›

Khóa luận Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C

pdf 57 trang thiennha21 18/04/2022 4620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_su_anh_huong_cua_mot_so_yeu_to_den_do_o.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  ĐỖ HƯNG ĐÔNG ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA DUNG DỊCH THUỐC CHỨA VITAMIN C KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  Người thực hiện: ĐỖ HƯNG ĐÔNG NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA DUNG DỊCH THUỐC CHỨA VITAMIN C KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH2015.Y Người hướng dẫn : GS.TS. NGUYỄN THANH HẢI ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN Hà Nội - 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và kình trọng tới: GS.TS. NGUYỄN THANH HẢI Ths. NGUYỄN THỊ HUYỀN Là người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn trân thành tới tất cả thầy cô của khoa Y – Dược, đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và bộ môn Bào chế và Công nghiệp dược phẩm nói riêng về sự tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong 5 năm học tập tại trường. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên khoa Y – Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 6 năm 2020 Sinh viên ĐỖ HƯNG ĐÔNG
  4. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Vitamin C 2 1.1.1 Công thức 2 1.1.2 Tính chất lý – hóa 2 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý, công dụng, liều dùng và các dạng bào chế của Vitamin C 4 1.1.4 Các phƣơng pháp định lƣợng Vitamin C 7 1.1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 9 1.2 Khí hòa tan 12 1.2.1 Khí Oxy (O2 ) 12 1.2.2 Khí Cacbonic (CO2 ) 16 1.3 Tổng quan một số công trình nghiên cứu 17 1.3.1 Các nghiên cứu trong nƣớc: 17 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc ngoài: 17 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Phƣơng pháp loại khí oxy trong dung môi pha chế dung dịch Vitamin C 10% 19 2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Vitamin C bằng HPLC 25 3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống 25 3.1.2 Độ đặc hiệu 25
  5. 3.1.3 Độ tuyến tính 27 3.2 Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C. 28 3.3 Kết quả khảo sát phƣơng pháp loại oxy hòa tan trong dung môi 31 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% 34 3.5 Bàn luận 37 3.5.1 Sự ảnh hƣởng của các chất chống oxy hóa khác nhau đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 37 3.5.2 Sự ảnh hƣởng của các biện pháp giảm oxy hòa tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 38 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AA Acid Ascorbic DO Nồng độ oxy hòa tan (Dissolved Oxygen) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography) DĐVN Dƣợc điển Việt Nam TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất EP Dƣợc điển Châu Âu (European Pharmacopoeia)
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG ảng 1 1: Một số dạng bào chế và tên biệt dƣợc của Vitamin C 7 ảng 1 2: Nồng độ bão hòa oxy trong nƣớc theo nhiệt độ 13 ảng 2 1: Các nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 19 ảng 2 2: C ng thức dung dịch Vitamin C 10% 21 ảng 3 1: Khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký (n=6) 25 ảng 3 2: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu 26 ảng 3 3: Diện tích pic của dãy dung Vitamin C dịch chuẩn 27 ảng 3.4: Cảm quan và độ hấp thụ của các dung dịch Vitamin C sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau 29 ảng 3 5: Hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau 30 ảng 3 6: Nồng độ oxy hòa tan trong các mẫu 32 ảng 3 7: Độ hấp thụ của các mẫu vitamin C sử dụng dung m i đã loại oxy 35 ảng 3 8: Hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng dung m i đã loại khí oxy hoà tan. 35
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ H nh 1 1: Độ hòa tan của oxy và nitơ trong nƣớc cất đƣợc bão hòa không khí ở áp suất 790 mm Hg. 12 H nh 2 1: Sơ đồ pha chế dung dịch Vitamin C 10 % 22 H nh 3 1: Đồ thị khảo sát độ tuyến tính của phƣơng pháp HPLC tại bƣớc sóng 254nm 27 Hình 3.2: Biểu đồ hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau . . 31 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn nồng độ oxy hòa tan trong các mẫu . .33 Hình 3.4: Biểu đồ thể hiện hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng dung môi đã loại khí oxy hoà tan 36
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Vitamin C là một loại vitamin thiết yếu cho cơ thể con ngƣời. Có tác dụng nhƣ một chất chống oxy hóa, kiểm soát huyết áp, chống viêm và tái tạo collagen, giúp thúc đẩy hệ miễn dịch trong cơ thể. Vì thế nên nó rất hữu ích trong việc đẩy lùi các bệnh nhiễm trùng nhƣ nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, bệnh nƣớu, mụn trứng cá, bệnh suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) [13,20,22]. Ngày nay, Vitamin C có thể đƣợc bào chế ở rất nhiều dạng thuốc khác nhau nhƣ viên nén, viên sủi, viên ngậm, viên nang, kem bôi và dạng thuốc tiêm [13,14]. Ngoài ra, nó còn đƣợc phối hợp trong các chế phẩm với các dƣợc chất khác để tăng tác dụng của thuốc.Tuy nhiên, Vitamin C là một chất rất dễ bị oxy hóa bởi oxy trong kh ng khí, đặc biệt khi có sự hiện diện của các yếu tố nhƣ ánh sáng, vết kim loại (Fe hoặc Cu), độ ẩm Oxy là nguyên tố hoá học hoạt động mạnh, tham gia vào tất cả các quá trình oxy hoá - khử các chất và có nhiều trong không khí. Do đó, oxy có thể hoà tan trong nƣớc khi bảo quản ở điều kiện thƣờng, và trở thành một loại tạp chất của nƣớc cất, ảnh hƣởng đến độ ổn định các chất, đặc biệt là các chất dễ bị oxy hóa trong dung dịch. Vì vậy, khi ở dạng dung dịch, độ ổn định của Vitamin C bị ảnh hƣởng nhiều bởi nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc. Do đó, để góp phần cải thiện hơn về độ ổn định của dung dịch Vitamin C, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C” Với mục tiêu: 1. Đánh giá ảnh hƣởng của một số chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10%. 2. Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ oxy hoà tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% 1
  10. CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Vitamin C 1.1.1 Công thức Tên thƣờng gọi: Vitamin C; Acid ascorbic [13]. Công thức cấu tạo: Tên khoa học: γ – lacton của acid 2,3 – dehydro – L – gulonic. Công thức phân tử: C6H8O6 Khối lƣợng phân tử: 176,14 g/mol [3,13]. 1.1.2 Tính chất lý – hóa 1.1.2.1 Lý tính Vitamin C ở dạng tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng hoặc gần nhƣ trắng, bị biến màu khi tiếp xúc với không khí ẩm [13]. Dễ tan trong nƣớc, hơi tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong chloroform, ether, benzen [13]. Điểm nóng chảy: 190 đến 192 oC (374 đến 378 oF) [3]. Góc quay cực của dung dịch Vitamin C 10% từ +20,5 đến +21,5o [13]. Khả năng hấp thụ tử ngoại (do có nhóm endiol nên Vitamin C có khả năng hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại): Vitamin C trong dung dịch HCl 0,01N sẽ 1% hấp thụ tại bƣớc sóng max = 243 nm với A1cm 545 ~ 585. Vitamin C trong nƣớc thì hấp thụ tại bƣớc sóng  = 265 với A1% 580 max 1cm [3,13]. 1.1.2.2 Hóa tính Do phân tử Vitamin C có chứa nhóm chức lacton; nhóm hydroxyl và nhóm endiol nên có tính khử và tính acid dù trong công thức cấu tạo không có nhóm –COOH. Vitamin C dễ bị oxi hóa và bị phân hủy thành CO2 và nƣớc ở 192 oC [3]. Tính acid: 2
  11. Dễ tan trong các dung dịch kiềm cũng nhƣ carbonat kim loại kiềm. Tác dụng với muối kim loại cho muối mới [3]. CH2OH HO CH CH2OH O O HO CH + NaHCO3 O 2+ O Fe OH OH Xúc tác + FeSO4 O OH 2 Tính khử: Dạng dung dịch khi có không khí thì Vitamin C dễ dàng bị oxy hoá. Các tác nhân xúc tác sự oxy hoá là ánh sáng, nhiệt độ, chất kiềm, các enzym, các vết kim loại nặng [3,13]. Vitamin C bị oxy hóa cho acid dehydroascorbic; đây là phản ứng oxy hóa khử thuận nghịch, việc oxy hoá xảy ra ở 2 giai đoạn [3]: Giai đoạn đầu là sự oxy hoá thuận nghịch Vitamin C thành acid dehydroascorbic, với sự tách hydro tạo ra các gốc ascocbyl trung gian CH2OH CH2OH HO CH HO CH O O O [O] O [H] OH OH O O Giai đoạn tiếp theo là quá trình oxy hoá không thuận nghịch của dạng dehydroascorbic tạo ra acid 2,3 – dicetogulonic Acid này tƣơng tác với một phân tử acid ascorbic khác, tạo ra furfurol sau khi mất H2O và CO2 . Các furfurol dễ dàng trùng hợp, ngƣng tụ tạo ra màu nâu đen của Vitamin C để lâu ngày [3]. 3
  12. CH2OH COOH HO CH C= O O O C= O O O [O] + C H C-OH H OH OH H C-OH CH2 OH 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý, công dụng, liều dùng và các dạng bào chế của Vitamin C 1.1.3.1 Tác dụng dƣợc lý Chức năng chủ yếu của Vitamin C là sản xuất collagen, một protein chính của cơ thể Đặc biệt, Vitamin C giúp nối kết một phần của phân tử amino acid prolin để hình thành hydroxyprolin, tạo ra một cấu trúc collagen ổn định. Collagen là một protein rất quan trọng trong việc liên kết các cấu trúc cơ thể với nhau (mô liên kết, sụn khớp, dây chằng, vv ) [3,24]. Vitamin C còn có chức năng miễn dịch, tham gia sản xuất một số chất dẫn truyền thần kinh và hormon, tổng hợp carnitin, hấp thụ và sử dụng các yếu tố dinh dƣỡng khác [17,18]. Kh ng nhƣ hầu hết các loài động vật khác, cơ thể ngƣời không thể tự sản xuất Vitamin C vì thế nếu để cơ thể thiếu hụt Vitamin C sẽ gây ra bệnh scorbut (Scurvy). Các triệu chứng dễ gặp ở bệnh này bao gồm: chảy máu nƣớu răng, chậm lành vết thƣơng, xuất hiện các vết thâm tím rộng trên da (là các mảng xuất huyết dƣới da) mà dân gian thƣờng gọi là “vết ma cắn”. Thêm vào đó là dễ bị nhiễm trùng, hysteria và trầm cảm cũng là những tiêu chuẩn chẩn đoán [14,17]. Vitamin C (Acid ascorbic) đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ vật chất di truyền của tinh trùng (DNA) tránh các tổn thƣơng Nồng độ Vitamin C trong tinh dịch cao hơn rất nhiều lần so với trong các dịch khác [17]. Vitamin C tuy ít tích lũy nhƣng nếu dùng liều cao lâu ngày, có thể tạo sỏi oxatlat (do dehydroascorbic chuyển thành acid oxalic), hoặc sỏi thận urat, có khi cả hai loại sỏi trên; đi lỏng, rối loạn tiêu hóa; giảm độ bền của hồng cầu. Dùng Vitamin C liều cao ở phụ nữ có thai gây tăng nhu cầu bất thƣờng về Vitamin C ở 4
  13. thai nhi (vì Vitamin C đi qua nhau thai) dẫn đến bệnh scorbut sớm ở trẻ sơ sinh [3,14]. 1.1.3.2 Công dụng và liều dùng Công dụng: Phòng và điều trị bệnh thiếu hụt Vitamin C (bệnh Scorbut) [3,13,17]. Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà Vitamin C ngăn chặn ảnh hƣởng xấu của các gốc tự do [3,17]. Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trƣng riêng của viamin C là vai trò quan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đối với sự tạo thành và bảo vệ các m nhƣ da, sụn, mạch máu, xƣơng và răng [3]. Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà Vitamin C cũng đóng vai trò trong quá tr nh liền sẹo [3]. Tăng cƣờng khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon - chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virus trong tế bào [17]. Vitamin C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể nhƣ kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra [17]. Chống lại chứng thiếu máu: Vitamin C kích thích sự hấp thụ sắt ở ruột non. Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu, làm giảm nguy cơ thiếu máu. Vitamin C còn đƣợc sử dụng để phối hợp trong các dung dịch thuốc tiêm khác giúp chống oxy hóa và ổn định dƣợc chất. Liều dùng: Vitamin C thƣờng sử dụng đƣờng uống, trong trƣờng hợp không thể uống đƣợc hoặc nghi hấp thu kém, và trong trƣờng hợp đặc biệt mới phải dùng đƣờng tiêm. Khi dùng đƣờng tiêm nên tiêm bắp là tốt nhất. Bổ sung trong trƣờng hợp thiếu Vitamin C: + Dự phòng: 25-75 mg /ngày (ngƣời lớn và trẻ em ) [14]. + Điều trị: Ngƣời lớn: 250-500mg/ngày, chia thành nhiều lần nhỏ, uống ít nhất trong 2 tuần [14]. Trẻ em: 100-300mg/ngày, chia thành nhiều liều nhỏ,uống ít nhất 2 trong 2 tuần [14]. 5
  14. + Phối hợp với desferrioxamin để tăng thêm đào thải sắt (do tăng tác dụng chelat - hoá của desferrioxamin) liều Vitamin C: 100 – 200 mg/ngày + Methemoglobin-huyết khi không có sẵn xanh methylen: 300 – 600 mg/ngày chia thành liều nhỏ. 1.1.3.3 Các dạng bào chế và hàm lƣợng Vitamin C hiện có rất nhiều dạng bào chế nhƣ: dạng bột, dạng viên nang, dạng viên nén, viên nén phóng thích hẹn giờ, dạng viên sủi [3,13,14]. Ngoài ra, các dạng muối củaVitamin C nhƣ muối natri, magnesi, calci, kali ascorbat để giảm tác hại đến dạ dày cũng hay đƣợc sử dụng Một dạng mới của Vitamin C nữa là Ester-C. Đó là Calci polyascorbat kết hợp với nhiều chất chuyển hóa của Vitamin C nhƣ ascorbat, dehyrdroascorbat, threonat, và aldonic acid tạo thành một mắt xích trong các đơn vị lặp lại của c ng thức Ester - C giúp cho việc hấp thụ và sử dụng của cơ thể Este - C đƣợc tạo ra nhằm tăng khả năng dung nạp ở những ngƣời nhạy cảm với Vitamin C, ít gây ra tác dụng phụ vùng thƣợng vị hơn, giảm thiểu nguy cơ sỏi thận [19,23]. 6
  15. ảng 1.1: Một số dạng bào chế và tên biệt dƣợc của Vitamin C Các dạng bào chế Một số biệt dƣợc Nang giải phóng kéo DHC 500; dài: 500 mg. Viên nén: 50mg; Rutin C 500mg; Rutin-Vitamin C 500mg; BIO C 100mg; 250mg; 1000mg; 500mg; 1g. Viên nhai: 100mg; BIO C 500mg chewable; Vitamin C 500 chew; 250 mg; 500mg; 1g. Viên giải phóng kéo Vitamin C 500; Vitamin C 1000mg; dài: 500mg;1g; 1,5g. Viên sủi bọt: 1g. Redoxon;Berocca; MyVita; Plussz C; UPSA-C; Viên ngậm Vita C; IPP C; Dạng bột: 1g, Emergen-C; Ester-C: 500mg; 1g NAT-C Este; Ester C; Ống tiêm: Laroscorbine; CEVIT 500; Cevita 100; 100mg/ml, 250mg/ml, 500mg/ml 1.1.4 Các phƣơng pháp định lƣợng Vitamin C 1.1.4.1 Phƣơng pháp hóa học a) Định lƣợng bằng iod [12]: Nguyên tắc: Iod bị Vitamin C khử thành iodid không màu. Khi tất cả Vitamin C đã bị oxy hóa, thì iod và triiodua sẽ hiện diện trong dung dịch và phản ứng với tinh bột. Iod thừa ở điểm tƣơng đƣơng một giọt iod dƣ sẽ cho màu xanh với chỉ thị hồ tinh bột. Qua đó xác định đƣợc hàm lƣợng Vitamin C trong mẫu khi biết lƣợng iod đã phản ứng [13]. Cơ chế: 7
  16. CH 2 OH CH 2 OH C H 2O H HO CH HO CH O HO CH O O O O O + I2 - 2 HI + I H I O O OH OH O H O H Acid ascorbic acid dehydro L - ascorbic b) Định lƣợng bằng 2, 6-DCIP (2, 6 – diclophenol - indophenol hydro) Nguyên tắc: Vitamin C sẽ khử chất chỉ thị màu 2,6 – diclophenol - indophenol hydro thành một dung dịch không màu. Ở điểm trung hòa, tất cả Vitamin C thì chất chỉ thị màu dƣ thừa sẽ làm cho dung dịch có màu hồng [13]. Cơ chế phản ứng: C H 2O H C H 2O H HO CH O C l HO CH C l O O O + O N O H + HO NH O H OH O H C l O O C l Acid ascorbic 2,6 - diclorophenol indophenol acid dehydro L - ascorbic 2,6 - diclorophenol - indophenol hydro (xanh) (Không màu) c) Định lƣợng bằng Amoniumceri (IV) sulfat [15]: Nguyên lý: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của dung dịch Ceri để nhận biết điểm tƣơng đƣơng Cơ chế phản ứng: CH OH 2 CH2OH HO CH HO CH O O O O +4 + 2 +3 + Ce + 2 Ce + 2 H OH OH O O 1.1.4.2 Phƣơng pháp hóa lý a) Phương pháp đo quang [12,13]: 8
  17. Do có nhóm endiol nên phân tử Vitamin C có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại [3,13]. Vitamin C trong dung dịch HCl 0,01M sẽ hấp thụ tại bƣớc sóng max = 243 nm với A (1%,1cm) nằm trong khoảng 545 đến 585. Vitamin C trong nƣớc thì hấp thụ tại bƣớc sóng max = 265,5nm [13]. b) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12,13]: Nguyên lý: Dung m i pha động đƣợc chạy qua cột tĩnh sẽ rửa giải Vitamin C khi bơm mẫu qua cột. Dựa vào Detector UV ở bƣớc sóng 254nm hàm lƣợng Vitamin C đƣợc xác định. Nồng độ Vitamin C trong mẫu đem định lƣợng tính theo công thức: ST CT CC n SC Trong đó: CT là nồng độ của Vitamin C trong mẫu thử. CC là nồng độ của Vitamin C trong mẫu chuẩn. ST là diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu thử. SC là diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. n là hệ số pha loãng. 1.1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 1.1.5.1 Ánh sáng Ánh sáng đƣợc chia thành 3 vùng có mức năng lƣợng khác nhau: Vùng tử ngoại: 185 – 400 nm Vùng khả kiến: 400 – 760 nm Vùng hồng ngoại: 760 – 1000 nm Vitamin C hấp thụ bƣớc sóng ở vùng tử ngoại. Khi bị oxy hoá dung dịch dần chuyển sang màu vàng khi đó nó có khả năng hấp thụ ánh sáng ở vùng khả kiến, mạnh nhất tại bƣớc sóng phụ của nó nằm trong vùng lam chàm. Tính chất này đƣợc ứng dụng trong phƣơng pháp đo màu dung dịch vitamin [15]. 1.1.5.2 Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng tới tất cả các phản ứng của dƣợc chất ở các mức độ khác nhau. Van’t Hoff đã nêu ra nguyên tắc gần đúng về ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng: tốc độ của phản ứng đồng thời có thể tăng gấp 2 đến 3 lần khi nhiệt độ tăng lên 10o C [4]. 9
  18. Theo hệ thức Arhenius [4]: K=α e-Ea/RT hoặc Log K=Log α – E/2,303RT hoặc ln K = - Ea/RT + ln α Trong đó: K là hằng số tốc độ phản ứng α là hằng số Ea là năng lƣợng hoạt hóa R là hằng số khí lí tƣởng T là nhiệt độ phản ứng Vitamin C dễ dàng bị oxy hóa và có thể xảy ra ở ngay nhiệt độ thƣờng. Dẫn đến chất lƣợng của Vitamin C bị ảnh hƣởng nên bảo quản trong nhiệt độ thích hợp là cách để tăng tính ổn định của Vitamin C. Các Vitamin C dạng tiêm thƣờng đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng và ở nhiệt độ từ 2 oC đến 8 oC để đảm bảo chất lƣợng thuốc cũng nhƣ độ ổn định. 1.1.5.3 Độ pH Trong dung dịch thuốc th độ pH cũng là yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của thuốc và cả cơ thể. Thay đổi pH có thể tăng hoặc giảm tốc độ phân hủy dƣợc chất, đ i khi làm thay đổi cơ chế phân hủy dƣợc chất. Mỗi dƣợc chất thƣờng ổn định nhất trong dung dịch nƣớc hay hỗn dịch nƣớc ở một khoảng giá trị pH nào đó (ít bị thủy phân, ít bị oxy hóa, không chuyển dạng kết tinh ), cả trong quá trình pha chế, tiệt khuẩn chế phẩm bằng nhiệt và trong quá trình bảo quản chế phẩm tới khi sử dụng. pH của dung dịch thuốc có thể bị thay đổi trong quá trình bảo quản chế phẩm do nhiều nguyên nhân: do dƣợc chất bị phân hủy (thủy phân, oxy hóa hay quang hóa); do tƣơng tác của các thành phần trong dung dịch thuốc với nhau; do sự hòa tan các chất từ bề mặt bao bì thủy tinh, chất dẻo hay cao su vào thuốc trong quá trình tiếp xúc với thuốc; do sự xâm nhập của các khí từ m i trƣờng bên ngoài qua bao bì bằng chất dẻo hay cao su vào thuốc. Khi pH của dung dịch thay đổi sẽ làm giảm độ ổn định của dƣợc chất trong dung dịch [28]. Dung dịch Vitamin C ổn định nhất khi pH trong khoảng từ 5 đến 6,5. Vì tại khoảng pH đó th tốc độ oxy hóa Vitamin C trong dung dịch là thấp nhất [13]. 1.1.5.4 Các ion kim loại 10
  19. Do nhóm endiol trong phân tử nên Vitamin C có khả năng tạo phức với các ion kim loại làm ảnh hƣởng đến độ ổn định của dung dịch. Trong dung dịch Vitamin C thì nguyên tố Cu kh ng đƣợc quá 5 phần triệu; nguyên tố Fe kh ng đƣợc quá 2 phần triệu và đƣợc đo bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [9]. 1.1.5.5 Dung môi Đối với Vitamin C là một chất dễ tan trong nƣớc nên dung m i đƣợc sử dụng để pha chế là nƣớc cất. Nƣớc cất sẽ chứa các khí hòa tan và sau một thời gian sẽ oxy hóa dƣợc chất làm ảnh hƣởng đến độ ổn định dƣợc chất. Việc giảm khí hòa tan trong dung môi pha dung dịch thuốc là một biện pháp để tăng độ ổn định của Vitamin C [11]. 1.1.5.6 Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là những chất rất dễ bị oxy hóa và có thế oxy hóa thấp hơn so với thế oxy hóa của dƣợc chất, nên chúng sẽ bị oxy hóa trƣớc khi dƣợc chất bị oxy hóa [5]. Các muối natri hay kali sulfit, bisulfit, metabisulfit và dithionit là những chất chống oxy hóa thƣờng dùng nhất trong các dung dịch thuốc. Các muối sulfit có tác dụng chống oxy hóa do sinh SO2 và hòa tan oxy trong thuốc theo phản ứng SO2 + O2 -> SO3. Khả năng chống oxy hóa của các muối sulfit phụ thuộc vào nồng độ muối đƣa vào dung dịch và pH của dung dịch. Muối sulfit tác dụng tốt trong các dung dịch có pH cao, muối bisulfit tác dụng tốt trong các dung dịch có pH trung tính, muối metabisulfit tác dụng tốt trong các dung dịch có pH thấp. Khi dùng muối sulfit cần chú ý là sản phẩm của quá trình oxy hóa sẽ tạo ra muối sulfat, gốc sulfat có thể kết hợp với các ion Ca2+, Ba2+ nhả ra từ bao bì thủy tinh tạo thành các muối không tan, làm vẩn đục dung dịch [5]. Chất hiệp đồng chống oxy hóa: Bản chất của quá trình oxy hóa là phản ứng chuỗi đƣợc khởi đầu với một lƣợng oxy rất nhỏ, nếu chỉ sử dụng chất chống oxy hóa kh ng th i th chƣa thể ngăn chặn hoàn toàn quá tr nh oxy hóa dƣợc chất Để tăng cƣờng hiệu quả chống oxy hóa, ngƣời ta thƣờng thêm các chất hiệp đồng chống oxy hóa phối hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác trong một dung dịch. Các chất hiệp đồng chống oxy hóa có tác dụng khóa vết các ion kim loại nặng dƣới dạng các phức, làm mất tác dụng xúc tác của ion kim loại trong phản ứng oxy hóa dƣợc 11
  20. chất Thƣờng dùng là muối dinatri của acid ethylendiamin tetra-acetic (dinatri edetat). Một số acid dicarboxylic nhƣ acid citric, acid tartric cũng đƣợc dùng với vai trò tƣơng tự nhƣ dinatri edetat [12]. 1.2 Khí hòa tan 1.2.1 Khí Oxy (O2 ) Oxy là nguyên tố phổ biến nhất ở vỏ Trái Đất, là nguyên tố phổ biến thứ ba trong vũ trụ sau Hydro và Heli. Uớc tính oxy chiếm 49,2% khối lƣợng của vỏ Trái Đất. Là một thành phần quan trọng của không khí, tạo ra bởi cây cối trong quá trình quang hợp và rất cần thiết để duy trì cho hô hấp của ngƣời và động vật. Trong không khí, oxy chiếm tới 23% về trọng lƣợng và 20,9% theo thể tích [6, 9,10]. Oxy là chất ít tan trong nƣớc và không tạo phản ứng hóa học với nƣớc Độ hòa tan của oxy trong nƣớc tỉ lệ nghịch với nhiệt độ, và ở 0 °C th lƣợng hòa tan tăng gấp đ i (14,6 mg·L−1) so với ở 20 °C (7,6 mg·L−1). Ở nhiệt động không khí 25 °C và 1atm, nƣớc ngọt chứa khoảng 6,04 (mL) oxy trong một lít nƣớc [10]. H nh 1.1: Độ hòa tan của oxy và nitơ trong nƣớc cất đƣợc bão hòa không khí ở áp suất 790 mm Hg. Ở 35 oC ; DO= 7 mg/L. DO thƣờng dao động trong khoảng 6-12 ppm [10]. 12
  21. ảng 1 2: Nồng độ bão hòa oxy trong nƣớc theo nhiệt độ Nhiệt độ Nồng độ bão hòa (t oC) (mg/L) 0 14,6 5 12,8 10 11,3 15 10,2 20 9,2 25 8,4 30 7,6 Oxy là chất hoạt động hóa học rất mạnh, nó tham gia vào tất cả các quá trình oxy hóa - khử trong các m i trƣờng, đặc biệt là trong m i trƣờng nƣớc [10]. 1.2.1.1 Các tác nhân làm tăng khả năng oxy hóa dƣợc chất có sự tham gia của oxy a. Ảnh hưởng của độ ẩm: Một số thuốc viên nén: Vitamin C, Vitamin 1 bị hỏng rất nhanh khi tiếp xúc với không khí ẩm. Tức là khi có nƣớc, theo thời gian tiếp xúc với oxy, . . . các gốc HO , O2 , HO 2 sẽ tạo thành, chúng tham gia vào các quá trình oxy hoá các dƣợc chất theo cơ chế phản ứng gốc tự do đã biết [9]. b. Ảnh hưởng của ánh sáng: Tia tử ngoại hay ánh sáng nói chung đều là những dạng bức xạ Năng lƣợng bức xạ càng lớn, th tác động phân huỷ các chất hữu cơ và nƣớc càng cao. Khi bị tác động của tia tử ngoại làm xuất hiện các gốc R-., ROO- dẫn đến một loạt phản ứng gốc tự do, xảy ra theo thời gian [9]. c. Ảnh hưởng của tạp chất kim loại chuyển tiếp: Ngay cả khi ở điều kiện thƣờng, các kim loại chuyển tiếp cũng là nhân tố làm tạo ra gốc tự do của oxy. Ví dụ nhƣ quả trình tạo ra gốc tự do của ion Cu+1 hay Fe+2 nhƣ sau: 13
  22. +2 -. + +3 Fe O2 O2 + Fe . +1 - +2 Cu + O O2 + Cu 2 Khi các gốc tự do đƣợc tạo ra sẽ dễ dàng phản ứng với dƣợc chất, đặc biệt là trong dung dịch Vitamin C khi bảo quản không tốt khiến các gốc O2 càng dễ xuất hiện và phản ứng sẽ xảy ra mạnh hơn Gốc tự do có thể hình thành và phản ứng lan truyền: . . . + O . RH + OH H O + R 2 ROO (1) 2 . . + R R R - R (2) Khi phản ứng (2) xảy ra, thì quá trình dimer hoá có thể xuất hiện; tạo ra những sản phẩm phân huỷ khác [9]. 1.2.1.2. Các phƣơng pháp định lƣợng oxy hòa tan Phƣơng pháp xác định oxy hòa tan cổ điển đƣợc thực hiện bằng cách đun nóng mẫu để đuổi khí hòa tan và xác định oxy từ mẫu thu đƣợc này nhờ áp dụng phƣơng pháp phân tích khí Nhƣng phƣơng pháp này đòi hỏi một lƣợng mẫu lớn và thời gian thực hiện dài. Hiện nay, đo oxy hòa tan đã có thể xác định một cách nhanh chóng, có 2 phƣơng pháp phổ biến hơn hẳn đó là: a. Phƣơng pháp Winkler: Các bƣớc trong phƣơng pháp winkler gồm: Bước1: Thêm muối Mn2+ và kiềm + KI vào mẫu nƣớc, oxy đơn chất hoà tan trong nƣớc đƣợc chuyển vào các kết tủa mangan hydroxyd lắng xuống đáy bình, vì vậy bƣớc này gọi là bƣớc cố định oxy hoà tan (tốt nhất là thực hiện bƣớc này ngay tại thời điểm lấy mẫu): 2Mn(OH)2 + 1/2O2 + H2O 2Mn(OH)3 nâu Mn(OH)2 + 1/2O2 MnO(OH)2 nâu Bước 2: Xác định lƣợng oxy đã đƣợc cố định: 14
  23. Dùng acid hoà tan các hydroxyd Mn4+; Mn3+ Trong m i trƣờng acid, 4+ 3+ - 2+ Mn ; Mn oxy hoá I thành I2 và trở lại thành Mn : 2Mn(OH)3 + 6HCl + 2 KI MnCl2 + I2 + 6H2O + 2KCl MnO(OH)2 + 4HCl + 2 KI MnCl2 + I2 + 3H2O + 2KCl Nhƣ vậy oxy hoà tan đã đƣợc chuyển thành iod đơn chất Xác định lƣợng I2 này bằng chuẩn độ với dung dịch chuẩn Na2S2O3 là xác định đƣợc hàm lƣợng oxy hoà tan trong nƣớc, phản ứng chuẩn độ: 2Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 b. Phƣơng pháp điện cực màng đo oxy hòa tan: Đây là phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả, nhanh chóng, dễ dàng xác định độ oxy hòa tan trong mẫu dung môi. Có nhiều máy đo nhanh nồng độ oxy hòa tan (DO) đƣợc chế tạo theo phƣơng pháp này Nguyên lý để đo đƣợc nồng độ oxy hòa tan là do cấu tạo ở đầu đo điện cực gồm một pin đƣợc bọc bằng màng chọn lọc, và chứa hai điện cực kim loại và chất điện giải vào nƣớc cần phân tích (Màng thực tế không thấm nƣớc và chất hòa tan ion, chỉ thấm oxy và một vài loại khí nào đó) Một trong hai điện cực đƣợc làm từ kim loại quý nhƣ vàng hoặc platin. Oxy bị khử tại bề mặt của chúng do một quá trình điện hóa. Để quá trình này xảy ra cần thiết lập thế điện hóa phù hợp tại điện cực này. Đối với đầu đo cực phổ, thế này đạt đƣợc bằng cách áp dụng một hiệu điện thế bên ngoài với một điện cực thứ hai. Đầu đo điện hóa có thể tạo ra điện thế giữa chúng. Dòng điện xuất hiện trong điện cực tỷ lệ với lƣợng oxy trong nƣớc khuếch tán qua màng điện cực, trong lúc đó lƣợng oxy khuếch tán qua màng lại tỷ lệ với nồng độ của oxy hòa tan. Dựa vào việc đo cƣờng độ dòng điện xuất hiện này ta sẽ tính đƣợc nồng độ oxy hòa tan (DO). Nhiệt độ có hai ảnh hƣởng khác nhau. Ảnh hƣởng thứ nhất liên quan đến sự thay đổi của tính thấm khí của màng đối với nhiệt độ Do vậy, phải bổ chính tín hiệu sơ cấp của đầu đo với một bộ cảm biến nhiệt độ Đồng hồ đo đƣợc sản xuất gần đây có thể thực hiện bổ chính tự động Ảnh hƣởng thứ hai là tác động của nhiệt độ lên phản ứng điện cực c. Phƣơng pháp phân tích quang (phƣơng pháp huỳnh quang) đo oxy hòa tan: 15
  24. Đây là một trong những phƣơng pháp thích hợp để đo nƣớc có màu đậm hoặc nƣớc đục và phù hợp để phân tích nƣớc kh ng thích hợp cho phƣơng pháp chuẩn độ Winkler do có chứa các chất cố định sắt và iod Cảm biến quang học đo chu kỳ phát quang/huỳnh quang hoặc pha phát quang/huỳnh quang thƣờng gồm có một chất phát quang hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang đặt trong nắp cảm biến, một nguồn sáng (ví dụ diod phát ánh sáng (LED) và một detector quang học Ánh sáng xung hoặc điều biến từ nguồn gây ra sự kích thích của chất phát quang, đƣợc dập tắt trong sự có mặt của oxy. Detector quang học chuyển đổi ánh sáng phát ra thành tín hiệu điện có thể đƣợc lấy mẫu và đƣợc xử lý để tính toán thay đổi giai đoạn/pha hoặc chu kỳ huỳnh quang hoặc phát quang Sự thay đổi pha này hoặc chu kỳ kích thích này đƣợc dùng để định lƣợng nồng độ oxy hòa tan Nhiệt độ có hai ảnh hƣởng khác nhau Ảnh hƣởng thứ nhất liên quan đến sự biến động của quá tr nh dập tắt của màng với nhiệt độ Do đó tín hiệu sơ cấp của đầu đo nhƣ vậy phải đƣợc bù trừ bằng một cảm biến nhiệt độ Máy đo có thể đƣợc thiết kế tự động Hiệu ứng thứ hai đƣợc tạo ra bởi sự phụ thuộc của mẫu và nhiệt của độ của oxy hòa tan trong mẫu Độ muối cũng có thể có hiệu ứng đáng kể 1.2.2 Khí Cacbonic (CO2 ) Khí CO2 là chất khí không màu, có mùi, vị hơi chua, nặng hơn kh ng khí (tỉ khối so với không khí là 1,5292). Khí cacbonic dễ hoá lỏng, dễ hoá rắn; nhiệt o o độ nóng chảy là -54,6 C ở 5,11 atm; độ tan CO2 trong 1 lít nƣớc ở 25 C là 0,759. Khí cacbonic là một thành phần quan trọng của khí quyển. Nồng độ CO2 trong không khí khoảng 3% chƣa có nguy hại cho con ngƣời nhƣng đã có tác động đến trung ƣơng thần kinh do sự kích thích của CO2 tan trong máu; nếu nồng độ trên 10% có thể nhanh chóng tử vong [16]. CO2 là chất có tính acid đồng thời có tính oxy háo nên dễ phản ứng với các cất có tính bazơ và chất có tính khử mạnh [16]. Khí CO2 tan khá nhiều trong nƣớc, khi tan một phần tác dụng với nƣớc cho phản ứng nên độ tan toàn phần của nó kh ng tuân theo định luật Henry. 16
  25. CO2 + H2O H2CO3 -7 + - 4,45.10 6,35 H2CO3 H + HCO3 K1 = pK1 = -11 - + 2 - , . HCO H + CO K = 4 7 10 pK = 10,33 3 3 2 2 Những phân tử H2CO3 không bền và kh ng tách đƣợc ở trạng thái tự do. Sự phân ly của H2CO3 tuỳ thuộc vào pH của nƣớc Nƣớc cất có pH dao động trong khoảng 5 – 7 [6,7,16]. 1.3 Tổng quan một số công trình nghiên cứu 1.3.1 Các nghiên cứu trong nƣớc: Năm 2009, Nguyễn Thị Hậu (Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của khí oxy và khí carbonic trong dung m i đến độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C 10%. Kết quả đã chỉ ra ảnh hƣởng của khí oxy và carbonic đến độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C 10% và đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của hai chất điều chỉnh pH là NaOH và NaHCO3 tới độ ổn định về màu sắc của thuốc tiêm vitamin C. Các khí hòa tan ảnh hƣởng đến độ ổn định của dung môi về màu sắc theo thứ tự là O2; CO2 và N2. Sử dụng NaOH thay cho NaHCO3 trong công thức pha chế thuốc tiêm vitamin C và sục dung m i trƣớc khi pha bằng khí N2 giúp độ ổn định của Vitamin C cao hơn [2]. Năm 2010, Dƣơng Thị Ánh Hồng và cộng sự (Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội) đã nghiên cứu các biệp pháp làm tăng độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C 10%. Kết quả nghiên cứu đã đánh giá ảnh hƣởng của ba tá dƣợc kiềm đối với độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C trong đó natri hydroxyd thích hợp hơn cả. Nghiên cứu đánh giá vai trò của tá dƣợc A (Triethanolamin) và B (Natri bircabonat) đối với độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C. Kết quả cho thấy thuốc tiêm Vitamin C có độ ổn định cao hơn khi dùng chất phụ A (Triethanolamin) với tỉ lệ 0,5% trong thành phần. Xây dựng công thức thuốc tiêm Vitamin C 10% có thể đảm bảo các tiêu chí chất lƣợng trong vòng 30 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm [1]. 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc ngoài: Năm 1986, G.L.Robertson và C.M.L.Samaniego đã nghiên cứu ảnh hƣởng của các nồng độ oxy hòa tan ban đầu khác nhau (0,41;1,44 và 3,74 mg/L) đếntỉ lệ phân hủy của Vitamin C trong nƣớc chanh khi bảo quản ở 36 °C. Sự phân hủy 17
  26. của Acid ascorbic chủ yếu là kỵ khí Các m h nh động học bậc nhất và bậc hai đƣợc đƣa ra cho các phản ứng phân hủy khác nhau ở nƣớc chanh trong quá trình bảo quản. Kết quả cho thấy tỷ lệ Acid ascorbic phân hủy và hình thành furfural có thể đƣợc quy cho mức oxy hòa tan ban đầu khác nhau. Sự phân hủy của acid ascobic sẽ xuất hiện chủ yếu là kỵ khí và có thể đƣợc mô tả tốt nhất bằng mô hình bậc hai [26]. Năm 1992, John F. Kennedy và cộng sự đã nghiên cứu về độ ổn định của acid ascorbic trong nƣớc cam đƣợc xử lý vô trùng trong các hộp TetraBrik và ảnh hƣởng của oxy. Tốc độ phân hủy của acid ascorbic trong nƣớc cam đƣợc xử lý vô trùng trong các hộp Tetra rik đƣợc đánh giá ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau. Trong loại mẫu này, mức độ oxy hòa tan có trong mẫu sau khi đóng gói ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng acid ascorbic, ảnh hƣởng có liên quan trực tiếp đến nhiệt độ Tƣơng tự nhƣ vậy, tốc độ tiêu thụ oxy hòa tan phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ acid ascorbic. Cả hai quá trình phân hủy hiếu khí và kỵ khí của acid ascorbic xảy ra trong cùng một hệ thống. Quá trình hiếu khí chiếm ƣu thế và quá trình kỵ khí diễn ra khi mức độ oxy hòa tan đã đạt đến trạng thái cân bằng [21]. Năm 2004, Mehmet Ozkan đã nghiên cứu về ảnh hƣởng của hydro peroxide đến độ ổn định của acid ascorbic trong quá trình bảo quản các loại nƣớc ép trái cây khác nhau. Sự phân hủy acid ascorbic trong nƣớc cam, nho và lựu, và mật hoa anh đào chua đƣợc nghiên cứu ở 20, 30 và 40 °C, có hoặc không có thêm hydro peroxide (H2O2). Phân tích dữ liệu động học cho thấy rằng sự phân hủyphù hợp hơn với mô hình bậc không so với mô hình bậc nhất. Các hằng số tốc độ tăng nhẹ với sự hiện diện của 0,5 ppm H2O2. Tuy nhiên, việc tăng nồng độ H2O2 từ 0,5 đến 5 ppm đã làm tăng đáng kể tốc độ phân hủy của acid ascorbic Anthocyanin làm tăng đáng kể sự thoái hóa của acid ascorbic trong mật hoa anh đào và nƣớc ép lựu, đặc biệt là ở nồng độ 5 ppm H2O2. Phân hủylà chậm nhất trong nƣớc cam, có hoặc không có thêm H2O2 Năng lƣợng kích hoạt là thấp nhất đối với nƣớc nho (26,2 kJ.mol-1) và cao nhất đối với nƣớc ép lựu -1 (71,0 kJ.mol ) với sự hiện diện của 0,5 ppm H2O2 [25]. 18
  27. CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu ảng 2 1: Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu STT Nguyên phụ liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Vitamin C Nhật Bản TCNSX Acid ascorbic Viện kiểm nghiệm thuốc Trung SKS: 0100031 2 chuẩn quốc gia ƣơng – BYT DĐVN 3 Natri metabisulfit Trung Quốc TCNSX 4 Natri bisulfit Trung Quốc TCNSX 5 NaOH Trung Quốc TCNSX 6 Nƣớc cất Việt Nam DĐVN V 7 Khí Nitơ Việt Nam TCNSX 8 Acetonitril Merck-Đức EP 2.1.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 1. Cân phân tích Sartorius (Đức) 2. Máy đo pH Hack sensION + PH3 (Trung Quốc) 3. Máy đo độ oxy hòa tan ORION Star A213 (Indonesia) 4. Máy đo quang UV-2600 (Mỹ) 5. Máy HPLC Agilent 1260 (Mỹ) 6. Máy cất nƣớc 2 lần Aquatron A4000D (Anh) 7. Máy siêu âm Elmasonic S100 (Đức) 8. Bình sục khí N2 (Việt Nam) 9. Tủ sấy memert UN1 10 (Đức) 10. Các dụng cụ thí nghiệm khác: b nh định mức các loại; pipet các loại; cốc có mỏ; màng lọc; 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp loại khí oxy trong dung môi pha chế dung dịch Vitamin C 10% 19
  28. 2.2.1.1. Phƣơng pháp sục khí N2 vào nƣớc cất pha dung dịch Lấy khoảng 300ml nƣớc cất vào bình nút mài có dung tích 500ml. Sử dụng vòi sục khí N2 vào bình với tốc độ sao cho nƣớc không trào ra ngoài. Sau khi sục xong liền đậy nắp kín, đo nồng độ oxy hòa tan trực tiếp bằng cách sử dụng máy đo oxy hòa tan và dùng pha chế dung dịch. Các bƣớc sử dụng máy đo nồng độ oxy hòa tan để xác định DO trong dung môi pha chế: Bước 1: Vệ sinh điện cực của máy để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của phép đo Bước 2: Hiệu chuẩn máy với dung dịch hiệu chuẩn đƣợc cung cấp kèm máy Sau đó vệ sinh lại điện cực cho sạch sẽ Bước 3: Đo DO của dung dịch bằng cách nhúng điện cực vào dung dịch mẫu và khuấy nhẹ Chú ý để kh ng có bọt khí bám trên điện cực Bước 4: Chờ cho giá trị hiển thị trên màn h nh ổn định rồi quan sát và lấy kết quả 2.2.1.2. Phƣơng pháp siêu âm nƣớc cất pha dung dịch Lấy khoảng 300ml nƣớc cất vào bình nút mài có dung tích 500ml Đặt vào bể siêu âm trong khoảng thời gian nhất định ở điều kiện phòng thí nghiệm. Sau khi siêu âm xong đậy nắp, đo nồng độ oxy hòa tan nhƣ ở phƣơng pháp trên và dùng pha chế dung dịch. 2.2.1.3. Phƣơng pháp đun sôi nƣớc cất pha dung dịch Lấy khoảng 300ml nƣớc cất cho vào bình nút mài có dung tích 500ml, đun s i trong khoảng thời gian nhất định Sau đó, đậy nắp và để nguội đến nhiệt độ phòng, đo nồng độ oxy hòa tan nhƣ ở phƣơng pháp trên và pha chế dung dịch. 2.2.1.4. Phƣơng pháp chuẩn bị dung dịch Vitamin C 10% 20
  29. ảng 2 2: C ng thức dung dịch Vitamin C 10% STT Nguyên liệu CT 1 CT 2 CT 3 1 Acid ascorbic 10 g 10 g 10 g 2 Natri metabisulfit 0,1 g - - 3 Natri bisulfit - 0,1 g - 4 Rongalit - - 0,1 g 5 NaOH 2,24 g 2,24 g 2,24 g 6 Nƣớc cất vđ 100 ml 100 ml 100 ml (-) : Không có trong c ng thức pha chế Quy trình pha chế dung dịch thuốc Vitamin C 10%: 21
  30. Chất chống oxy hóa Nƣớc cất đã sục khí Hòa tan hoàn toàn Acid ascorbic Hòa tan hoàn toàn NaOH Vừa đủ Dung dịch Vitamin C 10% Lọc Theo dõi nghiên cứu H nh 2.1: Sơ đồ pha chế dung dịch Vitamin C 10 % 2.2.2. Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 2.2.2.1 Phƣơng pháp đánh giá độ ổn định Các mẫu dung dịch thuốc sau khi pha chế đƣợc bảo quản trong điều kiện khắc nghiệt (tủ sấy ở nhiệt độ 95 oC) trong các khoảng thời gian là 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ. Các mẫu nghiên cứu đƣợc đánh giá dựa trên các chỉ tiêu: Hình thức: Đánh giá sự thay đổi màu sắc của dung dịch Vitamin C bằng cảm quan và đo hấp thụ tại bƣớc sóng 420nm. Hàm lƣợng Vitamin C đƣợc xác định bằng phƣơng pháp bằng HPLC. a. Phƣơng pháp đo quang để đánh giá sự thay đổi màu sắc Nguyên tắc: Vitamin C hấp thụ bƣớc sóng ở vùng tử ngoại. Khi bị oxy hoá dung dịch dần chuyển sang màu vàng, khi đó nó có khả năng hấp thụ ánh 22
  31. sáng ở vùng khả kiến, mạnh nhất tại bƣớc sóng phụ của nó nằm trong vùng lam chàm. Tính chất này đƣợc ứng dụng trong phƣơng pháp đo màu dung dịch Vitamin C [15]. Cách tiến hành: Pha loãng một thể tích chế phẩm (lấy chính xác) với nƣớc cất để thu đƣợc dung dịch có nồng độ Acid ascorbic 50 mg/ml Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 420 nm (Dƣợc điển Việt Nam V) b. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Vitamin C bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Agilent kích thƣớc (25 cm X 4,6 mm) đƣợc nhồi pha tĩnh aminopropylsilylsilica gel dùng cho sắc ký (5 µm). Pha động: Nƣớc cất – acetonitril (25 : 75). Nhiệt độ cột: 45 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở các bƣớc sóng 254nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 µl Chuẩn bị mẫu thử: Dung m i pha loãng: Nƣớc cất, nƣớc cất đã đƣợc loại khí oxy hòa tan bằng các biện pháp khác nhau. Dung dịch chuẩn gốc: Cân 0,05g chất chống oxy hóa vào b nh định mức 50ml, thêm nƣớc hòa tan hoàn toàn Sau đó, hòa tan tiếp 5g Acid ascorbic chuẩn vào bình, tiếp tục hòa tan thêm 1,12g NaOH rồi điều chỉnh độ pH sao cho nằm trong khoảng từ 5 đến 6,5 Thêm nƣớc cất đến vạch định mức. Dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung môi pha loãng để đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ acid ascorbic trong khoảng 20- 200 µg/ml Mẫu thử: Pha loãng mẫu thử trong dung môi pha loãng ở tỉ lệ nhất định để đƣợc dung dịch thử có nồng độ Vitamin C trong khoảng 20-200 µg/ml Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ acid ascorbic. Nồng độ Vitamin C trong mẫu thử đƣợc xác định bằng cách so sánh với mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. 2.2.2.2 Phƣơng pháp khảo sát sự ảnh hƣởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% 23
  32. Pha chế các mẫu dung dịch thuốc Vitamin C 10% theo các công thức ở bảng 2 2 và phƣơng pháp ở hình 2.1 với các chất chống oxy hóa khác nhau. Các mẫu đƣợc bảo quản trong tủ sấy ở nhiệt độ 95 oC. Tại các thời điểm 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, lấy mẫu, đánh giá độ ổn định nhƣ mục 2.2.2.1. 2.2.2.3 Khảo sát phƣơng pháp loại oxy hòa tan trong dung môi Trong các bình nút mài có thể tích nƣớc nhƣ nhau tiến hành lần lƣợt: Mẫu 4: Đun s i nƣớc trong các bình trong các khoảng thời gian 5; 10; 15; 20; 25 phút rồi để nguội. Mẫu 5: Sử dụng máy siêu âm để siêu âm nƣớc cất trong các bình trong khoảng thời gian 5; 10; 15; 20; 25 phút. Mẫu 6: Sục khí N2 vào các bình trong các khoảng thời gian 5; 10; 15; 20; 25 phút. Sau mỗi khoảng thời gian trên, sử dụng máy đo oxy hoà tan để đo nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc. 2.2.2.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% Vitamin C đƣợc pha trong các mẫu nƣớc cất đã loại khí oxy hòa tan bằng các biện pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp nêu ở mục 2.2.1, sau đó bảo quản trong tủ sấy ở nhiệt độ là 95 oC. Sau các khoảng thời gian 0 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ, lấy mẫu, đánh giá độ ổn định nhƣ mục phƣơng pháp nêu ở mục 2.2.2.1 24
  33. CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Vitamin C bằng HPLC 3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn acid ascorbic có nồng độ 100µg/ml, với các điều kiện chạy sắc ký đã lựa chọn, ghi lại giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của diện tích pic và thời gian lƣu ảng 3 1: Khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký (n=6) Lần đo Diện tích pic (mAU) Thời gian lƣu (phút) 1 1073,634 2,112 2 1094,853 2,11 3 1113,377 2,102 4 1108,359 2,101 5 1112,765 2,094 6 1105,833 2,098 TB 1101,47 2,1028 RSD % 1,379561 0,33 Nhận xét: Từ kết quả khảo sát có thể thấy điều kiện sắc ký lựa chọn là phù hợp để định lƣợng Vitamin C với phần trăm lặp lại của thời gian lƣu RSD ≤ 1% và diện tích pic RSD ≤ 2%. 3.1.2 Độ đặc hiệu Tiến hành chạy sắc ký các dụng dịch sau đây theo quy tr nh phân tích: Dung dịch trắng: Dung môi pha mẫu (Nƣớc cất và nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hòa tan) Dung dịch placebo: Cân và hòa tan lần lƣợt 0,05g chất chống oxy hóa; 1,12g NaOH trong b nh định mức 50ml, thêm nƣớc cất đến vạch. Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn acid ascorbic 100µg/ml. Dung dịch thử: Chuẩn bị mẫu nhƣ trong quy tr nh phân tích Diện tích pic, thời gian lƣu của dung dịch trắng, dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và sắc ký đồ của các dung dịch đƣợc thể hiện dƣới đây: 25
  34. ảng 3 2: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu Các mẫu dung dịch Thời gian lƣu (phút) Mẫu trắng Không có Mẫu placebo Không có Mẫu thử 2,094 Mẫu chuẩn 2,101 dịch thử Nhƣ vậy phƣơng pháp sắc ký đã chọn có tính đặc hiệu Nhận xét: Kết quả sắc ký cho thấy các mẫu trắng, mẫu placebo không có pic tại thời gian lƣu của pic acid ascorbic trong dung dịch chuẩn và dung cao. Sắc ký đồ các mẫu dung dịch: Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu chuẩn 26
  35. 3.1.3 Độ tuyến tính Để khảo sát mức độ tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ acid ascorbic, các dung dịch chuẩn acid ascorbic có nồng độ trong khoảng từ 20µg/ml đến 200µg/ml đƣợc chuẩn bị và tiêm sắc ký. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình: ảng 3 3: Diện tích pic của dãy dung dịch acid ascorbic chuẩn Nồng độ (g/ml) 20 40 80 100 200 Diện tích pic (mAU) 229,0893 428,1363 951,829 1112,765 2352,24 2500 y = 11.844x - 27.385 2000 R² = 0.9986 1500 1000 Diện tích pic (mAU) pic tíchDiện 500 0 0 50 100 150 200 250 Nồng độ acid ascorbic (µg/ml) H nh 3 1: Đồ thị khảo sát độ tuyến tính của phƣơng pháp HPLC tại bƣớc sóng 254nm Nhận xét: Giá trị R2 = 0,9986 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ acid ascorbic trong mẫu chuẩn với diện tích pic Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lƣợng Vitamin C trong các mẫu thử. Do đó, nồng độ Vitamin C trong mẫu thử có thể đƣợc xác định bằng cách so sánh với mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 20-200μg/ml Trong các nghiên cứu định lƣợng Vitamin C bằng phƣơng pháp HPLC tiếp theo, chúng t i 27
  36. sử dụng dung dịch chuẩn Vitamin C có nồng độ 100μg/ml để so sánh với mẫu thử Kết luận: Có thể sử dụng phƣơng pháp HPLC để định lƣợng nồng độ Vitamin C trong quá tr nh nghiên cứu 3.2 Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C. Công thức dung dịch Vitamin C 10% đƣợc pha chế bằng cách thay đổi chất chống oxy hóa khác nhau theo bảng 2.2. Các kết quả thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2010 và đƣợc tr nh bày dƣới dạng T ± SD trong đó T là giá trị trung b nh, SD là độ lệch chuẩn. Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch Vitamin C đƣợc thể hiện trong bảng 3.4 và bảng 3.5 28
  37. ảng 3 4: Cảm quan và độ hấp thụ của các dung dịch Vitamin C sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Thời điểm Cảm Độ hấp Cảm Độ hấp Cảm Độ hấp (Giờ) quan thụ (A) quan thụ (A) quan thụ (A) Trong Trong Trong suốt, 0,014 suốt, 0,018 suốt, 0,015 0 không ±0,0007 không ±0,0006 không ±0,0005 màu màu màu Trong Trong Trong suốt, 0,019 suốt, 0,026 suốt, 0,034 2 không ±0,0007 không ±0,0005 không ±0,0004 màu màu màu Trong,ng Trong, ả vàng, Trong, hơi ngả 0,032 0,057 đậm hơn 0,074 4 hơi ngả vàng, ±0,0006 ±0,0003 mẫu 1 và ±0,0002 vàng đậm hơn mẫu 2 mẫu 1 Trong, Trong ngả vàng ngả vàng Trong, 0,056 0,104 đậm, đậm 0,356 6 rõ, đậm ngả vàng ±0,0007 ±0,0007 hơn mẫu ±0,0005 hơn mẫu 1 và mẫu 1 2 Trong đó: Mẫu 1: Dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Natri metabisulfit Mẫu 2: Dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Natri bisulfit Mẫu 3: Dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Rongalit 29
  38. Nhận xét: Kết quả đo quang và cảm quan cho thấy có sự khác biệt về màu sắc dung dịch và giá trị độ hấp thụ quang giữa các thời điểm khác nhau trong cùng một mẫu chất chống oxy hóa và giữa các mẫu có các chất chống oxy hóa khác nhau. Đối với cả 3 mẫu, khi tăng thời gian bảo quản trong tủ sấy thì màu sắc của dung dịch đậm dần, từ trong suốt, không màu ở thời điểm 0 giờ, 2 giờ, chuyển sang màu hơi vàng ở thời điểm 4 giờ và màu vàng đậm hơn ở thời điểm 6 giờ. Kết quả về độ hấp thụ quang của các mẫu theo thời gian cũng theo chiều hƣớng tƣơng tự, tăng dần khi tăng thời gian bảo quản trong tủ sấy. Khi so sánh màu sắc của vitamin C trong dung dịch có các chất chống oxy hóa khác nhau nhận thấy: tại thời điểm 0 giờ và 2 giờ màu sắc của các mẫu đều trong suốt, không màu. Tuy nhiên khi tiếp tục bảo quản ở 4 giờ và 6 giờ có sự khác nhau về màu sắc giữa các mẫu, trong đó mẫu 3 (có chất chống oxy hóa rongalit) có màu đậm nhất và độ hấp thụ cao nhất (A=0,356±0,0005), sau đó đến mẫu 2 (có chất chống oxy hóa Natri bisulfit) (A=0,104 ±0,0007), thấp nhất là mẫu 1 (có chất chống oxy hóa Natri metabisulfit) (A=0,056 ±0,0007). Trên cơ sở đó tiếp tục đánh giá độ ổn định về hàm lƣợng của dung dịch Vitamin C 10% bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiêụ năng cao HPLC Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.5 và hình 3.2. ảng 3 5: Hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau Thời Hàm lƣợng (%) điểm (Giờ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 0 100,68 ± 0,18 99,75 ± 0,32 100,16 ± 0,41 2 100,12 ± 0,36 98,66 ± 0,27 99,72 ± 0,13 4 98,87 ± 0,45 97,25 ± 0,14 96,95 ± 0,54 6 97,19 ± 0, 23 94,68 ± 0,19 93,84 ± 0,25 30
  39. 120 100 80 0 giờ 2 giờ 60 4 giờ 40 6 giờ 20 0 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Hình 3.2: Biểu đồ hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng các chất chống oxy hóa khác nhau Nhận xét: Kết quả định lƣợng hàm lƣợng Vitamin C trong dung dịch cho thấy khi bảo quản ở diều kiện khắc nghiệt (95ºC), nồng độ Vitamin C giảm dần theo thời gian ở cả ba mẫu Trong đó, đáng chú ý, nồng độ Vitamin C ở mẫu 3 (có chất chống oxy hóa Rongalit) và mẫu 2 (có chất chống oxy hóa Natri bisulfit) giảm mạnh hơn mẫu 1(có chất chống oxy hóa Natri metabisulfit). Bên cạnh đó, có sự tƣơng quan giữa kết quả định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC và phƣơng pháp đo màu thể hiện ở độ hấp thụ quang tăng lên và hàm lƣợng Vitamin C giảm đi khi tăng thời gian bảo quản Điều đó chứng tỏ, độ ổn định của dung dịch Vitamin C giảm khi tăng thời gian bảo quản ở điều kiện khắc nghiệt. Từ các kết quả thu đƣợc, có thể thấy Vitamin C trong dung dịch có chất chống oxy hóa Natri metabisulfit ổn định hơn trong các chất chống oxy hóa còn lại Do đó lựa chọn chất chống oxy hóa Natri metabisulfit để pha dung dịch Vitamin C 10% phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3 Kết quả khảo sát phƣơng pháp loại oxy hòa tan trong dung môi Dung dịch Vitamin C bị biến đổi màu và hàm lƣợng giảm dần theo thời gian là do acid ascorbic bị oxy hóa Để hạn chế việc giảm độ ổn định của 31
  40. Vitamin C ta có thể làm giảm tác động của oxy hòa tan bằng cách sử dụng các phƣơng pháp loại khí oxy hòa tan trong nƣớc cất để pha dung dịch Vitamin C. Các biện pháp đƣợc sử dụng để giảm nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc cất đƣợc thực hiện nhƣ phƣơng pháp nêu ở mục 2.2.2.3. Các kết quả thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2010 và đƣợc trình bày dƣới dạng T ± SD trong đó T là giá trị trung b nh, SD là độ lệch chuẩn. Kết quả sau khi sử dụng các biện pháp đun s i, siêu âm và sục khí N2 đƣợc thể hiện trong bảng 3.6 và hình 3.3: ảng 3 6: Nồng độ oxy hòa tan trong các mẫu (mg/L) Thời điểm Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 (phút) 0 5,43 ± 0,04 5,43 ± 0,04 5,43 ± 0,04 5 2,69 ± 0,08 5,35 ± 0,02 1,70 ± 0,13 10 2,68 ± 0,04 4,94 ± 0,07 0,88 ± 0,06 15 2,78 ± 0,03 4,75 ± 0,04 0,54 ± 0,11 20 2,64 ± 0,02 4,68 ± 0,05 0,58 ± 0,1 25 2,59 ± 0,01 4,62 ± 0,10 0,57 ± 0,07 30 2,63 ± 0,04 4,59 ± 0,06 0,57 ± 0,05 Trong đó: Mẫu 4: Nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hòa tan bằng phƣơng pháp đun s i Mẫu 5: Nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hòa tan bằng phƣơng pháp sục siêu âm Mẫu 6: Nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hào tan bằng phƣơng pháp sục khí N2 32
  41. (mg/L) 6 5 4 Mẫu 4 3 Mẫu 5 Mẫu 6 2 1 0 0 phút 5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 25 phút 30 phút H nh 3 3: Đồ thị biểu diễn nồng độ oxy hòa tan trong các mẫu Nhận xét: Nồng độ oxy hoà tan trong nƣớc cất giảm khi tăng thời gian đun s i nƣớc, siêu âm và sục khí N2. Khi thời gian trên 20 phút, nồng độ oxy hòa tan (DO) không có sự thay đổi đáng kể, có nghĩa là nồng độ oxy hoà tan đã bị bão hoà. Các biện pháp khác nhau có ảnh hƣởng đến sự thay đổi nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc ở mức độ khác nhau Trong đó, biện pháp siêu âm làm giảm nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc ít nhất, nồng độ oxy hòa tan (DO) thay đổi không nhiều so với nƣớc cất th ng thƣờng, tăng thời gian siêu âm làm thay đổi DO khá ít (DO giảm từ 5,43 ± 0,04 mg/L đến 4,59 ± 0,06 mg/L sau 30 phút). Tuy nhiên, đối với biện pháp đun s i nƣớc cất và sục khí N2 thì nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc giảm đáng kể so với nƣớc cất th ng thƣờng và ổn định sau khoảng 20 phút tiến hành. Bên cạnh đó, biện pháp sục khí N2 giúp đẩy khí oxy hòa tan ra khỏi nƣớc tốt hơn (DO thấp hơn) biện pháp đun sôi (sau 30 phút, giá trị DO của sục khí N2 là 0,57 ± 0,05 mg/L so với DO của đun s i là 2,63 ± 0,04 mg/L) Hơn nữa biện pháp sục khí N2 thực hiện đơn giản và nhanh hơn phƣơng pháp đun s i (do phải cần thời gian làm nguội về nhiệt độ phòng). Kết luận: Với những biện pháp làm giảm nồng độ oxy hoà tan trong nƣớc, DO thấp nhất đƣợc xếp theo thứ tự trong các mẫu: DO siêu âm > DO đun nƣớc > DO sục N2 33
  42. 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% Pha mẫu vitamin C theo CT1 với dung m i đƣợc loại oxy hoà tan bằng các biện pháp nhƣ m tả ở mục 2.2.1. Cụ thể nhƣ sau: Mẫu 7: Dung dịch Vitamin C sử dụng dung môi pha chế là nƣớc cất ở điều kiện thƣờng Mẫu 8: Dung dịch Vitamin C sử dụng dung môi pha chế là nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hòa tan bằng phƣơng pháp đun s i trong thời gian 20 phút, để nguội về nhiệt độ phòng. Mẫu 9: Dung dịch Vitamin C sử dụng dung môi pha chế là nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hòa tan bằng phƣơng pháp sục siêu âm trong thời gian 20 phút. Mẫu 10: Dung dịch Vitamin C sử dụng dung môi pha chế là nƣớc cất đƣợc loại khí oxy hào tan bằng phƣơng pháp sục khí N2 trong thời gian 20 phút. Sau đó tiến hành lão hoá cấp tốc 4 mẫu bằng cách bảo quản trong tủ sấy ở nhiệt độ 95 độ C. Tại các thời điểm: 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, lấy mẫu, so sánh độ ổn định bằng hai chỉ tiêu: Hình thức: Đánh giá cảm quan, đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng  = 420nm. Hàm lƣợng: Định lƣợng bằng HPLC Các kết quả thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2010 và đƣợc tr nh bày dƣới dạng T ± SD trong đó T là giá trị trung b nh, SD là độ lệch chuẩn. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.7, bảng 3.8 và hình 3.4. 34
  43. ảng 3.7: Độ hấp thụ của các mẫu vitamin C sử dụng dung m i đã loại oxy hoà tan Độ hấp thụ (A) Thời điểm (giờ) Mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9 Mẫu 10 0,019 0,015 0,015 0,016 0 ± 0,0004 ± 0,0005 ± 0,0003 ± 0,0007 0,024 0,019 0,029 0,019 2 ± 0,0006 ± 0,0004 ± 0,0006 ± 0,0002 0,043 0,024 0,037 0,021 4 ± 0,0003 ± 0,0005 ± 0,0004 ± 0,0003 0,061 0,035 0,052 0,029 6 ± 0,0004 ± 0,0007 ± 0,0003 ± 0,0005 ảng 3.8: Hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng dung m i đã loại khí oxy hoà tan. Thời gian Hàm lƣợng (%) (giờ) Mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9 Mẫu 10 0 101,08 ± 0,27 100,95 ± 0,12 100,29 ± 0,34 100,86 ± 0,25 2 100,42 ± 0,14 100,48 ± 0,37 99,54 ± 0,18 100,68 ± 0,21 4 98,16 ± 0,38 99,27 ± 0,25 97,95 ± 0,42 99,33 ± 0,31 6 95,02 ± 0, 16 98,84 ± 0,30 96,31 ± 0,19 98,43 ± 0,12 35
  44. 120 100 80 0 giờ 60 2 giờ 40 4 giờ 6 giờ 20 0 Mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9 Mẫu 10 Hình 3.4: Biểu đồ thể hiện hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu sử dụng dung m i đã loại khí oxy hoà tan. Nhận xét: Khi tăng thời gian bảo quản trong tủ sấy 95 ºC, hàm lƣợng Vitamin C trong các mẫu giảm tƣơng ứng với sự tăng độ hấp thụ. Kết quả này phù hợp với quan sát bằng cảm quan cho thấy có sự tăng về mức độ đậm màu của các mẫu khi kéo dài thời gian bảo quản. Kết quả thu đƣợc cũng có sự tƣơng quan với kết quả đo nồng độ oxy hòa tan trong các mẫu ở bảng 3.6 và hình 3.3. Trong đó: Mẫu 7: dung m i là nƣớc cất không loại oxy hòa tan (có nồng độ oxy hòa tan lớn nhất), có sự giảm hàm lƣợng mạnh nhất và tăng độ hấp thụ cao nhất. Mẫu 9: dung m i là nƣớc cất đƣợc siêu âm trong 20 phút (có nồng độ oxy hòa tan khá lớn, chỉ sau nƣớc cất không loại oxy hòa tan), có sự giảm hàm lƣợng và tăng độ hấp thụ khá lớn, chỉ đứng sau mẫu 7. Mẫu 8 (dung m i là nƣớc cất đun s i 20 phút) và mẫu 10 (dung m i là nƣớc cất đƣợc sục khí N2 trong 20 phút) đều có nồng độ oxy hòa tan thấp, có sự giảm hàm lƣợng và tăng độ hấp thụ khá ít và gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau. Điều đó cho thấy dung dịch Vitamin C 10% khi pha bằng dung m i là nƣớc cất đun s i hoặc nƣớc cất sục khí N2 th có độ ổn định tốt hơn khi pha bằng nƣớc cất siêu âm và nƣớc cất kh ng đƣợc loại khí oxy hòa tan. 36
  45. Đun s i dung m i trƣớc khi pha không những loại đƣợc oxy hoà tan mà còn loại đƣợc cả CO2 và một số khí khác. Do vậy, sử dụng nƣớc cất mới cất hoặc nƣớc cất đƣợc đun s i, bịt kín để nguội trƣớc khi pha dung dịch vitamin C là một biện pháp hiệu quả. Tuy nhiên, nếu sử dụng phƣơng pháp này tốn rất nhiều thời gian để pha chế dung dịch vitamin C nên phƣơng pháp này kh ng đƣợc lựa chọn để giảm nồng độ oxy hoà tan. Phƣơng pháp dùng khí N2 để giảm nồng độ oxy hoà tan trong nƣớc cất, không những cho mẫu dung dịch vitamin C ổn định về màu sắc mà phƣơng pháp này dễ thực hiện, thời gian pha chế nhanh. Do đó chúng t i để xuất sử dụng nƣớc cất có sục khí N2 để loại oxy hòa tan khi tiến hành pha chế dung dịch Vitamin C 3.5 Bàn luận 3.5.1 Sự ảnh hƣởng của các chất chống oxy hóa khác nhau đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C Dung dịch Vitamin C rất dễ bị oxy hóa ở điều kiện thƣờng nên việc sử dụng thêm chất chống oxy hóa để tăng độ ổn định cho dung dịch là điều rất cần thiết. Tuy nhiên, việc lựa chọn chất chống oxy hóa cần phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ độ pH, bản chất của dƣợc chất trong dung dịch để lựa chọn một cách phù hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát 3 chất chống oxy hóa là Natri bisulfit, Natri metabisulfit và Rongalit, mỗi chất có khả năng chống oxy hóa tối ƣu trong một vùng pH nhất định. Cụ thể là các muối metabisulfit tác dụng tốt trong các dung dịch có pH thấp, muối bisulfit tác dụng tốt trong các dung dịch có pH trung tính, rongalit tác dụng tốt ở pH cao từ 9 – 11 [11]. Dung dịch Vitamin C bền hơn trong m i trƣờng có pH từ 5 đến 6,5 [13] nên Natri metabisulfit là chất chống oxy hóa phù hợp nhất. Lý thuyết này hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm, dung dịch Vitamin C 10% ổn định nhất khi dung môi có thêm chất chống oxy hóa là Natri metabisulfit [5]. Bản chất của quá trình oxy hóa là phản ứng chuỗi đƣợc khởi đầu với một lƣợng oxy rất nhỏ dƣới sự xúc tác của các ion kim loại, nếu chỉ sử dụng chất chống oxy hóa kh ng th i th chƣa thể ngăn chặn hoàn toàn quá trình oxy hóa dƣợc chất Để tăng cƣờng hiệu quả chống oxy hóa, thƣờng thêm các chất hiệp đồng chống oxy hóa phối hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác trong một dung dịch [5]. Các chất hiệp đồng chống oxy hóa có tác dụng khóa vết các ion 37
  46. kim loại nặng dƣới dạng các phức, làm mất tác dụng xúc tác của ion kim loại trong phản ứng oxy hóa dƣợc chất. Thƣờng dùng là muối dinatri của acid ethylendiamin tetra-acetic (dinatri edetat) [12]. Một số acid dicarboxylic nhƣ acid citric, acid tartric cũng đƣợc dùng với vai trò tƣơng tự nhƣ dinatri edetat [5, 11]. Trong nghiên cứu của chúng t i, để đơn giản hóa và đánh giá ảnh hƣởng trực tiếp của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C nên không sử dụng chất hiệp đồng chống oxy hóa Tuy nhiên khi đƣa vào dung dịch thành phẩm, cần thiết phải đƣa thêm các chất hiệp đồng chống oxy hóa để tăng độ ổn định. Theo tham khảo một số tài liệu, chất hiệp đồng chống oxy hóa thƣờng dùng trong các dung dịch và thuốc tiêm Vitamin C là Natri EDTA [12]. 3.5.2 Sự ảnh hƣởng của các biện pháp giảm oxy hòa tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C Có rất nhiều phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng oxy hoà tan trong nƣớc và cũng có nhiều cách để làm giảm nồng độ oxy hoà tan trong nƣớc. Các phƣơng pháp sử dụng là: siêu âm; sục khí N2; đun s i dung m i trong khoảng thời gian 20 phút Trong đó hai biện pháp hiệu quả hơn là sục khí N2 và đun s i nƣớc. Khi sục khí N2 vào nƣớc cất, áp suất riêng phần của khí oxy hòa tan giảm, dẫn đến nồng độ khí oxy hòa tan trong nƣớc giảm. Khi đun s i nƣớc cất, oxy hoà tan giảm khá nhiều Điều này phù hợp với lý thuyết: độ tan của một chất khí trong nƣớc tỷ lệ thuận với áp suất riêng phần và tỷ lệ nghịch với nhiệt độ theo định luật Henry [8]. Có công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của oxy hoà tan đối với glutathion [27] nhƣng chƣa có nghiên cứu để đánh giá vai trò của oxy hoà tan đến độ ổn định của dung dịch vitamin C. Kết quả của chúng tôi cho thấy có sự tƣơng quan giữa nồng độ oxy hòa tan trong nƣớc với độ ổn định của dung dịch Vitamin C về cả màu sắc và hàm lƣợng. Khi nồng độ oxy hòa tan giảm th độ ổn định của dung dịch Vitamin C tăng lên, điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết sự oxy hóa các chất trong dung dịch là do sự có mặt của oxy hòa tan trong nƣớc. Phƣơng pháp đun s i nƣớc cất cho nồng độ oxy hoà tan thấp và độ ổn định về màu sắc dung dịch thuốc tiêm vitamin C cao nhƣng khi triển khai sản xuất thực tế không khả thi vì tốn nhiệt đun s i nƣớc và mất thời gian đợi nƣớc nguội. Do vậy, sục khí N2 vào nƣớc cất trƣớc khi pha dung dịch Vitamin C vừa giảm oxy 38
  47. hoà tan trong nƣớc, đồng thời để tăng độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10% và dễ triển khai qui mô công nghiệp. 39
  48. CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C, đã thu đƣợc những kết quả nhƣ sau: Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10%. Cụ thể, dung dịch Vitamin C khi sử dụng chất chống oxy hóa là Natri metabisulfit đem lại độ ổn định cao nhất cho dƣợc chất. Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của nồng độ oxy hoà tan đến độ ổn định của dung dịch Vitamin C 10%. Kết quả cho thấy dung m i đƣợc loại oxy hòa tan bằng phƣơng pháp sục khí N2 cho hiệu quả cao nhất, nồng độ oxy hòa tan trong dung môi giảm thấp nhất và độ ổn định của dung dịch Vitamin C cao nhất. 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu các phƣơng pháp khác để giảm nồng độ oxy hòa tan trong dung môi. Trên cơ sở nghiên cứu sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới độ ổn định của dung dịch thuốc chứa Vitamin C, tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới độ ổn định của thuốc tiêm chứa Vitamin C. 40
  49. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Dƣơng Thị Hồng Ánh (2010), "Biện pháp làm tăng độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C", Tạp chí nghiên cứu dƣợc và thông tin thuốc,Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Số 3. 2. Nguyễn Thị Hậu (2009), "Ảnh hưởng của khí oxy và khí carbonic trong dung môi đến độ ổn định của thuốc tiêm Vitamin C 10%", Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 3. Trần Đức Hậu (2007), Hóa Dược, Bộ Y Tế, NXB Y Học, Tập 1, tr.(245- 249). 4. Lê Thị Thanh Hƣơng (2008), Hóa Lý, Đại học Công nghiệp Tp.HCM, Tập 2, tr.(82-84). 5. Võ Xuân Minh (2006), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc, Nhà xuất bản Y học, Bộ Y Tế, Tập 1, tr.(103-163). 6. Hoàng Nhâm (2002), Hóa học vô cơ, NXB Giáo Dục, Tập 2, tr.(12- 28;111-114;162-163). 7. Hoàng Nhâm (2002), Hóa học vô cơ, NXB Giáo Dục, Tập 2, tr.( 112- 121). 8. Hoàng Nhâm (2002), Hóa học vô cơ, Tập 1, tr.(137-157). 9. Lê Thành Phƣớc (1998), Phức chất và gốc tự do trong y dược, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 10. Huỳnh Ngọc Mai Phƣơng (2006), Hóa học môi trường. 11. Bộ Y Tế (2002), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc, NXB Y Học,Tập 1, tr.(103-162). 12. Bộ Y Tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y Học, tr.(68-104). 13. Bộ Y Tế (2017), Dược Điển Việt Nam V, tr.(23-26). 14. Bộ Y Tế (2017), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam. 15. Bộ môn hóa phân tích (2004), Hóa phân tích, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Tập 1,tr.(29-46; 205-223).
  50. 16. Nguyễn Đức Vận (2006), Hóa học vô cơ, NXB Khoa học và kỹ thuật, Tập 1, tr.(316-321). Tiếng Anh 17. Arrigoni Oreste, and De Tullio Mario C (2002), "Ascorbic acid: much more than just an antioxidant". Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- General Subjects, Vol 1569(1-3), p 1-9. 18. Englard Sasha, and Seifter Sam (1986), "The biochemical functions of ascorbic acid". Annual review of nutrition, Vol 6(1), p 365-406. 19. Gruenwald Joerg, Graubaum Hans-Joachim, Busch Regina, and Bentley Christine (2006), "Safety and tolerance of Ester-C® compared with regular ascorbic acid". Advances in therapy, Vol 23(1), p 171. 20. HARAKEH STEVE, and JARIWALLA RAXIT J (1997), "NF-κB- independent suppression of HIV expression by ascorbic acid". AIDS research and human retroviruses, Vol 13(3), p 235-239. 21. Kennedy John F, Rivera Zenaida S, Lloyd Linda L, Warner Frank P, and Jumel Kornelia (1992), "L-Ascorbic acid stability in aseptically processed orange juice in TetraBrik cartons and the effect of oxygen". Food chemistry, Vol 45(5), p 327-331. 22. Meister Alton (1992), "On the antioxidant effects of ascorbic acid and glutathione". Biochemical pharmacology, Vol 44(10), p 1905-1915. 23. Mitmesser Susan H, Ye Qian, Evans Mal, and Combs Maile (2016), "Determination of plasma and leukocyte vitamin C concentrations in a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with Ester-C®". SpringerPlus, Vol 5(1), p 1-11. 24. Murad S, Grove D, Lindberg KA, Reynolds G, Sivarajah A, and Pinnell SR (1981), "Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid". Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 78(5), p 2879- 2882. 25. Özkan Mehmet, Kırca Ayşegül, and Cemeroǧlu ekir (2004), "Effects of hydrogen peroxide on the stability of ascorbic acid during storage in various fruit juices". Food chemistry, Vol 88(4), p 591-597.
  51. 26. Robertson GL, and Samaniego CML (1986), "Effect of initial dissolved oxygen levels on the degradation of ascorbic acid and the browning of lemon juice during storage". Journal of Food Science, Vol 51(1), p 184- 187. 27. Touitou E, Alkabes M, Memoli A, and Alhaique F (1996), "Glutathione stabilizes ascorbic acid in aqueous solution". International journal of pharmaceutics, Vol 133(1-2), p 85-88. 28. Zhan Xiancheng, Yin Gongkuan, and Ma Baozhong (1998), "Improved stability of 25% vitamin C parenteral formulation". International journal of pharmaceutics, Vol 173(1-2), p 43-49.
  52. PHỤ LỤC PHỤ LỤC : HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ TRONG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG BẰNG HPLC
  53. Hình 1: Mẫu dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Natri metabisulfit trong các thời điểm 0 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ ở nhiệt độ 95 oC.
  54. Hình 2: Mẫu dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Natri bisulfit trong các thời điểm 0 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ ở nhiệt độ 95 oC.
  55. Hình 3: Mẫu dung dịch Vitamin C 10% với chất chống oxy hóa là Rongalit trong các thời điểm 0 giờ; 4 giờ; 6 giờ ở nhiệt độ 95 oC.
  56. Hình 4: Hình ảnh các mẫu dung dịch Vitamin C 10% đƣợc sử dụng bằng các chất chống oxy hóa khác nhau tại thời điểm 6 giờ ở nhiệt độ 95 oC
  57. Hình 5: Hình ảnh các mẫu dung dịch Vitamin C 10% đƣợc pha chế bằng các mẫu dung m i đã loại khí hòa tan ở thời điểm 2 giờ trong nhiệt độ 95 oC.