Luận văn Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

85 trang thiennha21 14/04/2022 4770

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_khao_sat_kha_nang_thuy_phan_ba_mia_va_carboxymethyl.pdf

Nội dung text: Luận văn Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Phan Thị Mỹ Dung TS. Trần Nhân Dũng MSSV:3082499 LỚP:CNSH K34 Cần Thơ, Tháng 5/2012 1
PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Phan Thị Mỹ Dung TS. Trần Nhân Dũng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN Cần Thơ, ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp 2
LỜI CẢM TẠ š› & •œ Đề tài luận văn được hoàn thành không chỉ với quá trình làm việc, học tập và nghiên cứu của tôi, mà còn có sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Gia đình, đã giúp đỡ tôi về mặt vật chất, và ủng hộ về mặt tinh thần trong suốt quá trình tôi học đại học. - Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cho tôi rất nhiều. - Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, đã quan tâm và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích để thực hiện tốt đề tài. - Các thầy cô và anh chị cán bộ ở các phòng thí nghiệm Vi sinh Vật, thực phẩm đã tạo điều kiên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học việc và làm đề tài. - Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 32TT và 33 đã tận tình chỉ dẫn tôi giúp tôi nắm được những kiến thức căn bản trong phòng thí nghiệm. - Các bạn và các em sinh viên trong Viện đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. - Thầy cô đã tận tình truyền dạy những kiến thức trong suốt quá trình học tập của tôi, để tôi có thể nắm vững và vận dụng tốt trong quá trình thực hiện đề tài cũng như trong công việc sau này. Xin chân thành cảm ơn tất cả! ¶¶¶ 3
TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được tiến hành nhằm khảo sát và tuyển chọn các dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu có khả năng thủy phân mạnh cơ chất bã mía và CMC trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn trên cơ chất bã mía, trong đó có 21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và 25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí, kết quả khảo sát đường kính thủy phân cho thấy 4 dòng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15 có khả năng thủy phân mạnh cơ chất CMC và cơ chất bã mía. Đặc biệt, dòng vi khuẩn hiếu khí CD 22 có hiệu suất thủy phân CMC và bã mía sau 5 ngày cao nhất trong nhóm hiếu khí, lần lượt là 21,581%, 9, 3147%, dòng vi khuẩn kỵ khí CD 11 có hiệu suất thủy phân CMC và dòng CD 15 có hiệu suất thủy phân bã mía cao nhất lần lượt là 30,049% và 8,8867%. Tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa các dòng vi khuẩn tuyển chọn, cho thấy, dòng CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus và dòng CD 26 tương đồng ở mức 73% với dòng Clavibacter agropygi (Corynebacterium). Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ cừu, thủy phân cellulose, i
MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CÁC TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu đề tài 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía 3 2.1.1. Cellulose 3 2.1.2. CMC 5 2.1.3. Bã mía 6 2.2. Hệ enzyme cellulase 7 2.2.1. Phân loại 7 2.2.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose 9 2.2.3. Nguồn enzyme cellulase 9 2.2.4. Ứng dụng enzyme cellulase 10 2.3. Tổng quan về dạ cỏ cừu 10 2.3.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu 10 2.3.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ 12 2.4. Các phương pháp vi sinh 13 2.4.1. Phân lập vi khuẩn 13 2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập 13 2.4.3. Phương pháp kiểm tra catalase 14 2.4.4. Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân 15 ii
2.5. Tình hình nghiên cứu 15 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 15 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 17 3.1.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị 17 3.1.2. Vật liệu thí nghiệm 18 3.1.2.1. Bã mía 18 3.1.2.2. Dạ cỏ cừu 18 3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 3.1.3.1. Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến 18 3.1.3.2. Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến 19 3.2. Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía 19 a. Khảo sát hàm lượng cellulose bột bã mía 19 b. Khảo sát hàm ẩm trong bã mía 20 c. Khảo sát hàm lượng tro tổng số trong bột bã mía 20 3.2.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu 21 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân CMC 22 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía 22 3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC 23 3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía 23 3.2.7. Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn 24 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía 25 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu 27 4.2.1. Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc 27 4.2.2. Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn 30 4.3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC 33 4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía 36 iii
4.5. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất CMC của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn 39 4.6. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn 41 4.7. Kết quả định danh một số dòng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp định danh sinh hóa 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC iv
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến 4 Bảng 2: Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến (M1) 18 Bảng 3: Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến (M2) 19 Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3 22 Bảng 5: Bảng bố trí thí nghiệm 4 23 Bảng 6: Kết quả khảo sát thành phần bã mía sau xử lý 25 Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu 27 Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu 27 Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí 28 Bảng 10: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí 29 Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí 30 Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí 32 Bảng 13: Hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh 43 Bảng 14: Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn phụ lục 1 Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía nguyên liệu phụ lục 2 Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía phụ lục 2 Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày phụ lục 2 Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày phụ lục 2 Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 2 v
Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 2 Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dòng vi khuẩn tuyển chọn phụ lục 2 Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC phụ lục 3 Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC phụ lục 3 Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía phụ lục 3 Bảng 31: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía phụ lục 3 Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí phụ lục 3 Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí phụ lục 3 Bảng 34: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày phụ lục 3 Bảng 35: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày phụ lục 3 vi
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cấu trúc cellulose 3 Hình 2: Cấu trúc CMC 6 Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase 7 Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở vi sinh vật hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) 8 Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu 11 Hình 6: Một số thiết bị sử dụng 17 Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý 26 Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28 28 Hình 9: Hình chụp nhuộm Gram một số dòng vi khuẩn 31 Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí 34 Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26 35 Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí 35 Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 23 và CD 37 36 Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí 36 Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí 37 Hình 16: Hoạt tính thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn 38 Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn 39 Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn 40 Hình 19:Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn 41 Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn 42 Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22 44 Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26 45 Hình 23: Phương pháp pha loãng mẫu phụ lục 1 Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường phụ lục 2 vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT nm: nanomete CMC: carboxymethyl cellulose m: meter mm: milimete g: gram FAO: Food anh Agriculture Organization ml:mililite EM: Effective Microorganisms UV: Untra violet Đktp: đường kính thủy phân đvC: đơn vị cacbon CFU: colony forming unit VSV : vi sinh vật ix
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tình hình ô nhiễm môi trường đang là vấn đề nóng trên các diễn đàn trong nước và thế giới. Trong các nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm, thì nguyên nhân do các chất hữu cơ thực vật dễ xử lý và ít nguy hại nhất. Tuy nhiên, việc làm thế nào để xử lý nhanh chóng và hiệu quả các chất thải hữu cơ thực vật đồng thời có thể tận dụng sản phẩm sau xử lý phục vụ cho nền nông nghiệp sạch và năng lượng xanh là vấn đề quan trọng đối với những nước có nền sản xuất nông nghiệp như nước ta. Trong tế bào thực vật, cellulose là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất, ở các loại cây gỗ nói chung, hàm lượng cellulose khoảng 40-50% riêng ở cây bông, hàm lượng cellulose lên đến 90%. Hàng năm, có đến hàng tỉ tấn cellulose được tích lũy lại trong đất dưới dạng rác thải hữu cơ thực vật, hoặc do chính thực vật thải ra trong quá trình sinh trưởng phát triển. Nếu lượng cellulose này không được xử lý thì trong thời gian không lâu, toàn bộ nguồn cacbon trong không khí sẽ được chuyển hóa thành cellulose. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật (VSV) sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Mặt khác, việc ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các sản phẩm thải thực vật, đồng thời tạo ra các sản phẩm phụ như thức ăn gia súc, cồn sinh học, biogas đang là hướng phát triển tiềm năng của công nghệ sinh học. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn đặc biệt, khu hệ VSV cộng sinh với các loài động vật ăn cỏ, là đối tượng VSV thủy phân cellulose được chú ý nhất. Các nhà khoa học đã phân lập được trên 200 loài vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulose từ dạ cỏ các loài động vật nhai lại (Theodorou và France, 1993). Nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao , đề tài: “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được thực hiện, góp phần cung cấp nguồn giống vi khuẩn phân hủy cellulose có hoạt tính cao để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 1 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên cơ chất CMC và bã mía. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 2 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.6. Tổng quan về cellulose 2.1.1. Cellulose Cellulose là một chất xơ không hòa tan và là một trong những thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose, liên kết với nhau nhờ cầu nối β 1,4-glucan có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000. Hình 1: Cấu trúc cellulose (Nguồn: Ngày 15/03/2012 ) Cellulose là glucan không phân nhánh, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Khối lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật và tùy phương pháp xác định (khi xác định bằng phương pháp siêu li tâm, người ta nhận thấy rằng khối lượng phân tử của cellulose ở bông là 150.000-500.000 đvC còn ở gai là 1.840.000 đvC), (Nguyễn Lân Dũng, 2008). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 3 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công. Bảng 1: Thành phần Lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1,6-4,7 1,4-3,3 2,7-5,7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35,7 6,4 Cỏ mềm 45 31,4 12,0 Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30 cho các loại) Bã thô 33,4 30,0 18,9 (Nguồn: Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011) Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình. - Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 4 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT - Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β 1,4 - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β 1,4 - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. Cellulose có cấu trúc rất bền, không tan trong nước, chỉ bị trương phồng do hút nước, và khó bị thủy phân, chỉ bị phân hủy do đun nóng với kềm hay acid hay do các enzyme gọi chung là cellulase. Người và động vật không có enzyme phân hủy cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân hủy cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. Trong xác thực vật (nhất là trong thành phần của thân và rễ) thì thành phần hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose. Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50-80% (tính theo khối lượng khô), trong sợi bông, hàm lượng này thường vượt quá 90%. Có người đã tính rằng tổng lượng cellulose trên Trái Đất là vào khoảng 3500 tỉ tấn. Nếu không có quá trình phân hủy cellulose thì số lượng này sẽ tăng lên rất nhanh và chẳng bao lâu, tât cả CO2 trong không khí sẽ chuyển hóa hết thành cellulose, sự sống sẽ không tồn tại được nữa. (Nguyễn Lân Dũng, 2004) 2.1.2. Carboxymethyl cellulose (CMC) CMC còn được gọi là carboxymethyl cellulose, là một dẫn suất của cellulose, được tạo thành từ phản ứng với kiềm và acid chloroacetic có độ nhớt cao và tan trong nước. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 5 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Chế phẩm CMC khác nhau phụ thuộc vào mức độ thay thế gốc hydroxyl bằng gốc carboxy methyl trong chuỗi cellulose. Thông thường, mức độ thay thế ở khoảng 6-9.5 dẫn xuất trên 1 monomer. CMC có tác dụng ổn định hệ huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn trong khai thác mỏ và dầu khí, trong công nghiệp dùng CMC để hồ vải. (Hồ Sĩ Tráng, 2003). Hình 2: Cấu trúc CMC (Nguồn: ngày 15/03/2012) 2.1.3. Bã mía Mía, Saccharum officinarum, là loài thân thảo, cao 1-4m, đường kính có thể tới 40 – 60 mm. Sau khi ép tách đường, bã mía còn chứa khoảng 50% ẩm và 1 -2 % đường. Về thành phần hóa học, bã mía chứa 40 – 50% cellulose, 18 – 23 % lignin và 20 – 25% hemincellulose. (Hồ Sĩ Tráng, 2003) Các thống kê cho thấy hơn 300 triệu tấn bã mía và củ cải đường được thải ra mỗi năm, tập trung hầu hết ở các nhà máy đường. Các số liệu của FAO cho thấy khoảng 1.248 tấn mía được thu hoạch vào năm 1997, trong đó là 25% bã mía ép (312 triệu tấn). Năng lượng của 1 tấn bã mía ép (độ ẩm 50%) là 2,85 GJ/tấn. Đó là chưa kể các phần thừa (bã bỏ, phần ngọn và lá) và phần thải trong quá trình thu hoạch mía. Các phần này lại chiếm một tiềm năng năng lượng cao hơn cả (55%), thế nhưng hiện nay phần lớn vẫn chỉ bị đốt bỏ hoặc để phân rã ngoài đồng. Nói cách khác, tiềm năng lớn này hầu hết vẫn đang bị bỏ phí. Cho đến năm 1999, Châu Á vẫn dẫn đầu về sản lượng bã mía (131 triệu tấn), sau đó là đến Nam Mỹ (89 triệu tấn). Các nhà máy sản xuất đường đã có truyền thống tái sử dụng bã mía để đốt tạo hơi nước từ nhiều thế kỷ qua, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 6 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT nhưng hiệu suất vẫn còn rất thấp. Cho đến gần đây, do sức ép kinh tế, các nhà máy đường đã phải tìm các giải pháp khác hoặc cải thiện hiệu suất tái tạo năng lượng, một số nhà máy thậm chí còn bán điện thừa, đặc biệt là tại Brazil, Ấn Độ, Thái Lan (Đỗ Văn Chương và Nguyễn Thị Hồng Anh, 2007). 2.7. Hệ enzyme cellulase 2.7.1. Phân loại Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase (Nguồn: ngày 15/03/2012) Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1à4) glucoside. Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Cellulase là một phức hệ enzyme gồm: + Exocellulase (1,4 b-glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): cắt từ đầu không khử của chuỗi polymer cho sản phẩm là các gốc đường đôi cellobiose, không phân hủy cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của phân tử, giúp cho Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 7 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT enzyme endocellulase phân hủy chúng tốt hơn. Ngoài ra exocellulase còn có các tên khác như: cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, avicellase. + Endocellulase (1,4 b-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân hủy liên kết b-1,4 glucoside trong vùng vô định hình của cellulose thành: cellodextrin, cellobiose, glucose. Tác động yếu lên vùng cellulose kết tinh. Các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 b-glucanase, C-cellulase. + b-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): phân hủy các gốc đường đôi cellobiose thành glucose. Không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Các tên gọi khác như: b-glucosidase hay cellobiase. (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở VSV hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) (Nguồn: Lee R. Lynd, et al. 2002) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 8 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 2.7.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose ¶ Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose ( phân hủy hiếu khí) Quá trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy phân sau đó chuyển hóa thành CO2 và H2O. Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose có thể qua hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: là sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới tác dụng của nhóm cellulase. Ngoài ra còn tạo thành một lượng đường glucose. Giai đọan thứ hai: là giai đoạn oxy hóa những đường đơn giản. Quá trình này có qua nhiều sản phẩm trung gian loại oxi axit và cuối cùng tạo thành CO2 và H2O (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ¶ Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí Quá trình phân hủy kỵ khí khi các chất cellulose được tiến hành qua hai giai đọan. Giai đoạn thủy phân cellulose thành glucose và sau đó lên men glucose theo kiểu lên men butyric. Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men dạng methan. Theo như Omelanskin thì lên men kiểu methan sản phẩm khi tạo ra bằng nửa trọng lượng cellulose còn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3. (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.7.3. Nguồn enzyme cellulase Trong tự nhiên có nhiều loại VSV có khả năng sinh ra các enzyme xúc tác quá trình phân hủy cellulose. Những VSV này được gọi chung là VSV phân hủy cellulose. Chúng có nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên, góp phần rất quan trọng trong việc nâng cao độ phì cho đất cũng như vào việc tiêu hóa thức ăn ở các loài động vật nhai lại. Trong điều kiện hiếu khí thì cellulose có thể được phân hủy dưới tác dụng của nhiều loại VSV hiếu khí (vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm túi ). Các loài VSV có khả năng sinh cellulase thuộc về các chi sau: Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellviribrio, Bacillus, Chondromyces, Myxococcus, Cytophaga Fusarium, Chaetomium, Aspergillus, Penicilium, Trichoderma, Meralius, Fomes Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 9 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Ngoài các VSV hiếu khí còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân hủy cellulose. Người ta còn gọi quá trình phân hủy cellulose kỵ khí là quá trình “lên men cellulose”. Còn một nhóm VSV đặc biệt nữa có khả năng phân hủy cellulose một cách mạnh mẽ trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn, là nhóm VSV phát triển trong dạ cỏ của trâu bò và các động vật nhai lại khác. Trâu bò sẽ không thể nào tiêu hóa được cỏ rơm rạ nếu không có sự cộng sinh với một khu hệ đông đúc các VSV trong dạ cỏ của chúng. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ bò có khoảng 109 – 1010 tế bào vi khuẩn. Sinh khối vi khuẩn chứa đến 5 – 10% so với lượng chất khô của toàn bộ chất chứa trong dạ cỏ của trâu bò. Ngoài vi khuẩn ra, trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ còn có khoảng vài triệu cơ thể động vật nguyên sinh (6 – 10% khối lượng khô dạ cỏ). Khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ động vật nhai lại có thể kể đến một vài loài có khả năng phân hủy mạnh mẽ nhất là: Ruminococcus flavefeciens, ruminococcus albus, Ruminobacter parvum, Bacteroides succunogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens (Nguyễn Đức Lượng, 2003) 2.7.4. Một số ứng dụng cellulase Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), cellulase có một số ứng dụng như sau: - Phá vỡ thành tế bào (cellwall) thực vật để nuôi cấy các tế bào trần, để lai tạo chúng với nhau nhằm tạo giống thực vật. - Sản xuất đường glucose thực phẩm, nguyên liệu công nghiệp hoặc nuôi cấy nấm men gia súc. - Lên men đường chuyển hóa (tạo thành bởi sự thủy phân cellulose do enzyme) thành etanol nguyên liệu động cơ đốt trong. - Tách tinh bột ra khỏi hạt và củ bằng cách dùng các enzyme tách tế bào - Sản xuất tổ hợp EM trong xử lý rác thải. 2.8. Tổng quan về dạ cỏ cừu 2.8.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu Cừu (Ovis aries) là động vật có vú thuộc họ trâu bò, chúng có cơ quan tiêu hóa đặc trưng của nhóm động vật nhai lại. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 10 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu (Nguồn: ngày 25/11/2011) Trong dạ dày cừu cũng như dạ cỏ của các loài động vật nhai lại, dạ cỏ là túi lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ hoành đến xương chậu. Dạ cỏ chiếm 85 – 90% dung tích dạ dày, 75% dung tích đường tiêu hóa, có tác dụng tích trữ, nhào lộn và lên men phân hủy thức ăn. Thức ăn sau khi ăn được nuốt xuống dạ cỏ, phần lớn được lên men bởi hệ VSV cộng sinh ở đây. Chất chứa trong dạ cỏ trung bình có khoảng 850 – 930g nước/kg, nhưng tồn tại ở hai tầng: tầng lỏng ở dưới chứa nhiều tiểu phần thức ăn mịn lơ lửng trong đó và phần trên khô hơn, chứa nhiều thức ăn kích thước lớn. Ngoài chức năng lên men, dạ cỏ còn có vai trò hấp thu qua vách dạ cỏ (cũng như dạ tổ ong và dạ lá sách) vào máu và trở thành nguồn năng lượng cho vật chủ. Sinh khối VSV cùng với những tiểu phần thức ăn có kích thước nhỏ (<1mm) sẽ đi xuống dạ múi khế và ruột để được tiêu hóa tiếp bởi men của đường tiêu hóa. Chất chứa dạ cỏ là một hỗn hợp gồm thức ăn vào, VSV dạ cỏ, các sản phẩm trao đổi trung gian, nước bọt và các chất chế tiết vào qua vách dạ cỏ. Đây là một hệ sinh thái rất phức hợp trong đó liên tục có sự tương tác giữa thức ăn, hệ VSV và vật chủ. Dạ cỏ có môi trường thuận lợi cho VSV kỵ khí phát triển. Đáp lại, VSV dạ cỏ đóng góp vai trò rất quan trọng vào quá trình tiêu hóa thức ăn của vật chủ. Ngoài dinh dưỡng, môi trường dạ cỏ có những đặc điểm thiết yếu cho sự lên men cuả VSV cộng sinh như sau: độ ẩm cao (85 – 90%), pH trong khoảng 6,4 – 7,0, nhiệt độ khá ổn định (38 – 42oC), áp suất thẩm thấu ổn định và môi trường kỵ khí (nồng độ oxi < 1%). Có một cơ chế để đảm bảo duy trì ổn định các điều kiện của môi trường lên men liên tục này. Nước bọt đổ vào dạ cỏ liên tục giúp duy trì độ ẩm của môi trường lên men. Muối photphat và cacbonat tiết qua nước bọt có tác dụng đệm đồng thời với sự hấp thu nhanh chóng axit béo bay hơi và amoniac qua vách dạ cỏ làm cho pH dịch dạ cỏ ổn định. Khí oxi nuốt vào thức ăn nhanh chóng được sử dụng, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 11 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT nên môi trường kỵ khí luôn luôn được duy trì. Áp suất thẩm thấu dạ cỏ được duy trì tương tự như áp suất thẩm thấu của máu nhờ có sự trao đổi ion qua vách của dạ cỏ. Các chất khí (chủ yếu là CO2 và CH4) là phụ phẩm trao đổi cuối cùng của quá trình lên men dạ cỏ cũng được thải ra ngoài thông qua quá trình ợ hơi. Thời gian thức ăn lưu trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho VSV công phá. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008) 2.8.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ Hệ VSV cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là vi sinh vật dạ cỏ. Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là vi khuẩn (Bacteria), động vật nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi); ngoài ta còn có mycoplasma, các loại virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa thức ăn. Quần thể VSV dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần ăn. Hệ VSV dạ cỏ đều là VSV kỵ khí và sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng. Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt cùng với cha mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong VSV dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa chất xơ. Tính từ năm 1941 là năm Hungate công bố những công trình nghiên cứu đầu tiên về VSV dạ cỏ đến nay đã có tới 200 loài VSV dạ cỏ được mô tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ. Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoản 25-%, số còn lại bám vào các mẫu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa. Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Vi khuẩn phân hủy cellulose: đây là nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những loài gia súc sử dụng khẩu phần giàu cellulose. Những loài vi khuẩn phân hủy cellulose quan trọng nhất là Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008) 2.9. Các phương pháp vi sinh 2.4.1. Phân lập vi khuẩn Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 12 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Nguyên tắc: Tách rời các tế bào VSV; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. ¶ Một số phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose: Phân lập trên môi trường với nguồn carbon là CMC: Cân 1g mẫu đất trồng lúa pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, sau đó hút 20µl trải đều trên môi trường CMC. Ủ môi trường 2 – 3 ngày ở 30oC, tách ròng từng khuẩn lạc thu được những dòng vi khuẩn riêng biệt. Môi trường CMC gồm 1g (NH4)2SO4, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,001g NaCl, 10g CMC, 2g Agar, thêm nước đến thể tích 1lít và điều chỉnh pH7. Phân lập trên môi trường với nguồn carbon là giấy photocopy: Cân 1g mẫu đất trồng lúa hoặc dịch dạ cỏ bò pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, hút 20µl dung dịch này trải đều trên môi trường M, sau đó dùng giấy photocopy (được khử trùng và cắt tròn có đường kính bằng với đường kính bề mặt đĩa môi trường) áp sát trên bề mặt môi trường, ủ môi trường 5-10 ngày ở 30oC cho đến khi khuẩn lạc phát triển trên bề mặt giấy, tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc trên môi trường CMC (Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011). 2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Có nhiều cách kiểm tra: Ø Kiểm tra vết cấy: Quan sát sự sinh trưởng của VSV qua vết cấy trên môi trường đặc. + Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. + Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ. Ø Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc: + Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 13 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT + Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. + Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường. + Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. + Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loại VSV. + Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006). 2.4.3. Phương pháp kiểm tra catalase Nguyên tắc - Các VSV hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2. - Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào. - Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Tiến hành Hóa chất sử dụng: - Dung dịch H2O2 30% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng - Dung dịch đệm phosphate pH 7,0. Có thể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong những phương pháp sau: Ø Thử trên phiến kính (lame): dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch . Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối VSV trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh khối của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O2 0,5% rồi đậy lại bằng một lame kính (lamelle). Ghi nhận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lam kính. Ø Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch nghiêng. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt quanh sinh khối. Ø Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau đó Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 14 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT chấm đầu ống mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi trường. Ghi nhận nếu có sự sủi bọt khí trong ống mao dẫn. Phương pháp này có ưu điểm là thử được trên từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần. Đọc kết quả - Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O2 được tạo ra. - Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí. (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006) 2.4.4. Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân Mục đích: Đánh giá sơ lược về khả năng phân hủy cơ chất cellulose của vi khuẩn, làm cơ sở khảo sát cho những thí nghiệm sau. Nguyên tắc: Khi cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy làm cho độ đục môi trường giảm và dần trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỉ lệ với độ hoạt động của cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2003). 2.10. Tình hình nghiên cứu 2.10.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Nguyễn Hoài Phong et al. (2003) đã phân lập được 7 chủng vi sinh vật từ mạt dừa của các cơ sở sản xuất chỉ sơ dừa. Bằng kỹ thuật định danh sơ bộ dựa vào hình dạng, tất cả đều là xạ khuẩn, sau đó tiến hành sơ chọn các vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme cellulase để phân hủy cellulose. Nguyễn Lân Dũng et al. đã tiến hành phân lập tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân hủy cellulose từ 343 chủng nấm men nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi. Kết quả đã tuyển chọn được các chủng 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 có khả năng phân hủy cellulose cao. Võ Hoài Bắc et al. (2010) đã chọn được 2 chủng vi sinh vật từ 17 chủng ban đầu có khả năng thủy phân mạnh cơ chất cellulose, qua định danh đã xác định được các chủng này là Bacillus lichenformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505, sau đó tiến hành ứng dụng 2 giống này trong thủy phân bã thải agar. Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp et al. (2010) khảo sát khả năng phân hủy rác thải hữu cơ của 3 dòng vi khuẩn gồm có 1 dòng vi khuẩn bình nhiệt (30oC) (dòng C1b), 2 dòng vi khuẩn ái nhiệt (55oC) (dòng 3a1và 3a2). Kết quả cho thấy hai nghiệm thức C2 (chủng vi khuẩn phân hủy cellulose bình nhiệt dòng C1b) và nghiệm thức C4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 15 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT (chủng vi khuẩn ái nhiệt dòng 3a2) đạt được các chỉ tiêu phù hợp nhất. Hơn nữa, hai nghiệm thức này có lượng khí CO2, CH4 thải ra thấp, không gây ảnh hưởng đến môi trường. Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) phân lập và nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose từ đất trồng lúa và dạ cỏ bò. Kết quả thu được 4 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme cellulase ngoại bào và thủy phân hiệu quả giấy photocopy và rơm rạ. Phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA cho thấy dòng vi khuẩn Q5, Q8 và Q9 đồng hình 99-100% tương ứng với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% tương ứng với dòng Cellulomonas flavigena. 2.10.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính thủy phân cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vât nhai lại như bò, cừu và dê. Kết quả phân lập được một số dòng vi khuẩn và nấm có khả năng thủy phân cellulose như P. eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium. Phân tích lượng cellulose được phân hủy và sự sinh trưởng của vi khuẩn phân hủy cellulose trong dạ cỏ (Russell et al., 2009). Khảo sát sự cạnh tranh của 3 nhóm vi khuẩn dạ cỏ có khả năng phân hủy cellulose chủ yếu trong trường hợp có hoặc không có nhóm vi sinh vật không phân hủy cellulose (Chen và Weimer, 2001) Barbara et al. (1968), phân lập được 30 dòng vi khuẩn từ dạ cỏ cừu. Trong đó có 19 dòng phẩy khuẩn Gram âm thuộc chi Butyrivibrio, bốn dòng cầu khuẩn thuộc nhóm Ruminococcus albus, năm dòng cầu khuẩn thuộc nhóm R.flavefacien, 2 dòng còn lại được xác định thuộc chi Clostridium. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 16 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 3.3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh hóa và Công nghệ Enzyme, Vi sinh Thực phẩm, Vi sinh, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. Thời gian : Tiến hành từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 4 năm 2012. Hóa chất: Ammonium sulfate (Merck), Congo Red, NaCl, agar, cacboxyl methyl cellulose (CMC), H2SO4, NaOH, gellan Gum, MgSO4.7H2O, K2HPO4, Pluronic F.68, Fuchsin, Iod, Crystal violet, cồn 96o Thiết bị: - Tủ cấy vi sinh vật (Pháp), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), nồi trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), biolog Gen II Microbial Identification System, hệ thống phân tích chất xơ VELP, máy đo độ nhớt Handheld Viscometer SKF TMVM1, máy tro hóa Nabertherm, bộ micropipet biorad P10, P20, P200, P1000, P5000 (Đức), Tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Sartorius (Đức), ống nghiệm 15 ml (Đức), chai Durham 8cc (Đức), đĩa petri đường kính 8cm, 16cm (Đức), tủ lạnh – 20 ºC Electrolux Confor plus (Thụy Điển), tủ lạnh – 4 ºC Akira (Việt Nam), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. - Một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, lam, lammen, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylong, ốngđong, đèn cồn, Máy tro hóa Nabertherm Hệ thống phân tích chất xơ Máy đo độ nhớt Hình 6: Một số thiết bị sử dụng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 17 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 3.3.2. Vật liệu thí nghiệm ¶ Bã mía Bã mía được lấy từ nhà máy đường Hậu Giang, thị xã Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang. Bã mía được ngâm và rửa nước nhiều lần để loại bỏ lượng đường của bã mía, sấy khô ở 70oC và nghiền mịn thành bột với kích thước hạt là 0,2mm. ¶ Dạ cỏ cừu Mẫu dạ cỏ cừu thu ở lò giết mổ dê cừu ở Cần Thơ. Cách thu mẫu dạ cỏ: 30ml dịch dạ cỏ thu ở 3 vị trí khác nhau trên cùng một dạ cỏ, trữ vào ống falcon 50ml, bảo quản trong tối ở nhiệt độ lạnh 4oC trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm; để lắng trong 10 phút để loại bỏ thức ăn, thu dịch trong chứa vi khuẩn. 3.3.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 3.3.3.1. Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến Bảng 2: Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1) Thành phần môi trường đặc Cơ chất 10 g (NH4)2SO4 1 g K2HPO4 1 g MgSO4.7H2O 0,5 g NaCl 0,001 g Agar 20 g Nước 1000 g ( Nguồn: Ryckeboer et al, 2003) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 18 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 3.3.3.2. Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến Bảng 3: Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2) Thành phần môi trường lỏng Cơ chất 10 g (NH4)2SO4 1 g K2HPO4 1 g MgSO4.7H2O 0,5 g NaCl 0,001 g Nước 1000 g ( Nguồn: Ryckeboer et al, 2003) Tùy theo mục đích cấy chuyển vi sinh vật, có thể bổ sung yeast extract nhằm kích hoạt vi khuẩn. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía Chuẩn bị bã mía: bã mía sau khi lấy từ nhà máy mía đường sẽ được sấy ở 700C trong khoảng 60 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lổ lưới là 0,2mm. Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc để loại đường. a. Khảo sát hàm lượng cellulose trong bột bã mía Nguyên tắc: phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh. Các chất như hemicellulose, lignin, tinh bột ít bền hơn với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh nên bị oxy hóa, phân hủy và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu ( Phạm Thị Ánh Hồng, 2003). Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3. Tiến hành: - Phân tích 1g bã mía với H2SO4 1,25% và NaOH 1,25% bằng hệ thống phân tích xơ VELP. - Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau: X = (a*100)/m Trong đó: m: trọng lượng mẫu ban đầu (g) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 19 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT a: trọng lượng cellulose còn (g) X: phần trăm cellulose có trong mẫu (%) b. Xác định độ ẩm trong bã mía Nguyên tắc: dùng nhiệt làm bay hơi nước trong nguyên liệu. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3. Tiến hành: sấy 3 gram bột bã mía ở 105oC trong 120 phút ở; phần trăm độ ẩm được tính theo công thức: X = (G1 – G2)*100/m Trong đó G1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g). G2 : khối lượng mẫu sau khi sấy (g). m: khối lượng nguyên liệu (g). X: phần trăm nước có trong bã mía (%). c. Xác định hàm lượng tro tổng số trong bã mía Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong nguyên liệu (do đó tro còn được gọi là tổng số muối khoáng). Nguyên tắc: Các chất hữu cơ sẽ bị nung cháy hoàn toàn ở nhiệt độ cao (550 – 6000C); những thành phần còn lại được dùng để xác định phần trăm tro có trong nguyên liệu. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số đơn vị thí nghiệm là 3. Tiến hành: Nung 3 gram bột bã mía ở 5500C trong 5 giờ. Hàm lượng tro toàn phần được tính theo công thức sau: X = G2*100/G1 Trong đó: G1: trọng lượng mẫu ban đầu (g). G2: trọng lượng mẫu sau khi nung (g). X: phần trăm tro có trong mẫu phân tích. (Nguyễn Thị Thu Thủy và Nguyễn Công Hà, 2009) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 20 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 3.1.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu Mục đích: phân lập những dòng vi khuẩn sống trong dạ cỏ cừu có khả năng sử dụng cơ chất bã mía làm nguồn cacbon. Tiến hành thí nghiệm: Vi khuẩn dạ cỏ được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường M1 (cơ chất bã mía) cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc ròng. - Đối với vi sinh vật hiếu khí: Mẫu được ủ ở 38oC trong 48 giờ. - Đối với vi sinh vật kỵ khí: Mẫu được ủ trong bình hút ẩm kỵ khí, ủ ở 38oC trong 48 giờ. Mô tả khuẩn lạc: Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên từng đĩa petri riêng ở điều kiện 38oC, trong 48 giờ. Quan sát và mô tả khuẩn lạc bằng kính lúp ở độ phóng đại 5X dựa vào một số đặc điểm sau. + Hình dạng: dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular); dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ (rhizoid). + Độ nổi: Dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc (phía vành khuẩn lạc lài xuống; dạng mô (convex) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate). + Dạng bìa: có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous). + Màu sắc: Khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ, vàng, lục, Mô tả vi khuẩn: Một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng, trạng thái, khả năng chuyển động của vi khuẩn. + Hình dạng, trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở vật kính 100X (phụ lục 1). + Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi trường thạch bán lỏng (0,3 - 0,6% thạch); đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 38oC và quan sát sau 3 ngày (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thị Thúy Hằng, 2006). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 21 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT + Gram vi khuẩn được khảo sát dựa theo phương pháp nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938) (phụ lục 1). 3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân cơ chất CMC của vi khuẩn thủy phân. Mục đích: Khảo sát vi khuẩn có khả năng thủy phân cơ chất CMC trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. - Nguyên tắc: Vi khuẩn phân hủy cellulose trong cơ chất sẽ tạo thành vòng halo bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nhân tố là từng dòng vi khuẩn riêng biệt), 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 3. Bảng 4. Bảng bố trí thí nghiệm 3 Nghiệm thức lặp lại 1 lặp lại 2 lặp lại 3 NT 1 - - - . - - - NT n - - - NT: nghiệm thức. 1, n: dòng vi khuẩn thứ 1 đến n. Mỗi 20 µl dịch mỗi dòng vi khuẩn được chủng vào giếng thạch môi trường M1 (cơ chất CMC) có đường kính 5mm; khảo sát vòng tròn đường kính thủy phân sau khi ủ 72 giờ ở 380C. Hoạt tính thủy phân = đường kính vòng tròn thủy phân – đường kính lỗ đục Chỉ tiêu đánh giá: - Hoạt lực của các dòng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng tạo vòng tròn đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất CMC). 3.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân cơ chất bã mía của vi khuẩn Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng thủy phân mạnh cơ chất bã mía trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Nguyên tắc: Vi khuẩn phân hủy cellulose trong cơ chất sẽ tạo thành vòng halo bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiêm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nhân tố là từng dòng vi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 22 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT khuẩn riêng biệt), 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 3. Bảng 5. Bảng bố trí thí nghiệm 4 Nghiệm thức lặp lại 1 lặp lại 2 lặp lại 3 NT 1 - - - . - - - NT n - - - NT: nghiệm thức. 1, n: dòng vi khuẩn thứ 1 đến n. Mỗi 20 µl dịch mỗi dòng vi khuẩn được chủng vào giếng thạch môi trường M1 (cơ chất bã mía) có đường kính 5mm; khảo sát vòng tròn đường kính thủy phân sau khi ủ 72 giờ ở 380C. Hoạt tính thủy phân = đường kính vòng tròn thủy phân – đường kính lỗ đục Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt lực của các dòng vi khuẩn được đánh giá thông qua khả năng tạo vòng tròn đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất bã mía). 3.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn để thủy phân CMC. Mẫu thử: 6 dòng vi khuẩn hiếu khí và 6 dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn trong thí nghiệm 3. Tiến hành thí nghiệm Chủng 1% dịch vi khuẩn mật số khoảng 107 CFU/ml vào 50 ml môi trường M2 (cơ chất CMC), ủ ở 38oC trong 5 ngày (ủ lắc vận tốc 100 vòng/phút đối với vi khuẩn hiếu khí, ). Chỉ tiêu đánh giá - Sự giảm độ nhớt của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn (phụ lục 1.4) 3.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn để thủy phân bã mía. Mẫu thử: 4 dòng vi khuẩn hiếu khí và 4 dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn trong thí nghiệm 3. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 23 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Tiến hành thí nghiệm Chủng 1% dịch vi khuẩn mật số khoảng 107 CFU/ml vào 50 ml môi trường M2 (cơ chất bã mía), ủ ở 38oC trong 5 ngày (ủ lắc vận tốc 100 vòng/phút đối với vi khuẩn hiếu khí, ). Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thủy phân bã mía = % xơ ban đầu – % xơ sau nuôi cấy 3.1.7. Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn Mục tiêu thí nghiệm: Định danh dòng vi khuẩn được chọn lọc Nguyên tắc: Mỗi loài vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (chủ yếu là nhiều loại đường), trong trường hợp chúng sử dụng cùng một loại đường thì nhu cầu về hàm lượng đường cũng khác nhau ở từng loài. Tiến hành thí nghiệm: - Vi khuẩn đã được chọn có khả năng đường hóa mạnh bã mía được dùng để xác định tên loài của vi khuẩn bằng hệ thống định danh vi sinh vật Biolog Gen II Microbial Identification System tại phòng thí nghiệm VSV Công nghiệp, Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học. - Mỗi dòng vi khuẩn được nuôi cấy riêng trên đĩa petri với thành phần môi trường bã mía-agar. Dùng que có đầu bông gòn vô trùng lấy vi khuẩn chuyển vào dung dịch chuyên biệt sao cho dung dịch sau khi lấy vi khuẩn đạt độ đục nhất định (đo bằng máy đo độ đục). Bơm rút 100 μl dung dịch sau khi lấy vi khuẩn chuyển vào mỗi giếng trên khay 96 giếng chuyên dùng để định danh vi khuẩn do công ty Victory (Hà Nội) cung cấp. Ủ ở 33oC trong 18-24 giờ, lấy khay ra đọc kết quả. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 24 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía Nhận xét: theo kết quả từ bảng 6 cho thấy: Sau khi phân tích 1 gram bã mía bằng máy phân tích xơ, lượng xơ bã mía còn lại là 58,57%. Kết quả này cao hơn so với kết quả của Issay (1980) với lượng chất cellulose trong xơ mía là 56,5%, cao hơn thành phần cellulose trong bã mía của Hồ Sĩ Tráng (2003) là 40-50%. Mặt khác, kết quả này cũng cho thấy hàm lượng xơ trong bã mía cao hơn 7,27% so với hàm lượng xơ bã mía của Nguyễn Thị Thanh Trúc et al. (2011). Có thể là do sự khác nhau về giống mía nguyên liệu dẫn đến sự khác biệt về thành phần chất xơ. Thành phần cellulose trong bã mía khá cao, hơn nhiều so với thành phần cellulose trong các nguồn nguyên liệu khác như: vỏ trấu (32,1 %), lá cây (15-20%) do đó, bã mía rất thích hợp để làm nguồn nguyên liệu cho quá trình thủy phân cellulose của vi khuẩn. Bột bã mía sử dụng có chứa 7,96 % nước. Bã mía sau xử lý có 3,59% chất khoáng. Kết quả này cao hơn kết quả của Issay (1980) là 1,3 %. Cao hơn hàm lượng khoáng trong xơ dừa là 2,22% (Sudhakaran và Vasudev, 2001). Bảng 6: kết quả khảo sát thành phần của bã mía sau xử lý Hàm lượng Cellulose Hàm lượng ẩm độ Hàm lượng tro (%) (%) (%) 58,57 7,96 3,59 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 25 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu Quá trình phân lập đã tách ròng được 46 dòng vi khuẩn từ dạ cỏ cừu, bao gồm 21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và 25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí. Tất cả 46 dòng vi khuẩn đều phát triển tốt ở 38oC sau 48 giờ. Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí 1 CD 2 12 CD 24 2 CD 4 13 CD 26 3 CD 6 14 CD 28 4 CD 8 15 CD 30 5 CD 10 16 CD 32 6 CD 12 17 CD 34 7 CD 14 18 CD 36 8 CD 16 19 CD 38 9 CD 18 20 CD 40 10 CD 20 21 CD42 11 CD22 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 26 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí 1 CD 1 14 CD 27 2 CD 3 15 CD 29 3 CD 5 16 CD 31 4 CD 7 17 CD 33 5 CD 9 18 CD 35 6 CD 11 19 CD 37 7 CD 13 20 CD 39 8 CD 15 21 CD 41 9 CD 17 22 CD 43 10 CD 19 23 CD 45 11 CD 21 24 CD 47 12 CD 23 25 CD 49 13 CD 25 4.2.1 Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí Tên dòng Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Màu sắc Stt vi khuẩn khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc 1 CD 2 tròn lài nguyên Xám 2 CD 12 tròn lài nguyên Xám 3 CD 14 tròn lài nguyên Xám 4 CD 6 tròn lài nguyên Xám 5 CD 18 tròn lài nguyên Xám 6 CD 32 tròn lài nguyên Xám 7 CD 34 tròn lài nguyên Xám 8 CD 40 tròn lài nguyên Xám 9 CD8 tròn lài Gợn sóng xám 10 CD 20 tròn lài gợn sóng Xám 11 CD 26 tròn lài Gợn sóng Xám 12 CD28 tròn lài Gợn sóng Xám 13 CD 38 tròn lài gợn sóng Xám 14 CD 4 không đều phẳng chia thùy trắng đục 15 CD 10 hình thoi phẳng gợn sóng trắng đục 16 CD 16 tròn lài nguyên trắng đục 17 CD 22 không đều lài gợn sóng trắng đục 18 CD 24 tròn Cầu chồng nguyên Trong 19 CD 30 tròn mô nguyên trắng đục 20 CD 36 tròn phẳng nguyên Xám 21 CD 42 tròn mô nguyên Trong Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 27 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 9 cho thấy: đa số khuẩn lạc các dòng vi khuẩn hiếu khí có dạng hình tròn, bìa nguyên, lài, chuyển màu xám khi vi khuẩn già. Có thể phân nhóm sơ bộ 19 dòng vi khuẩn hiếu khí này này như sau: nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, nguyên, xám có 8 dòng bao gồm CD 2, CD 6, CD 12, CD 14, CD 18, CD 32, CD 34 và CD 40; nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, bìa gợn sóng màu xám có 5 dòng CD 8, CD 20, CD 38, CD 26 và CD 28, 8 dòng vi khuẩn còn lại đều có những đặc điểm khuẩn lạc riêng biệt. CD 28 CD 22 Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 28 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 10: Kết quả quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí Tên dòng Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Màu sắc Stt vi khuẩn khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc khuẩn lạc 1 CD 1 tròn lài nguyên Xám 2 CD 5 tròn lài nguyên Xám 3 CD 21 tròn lài nguyên Xám 4 CD 3 tròn mô nguyên Trong 5 CD 39 tròn mô nguyên Trong 6 CD 45 tròn mô nguyên Trong 7 CD 7 tròn phẳng nguyên Xám 8 CD 49 tròn phẳng nguyên Xám 9 CD 9 tròn lài răng cưa Xám 10 CD 15 tròn lài răng cưa Xám 11 CD 11 không đều phẳng chia thùy trắng đục 12 CD 13 không đều phẳng chia thùy trắng đục 13 CD 27 tròn cầu chồng nguyên trắng đục 14 CD 29 tròn cầu chồng nguyên trắng đục 15 CD 47 không đều phẳng chia thùy Trong 16 CD 31 không đều phẳng chia thùy Trong 17 CD 17 tròn lài răng cưa Xám 18 CD 19 tròn phẳng Gợn sóng Xám 19 CD 23 tròn lài nguyên trắng đục 20 CD 25 tròn phẳng răng cưa Trong 21 CD 33 tròn lài nguyên trắng đục 22 CD 35 tròn phẳng chia thùy trắng đục 23 CD 37 tròn phẳng nguyên Trong 24 CD 41 tròn lài nguyên Trong 25 CD 43 tròn mô nguyên Xám Dựa vào kết quả bảng 10 cho thấy 25 dòng vi khuẩn kỵ khí có sự đa dạng hơn rất nhiều so với 21 dòng vi khuẩn hiếu khí. Sơ bộ chúng có thể thuộc 15 nhóm vi khuẩn khác nhau. Phần lớn mỗi dòng vi khuẩn có đặc điểm khuẩn lạc riêng; chỉ có một số dòng vi khuẩn có đặc điểm giống nhau như nhóm CD 3, CD 39, CD 45; nhóm CD 15, CD 9; nhóm CD 1, CD 5, CD 21; nhóm CD 11, CD 13; nhóm CD 7, CD 49, nhóm CD 31, CD 47; nhóm CD 27, CD 29. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 29 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 4.2.2 Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí Kích thước Tên dòng Hình dạng Gram Catalase Chuyển vi khuẩn Stt vi khuẩn vi khuẩn vi khuẩn động (μm) (1) (2) (3) (4) (5) (6) 1 CD 2 cầu 0,989 + + - 2 CD 4 cầu 1,484 + + + 3 CD 6 cầu 1,187 + + - 4 CD 8 Que ngắn 1,484-0,989 + + + 5 CD 10 cầu 1,088 + + + 6 CD 12 cầu 1,484 + + + 7 CD 14 cầu 0,989 + + - 8 CD 16 que ngắn 1,978-1,187 + + - 9 CD 18 que ngắn 1,978-1,484 + + - 10 CD 20 cầu 1,187 + + + 11 CD 22 cầu 1,78 + + + 12 CD 24 que ngắn 1,484- 0,79 + + - 13 CD 26 que ngắn 1,78-2,769 + + - 14 CD 28 cầu 2,474 + + + 15 CD 30 cầu 1,78 + + - 16 CD 32 que 5,934-1,187 - + + 17 CD 34 cầu 0,989 + + - 18 CD 36 que ngắn 1,088-1,978 + + - 19 CD 38 cầu 0,989 + + - 20 CD 40 que 4,451-0,989 - + - 21 CD 42 que 3,956-0,989 - + - * (4): Vi khuẩn Gram dương (+), vi khuẩn Gram âm (-) * (5) có hoạt tính catalase (+), không có hoạt tinh catalase (-) * (6) Chuyển động (+), không chuyển động (-) Theo kết quả ở bảng 11, 21 dòng vi khuẩn hiếu khí có 3 dạng: cầu, que ngắn và que. Vi khuẩn hình cầu tồn tại ở 3 trạng thái là cầu đơn (CD 2, CD 6, CD 10, CD 34), cầu đôi (CD 30), hoặc cả cầu đơn và đôi (CD 4, CD 12, CD 20, CD 22, CD 28, CD 38). Vi khuẩn hình que ngắn (CD 4, CD 16, CD 18, CD 24, CD 26, CD 36). Vi khuẩn hình que (CD 32, CD 40, CD 42). Khi tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn, ta nhận thấy tất cả vi khuẩn hình cầu và que ngắn đều thuộc Gram dương, trong khi đó, 3 dòng vi khuẩn hình que là CD 32, CD 40, CD 42 đều thuộc Gram âm. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 30 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Thí nghiệm xác định hoạt tính catalase cho kết quả 21 dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập được đều dương tính với catalase, kết quả này phù hợp, chứng tỏ, 21 dòng vi khuẩn đều sử dụng Oxi trong quá trình sinh trưởng. Qua kết quả khảo sát 21 dòng vi khuẩn hiếu khí ta nhận thấy phần lớn chúng đều không di động; chỉ có 6 trong 19 dòng vi khuẩn là có khả năng chuyển động thể hiện qua khả năng mọc lan rộng quanh vết cấy trên môi trường thạch bán lỏng (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thị Thúy Hằng, 2006). CD 32 CD 42 CD 26 CD 8 Hình 9: Vi khuẩn Gram âm và Gram dương Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 31 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí Kích thước Tên dòng Hình dạng Gram Chuyển vi khuẩn Catalase Stt vi khuẩn vi khuẩn vi khuẩn động (μm) 1 CD 1 cầu 1,484 + + - 2 CD 3 cầu 1,187 + + - 3 CD 5 cầu 1,187 + + - 4 CD 7 cầu 0,989 + + - 5 CD 9 que ngắn 1,978-1,088 - - + 6 CD 11 cầu 1,978 - + + 7 CD 13 cầu 1,978 - + + 8 CD 15 que 0,79-5,44 - - + 9 CD 17 cầu 1,484 - + + 10 CD 19 cầu 0,989 - + - 11 CD 21 cầu 1,484 + + - 12 CD 23 cầu 1,78 + + - 13 CD 25 cầu 1.484 + + - 14 CD 27 cầu 1.978 - + + 15 CD 29 cầu 1.978 + + - 16 CD 31 cầu 0,989 + + + 17 CD 33 cầu 1,484 + + + 18 CD 35 cầu 1,78 + + + 19 CD 37 que ngắn 1,178-1,978 + + + 20 CD 39 que ngắn 0,989-2,474 - + - 21 CD 41 cầu 0,989 + + - 22 CD 43 que 3,462-0,989 - + - 23 CD 45 cầu 1,484 - + - 24 CD 47 cầu 1.484 + + + 25 CD 49 que 1,978 - + + Theo kết quả bảng 12, 25 dòng vi khuẩn kỵ khí có 3 dạng: vi khuẩn hình cầu, vi khuẩn que ngắn và vi khuẩn hình que. Ở dạng cầu khuẩn, tồn tại 3 trạng thái vi khuẩn, cầu đơn (CD 1, CD 3, CD 21, CD 23, CD 25, CD 27, CD 29, CD 31, CD 33, CD 41), cầu đôi và đơn (CD 5, CD 7, CD 17, CD 19, CD 35, CD 45) cầu chùm (CD 11, CD 13). Vi khuẩn dạng que ngắn gồm có các dòng CD 9, CD 37, CD 39. Vi khuẩn dạng que có các dòng CD 15, CD 45, CD 49. Khi tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn, trong nhóm 18 cầu khuẩn đa số thuộc nhóm Gram dương, có 5 dòng cầu khuẩn thuộc nhóm Gram âm: CD 11, CD 13, CD 17, CD 19, CD 45. Trong khi đó, 6 dòng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hình que và que ngắn, đa số thuộc nhóm Gram âm, chỉ có dòng CD 37 thuộc nhóm Gram dương. Kết quả bảng 11 cho thấy phần lớn vi khuẩn 23 trong 25 dòng vi khuẩn đều có hoạt tính catalase; điều này chứng tỏ 24 dòng vi khuẩn này là nhóm vi khuẩn kỵ khí Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 32 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT không bắt buộc. Duy chỉ có 02 dòng vi khuẩn CD 9 và CD 15 là âm tính catalase điều này cho thấy CD 9 và CD 15 là 2 dòng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Qua kết quả khảo sát khả năng di động của 25 dòng vi khuẩn kỵ trên môi trường thạch bán lỏng cho thấy chúng cũng chia làm 02 nhóm. Một nhóm có khả năng di động thể hiện qua khả năng mọc lan rộng quanh vết cấy bao gồm CD 11, CD 13, CD 15, CD 17, CD 27, CD 31, CD 33, CD 35, CD 37, CD 47, CD 49 trong đó 6 dòng vi khuẩn hình que đều có khả năng di động; nhóm còn lại không có khả năng di động. 4.3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC Cơ chất cellulose nhân tạo có nhiều loại, trong đó, CMC là cơ chất cellulose thường được dùng để xác định sự hiện diện và hoạt lực của enzyme endoglucanases. (Lee et al., 2002). Qua kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của 46 dòng vi khuẩn, trong đó có 21 dòng vi khuẩn hiếu khí (bảng 16, phụ lục 2), 25 dòng vi khuẩn kỵ khí (bảng 17, phụ lục 2), cho thấy có 14 dòng vi khuẩn hiếu khí và 11 dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân cơ chất CMC ở nhiều mức độ khác nhau. hoạt tính thủy phân CMC hiếu khí 45 a a a a ab a 40 bc bc bc c mm) ( 35 d n d â 30 ph y 25 e ủ th 20 h n í f k 15 g n 10 ườ 5 đ 0 0 CD 2CD 4CD8 CD CD CD CD CD CD CD CD28 CD CD CD CD 10 14 16 18 20 22 26 32 34 38 42 dòng vi khuẩn hiếu khí Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí Trong 21 dòng vi khuẩn hiếu khí, thì có 14 dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân cơ chất CMC bao gồm CD 4, CD 8, CD 10, CD 14, CD 16, CD 18, CD 20, CD 22, CD 26, CD 28, CD 32, CD 34, CD 38, CD 42, trong đó, dòng CD 10, CD 20, CD Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 33 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 26, CD 22 có đường kính thủy phân (đktp) lớn nhất vào khoảng 40,3-41,3 mm và khác biệt không ý nghĩa với dòng CD28 (39.3mm) nhưng khác biệt ý nghĩa với các dòng vi khuẩn còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Các dòng vi khuẩn CD 2, CD 6, CD 12, CD 24, CD 30, CD 36, CD 40 điều chưa có khả năng thủy phân cơ chất CMC. Kết quả này cho thấy dòng vi khuẩn CD 28 với đktp 41,3mm có hoạt lực endoglucanase cao hơn kết quả khảo sát vòng tròn đường kính thủy phân của vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân cellulose được phân lập từ bã mía đang phân hủy (Nguyễn Văn Chắc et al., 2009) với đường kính thủy phân lớn chất là 30mm, cao hơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập từ con sùng (Nguyễn Phú Cường và Võ Văn Song Toàn, 2011) với kết quả đường kính thủy phân lớn nhất là 26,67mm. Dòng CD220 Dòng CD 26 Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 34 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT HOẠT TÍNH THỦY PHÂN CMC CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ 60 a 50 mm) b b b ( bc bc bc bc bc N 40 c HÂ P Y Ủ 30 TH 20 NH Í K d G 10 N 0 ƯỜ Đ 0 CD 1 CD 5 CD 9CD 11CD 13CD 15CD 17CD 19CD 21CD 29CD 35CD 49 DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí Trong 25 dòng vi khuẩn kỵ khí có 11 dòng vi khuẩn có khả năng thủy phân cơ chất CMC, bao gồm: CD 5, CD 9, CD 11, CD 13, CD 15, CD 17, CD 19, CD 21, CD 29, CD 35, CD 49. Trong đó, dòng CD 11 có vòng tròn đường kính thủy phân lớn nhất là 56mm, khác biệt ở mức ý nghĩa 95 % với các dòng vi khuẩn còn lại. Các dòng CD 1, CD 3, CD 7, CD 25, CD 27, CD 29, CD 33, CD 35, CD 39, CD 41, CD 43, CD 45, CD 47, CD 49 đều chưa thể hiện khả năng thủy phân cơ chất CMC. Kết quả này cho thấy dòng vi khuẩn CD 11 với đường kính thủy phân 56mm có hoạt lực endoglucanase cao hơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí được phân lập từ dạ cỏ trâu bò (Võ Chí Đức et al., 2009) với đktp lớn chất là 23,35mm, cao hơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí được phân lập từ con sùng (Nguyễn Phú Cường và Võ Văn Song Toàn, 2011) với kết quả đường kính thủy phân lớn nhất là 24mm. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 35 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Dòng CD 21 Dòng CD 35 Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 21 và CD 35 è Từ kết quả thí nghiệm 3, chọn được 6 dòng vi khuẩn hiếu khí (CD 10, CD 20, CD 22, CD 26, CD 28, CD 34) và 6 dòng vi khuẩn kỵ khí (CD 11, CD 15, CD 17, CD 21, CD 35, CD 49) có hoạt tính thủy phân CMC cao và khác biệt có ý nghĩa với nhóm vi khuẩn còn lại, để tiến hành khảo sát hiệu suất thủy phân CMC ở thí nghiệm 5. 4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía Để thủy phân hoàn toàn bã mía cũng như các cơ chất cellulose tự nhiên khác, vi khuẩn cần có đầy đủ hệ enzyme cellulase, đặc biệt là enzyme exoglucanases để phá vỡ cấu trúc vùng tinh thể của cellulose. Do đó các cơ chất cellulose thường được dùng để đánh giá sự hiện diện của enzyme exocellulase và hoạt lực của toàn bộ hệ enzyme cellulase. (Yung et al., 2009) Qua kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của 46 dòng vi khuẩn, trong đó có 21 dòng vi khuẩn hiếu khí (bảng 18, phụ lục 2), 25 dòng vi khuẩn kỵ khí (bảng 19, phụ lục 2), cho thấy có 11 dòng vi khuẩn hiếu khí và 8 dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân cơ chất CMC ở nhiều mức độ khác nhau. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 36 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT HOẠT TÍNH THỦY PHÂN BÃ MÍA 40 a a m) ab ab m ( 35 bc cd cd ÂN 30 H P de 25 e Y Ủ e e 20 TH 15 f NH Í K 10 NG 5 0 ƯỜ Đ 0 CD 2 CD 10CD 14CD 16CD 20CD 22CD 24CD 26 CD28 CD 30CD 32CD 38CD 40 DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí Khảo sát 21 dòng vi khuẩn hiếu khí thì có 10 dòng vi khuẩn có xuất hiện vòng halo trên đĩa thạch gồm: CD 10, CD 14, CD 16, CD 20, CD 22, CD 24, CD 26, CD 28, CD 30, CD 38, CD 40. Trong đó, dòng vi khuẩn CD 22 và CD 26 có đktp lớn nhất lần lượt là 37mm và 36 mm, khác biệt không ý nghĩa với dòng vi khuẩn CD 24 và CD 28 nhưng khác biệt nghĩa ở mức 5% với các dòng vi khuẩn còn lại. Kết quả này cho thấy dòng vi khuẩn CD 22 với đktp 37mm có hoạt lực thủy phân bã mía cao hơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân của các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ bã mía đang phân hủy (Nguyễn Thị Thanh Trúc et al., 2011) với đường kính thủy phân lớn chất là 5mm, cao hơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân của các dòng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ ruột mối trên cơ chất bột gỗ xoài (Nguyễn Phú Cường et al., 2011) với kết quả đường kính thủy phân lớn nhất là 25mm. Kết quả khảo sát hoạt lực thủy phân trên cơ chất bã mía của 21 dòng vi khuẩn hiếu khí có sự khác biệt so với hoạt lực thủy phân trên cơ chất CMC. Các dòng CD 4, CD 8, CD 18, CD 32, CD 34, CD 42 đều có hoạt tính endocellulase, nhưng chưa thể hiện vòng tròn đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía; có khả năng vì các dòng vi khuẩn này không có enzyme exoglucanase; Tuy nhiên, dòng CD 24 và CD 30 không có hoạt tính trên CMC lại có hoạt tính cellulose trên cơ chất bã mía; như vậy, hoạt lực thủy phân bã mía, không phụ thuộc nhiều vào hoạt lực của enzyme endoglucanase. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 37 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT HOẠT TÍNH THỦY PHÂN CƠ CHẤT BÃ MÍA 60 m) a m ( 50 b ÂN c c H 40 P d Y de Ủ 30 ef TH NH Í 20 f K G N 10 ƯỜ Đ 0 0 CD 1 CD 5 CD 11 CD 15 CD 17 CD 21 CD 25 CD 31 CD 43 DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí Có 8 trong 25 dòng vi khuẩn vi khuẩn kỵ khí có khả năng tạo vòng halo trên đĩa thạch với cơ chất bã mía gồm: CD 5, CD 11, CD 15, CD 17, CD 21, CD 25, CD 31, CD 43. Trong đó, dòng CD 15 có vòng halo lớn nhất với đường kính là 49,33mm khác biệt ý nghĩa ở mức 95 % với các dòng vi khuẩn còn lại. Kết quả này cho thấy đường kính thủy phân của dòng vi khuẩn CD 15 cao hơn so với kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân của các dòng vi khuẩn kỵ khí được phân lập từ dạ cỏ dê trên cơ chất bộ rơm (Nguyễn Thị Thanh Thúy và Võ Văn Song Toàn, 2010) với kết quả đường kính thủy phân cao nhất là 32mm. Kết quả này cũng tương tự kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí. Các dòng vi khuẩn CD 9, CD 13, CD 19, CD 29, CD 35, CD 49 có hoạt tính endocellulase chưa thể hiện vòng tròn đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía, và các dòng vi khuẩn CD 25, CD 31, CD 43 thể hiện vòng tròn đường kính thủy phân trên bã mía nhưng không có hoạt tính endocellulase. è Từ kết quả thí nghiệm 4, chọn được 4 dòng vi khuẩn hiếu khí (CD 22, CD 24, CD 26, CD 28) và 4 dòng vi khuẩn kỵ khí (CD 11, CD 15, CD 21, CD 43) thuộc nhóm vi khuẩn có hoạt tính thủy phân bã mía cao, và khác biệt ý nghĩa với nhóm vi khuẩn còn lại, để tiến hành khảo sát hiệu suất thủy phân ở thí nghiệm 6. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 38 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CD 11 CD 26 CD 15 CD 22 Hình 16: Đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn 4.5. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất CMC của một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn Cơ chất CMC là cơ chất cellulose nhân tạo có khả năng hòa tan tốt vào nước, ở mỗi tỉ lệ hòa tan và ở mỗi nhiệt độ pH khác nhau, dung dịch CMC có một độ nhớt khác nhau ( 15/03/2012). Do đó, dựa vào độ nhớt của dung dịch CMC ở cùng một nhiệt độ và pH, ta có thể xác định tỉ lệ phần trăm CMC có trong dung dịch. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ CMC trong dung dịch và độ nhớt cho phép xây dựng đường biểu diễn tương quan y = 118,09x - 61,604 với phương sai R2 = 0,975 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 39 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Chủng 1% dịch vi khuẩn với mật số 107CFU/ml của lần lượt 6 dòng vi khuẩn hiếu khí CD 10, CD 20, CD 22, CD 26, CD 28, CD 34 và 6 dòng vi khuẩn kỵ khí CD 11, CD 15, CD 17, CD 21, CD 35, CD 49 vào 150 ml canh trường 1% cơ chất CMC và tiến hành ủ ở 38oC trong 5 ngày. Độ nhớt của môi trường nuôi cấy vi khuẩn được kiểm tra bằng thiết bị Handheld Viscometer SKF TMVM 1. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CMC 25.00 a 20.00 a HÂN ab P ab ab Y Ủ 15.00 TH b T Ấ 10.00 SU U Ệ HI 5.00 c 0.00 CD 26 CD 28 CD 22 CD 20 CD 10 CD 34 ĐC DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TUYỂN CHỌN Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn từ thí nghiệm 3 cho thấy, cả 6 dòng vi khuẩn được chọn có hiệu suất thủy phân từ 11,137-21,581% và khác biệt có nghĩa với mẫu đối chứng không có vi khuẩn. Hiệu suất thủy phân của các dòng vi khuẩn CD 26, CD 20, CD 22, CD 10, CD 34 không có khác biệt ý nghĩa với nhau ở mức 5%, ngoại trừ dòng CD 28 nhỏ nhất và khác biệt ý nghĩa với các dòng còn lại với độ tin cậy 95%. Trong đó, dòng CD 22 có hiệu suất thủy phân cao nhất là 21,581 %. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 40 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CMC 35.00 a ab 30.00 abc bcd HÂN 25.00 P cd Y Ủ d 20.00 TH T Ấ 15.00 SU U 10.00 Ệ HI e 5.00 0.00 CD 21 CD 15 CD 35 CD 11 CD 17 CD 49 ĐC DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ TUYỂN CHỌN Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn từ thí nghiệm 3 cho thấy, cả 6 dòng vi khuẩn được chọn có hiệu suất thủy phân 19,323-31,179% và khác biệt nghĩa với mẫu đối chứng không có vi khuẩn. Kết quả này cao hơn kết quả hiệu suất thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí. Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí khác biệt với nhau ở mức tin cậy 95%. Trong đó, 2 dòng có hiệu suất thủy phân mạnh nhất là CD 35 và CD 11 với kết quả lần lượt là 31,179% và 30,049%. 4.6. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn Bốn dòng vi khuẩn hiếu khí gồm: CD 22, CD 24, CD 26, CD 28 và 4 dòng vi khuẩn kỵ khí gồm: CD 13, CD 17, CD 23, CD 45 có hoạt tính thủy phân bã mía cao thể hiện qua vòng halo tuyển chọn từ thí nghiệm 4 được nuôi cấy trong 100ml môi trường lỏng 2% cơ chất bã mía đồng nhất với nhau. Sau 5 ngày nuôi ủ ở 38oC tiến hành lọc lấy phần cặn và phân tích thành phần xơ bằng máy phân tích xơ VELP. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 41 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 10.00 HIỆU SUẤT THỦY PHÂN XƠ BÃ MÍA a 9.00 ÂN H 8.00 P Y 7.00 Ủ 6.00 TH 5.00 T b b Ấ 4.00 bc SU 3.00 U Ệ 2.00 c HI 1.00 0.00 CD11 CD15 CD43 CD21 ĐC DÒNG VI KỴ KHÍ TUYỂN CHỌN Hình 19: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn Kết quả sau 5 ngày nuôi lỏng, các dòng vi khuẩn đã thủy phân được từ 2,9343% đến 8,8867 % cơ chất bã mía và khác biệt có ý nghĩa với mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn. Đặc biệt dòng vi khuẩn CD 15 có hiệu suất thủy phân cao nhất là 8,8867% khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% với 3 dòng vi khuẩn còn lại. Kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN XƠ BÃ MÍA a ÂN 10.00 H P b 8.00 Y bc Ủ c 6.00 TH T Ấ 4.00 SU 2.00 c U Ệ HI 0.00 CD26 CD28 CD24 CD22 ĐC DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TUYỂN CHỌN Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 42 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Kết quả sau 5 ngày nuôi lỏng, hiệu suất thủy phân bã mía của 4 dòng vi khuẩn hiếu khí được tuyển chọn vào khoảng 5,7287% – 9,3147% trong số đó dòng vi khuẩn CD 22 có hiệu suất thủy phân cao nhất với 9,3147% bã mía được thủy phân. 4.7. Kết quả định danh một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp định danh sinh hóa Từ kết quả thí nghiệm 5 và thí nghiệm 6 tuyển chọn được 4 dòng có hiệu suất thủy phân cao: Bảng 13: hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh Hiệu suất Hiệu suất thủy Tên dòng STT thủy phân CMC phân bã mía vi khuẩn (%) (%) 1 CD 22 21,58 9,31 2 CD 26 16,22 7,49 3 CD 11 21,30 8,89 4 CD 15 30,05 2,93 DÒNG CD 22 Kết quả định danh: dòng CD 22 có khả năng sử dụng các loại đường : L- Arabinose, Palatinose, D-Rhamnose, D-xylose, L- Fucose, D-Melezitose, D-Ribose, Glycyl-L-Glutamic acid, Tween 80, Gentiobiose, làm nguồn carbon trong quá trình phát triển, tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus. Theo nghiên cứu về vi khuẩn acid lactic từ sữa và các phụ phẩm lên men (Karna et al., 2007) có dòng Pediococcus pentosaceus EL-5 dạng cầu khuẩn Gram dương, khuẩn lạc màu trắng đục và chảy lan trên bề mặt môi trường thạch, đặc điểm này giống với đặc điểm về hình dạng khuẩn lạc và vi khuẩn của dòng CD 22. Và dòng Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 thuộc nhóm vi khuẩn Pediococcus pentosaceus có khả năng thủy phân cellulose ( IMAGE?object=Cellulose-Degradation, 25/04/2012) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 43 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22 DÒNG CD 26 Kết quả định danh: dòng vi khuẩn CD 26 có khả năng sử dụng các loại đường L-Arabinose, D- Xytose, D-Ribose làm nguồn carbon, tương đồng ở mức 73% với dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi (Corynebacterium). Theo kết quả nghiên cứu của Wan và Lau Abdullah (2010), dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi phân lập được có dạng khuẩn lạc cầu, nổi mô ở giữa, vi khuẩn qua Gram dương, kết quả này cũng tương đồng với kết quả từ thí nghiệm 2. Theo kết quả nghiên cứu của M. Ramin et al. (2008) đã phân lập được 3 dòng vi khuẩn từ mối có khả năng sử dụng CMC và Cellulose làm nguồn cacbon trong đó có dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 44 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CD Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26 DÒNG CD 11 và CD 15 Qua kết quả định danh cho thấy: dòng CD 11 và CD 15 không có kết quả tương đồng ý nghĩa về khả năng sử dụng đường với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng của hệ thống Biolog. Tuy nhiên, vì vi khuẩn nhóm GP2 trong ngân hàng hệ thống Biolog chỉ có 310 dòng, do đó, có thể vi khuẩn dòng CD 11 không thuộc nhóm những dòng có sẵn, nên kết quả định danh không chính xác. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 45 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đề tài đã phân lập được 46 dòng vi khuẩn, trong đó có 21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí, và 25 dòng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí. Tất cả các dòng vi khuẩn đều phát triển tốt trong nhiệt độ 38oC sau 48 giờ. Qua khảo sát đường kính thủy phân và hiệu suất thủy phân trên cơ chất CMC và bã mía, đã tuyển chọn được 4 dòng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11, CD 15 có hoạt tính enzyme cellulase cao với hiệu suất thủy phân sau 5 ngày nuôi trong môi trường lỏng với cơ chất CMC lần lượt là 21,58%, 16,22%, 30,05% và 21,3%, hiệu suất thủy phân sau 5 ngày nuôi trong môi trường lỏng cơ chất bã mía lần lượt là 9,31%, 7,49%, 2,93% và 8,89%. Định danh bằng hệ thống Biolog Microlog Microstation Automated Identification System cho thấy dòng vi khuẩn CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus và dòng CD 26 tương đồng ở mức 73% với dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi (Corynebacterium). 5.2. Đề nghị Giải trình tự các dòng vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose cao: CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15. Khảo sát hệ enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn tuyển chọn. Khảo sát khả năng thủy phân một số cơ chất tự nhiên khác như rơm rạ, giấy của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đề tài. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 46 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Bài giảng thực hành vi sinh vật đại cương. Viện NC và PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Hà Thanh Toàn, Trương Thị Nhật Tâm, Cao Ngọc Điệp. 2010. Khả năng phân hủy rác thải hữu cơ của vi khuẩn phân giải cellulose (cellulolytic bacteria). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ. 16b. 189 – 198. Hồ Sĩ Tráng. 2003. Cơ sở hóa học gỗ và cellulose tập 1. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 1 – 31. Hồ Sĩ Tráng. 2004. Cơ sở hóa học gỗ và cellulose tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 185 – 191. Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 377 – 389. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền, Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm công nghệ vi sinh vật tập 2 _ thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 121 – 124. Nguyễn Hoài Phong, Nguyễn Thành Lâm, Phạm Tấn Việt, Nguyễn Khánh Hoàng. 2003. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose từ nguyên liệu mạt dừa ở Bến Tre. Nguyễn Lân Dũng. Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2008. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục, trang 240. Nguyễn Thị Thu Thủy. 2011. Giáo trình thực tập hóa học thực phẩm. Khoa NN và SHUD, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thị Thúy Hằng. 2006. Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi khuẩn. Vietsciences. Nguyễn Phú Cường, Võ Văn Song Toàn, Nguyễn Châu Tuấn, Nguyễn Thị Thanh Thúy. 2011. Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ hệ tiêu hóa của con mối. Đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Thanh Trúc, Võ Văn Song Toàn, Dương Thị Hương Giang. 2011. Tuyển chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy các dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân bã mía. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 47 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Nguyễn Văn Chắc, Võ Văn Song Toàn, Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong bã mía đang phân hủy. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Chương, Đỗ Thị Hoài Anh. 2007. Chuyên đề năng lượng chương 10 _ Năng lượng sinh khối. Vnggenergy. Nguyễn Vũ Hoàng Sơn, Võ Văn Song Toàn, Dương Thị Hương Giang. 2010. Khảo sát điều kiện nuôi cấy một số dòng vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp cellulase thủy phân mụn dừa. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Vũ Minh Hạnh. 2011. Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban. 2008. Giáo trình chăn nuôi trâu bò. Trường Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội, trang 58 – 62. Phạm Thị Ánh Hồng. 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 102 – 117. Võ Chí Đức, Võ Văn Song Toàn, Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ và phân trâu bò. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Võ Hoài Bắc, Lê Thị Hương Thủy, Lê Thị Lan Anh. 2010. Phân lập chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar. Viện Nghiên cứu Hải sản. Võ Văn Phước Quệ, Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose. Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ. Tập18a. Trang 177-184. Tài liệu tiếng Anh Barbara S. Shane L. Gouws and A. Kistner. 1969. Cellulolytic Bacteria Occurring in the Rumen of Sheep Conditioned to Low-protein Teff Hay. J. gen. Microbiol. pp 445-457. B.K.L. Karna, O.C. Emata, V.L. Baraquio. 2007. Lactic acid and probiotic bacteria from fermented and probiotic dairy products. Science diliman. 19:2. pp. 23 – 34. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 48 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Chen J, Weimer P. 2001. Competition among three predominant ruminal cellulolytic bacteria in the absence or presence of non-cellulolytic bacteria. FEMS Microbiology Letters. Vol 147. pp. 20 – 30. Issay Isaias and Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1980. Small-scale cane sugar processing and residue utilization. Rome : Food and Agriculture Organization of the United Nations. Jindou. S, Brulc. J. M., Levy-Assaraf. M, Rincon MT, Flint HJ, Berg ME, Wilson MK, White BA, Bayer EA, Lamed R, Borovok I. 2008. Cellulosome gene cluster analysis for gauging the diversity of the ruminal cellulolytic bacterium Ruminococcus flavefaciens. FEMS Microbiology Letters. Volume: 285. pp. 188 – 194. J. Ryckeboer, J. Mergaert, J. Coosemans, K. Deprins and J. Swings. 2002. Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. Journal of Applied Microbiology. 127–137. Lee R. Lynd, Paul J. Weimer, Willem H. van Zyl, and Isak S. Pretorius. 2002. Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. American Society for Microbiology. pp. 506–577. M. Rainin, A.R.Alimon, N.Abdullah, J.M.Panandam and K.Sijam. 2008. Isolation and identification of three species of bacteria from the termite Coptotermes Curvignathus (Holmgren). Research Journal of Microbiology 3 (4). pp 288-292. Oyeleke, S. B. and Okusanmi, T. A. 2008. Isolation and characterization of cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants. African Journal of Biotechnology Vol. 7 (10). pp. 1503-1504. Sudhakaran Pillai. M., Vasudev. R 2001. “Applications of Coir in Agricultural Textiles”. Proceeding International Seminar On Technical Textiles. Theodorou. M. K. & France, J. (1993). Rumen microorganisms and their interactions. In Quantitative Aspects of Ruminan Digestion and Metabolism. Wallingford: CAB International. pp. 145-163. Wan Azlina Ahmad and Nur Humaira’ Lau Abdullah. 2003. Biosorption of Cr(VI) by Non-Living Acinetobacter calcoaceticus genospecies 3 and Clavibacter agropyri Isolated from A Textile Effluent. Universiti Teknologi Malaysia. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 49 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Yung-Chung Loa, Ganesh D. Saratalea,Wen-Ming Chenb, Ming-Der Baic, Jo-Shu Changa,d. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and Microbial Technology . pp. 417–425. Trang web ngày 13/12/2011 Ngày 15/03/2012. ngày 15/03/2012. ngày 15/03/2012. ngày 25/11/2011. 15/03/2012. ngày 25/04/2012. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học - 50 - Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 1 1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Nguyên tắc: Phương pháp phân lập giống thuần đều dựa trên các bước: chuẩn bị mẫu, cấy trãi lên môi trường M1 (cơ chất bã mía), quan sát và cấy chuyển những khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, màu sắc đặc trưng, tiếp tục cấy ria để tách ròng vi khuẩn. Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Đĩa petri và môi trường M1 được khử trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong 20 phút; Khi nhiệt độ nồi khử trùng đã hạ xuống khoảng 450C – 500C thì tiến hành phân phối môi trường vào đĩa petri; sau đó khử trùng bằng tia UV, để môi trường nguội ta đem ủ ở 38oC trong 48 giờ để chọn đĩa petri không nhiễm dùng cho quá trình phân lập. Đồng nhất mẫu: Đồng nhất mẫu dịch dạ cỏ: Dịch dạ cỏ thu ở ba vị trí khác nhau ở cùng một địa điểm thu mẫu cho vào ống falcon 50ml (bổ sung 10ml nước muối sinh lý), wotex ống mẫu, để lắng khoảng 10 phút, thu dịch huyền phù của mẫu và tiến hành pha loãng, cấy trải. Sau khi đồng nhất mẫu xong thì tiến hành pha loãng mẫu như sau Nồng độ pha loãng: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Thể tích mẫu (µl) : 100 100 100 100 100 Thể tích nước cất (µl): 900 900 900 900 900 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Hình 23: Sơ đồ phương pháp pha loãng mẫu (Nguồn: ngày 13/12/2011) Cấy trải vi sinh vật Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10-5, 10-4, 10-3 và 102 để tiến hành cấy trải. Dùng micropipet hút 15µl dịch vi khuẩn ở mỗi nồng độ, nhỏ vào giữa đĩa petri (môi trường M1), sau đó dùng que trải dàn đều giọt vi khuẩn trên khắp mặt thạch đĩa để mẫu khô tự nhiên. Mỗi nồng độ cấy trãi lên 2 đĩa, một đĩa ủ ở điều kiện hiếu khí và một đĩa còn lại ủ ở điều kiện kỵ khí. Đối với vi sinh vật hiếu khí: Mẫu được ủ ở 38oC trong 48 giờ. Đối với vi sinh vật kỵ khí: Mẫu được ủ trong bình hút ẩm kỵ khí, ủ ở 38oC trong 48 giờ. Tiếp tục cấy trãi lần thứ 2 để tiếp tục chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau Chọn những khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa để cấy trải lần thứ 2. Tiếp tục cấy chuyển vi khuẩn theo phương pháp cấy ria 3-5 lần nữa. Lưu ý: Tất cả các thao tác trên (đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển) phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. ¶ Mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc Mục tiêu thí nghiệm: mô tả một số đặc điểm hình thái của khuẩn lạc bao gồm: hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Nguyên tắc: khuẩn lạc là tập đoàn vi khuẩn được sinh ra từ một tế bào hay một bào tử có trước. Mỗi loại vi khuẩn có đặc điểm riêng tùy theo cách phát triển của từng nhóm vi khuẩn mà hình thái của khuẩn lạc có hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc khác nhau. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Các bước tiến hành thí nghiệm: Cấy vi khuẩn lên đĩa petri, vi khuẩn phát triển tạo thành những khuẩn lạc sau 2-4 ngày ủ ở 38oC. Khi quan sát dưới kính lup, mỗi khuẩn lạc được mô tả dựa vào các đặc điểm sau: + Hình dạng: dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular); dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ (rhizoid). + Độ nổi: Dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc (phía vành khuẩn lạc lài xuống; dạng mô (convex) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate). + Dạng bìa: có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous). + Màu sắc: Khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ, vàng, lục, + Kích thước khuẩn lạc: Phản ánh tuổi của khuẩn lạc, khi bắt đầu hình thành chỉ bằng đầu kim (1-2 mm) và khuẩn lạc phát triển ngày càng rộng ra có thể chiếm hết bề mặt đĩa petri. Chỉ tiêu theo dõi: - Khuẩn lạc: hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc ¶ Mô tả đặc điểm của vi khuẩn Mục tiêu thí nghiệm: Mô tả một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng (cầu, que, xoắn, hay hình dấu phẩy), kích thước (khoảng 0,2 –2 µm), trạng thái (đơn lẻ, kết đôi, kết chuỗi, hay kết chùm), khả năng chuyển động của vi khuẩn. Các bước tiến hành thí nghiệm: a) Quan sát hình dạng bằng phương pháp giọt ép. - Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn. - Chấm đầu kim cấy vào khuẩn lạc, hòa lẫn vi khuẩn vào giọt nước trên kính mang vật. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT - Dùng kính đậy vật (lamelle) đậy lên giọt nước bằng cách cho cạnh kính đậy vật một góc 45o, rồi hạ từ từ kính đậy vật sao cho đừng có bọt khí trong mẫu. - Quan sát hình dạng của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 100X. ¶ Nhuộm Gram vi khuẩn Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884 để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae Mục đích: Xác định loại Gram của vi khuẩn. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau Bảng 14: Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn Giai đoạn Gram dương Gram âm Crystal violet Tế bào nhuộm tím xanh Tế bào nhuộm tím xanh Dung dịch iod Iod dán crystal violet Crystal violet vẫn không bám bám chặt vào vách tế bào chặt vào tế bào Rữa bằng cồn Không tẩy Crystal violet Tẩy crystal violet ra khỏi vách aceton tế bào Safranin hay Vì vách tế bào còn Vì vách tế bào khồng còn Fuchsin Crystal violet nên có màu tím Crystal violet nên có màu hồng của xanh Fuchsin (* Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2008) Các bước nhuộm Gram vi khuẩn: Chuẩn bị mẫu vật: Nhỏ 1 giọt nước đã khử trùng ( trong chai có ống đếm giọt) lên giữa kính mang vật. Hơ nóng đầu kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc cho vào giọt nước, trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Lướt mặt dưới của kính mang vật trên ngọn lửa cách khoảng 10 cm khoảng 3 lần để giết chết vi sinh vật và dàn chúng lên kính mang vật. Sau khi đã cố định mẫu vật, tiếp lục các bước sau: Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây. Rửa nước từ 2 – 3 giây; chậm nhẹ cho khô bớt nước. Nhỏ dung dịch iod trong 60 giây. Rửa nuớc, châm nhẹ. Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, để khi giọt cồn + aceton không còn màu tím nữa. Rửa nước vài giây, chậm nhẹ. Nhỏ Fuchsin haay Safranin từ 1 – 2 giọt để trong 60 giây. Rửa nước vài giây. Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nuớc. Quan sát dưới kính hiển vi. ( Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2008) ¶ Kiểm tra khả năng di động Vật liệu, hoá chất: Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch). Các bước tiến hành: - Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. Kết quả: - Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. - Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ quan sát ở phần trên của vết cấy. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 1.2. Phương pháp khảo sát đường kính thủy phân Nguyên tắc: Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn trên môi trường có Congo Red Ind. Congo red có khả năng tạo tạo liên kết với cầu nối β 1-4 glucosid, và bắt màu đỏ. Trên môi trường cơ chất cellulose có bổ sung congo red vi khuẩn sẽ phân hủy cellulose trong cơ chất tạo thành vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của vi khuẩn. Khi enzyme cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy làm cho độ đục của môi trường bị giảm đi, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỉ lệ với độ họat động của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2003) Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (mỗi dòng vi khuẩn), 2 thừa số (2 cơ chất), 3 lần lặp lại. Tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Vi khuẩn đã phân lập ròng cấy chuyển ra đĩa petri (có bổ sung yeast extract 0,1%) , ủ 2 ngày ở 38oC. Bước 2: Rút 2ml nước muối sinh lý đã khử trùng cho vào đĩa vi khuẩn, dùng kim cấy gạt trên bề mặt môi trường cho toàn bộ khuẩn lạc vi khuẩn tan vào nước, sau đó, rút dịch vi khuẩn vào ống ependorf 1,5ml. Bước 3: Nhỏ 15- 20 µl dịch vi khuẩn trên giếng thạch môi trường M1 có đường kính 5-6mm, để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch và khô tự nhiên, úp ngược đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ; sau đó được nhuộm với dung dịch Congo Red 0,1 % trong 60 phút và rửa bằng nước muối 1M, sau đó để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Đo vòng tròn hoạt tính bắt màu nhạt hơn xung quanh giếng thạch Chỉ tiêu quan sát: Hoạt tính thủy phân được tính theo công thức: Hoạt tính = đường kính thủy phân – đường kính lỗ đục 1.3. Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía Mục đích: khảo sát hàm lượng cellulose bị mất đi trong quá trình vi khuẩn sử dụng bã mía làm nguồn carbon trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Tiến hành thí nghiệm Ø Bước 1: Cân khối lượng mẫu ban đầu Ø Bước 2: Cân khối lượng mẫu khi kết thúc quá trình nuôi cấy vi khuẩn (sau 5 ngày). Ø Bước 3: Tính hiệu suất thủy phân cellulose Hiệu suất = Go – G1 G0: phần trăm cellulose ban đầu G1: phần trăm cellulose sau thủy phân 1.4. Khảo sát sự giảm độ nhớt của dung dịch CMC sau nuôi cấy Nguyên tắc: Máy đo độ nhớt handheld Viscometer SKF TMVM1 được sử dụng để đo độ nhớt của dung dịch cơ chất trước và sau khi nuôi cấy. Sau đó, dựa vào độ nhớt của dung dịch và đường chuẩn tỉ lệ giữa độ nhớt và phần trăm CMC, tính toán và đưa ra kết quả phần trăm CMC có trong mẫu Tiến hành: Đo biên độ và vận tốc quay của mẫu bằng máy SKF TMVM1. Mẫu đối chứng được tiến hành với dung dịch môt trường không chủng vi khuẩn. Hiệu suất thủy phân CMC = (1 - Cm) (%) Trong đó: - 1: phần trăm CMC cho vào môi trường lỏng lúc đầu - Cm: phần trăm CMC trong dịch nuôi vi khuẩn sau 5 ngày Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 1. Kết quả hoạt tính thủy phân CMC Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía nguyên liệu khối lượng bã Hàm lượng Hàm lượng lặp lại mía ban đầu ẩm độ khoáng (g) (%) (%) lần 1 3 7,9 3,67 lần 2 3 8,02 3,53 lần 3 3 7,95 3,58 Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía nguyên liệu bã mía khối lượng xơ Hàm lượng xơ lặp lại ban đầu sau phân tích (%) (g) (g) lần 1 1 0, 5766 57,66 lần 2 1 0,5731 57,31 lần 3 1 0,6073 60,73 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí đường kính thủy phân CMC Tên dòng STT (mm) vi khuẩn lần 1 lần 2 lần 3 TB 1 CD 2 0 0 0 0 2 CD 4 38 35 38 37bc 3 CD 6 0 0 0 0 4 CD8 36 37 37 36,6bc 5 CD 10 40 43 41 40,7a 6 CD 12 0 0 0 0 7 CD 14 30 34 26 30d 8 CD 16 23 24 24 23,7e 9 CD 18 13 11 14 12,7f 10 CD 20 40 42 40 40,7a 11 CD 22 39 40 39 39,3ab 12 CD 24 0 0 0 0 13 CD 26 40 41 40 40,3a 14 CD28 43 40 41 41,3a 15 CD 30 0 0 0 0 16 CD 32 30 31 33 33d 17 CD 34 41 41 40 40,7a 18 CD 36 0 0 0 0 19 CD 38 34 38 39 37bc 20 CD 40 0 0 0 0 21 CD 42 37 37 32 35,3c %Cv = 5,341% Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ tin cậy 95%. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí đường kính thủy phân CMC Tên dòng STT (mm) vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 1 CD 1 0 0 0 0 2 CD 3 0 0 0 0 3 CD 5 42 42 40 41,3bc 4 CD 7 0 0 0 0 5 CD 9 44 40 43 42,3bc 6 CD 11 60 58 50 56a 7 CD 13 36 37 38 37c 8 CD 15 40 43 41 41,3bc 9 CD 17 48 40 42 43,3b 10 CD 19 38 40 42 40bc 11 CD 21 44 44 42 43,3b 12 CD 23 0 0 0 0 13 CD 25 0 0 0 0 14 CD 27 0 0 0 0 15 CD 29 10 11 10 10,3d 16 CD 31 0 0 0 0 17 CD 33 0 0 0 0 18 CD 35 41 43 42 42bc 19 CD 37 0 0 0 0 20 CD 39 0 0 0 0 21 CD 41 0 0 0 0 22 CD 43 0 0 0 0 23 CD 45 0 0 0 0 24 CD 47 0 0 0 0 25 CD 49 37 41 52 43,3b %Cv = 8,49% Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ tin cậy 95%. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Trường ĐHCT 2. Kết quả hoạt tính thủy phân bã mía Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí: Tên dòng đường kính thủy phân STT vi khuẩn (mm) lần 1 lần 2 lần 3 TB 1 CD 2 0 0 0 0 2 CD 4 0 0 0 0 3 CD 6 0 0 0 0 4 CD 8 0 0 0 0 5 CD 10 20 18 20 19,3e 6 CD 12 0 0 0 0 7 CD 14 20 21 19 20e 8 CD 16 23 24 24 23,7de 9 CD 18 0 0 0 0 10 CD 20 22 22 24 22,7e 11 CD 22 38 36 37 37a 12 CD 24 30 36 35 33,7ab 13 CD 26 39 33 36 36a 14 CD28 32 44 30 35,3ab 15 CD 30 26 32 34 30,7bc 16 CD 32 30 29 25 28cd 17 CD 34 0 0 0 0 18 CD 36 0 0 0 0 19 CD 38 26 30 28 28cd 20 CD 40 12.5 14 12 12,8f 21 CD 42 0 0 0 0 %Cv = 11,37% Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ tin cậy 95%. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC & PT Công nghệ sinh học