›

Báo cáo tóm tắt dự án Sản xuất thử nghiệm cấp nhà nước hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm

pdf 156 trang yendo 4860
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo tóm tắt dự án Sản xuất thử nghiệm cấp nhà nước hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbao_cao_tom_tat_du_an_san_xuat_thu_nghiem_cap_nha_nuoc_hoan.pdf

Nội dung text: Báo cáo tóm tắt dự án Sản xuất thử nghiệm cấp nhà nước hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm

  1. bộ khoa học và công nghệ Bộ y tế ch−ơng trình khoa học và công nghệ phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng báo cáo tóm tắt dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà n−ớc hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm m∙ số KC.10-DA12 5972 10/8/2006 Hà nội – 2004
  2. dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà n−ớc kc.10 – da12 hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm Chủ nhiệm dự án : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân Các cán bộ tham gia TS.Nguyễn Tuyết Nga CNSH.Vũ Hồng Nga CN.Lê Hoàng Long TS.Đỗ Tuấn Đạt TS.Đỗ Thủy Ngân TS.Nguyễn Quế Anh PGS.TS.Đoàn Huy Hậu PGS.TS.Hồ Bá Do BS.Đinh Hồng D−ơng Các cơ quan tham gia Công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung −ơng Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắc xin và các chế phẩm sinh học Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin Sabin Bộ môn Dịch tễ - Học viện Quân y
  3. các chữ viết tắt ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axít ribonucleic) ALT Alanin transferaza AST Asparagin Transferaza CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ) cADN Complementary ADN (ADN bổ sung) ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ED50 Effective dose 50 (Liều gây miễn dịch 50%) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) ELU ELISA Unit (Đơn vị ELISA) GMT Geometric mean titer (hiệu giá trung bình nhân) HAV Hepatitis A Virus (Virút viêm gan A) HLA kháng nguyên bạch cầu ng−ời HT Huyết thanh IFNβ interferon-β IFNγ interferon-γ IFNα interferon-α
  4. kD kilodalton (kilôdalton) LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle mIU mili International unit (mili đơn vị quốc tế) àg mcg M Mol MSV Master seed virus (Chủng gốc giống) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( Kích cỡ giới hạn trọng l−ợng phân tử ) nm nanomet NCR Non coding region (Vùng không mã hóa) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza) PFU Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMMK Primary Monkey Kidney Cell (Tế bào thận khỉ tiên phát) rpm round per minute (Vòng/phút) SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamid) TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới
  5. TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào) VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 VSDTTƯ Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương VX Vắcxin WSV Working seed virus ( Chủng sản xuất)
  6. mục lục Đặt vấn đề 1 CHƯƠNG 1 : Vật liệu và ph−ơng pháp 2 1.1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt 2 1.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 3 1. 2.1. An toàn chung 3 1. 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3 1.2.3. Kiểm tra chất gây sốt 3 1.2.4. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4 1.2.5. Kiểm tra hàm l−ợng Formaldehyt 4 1.2.6. Kiểm tra hàm l−ợng protein toàn phần 4 1.2.7. Kiểm tra công hiệu 4 1.3. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 5 1.3.1. Đối t−ợng nghiên cứu . 5 1.3.2. Vật liệu nghiên cứu 5 1.3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 5 CHƯƠNG 2: Kết quả và bàn luận 8 2.1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt 8 2.1.1 Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình nuôi cấy 8 2.1.2. Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình tinh khiết virút 8 2.1.3 Hàm l−ợng Protein toàn phần 8 2.1.4. Thử nghiệm bất hoạt 9 2.1.5. Pha chế vắc xin và đóng ống 9 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 10
  7. 2. 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 10 2.2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học 11 2.3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 13 2.3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm gan A trên các đối t−ợng 13 2.3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối t−ợng có anti-HAV (-) 14 2.3.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối t−ợng có anti-HAV (+) 18 Kết luận 20 Kiến nghị 22 Tài liệu tham khảo 23
  8. đặt vấn đề Virút viêm gan A (HAV) là rất phổ biến ở tất cả các n−ớc khu vực Tây Thái Bình D−ơng và Đông Nam á. Điều kiện vệ sinh kém đã làm lây lan HAV ở những vùng dịch l−u hành cao. Mức độ l−u hành của HAV trong cộng đồng là cực kỳ cao. Các nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Bangladesh, Bhutan, India, Maldive và Nepal chứng minh rằng 85-95% trẻ em ở 10 tuổi đã có miễn dịch với HAV. Chỉ có một số ít trẻ bị nhiễm phát triển thành các tr−ờng hợp nhiễm trùng có triệu chứng. Nghiên cứu căn nguyên các tr−ờng hợp viêm gan rải rác ở các n−ớc này chứng minh rằng nhiễm HAV chịu trách nhiệm tới khoảng 10-25% tất cả các tr−ờng hợp viêm gan ở trẻ em, trong khi nhiễm ở ng−ời lớn th−ờng chỉ là 1-5%. Dịch viêm gan A th−ờng xẩy ra ở các thành phố có liên quan đến việc sử dụng nguồn n−ớc uống và thực phẩm không an toàn. Kết quả nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Indonesia và Thái Lan cho thấy huyết thanh d−ơng tính ở trẻ em giảm xuống trong năm 1994- 1995 (30-35%) so với kết quả nghiên cứu đã tiến hành vào năm 1977-1978 (85-90%) ở trẻ em tuổi từ 7-12 tuổi. Đây có thể là kết quả cải thiện tiêu chuẩn vệ sinh, làm sạch môi tr−ờng, thiết bị n−ớc uống và cũng do giảm mạnh sự l−u hành của HAV. ở Việt nam nhiều nghiên cứu về HAV cũng đã đ−ợc tiến hành và cho thấy HAV là nguyên nhân chủ yếu các tr−ờng hợp viêm gan cấp tính (29%), 59% trong số đó có độ tuổi > 20 tuổi. Những nghiên cứu khác cho thấy 90% dân ở nông thôn có anti-HAV (IgG) thuộc tuổi thanh niên. Tình hình dịch tễ học HAV đang thay đổi ở nhiều n−ớc. Với việc tăng c−ờng tiêu chuẩn vệ sinh ở nhiều n−ớc tỷ lệ nhiễm HAV ở trẻ nhỏ đã giảm đi nhiều, thậm trí cả ở những n−ớc và vùng có dịch l−u hành cao, song các 1
  9. ổ dịch thấp đang xuất hiện. Do đó ở nhiều n−ớc đang chuẩn bị phải đón nhận các tr−ờng hợp viêm gan A lâm sàng ngày càng tăng ở những trẻ lớn hơn và ng−ời lớn. Mặc dù đã có vắcxin tốt, song giá thành rất đắt và vì vậy không có khả năng tiêm đại trà đ−ợc. Các sinh phẩm chẩn đoán viêm gan A hiện nay cũng rất đắt do đó cũng hạn chế việc sử dụng để thử nghiệm tr−ớc khi tiêm phòng. Đề tài KHCN 11-10 đã nghiệm thu xuất sắc, nghiên cứu xây dựng đ−ợc công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ PMMK, đảm bảo yêu cầu tối thiểu của TCYTTG về loại vắcxin này. Hiện nay, tiêu chuẩn Việt nam đề ra cho loại vắcxin này vẫn ch−a đ−ợc dự thảo. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A trên nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát PMMK có nguồn cung cấp dồi dào trong n−ớc nhằm giảm giá thành của vắcxin là yêu cầu cấp thiết đ−ợc đặt ra. Mặt khác hiện nay liều tiêm và lịch tiêm rất khác nhau giữa các vắcxin viêm gan A đ−ợc sử dụng cũng nh− sự cần thiết của liều tiêm nhắc lại vẫn đang là vấn đề cần nghiên cứu. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó, dự án “ Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt quy mô 100.000 liều/năm” có mục tiêu nh− sau: 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt ở qui mô 100.000 liều/năm đạt tiêu chuẩn quốc tế. 2. Xây dựng tiêu chuẩn Việt nam cho vắcxin viêm gan A bất hoạt. 3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin trên thực địa lâm sàng, xác định lịch tiêm và liều tiêm phù hợp. Với những mục tiêu đó, Dự án có nội dung chính nh− sau : 2
  10. 1.Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta : bổ sung trang thiết bị cần thiết để mở rộng sản xuất; nghiên cứu và xây dựng đ−ợc các thông số hóa, lý, sinh học tối −u; cải tiến một số công đoạn trong quy trình sản xuất để nâng cao công suất 2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia thích hợp cho vắcxin viêm gan A bất hoạt về các thành phần hoá học (protein, formaldehyt, hydroxyt nhôm, pH), an toàn, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố. Nghiên cứu tính ổn định về chất l−ợng và các thành phần của các loạt vắcxin viêm gan A do Việt nam sản xuất so sánh với tiêu chuẩn của TTYTTG. 3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A trên thực địa lâm sàng giai đoạn III, theo dõi tính an toàn, phản ứng phụ, đáp ứng miễn dịch trên nhóm ng−ời tình nguyện, đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A với cỡ mẫu n = 300. Xác định liều tiêm và lịch tiêm phù hợp cho các đối t−ợng khác nhau. 3
  11. Ch−ơng 1 Tổng quan 1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan A 1.1. Lịch sử virút viêm gan A Hội chứng vàng da đã đ−ợc mô tả trong lịch sử từ thế kỷ thứ 8. Tuy nhiên đến tận thế kỷ 17, 18 và 19 những vụ dịch vàng da lớn đã đ−ợc mô tả đầy đủ hơn. Năm 1947, Mac Callum đã đ−a ra cụm từ viêm gan A và viêm gan B để phân biệt các loại viêm gan virút. Những cụm từ này đã đ−ợc Uỷ ban Viêm gan virút của Tổ chức y tế thế giới công nhận. Virút viêm gan A đ−ợc xác định lần đầu tiên bằng kính hiển vi điện tử năm 1973 nhờ Feinstone. Năm 1979 Provost và Hilleman đã thành công trong nuôi cấy virút viêm gan A trên tế bào, mở đầu cho những nghiên cứu phát triển vắcxin. 1.2. Đặc điểm virút viêm gan A Những nghiên cứu tiếp sau này đã xác định đ−ợc HAV là một virút picorna. Hạt virút hình cầu nhỏ không có vỏ có đ−ờng kính khoảng 27-32 nm, tốc độ lắng 156 -160S, và các băng xung quanh 1.33 -1,34 g/cm3 trong CsCl. Genôm là sợi đơn ARN thẳng dài 7,5 kb với cực nhận biết thông tin ở đầu 5’ và đầu 3’ là một chuỗi poly (A). Giống nh− tất cả các virút picorna khác, genom HAV có thể chia thành 3 phần : (a) đầu 5’ không mã hóa (NCR) chiếm khoảng 10% genom và nối với protein virút VPg ; (b) một khung đọc mở mã hóa cho tất cả các protein 4
  12. virút bao gồm P1 cho protein capsit và P2,P3 cho protein không cấu trúc ; (c) đầu 3’ ngắn không mã hóa (NCR). Đầu 5’ NCR là vùng ổn định nhất của genom HAV (hơn 89% nucleotit giống nhau trong 7 chủng đại diện cho genotýp I,II,III. Đột biến vùng 5’ NCR làm tăng khả năng thích ứng của HAV trong nuôi cấy tế bào nh−ng không đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của virút. Đầu 3’ NCR có tỷ lệ khác biệt cao giữa các chủng HAV và đột biến (20%). Tác động của vùng 3’ và 5’ trong tổng hợp ARN của picorna virut ch−a đ−ợc hiểu biết đầy đủ nh−ng đóng vai trò quan trọng. Ba protêin cấu trúc, VP1 - VP3, sắp xếp theo kích th−ớc từ 24 đến 33 kD đ−ợc sao chép từ trình tự axit nucleic của virút, và t−ơng tự giữa tổ chức genom của HAV và các picornavirút đã biết khác, song ch−a bao giờ xác định đ−ợc ở viriôn. Ba polypeptit capsit chính đã đ−ợc xác đinh bao gồm : VP1 (30-33 kD), VP2 (24-27 kD), VP3 (23-29 kD). Trọng l−ợng phân tử chính xác của polypeptit nhỏ (VP4) vẫn ch−a đ−ợc xác định. Vùng quyết định nguyên của protein capsit có thể rất bền vững trong quá trình nuôi cấy lâu dài. Mặc dù quá trình chế biến sau phiên dịch và số phận cuối cùng của đầu kết thúc amino của polyprotêin biểu thị vẫn ch−a đ−ợc xác định rõ ràng, một đoạn tín hiệu cho qúa trình myrin hoá ở vị trí axit amin thứ bảy sau Methionin thứ nhất với một vùng VP4 ngắn giả thiết rằng khả năng có một đầu dẫn peptit tắt (L). VP1 là một protein có khả năng hoạt động bề mặt chính trong picornavirut. Xác định trình tự dựa trên vùng VP1/2A phân loại đ−ợc 7 genotýp khác nhau. Bốn trong số các genotýp đó có liên quan đến khả năng gây bệnh cho ng−ời (I,II,III và VII). Genotýp I và III đ−ợc tìm thấy phổ biến trong các nghiên cứu trong khi genotýp II và VII mỗi loại chỉ đ−ợc đại diện bằng một chủng phân lập. So sánh bằng vùng VP1 cho thấy 23,7 % biến đổi ở mức độ nucleotit và 10,5% biến đổi ở mức độ axit amin giữa các 5
  13. chủng phân lập đ−ợc. Nghiên cứu của Mauro Costa –Mattioli và cộng sự đã tìm thấy đột biến trong vùng VP1 với sự biến mất của 15 axit amin cho thấy khả năng của đột biến trốn thoát kháng thể trung hòa. Một nghiên cứu khác tìm thấy đột biến của vùng VP1 với sự biến mất của 18 nucleotit của chủng HAV thích ứng trong nuôi cấy tế bào. Vùng gen mã hóa cho 2A của picornavirut đại diện cho vùng hay thay đổi nhất trong genom. Trong khi 2A có chức năng proteolytic trong entero và rhinovirut thì ở các virút khác không tìm thấy trình tự kiểu proteaza hoặc hoạt tính catalytic. Cấu trúc gen vùng 2A và kích th−ớc vẫn còn ch−a đ−ợc xác định rõ. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích th−ớc của 2A và 2B không giống nh− phỏng đoán ban đầu. Việc xóa bỏ 10 đến 15 axit amin trong protein 2A chỉ có một tác động rất nhỏ trong nuôi cấy HAV trên tế bào và gan khỉ đuôi sóc. Mặc dù đột biến vùng P2 (protein 2C và 2B) cần thiết cho khả năng thích ứng của chủng HM175 và các chủng HAV khác trong nuôi cấy tế bào, đột biến của vùng 5’ không dịch mã cũng có vai trò quan trọng . Hình 1 : Hình ảnh virút viêm gan A d−ới kính hiển vi điện tử 6
  14. HAV v−ợt xa poliovirút về ổn tính định nhiệt hoàn toàn ở 20oC , sống sót do nhiệt tới 60oC trong một thời gian dài. Sự ổn định nhiệt này cho thấy có sự khác biệt đáng kể trong hình ảnh cấu trúc capsit của HAV mà vẫn ch−a xác định đ−ợc. Giống nh− các enterovirút và cardiovirut, hạt HAV tinh khiết bền vững với axít. HAV tinh khiết bền vững hơn HAV không tinh khiết, giữ đ−ợc tính gây nhiễm trên 8 giờ. HAV bền vững với nhiệt độ 60˚C ở pH trung tính trong ít nhất 60 phút. Virút chỉ bất hoạt một phần sau 10 đến 12 giờ khác với các picornavirut không bền vững ở 56˚C. Hoạt tính gây nhiễm có thể duy trì ít nhất 1 tháng sau khi đông khô và bảo quản ở 25˚C với 42% độ ẩm hoặc nhiều năm ở nhiệt độ -20˚C hoặc thấp hơn. HAV không bị bất hoạt bởi chloramin T (1g/l trong 15 phút ở 20˚C) hoặc perchloracetic axit. HAV bị bất hoạt nhờ sấy −ớt (121˚C trong 20 phút), tia cực tím hoặc formalin (1 :4000 trong 72 giờ ở 37˚C). Cuối cùng thì quá trình sao chép của HAV trong tế bào hoàn toàn không giống nh− phần lớn các picornavirút đã đ−ợc biết rõ đặc tính khác. Thậm trí ở điều kiện tối −u thì chu trình sao chép của HAV đ−ợc thực hiện và kéo dài trên 24 đến 48 giờ. Sự sao chép có liên quan đến hủy hoại tế bào hiếm khi gặp trừ khi các chủng virút khác nhau phải đ−ợc chọn lọc một cách thận trọng, ở một vài hệ tế bào, và với điều kiện nuôi cấy đ−ợc xác định chặt chẽ . Không có sự làm suy sụp sinh tổng hợp đại phân tử ở tế bào chủ. Nhìn chung một nhiễm trùng dai dẳng đã đ−ợc xác định và virút tiền gen còn lại một l−ợng lớn trong tế bào.Trong một vài tr−ờng hợp có thể cần tới 2 đến 3 tuần nuôi cấy để đạt đ−ợc hàm l−ợng virút thậm trí 100 đến 10.000 lần thấp hơn, thí dụ, hàm l−ợng poliovirút trong cùng điều kiện nuôi cấy tế bào đặc hiệu. Đặc điểm nhân lên của virút viêm gan A là một trở ngại lớn trong việc sản xuất và mở rộng qui mô sử dụng vắcxin viêm gan A. Việc nuôi cấy HAV rất khó đạt đ−ợc hiệu suất cao hoặc không tạo ra hủy hoại tế bào để 7
  15. có thể quan sát đ−ợc. Bằng cách sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Provost đã xác định đ−ợc HAV cấy truyền 31 lần trên khỉ đuôi sóc có thể nuôi cấy đ−ợc trên tế bào. Kháng nguyên virút phần lớn là protein nội bào. Thời gian để có đ−ợc l−ợng kháng nguyên HAV tối đa trong nuôi cấy tế bào có thể giảm sau khi cấy truyền liên tiếp. Nhiều dòng tế bào tiên phát và tế bào th−ờng trực của động vật linh tr−ởng thích hợp cho việc nuôi cấy HAV, mặc dù kết quả nuôi cấy phụ thuộc vào chủng virút, loại tế bào và nhiệt độ. Dòng tế bào cảm nhiễm với HAV bao gồm tế bào thận khỉ xanh châu Phi tiên phát và thứ phát, tế bào thận khỉ cynomologus sơ sinh, tế bào thận khỉ Rhesus bào thai (FRhK-4), tế bào thận khỉ cercopithecus, tế bào gan Alexander, tế bào màng ối FL, và tế bào l−ỡng bội bào thai ng−ời (WI- 38 và MRC-5). Tế bào thận khỉ xanh châu Phi tiên phát (AGMK), tế bào nguyên bào sợi của ng−ời và dòng tế bào phổi l−ỡng bội ng−ời (MRC5) th−ờng đ−ợc sử dụng trong sản xuất vắcxin viêm gan A. Hiệu giá của HAV trong nuôi cấy tế bào có thể từ 103 đến 109 TCID50/ml. Thời gian để có đ−ợc hiệu giá virút tối đa từ 2 ngày cho đến 21 ngày sau gây nhiễm. Tuy nhiên sự ổn định hiếm thấy của virút ở mức độ cấu trúc và di truyền sẽ làm dễ dàng đi rất nhiều vấn đề này. Ba giai đoạn nhân lên của virút trong quá trình nuôi cấy đã đ−ợc xác định. Từ ngày thứ 2 cho đến ngày thứ 8 sau gây nhiễm, sợi ARN âm và sợi d−ơng của virút và tỷ lệ tổng hợp virút HAV có khả năng lây nhiễm đạt mức cao nhất. Từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 14, kháng nguyên virút đ−ợc tổng hợp ở mức cao nhất và sợi ARN d−ơng, HAV lây nhiễm vẫn ở mức cao nhất nh−ng sợi ARN âm giảm xuống ở d−ới mức phát hiện đ−ợc. Số l−ợng thấp ARN sợi kép phát hiện đ−ợc đã chứng minh rằng có rất ít sợi ARN âm đ−ợc tổng hợp. Sau 14 ngày, có rất ít hoạt tính quá trình trao đổi chất của virút. Có nhiều cơ chế đã đ−ợc đ−a ra để giải thích cho sự sao chép 8
  16. chậm HAV trong tế bào. Có nhiều hóa chất ảnh h−ởng đến quá trình sao chép của virút nh− guanidin, hóa chất kháng virút, amantadin, monensin Từ những số liệu của các thử nghiệm miễn dịch, HAV chỉ có 1 serotýp. Hạt virút tinh khiết kích thích sinh kháng thể trung hòa anti-HAV. Ng−ợc lại, kháng thể kháng lại protein capsit tinh khiết hoặc peptit tổng hợp không có hoạt tính trung hòa hoặc rất yếu. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng 98% IgG và 94% IgM đ−ợc tìm thấy trong giai đoạn nhiễm HAV cấp tính là kháng thể kháng VP1. Kháng thể anti-VP1, anti-VP0 và anti-VP3 IgG đ−ợc tìm thấy nhiều năm sau khi nhiễm HAV. Điều đó cho thấy rằng kháng thể kháng polypeptit capsit có thể có vai trò quan trọng trong việc duy trì đáp ứng miễn dịch lâu dài. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng thể trung hòa có thể đ−ợc tạo ra ở chuột khi gây miễn dịch bằng protein virút riêng lẻ VP1,VP2 hoặc VP3. Hơn nữa, vị trí gây miễn dịch trung hòa đã đ−ợc tìm thấy trên protein capsit VP3 của HAV. Một kho tàng các số liệu nghiên cứu viêm gan A đ−ợc l−u trữ trong hơn một nửa thế kỷ đã củng cố quan điểm cho rằng các chủng virút có tính chất sinh bệnh học và kháng nguyên thay đổi sẽ không xẩy ra . Bất kỳ lúc nào các quan sát dịch tễ và lâm sàng cho rằng có sự thay đổi về các tính chất sinh học cơ bản của virút, nh− khi có dịch viêm gan do nguồn n−ớc gây nên ở Delhi năm 1956, thì nghiên cứu sau này đã phát hiện thêm một tác nhân căn nguyên không có liên quan, cũng là một tác nhân virút truyền nhiễm đ−ờng ruột, một viêm gan không A, không B ( hiện nay đ−ợc mô tả là virút viêm gan E). Sự ổn định và đồng nhất kháng nguyên của HAV có thể là kết quả theo dõi tiêm glôbulin miễn dịch huyết thanh ng−ời bảo vệ đ−ợc viêm gan A trên toàn thế giới, không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý của chế phẩm glôbulin miễn dịch đã đ−ợc sử dụng. 9
  17. Hình 2 : Cấu trúc genom HAV và các sản phẩm mã hóa 1.3. Sinh bệnh học Nhiễm trùng tự nhiên với HAV th−ờng xẩy ra sau khi nhiễm virút theo đ−ờng tiêu hóa do các chất bị nhiễm phân có chứa HAV. Quá trình từ khi virút xâm nhập theo ống tiêu hóa cho đến khi gây ra hậu quả viêm gan vẫn ch−a đ−ợc hiểu biết đầy đủ. Mặc dù vị trí sao chép đầu tiên của HAV là tế bào gan, quá trình tự nhiên của các vật thể cảm thụ trên tế bào chủ đối với tác nhân vẫn ch−a đ−ợc xác định rõ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho biết sự kết dính của virút đối với tế bào là phụ thuộc vào canxi. Trong giai đoạn ủ bệnh, trạng thái virút huyết xuất hiện đồng thời với sự đào thải virút theo phân. Trạng thái virút huyết kết thúc nhanh sau khi triệu chứng viêm gan xuất hiện, trong khi HAV vẫn tiếp tục đào thải ra phân trong 1 đến 2 tuần nữa. Trong một vài tr−ờng hợp, HAV có thể l−u hành trong máu gắn với những đoạn màng có lipit có tác dụng bảo vệ virút tránh kháng thể trung hòa. 10
  18. Phức hợp miễn dịch giữa kháng thể IgA đặc hiệu và HAV trong phân đã đ−ợc phát hiện. Điều này giải thích tại sao HAV có thể phát hiện bằng phản ứng lai ghép sau khi kháng nguyên HAV âm tính đối với các thử nghiệm miễn dịch. Đã có giả thuyết cho rằng có vị trí sao chép ban đầu khác ngoài tế bào gan đối với HAV. Trên gây bệnh thực nghiệm cho động vật linh tr−ởng, kháng nguyên HAV và/hoặc vật liệu di truyền đã đ−ợc tìm thấy ở lách, thận, amidan và n−ớc bọt nh−ng không th−ờng xuyên thấy ở niêm mạc ruột. Sự phát hiện của HAV trong amidan và n−ớc bọt, ngay sau khi virút xuất hiện trong máu đã gợi ý rằng quá trình sao chép sớm có thể xẩy ra ở khoang miệng hầu hoặc tuyến n−ớc bọt. Mặc dù có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng có vài mối liên hệ giữa mức độ tiến triển của bệnh với đào thải virút trong phân nh−ng l−ợng virút đào thải trong phân lớn nhất tr−ớc khởi đầu của tổn th−ơng gan biểu hiện bằng ALT tăng cao. Trong vitro, tế bào nhiễm HAV lâu dài không bị phá hủy và sự trao đổi chất hoàn toàn không bị ảnh h−ởng. Điều đó gợi ý rằng, khả năng gây độc của virút có thể không phải là nguyên nhân gây ra những thay đổi bệnh lý trong nhiễm HAV và bệnh lý gan có thể là kết quả ban đầu của cơ chế miễn dịch. Cơ chế đào thải HAV ra khỏi gan vẫn ch−a đ−ợc nghiên cứu nhiều, song có lẽ bao gồm việc gây cảm ứng các tế bào giết không đặc hiệu cũng nh− kháng nguyên bạch cầu ng−ời (HLA) lớp I- giới hạn cho lymphô bào T gây độc. Phân tử đích cho tế bào hoạt hoá kiểu này ch−a đ−ợc biết, song ng−ời ta cho rằng prôtêin virút đ−ợc mã hoá có mặt trên bề mặt của tế bào bị nhiễm. Sự đáp ứng qua trung gian tế bào này đối với nhiễm HAV trong gan có lẽ chịu trách nhiệm phần lớn th−ơng tổn gan kèm theo viêm gan A cấp tính khi virút nhân lên mạnh mẽ và tiếp đến là khởi đầu hủy hoại tế bào 11
  19. gan và sự nhân lên của phần lớn các biến chủng HAV là không gây th−ơng tổn hủy hoại tế bào ở các giòng tế bào nuôi. Tế bào đơn nhân cũng xâm nhập vào bức tranh toàn cảnh trong tổ chức học của viêm gan A cấp tính. Mặc dù vai trò của interferon trong điều trị viêm gan A ch−a đ−ợc xác định rõ, song quá trình nhân lên của HAV có lẽ là hoàn toàn nhậy cảm với interferon-β (IFNβ) và IFNγ. Tuy nhiên IFNβ không đ−ợc sản xuất từ nguyên bào sơ bị nhiễm và chứng cớ để sản xuất IFNα vẫn còn đang tranh cãi. Mặt khác IFNα nh− đã biết sẽ đ−ợc sản xuất từ lymphô bào T trong đáp ứng với viêm gan A cấp tính và có lẽ đóng vai trò chủ yếu trong sinh bệnh học của căn bệnh này. Hơn nữa, đối với hiệu quả kháng virút trực tiếp, IFNα có thể khởi động các tế bào lymphô gây độc bằng cách gây cảm ứng ban đầu của HLA lớp kháng nguyên trên bề mặt tế bào gan. 1.4. Đặc điểm lâm sàng Đặc điểm lâm sàng của viêm gan virút rất đa dạng. Qúa trình nhiễm virút viêm gan cấp có thể chia thành 4 giai đoạn : (a) giai đoạn ủ bệnh giữa phơi nhiễm và ngày đầu tiên xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc vàng da ; (b) giai đoạn tiền lâm sàng ; (c) giai đoạn lâm sàng ; (d) giai đoạn hồi phục. Thời gian ủ bệnh của viêm gan A từ 10 đến 50 ngày, trung bình 1 tháng. Tuy nhiên, l−ợng virút lớn xâm nhập sẽ làm rút ngắn giai đoạn ủ bệnh. Trong giai đoạn này, bệnh nhân không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng mặc dù virút vẫn sao chép và nhân lên. Điều đáng quan tâm nhất trong giai đoạn ủ bệnh là khả năng lây truyền. Giai đoạn tiền lâm sàng kéo dài từ vài ngày đến vài tuần, kéo theo khởi đàu của vàng da. Triệu chứng th−ờng gặp là sốt, chán ăn, mệt mỏi, đau cơ, buồn nôn, nôn. Giai đoạn lâm sàng bao gồm các triệu chứng n−ớc tiểu sẫm mầu do tăng bilirubin niệu, kéo theo phân bạc mầu vài ngày sau đó và vàng 12
  20. da niêm mạc. Có thể gặp viêm gan kịch phát trong 6 đến 8 tuần của bệnh gây ra sốt cao đột ngột, đau dữ dội, nôn, và vàng da tiếp theo là hội chứng não do viêm gan lên quan đén hôn mê sâu và chảy máu não. Tỷ lệ chết cao liên quan đến tuổi, tỷ lệ sống sót rất hiếm đối với bệnh nhân trên 45 tuổi. Chẩn đoán lâm sàng viêm gan virút cấp dựa trên đánh giá chức năng sinh hóa của gan với sự tăng cao men gan ALT và AST. 1.5. Chẩn đoán Bởi vì tác nhân gây bệnh của viêm gan virút th−ờng không thể phân biệt dựa trên đặc điểm lâm sàng và bội nhiễm HAV có thể xẩy ra trên bệnh nhân nhiễm virút viêm gan B và C nên các thử nghiệm huyết thanh đ−ợc tiến hành để xác định nguyên nhân. Để chẩn đoán giai đoạn cấp của nhiễm HAV, một dấu ấn quan trọng th−ờng đ−ợc xác định là IgM anti-HAV. Kháng thể này tăng cao nhanh chóng trong 4 đến 6 tuần, rồi giảm xuống d−ới mức phát hiện trong vòng 3 đến 6 tháng ở phần lớn các bệnh nhân. Trên 85% các tr−ờng hợp men gan vẫn bình th−ờng tr−ớc khi hoặc tại thời điểm IgM anti-HAV biến mất. IgG anti-HAV có thể phát hiện đ−ợc trong vòng 1 hoặc 2 tuần của giai đoạn cấp tính và thay thế IgM. IgG có thể tồn tại nhiều năm sau khi nhiễm HAV. Ngoài các ph−ơng pháp xác định kháng thể IgG hoặc IgM anti-HAV trong huyết thanh bệnh nhân, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đ−ợc áp dụng nhằm tăng cao độ nhậy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán. Kỹ thuật lai ghép đã phát hiện đ−ợc virút với nồng độ 10 4-105 PFU/ml. Tuy nhiên, kỹ thuật này thiếu độ nhậy cần thiết để phát hiện trực tiếp hạt virút vơi số l−ợng nhỏ trong thực phẩm. Hiện nay, phản ứng chuỗi polymeraza - sao chép ng−ợc là kỹ thuật duy nhất cho phép phát hiện virút đ−ờng ruột trong 13
  21. thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã cho rằng kỹ thuật này cho phép phát hiện virút có nồng độ từ 10- 105 PFU/ml trong thực phẩm sau khi cô đặc mẫu bằng sử dụng miễn dịch từ tr−ờng. 1.6. Điều trị Hiện nay không có điều trị đặc hiệu với viêm gan virút cấp. Liệu pháp điều trị mang tính chất hỗ trợ và mục đích là duy trì nghỉ ngơi và dinh d−ỡng hợp lý. Yêu cầu cung cấp 10% glucoza bởi vì bệnh nhân viêm gan thể nặng có thể khó khăn trong việc bài tiết l−ợng n−ớc bình th−ờng. Triệu chứng buồn nôn có thể hạn chế bằng promethazin, cisaprit hoặc ondansetron. Nếu thời gian chẩy máu kéo dài có thể sử dụng liều đơn vitamin K (10mg). Việc điều trị với viêm gan kịch phát vẫn ch−a thành công và tỷ lệ chết vẫn cao. Việc sủ dụng neomyxin hoặc lactuloza theo đ−ờng uống có thể làm giảm hàm l−ợng ammonia trong máu, do đó hạn chế hội chứng viêm não do viêm gan. Điều trị rối loạn các yếu tố đông máu bằng cách sử dụng plasma t−ơi. Bởi vì giảm glucoza huyết th−ờng hay gặp trên bệnh nhân nên l−ợng glucoza phải đ−ợc kiểm soát hàng ngày. 14
  22. Hình 3 : Những biến đổi huyết thanh học trong nhiễm HAV 1.7. Đặc điểm dịch tễ học HAV là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nên hội chứng vàng da nhiễm trùng trên thế giới. 1,4 triệu ca bệnh hàng năm trên thế giới và chi phí điều trị lên tới 1,5 cho đến 3 tỷ đô la Mỹ hàng năm. HAV gây bệnh trên ng−ời, v−ợn (Pan troglodytes), khỉ mắt cú (Aotus trivirgatus), khỉ cộc đuôi (Macaca speciosa) và một vài loài khỉ đuôi sóc Nam Mỹ (Saguinus mystax và S.labiatus). Bệnh phát triển trên động vật linh tr−ởng gần giống nh− ng−ời nh−ng th−ờng nhẹ hơn. Đ−ờng lây truyền chính là đ−ờng tiêu hóa từ ng−ời này sang ng−ời khác. Khả năng lây truyền cao nhất trong thời kỳ 3 đến 10 ngày tr−ớc khi khởi đầu của bệnh, khi có l−ợng virút bài tiết cao nhất qua phân. Tuy nhiên, việc đào thải kháng nguyên HAV và HAV ARN kéo dài hơn đối với trẻ sơ 15
  23. sinh hoặc trẻ nhỏ so với ng−ời lớn. Có nghiên cứu đã xác định đ−ợc HAV ARN trong phân trẻ sơ sinh tới 4-5 tháng sau khi bị nhiễm. Sự đào thải của virút qua phân là nguyên nhân chủ yếu gây nên những vụ dịch ở các trung tâm chăm sóc trẻ sơ sinh, quân đội, nhà trẻ và trong cộng đồng. Ng−ợc lại với kiểu lây truyền giữa ng−ời –ng−ời, sự bùng nổ của các vụ dịch th−ờng do nguồn thực phẩm hoặc n−ớc uống chung bị nhiễm phân. Một vài vụ dịch lớn liên quan đến việc tiêu thụ sò sống hoặc không đ−ợc nấu chín từ nguồn n−ớc ô nhiễm với n−ớc thải. Vụ dịch lớn nhất gần đây xẩy ra ở Th−ợng Hải năm 1988 với hơn 300.000 ca bệnh. Các nghiên cứu về hình thái lây truyền cùng với các kỹ thuật sinh học phân tử đã chỉ ra rằng trạng thái virút huyết có thể tồn tại 7 đến 10 ngày tr−ớc khi có triệu chứng lâm sàng. Lây truyền HAV qua máu hiếm gặp nh−ng có thể xẩy ra do sau truyền máu bị nhiễm virút viêm gan. 16
  24. Hình 4 : Bản đồ dịch tễ học nhiễm HAV trên thế giới Có 4 hình thái nhiễm HAV trên thế giới dựa trên tỷ lệ mang kháng thể anti-HAV liên quan đến tuổi. Các hình thức này biến đổi từ vùng có tỷ lệ cao nh− châu Phi, một phần châu á và Mỹ La tinh, nơi có phần lớn các tr−ờng hợp nhiễm HAV xẩy ra trong thời kỳ thơ ấu cho đến vùng có tỷ lệ thấp và rất thấp nh− Bắc Mỹ và Tây Âu, nơi phần lớn các tr−ờng hợp nhiễm xẩy ra ở ng−ời tr−ởng thành. Các tr−ờng hợp nhiễm ở trẻ d−ới 6 tuổi đều không có triệu chứng và nếu có triệu chứng lâm sàng thì th−ờng nhẹ và không đặc hiệu. Các tr−ờng hợp nhiễm ở trẻ lớn và ng−ời tr−ởng thành th−ờng có triệu chứng và hội chứng vàng da là biểu hiện lâm sàng chính. Tỷ lệ tử vong tăng từ 0,2% trong trẻ 5-14 tuổi cho tới 1,8% trong nhóm 17
  25. ng−ời lớn trên 50 tuổi bị nhiễm HAV. Tại vùng có tỷ lệ mang kháng thể anti-HAV cao, tỷ lệ bệnh có thể thấp do phần lớn các tr−ờng hợp bị nhiễm ở lứa tuổi nhỏ không có triệu chứng lâm sàng. Sự lan truyền xẩy ra giữa ng−ời và ng−ời nh−ng những vụ dịch từ n−ớc hoặc thực phẩm ô nhiễm có thể xẩy ra. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV trung bình, tỷ lệ bệnh cao vì virút l−u hành trong quần thể ở mức độ cao có thể gây bệnh cho trẻ lớn, ng−ời tr−ởng thành, thiếu niên và có biểu hiện lâm sàng. Sự lây truyền qua tiếp xúc giữa ng−ời và ng−ời có thể gây ra những vụ dịch lớn, lây truyền qua n−ớc và thực phẩm cũng có thể xẩy ra. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV thấp, phần lớn trẻ lớn, thiếu niên và ng−ời tr−ởng thành đều có khả năng cảm thụ bệnh nh−ng tỷ lệ bệnh thấp hơn do ít cơ hội tiếp xúc với virút. Phần lớn các hình thái lây nhiễm là từ ng−ời sang ng−ời, th−ờng liên quan đến các vụ dịch lớn, có thể có những vụ dịch do thực phẩm ô nhiễm nh−ng không thể là nguyên nhân chính của bệnh. Tại vùng có tỷ lệ anti-HAV rất thấp, bệnh th−ờng giới hạn trong nhóm ng−ời lớn ở một vài quần thể xác định nh− khách du lịch quốc tế và tiêm chích ma túy. Bởi vì mức độ l−u hành HAV liên quan chặt chẽ đến mức độ phát triển, việc cải thiện điều kiện vệ sinh và điều kiện sống cùng với tăng cao điều kiện kinh tế xã hội sẽ chuyển dịch lứa tuổi cảm nhiễm sang nhóm tuổi lớn hơn. Điều này biểu hiện bằng sự giảm tỷ lệ anti-HAV theo tuổi và tăng quần thể không đ−ợc bảo vệ ở trẻ lớn, thiếu niên và ng−ời tr−ởng thành. Sự thay đổi hình thái từ tỷ lệ anti-HAV cao trong quần thể đến tỷ lệ trung bình có thể gây ra tỷ lệ bệnh cao. 18
  26. 1.8. Dự phòng và kiểm soát Biện pháp kiểm soát hiệu quả nhất là phòng chống ô nhiễm phân vào tay, thực phẩm, n−ớc. Một biện pháp thực hành hữu hiệu nhất là rửa tay đúng qui cách sau khi đi vệ sinh và tr−ớc khi chế biến thức ăn. Nh− đã nêu trên, những ng−ời trẻ tuổi, một bộ phận tích cực và lực l−ợng lao động của cộng đồng ng−ời lớn th−ờng bị nhiễm viêm gan A không phụ thuộc vào mức độ các điều kiện vệ sinh. Mặc dù tiến triển bệnh là không nguy hiểm, song tỷ lệ mắc bệnh đáng kể ở ng−ời lớn dẫn đến sự mất mát về mặt kinh tế một cách đáng kể, ng−ời ta −ớc tính ở Mỹ là trên 200.000.000 USD một năm. Bằng các biện pháp vệ sinh không thôi không đủ để kiểm soát bệnh dịch viêm gan A xẩy ra. Hơn nữa, ch−ơng trình tiêm phòng vắcxin có trọng điểm, chọn lọc hoặc đại trà là cần thiết để dự phòng dịch ở những n−ớc đang phát triển và bệnh tản phát ở những vùng bệnh dịch ít xẩy ra hơn. Vắcxin viêm gan A bất hoạt bằng formalin đã đ−ợc chứng minh là an toàn và hiệu quả. Đáp ứng miễn dịch với vắcxin viêm gan A có thể đạt tới hơn 90% sau một liều tiêm. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng một lịch tiêm nhiều liều là cần thiết để tạo ra một đáp ứng miễn dịch đủ lớn và kéo dài. Dựa theo các công thức −ớc tính, kháng thể bảo vệ anti-HAV sau khi tiêm phòng vắcxin viêm gan A có thể tồn l−u tới hơn 20 năm sau tiêm phòng. Khả năng bảo vệ kéo dài sau khi tiêm vắcxin viêm gan A là quan trọng để tránh sự thay đổi hình thái nhiễm trùng sang lứa tuổi lớn hơn với khả năng tiến triển bệnh nặng hơn. Uỷ ban t− vấn về thực hành tiêm chủng của Mỹ đã đ−a ra kết luận rằng chiến l−ợc tốt nhất để giảm tỷ lệ mắc viêm gan A là tiêm chủng th−ờng xuyên vắcxin ở trẻ nhỏ. Nhiễm HAV phần lớn xẩy ra trên trẻ nhỏ, đối t−ợng trở thành nguồn lây nhiễm cho trẻ lớn và ng−ời tr−ởng thành. Tuy 19
  27. nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêm chủng vắcxin viêm gan A cho trẻ sơ sinh có thể chỉ đạt đ−ợc hiệu giá kháng thể thấp và thời gian bảo vệ ngắn do ảnh h−ởng của kháng thể từ mẹ truyền sang. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sử dụng vắcxin viêm gan A trong thời kỳ có vụ dịch cấp tính xẩy ra ở cộng đồng, nếu hơn 70% đối t−ợng cảm nhiễm đ−ợc tiêm chủng khẩn cấp, vụ dịch có thể kết thúc nhanh chóng. Mức độ kháng thể bảo vệ >20 mIU/ml là đủ khả năng bảo vệ cá thể. Tuy nhiên những yêu cầu cho ch−ơng trình tiêm vắcxin phòng bệnh viêm gan A ở hai kiểu vùng dịch này là hoàn toàn khác nhau. ở những vùng dịch, ch−ơng trình tiêm phòng vắcxin đại trà là cần thiết để kết hợp với việc tiếp tục cải thiện điều kiện môi tr−ờng trong khoảng thời gian từ 10 đến 20 năm để loại trừ virút khỏi môi tr−ờng một cách có hiệu quả. Muốn vậy vắcxin phải có giá thành thấp, rất an toàn và phải dễ dàng lồng ghép vào lịch tiêm chủng hiện hành. Mặt khác, ở những vùng có tần xuất mắc thấp thì những nhóm có nguy cơ cao đặc hiệu sẽ là mục tiêu đầu tiên để gây miễn dịch. Những ng−ời đi lại nhiều vì công việc và nhóm du lịch vào những vùng có dịch, quân nhân, trẻ em lứa tuổi mẫu giáo đ−ợc gửi ở các tr−ờng mẫu giáo ban ngày và có thể cả ng−ời lớn tiếp xúc với họ, nhân viên của một số cơ quan cũng nh− nam giới đồng tính luyến ái và nghiện chích cũng thuộc nhóm ng−ời này. Với các điều kiện đã xác định rõ hơn và có thể kiểm soát đ−ợc, với vắcxin t−ơng đối đắt tiền và thậm chí là sơ đồ gây miễn dịch là nhiều mũi thì cũng có thể chấp nhận đ−ợc. Có rất nhiều vấn đề đặt ra liên quan đến việc sử dụng vắcxin viêm gan A. Điều quan trọng nhất là xác định hiệu lực bảo vệ của vắcxin kéo dài bao lâu và liệu mũi nhắc lại có cần thiết hay không. Điều quan trọng thứ hai là xác định thời gian phù hợp để đ−a vắcxin viêm gan A vào lịch tiêm chủng định kỳ cho trẻ nhỏ. Cuối cùng, giá thành của vắcxin cũng là một vấn đề cực kỳ quan trọng nhất là các n−ớc đang phát triển. 20
  28. Kháng thể anti-HAV có thể đạt đ−ợc trên ng−ỡng bảo vệ nhanh chóng sau 2 tuần tiêm mũi vắcxin đầu tiên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng vắcxin viêm gan A thay thế cho globulin miễn dịch (IG) trong một vài vụ dịch để ngăn chặn dịch phát triển. IG đã đ−ợc chỉ định sử dụng để bảo vệ cá thể kháng lại HAV trong vòng 2 tuần sau khi phơi nhiễm với virút. Tuy nhiên, sự kết hợp sử dụng IG cùng thời gian với vắcxin viêm gan A mũi đầu tiên đã gây ra sự giảm GMT anti-HAV sau khi kết thúc các mũi tiêm khi so sánh với cá thể sử dụng vắcxin viêm gan A đơn độc. Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ khuyến cáo sử dụng IG nh− là biện pháp điều trị sau phơi nhiễm và có thể phối hợp với vắcxin nếu cá thể này nằm trong đối t−ợng tiêm phòng vắcxin viêm gan A. IG đã đ−ợc chỉ định sử dụng cho những ng−ời tiếp xúc trong gia đình hoặc có quan hệ tình dục với ca bệnh, các vụ dịch xẩy ra ở nhà trẻ, mẫu giáo, khu dân c−, quân đội, ng−ời du lịch đến vùng dịch Liều sử dụng của IG đối với sau phơi nhiễm là 0,02 đến 0,04 mL/kg. 2. .Những nghiên cứu về phát triển vắcxin viêm gan A 2.1. Những nghiên cứu đề cập đến phát triển vắcxin viêm gan A cổ điển Không giống nh− virút polio miễn dịch tiết ra tại chỗ đ−ợc coi là đóng vai trò chủ yếu nếu không nói là nổi trội trong bảo vệ nhiễm bệnh, kháng thể IgA niêm mạc có lẽ ít quan trọng hơn trong miễn dịch phòng viêm gan A. Không chỉ miễn dịch có hiệu quả đạt đ−ợc do truyền thụ động IgG, mà cả mức hoạt tính trung hoà HAV có thể thấy đ−ợc cũng không tìm thấy trong n−ớc bọt hoặc huyền dịch phân thu thập đ−ợc sau khi bị viêm gan A. Sự thiếu vắng một đáp ứng kháng thể dịch tiết trung hoà không có thật đối 21
  29. với nhiễm HAV có thể phản ảnh không có sự nhân lên mạnh mẽ của HAV ở ruột. Nói tóm lại một vắcxin viêm gan A có hiệu lực chỉ cần tạo ra đ−ợc một mức độ kháng thể huyết thanh anti-HAV trung hoà đáng kể và tồn tại lâu. Tuy nhiên còn lâu mới có thể nói đến vai trò có thể có của đáp ứng tế bào T trong việc bảo vệ cơ thể chống lại căn bệnh do HAV (hơn nữa là tất cả các picornavirút) vẫn còn ch−a đ−ợc khám phá. Liệu có thể khởi đầu một đáp ứng của tế bào T gây độc đặc hiệu HAV không, nhiễm trùng gan có thể bị giới hạn nhiều do hệ quả phơi nhiễm với HAV. It nhất về lý thuyết thì kiểu nhiễm trùng không tiến triển này có thể gợi ý một tình trạng đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài ở ng−ời đối với virút mà không có bệnh lâm sàng đáng kể. Một trong những kết luận quan trọng đúc kết đ−ợc từ các tính chất của virút viêm gan A ở ng−ời đã đ−ợc trình bày ở trên là chỉ dùng một chủng HAV để phát triển vắcxin và một vắcxin viêm gan A chờ đợi phải tạo ra đ−ợc sự bảo vệ chống lại nhiễm trùng trên toàn thế giới. Tính ổn định về di truyền và kháng nguyên của virút cũng cho thấy rằng một vắcxin kiểu này sẽ là có ích trong một thời gian dài không cần phải điều chỉnh thêm do sự xuất hiện của các biến chủng virút viêm gan A mới. Những tính chất t−ơng tự đã nêu giữa HAV và các picornavirút khác cho thấy các ph−ơng pháp tiếp cận kỹ thuật đã dẫn đến thành công trong việc phát triển các vắcxin polio sống giảm độc lực và chết bất hoạt là hợp lý để có đ−ợc các cách tiếp cận hợp lý và đầy hứa hẹn cho việc phát triển một vắcxin viêm gan A. Kết luận này do Provost và Hilleman ghi nhận ngay sau khi phân lập đ−ợc HAV trong các bệnh phẩm lâm sàng và hàng loạt các nỗ lực đ−ợc tiến hành trong các phòng thí nghiệm theo h−ớng này. Tùy thuộc vào kiểu vắcxin đang đ−ợc phát triển mà phải đối đầu với rất nhiều vấn đề kỹ thuật khác 22
  30. nhau. Tuy nhiên tất cả mọi nỗ lực đều phải vấp phải những khó khăn cố hữu trong việc nuôi cấy HAV trong phòng thí nghiệm. Việc giảm độc lực HAV đã có kết quả sau nhiều lần cấy chuyển virút và cũng là một giải pháp để phát triển vắcxin giảm độc lực. HAV týp hoang dại phân lập từ phân hoặc gan động vật linh tr−ởng bị nhiễm, nhân lên rất chậm và th−ờng có hiệu giá thấp trong nuôi tế bào. Tuy nhiên bằng cách cấy truyền liên tục virút trở nên thích ứng mạnh đối với việc phát triển trong nuôi tế bào và dẫn đến khoảng cách ngắn hơn giữa thời gian gây nhiễm và hiệu suất virút tối đa cũng nh− hiệu suất virút tổng số cuối cùng đều tăng. Một qui trình gồm nhiều b−ớc này cũng làm virút bị giảm độc lực vì làm giảm sự bung ra của virút và virút cảm ứng làm hủy hoại gan trong thực nghiệm thử thách với tinh tinh, khỉ đuôi sóc và trong thực nghiệm rất hạn chế ở ng−ời. Khi cấy truyền một cách tăng c−ờng, virút có lẽ thậm chí không có khả năng nhân lên in vivo vì cả chứng cớ lâm sàng về một nhiễm trùng và cả đáp ứng kháng thể có thể đo đ−ợc đều không có sau khi thử thánh bằng cách tiêm đ−ờng màng bụng cho ng−ời với 106.3 đơn vị gây nhiễm tế bào của virút ở lần cấy chuyển tế bào thứ 31. Virút đã đ−ợc cấy truyền nhậy cảm với nuôi tế bào có thể rất giao động trong các loài linh tr−ởng khác nhau (tinh tinh, khỉ đuôi sóc và khỉ mắt cú), tuy nhiên có kết quả nh− thế nào ở ng−ời thì vẫn còn là vấn đề ch−a thể nói tr−ớc đ−ợc. Bởi vì một số biến chủng virút đã thích nghi tốt với nuôi tế bào vẫn giữ đ−ợc hầu nh− không thay đổi khả năng gây bệnh ở các loài linh tr−ởng không phải ng−ời, việc làm giảm độc lực và thích ứng trên tế bào nuôi mặc dù vậy vẫn yêu cầu phải xác định đ−ợc các đặc tính có liên quan mật thiết về genotýp của HAV. Di truyền học phân tử của các thuộc tính vẫn ch−a đ−ợc xác định đầy đủ. Genôm của hai biến chủng phân lập và thích ứng tế bào độc lập HM 175 của HAV đã đ−ợc xác định trình tự đầy đủ. Một trong những biến chủng này (cấy truyền trên tế bào lần thứ 35, p35 HM 175) là 23
  31. bị giảm độc lực mạnh và có chứa trong trình tự của nó tổng số 17 vị trí đột biến so với chủng hoang dại (không kể các vùng đột biến lặn trong khung đọc mở). Các biến chủng khác (p16 HM 175) đ−ợc coi nh− là có độc tính ở loài linh tr−ởng và chỉ có 14 đột biến. Hai phân lập HM 175 độc lập này có cùng đột biến ở 7 vị trí chung trong genôm. Tuy nhiên, sự phân bố các vị trí đột biến cho thấy rằng sự xen kẽ trong prôtêin của virút, và có lẽ vùng trình tự không mã hóa đầu 5’ tham gia vào quá trình sao chép ARN có thể đóng vai trò trung tâm trong việc thích ứng virút trên nuôi tế bào, có thể là bằng cách cho phép sử dụng một cách có hiệu quả hơn các yếu tố đặc hiệu của tế bào chủ tham gia vào quá trình này. Sự hiểu biết nhiều hơn về di truyền học khả năng nhân lên của nuôi tế bào và sự giảm độc lực của virút trở nên có thể với việc xây dựng đ−ợc một cách thành công cấu trúc độ dài genôm cADN của một clôn gây nhiễm làm từ chủng virút giảm độc lực p35 HM 175 . Một độ dài genôm cADN có cấu trúc t−ơng tự của clôn hoang dại HM 175 thì không gây nhiễm, kể cả ADN hoặc ARN, có thể do cả khả năng nhân lên rất chậm của HAV týp hoang dại trong nuôi tế bào và cả sự truyền nhiễm kém hiệu quả . Tuy nhiên khả năng nhân lên có thể có đ−ợc ở týp hoang dại bằng cách thay thế trình tự P2 bằng cADN điều chế từ virút p35 HM175. Điều này chứng tỏ rằng các vị trí đột biến trong vùng P2 của p35 HM175 (đặc biệt ở prôtêin 2B và 2C) có thể là nhất thiết cho việc thích ứng trên nuôi tế bào. Hơn nữa những nghiên cứu bổ xung bao gồm việc phân tích các virút ảo p16/p35 HM175 cho thấy các vùng đột biến trong vùng không mã hoá 5’ cũng có ảnh h−ởng đáng kể đến khả năng nhân lên trong nuôi tế bào. Mỗi týp p35/ HM175 hoang dại ảo nghiên cứu đều có một phenotýp giảm độc lực. Nh− tất cả các typ có chứa trình tự p35/HM 175 trong vùng P2, các vị trí đột biến trong vùng này cũng có thể là quan trọng để giảm độc lực cũng nh− khả năng nhân lên một cách có hiệu quả. Tuy nhiên 24
  32. những nghiên cứu tiếp tục theo kiểu này bị cản trở vì hiện nay không có một clôn gây nhiễm trình diện virút có độc lực. Những thành công về mặt lâm sàng của các vắcxin bất hoạt ứng cử cũng bị hạn chế. Thực địa sớm của vắcxin Merck chủng CR326 điều chế từ virút gặt từ các lần cấy truyền tế bào khác nhau và tiêm cho ng−ời tình nguyện thấy rằng tính miễn dịch (thực ra là “đánh giá” tỷ lệ sản sinh kháng thể) và tính gây độc gan là có liên quan mật thiết. Nh− vậy virút đã đ−ợc cấy chuyền một cách đầy đủ để loại trừ đ−ợc sự gia tăng enzym gan trong huyết thanh, sau khi tiêm màng bụng có tính miễn dịch thấp và sản sinh kháng thể ở mức độ thấp. Hơn nũa đáp ứng kháng thể bị muộn đáng kể sau khi nhiễm trùng đã đặt ra câu hỏi về số mệnh của virút gây nhiễm. Một điều vẫn còn phải xem xét là liệu việc điều chỉnh lại liều tiêm hoặc số lần cấy chuyển tế bào luân phiên có chọn lựa sẽ làm tăng tính miễn dịch mà không làm tăng tính phản ứng t−ơng tự có đ−ợc không. Một loạt câu hỏi cơ bản vẫn ch−a đ−ợc giải đáp với hy vọng có thể phát triển đ−ợc một vắcxin viêm gan A giảm độc lực. Tr−ớc tiên là mức độ tăng enzym gan bao nhiêu (nếu có) có thể là an toàn ở những ng−ời đã đ−ợc gây miễn dịch? Thêm nữa là liệu có khả năng đạt đ−ợc l−ợng kháng nguyên trong gan (vị trí nhân lên duy nhất cho virút giảm độc lực này) đủ để sản sinh kháng thể mạnh mà không có tạo ra đáp ứng của tế bào T gây độc dẫn đến th−ơng tổn gan đáng kể ? Liệu sự tồn tại lâu dài của kháng thể sau khi tiêm loại vắcxin ứng cử này là do khả năng có sự tồn tại dai dẳng của virút ? Động học và tầm cỡ sự bung ra của virút trong phân là nh− thế nào ? Provost phát hiện rằng sự bung ra của virút trong phân ở tinh tinh đã đ−ợc miễn dịch chỉ xẩy ra ở mức thấp, song khả năng chuyển nhiễm và sự trở lại độc tính vẫn còn là ch−a chắc chắn. Cuối cùng là liệu có các cách tiếp cận khác cho một vắcxin giảm độc lực không ? Các chủng vắcxin polio của Sabin đ−ợc thành công nh− vậy vì chúng kém ái lực thần kinh hơn phần lớn 25
  33. các chủng hoang dại, song vẫn giữ lại đ−ợc khả năng t−ơng đối để nhân lên trong ruột. Ng−ợc lại các HAV giảm độc lực ứng cử hiện nay có lẽ nhân lên rất yếu trong gan và không nhân lên ở bất kỳ đâu nữa. Liệu có các vị trí nào ngoài gan cho HAV nhân lên không sẽ đ−ợc tận dụng để phát triển các ứng cử giảm độc lực mới. 2.2. Vắcxin bất hoạt Một vài phòng thí nghiệm đã sản xuất vắcxin chết bằng cách bất hoạt HAV nuôi cấy trên tế bào bằng formalin hoặc β- propiolacton. Việc phát triển thành công một vắcxin HAV bất hoạt hoặc “chết” có thể giúp khắc phục đ−ợc một vài nh−ợc điểm cho việc sử dụng một vắcxin sống giảm độc lực. Với vắcxin bất hoạt thì vấn đề gây tổn th−ơng gan do quá trình nhân lên của virút ở những ng−ời đ−ợc tiêm, khả năng virút quay trở lại độc tính của týp hoang dại, sự bài tiết ra và chuyển nhiễm cho những ng−ời tiếp xúc ch−a đ−ợc tiêm vắcxin có thể không cần nêu ra. Tuy nhiên vắcxin chết sẽ kích thích tr−ớc hết là kháng thể dịch thể trong hệ miễn dịch và tầm cỡ, tốc độ của đáp ứng này phụ thuộc rất lớn vào số l−ợng và chất l−ợng của kháng nguyên đã đ−ợc tiêm. HAV nhân lên chậm và không có hiệu quả trong đại đa số các hệ nuôi tế bào, vì vậy vấn đề lớn nhất trong việc phát triển một vắcxin bất hoạt là phải sản xuất đ−ợc l−ợng kháng nguyên đủ với giá hợp lý. Tình trạng này có thể minh họa một cách tốt nhất khi so sánh quá trình nhân lên của virút polio và HAV. Với điều kiện tối −u có thể gặt virút polio trong vòng một đến vài ngày với hiệu giá giao động từ 109 đến 1010 TCID50/ml. Đối với HAV thì ng−ợc lại, các hệ nuôi tế bào sẵn có hiện nay tốt nhất cũng cần ít nhất là một tuần, còn phần lớn là vài tuần để virút có 7 thể nhân lên và đạt hiệu giá khoảng 10 TCID50/ml. Có thể đạt đ−ợc hiệu giá cao, song tiêu chuẩn hoá điều kiện nh− vậy để sản xuất lớn kháng 26
  34. nguyên có lẽ là khó khăn. Tuy nhiên HAV bất hoạt bằng formalin là hoàn toàn có tính miễn dịch và các vắcxin HAV bất hoạt thử nghiệm đã đ−ợc nhiều phòng thí nghiệm điều chế thành công và vắcxin đã đ−ợc sản xuất hoặc là dạng thô, hoặc tiến bộ hơn là ở dạng tinh khiết. Provost và Hilleman đã mở đầu trong việc nghiên cứu phát triển vắcxin HAV bất hoạt. Các tác giả này đã làm tinh khiết một phần HAV từ gan khỉ đuôi sóc bị nhiễm virút, bất hoạt bằng formalin và tiêm nhiều liều chế phẩm này với khoảng cách là hai tuần cho khỉ đuôi sóc. ở động vật đã phát triển kháng thể đặc hiệu virút và đề kháng đ−ợc HAV sau khi thử thách với virút sống có độc tính. Với thành công trong nuôi cấy virút in vitro, kháng nguyên virút có các nguồn gốc từ các hệ nuôi cấy tế bào khác nhau LLC- MK2 (khỉ xanh châu Phi chuyển dạng), BS-C-1 (thận khỉ xanh châu Phi), và thích hợp hơn là tế bào nguyên bào sợi bào thai ng−ời (hoặc là nuôi cấy thứ phát hoặc là giòng tế bào đ−ợc thiết lập nh− MRC-5 cũng đã đ−ợc sử dụng để sản xuất vắcxin bất hoạt. Bởi vì phần lớn HAV vẫn là virút liên kết tế bào trong đại đa số các hệ nuôi cấy tế bào, nên kháng nguyên virút th−ờng đ−ợc thu thập bằng cách làm ly giải tế bào với các chất tẩy hoặc làm đông tan. Nói chung hàm l−ợng kháng nguyên thấp trong nuôi cấy tế bào và hàm l−ợng prôtêin của tế bào t−ơng đối lớn hơn trong kiểu gặt này, nên cần có một loạt ít hoặc nhiều b−ớc tinh xảo để cô đặc và tinh khiết. Đối với những vắcxin đ−ợc đ−a ra thực nghiệm sớm bao gồm các lần ly tâm khác nhau. Đối với những sản phẩm cao cấp hơn đang đ−a vào nghiên cứu thực địa lâm sàng thì các b−ớc tinh khiết cũng bao gồm tủa, ly tâm phân vùng, lọc, sắc ký cột với các chất khác nhau. Kháng nguyên thu đ−ợc theo ph−ơng pháp này đã đ−ợc biết rõ đặc tính với hy vọng là kiểu hạt (th−òng bao gồm các hạt rỗng cũng nh− các hạt đầy đủ) và nh− hình ảnh trên SDS-PAGE là hoàn toàn tinh khiết. 27
  35. Bất hoạt HAV bằng formalin th−ờng tiến hành với tỷ lệ t−ơng tự nh− virút polio (Salk và Salk, 1984) với 10-6 lần giảm tính gây nhiễm bắt đầu đạt đ−ợc trong vòng 24-48 giờ sử lý đầu. Tuy nhiên nh− với các virút picorna khác, tính gây nhiễm tồn d− ở mức thấp, có thể ở dạng các hạt virút bị vón cục sau khi sử lý kéo dài vẫn còn có thể có. Lọc huyền dịch kháng nguyên để loại các hạt vón cục và kéo dài thời gian bất hoạt từ 12 đến 20 ngày có thể khắc phục đ−ợc vấn đề này mà không làm giảm công hiệu một cách đáng kể. Dù sao thì khả năng có tính gây nhiễm tồn d− vẫn còn là mối lo lắng, song có thể sử dụng các biến chủng virút giảm độc lực mạnh để sản xuất vắcxin bất hoạt. Kháng nguyên virút tinh khiết bất hoạt đã đ−ợc sử dụng làm vắcxin hoặc có hoặc không hấp phụ với hydrôxyt nhôm. Hàm l−ợng prôtêin trong một liều vắcxin th−ờng giao động trong khoảng 1 đến 7500 ng. Đúng vậy, bởi vì độ tinh khiết của sản phẩm này rất giao động và khối l−ợng kháng nguyên ch−a từng đ−ợc kiểm chứng với kháng nguyên mẫu chuẩn quốc tế, kết qủa nghiên cứu gây miễn dịch cho súc vật thí nghiệm khác nhau và thực địa tiêm vắcxin cho ng−ời cũng khó có thể so sánh đ−ợc. Tuy nhiên nói tóm lại là các kết quả hiện có cho thấy là với những vắcxin tiến bộ nhất, có độ tinh khiết cao và hấp phụ với hydrôxyt nhôm thì hàm l−ợng kháng nguyên miễn dịch có lẽ giao động trong khoảng 100 đến 300 ng/liều. Có 4 loại vắcxin viêm gan A bất hoạt đã đ−ợc đăng ký và sử dụng rộng rãi trên thế giới từ nhiều năm nay : HAVRIX, AVAXIM, VAQTA, EPAXAL. Vắcxin viêm gan A của SmithKline Beecham (HAVRIX) đ−ợc sản xuất bằng cách nuôi cấy chủng HM175 trên tế bào MRC5 chứa 1440 đơn vị ELISA, 0,5 mg hydroxyt nhôm và 5 mg 2-phenoxyethanol. HAV đ−ợc tách chiết từ tế bào bằng đông tan. Hỗn dịch này đ−ợc tinh khiết và cô đặc bằng lọc vô trùng, siêu lọc và tinh khiết qua cột gel. Virút tinh khiết đ−ợc xác định hàm l−ợng kháng nguyên, protein toàn phần và hàm l−ợng 28
  36. albumin bò không v−ợt quá 8àg trong 1 liều ng−ời lớn. Virút đ−ợc bất hoạt với formaldehyt trong 15 ngày ở 37°C. Liều sử dụng cho trẻ em bằng một nửa liều ng−ời lớn. Lịch tiêm đ−ợc áp dụng đối với vắcxin này là 2 mũi cách nhau 6 đến 12 tháng. Độ bền vững của vắcxin đ−ợc thử nghiệm công hiệu trên chuột cho thấy sự t−ơng đ−ơng khi sử dụng vắcxin bảo quản ở 37°C trong 3 tuần và 2-8°C trong 15 tháng. Vắcxin viêm gan A bất hoạt VAQTA (Merck) đ−ợc sản xuất bằng chủng HAV giảm độc lực CR326F’ trên MRC5. Bán thành phẩm đ−ợc xác định không có protein MRC5 và chứa <2pg ADN trong liều 50ng. Bất hoạt formalin đ−ợc tiến hành trong 5 ngày ở 37°C. Lọc vô trùng đ−ợc tiến hành 2 lần trong quá trình bất hoạt. Liều ng−ời lớn 50 ng chứa 450àg hydroxyt nhôm. Lịch tiêm đ−ợc áp dụng là 0-6. 2.3. Vắcxin giảm độc lực Trong quá trình phát triển của vắcxin bại liệt sống, một vài chủng đã đ−ợc giảm độc lực trong quá trình thích ứng trên tế bào. T−ơng tự nh− vậy, một vài chủng đột biến HAV tạo ra đáp ứng miễn dịch trên một số động vật linh tr−ởng mà không gây viêm gan. Những chủng đó đã đ−ợc nuôi cấy trên các dòng tế bào dùng cho sản xuất vắcxin (AGMK,MRC5 hoặc các tế bào nguyên bào sợi l−ỡng bội của ng−ời) sau khi phân lập trực tiếp từ phân bệnh nhân hoặc sau khi cấy truyền trên khỉ đuôi sóc. Provost đã nghiên cứu đánh giá nhiều dạng đột biến của chủng CR326. Chủng này đ−ợc tạo thành do cấy chuyển 31 lần trên khỉ đuôi sóc và trên tế bào ở 32°C hoặc 35°C. Tất cả chủng đột biến này đều có khả năng gây miễn dịch và bảo vệ v−ợn kháng lại chủng HAV thử thách. Một vài chủng CR326 đột biến giảm độc lực mạnh không có khả năng gây đáp ứng miễn dịch có thể do khi cấy truyền trên tế bào ở 32°C gây nên sự sao chép không 29
  37. đầy đủ của virút in vivo. Chủng đột biến hứa hẹn nhất là F (cấy truyền 15 lần trên FRhK6 ở 35°C và 8 lần trên MRC5) và F’ (cấy truyền thêm 8 lần nữa trên MRC5). Chủng F gây đáp ứng miễn dịch cho 17/20 ng−ời tình nguyện nh−ng 5 ng−ời có biểu hiện sinh hóa của viêm gan thể trung bình. Chủng F’ có khả năng giảm độc lực mạnh hơn. Sau khi sử dụng chủng F’ gây miễn dịch, kháng thể trung hòa xuất hiện sau 3 đến 6 tháng trên 10 ng−ời tình nguyện. Purcell đã thu đựoc kết quả t−ơng tự khi tạo chủng giảm độc lực với chủng HM175. Tất cả động vật gây miễn dịch bằng chủng cấy truyền 21 lần hoặc 32 lần đều có kháng thể trung hòa ở mức độ cao và có khả năng bảo vệ với chủng thử thách. So sánh chủng hoang dại và chủng thích ứng trên tế bào HM175 cho thấy nhiều vị trí đột biến ở trong vùng 2B/2C. Mặc cho sự thật là các tiến triển với vắcxin HAV sống giảm độc lực còn chậm chạp và bị đe doạ bởi vấn đề về tính miễn dịch yếu hoặc độc tính gan tồn d−, kiểu vắcxin này vẫn cho chúng ta một hy vọng lớn phát triển đ−ợc một sản phẩm có khả năng tạo ra đ−ợc miễn dịch lâu dài sau khi tiêm một liều vắcxin duy nhất. Tuy nhiên nh− chúng ta đã thấy ở trên, cần phải có nhiều nỗ lực có nhiều giải pháp khác nhau để giảm độc lực của virút bao gồm cả việc sử dụng genôm có mục đích của virút. Hơn nữa các dấu ấn có giá trị của quá trình giảm độc lực phải đ−ợc xác định và tính ổn định di truyền học của phenotýp giảm độc lực phải đ−ợc chứng minh. Để có đ−ợc những thành công cho các cố gắng này thì phải nghiên cứu thật kỹ hơn nữa sinh bệnh học cơ bản của viêm gan A, cũng nh− di truyền học phân tử của HAV giảm độc lực và độc tính. 30
  38. 2.4. Hiệu lực của vắcxin viêm gan A Vắcxin viêm gan A đ−ợc đăng ký sử dụng lần đầu tiên vào năm 1995. Hơn 95% ng−ời lớn và trẻ em có đáp ứng miễn dịch sau mũi tiêm đầu tiên và hiệu giá kháng thể kéo dài sau mũi tiêm nhắc lại 6 tháng sau đó. Những kết quả này đã đ−ợc chứng minh khi xác định hiệu giá kháng thể bằng thử nghiệm trung hòa hoặc thử nghiệm miễn dịch gắn men hoặc thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ với độ nhậy tăng. Tuy nhiên các thử nghiệm anti-HAV th−ơng mại hoá hiện nay nói chung là thất bại trong việc xác định đáp ứng miễn dịch sớm và đáng kể. Hiệu giá kháng thể trung hoà rất giao động trong khoảng 1: 80 đến >1: 6000 sau khi tiêm vắcxin thành công, tuy nhiên nhìn chung giao động trong khoảng 1: 320 đến 1: 1280. Đây là một điều đáng ghi nhận bởi vì sau khi tiêm chế phẩm chuẩn glôbulin miễn dịch ng−ời thì hiệu giá kháng thể trung hoà rất thấp chỉ là 1: 10 - 1: 40. L−ợng kháng thể này đã đ−ợc chứng minh là có hiệu lực phòng viêm gan A lâm sàng khi có tiếp xúc với virút. Kháng thể do vắcxin tạo ra tồn tại trong thời gian khoảng 20 năm. Một vài quốc gia đã sản xuất vắcxin phòng viêm gan A bất hoạt toàn tế bào nh− Mỹ, Bỉ, Nhật Bản. Tính an toàn và hiệu lực đáp ứng miễn dịch của các vắcxin này đã đ−ợc thử nghiệm. Trung Quốc cũng đã tiến hành thử nghiệm vắcxin sống, giảm độc lực. Một nghiên cứu đánh giá hiệu lực vắcxin viêm gan A của Merck đ−ợc tiến hành trên 505 trẻ từ 2 đến 16 tuổi. Sau 21 ngày tiêm mũi đầu tiên, không có tr−ờng hợp nào mắc viêm gan A so với 34 tr−ờng hợp bệnh trong 508 trẻ nhóm chứng sử dụng placebo. Một nghiên cứu thứ hai đ−ợc tiến hành ở Thái Lan với 19 037 trẻ đ−ợc tiêm hai mũi vắcxin viêm gan A bất hoạt của SmithKline Beecham. Hiệu quả bảo vệ của vắcxin là 94% khi so 31
  39. sánh với nhóm chứng tiêm vắcxin viêm gan B. Cả hai loại vắcxin trên đều chứng tỏ là an toàn và hiệu lực trên ng−ời tình nguyện. Jaaijer H.L., và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hiệu lực miễn dịch ở nhóm ng−ời tiêm vắcxin phòng viêm gan A 3 liều vào tháng thứ 0, tháng thứ 1 và tháng thứ 6 (phác đồ "0-1-6" tháng) so với tiêm Immuno globulin. Kết quả cho thấy nếu tiêm đủ 2 liều vắcxin thì không cần phải tiêm Immunoglobulin cho những ng−ời du lịch, và nếu tiêm đủ 3 liều sẽ đạt miễn dịch đủ cao để bảo vệ. Van D.P., và cộng sự thử nghiệm vắcxin kết hợp HAV và HBV tiêm theo lịch "0-1-6" tháng. Kết quả cho thấy vào tháng thứ 6 anti-HBV đạt 89,6% và 100% vào tháng thứ 7. Vào tháng thứ 6, 100% đối t−ợng có anti- HAV trên 20mIU/ml, trong đó 87,6% đối t−ợng có anti-HAV trên 200mIU/ml. Nh− vậy việc kết hợp vắcxin viêm gan A và viêm gan B đạt đ−ợc tính an toàn và hiệu lực miễn dịch bảo vệ với cả HAV và HBV, rất có ích cho việc phòng bệnh cho nhóm có nguy cơ cao: ng−ời du lịch, quân đội, nhân viên y tế Just M. và cộng sự so sánh giữa tiêm vắcxin 1 liều kép duy nhất (tiêm 1 liều 2ml=1440 đơn vị ELISA) và tiêm 2 liều (mỗi liều 1ml=720 đơn vị ELISA) theo lịch "0-6" tháng. Kết quả cho thấy ở cả 2 nhóm đều đạt tính an toàn và hiệu lực miễn dịch bảo vệ cao. Một vắcxin viêm gan A bất hoạt đông khô không có tá chất và chất bảo quản đẫ đ−ợc nghiên cứu phát triển ở Nhật Bản trong nghiên cứu của Atsuko Totsuka. Vắcxin này đã đ−ợc thử nghiệm trên 1869 ng−ời tình nguyện và đã chứng minh đ−ợc tính an toàn và hiệu quả bảo vệ. Một thử nghiệm lâm sàng của vắcxin Havrix (SmithKline Beecham) với liều 720 EU/ml và lịch tiêm 0-1-6 trên ng−ời tình nguyện cho thấy 91% cá thể tiêm phòng có kháng thể trên ng−ỡng bảo vệ sau mũi tiêm đầu tiên 1 32
  40. tháng và 100% sau mũi tiêm thứ hai. Sau mũi tiêm cuối cùng tất cả đối t−ợng nghiên cứu đều có l−ợng anti-HAV trên 200 mIU/ml. Tháng thứ 36 sau khi tiêm phòng 100% đối t−ợng nghiên cứu vẫn còn kháng thể lớn hơn ng−ỡng bảo vệ. Christian Goilav và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hiệu lực và an toàn của 2 loại vắcxin viêm gan A của Pasteur Merieux và SmithKline Beecham trên 839 ng−ời tình nguyện. Hai lịch tiêm khác nhau đ−ợc so sánh giữa hai loại vắcxin bao gồm 0-6 với Pasteur Merieux và 0-1-6 với SmithKline Beecham. Vào tháng thứ bẩy sau mũi tiêm đầu tiên, cả 2 nhóm đều có 100% đáp ứng miễn dịch với GMT từ 4189 mIU/ml đến 3163 mIU/ml. Sau liều đầu tiên, 19,6% -24,6% số ng−ời tiêm có phản ứng phụ tại chỗ giữa hai nhóm tiêm. Hiệu lực và an toàn của hai loại vắcxin đ−ợc đánh giá là nh− nhau. Kết quả của nghiên cứu này cũng t−ơng đ−ơng với nhiều nghiên cứu khác cho rằng lịch tiêm 2 mũi hoặc 3 mũi đều giống nhau trong việc tạo đáp ứng kháng thể. Đ−ờng tiêm cũng là một vấn đề đ−ợc các nghiên cứu quan tâm. Khi so sánh 3 đ−ờng tiêm khác nhau (tiêm bắp, d−ới da và sử dụng dụng cụ tiêm Jet injector) với vắcxin viêm gan A do Pasteur Merieux sản xuất cho thấy l−ợng kháng thể cao nhất đạt đ−ợc khi sử dụng dụng cụ tiêm Jet injector rồi đến tiêm bắp. Tính an toàn và hiệu lực của vắcxin viêm gan A với liều tiêm 160 đơn vị kháng nguyên và lịch tiêm 0-6 cũng đ−ợc khẳng định. Nghiên cứu đánh giá độ an toàn và hiệu lực gây miễn dịch giữa các liều khác nhau của vắcxin viêm gan A sản xuất từ chủng CLF và HM175 (180ELU/ml ; 360 ELU/ml và 720 ELU/ml) cho thấy vắcxin từ chủng HM175 với liều 720 ELU/ml là tốt nhất. Nghiên cứu đánh giá độ an toàn và hiệu lực của vắcxin viêm gan A (Havax) do Công ty vắcxin và sinh phẩm, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng 33
  41. sản xuất đã đ−ợc tiến hành trên ng−ời tình nguyện. Với liều tiêm 200mcg/ml và lịch tiêm 0-1-2, Havrix đã gây 100% đáp ứng miễn dịch cho ng−ời đ−ợc tiêm với GMT là 2186,1mIU/ml. Sau 24 tháng tiêm mũi đầu tiên, đáp ứng miễn dịch vẫn là 100% với GMT bằng 831,5 mIU/ml. 34
  42. Ch−ơng 2 vật liệu và ph−ơng pháp 1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt 1.1 Tế bào thận khỉ Rhesus bào thai th−ờng trực (Frhk-4) Dòng tế bào Frhk-4 nhận từ Phòng nghiên cứu chẩn đoán miễn dịch phân tử viêm gan virút, Trung Tâm Kiểm Soát Bệnh tật và Dự phòng (CDC), Atlanta, Mỹ. CDC nhận từ Ts. Petricciani, Văn phòng các sinh phẩm, FDA, Bethesda, Maryland. Tế bào Frhk4 đ−ợc sử dụng để sản xuất chủng gốc và chủng sản xuất cho quy trình sản xuất vắcxin viêm gan A. Thời gian nhân đôi để có đ−ợc tế bào một lớp là 5-7 ngày, ở nhiệt độ 37°C. 1.2 Chủng virút sản xuất HAV HM - 175 Chủng HAV HM-175 có nguồn gốc từ một phân lập phân ng−ời đ−ợc cấy truyền 6 lần trên khỉ đuôi sóc và tiếp đến là 10 lần cấy truyền cấp tập trên tế bào thận khỉ xanh Phi Châu tiên phát (AGMK), sau đó lại 6 lần cấy truyền cấp tập trên tế bào thận khỉ xanh Phi Châu th−ờng trực (BS-C-1) tr−ớc khi cấy truyền duy trì. 35
  43. HAV – HM- 175 ↓ Cấy truyền 6 lần trên khỉ đuôi sóc ↓ Cấy truyền 10 lần trên tế bào AGMK ↓ Cấy truyền 6 lần trên tế bào BS-C-1 ↓ Cấy truyền 10 lần trên tế bào Frhk-4 ↓ Chủng virút gốc giống (MSV) ↓ Chủng virút sản xuất (WSV) Chủng HAV HM175 đ−ợc nhận từ CDC, Mỹ. Chủng virút gốc giống đ−ợc sản xuất bằng cách nuôi cấy chủng HM175 trên tế bào FRhK-4 ở 37°C trong 10 ngày. Gặt virút bằng cách đông tan 3 lần và ly tâm 4500 vòng/phút trong 30 phút. Từ chủng gốc giống (MSV), chủng sản xuất (WSV) đ−ợc tạo thành bằng ph−ơng pháp cấy truyền chủng gốc giống thêm 1 lần trên tế bào FRhK-4 theo đúng quy trình trên. Hiệu giá virút trong MSV và WSV đều là 107 PFU/ml. 1.3. Tế bào thận khỉ Maccaca Mulatta tiên phát một lớp (PMMK) PMMK nhận từ Trung Tâm sản xuất vắcxin Sabin (POLIOVAC). Tất cả khỉ tr−ớc khi đ−a vào sản xuất phải đ−ợc kiểm tra các virút ở khỉ nh− SV40 (miễn dịch huỳnh quang), Foamy virút (miễn dịch hùynh quang) và SIV (ELISA). Chỉ những khỉ âm tính mới đạt yêu cầu cho sản xuất. Hỗn 36
  44. dịch tế bào thận khỉ có nồng độ 3 x 105 tb/ml trong môi tr−ờng LHE (Lactalbumin Hydrolysate Eagle) đ−ợc phân chia vào các chai nhựa 3 lớp có diện tích mặt bằng 325 cm2 và ủ ở nhiệt độ 37oC. Thay môi tr−ờng vào ngày thứ 6-7. Sau 1-2 ngày chọn các chai tế bào một lớp đạt yêu cầu để gây nhiễm với virút. 1.4. Môi tr−ờng nuôi cấy tế bào * Môi tr−ờng phát triển D’MEM 10%FBS D’MEM (Gibco) 500ml L - G l u t a m i n ( G i b c o ) 5 m M Gentamyxin sulfat (Gibco) 5mcg/ml Fungizon (Gibco) 5mcg/ml F B S ( G i b c o ) 5 0 m l * Môi tr−ờng duy trì D’MEM 2%FBS D’MEM (Gibco) 500ml L - G l u t a m i n ( G i b c o ) 5 m M Gentamyxin sulfat (Gibco) 5mcg/ml Fungizon (Gibco) 5mcg/ml F B S ( G i b c o ) 1 0 m l 1.5. Gây nhiễm tế bào sản xuất Sau khi loại bỏ hết môi tr−ờng phát triển trong các chai tế bào thận khỉ tiên phát một lớp, gây nhiễm tế bào với 20 ml hỗn dịch virút WSV với tỷ lệ gây nhiễm là 0,05PFU/tế bào. Cho virút hấp phụ vào tế bào trong 2 giờ ở 37
  45. nhiệt độ 37oC. Hút bỏ hỗn dịch virút còn thừa. Phân chia vào mỗi chai 200 ml môi tr−ờng duy trì D’MEM 2% FBS. Nuôi tế bào trong 21 ngày. Thay môi tr−ờng hàng tuần. N−ớc nổi thu đ−ợc trong quá trình thay môi tr−ờng đ−ợc cất giữ ở - 20 °C. Mỗi mẻ gây nhiễm giữ lại 10% chai tế bào không gây nhiễm làm chứng tế bào và đ−ợc nuôi cấy trong cùng điều kiện nh− tế bào gây nhiễm để quan sát các hiện t−ợng gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu cũng nh− để kiểm tra các tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào. 1.6. Qúa trình tinh khiết virút Ngày thứ 22 toàn bộ các chai gây nhiễm đ−ợc đ−a vào cất giữ ở nhiệt độ -70oC, trừ chứng tế bào. N−ớc nổi tế bào chứng đ−ợc hộn lại và sau khi ly tâm loại xác tế bào đ−ợc tiến hành kiểm tra các tác nhân ngoại lai gây hủy hoại tế bào không đặc hiệu trên các dòng tế bào khác nhau (thận khỉ tiên phát, Vero, Hep2 ). Các chai tế bào đã gây nhiễm đ−ợc làm đông tan 3 lần, sau đó đ−ợc hộn với n−ớc nổi thu đ−ợc trong quá trình thay môi tr−ờng để ly tâm 6000 vòng/phút trong 1 giờ và n−ớc nổi (RV) đ−ợc siêu lọc và cô đặc bằng màng Millipore Pellicon 10.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit) đến thể tích cần thiết. Thêm vào cặn tế bào (CAV) Triton X- 100 để có nồng độ cuối cùng 2%. Để tiếp xúc ở nhiệt độ 4oC trong 1 giờ sau đó siêu âm bằng máy LABSONIC (Satorious-Đức) trong 3 phút ; lặp lại chu kỳ 0,3. Ly tâm loại bỏ cặn. N−ớc nổi trộn chung với dung dịch đã cô đặc trên để chuẩn bị cho các b−ớc tiếp theo 1.7. Bất hoạt virút Virút đ−ợc siêu lọc và bất hoạt bằng Formalin 1/2000 trong 37 °C - 96 giờ. Lấy mẫu sau khi kết thúc quá trình để kiểm tra bất hoạt để kiểm tra bất hoạt. 38
  46. 1.8. Pha vắcxin Vắcxin đ−ợc pha loãng đến hàm l−ợng 200 mcg/ml trong các dung dịch M199, hydroxyt nhôm và các chất bảo quản nh− 2- phenoxyethanol và Tween 20. Lọc vô trùng và đóng lọ. 1.9. Kỹ thuật tạo đám hoại tử (pfu) để xác định hiệu giá HAV trong nuôi tế bào Tế bào một lớp Frhk-4 trong phiến 24 giếng (NUNC) 1-2 ngày tuổi đ−ợc gây nhiễm với 0,1ml hỗn dịch virút HAV ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-2 - 10-6 trong dung dịch Hank’s (mỗi nồng độ 4 giếng) sau khi đã hút bỏ n−ớc nổi trong các giếng. Cho virút hấp phụ với tế bào ở nhiệt 37oC - 2h. Hút bỏ n−ớc nổi virút còn lại. Phủ tất cả các giếng với 0,6ml thạch phủ 0,5% (Agarose, Seakem ME, FMC Co., Rockland, ME) trong môi tr−ờng D’MEM đặc 2 lần có 2% FBS và 26mM MgCl2. ủ 8 ngày ở nhiệt độ 37oC. Nhuộm mỗi giếng với 0,3ml thuốc nhuộn crystal violet trong dung dịch PBS/formalin qua đêm ở 37oC. Tách bỏ lớp thạch phủ. Để khô phiến. Đọc các đám hoại tử duới đèn có ánh sáng trắng. Tính hiệu giá của hỗn dịch virút kiểm tra theo công thức : Trung bình số l−ợng đám hoại tử đếm đuợc x độ pha loãng = Số pfu/0,1ml 1.10. Thử nghiệm bất hoạt Thử nghiệm bất hoạt đ−ợc tiến hành nhằm kiểm tra độ bất hoạt của virút trong vắcxin thô sau khi kết thúc quá trình bất hoạt. Mẫu thử đ−ợc lấy tại thời điểm 96 giờ sau bất hoạt, thẩm tích qua đêm trong PBS 0,01 M ở 4°C sau đó lọc qua màng lọc 0,22 àm nhằm loại bỏ formalin. Mẫu thử 39
  47. đ−ợc pha loãng 0,5% trong Hank’s sau đó nuôi cấy trên tế bào FRhK- 4 trong 3 tuần. Cấy truyền lần 2 đ−ợc tiến hành với 3 tuần tiếp theo. Sau đó n−ớc nổi nuôi cấy tế bào đ−ợc kiểm tra bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử để xác định hoạt tính virút. Virút đ−ợc bất hoạt hoàn toàn khi hiệu giá virút bằng 0 PFU/ml. 40
  48. sơ đồ tóm tắt qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A Chủng gốc giống HAV- HM -175 (MSV) ↓ Chủng sản xuất HAV-HM -175 (WSV) ↓ Gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát (PMMK) ↓ Nuôi cấy 21 ngày - 37oC ↓ Thay môi tr−ờng hàng tuần → Cất giữ n−ớc nổi -20°C ( Kiểm tra n−ớc nổi tế bào chứng các virút ngoại lai : SV40, lao, Foamy, Mycoplasma .) ↓ Cất giữ ở -70oC ↓ Đông tan 3 lần ↓ Ly tâm 6000 vòng/phút - 1h - 4oC N−ớc nổi (RV) Cặn tế bào (CAV) ↓ Triton X-100 (2% nồng độ cuối) Siêu âm Cô đặc bằng màng lọc Pellicon ↓ (10.000NMWL) Ly tâm 4.500rpm-30’-10oC → cặn ↓ ↓ Dung dịch sau cô đặc →← Nuớc nổi ↓ 41
  49. Bất hoạt formalin 1/2000 - 37oC - 96h (Kiểm tra bất họat = PFU) ↓ Siêu lọc ↓ Kiểm tra độ tinh khiết, hàm l−ợng prôtêin (Lowry) ↓ Pha vắcxin viêm gan A có hàm l−ợng prôtêin = 200mcg/ml. ↓ Hấp phụ với hydroxyt alumimium Al(OH)3 - 300àg/ml. ↓ Kiểm tra chất l−ợng: vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chí nhiệt tố, thành phần hoá học 2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt Các loạt vắcxin viêm gan A do Công ty vắcxin và sinh phẩm sản xuất đều đ−ợc kiểm tra chất l−ợng về các mặt : vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt và các thành phần hóa học. Tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan A đ−ợc xây dựng dựa trên tính ổn định về chất l−ợng của vắcxin giữa các loạt sản xuất, có so sánh với tiêu chuẩn của TCYTTG. 2.1 An toàn chung Trên chuột lang Chuột lang dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 300-350g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 2 chuột lang để kiểm tra. Tiêm 0,5ml vắcxin đ−ờng màng bụng cho mỗi chuột và theo dõi trong thời 42
  50. gian ít nhất là 7 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng. Trên chuột nhắt Chuột nhắt dùng để kiểm tra là 5 tuần tuổi, không có các biểu hiện bệnh lý, tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 2 chuột để kiểm tra. Tiêm 0.5ml đ−ờng màng bụng cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 7 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng. 2.2 Kiểm tra vô khuẩn Cấy 10 ml mẫu cấy vào 5 ống môi tr−ờng thioglycolat (20ml) và 5 ống môi tr−ờng Soybean pepton (10 ml), mỗi ống 1ml mẫu. Môi tr−ờng thioglycolat để theo dõi ở nhiệt độ 35-37oC và Soybean ở nhiệt độ 20-22oC trong thời gian 14 ngày. Không đ−ợc phát hiện thấy nấm và tạp khuẩn phát triển trong các ống môi tr−ờng trong suốt thời gian theo dõi. 2.3. Kiểm tra chất gây sốt Mỗi loạt thành phẩm cuối cùng đ−ợc kiểm tra chất gây sốt trên thỏ. Dùng thỏ có cân nặng ít nhất là 1,5kg. Những thỏ đã dùng rồi có thể dùng lại sau 3 ngày hoặc hơn kể từ lần thử nghiệm tr−ớc, trừ những thỏ có phản ứng d−ơng tính ở thử nghiệm tr−ớc hoặc dùng lại để tiêm cùng một loại sản phẩm nh− thử nghiệm tr−ớc. Không dùng thỏ có thân nhiệt > 39,8oC. Cách ly thỏ 2 ngày tr−ớc khi thử nghiệm ở nhiệt độ 20-25oC. Nhiệt kế dùng để đo thân nhiệt phải có độ chia tới 0,1oC. Bơm kim tiêm phải khử trùng ở 250oC trong ít nhất 30 phút tr−ớc khi dùng. Không cho thỏ ăn mà chỉ cho uống 43
  51. n−ớc trong vòng 16 giờ tr−ớc khi tiêm và cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Không nên giữ thỏ chặt quá. Đ−a nhiệt kế hoặc một dụng cụ ghi nhiệt độ nào khác vào hậu môn thỏ với độ sâu cố định từ 6-9cm. Đọc nhiệt độ sau thời gian cần thiết. Nhiệt độ “ban đầu” của thỏ đo khoảng 15 phút tr−ớc khi tiêm mẫu. Mẫu thử nghiệm phải làm ấm lên 37oC và tiêm vào tĩnh mạch tai 1ml/kg trọng l−ợng. Ghi và đọc nhiệt độ ít nhất 3 lần trong vòng 3 giờ với khoảng cách giữa 2 lần không quá 60 phút. Nhiệt độ cao nhất của thỏ đ−ợc ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiêm đ−ợc coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ tối đa đ−ợc coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là âm tính, thì phản ứng đ−ợc đọc là 0. Thử nghiệm phải đ−ợc tiến hành lần đầu trên 3 thỏ và kết quả đ−ợc nhận định theo bảng d−ới đây. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa các cột 3 và 4 thì thử nghiệm phải tiến hành lại trên một nhóm 3 thỏ khác và tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ đ−ợc nhận định theo bảng. Không tiến hành lại thử nghiệm với hơn 3 nhóm thỏ. Thử nghiêm Thử nghiệm Thử Tổng số đạt nếu không nghiệm thỏ tích lũy tổng nhiệt độ đạt yêu cầu nếu số không quá tổng nhiệt độ quá 1 3 1o3 2o4 2 6 3o0 4o1 3 9 4o9 4o9 Tiêu chuẩn chấp thuận = Tổng nhiệt độ tăng của 3 thỏ ≤ 1,3oC. 2.4. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 Hàm l−ợng nhôm có trong mẫu thử đ−ợc xác định bằng cách đo mầu của phản ứng với thuốc thử Stilbazơ. Thử nghiệm đ−ợc tiến hành sau khi 44
  52. muối nhôm không tan có trong mẫu thử đ−ợc làm tan hoàn toàn. Lắc mẫu kiểm tra thật kỹ thành một hỗn dịch đồng nhất. Lấy chính xác 1 ml hỗn dịch mẫu thử, thêm 0,2 ml axít nitric đậm đặc, đun sôi hỗn dịch cho đến lúc tan hoàn toàn, sau đó pha loãng mẫu kiểm tra bằng n−ớc để có đ−ợc một dung dịch pha loãng có hàm l−ợng nhôm không quá 4àg/ml (pha loãng 25 và 50 lần). Pha loãng dung dịch nhôm chuẩn 0,1% (trọng l−ợng/thể tích) trong n−ớc để có đ−ợc dung dịch chuẩn có hàm l−ợng 2àg/ml (pha loãng 500 lần). Mẫu kiểm tra lấy : 1 ml (pha loãng 25 lần) và 1 ml (pha loãng 50 lần). Dung dịch chuẩn : 1 - 2 - 3 - 4 - 5ml (t−ơng đ−ơng 2 - 4 - 6 - 8 - 10àg). Thêm n−ớc cất vừa đủ 5 ml + 10 ml dung dịch đệm acetat 1M + 5 ml thuốc thử Stilbazơ và n−ớc cất vừa đủ 25 ml. Để nhiệt độ phòng 20 phút. Đo mẫu ở b−ớc sóng 510nm. Song song tiến hành kiểm tra với mẫu trắng là 1 ml n−ớc cất. Hàm l−ợng nhôm có trong mẫu đ−ợc xác định theo đ−ờng chuẩn. Tiêu chuẩn chấp thuận : Al+++ ≤ 500àg/ml 2.5. Kiểm tra hàm l−ợng formaldehyt Hàm l−ợng formaldehyt có trong mẫu đ−ợc xác định bằng cách đo c−ờng độ mầu của 3,5 diacetyl-1,4-dihydrolutidin tạo ra trong phản ứng với acetylaceton với sự có mặt của muối ammoniac thừa ở điều kiện phản ứng axít nhẹ. Lấy 0,5 ml mẫu thử và 0,5 - 1 - 2 - 3 - 5 ml dung dịch mẫu chuẩn formaldehyt 0,01% (100àg/ml) t−ơng ứng với 5 - 10 - 20 - 30 - 40àg. Thêm n−ớc cất vừa đủ 10ml + 4 ml dung dịch đệm acetat + 4 ml dung dịch acetylaceton. ủ 15 phút ở 60oC trong nồi cách thủy (trong tr−ờng hợp dùng hexamethylen tetramin làm dung dịch chuẩn thì phải ủ ở 100oC trong nồi cách thủy). Làm nguội 5 phút trong đá lạnh. Để chính xác 20 phút ở nhiệt 45
  53. độ phòng. Đo mật độ quang ở 410/415nm (tr−ớc khi đo máy, lọc mẫu qua giấy lọc hoặc ly tâm 10 phút ở tốc độ 5.000 vòng/phút. Tiêu chuẩn chấp thuận : Formaldehyt ≤ 0,02 g% 2.6. Kiểm tra hàm l−ợng prôtêin toàn phần Thêm 1 ml dung dịch axít trichloracetic 10% (TCA) vào một ống nghiệm có 1 ml mẫu thử. Đun nóng 80oC trong nồi cách thủy - 15 phút. Làm nguội, sau đó thêm 1 ml Al(OH)3, lắc đều. Ly tâm 3.500 rpm - 30 phút, bỏ n−ớc nổi (có thể lặp lại b−ớc này nếu cần thiết). Thêm 2.5 ml dung dịch Alkalin vào mỗi ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ phòng (25oC) qua đêm. Thêm 2,5 ml n−ớc n−ớc + 0,5 ml thuốc thử folin (pha loãng 1/2), ủ 37oC - 10 phút. Ly tâm 3.500 rpm - 30 phút. Đo mật độ quang ở b−ớc sóng 750nm. Song song tiến hành dựng đ−ờng chuẩn với dung dịch mẫu (dung dịch albumin chuẩn ở các nồng độ 25 - 50 - 100àg/ml). Dựng đ−ờng chuẩn. Dựa vào hàm l−ợng prôtêin tìm đ−ợc trên đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng prôtêin có trong mẫu thử. Song song tiến hành thử nghiệm với mẫu trắng, thay vào 1 ml dung dịch mẫu thử nghiệm là 1 ml n−ớc cất. Tiêu chuẩn chấp thuận ≤ 200mcg/ml 2.7. Kiểm tra công hiệu Công hiệu của vắcxin viêm gan A đ−ợc tiến hành kiểm tra song song với mẫu chuẩn theo ph−ơng pháp thử nghiệm song song. Vắcxin kiểm tra và vắcxin mẫu đem pha loãng ở các độ pha 1: 2 - 1: 4 - 1: 8 - 1:16 trong n−ớc muối sinh lý. Mỗi độ pha tiêm 1 ml d−ới da l−ng cho 8 chuột NMRI 5 tuần tuổi. Toàn bộ chuột đ−ợc nuôi và theo dõi trong 28 ngày. Sau đó lấy máu riêng từng chuột vô trùng. Tách huyết thanh và tiến hành kiểm tra hiệu 46
  54. giá kháng thể anti-HAV toàn phần có trong máu từng chuột bằng ph−ơng pháp ELISA. Kết quả đ−ợc tính theo ch−ơng trình phân tích “STAT- PROBIT” Công hiệu của vắcxin tính theo liều ED50. Tiêu chuẩn chấp thuận : ED50 của vắcxin thử nghiệm phải t−ơng đ−ơng với ED50 của vắcxin mẫu. 3. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 3.1. Đối t−ợng - 304 học viên của Học viện quân y gồm 277 nam và 27 nữ, tuổi đời từ 19 – 27 (trung bình: 22,3), chia làm 6 nhóm thử nghiệm để tiêm các liều tiêm và lịch tiêm khác nhau (Hình 1). - 306 trẻ gồm 149 trai và 157 gái thuộc xã Bình phú (Thạch Thất) và Liên Hồng (Đan Ph−ợng), Hà Tây, tuổi từ 2 – 5 (trung bình: 3,7), chia làm 6 nhóm thử nghiệm để tiêm các liều tiêm và lịch tiêm khác nhau (Hình 2). - Vắcxin Havax do Vabiotech (Viện VSDTTƯ) sản xuất: . Tên vắcxin: Havax. . Lô số: 010403. . Ngày sản xuất: 21/08/2003. . Hạn sử dụng: 04/2005. 3.2. Vật liệu - Dụng cụ lấy máu: bơm kim tiêm 5ml, bông cồn, dây ga rô, kìm kẹp bông, ống thuỷ tinh 5ml. 47
  55. - Dụng cụ tách chiết, bảo quản, xét nghiệm huyết thanh: . Máy ly tâm, tủ lạnh âm sâu, ống Eppendorf. . Tủ ấm 37OC, pipetman, máy đọc ELISA. 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Cỡ mẫu: Xác định theo bảng tính cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng của WHO năm 1991. Theo đó, cỡ mẫu tối thiểu đ−ợc xác định cho mỗi nhóm là 40 (với α = 0,05 và 1 - β = 80%). 3.3.2.Phân nhóm đối t−ợng, lịch tiêm, liều tiêm - Ng−ời lớn: 304 học viên đ−ợc chia làm 6 nhóm, tiêm theo 3 liều 150àg, 100àg và 50àg với 2 lịch tiêm “0-1-2” tháng và “0-1-6” tháng. - Trẻ em: 284 trẻ đ−ợc chia làm 6 nhóm, tiêm theo 3 liều 75àg, 50àg và 25àg với 2 lịch tiêm “0-1-2” tháng và “0-1-6” tháng. 304 học viên 149 HV tiêm theo 155 HV tiêm theo lịch “0-1-2” tháng lịch “0-1-6” tháng 002050 50 49 52 52 51 HV HV HV HV HV HV tiêm tiêm tiêm tiêm tiêm tiêm liều liều liều liều liều liều 150 100 50 150 100 50 àg àg àg àg àg àg 48
  56. Hình 5: Sơ đồ phân nhóm, liều tiêm, lịch tiêm ở ng−ời lớn 306 trẻ từ 2 – 5 tuổi 154 trẻ tiêm theo lịch 152 trẻ tiêm theo lịch “0-1-2” tháng “0-1-6” tháng 52 49 53 52 51 49 trẻ trẻ trẻ trẻ trẻ trẻ tiêm tiêm tiêm tiêm tiêm tiêm liều liều liều liều liều liều 75 50 25 75 50 25 àg àg àg àg àg àg Hình 6: Sơ đồ phân nhóm, liều tiêm, lịch tiêm ở trẻ em 3.3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu Đánh giá tính an toàn của vắcxin Các đối t−ợng đ−ợc theo dõi trong 15 phút đầu và 15 ngày đầu sau mỗi mũi tiêm vắcxin: các dấu hiệu lâm sàng tại chỗ và toàn thân (có phiếu theo dõi kèm theo). Đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin - Lấy máu lần 1 cho các đối t−ợng ngay tr−ớc khi tiêm vắcxin, xác định hiệu giá kháng thể kháng HAV (anti-HAV) – hiệu giá kháng thể “nền”, tính hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT). 49
  57. - Về ph−ơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch : Sử dụng ph−ơng pháp ELISA định l−ợng kháng thể anti-HAV toàn phần bằng sinh phẩm HAV Total của BioRad. Tiêu chuẩn đánh giá dựa theo tiêu chuẩn của TCYTTG đề ra : l−ợng kháng thể anti-HAV ≥20 mIU/ml là đủ để bảo vệ cá thể khỏi nhiễm HAV. - Tiêm vắcxin nghiên cứu ở cơ Delta cánh tay theo liều và lịch tiêm nêu trên. - Lấy máu lần 2, 3 ở thời điểm ngay tr−ớc khi tiêm vắcxin mũi 2, 3 và lấy máu lần thứ 4 ở thời điểm 1 tháng sau khi tiêm vắcxin mũi 3. - Xác định hiệu giá kháng thể, tính GMT và so sánh biến động kháng thể sau mỗi liều tiêm ở mỗi nhóm và so sánh các nhóm với nhau (Xem sơ đồ d−ới đây) VX VX VX Mũi 1 Mũi 2 Mũi 3 1 3 tháng 0 2 HT 1 HT 2 HT 3 HT 4 Hình7: Sơ đồ tiêm vắcxin và lấy theo dõi biến động kháng thể ở các nhóm tiêm theo lịch “0-1-2” tháng 50
  58. VX VX VX Mũi 1 Mũi 2 Mũi 3 0 1 6 7 tháng HT 1 HT 2 HT 3 HT 4 Hình 8: Sơ đồ tiêm vắcxin và lấy máu theo dõi biến động kháng thể ở các nhóm tiêm theo lịch “0-1-6” tháng 3.3.4. Chỉ tiêu đánh giá, so sánh: Đánh giá tính an toàn của vắcxin - Các dấu hiệu lâm sàng tại chỗ và toàn thân xuất hiện trong vòng 15 phút đầu tiên và 15 ngày đầu sau mỗi mũi tiêm vắcxin: s−ng, nóng, đỏ, đau, áp xe (tại chỗ tiêm) và sốt, đau đầu, buồn nôn – nôn, s−ng hạch (toàn thân). Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắcxin - Hiệu giá kháng thể của anti-HAV < 20mIU/ml đ−ợc coi là không đạt hiệu giá bảo vệ (âm tính với HAV) - Hiệu giá kháng thể của anti-HAV ≥ 20mIU/ml đ−ợc coi là đạt hiệu giá bảo vệ (d−ơng tính với HAV): . Từ 20 đến d−ới 100 mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức thấp. . Từ 100 đến d−ới 1000mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức trung bình. 51
  59. . Từ 1000 đến d−ới 10.000mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ỏ mức cao. . Từ 10.000mIU/ml trở lên: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức rất cao. - Tính hiệu giá kháng thể trung bình nhân (Geometric Mean Titer) bằng phần mềm Excel. - Đáp ứng miễn dịch của mỗi liều, lịch tiêm đ−ợc đánh giá qua tỷ lệ đối t−ợng đạt hiệu giá bảo vệ và sự biến động của GMT mỗi mũi tiêm. - So sánh sự biến động của hiệu giá kháng thể ở mỗi liều, lịch tiêm: Sử dụng GMT và ln (logarit cơ số e) của GMT ở các thời điểm. So sánh mức đáp ứng miễn dịch giữa các lịch, liều tiêm bằng thuật toán Chi2; so sánh GMT giữa các lịch, liều tiêm bằng thuật toán T-Student. 3.3.5. Xử lý số liệu: Các số liệu thu đ−ợc sẽ đ−ợc phân tích bằng phần mềm EPIINFO 6.0 và Excel. 4. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin HAVAX (DO Vabiotech sản xuất) và vắcxin avaxim ( do aventis pasteur sản xuất) 4.1. Đối t−ợng - 74 trẻ em từ 10-15 tuổi của huyện Đông H−ng- tỉnh Thái Bình, chia làm 2 nhóm thử nghiệm để tiêm HAVAX và AVAXIM. Ph−ơng pháp mù một lần đ−ợc áp dụng để đánh mã các đối t−ợng. Việc mã hóa và phân nhóm tiêm, tổ chức nghiên cứu do TT YTDP Thái Bình thực hiện. Việc khớp mã hóa các đối t−ợng đ−ợc thực hiện sau khi có kết quả định l−ợng anti-HAV. 4.2. Vật liệu 52
  60. - Dụng cụ lấy máu: bơm kim tiêm 5ml, bông cồn, dây ga rô, kìm kẹp bông, ống nhựa 5ml. - Dụng cụ tách chiết, bảo quản, xét nghiệm huyết thanh: . Máy ly tâm, tủ lạnh âm sâu, ống Eppendorf. . Tủ ấm 37OC, pipetman, đầu côn các loại, máy đọc ELISA. - Vắcxin Havax do Vabiotech (Viện VSDTTƯ) sản xuất: . Tên vắcxin: Havax. . Lô số: 030804. . Ngày sản xuất: 21/09/2004. . Hạn sử dụng: 08/2006. - Vắcxin AVAXIM (Aventis Pasteur) sản xuất : . Tên vắcxin : Avaxim . Lô số : Y0474 . Ngày sản xuất : 28/05/2005 - Hạn dùng : 04/2007 4.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 4.3.1. Cỡ mẫu: Nhóm tiêm vắc xin ngoại 30 trẻ và nhóm tiêm vắc xin HAVAX 30 trẻ. 4.3.2. Lịch tiêm, liều tiêm - 44 trẻ tiêm HAVAX với liều 0,5ml/mũi tiêm bắp t−ơng đ−ơng liều 100àg và tiêm theo lịch tiêm “0-1” tháng. - 30 trẻ tiêm AVAXIM với liều 0,5ml/mũi tiêm bắp t−ơng đ−ơng 160 đơn vị kháng nguyên HAV và tiêm theo lịch tiêm “0-1” tháng. 53
  61. 4.3.3. Ph−ơng pháp đánh giá Đánh giá tính an toàn của vắcxin Các đối t−ợng đ−ợc theo dõi trong 15 phút đầu và 15 ngày đầu sau mỗi mũi tiêm vắcxin: các dấu hiệu lâm sàng tại chỗ và toàn thân (có phiếu theo dõi kèm theo). Đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin - Lấy máu lần 1 cho các đối t−ợng ngay tr−ớc khi tiêm vắcxin, xác định hiệu giá kháng thể kháng HAV (anti-HAV) – hiệu giá kháng thể “nền”, tính hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT). - Tiêm vắcxin nghiên cứu ở cơ Delta cánh tay theo liều và lịch tiêm nêu trên. - Lấy máu lần 2, ở thời điểm 1 tháng sau khi tiêm vắcxin mũi thứ 2 - Xác định hiệu giá kháng thể, tính GMT 4.3.4. Chỉ tiêu đánh giá, so sánh: Đánh giá tính an toàn của vắcxin - Các dấu hiệu lâm sàng tại chỗ và toàn thân xuất hiện trong vòng 15 phút đầu tiên và 15 ngày đầu sau mỗi mũi tiêm vắcxin: s−ng, nóng, đỏ, đau, áp xe (tại chỗ tiêm) và sốt, đau đầu, buồn nôn – nôn, s−ng hạch (toàn thân). Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắcxin - Hiệu giá kháng thể của anti-HAV < 20mIU/ml đ−ợc coi là không đạt hiệu giá bảo vệ (âm tính với HAV) - Hiệu giá kháng thể của anti-HAV ≥ 20mIU/ml đ−ợc coi là đạt hiệu giá bảo vệ (d−ơng tính với HAV): 54
  62. . Từ 20 đến d−ới 100 mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức thấp. . Từ 100 đến d−ới 1000mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức trung bình. . Từ 1000 đến d−ới 10.000mIU/ml: đạt hiệu giá bảo vệ ỏ mức cao. . Từ 10.000mIU/ml trở lên: đạt hiệu giá bảo vệ ở mức rất cao. - Tính hiệu giá kháng thể trung bình nhân (Geometric Mean Titer) bằng phần mềm Excel. - So sánh mức độ đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm bằng thuật toán chính xác của Fisher 4.3.5. Xử lý số liệu: Các số liệu thu đ−ợc sẽ đ−ợc phân tích bằng phần mềm EPIINFO 6.0 và Excel. 55
  63. ch−ơng 3 kết quả và bàn luận 1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt 1.1. Hiệu giá virút viêm gan A trong quá trình nuôi cấy Nhằm nâng cao công suất của quy trình, chúng tôi đã sử dụng chai tế bào 3 lớp với tổng diện tích là 325 cm2/chai thay thế cho chai 1 lớp 125 cm2 đ−ợc sử dụng tr−ớc kia đồng thời mở rộng sản xuất bằng cáchtăng số chai tế bào nuôi cấy trong một loạt lên gấp đôi. Một điều rất quan trọng là vẫn phải đảm bảo tính ổn định của quy trình và hiệu giá virút cao khi chuyển sang hệ thống chai nuôi cấy tế bào mới. Virút trong n−ớc nổi gặt vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 sau khi gây nhiễm đ−ợc chuẩn độ bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử. Kết quả này đ−ợc so sánh giữa thời gian trong và sau khi hoàn thiện quy trình. 56
  64. Bảng 1: Hiệu giá HAV (PFU/ml) trong n−ớc nổi 7 loạt trong khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0103 0203 0303 0403 0503 0603 0703 4 5 4 4 5 5 5 N−ớc nổi 1 6ì10 4ì10 6ì10 6ì10 2ì10 10 7ì10 5 5 5 4 5 5 5 N−ớc nổi 2 10 6ì10 6ì10 6ì10 6ì10 2ì10 8ì10 Qua kết quả này cho thấy hiệu giá virút trong 7 loạt này đều là 105, có tăng lên giữa hai thời điểm ngày thứ 7 và ngày thứ 14. Bảng 2 : Hiệu giá HAV (PFU/ml) trong n−ớc nổi 7 loạt sau khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0903 0104 0204 0304 0404 0504 0604 6 6 6 6 6 6 6 N−ớc nổi 1 2ì10 6,75ì10 3,25ì10 1ì10 0,75ì10 1ì10 1ì10 6 7 6 6 6 6 6 N−ớc nổi 2 5,5ì10 4ì10 4ì10 2,5ì10 1ì10 2ì10 3ì10 Sau khi hoàn thiện quy trình, hiệu giá virút trong n−ớc nổi tại các thời điểm đều là 106, tăng lên một log so với 7 loạt tr−ớc và đảm bảo tính ổn định của quy trình với các kết quả không khác biệt giữa các loạt. 57
  65. 5 1000 100 N−ớc nổi 1 N−ớc nổi 2 10 Hiệu giá vi rút (PFU/ml) 10 (PFU/ml) rút vi giá Hiệu 1 0903 0104 0204 0304 0404 0504 0604 Loạt Hình 9 : Hiệu giá HAV (PFU/ml) trong n−ớc nổi 7 loạt sau khi hoàn thiện quy trình 1.2. Hiệu giá virút viêm gan A trong quá trình tinh khiết virút Sau 21 ngày nuôi cấy, tế bào đ−ợc ly giải bằng cách đông tan 3 lần ở nhiệt độ -80°C. Hiệu giá virút đ−ợc kiểm tra ở tất cả các giai đoạn của quá trình tinh khiết virút bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử. Bảng 3 : Hiệu giá HAV (PFU/ml) 7 loạt trong khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0103 0203 0303 0403 0503 0603 0703 4 5 4 4 6 5 5 Sau ly tâm 6ì10 6ì10 6ì10 6ì10 3ì10 3ì10 3ì10 6 7 7 7 7 7 7 Cặn sau siêu âm 9ì10 3ì10 6ì10 6ì10 6ì10 4ì10 8ì10 5 6 7 6 7 7 6 Sau cô đặc 4ì10 10 6ì10 6ì10 6ì10 4ì10 4,5ì10 6 7 7 6 7 6 7 Tr−ớc khi bất hoạt 6ì10 10 6ì10 6ì10 6ì10 8ì10 2,5ì10 58
  66. Trong quá trình tinh khiết, hiệu giá virút cao nhất tập trung vào cặn, 7 đều là 10 . Điều này cũng đúng nh− nhiều nghiên cứu khác là l−ợng virút chủ yếu tập trung trong tế bào nhiều hơn là giải phóng ra n−ớc nổi. Do vậy b−ớc siêu âm phá cặn là rất quan trọng để đảm bảo thu đ−ợc toàn bộ virút trong cặn. Chúng tôi đã sử dụng máy siêu âm mới LABSONIC (Satorius, Đức) thay thế cho hệ thống siêu âm cũ nhằm đảm bảo có thể siêu âm đ−ợc l−ợng thể tích cặn lớn hơn mà l−ợng virút thu đ−ợc trong tế bào vẫn cao. 7 Hiệu giá virút sau quá trình tinh khiết cũng rất cao đều là 10 tr−ớc khi bất hoạt. Bảng 4 : Hiệu giá HAV (PFU/ml) 7 loạt sau khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0903 0104 0204 0304 0404 0504 0604 Sau ly tâm 2ì106 1,25ì106 6,25ì105 1ì106 2ì106 0,5ì106 2,5ì106 Cặn sau 8 7 8 1ì108 4ì108 7ì107 0,5ì108 2,5ì10 8ì10 1,75ì10 siêu âm Sau cô đặc 1.5ì107 4,5ì108 3,25ì107 2ì106 3ì107 3ì107 1,25ì108 Tr−ớc khi 2.5ì107 6,25ì107 2,5ì107 2ì107 4ì107 2ì107 5,75ì106 bất hoạt Kết quả trên cho thấy hiệu giá virút trong cặn là rất cao so với 7 loạt tr−ớc (0103 đến 0703) từ 0,5-1 log. Quy trình sản xuất của những loạt này đã đ−ợc hoàn thiện và mở rộng, tăng gấp đôi số l−ợng chai tế bào nuôi cấy so với ban đầu. Hiệu giá virút tr−ớc khi bất hoạt và thể tích bán thành phẩm cũng tăng gần gấp đôi so với 7 loạt tr−ớc (3,6 lít so với 1,8 lít). Điều này 59
  67. chứng tỏ quy trình đã hoàn thiện đảm bảo một công suất cao có thể tăng cao số liều sản xuất mà chất l−ợng vắcxin vẫn đảm bảo. 10000 1000 ) 5 Sau ly tâm Cặn sau siêu âm 100 Sau cô đặc PFU/ml(10 Tr−ớc khi bất hoạt 10 1 0903 0104 0204 0304 0404 0504 0604 Loạt Hình 10 : Hiệu giá HAV (PFU/ml) trong quá trình tinh khiết 7 loạt sau khi hoàn thiện quy trình 1.3. Hàm l−ợng Protein toàn phần Hỗn dịch virút tinh khiết và bất hoạt đ−ợc kiểm tra hàm l−ợng Protein toàn phần tr−ớc khi pha vắcxin. Hiện tại, ch−a có ph−ơng pháp chuẩn thức để định l−ợng kháng nguyên HAV nên tất cả các loạt vắcxin thô đều đ−ợc kiểm tra hàm l−ợng Protein toàn phần tr−ớc khi pha vắcxin bán thành phẩm. 60
  68. Bảng 5 : Hàm l−ợng Protein toàn phần trong vắcxin thô 7 loạt trong khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0103 0203 0303 0403 0503 0603 0703 Protein toàn phần 480 378 300 266 320 378 218 (mcg/ml) Hàm l−ợng Protein toàn phần dao động giữa các loạt từ 200- 400mcg/ml. Bảng 6 : Hàm l−ợng Protein toàn phần trong vắcxin thô 7 loạt sau khi hoàn thiện quy trình Mẫu 0903 0104 0204 0304 0404 0504 0604 Protein toàn phần (mcg/ml) 497 399 444 474 371 386 424 Hàm l−ợng Protein toàn phần trong vắcxin thô dao động từ 370- 500mcg/ml. 1.4. Thử nghiệm bất hoạt Tất cả 14 loạt vắcxin thô đều đạt yêu cầu về thử nghiệm bất hoạt. Điều đó chứng tỏ quy trình bất hoạt virút 1/2000 ở 37°C trong 96 giờ là đảm bảo an toàn. 61
  69. 1.5. Pha chế vắcxin và đóng ống Vắcxin viêm gan A bất hoạt đ−ợc pha trong dung dịch M199, Al(OH)3, Tween 20 và 2-phenoxyethanol với hàm l−ợng là 200 mcg/ml. Vắcxin đ−ợc đóng lọ 1ml = 2 liều trẻ em 1 lọ. Chúng tôi đã xuất x−ởng 3 loạt vắcxin thành phẩm với số l−ợng nh− sau : a/ Vắcxin thành phẩm : Loạt 010403 : 4.560 liều Loạt 021103 :21.580 liều. Loạt 030804 : 48.780 liều Loạt 040105 : 51.260 liều Tổng số = 126.180 liều Đã bán đ−ợc : 41.686 liều x 33.600 = 1.400.649.600đ b/ Vắcxin bán thành phẩm (ch−a pha vì vắcxin thành phẩm tồn kho còn nhiều, hạn sử dụng chỉ là 24 tháng vì vậy tùy thuộc vào nhu cầu thị tr−ờng sẽ chủ động pha vào các thời gian thích hợp) Loạt 0904 : 4.000 ml Loạt 0105 : 4.200 ml Loạt 0305 : 4.200 ml Loạt 0505 : 5.000 ml Tổng số = 92.800 liều Tổng sản phẩm = 126.180 liều + 92.800 liều = 218.980 liều 62
  70. 2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt Từ tr−ớc đến nay, chúng ta th−ờng dựa vào tiêu chuẩn của TCYTTG hoặc của các n−ớc khác để kiểm định chất l−ợng vắcxin viêm gan A bất hoạt do Việt Nam sản xuất mà ch−a có tiêu chuẩn quốc gia phù hợp cho loại vắcxin mới này. Mỗi loại vắcxin đều có điều kiện, hoàn cảnh sản xuất, qui trình sản xuất khác nhau. Vì vậy việc thăm dò, xây dựng tiêu chuẩn chất l−ợng về các mặt sinh học, hóa học để có đ−ợc một vắcxin an toàn và hiệu quả nh−ng đồng thời phù hợp với điều kiện mỗi quốc gia là rất thiết thực và quan trọng. Song song với việc nghiên cứu tính ổn định để hoàn thiện quy trình sản xuất, việc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt cũng đ−ợc tiến hành. Các ph−ơng pháp chúng tôi chọn để nghiên cứu đánh giá là các ph−ơng pháp chuẩn thức đ−ợc TCYTTG quy định về kiểm tra chất l−ợng vắcxin. Từng loạt vắcxin đ−ợc lấy mẫu một cách ngẫu nhiên theo quy định của TCYTTG tại kho vắcxin thành phẩm của Công ty VABIOTECH dể đảm bảo tính khách quan và đồng đều. 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hóa học Trong quá trình sản xuất cũng nh− bảo quản, nhà sản xuất phải dùng tới một số hóa chất có độc tính nh− Formaldehyt để bất hoạt và hydroxyt nhôm để hấp phụ kháng nguyên. D−ợc điển các n−ớc cũng nh− TCYTTG đều quy định giới hạn cho phép đối với hóa chất này trong từng vắcxin, vì 63
  71. vậy việc nghiên cứu để đề ra các tiêu chuẩn hóa học cho vắcxin viêm gan A bất hoạt để đánh giá chất l−ợng vắcxin xuất x−ởng là điều cần thiết. Trong năm 2000 có 6 loạt vắcxin viêm gan A xuất x−ởng và trong năm 2003-2004 có 3 loạt vắcxin xuất x−ởng. Tất cả các loạt vắcxin này đều đ−ợc kiểm tra thành phần hóa học có trong vắcxin bao gồm : Protein toàn phần, Formaldehyt, Al+++ và pH. Qua các kết quả kiểm định, chúng tôi thấy chỉ số hóa lý của các loạt t−ơng đối đồng đều và ổn định. So sánh với kết quả kiểm tra 6 loạt sản xuất năm 2000 với tiêu chuẩn của TCYTTG đề ra đều đạt yêu cầu. Riêng về tiêu chuẩn Protein toàn phần đối với vắcxin viêm gan A ch−a có tiêu chuẩn đề ra. Chúng tôi đang tiến hành nghiên cứu xây dựng một thử nghiệm ELISA để định l−ợng kháng nguyên HAV nhằm xác định chính xác hàm l−ợng kháng nguyên trong vắcxin thay vì xác định hàm l−ợng Protein toàn phần. Bảng 7 : Thành phần hóa học của các loạt vắcxin viêm gan A sản xuất trong năm 2000 Protein toàn Formaldehyt Al+++ Loạt số pH phần (àg/ml) (g%) (àg/ml) 0100 280 0,0009 323 7,29 0200 238 0,00102 323 7,14 0300 396 0,0017 323 7,29 0400 386 0,0104 323 7,35 0500 292 0,009 323 7,41 0600 208 0,0124 323 7,17 Tiêu chuẩn Ch−a có tiêu ≤0,02 ≤500 5,5-7,5 TCYTTG chuẩn 64
  72. Bảng 8 : Thành phần hóa học của các loạt vắcxin viêm gan A sản xuất trong năm 2003-2004 Loạt số Protein toàn phần Formaldehyt Al+++ pH (mcg/ml) (g%) (àg/ml) 010403 115,32 0,018 304,43 6,93 021103 168,38 0,011 364,67 7,3 030804 185,57 0,01 315,85 7,09 040105 155,12 0,0048 307,55 7,19 Tiêu chuẩn Ch−a có tiêu ≤0,02 ≤500 5,5-7,5 TCYTTG chuẩn Kết quả kiểm tra của 3 loạt vắcxin năm 2003-2004 đều cho thấy kết quả ổn định và đạt yêu cầu so với tiêu chuẩn của TCYTTG. 0.03 Tiêu chuẩn chấp thuận ≤0,02 g% 0.025 0.02 0.015 0.01 Formaldehyt (g%) Formaldehyt 0.005 0 3 4 00 00 0 03 0 0100 02 0300 0400 05 0600 11 0104 02 0308 Loạt Hình 11: Hàm l−ợng Formaldehyt của 9 loạt vắcxin viêm gan A 65
  73. Tiêu chuẩn chấp thuận ≤ 500 mcg/ml 600 400 200 Al+++(mcg/ml) 0 4 00 00 03 03 0 01 0200 0300 04 0500 0600 04 11 01 02 0308 Loạt Hình 12: Hàm l−ợng Al+++ của 9 loạt vắcxin viêm gan A 9 Tiêu chuẩn chấp thuận trên ≤7,5 8 7 6 5 pH 4 Tiêu chuẩn chấp thuận d−ới ≥5,5 3 2 1 0 00 00 0100 0200 0300 0400 05 06 0403 1103 0804 01 02 03 Loạt Hình 13: pH của 9 loạt vắcxin viêm gan A Với mỗi tiêu chuẩn hóa học, các mẫu vắcxin nghiên cứu đ−ợc tiến hành trong một điều kiện chuẩn thức, tối −u. Các thử nghiệm đều sủ dụng 66
  74. các máy móc hiện đại, chuẩn thức nh− máy đo quang phổ của hãng Perkin Elmer, máy đo pH (Taccussel, Pháp), máy ly tâm (Firlabo, Pháp), cân phân tích (Satorius, Pháp), các hóa chất phân tích tinh khiết của LABOSI, Merck, Sigma, BDH Tất cả các thuốc thử, dung dịch chuẩn đ−ợc pha và đ−ợc kiểm tra chất l−ợng tr−ớc khi tiến hành thử nghiệm Đối chiếu với các tiêu chuẩn khuyến cáo của TCYTTG về giới hạn các thành phần hóa học, chúng tôi thấy 9 loạt vắcxin viêm gan A bất hoạt đều đạt các tiêu chuẩn hóa học của TCYTTG đề ra cho loại vắcxin này. Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy sự ổn định của quy trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt. Để bất hoạt HAV, các nhà sản xuất đã sử dụng Formaldehyt. Kết quả kiểm tra Formaldehyt cho thấy đều thấp hơn tiêu chuẩn cho phép của TCYTTG. Chất hấp phụ Al(OH)3 đ−ợc điều chế từ AlCl3.6H20 và NaOH. Kháng nguyên HAV sau khi tinh khiết và bất hoạt đ−ợc hấp phụ lên Al(OH)3. Tính đồng nhất của Al(OH)3 cũng đ−ợc kiểm tra bằng cách lắc đều và theo dõi trong thời gian nhất định. Từ những kết quả thực tế của 9 loạt vắcxin đã xuất x−ởng so sánh với tiêu chuẩn của TCYTTG cho phép chúng tôi xây dựng các tiêu chuẩn hóa học cho vắcxin viêm gan A sản xuất tại Việt Nam. Tiêu chuẩn đề nghị nh− sau : * F o r m a l d e h y t : ≤0,02g%. * Al +++ : ≤500àg/ml. * p H : 5 , 5 - 7 , 5 . 67
  75. * P r o t e i n t o à n p h ầ n : ≤200àg/ml. 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn về chỉ số sinh học Các loạt vắcxin viêm gan A xuất x−ởng đều đ−ợc tiến hành kiểm tra đầy đủ về các mặt sinh học theo yêu cầu tối thiểu của TCYTTG bao gồm : vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt. Tất cả các loạt đều đạt yêu cầu đề ra của TCYTTG về các chỉ tiêu này. Trong năm 2000, thử nghiệm công hiệu không thể đánh giá bằng hệ số t−ơng quan vì không có mẫu vắcxin chuẩn để so sánh. Do vậy, trong thời gian đó chúng tôi tiến hành so sánh công hiệu ED50 giữa các loạt với nhau để đảm bảo tính ổn định và đồng nhất. Kết quả ED50 là t−ơng đ−ơng giữa các loạt. Đồng thời khi sử dụng loạt vắcxin 0500 trên thực địa lâm sàng cho thấy kết quả gây đáp ứng miễn dịch là 100% sau 2 mũi tiêm đầu với hiệu giá trên 2000 mIU/ml. Sau 24 tháng tỷ lệ có đáp ứng kháng thể tồn l−u vẫn là 100% với GMT là hơn 800 mIU/ml. Trong khi đó, theo quy định của TCYTTG chỉ cần hiệu giá 20mIU/ml là đủ khả năng bảo vệ. Đối với các loạt sản xuất năm 2003- 2004, chúng tôi sử dụng loạt 0500 là loạt vắcxin đã đ−ợc chứng minh hiệu quả trên thực địa để làm vắcxin chuẩn và tính hệ số t−ơng quan giữa vắcxin chuẩn và vắcxin mẫu. Kết quả công hiệu đạt yêu cầu khi hệ số t−ơng quan ≥1. 68
  76. Bảng 9 : Các chỉ số sinh học của vắcxin viêm gan A sản xuất năm 2003-2004 Loạt số Vô An toàn Công hiệu Chất gây sôt khuẩn Chuột nhắt Chuột lang (°C) (% tăng trọng) (% tăng trọng) 0100 VK 105,4 126,2 ED50=1/100 0,3 0200 VK 106,5 127,55 ED50=1/117 0,2 0300 VK 105,2 119,4 ED50=1/100 0,5 0400 VK 129,7 127 ED50=1/127 0,4 0500 VK 105,7 127,7 ED50=1/108 0,2 0600 VK 107,05 119,25 ED50=1/99 0,5 Tiêu VK Chuột khỏe mạnh, tăng trọng Hệ số t−ơng Tổng nhiệt độ chuẩn bình th−ờng quan ≥1 3 thỏ tăng <1,4 TCYTTG 160 140 120 Chuột nhắt 100 Chuột lang 80 60 Tiêu chuẩn chấp %tăng trọng %tăng 40 thuận 20 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 30 01 02 0 04 05 0600 04 0804 1 3 0 0211030 Loạt Hình 14 : Độ an toàn của 9 loạt vắcxin viêm gan A trên chuột nhắt, chuột lang 69
  77. 1.6 0 C) 1.4 1.2 1 0.8 0.6 Nhiệt0.4 độ tăng ( 0.2 0 0100 Hình 15 0200 Tất cả các thử nghiệm về 0300 : Chỉ số chất gây sốt của 9 loạt vắcxin viêm gan A pháp chuẩn thức cuả TCYTTG. Kết quả thử nghiệm cho thấy0 4tất0 cả0 các loạt vắcxin đều đạt yêu cầu đề ra của TCYTTG và có chất l 0500 0600 Loạt Thân nhiệt thỏ 010403 021103 Tiêu chuẩn chấp 030804 thuận chỉ số sinh học đều đ − ợc tiến hành theo ph − ợng ổn định. − ơng 70
  78. Bảng 10 : Các chỉ số sinh học của vắcxin viêm gan A sản xuất năm 2003-2004 An toàn Công Chất gây hiệu sôt (°C) Loạt số Vô khuẩn Chuột nhắt Chuột lang t−ơng (% tăng trọng) (% tăng trọng) quan 010403 VK 131,80 104,86 1,43 0,3 021103 VK 13,00 105,40 1,97 0,3 030804 VK 135,60 115,20 2,66 0 040105 VK 140,49 112,01 2,73 0,9 Tiêu chuẩn VK Chuột khỏe mạnh, tăng Hệ số Tổng nhiệt TCYTTG trọng bình th−ờng t−ơng độ 3 thỏ quan ≥1 tăng <1,4 Trên cơ sở các kết quả thu đ−ợc, chúng tôi đề nghị tiêu chuẩn quốc gia về mặt sinh học cho vắcxin viêm gan A bất hoạt sản xuất tại Việt nam nh− sau : *Vô khuẩn : Không phát hiện đ−ợc nấm và tạp khuẩn. * An toàn chung : - Trên chuột lang : Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình th−ờng trong thời gian theo dõi. - Trên chuột nhắt : Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình th−ờng trong thời gian theo dõi. * Chất gây sốt : Tổng nhiệt độ không tăng quá 1°3 * Công hiệu : ED50 của vắcxin thử nghiệm phải t−ơng đ−ơng với ED50 của vắcxin mẫu hay hệ số t−ơng quan r ≥ 1. 71
  79. 2.3. Theo dõi tính ổn định của HAVAX theo thời gian và nhiệt độ bảo quản ở 4oC Loạt số Ngày sản xuất Ngày thử nghiệm ED50 0500 14 – 06 - 2000 14 – 07 - 2000 0,13 0500 14 – 06 - 2000 20 – 09 - 2000 0,12 0500 14 – 06 - 2000 10 – 12 - 2000 0,14 0500 14 – 06 - 2000 28 – 04 – 2001 0,11 0500 14 – 06 – 2000 04 – 08 – 2001 0,13 0500 14 – 06 – 2000 10 – 10 – 2002 0,15 0500 14 – 06 – 2000 05 – 03 – 2003 0, 11 0500 14 – 06 – 2000 22 – 08 – 2003 0,13 0500 14 – 06 – 2000 16 – 01 – 2004 0,14 0500 14 – 06 – 2000 31 – 08 – 2004 0,11 0500 14 – 06 – 2000 07 – 04 - 2005 0,21 Kết quả bảng trên cho thấy vắcxin HAVAX có tính ổn định cao khi kiểm tra công hiệu trên chuột MRI. ED50 dao động từ 0,11 – 0,21 trong thời gian từ tháng 7/2000 đến tháng 4/2005 (57 tháng). Nh− vậy với hạn dùng nh− đã đăng ký là 24 tháng sẽ đảm bảo HAVAX còn đủ công hiệu khi tiêm cho ng−ời sử dụng. Đồng thời loạt 0500 cũng đ−ợc sử dụng làm vắcxin mẫu chuẩn của cơ sở trong khi ch−a có vắcxin mẫu chuẩn quốc gia và cũng chính loạt 0500 đã đ−ợc đánh giá trên thực địa lâm sàng giai đọan 1 và 2 72
  80. khi thực hiện đề tài KHCN-11-10 và cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt - 100% đối t−ợng đ−ợc tiêm vắcxin HAVAX loạt 0500 cho đáp ứng miễn dịch sau 2 mũi tiêm với GMT anti-HAV> 2000 mIU/ml, trong khi yêu cầu tối thiểu đủ bảo vệ là ≥ 20 mIU/ml. 3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của vắcxin viêm gan A trên các đối t−ợng Bảng 11: Kết quả theo dõi biểu hiện toàn thân và tại chỗ sau tiêm vắcxin ở 2 nhóm đối t−ợng Tại chỗ tiêm Toàn thân Biểu hiện khác Đối t−ợng Đau Dị ứng (*) Số l−ợng Tỷ lệ (%) Số l−ợng Tỷ lệ (%) Ng−ời lớn 56 18,42 1 0,33 Không (n = 304) Trẻ em 40 13,07 0 0 Không (n = 306) Cộng 96 15,73 1 0,16 Không (n = 610) (*): các biểu hiện khác: s−ng, nóng, đỏ, áp xe (tại chỗ tiêm); sốt, nhức đầu, chóng mặt, nôn/buồn nôn, khó thở, đau cơ, khớp (xem mẫu theo dõi ở phụ lục) - Có 96/610 (15,73%) đối t−ợng đ−ợc tiêm vắcxin (VX) ở cả 2 nhóm có cảm giác đau nhẹ tại chỗ tiêm. Trong đó nhóm ng−ời lớn là 56/304 (18,42%) và nhóm trẻ em là 40/306 (13,07%) đối t−ợng. Cảm giác đau này đ−ợc mô tả là nhẹ nhàng, âm ỉ, thoáng qua và kéo dài trong 1 – 3 ngày thì 73
  81. tự hết. Tỷ lệ đau tại chỗ tiêm ở nhóm ng−ời lớn (18,42%) cao hơn ở nhóm trẻ em (13,07%) không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), theo chúng tôi là do ở nhóm ng−ời lớn dễ khai thác chính xác triệu chứng chủ quan hơn ở nhóm trẻ em. Không thấy có biểu hiện s−ng, nóng, đỏ và áp xe tại chỗ tiêm. - Triệu chứng toàn thân: có 1 tr−ờng hợp (0,33%) ở nhóm ng−ời lớn sau tiêm VX mũi thứ nhất khoảng 24 giờ thì xuất hiện dị ứng nhẹ vùng ngực và không thấy xuất hiện ở các mũi thứ 2 và thứ 3. Biểu hiện: các ban màu đỏ ở vùng ngực bằng với mặt da với diện tích khoảng 10% diện tích da và có cảm giác ngứa. Tr−ờng hợp này cũng tự hết sau 2 ngày mà không cần điều trị. Mặc dù ch−a thể khẳng định đ−ợc nguyên nhân gây dị ứng, nh−ng theo nhận xét của chúng tôi đây có thể là tr−ờng hợp xảy ra dị ứng ngẫu nhiên trùng với thời điểm tiêm vắcxin chứ không phải do bản thân vắcxin gây ra. Nh− vậy vắcxin Havax do Vabiotech (Viện VSDT TW) sản xuất đạt yêu cầu về an toàn trên ng−ời tình nguyện (trẻ 2 – 5 tuổi và ng−ời lớn) 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắcxin ở nhóm đối t−ợng có anti-HAV (-) 3.2.1. Nhóm trẻ em Bảng 12: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch (%) sau tiêm vắcxin theo lịch 0-1-6 Liều 75àg Liều 50àg Liều 25àg HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 9/26 22/25 25/25 4/30 19/30 28/28 1/24 6/23 20/22 (34,6%) (88%) (100%) (13,3%) (63,3%) (100%) (4,2%) (26,1%) (90,9%) 74
  82. Bảng 13 : GMT theo mức độ khác nhau sau tiêm VX theo lịch 0-1-6 Mức hiệu giá Liều 75àg Liều 50àg Liều 25àg (mIU/ml) HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 (20 - 100) 7/9 11/22 4/25 3/4 9/19 6 1/1 6/6 9/20 (77,8%) (50%) (16,0%) (75%) (47,4%) (21,4%) (100%) (100%) (45%) (100 -1000) - 9/22 15/25 - 9/19 17 - - 9/20 (40,9%) (60%) (47,4%) (60,7%) (45%) (1000-10.000) - - 4/25 1/4 1/19 3 - - 1/20 (16,0%) (25%) (5,2%) (10,7%) (5%) ≥ 10.000 2/9 2/22 2/25 - - 2 - - 1/20 (22,2%) (9,1%) (8,0%) (7,1%) (5%) Cộng 9 22 25 4 19 28 1 6 20 p < 0,01 p < 0,01 p < 0,01 Bảng 14: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch (%) sau tiêm vắcxin theo lịch 0-1-2 Liều 75àg Liều 50àg Liều 25àg HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 17/51 45/51 51/51 10/47 29/47 39/46 3/52 19/52 44/48 (33,3%) (88,2%) (100%) (21,3%) (61,7%) (84,8%) (5,8%) (36,5%) (91,7%) 75
  83. Bảng 15: GMT theo mức độ khác nhau sau tiêm vắcxin theo lịch 0-1-2 Mức hiệu giá Liều 75àg Liều 50àg Liều 25àg (mIU/ml) HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 HT2 HT3 HT4 17/17 34/45 10/51 10/10 28/29 17/39 3/3 17/19 30/44 (20 - 100) (100%) (75,6%) (19,6%) (100%) (96,6%) (43,6%) (100%) (89,5%) (68,1%) 11/45 39/51 1/29 22/39 12/44 (100 - 1000) - - - - (24,4%) (76,5%) (3,4%) (56,4%) (27,3%) 2/51 1/19 1/44 (1000-10.000) - - - - - - (3,9%) (5,25%) (2,3%) 1/19 1/44 ≥ 10.000 - - - - - - - (5,25%) (2,3%) Cộng 17 45 51 10 29 39 3 19 44 p 0,05). T−ơng tự nh− vậy, tỷ lệ đối t−ợng đạt mức hiệu giá kháng thể bảo vệ cũng tăng dần có ý nghĩa thống kê sau mỗi mũi tiêm VX ở mỗi nhóm tiêm liều thấp hơn (50àg và 25àg) của cả 2 lịch (p<0,01). Và 76