Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ rươi lá bắc (Murdannia Bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây cỏ rươi lá bắc (Murdannia Bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ===  === ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ RƯƠI LÁ BẮC (Murdannia Bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2021
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ===  === ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ RƯƠI LÁ BẮC (Murdannia Bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2016.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS. TS. VŨ ĐỨC LỢI Hà Nội – 2021
3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Thầy không những cung cấp cho em kiến thức học thuật, mà còn giúp em có thêm nhiều kỹ năng cần thiết để bước sang trang mới sau cánh cửa đại học. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm của Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em và cung cấp đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong Trường đại học Y Dược và thầy cô ở các đơn vị liên kết đào tạo với Trường đại học Y Dược đã nhiệt tình dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường. Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Do kiến thức của em còn hạn hẹp, kinh nghiệm chưa nhiều nên bài báo cáo của em không thể tránh được những sai sót. Kính mong sự đóng góp ý kiến chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Nghiên cứu này đã được hỗ trợ kinh phí để thực hiện từ đề tài KHCN cấp Nhà nước mã số: ĐTĐLCN-27/21 do PGS.TS. Vũ Đức Lợi làm chủ trì đề tài. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con có thể hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Đỗ Thị Thanh Hương
4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên tiếng anh Tên tiếng việt 1H Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ 1 1H-NMR Resonance Spectroscopy hạt nhân proton 13C Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ 2 13C-NMR Resonance Spectroscopy hạt nhân cacbon-13 3  (ppm)  (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học 4 ALT Alanine transaminase 5 AST Aspartate transaminase Distortionless Enhancement 6 DEPT Phổ DEPT by Polarization Transfer 7 D-GalN D-galactosamin N 8 DPPH 2,2′-diphenyl-1- picrylhydrazyl Half Maximal Effective Nồng độ cho 50% tác dụng 9 EC50 Concentration tối đa Electrospray Ionization- Khối phổ đo bằng phương 10 ESI-MS Mass Spectrometry pháp ion hóa phun điện tử Phổ hồng ngoại biến đổi 11 FTIR Fourier transfer infrared Fourier Gas chromatography–mass 12 GC-MS Sắc ký khí- Khối phổ spectrometry Half Maximal Inhibitory Nồng độ ức chế tối đa 13 IC50 Concentration một nửa 14 IR Infrared Tia hồng ngoại 15 TNFα Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử u Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng 16 UPLC Chromatography
5. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam 4 Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR1 và chất Bảng 3.1 28 tham khảo Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR2 và chất Bảng 3.2 30 tham khảo Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR3 và chất Bảng 3.3 31 tham khảo
6. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Hình 1.1 6 Việt Nam Hình 1.2 Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia 7 Trà Rumput Beijing Tea – Thành phần chính: Hình 1.3 14 Murdannia bracteata Hình 3.1 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng 19 Hình 3.2 Đặc điểm cơ quan sinh sản của Murdannia bracteata 20 Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân 22 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá 23 Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu lá 24 Hình 3.6 Đặc điểm bột dược liệu thân 25 Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc 26 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập 3 chất từ phân đoạn ethyl acetat 27 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất CR1 29 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất CR2 31 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất CR3 33
7. Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Murdannia 3 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Murdannia 3 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Murdannia 5 1.2. Tổng quan về loài Murdannia bracteata 7 1.2.1. Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata 8 1.2.2. Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata 8 1.2.3. Thành phần hóa học của loài Murdannia bracteata 8 1.2.4. Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata 10 1.2.5. Công dụng của Murdannia bracteata theo y học cổ truyền 14 1.2.6. Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata trên thị trường 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Phương pháp mô tả về đặc điểm thực vật 17 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 17 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật của cây Cỏ rươi lá bắc 19 3.1.1. Đặc điểm hình thái 19 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu 21
8. 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu 24 3.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất 26 3.3. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 28 3.3.1. Hợp chất CR1: Acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic 28 3.3.2. Hợp chất CR2: Acid 3-amino butanoic 30 3.3.3. Hợp chất CR3: Acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O- β-D-glucopyranosid 31 3.4. Bàn luận 34 3.4.1. Hợp chất 1: Acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic 34 3.4.2. Hợp chất 2: Acid 3-amino butanoic 34 3.4.3. Hợp chất 3: Acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β- D-glucopyranosid 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
9. ĐẶT VẤN ĐỀ Nhờ điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa và sự đa dạng về địa hình, Việt Nam sở hữu một hệ sinh thái vô cùng phong phú với tiềm năng lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật, ) nói chung. Theo thống kê, nước ta có trên 12000 loài thực vật bậc cao, trong số đó có khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc.Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy vào từng địa phương. Ngày nay, mọi người dân ngày càng chú trọng đến việc chăm sóc sức khỏe từ những sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên vì vậy nhu cầu về thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng tăng. Đây là cơ sở cho các nhà khoa học dược và các tập đoàn dược phẩm dược nghiên cứu chú trọng vào sàng lọc từ tự nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn và chi phí cho nghiên cứu phát triển thấp hơn so với tổng hợp hóa học. Việt Nam là một đất nước được biết đến với: “rừng vàng, biển bạc”- giàu nguồn tài nguyên thiên nhiên, thì xu hướng phát triển các sản phẩm từ tự nhiên là một hướng đi đúng đắn. Mỗi cây thuốc có chứa đặc điểm thực vật và thành phần các chất có hoạt tính khác nhau, vì vậy việc nghiên cứu sâu hơn về từng loại cây sẽ mang lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Cây Cỏ rươi lá bắc thuộc chi Murdannia, một trong những chi lớn nhất của họ Thài lài (Commelinaceae). Một số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận loài cây này chứa các nhóm chất như: flavonoid, saponin, steroid, acid béo, có tác dụng kháng khuẩn [23], chống viêm [22], bảo vệ gan [25], hỗ trợ điều trị ung thư gan và tiểu đường [19]. Ở Trung Quốc và Malaysia, người dân sử dụng cây Cỏ rươi lá bắc để chữa bệnh tiêu hóa, cảm lạnh, tiểu đường, ung thư, Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian cây này dùng để chữa bệnh đau dạ dày. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần 1
10. hóa học và tác dụng sinh học của cây Cỏ rươi lá bắc ở Việt Nam còn rất hạn chế. Để góp phần xây dựng cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Cỏ rươi lá bắc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)” với những mục tiêu sau: - Mô tả được đặc điểm thực vật của cây Cỏ rươi lá bắc. - Chiết xuất phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cây Cỏ rươi lá bắc. - Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập. 2
11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Murdannia 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Murdannia Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa APG IV (Hệ thống phân loại thực vật hạt kín - Angiosperm Phylogeny Group) [8], vị trí phân loại của chi Murdannia như sau: Giới Thực vật (Plantae) Thực vật hạt kín (Angiospermae) Thực vật một lá mầm (Monocots) Bộ Thài Lài (Commelinales) Họ Thài Lài (Commelinaceae) Chi Murdannia 1.1.2. Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia 1.1.2.1. Trên thế giới Chi Murdannia gồm khoảng 60 loài được phân bố rộng khắp thế giới, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ấm thuộc Châu Á, Châu Phi, Trung và Nam Mỹ, đặc biệt là Châu Á với hơn 50% số lượng loài [10,26]. Trong đó phát hiện ở Châu Phi có 11 loài [11], Ấn Độ có 29 loài [18], Trung và Nam Mỹ có 6 loài [10]. Các nghiên cứu gần đây trên thế giới được thực hiện nhiều nhất ở Ấn Độ [18]. 1.1.2.2. Ở Việt Nam Chi Murdannia ở Việt Nam có 15 loài, được GS.TS. Phạm Hoàng Hộ mô tả trong cuốn sách “Cây cỏ Việt Nam” và được phân bố ở một số nơi như Bảng 1.1 [1,2]. Năm 2004, World Checklist of Selected Plant Families có ghi nhận thêm 01 loài là Murdannia graminea. Các loài được sử dụng làm thuốc 3
12. là: M. bracteata, M. divergens, M. edulis, M. medica, M. nudiflora, M. simplex, M. triquetra [1]. Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam Loài Phân bố Các tỉnh phía Bắc (Ninh Bình, Murdannia bracteata J.K.Morton ex Nam Định, ) đến Thừa Thiên – D.Y. Hong Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng. Murdannia divergens (C.B.Clarke) Từ Lâm Đồng đến các tỉnh Nam Bộ. Bruckner Lâm Đồng, Phú Yên, Ninh Thuận, Murdannia edulis (Stokes) Faden Bình Phước, TP. Hồ Chí Minh. Murdannia gigantea (Vahl.) Hoang nguyên 1 – 1500m. Bruckner Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Murdannia japonica (Thurnb.) Faden Đồng Nai. Murdannia keisak (Hassk.) Handel- Hoàng Liên Sơn, Phú Yên, Khánh Mazz Hòa. Thừa Thiên – Huế, Khánh Hòa, Lâm Murdannia medica (Lour.) D.Y.Hong Đồng, Đồng Nai. Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Murdannia nudiflora (L.) Brenan Quảng Trị, Thừa Thiên- Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, TP. Hồ Chí Minh. Murdannia semiteres (Dalz.) Phan Rang Santapau Murdannia simplex (Vahl.) Brenan Khánh Hòa, Ninh Thuận, Lâm Đồng. Murdannia spectabilis (Kurz) Faden Từ Huế đến Đà Lạt, Đồng Nai. Murdannia spirata (L.) Bruckner Quảng Nam, Thừa Thiên – Huế. Murdannia triquetra (Wall.) Bà Rịa – Vũng Tàu, TP. Hồ Chí Bruckner Minh. Thảo nguyên trên vùng cát: Huế, Đà Murdannia vaginata (L.) Bruckner Nẵng, Nha Trang, Biên Hòa, Vũng Tàu, Phú Quốc. Murdannia vescicolor (Dalz.) Ruộng, dựa lộ, bình nguyên. Bruckner 4
13. 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Murdannia Chi Murdannia, họ Thài lài (Commelinaceae): Cây thân thảo mọc đứng hoặc mọc bò. Rễ thường phình lên ở giữa. Lá mọc cách hoặc mọc vòng ở gốc. Cụm hoa mọc ở ngọn hoặc nách lá, có cuống rõ. Hoa lưỡng tính được bao bọc trong các lá bắc. Ở mỗi lá bắc có 2 – 5 xim hoa. Hoa thường có vòi nhụy lệch về 1 phía so với trục hoa. Cánh hoa rời, màu tím, xanh dương, hồng, vàng hoặc hơi trắng, hình tròn hoặc hình trứng. Nhị sinh sản 3 đối diện các lá đài, nhị lép 3 đối diện các cánh hoa. Quả hình trứng, hình nang hoặc hình cầu, mở thành 3 ô. Mỗi ô có 1 hoặc 2 hạt, rốn hạt tròn. Dưới đây là hình ảnh một số loài Murdannia tìm thấy ở Việt Nam 5
14. Hình 1.1: Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam 6
15. Các loài thuộc chi Murdannia có đặc điểm thực vật tương đối giống nhau. Vì vậy, khi phân tích cần chọn cây có cơ bản đầy đủ các bộ phận, đặc biệt là hoa- bộ phận ít bị thay đổi bởi điều kiện tự nhiên và khá đặc trưng cho loài. Hoa của các loài có thể khác nhau về màu sắc, hình dạng tràng hoa, kích thước nhị, nhụy hoa (Hình 1.2). Hình 1.2: Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia 1.2. Tổng quan về loài Murdannia bracteata - Tên khoa học: Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, họ Thài lài (Commelinaceae). - Tên tiếng Việt: Cỏ rươi lá bắc, Trai lá hoa, Bao tử. 7
16. 1.2.1. Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata Cây thân thảo, sống lâu năm. Rễ sợi, dài. Thân hình trụ, có khía dọc, màu xanh đậm; lông phủ dày đặc, màu trắng. Lá đơn, mọc so le; bẹ lá dài 0,7 – 1,3 cm; màu xanh nhạt, gốc lá có màu trắng, ôm lấy thân, mặt ngoài phủ lông dày đặc, màu trắng; phiến lá nguyên, hình dải dài, hình mác hoặc hình elip thuôn, phiến thon hẹp, đầu nhọn, gân lá chạy thẳng song song từ gốc, gân giữa rõ [3]. Cụm hoa mọc ở nách lá hay tận cùng của ngọn. Mỗi hoa có một lá bắc riêng hình bầu dục. Hoa đều, lưỡng tính; cuống hình trụ dài, màu xanh, nhẵn; đài 3, rời, hình lòng thuyền, màu xanh nhạt, có lông ngắn thưa ở mặt ngoài; tràng 3, rời, màu tím; nhị 6 cái xếp thành 2 vòng, 3 nhị vòng ngoài bất thụ có chỉ nhị hình sợi, màu tím, mang bao phấn bất thụ có 3 thùy, 3 nhị hữu thụ có kích thước khác nhau, chỉ nhị mập, mang các lông dài màu tím tập trung ở phần chân của chỉ nhị, bao phấn 2 ô, hình bầu dục, màu trắng; bầu nhụy hình elip thuôn, màu xanh, bầu 3 lá noãn liền nhau tạo thành 3 ô; vòi nhụy hình sợi dài 0,6 cm, màu tím nhạt. Mùa hoa tháng 5 – tháng 11 [1, 3, 24]. 1.2.2. Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata Cây Cỏ rươi lá bắc phân bố ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc và một số nước Đông Nam Á bao gồm Lào, Thái Lan, Việt Nam [12, 24]. Ở nước ta, loài này được tìm thấy ở những nơi đất ẩm ven đường, bờ kênh rạch, ven rừng, trên nương rẫy các tỉnh phía Bắc đến Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng [1]. 1.2.3. Thành phần hóa học của loài Murdannia bracteata Năm 2006, Wang Guei Jane cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 4 hợp chất từ Murdannia bracteata [22]: (1) bracteanolide A (2) bracteanolide B 8
17. (3) acid (+)-(R)-p-hydroxyphenyllactic (4) isovitexin Năm 2009, Yam Mun Fei và cộng sự xác định được tổng hàm lượng phenolic của M. bracteata là khoảng 10% bằng xét nghiệm Folin-Ciocalteu [25]. Năm 2014, Ooi Kheng Leong cùng các cộng sự đã sử dụng 2 phương pháp GC-MS và UPLC để phân lập một số hợp chất từ dịch chiết hexan của M. bracteata. GC-MS cho thấy sự có mặt của 15 hợp chất bay hơi: (5) phytol (6) acid octadecanoic, butyl ester (7) tetracosan (8) 2,2-dimethyl-3-(3,7,16,20-tetramethyl-heneicosa-3,7,11,15,19- pentaenyl)-oxiran (9) tetrapentacontan (10) α-tocopherol (11) (3,5α)-cholest-7-en-3-ol (12) (3)-ergost-5-en-3-ol (13) stigmasterol (14) hexacontan (15) (3,5α)-ergost-7-en-3-ol (16) 9,19-cyclocholestan-3-ol, 14-methyl, ( 3,5α) (17) sitosterol (18) (3)-stigmasta-5,24(28)-dien-3-ol (19) 9,19-cyclo-25,26-epoxyergostan-3-ol, 4,4,14-trimethyl-, acetat 9
18. Các hợp chất không bay hơi được xác định bằng UPLC, kết quả thu được là: có 2 dẫn xuất của apigenin (20) và acid caffeic (21) [19]. Năm 2016, Ch’ng Yung Sing và cộng sự đã cho thấy M. bracteata có chứa hàm lượng lớn các hợp chất saccharid hay đường thông qua phổ IR [9]. Năm 2019, Shyur Lie Fen cùng các cộng sự xác định được tất cả 7 hợp chất monogalatosyldiacylglycerol có trong phân đoạn dịch chiết giàu galactolipid của M.bracteata. Trong đó, 1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-β- galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) (22) là thành phần chính (78,9%). Các gốc acyl cấu tạo nên 6 galactolipid còn lại là: (23) α-stearidonoyl / α-stearidonoyl (24) α-linolenoyl / α-stearidonoyl (25) α-linoleoyl / α-linolenoyl (26) palmitoyl / α-linolenoyl (27) oleoyl / α-linolenoyl (28) palmitoyl / α-linoleoyl Vị trí của 2 gốc acyl trong các hợp chất 24, 25, 26, 27, 28 chưa được xác định (R1, R2 có thể hoán vị cho nhau) [21]. Cùng trong năm đó, nghiên cứu của Lê Phương Thảo đã phân lập được 2 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của lá cây M. bracteata bằng phương pháp sắc ký cột: Apigenin (29) và Quercetin (30) [3]. 1.2.4. Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata 1.2.4.1. Tác dụng kháng Helicobacter pylori Năm 2005, Wang Yuan Chuen cùng cộng sự đã thử nghiệm và sàng lọc tác dụng kháng Helicobacter pylori của dịch chiết 50 loài thảo dược Đài Loan. Dung môi chiết được sử dụng là ethanol 95%. Thử nghiệm thực hiện 10
19. trên 10 chủng Hp. Trong đó, dịch chiết của M.bracteata cho hoạt tính kháng Hp trung bình với khả năng ức chế 8/10 chủng thử nghiệm [23]. 1.2.4.2. Tác dụng chống viêm Khi các đại thực bào được hoạt hóa, việc sản sinh quá mức nitric oxid (NO) thông qua NO synthase cảm ứng (iNOS) là một trong những yếu tố gây viêm. Năm 2006, Wang Guei Jane cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập các hoạt chất và thử tác dụng trên iNOS ở các đại thực bào được hoạt hóa bởi lipopolysaccharid (LPS) để chứng tỏ tác dụng chống viêm của M.bracteata. Cụ thể, các thành phần hóa học được phân lập từ lá của M.bracteata: bracteanolid A (1), bracteanolid B (2) và isovitexin (4) ức chế sự sản sinh nitric oxid (NO), hạn chế các tổn thương viêm khác nhau ở mô khi đại thực bào sản xuất quá nhiều NO. Tác dụng điều hòa hoạt động iNOS là chọn lọc, vì nó không ảnh hưởng đến quá trình giãn mạch do giải phóng NO nội mạc khi bị kích thích bởi acetylcholin. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học cho việc sử dụng M.bracteata với tác dụng chống viêm trong y học cổ truyền. Ngoài ra, hoạt tính ức chế chọn lọc iNOS của bracteanolid A có tiềm năng để phát triển thành thuốc ức chế chọn lọc iNOS phục vụ điều trị trong tương lai [22, 27]. 1.2.4.3. Tác dụng chống oxy hóa Dựa trên công dụng y học cổ truyền ở Malaysia, loài M. bracteata được dùng trong điều trị các bệnh viêm, ung thư ở gan và thận. Nhóm nghiên cứu của Mun Fei Yam và cộng sự (2010) đã công bố dịch chiết ethanol lá của loài này có tác dụng chống oxy hóa dựa trên hoạt tính thu dọn gốc 2,2′-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH), ức chế lipid peroxidase và chống oxy hóa tương đương chế phẩm trolox [25]. 1.2.4.4. Tác dụng giãn mạch 11
20. Năm 2016, Ch’ng Yung Sing và cộng sự đã sàng lọc tác dụng giãn mạch của 6 loài thảo dược Malaysia, trong đó có M.bracteata. Dược liệu được chiết bằng 3 loại dung môi: nước, ethanol 50% và ethanol 95%, thử tác dụng trên động mạch chủ chuột đã tách ra và cắt thành các vòng. Qua phân tích phổ FTIR, các nhà khoa học cho rằng hàm lượng flavonoid ảnh hưởng đến hoạt tính giãn mạch của dược liệu. M.bracteata có tác dụng giãn mạch nhưng không quá mạnh [9]. 1.2.4.5. Tác dụng bảo vệ gan Một trong những nguyên nhân gây tổn thương tế bào gan là do CCl4 dẫn đến sự gia tăng của các enzym ALT và AST, được giải phóng từ gan vào máu. Năm 2009, Yam Mun Fei và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết methanol toàn cây M.bracteata. Kết quả cho thấy lá M.bracteata có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan do CCl4 gây ra theo liều phụ thuộc bằng cách ức chế sự tăng enzym gan AST và ALT. Các quan sát mô bệnh học cũng cho thấy khả năng bảo vệ gan của M.bracteata. Hoạt tính bảo vệ gan của loài này được cho là do hàm lượng phenol cao và nghiên cứu cho ta thấy tổng hàm lượng phenolic của lá M.bracteata là khoảng 10% [25]. Năm 2019, trong nghiên cứu của Shyur Lie Fen cùng các cộng sự, phân đoạn chiết giàu galactolipid (GLE) của M bracteata và dLGG (22)– hoạt chất phân lập từ phân đoạn này của M.bracteata được đánh giá có tác dụng điều trị tổn thương gan. GLE và dLGG làm giảm đáng kể sự tăng hoạt độ AST, ALT huyết thanh ở chuột bị gây tổn thương gan bằng LPS và D-galactosamin N (LPS/D-GalN), do đó có hiệu quả trong điều trị tổn thương gan và viêm gan cấp do LPS/D-GalN. Ngoài ra, dLGG còn có tác dụng bảo vệ gan nếu dùng với liều 1 hoặc 10 mg/kg trước khi tiêm LPS/D-GalN cho chuột. Các kết quả 12
21. cho thấy dLGG có cả tác dụng bảo vệ gan và điều trị viêm gan cấp do LPS/D- GalN [21]. Ở Malaysia, lá M.bracteata được người dân ép tươi hoặc phơi khô sắc nước uống để điều trị ung thư gan hoặc tiểu đường [19]. 1.2.4.6. Tác dụng gây độc tế bào ung thư gan và ức chế α-glucosidase Năm 2012, Ooi Kheng Leong và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu tác dụng điều trị ung thư gan và tiểu đường của M.bracteata trong y học cổ truyền ở Malaysia. Dược liệu sau khi phơi khô và xay được chiết bằng các dung môi hexan, chloroform và methanol, sau đó thử độc tính từng dịch chiết trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 và hoạt tính ức chế α-glucosidase [19]. Sàng lọc sơ bộ các dịch chiết cho thấy tác dụng ức chế tế bào HepG2 chỉ có ở dịch chiết hexan (HE), với EC50 = 37,17± 1,00 μg/mL. α-tocopherol (10), thành phần chính của HE, đã được ghi nhận có tác dụng gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư ở chuột và người [5, 6, 13]. Chất này còn có khả năng khuếch đại quá trình apoptosis bằng cách làm tăng biểu hiện caspase 3 ở một số dòng tế bào ung thư của người [17]. Bên cạnh đó, apigenin (20) cũng đã được ghi nhận tác dụng kích hoạt apoptosis thông qua hoạt hóa caspase 3, 7, 9, 10 trong các tế bào HepG2 [14]. Do đó, α-tocopherol (10) và dẫn xuất của apigenin (20) có thể là tác nhân chính gây độc tế bào và kích hoạt quá trình apoptosis của các tế bào HepG2. HE không chỉ gây độc tế bào ung thư biểu mô gan mà còn ức chế α- glucosidase, với EC50 = 117,04 ± 2,34 g/mL. Việc ức chế enzym làm giảm hấp thu carbohydrat ở ruột non, do đó làm giảm đường huyết sau ăn. Theo nghiên cứu so sánh một số hợp chất chứa nhóm phenol của Kwon Young In và cộng sự (2008), acid caffeic (21) là chất có khả năng ức chế α-glucosidase 13
22. mạnh [15]. Do đó, hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch chiết hexan của M.bracteata có thể do sự có mặt của dẫn xuất acid caffeic (21). 1.2.5. Công dụng của Murdannia bracteata theo y học cổ truyền Theo y học cổ truyền, M.bracteata có tác dụng hóa đàm tán kết, có thể dùng để trị ho, cảm lạnh [16]. Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây làm thuốc chữa viêm hạch lympho, tiểu đục, tiểu buốt, ghẻ lở [1]. Ở Malaysia, dịch chiết toàn cây tươi và dược liệu khô được dùng để điều trị các bệnh về gan, ung thư và tiểu đường [19]. 1.2.6. Sản phẩm có thành phần Murdannia bracteata trên thị trường Ở Trung Quốc, M.bracteata được bào chế dưới dạng trà với công dụng tiêu đàm tán kết, giải nhiệt, giảm chứng tiểu buốt. Có thể dùng cho người bị viêm gan, ho, cảm sốt và ung thư [3]. Hình 1.3: Trà Rumput Beijing Tea – Thành phần chính: Murdannia bracteata. 14
23. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Cây Cỏ rươi lá bắc có hoa được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định tháng 11 năm 2020. Mẫu thực vật đã được ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu- Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN giám định tên khoa học là Murdannia bracteata (Phiếu giám định số: UMP-082021). Mẫu tươi gồm cả cây mang lá và hoa 2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: - Nước javen: Công ty Cổ phần Bột giặt & Hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam. Sản xuất theo tiêu chuẩn TCCS 96: 2009/HCĐG. - Acid acetic: Công ty Xilong Scientific, Guangdong, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – ISO 14001 – OHSAS 18001. - Xanh methylen: Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – 2000. - Đỏ son phèn: Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – 2000. - Nước cất. Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết. 15
24. Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, pha đảo RP-18 (Merck) cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm. Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm, pha thường silica gel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm; pha đảo silica gel 60 RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 110oC trong 1h. 2.1.2.2. Trang thiết bị - Kính hiển vi soi vi phẫu gắn camera: Meiji Infinity 1 (Nhật Bản). - Kính hiển vi soi nổi gắn camera: Optika (Ý). - Sắc ký cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau tại Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. - Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm, thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Đại học Y Dược, ĐHQGHN. - Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy, tủ hút, đèn soi UV, tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Đại học Y Dược, ĐHQGHN. 16
25. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp mô tả về đặc điểm thực vật - Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích. - Mô tả giải phẫu: + Thân, lá: Cắt, tẩy và nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép. + Soi bột: lên tiêu bản bột theo phương pháp giọt ép. + Quan sát cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số. 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Mẫu lá cây Cỏ rươi lá bắc sau khi rửa sạch, hơi khô, làm nhỏ được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng bằng dung môi EtOH 80% (3 lần, mỗi lần 10 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết tổng trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc. Các phân đoạn n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cắn tương ứng: n-hexan và EtOAc. Phần dịch nước còn lại được cô cạn thu được phân đoạn nước. Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ cắn EtOAc bằng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn thu được trong quá trình phân lập được theo dõi bằng TLC. + Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. Lựa chọn các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. 17
26. + Sắc ký bản mỏng: thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được qua 2 bước chính + Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), thiết lập bộ dữ liệu của các chất phân lập được. + Bước 2: So sánh bộ dữ liệu của các chất phân lập được với dữ liệu của các chất đã công bố. 18
27. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả mô tả đặc điểm thực vật của cây Cỏ rươi lá bắc 3.1.1. Đặc điểm hình thái Thân thảo sống lâu năm, rễ sợi dài đường kính 0,15 - 0,4 cm màu nâu nhạt. Thân hình trụ, có khía dọc, chia đốt dài từ 3 - 10 cm, màu xanh đậm, phủ lông dày đặc, màu trắng. Lá đơn, mọc so le; bẹ lá dài từ 0,7 - 1,3 cm, màu xanh nhạt, ở gốc có màu trắng, ôm lấy thân, mặt ngoài phủ lông dày đặc, màu trắng; phiến lá nguyên, hình dải dài, hình mác hoặc hình elip thuôn, kích thước 1,2 - 2,2 cm × 4,0 - 10,0 cm, hai mặt lá màu xanh đậm, phủ lông dày đặc, màu trắng ở lá non, lá già phủ lông dày đặc, màu trắng ở mặt dưới; mép lá có lông mi dài màu trắng; gân lá song song. Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng Chú thích: 1. Toàn cây; 2. Rễ cây; 3. Thân cây; 4. Hình thái lá; 5. Bẹ lá; 6. Mép lá. Cụm hoa mọc ở nách lá mang nhiều hoa, cuống cụm hoa dài 5 - 8 cm, màu xanh, phủ lông dày màu trắng, hai lá bắc có hình dáng như lá, lá bắc phía 19
28. trong thường bé hơn lá bắc phía ngoài; mỗi hoa có một lá bắc riêng hình bầu dục, rộng 0,6 cm, dài 0,4 cm, màu xanh nhạt, có lông ngắn thưa ở mặt ngoài. Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản của Murdannia bracteata Chú thích: 1. Cụm hoa; 2a. Hoa nguyên vẹn nhìn từ trên xuống; 2b. Hoa nguyên vẹn nhìn từ dưới dưới lên; 3. Lá bắc; 4. Đài; 5. Tràng; 6a. Nhị bất thụ; 6b. Nhị hữu thụ; 7. Bầu; 8. Bầu cắt ngang. Hoa đều, lưỡng tính; cuống hình trụ dài 0,3 - 0,4 cm, màu xanh, nhẵn; đài 3 rời, hình lòng thuyền, rộng 0,2 - 0,3 cm, dài 0,4 cm, màu xanh nhạt, có lông ngắn thưa ở mặt ngoài; tràng 3, rời, hình cánh hoa hồng, rộng 0,7 - 0,9 cm, dài bằng đài, màu tím; nhị 6 xếp thành 2 vòng, 3 nhị vòng ngoài bất thụ có chỉ nhị hình sợi, màu tím, dài 0,4 - 0,5 cm, mang bao phấn bất thụ có 3 thùy, 3 nhị hữu thụ có kích thước khác nhau, chỉ nhị mập, màu tím dài từ 0,2 - 0,7 cm, mang các lông dài màu tím tập trung ở phần chân của chỉ nhị, bao phấn 2 ô, hình bầu dục, màu trắng; bầu hình elip thuôn, dài 0,3 cm, đường kính 0,15 cm, màu xanh, bầu 3 lá noãn hàn liền tạo thành 3 ô; vòi nhụy hình sợi dài 0,6 cm, màu tím nhạt. Quả và hạt chưa thấy. 20
29. 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu • Vi phẫu thân: Vi phẫu thân có tiết diện tròn, cấu tạo gồm có hai phần là vỏ và trụ giữa. Phần vỏ chiếm 1/6 tiết diện, từ ngoài vào trong gồm: Biểu bì (2) có cấu tạo gồm một lớp tế bào hình đa giác xếp sít nhau, vách ngoài hóa cutin, trên biểu bì mang các lông che chở đa bào hình dải (1). Mô nâng đỡ (3) gồm 2 lớp tế bào nằm sát biểu bì, vách dày, bắt màu hồng chuẩn bị hóa mô cứng nâng đỡ cho cây. Mô mềm (4) là các tế bào hình đa giác xếp lộn xộn có kích thước lớn hơn mô nâng đỡ. Nội bì (5) gồm một lớp tế bào hình đa giác, vách dày lên hình chữ U, phần vách dày lên bắt màu xanh. Phần trụ giữa từ ngoài vào trong gồm: Trụ bì (6) gồm 1 - 2 lớp tế bào hình đa giác nằm sát nội bì và có kích thước nhỏ hơn các tế bào nội bì, vách dày bách màu xanh. Các bó libe gỗ hình chữ V nằm rải rác trong mô mềm ruột, các bó ở phía tâm có kích thước lớn hơn các bó phía ngoài, trong mỗi bó libe gỗ, gỗ sơ cấp (8) là các tế bào hình tròn, vách dày hóa gỗ, bắt màu xanh, xếp thành hai bó bên ngoài libe sơ cấp (7), trong mỗi bó, mạch gỗ có kích thước giảm dần từ tâm ra vỏ. Libe sơ cấp (7) là những tế bào có kích thước nhỏ, bắt màu hồng nằm giữa 2 bó gỗ. Mô mềm ruột (9) gồm các tế bào hình đa giác, có kích thước rất lớn, sắp xếp lộn xộn, có nhiều khoảng gian bào chiếm phần lớn vi phẫu. 21
30. Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu thân Chú thích: 1. Lông che chở; 2. Biểu bì; 3. Mô nâng đỡ; 4. Mô mềm vỏ; 5. Nội bì; 6. Trụ bì; 7. Libe sơ cấp; 8. Gỗ sơ cấp; 9. Mô mềm ruột. • Vi phẫu lá: Vi phẫu lá có cấu tạo đối xứng hai bên, tiết diện có mặt trên lá lõm xuống ở gân giữa, cấu tạo từ dưới lên trên gồm: Biểu bì dưới (2) gồm một lớp tế bào hình đa giác xếp sít nhau, vách hóa cutin, trên biểu bì mang các lông che chở đa bào hình dải (1). Mô nâng đỡ (3) gồm 2 lớp tế bào nằm sát biểu bì, vách dày, bắt màu hồng chuẩn bị hóa mô cứng nâng đỡ cho cây. Mô mềm dưới (4) là các tế bào hình đa giác xếp lộn xộn phía trong mô nâng đỡ. Bó libe gỗ nằm gần giữa vi phẫu có libe (5) ở phía ngoài gồm các tế bào đa giác có kích thước bé, bắt màu hồng. Gỗ (6) gồm một vài tế bào hình tròn, vách dày 22
31. hóa gỗ bắt màu xanh, nằm phía trong libe. Mô mềm trên (7) gồm 2 - 3 lớp tế bào hình đa giác có kích thước rất lớn, sắp xếp lộn xộn có nhiều gian bào. Biểu bì trên (8) có cấu tạo gồm một lớp tế bào hình đa giác xếp sít nhau, vách ngoài hóa cutin. Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu lá Chú thích: 1. Lông che chở; 2. Biểu bì dưới; 3. Mô nâng đỡ; 4. Mô mềm dưới; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Mô mềm trên; 8. Biểu bì trên. 23
32. 3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu Bột dược liệu lá có màu xanh nhạt, quan sát dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm sau: Lông che chở (1) đa bào hình sợi dài 200 - 250 µm. Mảnh mô mềm (2) gồm các tế bào hình đa giác, kích thước lớn. Hạt tinh bột (3) đơn hình tròn quan sát rõ rốn hình chữ Y kích thước bé từ 3 - 6 µm, quan sát được cả hạt tinh bột kép đôi hoặc ba. Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu lá Chú thích: 1. Lông che chở, 2. Mảnh mô mềm; 3. Hạt tinh bột; 4. Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 5. Tinh thể canxi oxalat hình kim; 6. Mảnh mạch xoắn. Mảnh biểu bì (4) gồm các tế bào vách ngoằn ngoèo mang lỗ khí, hình bầu dục, kích thước 25 µm × 50 µm. Tinh thể canxi oxalat hình kim (5) nằm 24
33. riêng lẻ hoặc tụ họp thành bó dài 80 - 100 µm. Ngoài ra còn quan sát thấy các mảnh mạch xoắn (6) đường kính khoảng 40 µm. Hình 3.6: Đặc điểm bột dược liệu thân Chú thích: 1. Lông che chở, 2. Mảnh mô mềm; 3. Hạt tinh bột; 4. Tinh thể canxi oxalat hình kim; 5. Mảnh mạch điểm; 6. Mảnh mạch xoắn. Bột dược liệu thân có màu xanh nhạt, quan sát dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm sau: Lông che chở (1) đa bào hình sợi dài 200 – 250 µm. Mảnh mô mềm (2) gồm các tế bào hình đa giác, kích thước lớn, sắp xếp lộn xộn. Hạt tinh bột (3) đơn hình tròn quan sát rõ rốn hình chữ Y kích thước bé từ 3 – 6 µm, quan sát được cả hạt tinh bột kép đôi hoặc ba. Tinh thể canxi oxalat hình kim (4) nằm riêng lẻ hoặc tụ họp thành bó dài 80 - 100 µm. Ngoài 25
34. ra còn quan sát thấy các mảnh mạch xoắn (6) đường kính khoảng 40 µm và các mảnh mạch điểm (5). 3.2. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất Mẫu lá cây Cỏ rươi lá bắc (2,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 80% (3 lần, mỗi lần 10 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 180 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 120 g cao chiết phân tán trong nước cất (800 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 800 mL). Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (34,6 g) và ethyl acetat (56,8 g). Hình 3.7: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Cỏ rươi lá bắc 26
35. Tiến hành phân tách phân đoạn dịch chiết EtOAc (40,0 g) trên cột sắc ký silicagel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan : EtOAc (5:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3 : MeOH (10:1 → 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 mL) thu được 5 phân đoạn ký hiệu là B1 ~ B5. Hình 3.8: Sơ đồ phân lập 3 chất từ phân đoạn ethyl acetat Từ phân đoạn B3 (9,8 g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3 : MeOH (8:1; 5:1; 3:1, v/v, 2,5 L) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn là B3.1 ~ B3.3. Phân tách phân đoạn nhỏ B3.1 (2,6 g) bằng sắc ký cột pha đảo YMC C18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH : H2O (4:1, v/v, 1,5 L) thu được 1 hợp chất ký hiệu là CR1 (23 mg). Phân tách phân đoạn nhỏ B3.2 (3,2 g) bằng sắc ký cột với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (3:1) thu được 1 hợp chất ký hiệu là CR2 (36 mg). Tiến hành triển khai phân tách trên sắc ký cột pha thường phân đoạn B3.3 (3,4 g) với hệ dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH (12:1) thu được hợp chất CR3 (38 mg). 27
36. 3.3. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 3.3.1. Hợp chất CR1: Acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic o 24 Chất bột màu trắng, tnc = 122- 124 C. Độ quay cực: [α] D = −20.8(c 2, H2O). Bảng 3.1: Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR1 và chất tham khảo [28]. CR1 Aa,b CR1 Aa,c STT δC δC δH (ppm) δH (ppm) HMBC DEPT Carbon (ppm) (ppm) (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) (H→ C) 1 C 167,4 167,3 4,11 (1H, dd, J = 4,10 (1H, dd, 2 CH 56,6 56,5 C-1’, C-1 6,5; 4,0 Hz) J=6,5;4,0 Hz) 2,95 (1H, dd, J = 2,94 (1H, dd, J C-1’, C-2’, 3 CH2 40,2 40,3 7,0; 3,5 Hz) = 7,0; 3,5 Hz) C-6’, C-1 2,18 (1H, dd,J = 2,17 (1H, dd, J 8,0; 7,5 Hz) = 8,0; 7,5 Hz) 1ꞌ C 135,5 135,6 7,12 (2H, brd, J 7,11 (2H, brd, C-3, C-4’, 2ꞌ CH 130,3 130,2 = 7,0 Hz) J= 7,0 Hz) C-6’ 3ꞌ CH 129,1 129,1 7,34 (2H, m) 7,35 (2H, m) C-1’, C-5’ 7,27 (1H, t, J = 7,28 (1H, t, 4ꞌ CH 127,5 127,6 C-2’, C-6’ 7,5 Hz) J=7,5 Hz) 5ꞌ CH 129,1 129,1 7,34 (2H, m) 7,35 (2H, m) C-1’, C-3’ 7,12 (2H, brd, J 7,11 (2H, brd, C-3, C-4’, 6ꞌ CH 130,3 130,2 = 7,0 Hz) J= 7,0 Hz) C-2 a) b) c) A) đo trong CDCl3&CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, của chất tham khảo acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic Phổ 1H-NMR của hợp chất CR1 xuất hiện các tín hiệu proton của vòng benzen thế mono của hệ ABX: δH 7,34 (2H, m, H-3’,5’), 7,27 (1H, t, J = 7,5 28
37. Hz, H-4’), 7,12 (2H, brd, J = 7,0 Hz, H-2’,6’), một proton oxygen methin δH 4,11 (1H, dd, J = 6,5; 4,0 Hz, H-2), hai proton methylen δH 2,95 (1H, dd, J = 7,0; 3,5 Hz, H-3a), 2,18 (1H, dd, J = 8,0; 7,5 Hz, H-3b). Phổ 13C-NMR của hợp chất CR1 cho thấy tín hiệu của một carbonyl carbon δC 167,4 (C-1), sáu carbon thơm δC 135,5 (C-1’), 130,3 (C-2’,6’), 129,1 (C-3’,5’), 127,5 (C-4’), một carbon oxygen δC 56,6 (C-2), một carbon methylen δH 40,2 (C-3). Phổ HMBC của hợp chất CR1 cho thấy tín hiệu tương tác xa H-2 với C-1/C-1’; H- 3 với C-1’/C-1/C-2’/C-6’ và các tương tác trong vòng thơm. Căn cứ vào số liệu phổ nêu trên và so sánh với dữ liệu phổ tham khảo [28], xác định hợp chất CR1 là acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic. Hình 3.9: Cấu trúc hóa học của hợp chất CR1 29
38. 3.3.2. Hợp chất CR2: Acid 3-amino butanoic o Chất bột không màu, tnc = 189- 190 C. Bảng 3.2: Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR2 và chất tham khảo [28] Bd,b Be,c STT δC δC δH (ppm) δH (ppm) DEPT Carbon (ppm) (ppm) (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 1 C 169,1 169,2 2,61 (1H, dd, J = 7,0; 2.60 (1H, dd, J = 7,0; 2 CH2 40,9 40,8 7,0 Hz) 7,0 Hz) 2,46 (1H, dd, J = 7,0; 2.47 (1H, dd, J =7,0; 7,0 Hz) 7,0 Hz) 5,24 (1H, dt, J = 6,5 5.25 (1H, dt, J = 6,5; 3 CH 67,6 67,6 Hz) 13,0 Hz) 1,26 (3H, d, J = 6,5 1.27 (3H, d, J = 6,5 4 CH3 19,7 19,8 Hz) Hz) d) e) b) c) B) đo trong DMSO, đo trong CDCl3, 125 MHz, 500 MHz, của chất tham khảo acid 3-amino butanoic Phổ 1H-NMR của hợp chất CR2 xuất hiện 7 proton, trong đó bao gồm một proton của carbon liên kết với một nhóm amino tại 5,24 (1H, dt, J = 6,5 Hz, H-3), proton của nhóm methylene tại 2,61 (1H, dd, J = 7,0; 7,0 Hz, H-2) và 2,46 (1H, dd, J = 7,0; 7,0 Hz, H-2), và proton của nhóm methyl tại 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-4). Ngoài ra, phổ 13C-NMR và DEPT hiển thị tổng cộng tín hiệu của bốn carbon, trong đó bao gồm một carbon carbonyl tại 169,1 (C- 1), một carbon nitrogen 67,6 (C-3), một carbon methylene tại 40,9 (C-2) và một carbon methyl 19,7 (C-4). Căn cứ vào số liệu phổ nêu trên và so sánh với dữ liệu phổ tham khảo [28], xác định hợp chất CR2 là acid 3-amino butanoic. 30
39. Hình 3.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất CR2 3.3.3. Hợp chất CR3: Acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O- β-D-glucopyranosid o 31 Chất bột màu trắng, tnc : 199- 200 C. Độ quay cực: [α]D = -110 (c 1,0, MeOH). Bảng 3.3: Số liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của CR3 và chất tham khảo [29] Cf,c STT δ δ Cf,b δH (ppm) δH (ppm) DEPT C C Carbon (ppm) (ppm) (Mult, J=Hz) (Mult, J=Hz) 1 C 174,5 175,0 2 CH 126,8 127,9 5,84(s) 5,81 (s) 3 C 142,6 139,2 4 CH 132,9 132,3 7,79(d, J = 16 Hz) 7.69(d, J= 16 Hz) 5 CH 131,0 129,0 6,32(d, J = 16 Hz) 6.21(d, J= 16 Hz) 6 CH3 20,6 19,5 2,18(s) 1,91 (s) 1ꞌ C 49,8 48,3 2ꞌ CH2 42,9 41,9 1,96(m) 2,13 (m) 1,80 (m) 3ꞌ CH 74,1 73,2 4,28(m) 4,20 (m) 4ꞌ CH2 42,8 41,9 1,19(m) 1,93 (m) 2,18(m) 1,75 (m) 5ꞌ C 87,6 86,7 6ꞌ C 83,2 82,2 31
40. 7ꞌ CH2 77,2 76,3 3,76(d, J =7,5 Hz) 3,77 (m) 3,82(dd, J = 2,0; 3,70 (m) 7,5Hz) 8ꞌ CH3 16,3 15,4 0,94(s) 0,90 (s) 9ꞌ CH3 19,7 18,8 1,17(s) 1,13 (s) 3ꞌ-O- Glc 1ꞌꞌ CH 103,2 102,3 4,37(d, J = 8,0 Hz) 4.33(d, J= 8,0 Hz) 3,16(dd, J = 8,0; 3.11(dd, J= 9,6; 2ꞌꞌ CH 75,1 74,2 9,0Hz) 8,0 Hz) 3.24(dd, J= 9,6; 3ꞌꞌ CH 78,1 77,2 3,30(m) 8,4 Hz) 3.25(dd, J= 8,4; 4ꞌꞌ CH 71,7 70,8 3,29(m) 8,0 Hz) 5ꞌꞌ CH 77,9 77,0 3,39(m) 3,32(m) 3,29(dd, J = 2,0 Hz, 3.83(dd, J= 11,6; 6ꞌꞌ CH2 62,8 61,9 12,0Hz) 2,0 Hz) 3,90(dd, J = 5,0 Hz, 3.64(dd, J= 11,6; 12,0Hz) 1,6 Hz) f) b) c) C) đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, của chất tham khảo acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D-glucopyranosid Phổ 1H-NMR của hợp chất CR3 xuất hiện tín hiệu 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,94 (3H, s), 1,17 (3H, s) và 2,18 (3H, s), 3 proton olefin tại δH 5,84 (1H, s), 6,32 (1H, d, J = 16,0 Hz), 7,79 (1H, d, J = 16,0 Hz), 1 proton anome tại δH 4,37 (1H, d, J = 8,0 Hz), những tín hiệu này gợi ý sự có mặt cấu trúc khung megastigmane và 1 phân tử đường. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất CR3 xuất hiện tín hiệu của 21 cacbon: 1 carboxyl, 4 carbon bậc 4, 9 nhóm methine, 4 nhóm methylene và 3 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CR3 khá tương đồng với hợp chất acid 32
41. (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D-glucopyranosid. Trên phổ HMBC, tương tác giữa H-5 (δH 6,32) với C-3 (δC 142,6)/C-4 (δC 132,9)/C-6′ (δC 83,2); giữa H-6 (δH 2,18) với C-2 (δC 126,8)/C-3 (δC 142,6)/C-4 (δC 132,9); và giữa H-2 (δH 5,84) với C-1 (δC 174,5)/C-3 (δC 142,6)/C-6 (δC 20,6) khẳng định hai liên kết đôi tại C-2/C-3 và C-4/C-5. Bên cạnh đó́ , hằng số tương tác J giữa H-4 và H-5, J = 16,0 Hz khẳng định cấu hình của liên kết đôi tại C-4/C-5 là E. Tương tác HMBC giữa H-8′ (δH 0,94) với C-1′ (δC 49,8)/C-2′ (δC 42,9)/C-6′ (δC 83,2)/C-7′ (δC 77,2); giữa H-9′ (δH 1,17) với C-4′ (δC 42,8)/C-5′ (δC 87,6)/C-6′ (δC 83,2) khẳng định vị trí của hai nhóm methyl tại C-1′ và C-5′. Vị trí cầu epoxy giữa C-5′ và C-7′ được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa H-7′ (δH 3,76 và 3,82) với C-1′ (δC 49,8)/C-2′ (δC 42,9)/C-5′ (δC 87,6)/C-6′ (δC 83,2)/C-8′ (δC 16,3). Thêm vào đó́ , tương tác HMBC giữa glc H-1″ (δH 4,37) với C-3′ (δC 74,1) gợi ý phân tử đường glucopyranosyl liên kết với aglycone megastigmane tại C-3′. So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất CR3 với số liệu phổ của hợp chất acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)- dihydrophaseic 3′-O-β-D-glucopyranoside [29] cho thấy khá tương đồng. Từ các dữ kiện nêu trên, hợp chất CR3 được xác định là acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D-glucopyranosid. Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất CR3 33
42. 3.4. Bàn luận 3.4.1. Hợp chất 1: Acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic Hợp chất acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic là một acid hữu cơ tồn tại trong mật ong với hàm lượng cao hơn nhiều so với các acid phenolic khác [30]. Hợp chất này được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn lactic (LAB) [31] và các loại vi sinh vật khác như: họ trực khuẩn (Bacillus coagulans), nấm (Geotrichum candidum), họ vi khuẩn Brevibacteriaceae, G.candidum và B.lactofermentum bằng hình thức lên men [30]. Năm 2012, Wanmeng Mu và cộng sự đã chứng minh hợp chất acid 2- hydroxyl-3-phenylpropanoic có hoạt động chống nấm và kháng khuẩn rộng rãi [30]. Nó ức chế một số loại vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và Enterococcus faecalis) và vi khuẩn Gram âm (Salmonella enterica, Escherichia coli, Providencia stuartii và Klebsiella oxytoca) [30, 32]. Ngoài ra, hợp chất này cũng được chứng minh có đặc tính ức chế, chống lại nấm men (Candida pulcherrima, Candida parapsilosis và Rhodotorula mucilaginosa) và một loạt các loài nấm mốc được phân lập từ các sản phẩm bánh mì, bột mì và ngũ cốc (Aspergillus ochraceus, Penicillium roqueforti, Penicillium citrinu, v.v.) [30]. Năm 1991, Wang và cộng sự đã chứng minh hợp chất acid 2-hydroxyl- 3-phenylpropanoic có tiềm năng trở thành thuốc điều trị bệnh mạch vành [42]. Năm 1997, Yu R và Van Scott E cho thấy hợp chất này được cấp bằng sáng chế để sử dụng như thành phần bảo vệ da để giảm nếp nhăn trên da [42]. Ngoài ra, nó có thể được sử dụng làm chất phụ gia thức ăn chăn nuôi để thay thế kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi [30]. 3.4.2. Hợp chất 2: Acid 3-amino butanoic Hợp chất acid 3-amino butanoic là acid amin không chứa protein được tạo ra bằng hóa học tổng hợp, chất này chiếm một vị trí đặc biệt do hoạt động 34
43. ở phổ rộng. Nó giúp tăng cường khả năng chống các tác nhân sinh học và phi sinh học ở thực vật bằng việc tăng các tín hiệu thích hợp nhất để chống lại các tác nhân nhất định [36]. Năm 2001, Jakab và cộng sự chứng minh hợp chất acid 3-amino butanoic có thể tạo ra sức đề kháng chống lại một số lượng lớn căng thẳng sinh học như: sự tấn công của virus, vi khuẩn, nấm, giun tròn và động vật chân đốt; cũng như căng thẳng phi sinh học như: nóng, lạnh hoặc muối [44]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, hợp chất acid 3-amino butanoic có tác dụng chủ yếu trên thực vật như: tăng sức đề kháng ở nhiều loại cây trồng chống lại một số loại mầm bệnh [34], chống lại bệnh sương mai ở cây nho [33], chống lại bệnh phấn trắng ở bí [35], Năm 2013, Arasimowicz-Jelonek và cộng sự đã chứng minh hợp chất acid 3-amino butanoic trực tiếp gây ra tích tụ protein ở khoai tây khi điều trị với nitric oxid (NO) [45]. Năm 2010, Dubreuil- Maurizi và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất acid 3-amino butanoic trên protein kinase kích hoạt mitogen (MAPKs) [46]. Trong đó, MAPK đóng vai trò là một tín hiệu quan trọng trong các tương tác giữa cây trồng và mầm bệnh, vì chúng chuyển các kích thích ngoại bào thành các phản hồi [47]. Cần tiến hành nghiên cứu thêm về tác dụng của hợp chất acid 3- amino butanoic trên cơ thể người. 3.4.3. Hợp chất 3: Acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D- glucopyranosid Hợp chất acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D- glucopyranosid ngoài được chiết xuất từ cây Cỏ rươi lá bắc (M. Bracteata) nó còn được chiết xuất từ vỏ thân cây Ginkgo biloba [29], quả Annona glabra (cây na biển) [37], hạt của Nelumbo nucifera (cây sen) [38] và Scaphium Macropodum [39]. Một số nghiên cứu chỉ ra các đồng phân của hợp chất này như: hợp chất (2Z,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D- glucopyranosid được chiết xuất từ vỏ cây Lycii radicis và đây là một ứng cử 35
44. viên trong điều trị loãng xương [40]; từ chiết xuất chloroform của Canarium album phân lập được 2 đồng phân là: (1′S, 3′ R, 5′S, 6′R, 2Z, 4E)-acid hydrohydrophaseic-3′-O-β-D-glucopyranoside và (1′R, 3′S, 5′R, 8′R, 2Z, 4E) -dihydrophaseic acid-3′-O–β–D-glucopyranoside [41]. Năm 2012, Nguyen Thi Thanh Ngan và các cộng sự đã đánh giá tác dụng chống viêm và chuyển dịch PPAR của các thành phần trong vỏ cây Ginkgo biloba. Hoạt hóa các yếu tố hạt nhân cảm ứng kappa-B (NF-κB) bằng các cytokine gây viêm (yếu tố hoại tử u (TNFα), IL-1, tín hiệu hoạt hóa tế bào T, yếu tố tăng trưởng và các chất cảm ứng gây ra phiên mã tại vị trí κB) có ảnh hưởng đến một số bệnh: ung thư, AIDS và các rối loạn viêm nhiễm. Do đó, ức chế tín hiệu NF-κB đã trở thành mục tiêu điều trị để điều trị các bệnh viêm nhiễm và ung thư. Hoạt động chống viêm của các hợp chất được đánh giá thông qua sự ức chế NF-κB và sự suy giảm của gen gây viêm (iNOS và COX-2) biểu hiện ở tế bào HepG2 do TNFα gây ra. Kết quả cho thấy hợp chất acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D- glucopyranosid ức chế đáng kể hoạt động phiên mã NF-κB ở tế bào HepG2 do TNFα gây ra phụ thuộc vào liều lượng với giá trị IC50 =9,1µM. Các thụ thể được kích hoạt bởi chất tăng sinh peroxisome (PPAR) điều chỉnh sự biểu hiện của các gen liên quan đến điều hòa chuyển hóa glucose, lipid và cholesterol bằng cách liên kết với các yếu tố phản ứng của chất tăng sinh peroxisome cụ thể (PPRE) trong các vị trí tăng cường của các gen được điều chỉnh. Kết quả chỉ ra rằng hợp chất acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D- glucopyranosid hoạt hóa hoạt động phiên mã PPARs phụ thuộc vào liều lượng với EC50 =10,4 µM, tăng hoạt động phiên mã của PPARα với EC50 =12,4 µM, hoạt hóa PPARγ với giá trị EC50 =11,9 µM, tăng hoạt hóa PPARβ (δ) với giá trị EC50 =10,7 μM [29]. 36
45. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau: - Đã mô tả được đặc điểm thực vật của cây Cỏ rươi lá bắc - Đã chiết xuất, phân lập được 3 hợp chất từ cây Cỏ rươi lá bắc: Sử dụng phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 3 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây Cỏ rươi lá bắc. - Đã xác định được cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan, 3 hợp chất được xác định là: acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic (CR1), acid 3-amino butanoic (CR2), acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic 3′-O-β-D-glucopyranosid (CR3). Đây là lần đầu tiên 3 hợp chất này được phân lập từ lá cây Cỏ rươi lá bắc. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu, chiết xuất và phân lập thêm các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây Cỏ rươi lá bắc. - Thử nghiệm chiết xuất từ các bộ phận khác của cây Cỏ rươi lá bắc (thân, rễ, ) và các phân đoạn khác (n-hexan, nước, ) để tìm kiếm thêm các thành phần mới hoặc có hoạt tính. - Đánh giá tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, giảm đau của phân đoạn dịch chiết từ cây Cỏ rươi lá bắc. 37
46. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, NXB Y học. 2. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Tập 3, NXB Trẻ, tr. 376 - 380. 3. Lê Phương Thảo (2019), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ rươi lá bắc (Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong)”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN. Tài liệu tiếng Anh 4. Atkinson J, Epand RF, Epand RM (2008), "Tocopherols and tocotrienols in membranes: a critical review", Free radical biology and medicine, 44(5), tr. 739-764. 5. Bermudez Y, Ahmadi S, Lowell NE và các cộng sự (2007), "Vitamin E suppresses telomerase activity in ovarian cancer cells", Cancer Detection and Prevention, 31(2), tr. 119-128. 6. Betti M, Minelli A, Canonico B và các cộng sự (2006), "Antiproliferative effects of tocopherols (vitamin E) on murine glioma C6 cells: homologue-specific control of PKC/ERK and cyclin signaling", Free Radical Biology and Medicine, 41(3), tr. 464-472. 7. Birringer M, Lington D, Vertuani S và các cộng sự (2010), "Proapoptotic effects of long-chain vitamin E metabolites in HepG2 cells are mediated by oxidative stress", Free Radical Biology and Medicine, 49(8), tr. 1315-1322. 8. Byng JW, Smets EF, van Vugt R và các cộng sự (2018), "The phylogeny of angiosperms poster: a visual summary of APG IV family relationships and floral diversity", The Global Flora, 1. 9. Ch’ng YS, Tan CS, Loh YC và các cộng sự (2016), "Vasorelaxation study and tri-step infrared spectroscopy analysis of Malaysian local herbs", Journal of pharmacopuncture, 19(2), tr. 145.
47. 10. de Oliveira Pellegrini MO, Faden RB, de Almeida RF (2016),"Taxonomic revision of Neotropical Murdannia Royle (Commelinaceae)", PhytoKeys(74), tr. 35-78. 11. Faden RB, Inman KE (1996), "Leaf anatomy of the African genera of Commelinaceae: Anthericopsis and Murdannia", The biodiversity of African plants, tr. 464-471. 12. Govaerts R (2004), "World Checklist of Monocotyledons Database in ACCESS: 1–54382", The Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens, Kew. 13. Hao J, Zhang B, Liu B và các cộng sự (2009), "Effect of α‐tocopherol, N‐acetylcysteine and omeprazole on esophageal adenocarcinoma formation in a rat surgical model", International Journal of Cancer, 124(6), tr. 1270-1275. 14. Khan TH, Sultana S (2006), "Apigenin induces apoptosis in Hep G2 cells: possible role of TNF-α and IFN-γ", Toxicology, 217(2-3), tr. 206- 212. 15. Kwon YI, Apostolidis E, Shetty K (2008), "Inhibitory potential of wine and tea against α‐Amylase and α‐Glucosidase for management of hyperglycemia linked to type 2 diabetes", Journal of Food Biochemistry, 32(1), tr. 15-31. 16. Li DL, Zheng XL, Duan L và các cộng sự (2017), "Ethnobotanical survey of herbal tea plants from the traditional markets in Chaoshan, China", Journal of Ethnopharmacology, 205, tr. 195-206. 17. Miyoshi N, Naniwa K, Kumagai T và các cộng sự (2005), "α- Tocopherol-mediated caspase-3 up-regulation enhances susceptibility to apoptotic stimuli", Biochemical and biophysical research communications, 334(2), tr. 466-473. 18. Naik MC, Rao BRP (2017), "A new species of dewflower Murdannia sanjappae (Commelinaceae) from Andaman Islands, India", Journal of Threatened Taxa, 9(11), tr. 10909-10913. 19. Ooi KL, Loh SI, Tan ML và các cộng sự (2015), "Growth inhibition of human liver carcinoma HepG2 cells and α-glucosidase inhibitory
48. activity of Murdannia bracteata (CB Clarke) Kuntze ex JK Morton extracts", Journal of Ethnopharmacology, 162, tr. 55-60. 20. Panigo E, Ramos J, Lucero L và các cộng sự (2011), "The inflorescence in Commelinaceae", Flora-Morphology, Distribution, Functional Ecology of Plants, 206(4), tr. 294-299. 21. Shyur LF, Feng JH, Apaya MK (2019), “Galactolipids-enriched plant extracts and the uses thereof”, US Patent Application Publication. 22. Wang GJ, Chen SM, Chen WC và các cộng sự (2007), "Selective inducible nitric oxide synthase suppression by new bracteanolides from Murdannia bracteata", Journal of Ethnopharmacology, 112(2), tr. 221- 227. 23. Wang YC, Huang TL (2005), "Screening of anti-Helicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants", FEMS Immunology & Medical Microbiology, 43(2), tr. 295-300. 24. Wu Z, Al-Shehbaz IA (2000), “Flora of China. 24. Flagellariaceae through Marantaceae”, Science Press, tr. 25-31. 25. Yam MF, Ang LF, Lim CP và các cộng sự (2010), "Antioxidant and hepatoprotective effects of Murdannia bracteata methanol extract", Journal of acupuncture and meridian studies, 3(3), tr. 197-202. 26. Mayur D. Nandikar & Rajaram V. Gurav (2015), “Revision of the genus Murdannia (Commelinaceae) in India”, Phytodiversity, 2(1), tr. 56-112. 27. Guei Jane Wang và cộng sự (2007), “Selective inducible nitric oxide synthase suppression by new bracteanolides from Murdannia bracteata”, Journal of Ethnopharmacology, 112, 221–227 28. Nguyen Ngoc Tuan (2016), “Chemical constituents from the mycelium of isaria japonica yasuda”, VietNam Journal of Science and Technology, 54(2C), tr. 334-340. 29. Ngan N.T.T, Quang T.H, và cộng sự (2012), “Anti-inflammatory and PPAR transactivational effects of components from the stem bark of Ginkgo biloba”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, tr. 2815–2824.
49. 30. Mu W, Yu S và cộng sự (2012), “Recent research on 3-phenyllactic acid, a broad-spectrum antimicrobial compound”, Applied Microbiology and Biotechnology, 95(5), tr. 1155–1163. 31. O. Cortés-Zavaleta, A. López-Malo và cộng sự (2014), “Antifungal activity of lactobacilli and its relationship with 3-phenyllactic acid production”, International Journal of Food Microbiology, 173, tr. 30– 35. 32. Dieuleveux V, Lemarinier S, & Guéguen M (1998), “Antimicrobial spectrum and target site of d-3-phenyllactic acid”, International Journal of Food Microbiology, 40(3), tr. 177–183. 33. Slaughter A. R, Hamiduzzaman M. M và các cộng sự (2008), “Beta- aminobutyric acid-induced resistance in grapevine against downy mildew: involvement of pterostilbene”, European Journal of Plant Pathology, 122(1), tr. 185–195. 34. Bengtsson T, Weighill D và cộng sự (2014), “Proteomics and transcriptomics of the BABA-induced resistance response in potato using a novel functional annotation approach”, BMC Genomics, 15(1), tr. 315. 35. Zeighaminejad R, Sharifi-Sirchi G.R và cộng sự (2016), “Induction of resistance against powdery mildew by Beta aminobutyric acid in squash”, Journal of Applied Botany and Food Quality 89, tr. 176 – 182. 36. Thevenet D, Pastor V và cộng sự (2016), “The priming molecule β- aminobutyric acid is naturally present in plants and is induced by stress”, New Phytologist, 213(2), 552–559. 37. Hien N. T. T, Nhiem N. X và cộng sự (2015), “Chemical constituents of the Annona glabrafruit and their cytotoxic activity”, Pharmaceutical Biology, 53(11), 1602–1607. 38. U J Youn, J Lee và cộng sự (2011), “Identification of a New Isomer of Dihydrophaseic Acid 3'-O-β-D-Glucopyranoside from Nelumbo Nucifera”, Bulletin of the Korean Chemical Society, 32(11), tr. 4083- 4085.
50. 39. Tu V.A, Diep C.N và cộng sự (2016), “Glucosides and urea derivatives from the seeds of Scaphium Macropodum (Miq.) Beumée”, VietNam Journal of Science and Technology, 54(2), tr. 207-213. 40. Park E, Kim MC và cộng sự (2016), “Effects of Dihydrophaseic Acid 3′-O-β-d-Glucopyranoside Isolated from Lycii radicis Cortex on Osteoblast Differentiation”, Molecules, 21(9), tr. 1260. 41. Yang LP, Gu XL và cộng sự (2018), “Chemical constituents from Canarium album Raeusch and their anti-influenza A virus activities” Journal of Natural Medicines, 72(3), tr. 808–815. 42. Wang J, Shao Y và cộng sự (1991), “Experimental studies of β- phenyllactic acid on the coronary system”, Acta Universitatis Medicinalis Secondae Shanghai 18, tr. 295–297. 43. Yu R, Van Scott E (1997), “Method of using 3-phenyllactic acid for treating wrinkles”, US Patent Application Publication. 44. Jakab G, Cottier V và cộng sự (2001), “β-Aminobutyric acid-induced resistance in plants”, European Journal of Plant Pathology 107, tr. 29– 37. 45. Arasimowicz-Jelonek M, Kosmala A và cộng sự (2013), “The proteome response of potato leaves to priming agents and S- nitrosoglutathione”, Plant Science 198, tr. 83–90. 46. Dubreuil-Maurizi C, Trouvelot S và cộng sự (2010), “β-Aminobutyric acid primes an NADPH oxidase-dependent reactive oxygen species production during grapevine-triggered immunity”, Molecular Plant Microbe Interactions 23, tr. 1012–1021. 47. Bigeard J, Colcombet J, Hirt H (2015), “Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI)”, Molecular Plant 8, tr. 521–539.