›

Khóa luận Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 2630
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_tac_dung_chong_oxy_hoa_va_uc_che_enzym_xa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO CỦA LÁ CÂY GAI ( Boehmeria nivea L. Gaudich) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO CỦA LÁ CÂY GAI ( Boehmeria nivea L. Gaudich) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN HÀ NỘI - 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Được làm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, tôi cảm thấy vô cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thanh Tùng, ThS. Nguyễn Thị Huyền – hai thầy cô giáo đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, ủng hộ, động viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Trần Thị Quỳnh Hoa
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine monophosphate ATP Adenosine triphosphat B. nivea Boehmeria nivea (L.) Gaudich DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl FAD Dinucleotide adenine flavin GMP Guanine monophosphate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography) LD50 Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose) OD Mật độ quang PNP Purine nucleoside phosphorylase XO Xanthine oxidase XOR Xanthin oxyoreductase TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Acid uric 3 Hình 1.2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể 4 Hình 1.3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase 8 Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase 9 Hình 1.5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) 15 Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B. Nivea 17 Hình 2.1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội 21 Hình 2.2: Cao toàn phần ethanol lá Gai 22 Hình 2.3: Quy trình chiết xuất dược liệu 23 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm 29 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử 32 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic 33 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử 35 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol 35
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết 23 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử 27 Bảng 3.1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử 31 Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử 343 Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử 34 Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử 36
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3 1.1. Tăng acid uric máu 3 1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric 3 1.1.2. Tăng acid uric máu 4 1.2. Enzym xanthine oxidase 6 1.2.1. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric6 1.2.2. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa 7 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase . 9 1.2.4. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase 10 1.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro .10 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa 11 1.3.1. Khái quát 11 1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 13 1.4. Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) 14 1.4.1. Tổng quan 14 1.4.2. Đặc điểm thực vật 14 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu 21 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 21 2.1.3. Thuốc, hóa chất 23
  8. 2.1.4. Máy móc, thiết bị, dụng cụ 24 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 25 2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. 26 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 31 3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu 31 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 31 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai 33 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1. Về kết quả chiết xuất dược liệu 37 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 37 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 KẾT LUẬN 41 ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài thập kỷ qua, tỷ lệ tăng acid uric máu đang gia tăng nhanh chóng trong dân số thế giới. Bằng chứng nổi bật cho thấy tăng acid uric máu phổ biến không chỉ ở các nước phát triển [55, 71] mà còn gia tăng ở các nước thu nhập thấp và trung bình với tần suất cao [24, 38], trong đó có Việt Nam. Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]. Đặc biệt, tăng acid uric máu đã được biết từ rất lâu là yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh gout [45, 66]. Ngoài ra, khi tăng acid uric máu sẽ gây ra tình trạng stress oxy hóa ở bệnh nhân gout [13]. Xanthine oxidase (XO) là một enzym quan trọng, xúc tác phản ứng chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric. Hoạt động của enzym XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do, góp phần gây tổn thương đến nhiều quá trình bệnh lý bao gồm viêm, xơ vữa động mạch, ung thư, lão hóa và bệnh gout [49, 50]. Do đó, ức chế hoạt động của XO dẫn đến giảm nồng độ acid uric và giảm sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS). Từ xa xưa con người đã khám phá được sức mạnh thiên nhiên, biết sử dụng nhiều loài thực vật nhằm mục đích chữa bệnh và được đúc kết trong các kinh nghiệm dân gian trong những bài thuốc y học cổ truyền dùng để điều trị các chứng bệnh, trong đó có thống phong (bệnh gout). Cây lá gai có tên khoa học là Boehmeria nivea (L.) Gaudich có chứa nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, vitamin, khoáng chất [14, 21, 23, 61] xuất hiện trong các bài thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh như lợi tiểu, cầm máu và biết đến với tác dụng chống viêm, bảo vệ gan. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu khoa học được công bố về tác dụng điều trị bệnh gout, khả năng chống oxy hóa cũng như ức chế enzym XO của lá cây Gai. Vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) với mục tiêu: 1
  10. 1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH. 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. 2
  11. CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1. Tăng acid uric máu 1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng từ nhóm purin ngoại sinh và chuyển hóa purin nội sinh [74]. Trong số các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến việc sản xuất acid uric, chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng. Thực tế này đã được các nhà điều tra châu Âu ghi nhận từ kinh nghiệm của họ trong hai cuộc chiến tranh thế giới và được chứng minh thông qua sự gia tăng của bệnh gout ở Nhật Bản kể từ Thế chiến thứ II (Lượng protein trên đầu người đã tăng gấp đôi trong thời kỳ hậu chiến ở nước này) [56]. Việc sản xuất acid uric nội sinh chủ yếu từ gan [42, 69, 74], ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạch máu [69, 74]. Ở người bình thường, acid uric được bài tiết chủ yếu qua thận (chiếm 2/3 tổng lượng acid uric được tạo ra mỗi ngày) [69, 74]. Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ hơn nhưng đáng kể, acid uric được bài tiết trong dịch tiêu hóa vào ruột. Ít hơn 1% của tổng lượng acid uric được bài tiết qua mồ hôi [56]. Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C5H4N4O3 (7,9- dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton. Hình 1. 1: Acid uric Nhiều enzym có liên quan đến việc chuyển đổi hai purin acid nucleic là adenin và guanin thành acid uric như deaminase, nucleotidase (NT), purin nucleoside phosphorylase (PNP), xanthin oxidease (XO), hypoxanthine-guanin phosphoribosyl transferase (HGPRT) [33, 74] 3
  12. Hình 1. 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33]. 1.1.2. Tăng acid uric máu 1.1.2.1. Định nghĩa Tăng acid uric máu khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độ hòa tan của urat trong dung dịch có nồng độ natri như huyết tương, cụ thể là: Trên 7,0 mg/dl (tức trên 420 mol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360 mol/l) đối với nữ giới [5]. 1.1.2.2. Dịch tễ học ▪ Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) là 14,6% dân số (ước tính 32,5 triệu người), phổ biến hơn ở nam giới (24,7%) so với nữ giới (5,2%). Tăng acid uric máu ở người Mỹ gốc Mexico ít phổ biến hơn so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi [55]. ▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó, 16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới. Tỷ lệ tăng acid uric máu 4
  13. của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% so với 19,5%) [41]. ▪ Tại Nhật Bản, trong nghiên cứu Yamagata (2016) về “Nồng độ acid uric huyết thanh và tỷ lệ tử vong trong dân số Nhật Bản” đã chỉ ra rằng tỷ lệ tăng acid uric máu là 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới [73]. ▪ Tại Việt Nam, nghiên cứu về mối liên hệ giữa tăng acid uric máu với bệnh tiểu đường type 2 trong dân số Việt Nam, nhóm tác giả đã chỉ ra rằng tăng acid uric máu cao hơn nhiều trong nhóm người bị rối loạn đường huyết lúc đói, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói kết hợp với rối loạn dung nạp glucose, nhóm người tiểu đường so với nhóm dung nạp glucose bình thường. Nồng độ acid uric không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm dung nạp glucose bình thường và nhóm dung nạp glucose kém. Nam giới có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn so với nữ giới trong nhóm dung nạp glucose bình thường, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói và nhóm tiểu đường [68]. Như vậy, sự tăng acid uric có sự khác nhau giữa các quốc gia, tộc người, giữa người bình thường và những người có bệnh lý mắc kèm. Tuy nhiên, đa số tỷ lệ tăng acid uric ở nam giới cao hơn nữ giới. 1.1.2.3. Nguyên nhân tăng acid uric máu Nguyên nhân gây tăng acid uric máu là do tăng sản xuất acid uric, thận giảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74]. Tăng tổng hợp acid uric (dưới 5%) bao gồm: khiếm khuyết enzym, hoạt động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, giảm hoạt động của hypoxanthine phosphoribosiltransferase, bệnh lưu trữ glycogen (loại I, III, V, VII), tình trạng bệnh dẫn đến sản xuất quá mức purine, rối loạn tủy, bệnh ác tính, tan máu, bệnh vẩy nến, tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếu oxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống, vitamin B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức. 5
  14. Giảm bài tiết acid uric ở thận (trên 95%) bao gồm: khiếm khuyết di truyền của chức năng ống thận (không xác định), tình trạng bệnh dẫn đến giảm bài tiết acid uric, suy thận, mất nước, nhiễm toan (thiếu oxy mô), bệnh cường cận giáp, suy giáp, hội chứng Bartter, sản giật, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống, thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng, salicylat (liều thấp). Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu men Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase. 1.1.2.4. Hậu quả tăng acid uric máu ▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout Khi nồng độ acid uric trong máu lớn hơn 7 mg/dl, vượt quá nồng độ hòa tan tối đa, urat kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat. Sự lắng đọng của các hạt này ở các vị trí khác nhau gây ra các tổn thương khác nhau. Các vi tinh thể urat lắng đọng tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi. Sự khởi phát cơn gout cấp xảy xa khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch khớp, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gout, và cuối cùng, viêm thận kẽ (bệnh thận do gout) là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận [5]. ▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]. Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và các bệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu. 1.1.3. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric Năm 1902, Schardinger và các đồng nghiệp đã báo cáo về một chất chưa xác định có trong sữa tươi nguyên chất có thể làm mất màu xanh metylen khi bổ sung formaldehyd. Gần 20 năm sau, chất này cũng được tìm thấy trong sữa bò, 6
  15. trong gan, thận, lá lách và phổi của chuột, có khả năng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và sau đó xanthin thành urate trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Những phát hiện này đã thúc đẩy rất nhiều sự quan tâm từ các nhà nghiên cứu enzym và sinh hóa, dẫn đến sự phân lập, tinh chế và nghiên cứu về xanthin oxyoreductase (XOR) [43]. Thực tế, enzym XO được tìm thấy trên nhiều động vật có vú [15, 47], chim, bò sát, vi khuẩn. Trong tất cả các động vật có vú được nghiên cứu, enzym XO có trong gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu, và các mô khác. Trong đó, gan và ruột có hoạt động XOR cao nhất [19] . .Xanthine oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra acid uric. Dưới tác dụng xúc tác của enzym XO, hypoxanthin được chuyển thành xanthin và xanthin được chuyển hóa thành acid uric. Ức chế XO sẽ làm giảm nồng độ acid uric, dẫn đến tác dụng chống tăng acid uric [67]. Ngày nay, việc kiểm soát nồng độ acid uric là một yếu tố quan trọng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric và gout [27]. 1.2. Enzym xanthine oxidase 1.2.1. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu đơn vị [18, 30]. Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxy hóa khử : một phần phụ molybden (Mo-co), một FAD và hai Fe2S2 (trung tâm Fe/S). Phần phụ của molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác. 7
  16. Hình 1. 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase FAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng) Cơ chế hoạt động: Enzym XO xúc tác quá trình hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric tại trung tâm Mo-co. Ở trạng thái oxy hóa, proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân của cơ chất, hai electron được chuyển đến nguyên tử Mo (Mo VI đến Mo IV ) của Mo-co. Sự vận chuyển electron đến FAD thông qua hai trung tâm Fe/S được chuyển tiếp nhanh chóng và tạo ra MoV. Sau đó, 표 được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi kết thúc phản ứng [57]. 8
  17. Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20] 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất xanthin tăng thì tốc độ phản ứng tăng, lượng acid uric tạo ra càng nhiều. Tuy nhiên đến một mức nào đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng thêm nữa khi enzym đã bão hòa cơ chất [7]. Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [7]. Nhiệt độ: Hoạt động của enzym phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Thông thường, khi tăng 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2-3 lần [35]. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao enzym sẽ bị biến tính. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng trong quá trình bảo quản enzym. XO được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC [54]. 9
  18. pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym. Với XO, pH thích hợp từ 7,5- 8,0 [16]. 1.2.3. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) ban đầu được Falco tổng hợp vào giữa những năm 50 của thế kỷ trước trong một nỗ lực để tạo ra các chất chống ung thư mới, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt tính ức chế xanthine oxidase, làm giảm cả nồng độ acid uric trong huyết thanh và nước tiểu. Năm 1963, Rundles và đồng nghiệp lần đầu tiên đã thử nghiệm lâm sàng thành công về việc sử dụng allopurinol trong điều trị bệnh gout. Thuốc đã được FDA chấp thuận vào năm 1966 [19]. Cả allopurinol và oxypurinol (chất chuyển hóa chính của nó) đều ức chế enzym xanthine oxidase, do đó làm giảm sinh tổng hợp acid uric dẫn đến giảm nồng độ acid uric máu, thúc đẩy sự thanh thải hypoxanthin và xanthin qua nước tiểu, vì vậy giảm hình thành sỏi thận và các cơn đau thận hơn [8, 19]. Allopurinol có ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh gout và các trường hợp tăng acid uric thứ phát (do dùng thuốc chống ung thư, thuốc lợi tiểu thiazid ) [8]. Tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc có thể gây kích ứng tiêu hóa, độc với gan và dị ứng da, có thể gặp cơn gout cấp ở giai đoạn đầu điều trị. Khắc phục bằng cách dùng kết hợp với colchicin hoặc các thuốc chống viêm khác [8]. 1.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro Các phương pháp xác định hoạt hoạt độ enzyme XO in vitro thường đo lượng các sản phẩm chuyển hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành axit uric, cũng như sản xuất gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH. Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng: 10
  19. Xanthine oxidase Xanthin + H2O + O2 Acid uric + H2O2 Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60]. Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện, nhạy đối với enzym tinh khiết. Phương pháp hóa phát quang phát hiện O2- gây ra bởi XO Luminol là chất phát quang hóa học và đặc biệt các chất phát quang có nguồn gốc lucigenin (LDCL) thường được sử dụng để phát hiện O2- in vitro sản xuất bởi hệ thống enzyme hoặc các tế bào nguyên vẹn [19]. .- Phương pháp xác định O2 bằng thử nghiệm Cytochrom c .- Việc sản xuất O2 có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạng sắt có trong cytochrom c: Các tế bào được ủ với Fe3+-Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19]. 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa 1.3.1. Khái quát Chất chống oxy hóa là một chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các chất khác gây ra. Trong cơ thể, chúng bảo vệ các thành phần tế bào quan trọng bằng cách trung hòa các gốc tự do (là sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa tế bào. Các gốc tự do được tạo ra khi oxy được chuyển hóa hoặc hình thành 11
  20. trong cơ thể.) Các gốc tự do có electron chưa ghép cặp vỏ ngoài của phân tử. Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA. Những gốc tự do này tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào. Các gốc tự do có thể là dẫn xuất oxy (ROS, các loại oxy phản ứng) hoặc có nguồn gốc nitơ (RNS, các loại nitơ phản ứng). Các phân tử có nguồn gốc oxy là - O 2 (superoxide), HO (hydroxyl), HO2 (hydroperoxyl), ROO (peroxyl), RO (alkoxyl) là gốc tự do và H2O2. Các nitơ phản ứng chủ yếu là NO (oxit nitric), ONOO (peroxy nitrate), NO2 (nitơ dioxide) và N2O3 (dinitrogen trioxide). Trong một tế bào bình thường, chất chống oxy hóa và chất oxy hóa cân bằng. Tuy nhiên, sự cân bằng này có thể được thay đổi, khi các chất oxy hóa tăng hoặc khi mức độ chất chống oxy hóa bị giảm. Giai đoạn này được gọi là stress oxy hóa. Stress oxy hóa dẫn đến tổn thương các phân tử sinh học bao gồm axit nucleic, protein, axit béo không bão hòa đa (PUFA) và carbohydrate. Peroxid hóa lipid là sự suy giảm oxy hóa của lipid không bão hòa đa và nó liên quan đến ROS và các ion kim loại chuyển tiếp. Đây là một cơ chế phân tử của tổn thương tế bào dẫn đến một loạt các sản phẩm gây độc tế bào, hầu hết là các aldehyd, như malondialdehyd (MDA), 4 hydroxynonrnal (HNE), stress oxy hóa gây ra tổn thương tế bào nghiêm trọng dẫn đến nhiều loại bệnh ở người như bệnh Alzheimer, Parkinson, xơ vữa động mạch, ung thư, viêm khớp, suy giảm miễn dịch và rối loạn thoái hóa thần kinh, Thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên cũng dẫn đến stress oxy hóa, biểu thị các chất chống oxy hóa tự nhiên có trong cơ thể người chết. Có 2 loại chất chống oxy hóa là chất chống oxy hóa enzym và không enzym. Trong chất chống oxy hóa enzym có chất chống oxy hóa sơ cấp và thứ cấp [46]. Chất chống oxy hóa sơ cấp là các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi phản ứng với các gốc lipid và chuyển chúng thành các sản phẩm ổn định hơn. Chất chống oxy hóa của nhóm này chủ yếu là các phenolic, trong cấu trúc và bao gồm 12
  21. các chất sau: Khoáng chất chống oxy hóa, vitamin chống oxy hóa, các chất hóa học thiên nhiên bao gồm các flavonoid, catechin, carotenoid, -carotene, lycopene, diterpene, tiêu đen, tỏi. Chất chống oxy hóa thứ cấp là những hợp chất phenolic thực hiện chức năng thu giữ các gốc tự do và ngăn chặn các phản ứng dây chuyền. Các hợp chất bao gồm: butylated hydroxy anisole (BHA), butylated hydroxy toluene (BHT) và propyl gallate (PG). 1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Có nhiều phương pháp để đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro. Dựa trên phản ứng hóa học giữa các hợp chất chống oxy hóa và các gốc tự do, các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa được phân loại thành hai loại [26]. 1. Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển nguyên tử hydro (HAT) 2. Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển điện tử (ET) Thử nghiệm ET bao gồm: phương pháp DPPH, phương pháp nhặt gốc Superoxide anion, FRAP, TEAC sử dụng ABTS, thử nghiệm CUPRAC, FCR-xét nghiệm tổng phenol, thử nghiệm DMPD, ức chế gốc oxit nitric, thử nghiệm TBARS Thử nghiệm dựa trên HAT bao gồm: ORAC, phương pháp ABTS, thử nghiệm Crocin, TRAP, hoạt động quét gốc hydroxyl, HORAC, thử nghiệm LPIC, quét các gốc H2O2, IOC, thử nghiệm PCL, thử nghiệm -carotene-axit linoleic (linoleate) Một số phương pháp chống oxy hóa in vitro khác: hàm lượng axit ascoric, CAA, đo quang EPR, thử nghiệm phosphomolybdenum, phương pháp Xanthine oxyase, hoạt động chelating kim loại. Trong số các phương pháp nhặt gốc tự do, phương pháp 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) còn nhanh hơn, đơn giản (tức là không liên quan đến nhiều bước và thuốc thử) và không tốn kém so với các mô hình thử nghiệm khác. 13
  22. 1.4. Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) 1.4.1. Tổng quan Cây lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich), còn có nhiều tên gọi khác là Gai tuyết, Trữ ma, Tầm Ma, [6, 10], là một loài thực vật có hoa thuộc họ Urticaceae, được trồng rộng rãi ở các nước Đông Á như Hàn Quốc, Ấn Độ và Trung Quốc [34, 40, 65]. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, được trồng ở một số tỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1]. Trong dân gian, từ lâu đời, lá gai vẫn thường được sử dụng như một loại thuốc lợi tiểu và cầm máu, và được cho là có đặc tính bảo vệ gan, chống oxy hóa và chống viêm [11, 37]. 1.4.2. Đặc điểm thực vật 1.4.2.1. Tên khoa học Boehmeria nivea (L.) Gaudich 1.4.2.2. Phân loại thực vật Giới (regnum) Plantae Ngành (divisio) Magnoliophyta Lớp (class) Magnoliopsida Bộ (ordo) Urticales Họ (familia) Urticaceae Chi (genus) Boehmeria Loài (species) B. nivea 1.4.2.3. Tên địa phương Gai tuyết, Trữ ma, Tầm ma, Co pán (Thái), Bẩu pán (Tày), Chiểu đủ (Dao) .[11]. 1.4.2.4. Đặc điểm thực vật 14
  23. Cây nhỏ cao 1,5-2m; gốc hoá gỗ. Rễ dạng củ, hình trụ thường cong queo, màu vàng chứa nhiều nhựa gôm. Cành màu nâu nhạt, có lông. Lá lớn, mọc so le, hình trái xoan dài 5-16 cm, rộng 9,5-14 cm, mép khía răng, mặt trên xanh, mặt dưới trắng bạc phủ lông mềm và mịn; lá kèm hình dải nhọn, thường rụng, cuống lá màu đo đỏ. Hoa đơn tính cùng gốc. Hoa đực có 4 lá đài và 4 nhị. Hoa cái có đài hợp chia làm 3 răng. Quả bế mang đài tồn tại. Mùa hoa tháng 5-8, mùa quả tháng 8-11 [6, 10]. Hình 1. 5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) 1.4.2.5. Phân bố Cây có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới châu Á, phân bố ở các nước Bhutan, Campuchia, Trung Quốc (Nam An Huy, Phúc Kiến, Nam Cam Túc, Quảng Đông, Quảng Tây Quý Châu, Nam Hà Nam, Hải Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tây, Nam Thiên Tây, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang), Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Nepal, Sikkim, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam [17, 34, 40, 65]. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, thường mọc ở rìa rừng, bụi cây, những nơi ẩm ướt dọc theo suối, ven đường, được trồng ở một số tỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1]. 15
  24. 1.4.2.6. Bộ phận dùng Rễ củ-Radix Boehmeriae thường gọi là Trữ ma căn và lá-Folium Boehmeriae. Thu hái: rễ có thể thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa hạ hay mùa thu. Ðào rễ, rửa sạch đất cát, bỏ rễ con, thái mỏng hoặc để nguyên, rồi phơi hay sấy khô; có khi dùng tươi. Lá có thể thu hái quanh năm [10]. 1.4.2.7. Thành phần hóa học Kết quả định tính trong dịch chiết lá B. nivea chỉ ra các thành phần hóa học có chứa trong dịch chiết bao gồm anthraquinon, phenol, tinh dầu, steroid, terpen, acid amin, polysaccharid và acid hữu cơ, lacton và coumarin [63]. Theo Yongsheng Chen và cộng sự (2014), lá Gai có chứa các hợp chất có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm và tác dụng chống ung thư đối với ung thư phổi và gan, trong đó bao gồm các phenolic và flavonoid [21]. Tại Hàn Quốc, các công trình nghiên cứu xác định thành phần hóa học của lá gai bằng HPLC đã chỉ ra nhiều hợp chất có tác dụng dược lý: lá B. nivea chứa một lượng lớn các hợp chất phenolic có khả năng ức chế men chuyển angiotensin; các hợp chất polyphenolic hay flavonoid là epicatechin, epicatechin gallate và rutin, acid chlorogenic được biết đến với các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi khuẩn, chống vi rút và chống dị ứng [22, 37, 59]. Bên cạnh đó, theo 3 tác giả Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014), Sunghun Cho và cộng sự (2017) đều chỉ ra rằng lá Gai chứa nhiều loại amino acid, acid béo, acid hữu cơ, carbohydrat, vitamin, khoáng chất [14, 23, 52]. Trong đó, các phenolic bao gồm: chlorogenic acid, caffeic acid, 4-coumaric acid, ferulic acid, benzoic acid. Các flavonoid bao gồm: epicatechin, rutin, isoquercetin, hyperoside Các carbohydrate bao gồm: sucrose, glucose, fructose, galactose, mannitol Các amino acid bao gồm: threonine, glutamic acid, proline, methionine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine 16
  25. Các acid béo bao gồm: palmitic acid, margaric acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosylic acid, lignoceric acid Các acid hữu cơ bao gồm: oxalic acid, citric acid, succinic acid Các vitamin bao gồm: vitamin A (retinol), vitamin E (α- tocopherol), vitamin C Các khoáng chất bao gồm: Ca, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B. Nivea [22] 1. β-sitosterol, 2. Loliolide, 3. Rutin, 4. Pyrimidinedione 1.4.2.8. Công dụng cổ truyền Trong y học cổ truyền ở Cộng hòa dân chủ Congo (DR Congo), toàn bộ cây được nghiền nát và ngâm trong nước để được một loại thuốc bôi lên cơ thể điều trị bệnh thấp khớp, bệnh phong, bệnh ngoài da và vết thương, thấm vào mắt để điều trị bệnh về mắt, thấm vào mũi chống viêm mũi, và ngâm rượu để điều trị tiêu chảy và giun sán. Ở Malaysia, lá gai được sử dụng để đắp mụn nhọt và chống đầy 17
  26. hơi; thuốc sắc của rễ và lá được dùng làm thuốc bổ trong trường hợp kiết lỵ và rễ được sử dụng trên các vết loét. Ở Ấn Độ, rễ và lá được xem là có tác dụng làm mát, lợi tiểu và được sử dụng trong một số rối loạn bao gồm rối loạn tiểu tiện, viêm niệu sinh dục và sa tử cung. Ở Trung Quốc và Đài Loan, cây được sử dụng cho mục đích lợi tiểu, hạ sốt và bảo vệ gan [51]. Một số bài thuốc sử dụng lá gai: 1. Lá gai dùng riêng hoặc giã đắp với cây cứt lợn có tác dụng cầm máu, làm lành vết thương; lá gai phối hợp với lá vông, lạc tiên, rau má, nấu thành cao, pha đường uống, làm thuốc an thần, gây ngủ [11]. 2. Rễ và lá gai còn là thuốc lợi tiểu, chữa đi tiểu ra máu với liều dùng trung bình 10 – 30g mỗi ngày, sắc nước uống [11]. 1.4.2.9. Tác dụng dược lý 1. Dịch chiết bằng cồn từ cây gai trên ống nghiệm có tác dụng thúc đẩy quá trình đông máu, trên thí nghiệm cắt đuôi chuột nhắt để xác định thời gian chảy máu, thuốc có tác dụng cầm máu. Trong thí nghiệm lấy máu từ tĩnh mạch sau hố mắt trên chuột nhắt trắng, dạng thuốc trên với liều 0,3ml bằng đường tiêm phúc mạc hoặc với liều 0,5ml bằng đường uống có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu. Trên những chó thí nghiệm gây xuất huyết dưới da bằng cách dùng chất cobalt để chiếu xạ thì dạng chế phẩm trên của gai có tác dụng làm giảm hiện tượng xuất huyết một cách rõ rệt [11]. 2. Acid chlorogenic có trong dược liệu là một chất ít độc, có tác dụng tăng cường hiệu lực của adrenalin, thông tiểu tiện, kích thích sự bài tiết mật và có khả năng ức chế tác dụng của pepsin và trypsin. Acid chlorogenic còn có tác dụng diệt nấm và kháng khuẩn [11]. 3. Muối ammonium của acid cafeic được phân giải từ acid chlorogenic, trên thỏ thí nghiệm tĩnh mạch với liều lượng 7mg/kg có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu 58%, rút ngắn thời gian chảy máu 52%. Trên chuột nhắt trắng đã dùng cobalt để chiếu xạ, dùng acid cafeic tiêm xoang bụng với liều lượng 14mg/kg, tiêm liên tục trong 2 tuần lễ thì số lượng bạch cầu tăng 18
  27. 76,4% và số lượng tiểu cầu tăng 45,6%. Với nồng độ pha loãng 1: 128 trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn vàng [11]. 4. Về độc tính cấp trên chuột nhắt trắng bằng tiêm phúc mạc, thuốc có 퐿 50=1583 mg/kg, về độc tính bán mãn trên thỏ thí nghiệm với liều 14mg/kg tiêm liên tục trong 10 ngày qua kiểm tra thấy các cơ quan tim, gan, thận về mặt công năng và tổ chức học không có biểu hiện gì về biến đổi bệnh lý [11]. 1.4.2.10. Một số nghiên cứu về tác dụng của lá gai trên thế giới liên quan đến tác dụng chống oxy hóa và bệnh gout Nghiên cứu của Mi Jeong Sung và cộng sự (2013) đã đánh giá tác dụng chống viêm của chiết xuất ethanol 70% từ lá gai bằng cách đo sự bài tiết của oxit nitric (NO), yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và interleukin 6 (IL-6), được kích thích bởi lipopolysacarit (LPS) trong các đại thực bào RAW264.7, kết quả chỉ ra rằng lá gai có tác dụng chống viêm đối với các đại thực bào bằng cách ức chế p38 và JNK (là các phân tử tín hiệu đóng vai trò trung gian đáng kể trong việc sản xuất các cytokine gây viêm), cho thấy lá gai có thể được sử dụng như một thành phần có tác dụng chống viêm [58]. Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa của lá gai đã được chứng minh bởi Jin Woo Nho và cộng sự (2010) bằng phương pháp đo DPPH với IC50 là 97 g/ml [48]. Trong nghiên cứu của Qin Wang và cộng sự (2018) về đánh giá khả năng chống oxy hóa và hoạt động ức chế α -glucosidase chiết xuất từ mười giống lá gai khác nhau ở Trung Quốc đều cho thấy tác dụng chống oxy hóa và khả năng ức chế α-glucosidase của dược liệu này [62]. 1.4.2.11. Một số nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase của lá gai tại Việt Nam Nguyễn Thị Thu Hoài (2014) đã nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro trên 147 dược liệu bằng dung môi methanol cho thấy lá cây gai thuộc một trong tám mẫu dược liệu có khả năng ức chế XO mạnh nhất (IC50 = 10,60 µg/ml) [2]. 19
  28. Phạm Ngọc Khôi (2019) đã ghiên cứu khảo sát khả năng ức chế enzym xanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai cho thấy giá trị IC50 của cao chiết ethanol 50% từ lá gai là 273 µg/ml, tuy kết quả IC50 của cao chiết yếu nhưng các hợp chất sinh học trong cao chiết lá cây gai có khả năng ức chế enzym XO và có tiềm năng sử dụng cao chiết lá cây gai như thực phẩm bổ sung trong điều trị bệnh gout [4]. Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá tác dụng của lá cây gai ở các phân đoạn khác nhau với mục đích tìm ra phân đoạn dịch chiết có hoạt tính cao nhất. 20
  29. CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu Nguyên liệu là lá cây Gai được thu hái tại Hà Nội vào tháng 7 năm 2019, rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khối lượng không đổi và bảo quản trong túi nilon. Mẫu nghiên cứu được Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược giám định tên khoa học là Boehmeria nivea (L.) Gaudich, họ Urticaceae. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Hình 2. 1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu Chuẩn bị dịch chiết toàn phần ethanol Dược liệu lá Gai (300 g) khô được tiến hành chiết xuất bằng dung môi ethanol 50% (3 lít x 3 lần) sử dụng thiết bị siêu âm ở 40표C trong vòng 1 giờ 30 phút. Gộp các dịch chiết ethanol sau đó lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới 21
  30. áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được cao chiết toàn phần ethanol (27 g). Hình 2. 2: Cao toàn phần ethanol lá Gai Chuẩn bị các phân đoạn dịch chiết Cao chiết được phân tán vào nước cất tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và n-Butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 300 mL). Các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được thu được phân đoạn tương ứng là n-hexan, EtOAc và n-BuOH. Quy trình chiết xuất dược liệu được thể hiện ở hình 2.3: 22
  31. Hình 2. 3: Quy trình chiết xuất dược liệu 2.1.3. Thuốc, hóa chất Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết STT Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc, xuất Tiêu chuẩn xứ 1 Allopurinol Sigma Aldrich, USP Singapore 2 Xanthin (≥ 99%) Sigma Aldrich, USP Singapore 3 Enzym Xanthine oxidase Sigma Aldrich, USP Singapore 4 1,1 – diphenyl – 2 – Ấn Độ TCNSX picrylhydrazyl 23
  32. 5 Na2HPO4.12H2O, Trung Quốc TCNSX NaH2PO4.2H2O 6 Acid ascorbic Trung Quốc TCNSX 7 HCl đậm đặc 37%, NaOH Trung Quốc TCNSX 8 Dung môi: n-hexan, Trung Quốc TCNSX ethylacetat (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), DMSO, ethanol, methanol, nước cất. 2.1.4. Máy móc, thiết bị, dụng cụ - Máy đo quang UV Aligent technologies cary 60 UV-Vis, Mỹ - Máy đo pH Metteler Toledo (Thụy Sỹ) - Cân phân tích AY 220 (Shimadzu, Nhật Bản) - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi- Đức) - Máy khuấy từ (Shimadzu, Nhật Bản) - Máy ly tâm (Shimadzu, Nhật Bản) - Micro pipet đa kênh 10-200µL, 100-1000µL. - Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh 2.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung sau: Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 24
  33. Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một trong những phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất, lựa chọn đầu tiên để đánh giá hoạt động chống oxy hóa vì tính đơn giản và nhanh chóng, chỉ yêu cầu máy quang phổ UV-VIS để thực hiện [28]. Nguyên lý DDPH có khả năng tạo gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Dung dịch DPPH có màu tím đậm với độ hấp thụ tối đa ở 517nm. Màu tím này thường sẽ chuyển thành màu vàng khi có chất chống oxy hóa trong môi trường. Cho các chất thử vào dung dịch, nếu chất có khả năng quét gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của DDPH [28]. Chuẩn bị hóa chất cần thiết - Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích. - Chất chuẩn dương acid ascorbic (Trung quốc) được hòa tan trong MeOH bão hòa với nồng độ 50 µg/ml; 25 µg/ml; 20 µg/ml; 10µg/ml; 5 µg/ml; 2,5 µg/ml. - 1,1- diphenyl – 2 –picrylhydrazyl (DDPH, Ấn Độ) pha trong MeOH được nồng độ 4,0 mg/ml. - Mẫu thử: dược liệu được hòa tan trong MeOH bão hòa với các nồng độ 500 g/ml; 250 g/ml; 125 g/ml; 62,5 g/ml; 31,25 g/ml; 15,625 g/ml dùng cho thí nghiệm. Cách tiến hành Mẫu thử được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Hỗn hợp phản ứng gồm: 630μL dung dịch DPPH (4,0 mg/ml trong methanol); 100 25
  34. μL các mẫu với nồng độ khác nhau của dịch chiết; 270μL MeOH. Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở 25표C trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm. Tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 630μL dung dịch DPPH ; 370μL MeOH. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cách đánh giá kết quả Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (I%) theo công thức: − 푡 I% = 100 − 표 Trong đó: I%: phần trăm ức chế Ac: độ hấp thụ của mẫu chứng At: độ hấp thụ của mẫu thử A0: độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn dương là acid ascorbic. Giá trị IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị giữa nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%). 2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai. Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ xúc tác của enzym XO. Thí nghiệm được tiến hành dựa trên phương pháp của M. Umamaheswari và của Đái Thị Xuân Trang có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [9, 60]. Nguyên tắc định lượng dựa trên phản ứng sau: 26
  35. Xanthine oxidase Xanthin + H2O + O2 Acid uric + H2O2 Hoạt độ XO được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành được đo ở bước sóng 295nm ở 37표C, pH 7,5 hoặc 8,0. Một đơn vị enzym được định nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra 1 µmoL acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 37ºC. Chuẩn bị hóa chất cần thiết - Đệm phosphat 50mM, pH=7,5. - Enzym XO - Cơ chất: dung dịch xanthin 150µM trong đệm phosphat. - Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 0,5M. - Chất chuẩn dương Allopurinol được hòa tan trong đệm phosphat với nồng độ 50 µg/ml; 25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 10µg/ml; 5 µg/ml; 2,5 µg/ml. - Mẫu thử: cao dược liệu được hòa tan trong DMSO. Sau đó được pha với đệm đến các nồng độ 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL dùng cho thí nghiệm. Cách tiến hành Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai được tiến hành tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Bố trí thí nghiệm Bảng 2. 2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử Mẫu chứng (µl) Mẫu đối chiếu (µl) Mẫu thử (µl) Dung dịch thử 0 0 100 Allopurinol 0 100 0 27
  36. Đệm phosphat 500 400 400 pH=7,5 XO 0,2 U/ml 100 100 100 Xanthin 150 µM 200 200 200 HCl 0,5M 200 200 200 Tổng thể tích 1000 1000 1000 Quy trình thí nghiệm Chuẩn bị mẫu thử: Các cao phân đoạn từ lá gai được pha trong DMSO tạo thành dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL. Sau đó dung dịch gốc này được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat thành các nồng độ 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng gồm: 100 µL dung dịch mẫu thử, 400 µL dung dịch đệm phosphat 50 mM pH = 7.5, 100 µL dung dịch enzym XO 0,2 U/mL trong dung dịch đệm phosphat (pha ngay trước khi tiến hành phản ứng). Hỗn hợp này được ủ ở 37표C trong 15 phút, sau đó thêm 200 µL xanthin (0,15 mM) trong dung dịch đệm rồi ủ tiếp 30 phút. Dừng phản ứng bằng cách thêm 200 µL HCl 0,5M. Hỗn hợp phản ứng được đem đo độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 295 nm. Mẫu chứng được tiến hành tương tự nhưng dung dịch thử được thay bằng dung dịch đệm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4: 28
  37. Hình 2. 4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm Cách đánh giá kết quả Tính I% (phần trăm ức chế) theo công thức: ℎứ푛𝑔− 푡ℎử I= 100% ℎứ푛𝑔 Trong đó: OD: Độ hấp thụ quang ODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng ODthử = ODthử - ODtrắng thử 29
  38. Allopurinol được sử dụng làm chứng dương. Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn nồng độ (C) và giá trị phần trăm ức chế enzym XO (I%). 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và phần mềm SigmaPlot 12.0. Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn). Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình biểu diễn giữa nồng độ (C) và giá trị phần trăm ức chế (I%) của các phân đoạn cao chiết từ lá gai. 30
  39. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu Sau khi tiến hành chiết xuất 300g dược liệu lá gai khô bằng EtOH 50%, kết quả thu được 27g (9.00%) cao khô. Tiếp theo, tiến hành chiết phân đoạn cao EtOH thu được kết quả các phân đoạn n- Hexan, EtOAc, n- BuOH lần lượt như sau: 0,93g; 1,00g; 2,53g, hiệu suất chiết phân đoạn tương ứng là 3,44%; 3,70%; 9,37%. 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của cao toàn phần ethanol lá gai, các phân đoạn n-hexan, ethylacetat, n-butanol và acid ascorbic được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3. 1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử Phần trăm ức chế (%) Nồng độ 15,625 31,25 62,5 125 250 500 (g/ml) 24,67 35,03 44,16 51,27 61,42 74,62 EtOH ±0,66 ±1,07 ±0,81 ±0,37 ±1,44 ±0,53 n- 13,71 24,67 32,69 40,81 50,96 64,67 Hexan ±1,12 ±0,67 ±0,37 ±0,37 ±1,13 ±0,53 17,77 27,92 37,06 44,16 55,13 68,53 EtOAc ±0,87 ±1,23 ±0,97 ±0,73 ±0,44 ±0,70 n- 27,01 38,98 46,80 55,43 65,69 79,59 BuOH ±0,57 ±1,03 ±0,71 ±1,68 ±0,56 ±0,37 31
  40. Phần trăm ức chế (%) Nồng độ 2,5 5 10 20 25 50 (g/ml) Acid 14,11 25,05 36,09 48,77 58,08 79,55 ascorbic ±0,67 ±0,18 ±0,45 ±0,47 ±0,27 ±0,35 Từ bảng kết quả, ta vẽ đường đồ thị và phương trình biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử: EtOH n- BuOH 600 600 2 2 Y= 0.2158x -13.94x+239.08 Y= 0.2394x -14.231x+226.03 500 500 R2=0.9992 2 R =0.999 400 400 g/ml) g/ml)  (  ( 300 ộ ộ 300 ng đ ng đ ồ 200 ồ 200 N N 100 100 0 0 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 I% I% n- Hexan EtOAc 600 600 2 Y= 0.2252x2-8.2741x+90.894 Y= 0.2257x -10.101x+128.66 500 500 2 R2=0.9994 R =0.999 400 g/ml) 400 g/ml)   ( ( ộ 300 ộ 300 ng đ ng đ ồ ồ N 200 N 200 100 100 0 0 0 20 40 60 0 20 40 60 80 I% I% Hình 3. 1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử 32
  41. Acid ascorbic 60 Y= 0.0085x2-0.0669x+1.6533 50 2 R =0.997 40 g/ml)  ( 30 ộ ng đ 20 ồ N 10 0 0 20 40 60 80 I% Hình 3. 2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic Từ phương trình biểu diễn giữa nồng độ (C) và giá trị phần trăm ức chế (%I) của các mẫu thử ta tính được giá trị IC50 như sau: Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử Mẫu Cao Cao Acid Cao EtOH Cao EtOAc thử n-hexan n-BuOH ascorbic IC 50 112,98±2,21 240,19±3,56 187,86±2,48 81,58±3,76 19,56±2,89 (g/ml) Kết quả phần trăm ức chế (I%) của cao chiết phân đoạn lá Gai và acid ascorbic được trình bày ở bảng 3.1. Giá trị IC50 của các phân đoạn lá Gai dao động từ 81,58 ± 3,76 g/ml đến 240,19 ± 3,56 g/ml. Trong đó, phân đoạn n- BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao nhất với IC50 là 81,58 ± 3,76 g/ml, sau đó là cao chiết toàn phần EtOH, phân đoạn EtOAc với IC50 lần lượt là 112,98 ± 2,21 g/ml, 187,86 ± 2,48 g/ml. Phân đoạn n- Hexan thể hiện khả năng chống oxy hóa thấp với giá trị IC50 là 240,19 ± 3,56 g/ml. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Acid ascorbic cho kết quả IC50 là 19,56 ± 2,89 µg/ml thể hiện khả năng chống oxy hóa cao hơn các mẫu thử. 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai 33
  42. Giá trị phần trăm ức chế I (%) của các phân đoạn lá gai ở các nồng độ khác nhau và Allopurinol được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử Phần trăm ức chế (%) Nồng độ 25 50 100 200 400 (g/ml) EtOH 16,08±0,63 24,11±0,47 33,96±0,14 45,15±0,71 59,34±0,24 n- Hexan 6,38±0,85 15,76±0,36 24,98±0,59 34,67±0,59 47,04±0,24 EtOAc 13,71±1,32 21,51±0,71 32,62±1,03 43,95±0,36 58,47±0,27 n- BuOH 24,35±2,36 33,10±0,71 43,34±0,83 53,19±0,47 68,64±0,55 Phần trăm ức chế (%) Nồng độ 2,5 5 10 12,5 25 50 (g/ml) 34,28 43,50 53,90 58,63 71,63 88,89 Allopurinol ±1,44 ±0,47 ±1,03 ±0,41 ±0,63 ±0,24 Từ bảng kết quả, ta vẽ được đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym xanthine oxidase của các mẫu thử 34
  43. EtOH n- BuOH 500 500 Y= 0.1791x2-4.9256x+60.435 Y= 0.1674x2-7.0839x+98.503 400 400 R2=0.9996 R2=0.9993 300 300 g/ml) g/ml)  (  ( ộ ộ 200 200 ng đ ng đ ồ ồ N N 100 100 0 0 0 20 40 60 0 20 40 60 80 I% I% n- Hexan 500 EtOAc 500 Y= 0.2345x2-3.4129x+39.928 Y= 0.1621x2-3.3552x+42.342 400 400 R2=0.9994 R2=0.9993 300 g/ml) g/ml) 300   ( ( ộ ộ 200 200 ng đ ng đ ồ ồ N N 100 100 0 0 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 I% I% Hình 3. 3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử Allopurinol 60 Y= 0.0149x2-0.9704x+18.654 50 R2=0.9995 40 30 g/ml)  ( ộ 20 ng đ ồ 10 N 0 0 20 40 60 80 100 I% Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol Từ phương trình biểu diễn giữa nồng độ và giá trị phần trăm ức chế của các mẫu thử, ta tính được giá trị IC50 như sau: 35
  44. Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử Mẫu Cao Cao Cao EtOH Cao EtOAc allopurinol thử n-hexan n-BuOH IC 50 261,91±7,82 455,53±9,32 279,83±8,65 162,81±6,87 7,38±1,25 (g/ml) Giá trị phần trăm ức chế I (%) của cao chiết phân đoạn lá Gai và allopurinol được trình bày ở bảng 3.2. Theo sự tăng dần của nồng độ từ 25 đến 400 g/ml, phần trăm ức chế enzym XO của các cao chiết đều tăng dần. Chứng tỏ, tác dụng ức chế enzym XO của cao toàn phần và các cao phân đoạn của lá Gai tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Trong các cao chiết phân đoạn, phân đoạn n-BuOH có giá trị IC50 thấp nhất là 162,81 ± 6,87 g/ml, thể hiện tác dụng ức chế enzym XO mạnh nhất, tiếp theo là phân đoạn EtOH (IC50: 261,9 ± 7,82 g/ml) và phân đoạn EtOAc ( IC50: 279,83 ± 8,65 g/mL) và thấp nhất là phân đoạn n-hexan (IC50: 455,53 ± 9,32 g/mL). Thứ tự tác dụng ức chế enzym XO của các phân đoạn tăng lần lượt như sau: n- Hexan < EtOAc< EtOH < n-BuOH. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Allopurinol cho kết quả IC50 là 7,38 ± 1,25 µg/ml, thể hiện tác dụng ức chế enzym XO cao hơn các mẫu thử. 36
  45. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về kết quả chiết xuất dược liệu Kết quả chiết xuất dược liệu lá gai thu tại huyện Mê Linh, Hà Nội trong EtOH 50% với hiệu xuất chiết cao EtOH và các phân đoạn n- Hexan, EtOAc, n- BuOH lần lượt là 9,00%, 3,44%, 3,70%, 9,37%. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Phạm Ngọc Khôi (2019) chiết xuất lá gai thu hái ở tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam trong dung môi nước (9%) [4]. Tuy nhiên, kết quả này nhỏ hơn so với Chikwang Kim (2015) là 17,68% chiết xuất lá gai thu hái tại Hàn Quốc trong dung môi EtOH 50% [12]. Điều này có thể được giải thích do sự khác nhau về địa điểm thu hái, giống dược liệu, điều kiện sinh sống, quy trình chiết xuất dẫn đến các hoạt chất trong dược liệu có thể khác nhau [3, 62]. 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH Kết quả nghiên cứu đã xác định các cao phân đoạn khác nhau từ lá cây gai thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH. Trong đó, theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn n- BuOH thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất với IC50 là 81,58 ± 3,76 (g/ml) tuy nhiên vẫn nhỏ hơn 4 lần so với vitamin C (IC50 là 19,56 ± 2,89 g/ml). Tuy nhiên, trong mẫu cao chiết chứa nhiều hợp chất khác nhau còn vitamin C là một hợp chất duy nhất, do đó tác dụng chống oxy hóa của cao dược liệu này là khá tốt. Sau đó là phân đoạn EtOH, EtOAc, n-Hexan với giá trị IC50 lần lượt là 112,98 ± 2,21; 187,86 ± 2,48; 240,19 ± 3,56 (g/ml). Như vậy, các cao phân đoạn lá gai có hoạt tính chống oxy hóa khác nhau, trong đó các chất có hoạt tính oxy hóa chủ yếu nằm trong phân đoạn n-BuOH. Điều này có thể được giải thích theo các công trình nghiên cứu của các tác giả Yongsheng Chen và cộng sự (2014), Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014), Sunghun Cho và cộng sự (2017). Các nghiên cứu này cho thấy trong lá gai có chứa các hợp chất phenolic, flavonoid, vitamin A, vitamin C, vitamin E [14, 21, 52]. Trong đó, các acid phenolic (acid 4 -coumaric, acid caffeic, acid ferulic và acid Chlorogenic) [29, 53], flavonoid (rutin, 37
  46. epicatechin, isoquercetin) [67] đã được chứng minh thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Bên cạnh kết quả trong nghiên cứu này, Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2019) đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết lá Gai với điều kiện chiết xuất trong dung môi nước, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:30 g/ml, thời gian chiết là 30 phút, nhiệt độ 600C bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH cho kết IC50 là 82,09 g/ml [4]. Kết quả này cũng tương tự với phân đoạn n- BuOH. Jin Woo Nho và cộng sự (2010) đã tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết lá Gai trong EtOH 70% và các phân đoạn thu được kết quả IC50: cao EtOH 70% (688± 0,002 g/ml), cao hexan (484 ± 0.004 g/ml), cao ethylacetat (97 ± 0.004 g/ml), cao nước (1127± 0,006 g/ml) [48]. Kết quả này có sự khác biệt so với 2 nghiên cứu trên. Điều này có thể được giải thích do sự ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất như dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi, địa điểm thu hái dược liệu. Do đó, các nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất, khảo sát các mẫu dược liệu khác nhau là cần thiết để có thêm bằng chứng trong việc lựa chọn dược liệu tốt phục vụ việc phát triển các thực phẩm chức năng và thuốc trong tương lai. Như vậy, với các kết quả ghi nhận được, lá Gai đã thể hiện khả năng chống oxy hóa. Điều này góp phần cung cấp những dẫn liệu khoa học cho các ứng dụng trong y học sau này. Bởi vì, quá nhiều chất oxy hóa có thể gây ra stress oxy hóa dẫn đến tình trạng cơ thể mất cân bằng, cuối cùng dẫn đến sự phát triển của nhiều bệnh mãn tính như ung thư, tim mạch và bệnh thoái hóa thần kinh [39]. Vì vậy, việc nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và trị bệnh có ý nghĩa thiết thực. 4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai Gout là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa phổ biến ở con người. Nó được đặc trưng bởi sự tăng acid uric máu, gây ra sự lắng đọng của tinh thể urate monohydrate trong khớp và thận dẫn đến viêm khớp do gout và sỏi thận acid 38
  47. uric [36]. Nguy cơ tăng acid uric máu cũng có liên quan với sự phát triển của tăng huyết áp và tăng lipid máu (hai yếu tố nguy cơ tim mạch), bệnh tiểu đường, béo phì [25, 32, 69, 70]. Kiểm soát mức tăng acid uric là một trong những cách để phòng ngừa bệnh gout và các rối loạn khác. Allopurinol là thuốc điển hình có tác dụng ức chế enzym XO hiện đang được sử dụng để điều trị bệnh gout mãn tính. Tuy nhiên, khi dùng allopurinol có thể gây ra các tác dụng phụ chẳng hạn như viêm gan, tổn thương thận, hội chứng quá mẫn [8]. Trong khi đó, các hợp chất hóa học trong thực vật (flavonoid ) có nhiều tiềm năng tác dụng dược lý, cùng với kinh nghiệm sử dụng trong y học cổ truyền là nguồn tài nguyên lớn trong điều trị bệnh. Trong y học cổ truyền ở DR Congo, toàn bộ cây Gai được nghiền nát và ngâm trong nước để có được một loại thuốc bôi lên cơ thể điều trị bệnh thấp khớp [51]. Trong một nghiên cứu gần đây, Phạm Ngọc Khôi đã tiến hành đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của cao nước lá Gai thu được kết quả IC50 là 273 g/ml. Kết quả của nghiên cứu này đã xác định được cao chiết từ các phân đoạn khác nhau của lá cây Gai có tác dụng ức chế enzym XO. Trong đó, phân đoạn n- BuOH thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất với IC50 là 162,81 ± 6,87 (g/ml) tuy nhiên vẫn nhỏ hơn 20 lần so với Allopurinol (IC50 là 7,38 ± 1,25 g/ml), sau đó là phân đoạn EtOH, EtOAc, n-Hexan với giá trị IC50 lần lượt là 261,91 ± 7,82; 279,83 ± 8,65; 455,53 ± 9,32 (g/ml). Như vậy, các chất có tác dụng ức chế enzym XO chủ yếu nằm trong phân đoạn n-BuOH. Điều thú vị là thứ tự ức chế enzym XO và khả năng chống oxy hóa của các cao phân đoạn lá Gai giống nhau: n- Hexan < EtOAc < EtOH < n- BuOH. Kết quả này có thể giải thích là do trong lá gai chứa các hợp chất phenolic, flavonoid, trong đó caffeic acid [31, 64], rutin, isoquercetin [67], chlorogenic acid [44] được đánh giá là có đồng thời khả năng ức chế hoạt động của enzym XO và hoạt tính chống oxy hóa cao. Li-Na Huo và cộng sự (2015), trong nghiên cứu xác định các thành phần ức chế xanthine oxidase từ lá của cây tía tô đã chỉ ra 5 hợp chất trong đó phần nhiều là caffeic acid (một thành 39
  48. phần có trong lá cây gai), rosmarinic acid, 3 hợp chất còn lại là vinyl caffeate, methyl rosmarinate và apigenin trong phần rửa giải EtOH 70% của chiết xuất n- butanol của cao chiết nước lá tía tô cho thấy hoạt động ức chế mạnh đối với enzym XO in vitro, trong đó tác dụng ức chế XO của caffeic acid được thể hiện bởi giá trị IC50 là 121,22 g/ml [31]. Zhao-Qing Meng và cộng sự (2014) đã nghiên cứu về sự cải thiện tình trạng tăng acid uric máu và viêm gout của chlorogenic acid. Nghiên cứu này cho thấy, chlorogenic acid liều 50, 100 và 200 mg/kg làm giảm đáng kể nồng độ acid uric trên chuột bị gây tăng acid uric do kali oxonat. Nghiên cứu này còn chỉ ra rằng chlorogenic acid cải thiện các triệu chứng viêm trên chuột thí nghiệm gây ra do tinh thể MSU bằng cách ức chế sản xuất các cytokine tiền viêm bao gồm interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u- (TNF- ) [44]. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế enzym XO ở các cao phân đoạn khác nhau của lá Gai, nhất là các chất từ phân đoạn n-BuOH. Bên cạnh đó, lá Gai là một dược liệu quen thuộc và dễ kiếm nên rất có tiềm năng sử dụng như thực phẩm bổ sung trong điều trị gout và các bệnh liên quan đến tăng acid uric máu. 40
  49. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trong phạm vi đề tài "Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)", chúng tôi đã thu được những kết quả như sau: 1. Đã đánh giá được khả năng chống oxy hóa ở các phân đoạn khác nhau của cao chiết lá Gai. Giá trị IC50 của các phân đoạn lá Gai dao động từ 81,58 ± 3,76 g/ml đến 240,19 ± 3,56 g/ml. Trong đó, phân đoạn n- BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao nhất với IC50 là 81,58 ± 3,76 g/ml, gấp hơn 10 lần mẫu chứng dương là Acid ascorbic thu được IC50 là 19.56 ± 2,86 g/ml. 2. Đã đánh giá được tác dụng ức chế enzym XO ở các phân đoạn khác nhau của cao chiết lá Gai. Kết quả cho thấy theo sự tăng dần của nồng độ từ 25 đến 400 g/ml, tỷ lệ phần trăm ức chế enzym XO của các cao chiết đều tăng dần. Chứng tỏ, tác dụng ức chế enzym XO của cao toàn phần và các cao phân đoạn của lá Gai tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Trong các cao chiết phân đoạn, phân đoạn n- BuOH có giá trị IC50 thấp nhất là 162.81 ± 6,87 g/ml, thể hiện tác dụng ức chế enzym XO mạnh nhất, gấp hơn 20 lần so với mẫu chứng dương Allopurinol cho kết quả IC50 là 7.38 ± 1,25 µg/mL. 41
  50. ĐỀ XUẤT Đề tài đã đánh giá được khả năng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym XO của lá cây Gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich). Tuy nhiên, để có thể khai thác và sử dụng dược liệu này hiệu quả hơn trong việc phòng và điều trị bệnh gout và các bệnh khác liên quan đến tăng acid uric, chúng tôi xin đề xuất một số nội dung nghiên cứu tiếp theo: - Phân lập chất, xác định hoạt tính và cơ chế ức chế xanthine oxidase in vitro. - Đánh giá tác dụng hạ acid uric, các tác dụng liên quan đến bệnh gout (giảm đau, chống viêm) in vivo của dược liệu. 42
  51. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (29/11/2010), "Công văn số 3960/BNN-TT về việc phát triển cây gai lá (ramie leaf) ở Việt Nam", Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. 2. Nguyễn Thị Thu Hoài (2014), Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro Bộ môn dược liệu, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Thu Hường (2018), Bài giảng Tài nguyên cây thuốc, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 4. Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Hoàng Thanh Trúc và Đặng Đình Dần (2019), "Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chết lá cây Gai (Boehmeria nivea L.) ", Y Học TP. Hồ Chí Minh, 23(3). 5. Bộ Y Tế , PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Lan chủ biên (2010), Bệnh học Cơ xương khớp nội khoa, NXB Giáo dục Việt Nam, tr189. 6. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 7. Bộ Y Tế , Nguyễn Nghiêm Luật chủ biên (2010), Hóa sinh, NXB Y học. 8. Bộ Y Tế, PGS. TS Mai Tất Tố và TS. Vũ Thị Trâm (2012), Dược lý học tập 2, NXB Y học. 9. TS. Đái Thị Xuân Trang và Huỳnh Ngọc Trúc (2013), Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase từ lá sa kê (Artocarpus altili) trong điều trị bệnh gout, Bộ môn sinh học, Đại học Cần Thơ, Đại học Cần Thơ, Khoa Khoa học tự nhiên. 10. Tuệ Tĩnh Thiền Sư, Tuyển tập 3033 cây thuốc Đông y, Y học và Sức khỏe. 11. Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 840-842. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 12. Chikwang Kim, Man-Jin In và Dong Chung Kim (2015), "In Vitro Antioxidant Activity of Ethanol Extract from Boehmeria nivea L. Leaves", Food Engineering Progress, 9(1), tr. 76-81. 13. Chetan R Acharya, Abhinav K Sharma và ND Kantharia (2015), "Involvement of oxidative stress in patients of gout and antioxidant effect of allopurinol", International Journal of Medical Science and Public Health, 4(2), tr. 168-172. 14. Ah-Ra Kim, Hyun-Joo Lee, Hae-Ok Jung và các cộng sự. (2014), "Physicochemical Composition of Ramie Leaf According to Drying Methods", J Korean Soc Food Sci Nutr, 43(1), tr. 118-127.
  52. 15. UAS Al-Khalidi và TH Chaglassian (1965), "The Species Distribution of Xanthine Oxidase", Biochemical Journal, 97(1), tr. 318-320. 16. Michael J. Barber và Lewis M. Siegel (1982), "Oxidation-Reduction Potentials of Molybdenum, Flavin, and Iron-Sulfur Centers in Milk Xanthine Oxidase: Variation with pH", Biochemistry, 21(7), tr. 1638-1647. 17. Boehmeria nivea (L.) Gaudich., Khartasia, truy cập ngày 18/3-2020, tại trang web gaudich. 18. F. Borges, E. Fernandes và F. Roleira (2002), "Progress Towards the Discovery of Xanthine Oxidase Inhibitors", Current Medicinal Chemistry, 9(2), tr. 195-217. 19. F. Borges, E. Fernandes và F. Roleira (2002), "Progress Towards the Discovery of Xanthine Oxidase Inhibitors", Current Medicinal Chemistry, 9(195-217). 20. Hongnan Cao, James M. Pauff và Russ Hille (2010), "Substrate Orientation and Catalytic Specificity in the Action of Xanthine Oxidase", The Journal of biological chemistry, 285(36), tr. 28044-28053. 21. Yongsheng Chen, Gaoyan Wang, Hong Wang và các cộng sự. (2014), "Phytochemical Profiles and Antioxidant Activities in Six Species of Ramie Leaves", Plos one, 9(9). 22. Sunghun Cho, Dong Gu Lee, Yong-Su Jung và các cộng sự. (2016), "Phytochemical Identification from Boehmeria nivea Leaves and Analysis of (–)-Loliolide by HPLC", Natural Product Sciences, 22(2), tr. 134-139. 23. Sunghun Cho, Jaemin Lee, Young Mi Kim và các cộng sự. (2017), "Chemical composition of different parts of ramie (Boehmeria nivea)", Korean Journal of Agricultural Science, 44(1). 24. D Conen, V Wietlisbach, P Bovet và các cộng sự. (2004), "Prevalence of hyperuricemia and relation of serum uric acid with cardiovascular risk factors in a developing country", BMC Public Health. 25. Rishi J. Desai, Jessica M. Franklin, Julia Spoendlin-Allen và các cộng sự. (2018), "An evaluation of longitudinal changes in serum uric acid levels and associated risk of cardio-metabolic events and renal function decline in gout", PLoS One, 13(2). 26. Sunitha Dontha (2016), "A review on antioxidant methods ", Asian J Pharm Clin Res, 9, tr. 14-32. 27. PhD Frédéric Lioté MD (2003), "Hyperuricemia and Gout", Current Rheumatology Reports, 5(3), tr. 227-234. 28. İlhami Gulcin (2020), "Antioxidants and antioxidant methods: an updated overview", Archives of Toxicology.
  53. 29. Sari H. HaÈkkinen và A. Riitta ToÈrroÈnen (2000), "Content of favonols and selected phenolic acids in strawberries and Vaccinium species: infuence of cultivar, cultivation site and technique", Food Research Internationa, 33(6), tr. 517-524. 30. Roger harrison (2002), "Structure and function of xanthine oxidoreductase: where are we now?", Free Radical Biology & Medicine, 33(6), tr. 774-797. 31. Li-Na Huo, Wei Wang, Chun-Yu Zhang và các cộng sự. (2015), "Bioassay- Guided Isolation and Identification of Xanthine Oxidase Inhibitory Constituents from the Leaves of Perilla frutescens", Molecules, 20(10), tr. 17848-17859. 32. Chii-Min Hwu và Kuan-Hung Lin (2010), "Uric acid and the development of hypertension", Medical Science Monitor, 16(10). 33. Ming Jin, Fan Yang, Irene Yang và các cộng sự. (2012), "Uric Acid, Hyperuricemia and Vascular Diseases", Frontiers in Bioscience, 17, tr. 656-659. 34. Sung Hee Kim, Mi Jeong Sung, Jae Ho Park và các cộng sự. (2013), "Boehmeria nivea Stimulates Glucose Uptake by Activating Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma in C2C12 Cells and Improves Glucose Intolerance in Mice Fed a High-Fat Diet", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013, tr. 1-9. 35. N. V. Kotov, R. E. Baker, D. A. Dawidov và các cộng sự. (2007), "A study of the temperature dependence of bienzyme systems and enzymatic chains", Computational and Mathematical Methods in Medicine, Taylor & Francis, 8(2), tr. 93-112. 36. Holly J Kramer, Hyon K Choi, Karen Atkinson và các cộng sự. (2003), "The Association Between Gout and Nephrolithiasis in Men: The Health Professionals' Follow-Up Study", Kidney International, 64(3), tr. 1022. 37. Dong Gu Lee, Sunghun Cho, Jaemin Lee và các cộng sự. (2015), "Quantitative Analysis of the Flavonoid Content in the Leaves of Boehmeria nivea and Related Commercial Products", Natural Product Sciences, 21(1), tr. 66-70. 38. Chen Li-ying, Zhu Wen-hua, Chen Zhou-wen và các cộng sự. (2007), "Relationship between hyperuricemia and metabolic syndrome", Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 8(8), tr. 593-598 39. Rui Hai Liu (2013), "Health-Promoting Components of Fruits and Vegetables in the Diet", Advances in Nutrition, 4(3), tr. 384S-392S. 40. Touming Liu, Siyuan Zhu, Qingming Tang và các cộng sự. (2013), "De novo assembly and characterization of transcriptome using Illumina paired-
  54. end sequencing and identification of CesA gene in ramie (Boehmeria nivea L. Gaud)", BMC Genomics, 14. 41. Xiaolan LU, Xiaoxia LI, Yi ZHAO và các cộng sự. (2014), "Contemporary epidemiology of gout and hyperuricemia in community elderly in Beijing", International Journal of Rheumatic Diseases 17, tr. 400–407. 42. Luis Miguel Ruilope MD và Juan Garcia-Puig (2001), "Hyperuricemia and Renal Function", Current Hypertension Reports, 3(3), tr. 197-202. 43. Avedis Meneshian và Gregory B. Bulkley (2002), "The Physiology of Endothelial Xanthine Oxidase: From Urate Catabolism to Reperfusion Injury to Inflammatory Signal Transduction", Microcirculation, 9(3), tr. 161-175. 44. Zhao-Qing Meng, Zhao-Hui Tang, Yun-Xia Yan và các cộng sự. (2014), "Study on the Anti-Gout Activity of Chlorogenic Acid: Improvement on Hyperuricemia and Gouty Inflammation", The American Journal of Chinese Medicine, 42(6), tr. 1471-1483. 45. M.D. Michael, H. Pillinger, M.D. Pamela Rosenthal và các cộng sự. (2007), "Hyperuricemia and Gout: New Insights into Pathogenesis and Treatment", Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases, 65(3), tr. 215-221. 46. H.A. Moharram và M.M. Youssef (2014), "Methods for Determining the Antioxidant Activity: A Review", Alex. J. Fd. Sci. & Technol, 11(1), tr. 31- 42. 47. M. Muxfeldt và W. Schaper (1987), "The activity of xanthine oxidase in heart of pigs, guinea pigs, rabbits, rats, and humans", Basic Research in Cardiology, 82, tr. 486-492. 48. Jin Woo Nho, In Guk Hwang, Hyun Young Kim và các cộng sự. (2010), "Free radical scavenging, angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory, and in vitro anticancer activities of ramie (Boehmeria nivea) leaves extracts", Food Science and Biotechnology, 19(2), tr. 383-390. 49. Shivraj H Nile và Chandrahasy N Khobragade (2011), "In Vitro Anti- Inflammatory and Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Tephrosia Purpurea Shoot Extract", Nat Prod Commun., 6(10), tr. 1437-1440. 50. Shivraj H Nile, Brajesh Kumar và Se W Park (2013), "In Vitro Evaluation of Selected Benzimidazole Derivatives as an Antioxidant and Xanthine Oxidase Inhibitors", Chem Biol Drug Des., 82(3), tr. 290-295. 51. PROTA4U not-for-profit Foundation in the Netherlands and an international NGO in Kenya Boehmeria nivea (L.) Gaudich., chủ biên. 52. Mi-Ran Park, Jae-Joon Lee, Ah Ra Kim và các cộng sự. (2010), "Physicochemical Composition of Ramie Leaves (Boehmeria nivea L.)", Korean j. Food Preserv, 17(6), tr. 853-860.
  55. 53. Yuki Sato, Shirou Itagaki, Toshimitsu Kurokawa và các cộng sự. (2011), "In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid", International Journal of Pharmaceutics, 403(1-2), tr. 136-138. 54. Sigma-Aldrich Product information: Xanthine Oxidase from bovine milk, Sigma, truy cập ngày 15/03/2020, tại trang web aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/x4376pis.pdf. 55. Gurkirpal Singh, Bharathi Lingala và Alka Mithal (2019), "Gout and hyperuricaemia in the USA: prevalence and trends", Rheumatology (Oxford). 56. Leif B. Sorensen và Dennis J. Levinson (1975), "Origin and extrarenal elimination of uric acid in man". 57. Amy L. Stockert, Sujata S. Shinde, Robert F. Anderson và các cộng sự. (2002), "The Reaction Mechanism of Xanthine Oxidase: Evidence for Two- Electron Chemistry Rather Than Sequential One-Electron Steps", Journal of the American Chemical Society, 124(49), tr. 14554-14555. 58. Mi Jeong Sung, Munkhtugs Davaatseren, Sung Hee Kim và các cộng sự. (2013), "Boehmeria nivea attenuates LPS-induced inflammatory markers by inhibiting p38 and JNK phosphorylations in RAW264.7 macrophages", Pharmaceutical Biology, 51(9), tr. 1131-1136. 59. Zhijian Tan, Chaoyun Wang, Yongjian Yi và các cộng sự. (2014), "Extraction and purification of chlorogenic acid from ramie (Boehmeria nivea L. Gaud) leaf using an ethanol/salt aqueous two-phase system", Separation and Purification Technology, 132, tr. 396-400. 60. Muthuswamy Umamaheswari, Kuppusamy AsokKumar, Arumugam Somasundaram và các cộng sự. (2007), "Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants", Journal of Ethnopharmacology, 109(3), tr. 547-551. 61. Hong Wang, Caisheng Qiu, Ling Chen và các cộng sự. (2019), "Comparative Study of Phenolic Profiles, Antioxidant and Antiproliferative Activities in Different Vegetative Parts of Ramie (Boehmeria nivea L.)", Molecules, 24(8), tr. 1551. 62. Qin Wang, Muzammal Rehman, Dingxiang Peng và các cộng sự. (2018), "Antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity of leaf extracts from ten ramie cultivars", Industrial Crops & Products, 122, tr. 430-437. 63. Jingchen Wei, Lianku Lin, Xiaojian Su và các cộng sự. (2014), "Anti- hepatitis B virus activity of Boehmeria nivea leaf extracts in human HepG2.2.15 cells", Biomed Rep, 2(1), tr. 147-151.
  56. 64. Chang WS, Chang YH, Lu FJ và các cộng sự. (1994), "Inhibitory effects of phenolics on xanthine oxidase", Anticancer Research, 14(2A), tr. 501-506. 65. Liangbin Zeng, Airong Shen, Jia Chen và các cộng sự. (2016), "Transcriptome Analysis of Ramie (Boehmeria nivea L. Gaud.) in Response to Ramie Moth (Cocytodes coerulea Guenée) Infestation", BioMed Research International, 2016, tr. 1-10. 66. W Zhang, M Doherty, T Bardin và các cộng sự. (2006), "EULAR evidence based recommendations for gout. Part I: Diagnosis. Report of a task force of the Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutics (ESCISIT)", Annals of the Rheumatic Diseases, 65(10), tr. 1301-1311. 67. Ji Xiao Zhu, Ying Wang, Ling Dong Kong và các cộng sự. (2004), "Effects of Biota orientalis extract and its flavonoid constituents, quercetin and rutin on serum uric acid levels in oxonate-induced mice and xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase activities in mouse liver", Journal of Ethnopharmacology, 93(1), tr. 133-140. 68. Binh T. Q., Tran Phuong P., Thanh Chung N. và các cộng sự. (2019), "First Report on Association of Hyperuricemia with Type 2 Diabetes in a Vietnamese Population", Int J Endocrinol, 2019, tr. 5275071. 69. Chaudhary K., Malhotra K., Sowers J. và các cộng sự. (2013), "Uric Acid - key ingredient in the recipe for cardiorenal metabolic syndrome", Cardiorenal Med, 3(3), tr. 208-220. 70. Dehghan A, van Hoek M, Sijbrands EJ và các cộng sự. (2008), "High Serum Uric Acid as a Novel Risk Factor for Type 2 Diabetes", Diabetes Care, 31(2), tr. 361-362. 71. Zhu Y, Pandya BJ và Choi HK (2011), "Prevalence of gout and hyperuricemia in the US general population: the National Health and Nutrition Examination Survey 2007–2008", Arthritis Rheum, 63(10). 72. Todd S. Perlstein, Olga Gumieniak, Gordon H. Williams và các cộng sự. (2006), "Uric Acid and the Development of Hypertension", Hypertension, 48, tr. 1031-1036. 73. Kamei K., T. Konta, Ichikawa K. và các cộng sự. (2016), "Serum uric acid levels and mortality in the Japanese population: the Yamagata (Takahata) study", Clin Exp Nephrol, 20(6), tr. 904-909. 74. Jessica Maiuolo, Francesca Oppedisano, Santo Gratteri và các cộng sự. (2016), "Regulation of uric acid metabolism and excretion", Int J Cardiol, 213, tr. 8-14.