L) L. Protected Zymosan-induced shock in Mice". Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 17 (2), 653. 18. Sunita Dalal, Sudhir K Kataria, KV Sastry, SVS Rana (2010) "Phytochemical screening of methanolic extract and antibacterial activity of active principles of hepatoprotective herb, Eclipta alba". Ethnobotanical leaflets, 2010 (3), 3. 19. Luciana C Diogo, Renata S Fernandes, Silvana Marcussi, Danilo L Menaldo, Patrícia G Roberto, Paula VF Matrangulo, Paulo S Pereira, Suzelei C França, Silvana Giuliatti, Andreimar M Soares (2009) "Inhibition of snake venoms and phospholipases A2 by extracts from native and genetically modified Eclipta alba: isolation of active coumestans". Basic & clinical pharmacology & toxicology, 104 (4), 293-299. 20. Montserrat Dueñas, Susana González-Manzano, Ana González-Paramás, Celestino Santos-Buelga (2010) "Antioxidant evaluation of O-methylated metabolites of catechin, epicatechin and quercetin". Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 51 (2), 443-449. 21. Randi L Edwards, Tiffany Lyon, Sheldon E Litwin, Alexander Rabovsky, J David Symons, Thunder Jalili (2007) "Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects". The Journal of nutrition, 137 (11), 2405-2411. 22. Sarah Egert, Anja Bosy-Westphal, Jasmin Seiberl, Claudia Kürbitz, Uta Settler, Sandra Plachta-Danielzik, Anika E Wagner, Jan Frank, Jürgen Schrezenmeir, Gerald Rimbach (2009) "Quercetin reduces systolic blood pressure and plasma oxidised low-density lipoprotein concentrations in overweight subjects with a
  36. high-cardiovascular disease risk phenotype: a double-blinded, placebo- controlled cross-over study". British Journal of Nutrition, 102 (7), 1065-1074. 23. James H Everitt, Robert I Lonard, Christopher R Little (2007) Weeds in south Texas and northern Mexico, Texas Tech University Press, 24. Dayani Galato, Karina Ckless, Michelle F Susin, Cristiano Giacomelli, Rosa M Ribeiro-do-Valle, Almir Spinelli (2001) "Antioxidant capacity of phenolic and related compounds: correlation among electrochemical, visible spectroscopy methods and structure–antioxidant activity". Redox Report, 6 (4), 243-250. 25. Malaya Gupta, U K anti Mazumder, P Haldar, CH Kandar, Laxmanan Manikandan, G Senthil (2010) "Anticancer activity of Indigofera aspalathoides and Wedelia calendulaceae in Swiss albino mice". Iranian journal of pharmaceutical research, 141-145. 26. S Hemalatha, T Ayyappan, S Shanmugan, D Nagavalli (2006) "Shrivijaya kirubha T. Evaluation of antidiabetic and diuretic activity of polyherbal formulation". Indian Journal of Traditional Knowledge, 5 (4), 468-70. 27. KA Homer, F Manji, D Beighton (1990) "Inhibition of protease activities of periodontopathic bacteria by extracts of plants used in Kenya as chewing sticks (mswaki)". Archives of Oral Biology, 35 (6), 421-424. 28. Tian-Jye Hsieh, Tsan-Zon Liu, Yi-Chen Chia, Chi-Liang Chern, Fung-Jou Lu, Man-chun Chuang, Shin-Yi Mau, Shiang-Hsun Chen, Yu-Hua Syu, Ching- Hsein Chen (2004) "Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells". Food and Chemical Toxicology, 42 (5), 843-850. 29. Iqbal Hussain, Naeem Khan, Riaz Ullah, Shabir Ahmed, Farhat Ali Khan, Sultan Yaz (2011) "Phytochemical, physiochemical and anti-fungal activity of Eclipta alba". African journal of Pharmacy and Pharmacology, 5 (19), 2150- 2155. 30. Aymen I Idris, Hélène Libouban, Hervé Nyangoga, Euphemie Landao-Bassonga, Daniel Chappard, Stuart H Ralston (2009) "Pharmacologic inhibitors of IκB kinase suppress growth and migration of mammary carcinosarcoma cells in vitro and prevent osteolytic bone metastasis in vivo". Molecular cancer therapeutics, 8 (8), 2339-2347. 31. VM Jadhav, RM Thorat, VJ Kadam, KP Salaskar (2009) "Chemical composition, pharmacological activities of Eclipta alba". Journal of Pharmacy Research, 2 (8), 1129-1231. 32. MG Jayathirtha, SH Mishra (2004) "Preliminary immunomodulatory activities of methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica". Phytomedicine, 11 (4), 361-365. 33. Neerja Kaushik-Basu, Alain Bopda-Waffo, Tanaji T Talele, Amartya Basu, Paulo RR Costa, Alcides JM da Silva, Stefan G Sarafianos, Francois Noel (2008)
  37. "Identification and characterization of coumestans as novel HCV NS5B polymerase inhibitors". Nucleic acids research, 36 (5), 1482-1496. 34. Venkatesan Gopiesh Khanna, Krishnan Kannabiran (2009) "Anticancer-cytotoxic activity of saponins isolated from the leaves of Gymnema sylvestre and Eclipta prostrata on HeLa cells". International Journal of Green Pharmacy (IJGP), 3 (3) 35. Byung-Hak Kim, Jung Sook Choi, Eun Hee Yi, Jin-Ku Lee, Cheolhee Won, Sang- Kyu Ye, Myoung-Hwan Kim (2013) "Relative antioxidant activities of quercetin and its structurally related substances and their effects on NF- κB/CRE/AP-1 signaling in murine macrophages". Molecules and cells, 35 (5), 410-420. 36. Haesung Kim, Eun-Min Seo, Ashish R Sharma, Bilguun Ganbold, Jongbong Park, Garima Sharma, Young-Hee Kang, Dong-Keun Song, Sang-Soo Lee, Ju-Suk Nam (2013) "Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells". International journal of oncology, 43 (4), 1319-1325. 37. Robert Kleemann, Lars Verschuren, Martine Morrison, Susanne Zadelaar, Marjan J van Erk, Peter Y Wielinga, Teake Kooistra (2011) "Anti-inflammatory, anti- proliferative and anti-atherosclerotic effects of quercetin in human in vitro and in vivo models". Atherosclerosis, 218 (1), 44-52. 38. M Kobori, Z Yang, D Gong, V Heissmeyer, H Zhu, YK Jung, M Angelica M Gakidis, A Rao, T Sekine, F Ikegami (2004) "Wedelolactone suppresses LPS- induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK complex". Cell death and differentiation, 11 (1), 123. 39. Ki Won Lee, Ann M Bode, Zigang Dong (2011) "Molecular targets of phytochemicals for cancer prevention". Nature Reviews Cancer, 11 (3), 211. 40. Mi Kyeong Lee, Na Ry Ha, Hyekyung Yang, Sang Hyun Sung, Gun Hee Kim, Young Choong Kim (2008) "Antiproliferative activity of triterpenoids from Eclipta prostrata on hepatic stellate cells". Phytomedicine, 15 (9), 775-780. 41. Mi-Youn Lim, Young-Hyun Park, Dong-Ju Son, Moo-Key Kim, Hoi-Seon Lee (2004) "Antiplatelet activity of gallic acid and methyl gallate". Food Science and Biotechnology, 13 (6), 806-809. 42. Qi-Mei Liu, Hai-Yan Zhao, Xian-Ke Zhong, Jian-Guo Jiang (2012) "Eclipta prostrata L. phytochemicals: isolation, structure elucidation, and their antitumor activity". Food and Chemical Toxicology, 50 (11), 4016-4022. 43. Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008) "Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities". Food chemistry, 109 (4), 909-915.
  38. 44. Pimolpan Pithayanukul, Bunmun Lapett, Rapepol Bavovada, Narumol Pakmanee, Rutt Suttisri (2007) "Inhibition of Proteolytic and Hemorrhagic Activities by Ethyl Acetate Extract of Eclipta prostrata. Against Malayan Pit Viper Venom". Pharmaceutical biology, 45 (4), 282-288. 45. Elisa SC Poˆças, Daniele VS Lopes, Alcides JM da Silva, Paulo HC Pimenta, Fernanda B Leitao, Chaquip D Netto, Camilla D Buarque, Flávia V Brito, Paulo RR Costa, François Noël (2006) "Structure–activity relationship of wedelolactone analogues: structural requirements for inhibition of Na+, K+- ATPase and binding to the central benzodiazepine receptor". Bioorganic & medicinal chemistry, 14 (23), 7962-7966. 46. RK Roy, Mayank Thakur, VK Dixit (2008) "Hair growth promoting activity of Eclipta alba in male albino rats". Archives of dermatological research, 300 (7), 357-364. 47. Mahesh Sawant, Jolly C Isaac, Shridhar Narayanan (2004) "Analgesic studies on total alkaloids and alcohol extracts of Eclipta alba (Linn.) Hassk". Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 18 (2), 111-113. 48. AK Saxena, B Singh, KK Anand (1993) "Hepatoprotective effects of Eclipta alba on subcellular levels in rats". Journal of ethnopharmacology, 40 (3), 155-161. 49. Bao-En Shan, Ming-Xia Wang, Run-qing Li (2009) "Quercetin inhibit human SW480 colon cancer growth in association with inhibition of cyclin D1 and survivin expression through Wnt/β-catenin signaling pathway". Cancer investigation, 27 (6), 604-612. 50. Nahid Tabassum, Shyam S Agrawal (2004) "Hepatoprotective activity of Eclipta alba Hassk. against paracetamol induced hepatocellular damage in mice". Jk- practitioner, 11 (4), 278-280. 51. VD Thakur, SA Mengi (2005) "Neuropharmacological profile of Eclipta alba (Linn.) Hassk". Journal of Ethnopharmacology, 102 (1), 23-31. 52. Chin-Hsien Tsai, Feng-Min Lin, Yu-Chih Yang, Ming-Ting Lee, Tai-Lung Cha, Guan-James Wu, Shih-Chuan Hsieh, Pei-Wen Hsiao (2009) "Herbal extract of Wedelia chinensis attenuates androgen receptor activity and orthotopic growth of prostate cancer in nude mice". Clinical Cancer Research, 15 (17), 5435-5444. 53. RK Upadhyay, MB Pandey, RN Jha, VB Pandey (2001) "Eclalbatin, a triterpene saponin from Eclipta alba". Journal of Asian natural products research, 3 (3), 213-217.
  39. 54. H Wagner, B Fessler (1986) "In vitro 5-lipoxygenase inhibition by Elipta alba extracts and the coumestan derivative wedelolactone". Planta medica, (5), 374-377. 55. Shoji Yahara, Ning Ding, Toshihiro Nohara, Kazuo Masuda, Hiroyuki Ageta (1997) "Taraxastane glycosides from Eclipta alba". Phytochemistry, 44 (1), 131-135. 56. JS Zhang, QM Guo (2001) "Studies on the chemical constituents of Eclipta prostrata (L)". Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica, 36 (1), 34-37.
  40. PHỤ LỤC PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ ĐƯỢC PHÂN LẬP
  41. Phụ lục 1. Phổ của hợp chất N01 (Wedelolacton) Phụ lục 1.1. Phổ khối của hợp chất N01
  42. Phụ lục 1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất N01
  43. 1 Phụ lục 1.3. Phổ H-NMR của hợp chất N01
  44. Phụ lục 1.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất N01
  45. Phụ lục 1.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất N01
  46. Phụ lục 1.6. Phổ 13C-NMR của hợp chất N01
  47. Phụ lục 1.7. Phổ DEPT của hợp chất N01
  48. Phụ lục 1.8. Phổ DEPT của hợp chất N01
  49. Phụ lục 1.9. Phổ HMBC của hợp chất N01
  50. Phụ lục 1.10. Phổ HMBC của hợp chất N01
  51. Phụ lục 1.11. Phổ HMBC của hợp chất N01
  52. Phụ lục 1.12. Phổ HSQC của hợp chất N01
  53. Phụ lục 1.13. Phổ HSQC của hợp chất N01
  54. Phụ lục 2. Phổ của hợp chất N02 (Quercetin) Phụ lục 2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất N02
  55. Phụ lục 2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất N02
  56. Phụ lục 2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất N02
  57. Phụ lục 2.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất N02
  58. Phụ lục 2.5. Phổ DEPT của hợp chất N02
  59. Phụ lục 2.6. Phổ DEPT của hợp chất N02
  60. Phụ lục 3. Phổ của hợp chất N03 (Methyl gallat) Phụ lục 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất N03
  61. Phụ lục 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất N03
  62. Phụ lục 3.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất N03
  63. Phụ lục 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất N03
  64. Phụ lục 3.5. Phổ HMBC của hợp chất N03
  65. Phụ lục 3.6. Phổ HMBC của hợp chất N03