›

Nghiên cứu khoa học Khảo sát thành phần hoá học và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài trồng ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu

pdf 68 trang thiennha21 14/04/2022 5341
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Nghiên cứu khoa học Khảo sát thành phần hoá học và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài trồng ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfde_tai_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_va_kha_nang_khang_khuan_c.pdf

Nội dung text: Nghiên cứu khoa học Khảo sát thành phần hoá học và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài trồng ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT LÁ XOÀI TRỒNG Ở TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU Trình độ đào tạo: Đại học – Chính quy Ngành: Công Nghệ Hoá Học Chuyên ngành: Hoá Dược Giảng viên hướng dẫn: Th.S Lê Thị Thu Dung Sinh viên thực hiện: Phạm Thái Quang MSSV: 15031541 Lớp: DH15HC Bà Rịa-Vũng Tàu, năm 2019
  2. ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN 1. Thái độ tác phong khi tham gia đồ án: 2. Kiến thức chuyên môn: 3. Nhận thức thực tế: 4. Đánh giá khác: Bà Rịa – Vũng Tàu, ngày 22 tháng 6 năm 219 Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) ThS. Lê Thị Thu Dung
  3. NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN 1.Thái độ tác phong khi làm việc: 2. Kiến thức chuyên môn: 3. Đánh giá khác: Bà Rịa – Vũng Tàu, ngày 22 tháng 6 năm 2019 Giảng viên phản biện (Ký và ghi rõ họ tên) Th.S Nguyễn Quang Thái
  4. MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH ẢNH iii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về cây xoài: [2], [4], [9] 4 1.1.1 Đặc điểm thực vật 4 1.1.2 Tình hình sử dụng trong y học của cây xoài [2] 6 1.1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá xoài [2] [18] [17] : 8 1.2. Hoạt tính sinh học của cao chiết lá xoài [2] 11 1.3. Quy trình chiết tách tạo cao chiết lá xoài: 14 1.3.1 Một số quy trình chiết xuất tạo cao trong và ngoài nước 14 1.3.2 Quy trình chiết cao lá xoài áp dụng trong báo cáo 16 1.3.3 Ảnh hưởng của dung môi, nồng độ dung môi : 16 1.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích dung môi/khối lượng nguyên liệu và thời gian ngâm dầm : 17 1.4 Giới thiệu về kháng khuẩn, chống oxy hoá : 17 1.4.1 Tính kháng khuẩn : 17 1.4.2 Tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá của cao chiết lá xoài : 20 1.4.3 Một số ứng dụng trong dược – mỹ phẩm : 21 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 24 2.1 Đối tượng, thiết bị, dụng cụ, hoá chất nghiên cứu: 24 2.2 Quy trình chiết tách tạo cao lá xoài: 25 2.3 Khảo sát điều kiện chiết tách tối ưu: 29 2.3.1 Lựa chọn dung môi 29 2.3.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 29 2.3.3 Khảo sát nồng độ của dung môi : 29 2.3.4 Khảo sát thời gian ngâm dầm : 30 2.4. Phương pháp định tính thành phần hoá học cao lá xoài bằng phương pháp màu đặc trưng: 30 2.5. Phương pháp quang phổ GC-MS 34
  5. 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học: 35 2.6.1 Phương pháp đo vòng kháng khuẩn : 35 2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá : 36 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tối ưu hoá quá trình tạo cao chiết lá xoài 38 3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi : 38 3.1.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 39 3.1.3 Kết quả khảo sát nồng độ của dung môi : 40 3.1.4 Kết quả lựa chọn thời gian ngâm dầm : 42 3.2 Kết quả định tính: 43 3.3 Kết quả xác định cấu tử bằng GCMS 44 3.4 Hoạt tính của cao chiết lá xoài tách được: 49 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn : 49 3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa 52 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
  6. DANH MỤC VIẾT TẮT BRVT: Bà Rịa Vũng Tàu NB: Nutrient Agar MYP Mannitol Egg Yolk Polymixin DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton MIC: Minimal Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA BK: Bán kính rpm: Tốc độ vòng/ phút Am: Thuốc kháng sinh Amipicillin Te: Thuốc kháng sinh Tetracycline GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry: Sắc kí ghép khối phổ i
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1 Công dụng của xoài trong Y học 7 Bảng 2. 1 Dụng cụ cần thiết 24 Bảng 2. 2 Hoá chất cần dùng 25 Bảng 3. 1: Khối lượng cao chiết thu được theo dung môi 38 Bảng 3. 2 Tỉ lệ cao chiết thu được theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 39 Bảng 3. 3 Tỉ lệ khối lượng cao chiết thu được theo nồng độ dung môi 41 Bảng 3. 4 Khối lượng cao chiết thu được theo thời gian ngâm dầm 42 Bảng 3. 5: Đường kính vòng kháng khuẩn 49 Bảng 3. 6: Mật độ quang của đường chuẩn acid gallic 53 Bảng 3. 7: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ 53 ii
  8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây xoài 4 Hình 1.2: Lá non, lá già, lá phát triển 5 Hình 1.3: Hoa xoài, Qủa xoài 5 Hình 1.4: Vi khuẩn Bacillus cereus 17 Hình 1.5: Vi khuẩn S. Aureus 18 Hình 1.6: Vi khuẩn E. Coli 19 Hình 1.7: Vi khuẩn Samonella 19 Hình 1.8: Vi khuẩn Pseudomonas 20 Hình 1.9: Thuốc bôi da, thuốc viên nang 21 Hình 1.10: Sơ đồ tinh chế Mangiferin từ cao chiết lá xoài 22 Hình 1.11: Mangiferin thô 23 Hình 1.12: Mangiferin tinh chế 23 Hình 2.1: Lá xoài khi thu hái 25 Hình 2.2: Bột lá xoài khô 25 Hình 2.3: Sơ đồ quá trình tạo cao chiết lá xoài 26 Hình 2.4: Hệ thống tách béo bằng Soxhlet 27 Hình 2.5: Ngâm dầm trong cồn 80% 27 Hình 2.6: Lọc thu lấy dịch chiết 27 Hình 2.7: Hệ thống cô quay chân không 28 Hình 2.8: Cao chiết lá xoài và Mangiferin thô kết tinh trên thành lọ 28 Hình 2.9: Hệ thống GCMS 35 Hình 3.1: Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo dung môi 39 Hình 3.2: Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và khối lượng cao chiết thu được 41 Hình 3.3: Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dung môi và khối lượng cao chiết thu được 42 Hình 3.4: Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được 44 Hình 3.5: Phản ứng màu đặc trưng 45 Hình 3.6: Phổ GCMS so sánh 45 Hình 3.7: Phổ GCMS cao chiết lá xoài 48 iii
  9. Hình 3.8: Phổ GCMS mở rộng của cao chiết lá xoài 49 Hình 3.9: Kết quả đo vòng kháng khuẩn 53 Hình 3.10: Biểu đồ phương trình đường chuẩn Acid Galic 54 Hình 3.11: So sánh độ hấp thụ quang của một số lá 55 iii
  10. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Với điều kiện tự nhiên và khí hậu đặc trưng, đất nước ta có một hệ sinh thái thưc vật rất phong phú. Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời, sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khỏe. Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, hơn 5.000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh[6]. Hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc truyền thống đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đây là hướng nghiên cứu cơ bản về xác định thành phần hóa học và tìm ra hoạt chất thể hiện tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Tại Việt Nam, cây xoài được trồng khá phổ biến với phương pháp chăm sóc đơn giản. Trong địa tỉnh bàn Bà Rịa – Vũng Tàu, tổng diện tích trồng xoài hiện nay khoảng 650 ha, sản lượng 4500 tấn/ năm. Theo y học cổ truyền, trái xoài và các bộ phận khác của cây xoài được sử dung làm thuốc chữa bệnh đau răng, kiết lỵ, tiêu chảy, xuất huyết tử cung, chảy máu ruột, trị ngoài da Những ứng dụng này hầu hết đều liên quan đến tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm trong y học. Theo các kết quả nghiên cứu trước đây đã cho thấy, cây xoài chứa các hợp chất hoá học khác nhau, đặc biệt là polyphenolic, flavonoid, triterpenoids, các hợp chất của sterol, có trong hầu hết các bộ phận của cây: nhiều nhất trong thân vỏ 5-7%, lá xoài 1-3% tuỳ chủng loại [2] [17] [18]. Vì vậy, việc tận thu lá xoài dùng làm nguyên liệu để tách các hợp chất có lợi trong việc chống viêm nhiễm, chống lại sự oxi hoá, giảm nguy cơ tiểu đường, trị các bệnh ngoài da là một hướng nghiên cứu đúng đắn. Với hướng nghiên cứu nêu trên, tôi đã lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hoá học và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài trồng ở BRVT”. 2. Tình hình nghiên cứu GVHD: Lê Thị Thu Dung 1 SVTH: Phạm Thái Quang
  11. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cơ bản về khảo sát thành phần hóa học của lá xoài để tìm ra hoạt chất thể hiện tính tác dụng chữa bệnh và nâng cao sức khỏe con người. Từ năm 1992, Garter và Wiechowski đã tiến hành khảo sát để phân lập các hoạt chất thể hiện tác dụng chữa bệnh trong lá xoài. Đến năm 1990, các nhà khoa học Nga đã lần lượt dùng 4 dung môi: aceton, chloroform, n-butanol, dioxan để lý trích tạo cao chiết lá xoài. Từ thời điểm những năm 2001, các nghiên cứu đã tập trung hơn để đi sâu vào phân lập hợp chất mangiferin được xác định là hoạt chất chính tạo khả năng kháng khuẩn trong lá xoài. Gần đây, Ivanka Stoilova, Leopold Jirovetz, Albena Stoyanova, Albert Kratanov, Stoyanka Gargova, Lien Ho đã nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của polyphenol mangiferin (Stoilova et al, 2008) từ cây xoài. Tại Việt Nam, nhóm nghiên gồm Phan Hữu Điền, Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hòa, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Thế Dũng, Phạm Khắc Tiệp, Phan Đình Tỵ nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của Tri Mẫu và mangiferin chiết tách từ Tri Mẫu. Ngoài ra nhóm cũng đã khảo sát tác dụng hạ glucose trong máu của mangiferin chiết xuất từ Tri Mẫu trên chuột nhắt bình thường và chuột đái tháo đường bằng Streptozotocin. 3. Mục đích nghiên cứu Khảo sát thành phần hóa học chủ yếu của lá xoài, từ đó phân loại các hợp chất chính có tính kháng viêm, kháng khuẩn trong cao lá xoài sau khi trích ly. Bước đầu khảo sát khả năng kháng khuẩn từ cao chiết lá xoài để chứng minh hoạt tính sinh học của cao chiết lá xoài. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát quy trình tạo cao chiết lá xoài với các điều kiện dung môi, thời gian ngâm dầm, khác nhau. Định tính thành phần hóa học trong cao chiết lá xoài với các phương pháp định tính và quang phổ khác nhau. GVHD: Lê Thị Thu Dung 2 SVTH: Phạm Thái Quang
  12. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Từ các sản phẩm cao chiết khác nhau, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn một số chủng vi khuẩn khác nhau. 5. Phương pháp nghiên cứu Đề tài được thực hiện sau khi đã tham khảo 11 tài liệu tiếng Việt và 15 tài liệu nước ngoài. Phần thực nghiệm, chúng tôi áp dụng phương pháp ly trích với dung môi đơn giản, dễ thực hiện. Để minh chứng kết quả, các phương pháp phân tích hiện đại như IR, GCMS, UV-vis cũng được áp dụng. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Đề tài đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tìm quy trình tối ưu để tạo ra cao chiết lá xoài có hoạt tính kháng khuẩn. Các kết quả quang phổ, các số liệu từ kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đóng góp vào dữ liệu nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn từ cao lá xoài. 7. Cấu trúc của Đồ Án Tốt Nghiệp Với các mục tiêu nêu trên, nội dung báo cáo bao gồm 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu: về các phương pháp tạo cao chiết, công dụng Chương 2: Thực nghiệm: xây dựng quy trình tạo cao chiết lá xoài. Chương 3: Kết quả thảo luận: tối ưu hoá quy trình và hướng phát triển. GVHD: Lê Thị Thu Dung 3 SVTH: Phạm Thái Quang
  13. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây xoài: [2], [4], [9] 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây xoài thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) thuộc chi Mangifera L là một họ thực vật có hoa có quả là loại quả hạch. Các loài trong họ này có cây gỗ, bụi hoặc dây leo thân gỗ; lá mọc cách, thường kép một lần lông chim; đặc trưng bởi cây có nhựa mủ. Hoa của cây trong họ nhỏ, đều, bộ nhị xếp thành 2 vòng (diplostemon) hoặc 1 vòng (haplostemon), hiếm khi 2 vòng với các nhị vòng ngoài đối diện các cánh hoa (obdiplostemon); có triền ở trong hay ngoài nhị. Bộ nhụy thường gồm 3 lá noãn hợp quả tụ (hợp nguyên lá noãn), đôi khi lá noãn 1 hoặc 4 - 6, rời nhau. Quả của cây trong họ thường là dạng hạch hay quả mọng. Hạt có phôi cong. Một số loài tiết ra urushiol là một chất gây dị ứng. Chi điển hình là Anacardium (đào lộn hột). Các loài khác trong họ này còn có xoài, điều, sơn độc, sơn, hoa khói và hồ trăn. Hồ trăn đôi khi còn được đưa vào họ riêng là Pistaciaceae. Chi Mangifera L. phân bố tự nhiên từ vùng Ấn Độ - Xrilanca xuống phía Nam đến quần đảo Solomon (Indonexia), sang phía Đông đến các nước Đông Dương và tỉnh Vân Nam Trung Quốc. Việt Nam có 11 loài, trong đó cây xoài với nhiều giống khác nhau. Đây cũng là cây trồng nổi tiếng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á và Châu Mỹ. Ở Việt Nam, xoài được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam từ Khánh Hoà trở vào, song nhiều nhất ở các tỉnh miền Tây và miền Đông Nam Bộ. Vài năm gần đây, cây xoài cũng được phát triển và trồng nhiều ở phía Bắc, nhưng là giống xoài mới đã được lai ghép với giống xoài gốc ở các tỉnh ở phía Nam. Hình 1. 1 Cây xoài GVHD: Lê Thị Thu Dung 4 SVTH: Phạm Thái Quang
  14. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Về đặc điểm hình thái thực vật, cây xoài là cây thân gỗ, cao 8 - 10m, sống lâu năm. Thân, cành nhẵn vỏ cây màu xám nâu. Thời gian sinh trưởng của cây trong năm có 2 mùa, mùa ra hoa và mùa ra quả, mỗi mùa vào khoảng 2-3 tháng. Phần lá của cây xoài là lá đơn, nguyên, mọc so le, có cuống. Cuống lá dài 2 - 3,5cm có thể chuyển dài tới 5 - 6cm. Phiến lá nguyên hình bầu dục hoặc hình mũi mác, dài 15 - 30cm, rộng 5,5 - 7cm; gốc lá tròn, ngọn lá có mũi nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt trên lá sẫm bóng, gân lá kết thành mạng rõ như hình lông chim. Lá non có màu hồng nhạt rồi chuyển dần thành màu xanh nhạt, lá phát triển có màu xanh. Hình 1. 2: Lá non, Lá phát triển, Lá già Hoa xoài mọc thành cụm, ở đầu cành thành chùm kép, hoa màu xanh lục, màu vàng, trắng, kem nhạt hoặc hơi hồng dài 5 răng có long ở mặt ngoài, tràng năm cánh loăn xoăn, nhị 5, chỉ có 1-2 cái sinh sản, bầu thượng hình trứng nhẫn, chỉ có 1 noãn. Hình 1. 3: Hoa xoà, quả xoài Quả xoài có sự thay đổi lớn trong hình thức, màu sắc, kích thước và chất lượng của các loại trái cây. Có thể là gần tròn, hình bầu dục, hình trứng thuôn tù hoặc hơi hình thận, quả non có màu xanh, khi chin màu vàng, chứa thịt mọng nước, hạt dẹt, rắn. GVHD: Lê Thị Thu Dung 5 SVTH: Phạm Thái Quang
  15. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Trên thế giới, xoài có khoảng 50 loài, ở nước ta có khoảng 11 loài [10] như: Mangifera Cambodiana (xoài Cơm), Magifera Foatida (xoài Hôi), Mangifera Indica (xoài Tượng), Mangifera Mekongensis (xoài Thanh Ca), Mangifera Dongnaiensis (xoài Đồng Nai), Mangifera Longipes (xoài Cuốn Dài), Mangifera Duperreana (xoài Lửa), Mangifera Flavan (xoài Vàng), Mangifera Altissima, Mangifera Caesia, Mangifera Applanata, Mangifera Casturi, Ở Việt Nam xoài được trồng tập trung ở các tỉnh phía Nam. Hiện có khoảng 50 giống xoài đang được trồng và nghiên cứu. Xoài có thể trồng trên nhiều loại đất, chịu hạn tốt và cũng chịu được ứng nhẹ. Nhưng để xoài ra hoa kết quả thuận lợi, cần chọn nơi có một mùa khô, ẩm. Khi trồng, đào hố kích thước 80 – 90 cm, cách nhau 10 -14 m, mỗi hố bón lót 20 – 30kg phân chuồng, 2 kg supe lân, 1 kg kali. Trồng xong phải tưới nước đầy đủ, phủ gốc che nắng trong vài tháng đầu. Có thể trồng xen chuối, đu đủ, rau đậu khi cây còn nhỏ. Tất cả bộ phận của cây xoài như quả, hạt, lá và thân vỏ cây xoài đều có thể sử dụng được. Lá được phơi khô hay sấy, người ta chọn lá đã già, có tác dụng làm thuốc chữa bệnh. Lúc này cũng phù hợp với mùa thu hoạch lá. Vì để bảo vệ quả, trong mùa thu hoạch quả người ta không thu hái lá xoài chín vào mùa hè. Cần xác định đúng độ chín và căn cứ yêu cầu sử dụng để thu hái. Nên chọn những ngày nắng ráo, hái quả vào lúc trời râm mát, có thể bảo quản lạnh hoặc xử lý với NaB4O7 (2 - 4%). Trung bình một cây cho 100 – 200 kg quả/năm. Cây tốt có thể đạt 500kg quả/năm. 1.1.2 Tình hình sử dụng trong y học của cây xoài [2] Quả xoài, lá xoài có vị chua ngọt, tính mát, còn hạch quả có vị chua chat tính bình. Thịt quả có tác dụng thanh nhiệt, tiêu trệ, ích vị, chi thổ giải khát lợi niệu. Hạch quả có tác dụng chi khí kiện vị. Xoài là một trái cây bổ dưỡng cao chứa carbonhydrate, protein, chất béo, khoáng chất và vitamin, đặc biệt là vitamin A (beta carotene), B1, B2 và vitamin C (acid ascorbic). Khi quả chin, nồng độ vitamin C giảm và glucose, fructose và đường sucrose tăng nồng độ. Lá có tác dụng chí dương hành khí, sơ trệ lợi tiểu. Vỏ cây có tác dụng tu liễm sát trùng. Nhựa từ vỏ cây thân ra rỉ, GVHD: Lê Thị Thu Dung 6 SVTH: Phạm Thái Quang
  16. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 màu đen không mùi, vị chát đắng hơi cay, cũng có tác dụng như vỏ. Theo thống kê, cây xoài đặc biệt là lá xoài được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh khác nhau. Tuy nhiên nhóm các bệnh này thường tập trung các các bệnh viêm, nhiễm khuẩn. Bảng 1. 1 Công dụng của xoài trong Y học Theo y học cổ truyền[6] TT Bệnh Bộ phận sử dụng Cách sử dụng phơi trong râm đến khô, nghiền 1 kiết lị, tiêu chảy lá tươi thành bột mịn, uống mỗi ngày từ 1 – 2g, ta dùng 2 – 3 lần/ngày. 200g đun sôi với 10 phút trong 1 2 Rửa vết thương lá tươi lít nước, dùng để rửa vết thương lấy lá xoài tươi 200g đun sôi nhỏ lửa 15 phút với 1 lít nước. Sau đó ta bắc xuống và dung khan trùm Trị ho, viêm kín đầu để xông. Khi xông ta nên 3 lá tươi họng: há miệng để đưa hơi vào cổ họng. Làm 1 lần mỗi ngày. Hoặc ta có thể sắc uống 20 – 30mg lá tươi, ngày 2 lần/ngày. Một số nghiên cứu gần đây nồng độ 0,1 – 1g / ml. Nuôi cấy virus cúm trong phôi gà. Lấy 0,2 Cao chiết từ lá 5 Ức chế virus ml dịch cao đã pha cho vào phôi xoài gà, có tác dụng ức chế sự tác dụng của virus. GVHD: Lê Thị Thu Dung 7 SVTH: Phạm Thái Quang
  17. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) Staphylococcus aureus là 6,25 Tác dụng kháng Cao lá xoài chiết 6 mg/ml, Escherichia coli là 50 khuẩn: cồn mg/ml và Bacillus pyocyaneus là 100mg/ml. Dùng nhân hạt có tác dụng ức chế sự phát triển xoài chiết cao cồn, của 2 nấm Candida lunata và Tác dụng kháng 7 phân đoạn eter Trychophyton mentagophytes. nấm: ethylic, ethyl acetat. Qua các bài thuốc dân gian trên và các nghiên cứu khoa học đã trích dẫn, ta nhận thấy lá xoài hoặc cao chiết cồn từ lá xoài rất phù hợp với định hướng ứng dụng trong dược – mỹ phẩm với mục đích kháng các loại virus và nấm. 1.1.3 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá xoài [2] [18] [17] : Theo các nghiên cứu đã công bố gần đây, cây xoài chứa nhiều hợp chất hoá học khác nhau đặc biệt là poluyphenolic, flavonoid, triterpenoids. Trong đó, Mangiferin là một xanthan glycoside là thành phần chính có trong hầu hết các bộ phận của cây nhiều nhất trong thân vỏ 5-7% tuỳ chủng loại. Lá xoài cũng có chứa mangiferin (với tỉ lệ 1- 3%) và taxarol, friedelin, tannin, lupeol -  - sitosterol, isomangiferin, homomangiferin, acid gallic, kaempferol, étragol, 3 – glucoside astrageline, quercetin, isoquercetin. GVHD: Lê Thị Thu Dung 8 SVTH: Phạm Thái Quang
  18. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bảng 1. 2 Thành phần hoá học trong lá xoài STT Tên hợp chất Công thức hợp chất 1 Mangiferin 2 Taraxerol 3 Fridelin Acid galic 4 GVHD: Lê Thị Thu Dung 9 SVTH: Phạm Thái Quang
  19. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Kaempferol 5 6 Estragol 7 Quercetin 8 Isoquercetin GVHD: Lê Thị Thu Dung 10 SVTH: Phạm Thái Quang
  20. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 9 Astragalin Ta thấy bên cạnh các hợp chất thiên nhiên khác thì Mangiferin là một hơp chấp quan trọng có hàm lượng cao nhiều trong lá xoài. Ngoài ra, các nhà khoa học trên thế giới cũng đã từng công bố về việc chiết tách Mangiferin trong lá xoài như: Năm 1996, giáo sư Nguyễn Viết Tựu - Phân viện Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã tìm ra quy trình công nghệ chiết xuất mangiferin từ lá xoài Năm 2000, Huỳnh Vũ Phương, Nguyễn Công Hào, Lê Tiến Dũng đã khảo sát hàm lượng, cấu trúc của hợp chất mangiferin trong lá các loại xoài trồng ở những vùng đất khác nhau. Mangiferin đã được Garter (1992) và Wiechowski (1923) phân lập, Iseda (1957) và Ramanahan, Seshar (1960) đã nghiên cứu cấu trúc hoàn chỉnh. Năm 1990, các nhà khoa học Nga đã lần lượt dùng 4 dung môi: aceton, chloroform, n-butanol, dioxan để ly trích mangiferin từ lá xoài. 1.2. Hoạt tính sinh học của cao chiết lá xoài [2] a) Tác dụng với virus Herpes: Khi cấy vào phôi nguyên bào Tripsin virus Herpes ở những nồng độ khác nhau 1,0 và 100 TCD50/ml đã được xác định liều diệt virus của mangiferin từ 20 ÷ 50μg/ml. GVHD: Lê Thị Thu Dung 11 SVTH: Phạm Thái Quang
  21. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Virus gây bệnh Herpes : hoạt chất mangiferin và isomangiferin với nồng độ 25-250μg/ml, có tác dụng ức chế sự phát triển của virus Herpes 69,5%. Nếu đưa đồng thời virus và thuốc vô cùng một lúc thì tác dụng ức chế là 56,8% b) Tác dụng trực tiếp diệt Sitomegalo virus Khi thử nghiệm tác dụng của hoạt chất lên Sitomegalo virus được cấy ở tế bào người, người ta thấy rằng mangiferin với liều 100μg/ml đã hoàn toàn phá hủy sự tái tạo đối với 1 lượng 10000 TCD50 Sitomegalo virus. c) Ảnh hưởng của việc mangiferin lên việc tạo Interferon trong máu Interferon có tác dụng ngăn ngừa viên nhiễm của virus. Việc sản sinh ra interferol góp phần ổn định các cơ quan giúp chống lại các bệnh có nguồn gốc từ virus. Thử nghiệm cho thấy rằng mangiferin với nồng độ 10 và 100μg/ml kích thích sự tiết ra interferol bởi tế bào máu của người khỏe với nồng độ 50μg/ml từ máu của người bị nhiễm virus Herpes. d) Tác dụng chống viêm của mangiferin Mangiferin với liều 50mg/kg cho chuột cống trắng uống hoặc tiêm trong màng bụng, có tác dụng ức chế phù (viêm cấp) do caragenin và ức chế u hạt (viêm mãn tính). Chuột đã cắt bỏ tuyến thận vẫn có tác dụng chống viêm trên 2 mô hình trên điều đó chứng tỏ tác dụng chống viêm của mangiferin không thông qua cơ chế tác động lên tuyến thượng thận. e) Ảnh hưởng lên sự miễn dịch của dịch thể và tế bào Trong thử nghiệm trên chuột nhắt và chuột bạch được miễn dịch bởi một liều tối ưu hồng cầu thì mangiferin khi được đưa vào dạ dày 5 lần cách quãng theo liều 10 - 100 - 500mg/kg sẽ làm tăng 2,5 - 5 số lượng kháng thể có khả năng miễn dịch trong lá lách, và tăng 3 - 7 lần số lượng kháng thể có khả năng miễn dịch trong máu. f) Tác dụng chống oxy hóa Mangiferin đóng vai trò của một chất chống oxy hóa trong việc ngăn ngừa các nguồn bệnh. Khả năng chống oxy hóa của mangiferin đã được nghiên cứu trong ống GVHD: Lê Thị Thu Dung 12 SVTH: Phạm Thái Quang
  22. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 nghiệm tại chuột OF1 (Sanchez et al 2000), mangiferin được dùng sản xuất Vimang (50, 110, 250 mg/kg), mangiferin (50mg/kg), vitamin C (100mg/kg), vitamin E (100mg/kg), vitamin E + vitamin C (100mg/kg mỗi loại) và β-carotene (50mg/kg) dùng 1 lần/ngày trong 7 ngày liên tiếp, có tác dụng lớn chống oxy hóa. g) Tác dụng hạ đường huyết Qua mô hình gây đái tháo đường thử nghiêm bằng steptozocin (chất kháng sinh có tác dụng phá hủy tế bào của tuyến tụy gây mô hình đái tháo đường loại 1 do thiếu insulin) trên chuột nhắt trắng, đã tìm ra cơ chế tác dụng của mangiferin. Chất mangiferin không kích thích tế bào tuyến tụy tiết insulin, làm tăng độ nhạy cảm của mô tế bào với insulin, ức chế sự tạo đường mới ở gan và cơ (do ức chế tác dụng tăng cường máu của adrenalin). h) Tác dụng kháng viêm của cao chiết lá xoài [12], [13], [14] Trong cao chiết ls xoài có chứa nhiều hợp chất thiên nhiên thuộc nhóm phenolic. Phenolic là nhóm các hợp chất hoá học mà trong phân tử có chứa nhóm chức Hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydro cacbon thơm như Mangiferin, tanin, taraxerol, fidelin, . Các nhóm nhỏ trong nhóm Phenolic như Flavonoid, Anthraquinoe, có tác dụng khám viêm, giảm đau, duy trì độ mềm dẻo của thành mạch máu, chống suy giãn suy yếu tĩnh mạch [16] . Sở dĩ chúng có khả năng này là nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm-OH phenol tự do [26] Các flavonoid có khả năng ức chế sinh tổng hợp nito axit, cyclooxygenase và lypooxygenase mà tạo ra lượng lớn nitric oxide, postanoids và leukotrienes, cũng như các chất trung gian khác của quá trình viêm như cytokine, chemokine[25]. i) Động dược học của mangiferin trong cao chiết lá xoài Khi nghiên cứu động dược học của mangiferin thấy rằng khi tiêm vào cơ thể thì chỉ sau 15 phút đã phát hiện nó trong máu. Trong máu mangiferin không bị biến đổi và được xác định ở nồng độ 0,05 - 4,5μg/ml trong khoảng 0,5 - 5 giờ sau khi sử dụng. Việc bài tiết mangiferin theo nước tiểu không quá 0,1%. Chất chuyển hóa của mangiferin không được phát hiện. GVHD: Lê Thị Thu Dung 13 SVTH: Phạm Thái Quang
  23. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 1.3. Quy trình chiết tách tạo cao chiết lá xoài: 1.3.1 Một số quy trình chiết xuất tạo cao trong và ngoài nước Để tạo ra cao chiết lá xoài có khá nhiều phương pháp, nhưng phương pháp được sử dụng nhiều nhất là kết tinh cao lá xoài trong dung môi phù hợp. Một số nghiên cứu tách chiết xuất cao lá xoài trong và ngoài nước đã áp dung như sau: Qui trình của GS Glyzin viện Cây thuốc toàn liên bang thuộc Liên Xô cũ chiết xuất bằng aceton - nước, loại tạp chất bằng clorofrom rồi chiết lại bằng n-butanol. Cuối cùng tinh chế bằng dioxan. Trong nghiên cứu này, tác giả đã bước đầu kết luận hoạt chất chính trong cao lá xoài tạo khả năng kháng khuẩn và mangiferin và các hợp chất sinh học khác như flavonoids, polyphenolic, Giáo sư Nguyễn Viết Tựu (1996) đã chiết mangiferin tạo cao lá xoài theo quy trình: Bột lá khô sau khi làm sạch được chiết với dung môi nước nóng, ly tâm thu dịch chiết. Lên men thủy giải, dịch chiết kho có mặt các enzym thủy giải của bản thân dược và của nấm meo tiết ra sẽ phân giải mangiferin ở dạng hòa tan thành mangiferin tự do, không tan, tách khỏi dung dịch và lắng xuống dưới. Ly tâm, lấy tủa rửa sạch sẽ thu được mangiferin thô 80%. Mangiferin thô sẽ được tinh chế với cồn - H2O nóng, thu được mangiferin tinh khiết 98%. Shashi Kant Singh và cộng sự chiết các hợp chất thiên nhiên từ vỏ và thân của M. Indica L. bằng ethanol sau đó tách và tinh chế mangiferin bằng phương pháp sắc kí hấp thụ theo quy trình: dược liệu Sau khi loại bỏ chất béo bằng cách chiết kiệt với ether dầu hỏa trong bình Soxhlet (60 - 80oC, 56h) được chiết kiệt với ethanol 95% (56h). Dịch chiết được cô với áp suất giảm, thu được bột màu vàng. Sau đó, bột thu được, được hấp thụ lên cột silicagel (60 - 120mesh), nhồi cột bằng ether dầu hỏa, rửa giải bằng hỗn hợp CHCl3/MeOH (1:1) thu được mangiferin màu vàng nhạt. S. Muruganandan và cộng sự cũng chiết cao lá xoài bằng ethanol theo quy trình tương tự nhưng tinh chế Mangiferin bằng phương pháp kết tinh. Dịch chiết ethnol thu được đêm cô đến áp suất thấp đến cắn, loại chất béo nhiều lần rồi hòa tan tiếp vào ethanol. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, thu tủa được bột màu trắng ở dạng GVHD: Lê Thị Thu Dung 14 SVTH: Phạm Thái Quang
  24. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 vô định hình. Sau đó, kết tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi H2O - EtOAc, thu được mangiferin tinh khiết, độ tinh khiết được xác định bằng HPLC đạt 95,56%. Trong những nghiên cứu gần đây, phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (ultrasonic - assisted extraction) đã được phát triển để tách chiết các hợp chất thiên nhiên hiệu quả từ lá xoài. Những thông số như nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi-nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian chiết xuất được tối ưu hóa bằng cách thử nghiệm trên từng yếu tố và phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology - RSM). Điều kiện chiết xuất tối ưu hóa như sau: 44% ethanol, tỉ lệ dung môi - nguyên liệu 38:1, chiết trong thời gian 19,2 phút ở 60oC dưới 200W của bức xạ siêu âm. Với điều kiện tối ưu đó, năng suất chiết mangiferin là 58,46 ± 1,27 mg/g. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và sử dụng kĩ thuật chiết xuất với sự hỗ trợ của lò vi sóng (microwave assisted) để chiết mangiferin từ cao lá xoài Mangifera indica. Một nhà thiết kế Box - Behnken đã được sử dụng để đánh giá tác dụng của ba thông số: điện lò vi sóng, thời gian khai thác, và tỷ lệ dung môi-nguyên liệu (ml/g). Các thông số đã được tối ưu hóa như sau: năng lượng của lò vi sóng 900W, thời gian chiết xuất 5 phút, tỷ lệ dung môi - nguyên liệu 10ml/g. Với những thông số tối ưu đó, năng suất chiết mangiferin đạt 63,22%. Pereira và Miereles (2007) đã nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học từ lá xoài bằng CO2 lỏng siêu tới hạn (SC - CO2) đạt sản lượng rất thấp, chỉ 1,00% SC - CO2 là một dung môi không phân cực, vì vậy việc bổ sung hợp chất có khả năng phân cực là cần thiết để nâng cao hiệu suất khi khai thác của các hợp chất phenolic. Fernandez - Ponce et al (2012) cho thấy việc bổ sung ethanol đã cải thiện năng suất của quá trình nhanh lên 4,2 - 8,2%, tuy nhiên khai thác ở áp suất 4Mpa, 100oC, 10g/phút và 3 giờ cho hiệu quả cao với hiệu suất 35%. Các bộ phận cơ bản của một thiết bị chiết suất siêu tới hạn: một bể chứa chất lỏng CO2, một ống làm mát để ngăn chặn CO2 bay hơi trong máy bơm, một máy bơm CO2 lỏng, một bộ trao đổi nhiệt để kiểm soát nhiệt độ CO2, một ống thu dịch chiết, một bộ trao đổi nhiệt để kiểm soát CO2 cộng với chất tan hỗn hợp vào bình phân tách. Tại phòng thí nghiệm quy mô GVHD: Lê Thị Thu Dung 15 SVTH: Phạm Thái Quang
  25. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 ngưng tụ và tái chế CO2 sau khi tách chiết là không cần thiết nhưng ở mức sản xuất công nghiệp là những yêu cầu thiết yếu. 1.3.2 Quy trình chiết cao lá xoài áp dụng trong báo cáo Qua các nghiên cứu đã nêu trên, dù phương pháp trích ly bằng sóng siêu âm có thể trích ly với hiệu quả cao và thời gian nhanh hơn, nhưng để phù hợp với điều kiện thiết bị trong phòng thí nghiệm trường Đại học BRVT, ta chọn phương pháp trích ly ngâm dầm. Ưu điểm của phương pháp ngâm dầm là không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng mẫu lớn, ít mất công hơn, quá trình chiết được diễn ra liên tục. Qua đó tôi xây dựng được quá trinh trích ly tạo cao chiết lá xoài phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm trường Đại học BRVT: Đầu tiên ta xử lý nguyên liệu bằng nhiều phương pháp và trích ly với dung môi thích hợp nhằm làm sạch nguyên liệu, tăng hiệu suất trích ly ngâm dầm. Sau đó ta ngâm dầm bột lá xoài với dung môi phù hợp để trích ly các hợp chất thiên nhiên có trong nguyên liệu. Cuối cùng là việc đuổi dung môi nhằm tăng nồng độ của cao chiết lá xoài và lấy mẫu vật thực hiện các công đoạn sau. Tuy nhiên, hiệu suất của cao chiết thu được còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung môi, thời gian, tỉ lệ, Trong điều kiện của đồ án này, tôi sẽ khảo sát 4 yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly cao lá xoài. Bao gồm: loại dung môi, nồng độ dung môi, thời gian ngâm dầm và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi. 1.3.3 Ảnh hưởng của dung môi, nồng độ dung môi : Trong các hợp chất thiên nhiên, điển hình như nhóm flavonoids, polyphenolic, việc cô lập chất phức tạp hơn vì một hợp chất thiên nhiên thường có hai hay nhiều nhóm chức hoá học có tính phân cực khác biệt nhau. Do vậy chúng ta phải lựa chọn dung môi phù hợp dựa trên nguyên tắc chung là ‘các chất giống nhau sẽ hoà tan với nhau’ để giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất được dễ dàng hơn. Tuy nhiên dung môi không có tính chọn lọc cao. Các loại dung môi có độ phân cực khác nhau GVHD: Lê Thị Thu Dung 16 SVTH: Phạm Thái Quang
  26. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 có thể hoà tan các loại hợp chất giống nhau. Việc pha loãng dung môi có tác dụng tiết kiệm dung môi và thay đổi độ phân cực của dung môi. 1.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ thể tích dung môi/khối lượng nguyên liệu và thời gian ngâm dầm : Kĩ thuật ngâm dầm không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thuỷ tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hoà tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Đổ một lượng dung môi thích hợp và đậy kín. Sau một khoảng thời gian nhất định ta thu được dịch chiết. Tuy nhiên nếu để quá lâu cũng sẽ không làm tăng thêm hiệu suất, ngược lại còn gây mất thời gian nên ta phải khảo sát. Bên cạnh đó, dù lý thuyết là « ngâm dầm nguyên liệu » với một lượng sấp sấp bề mặt nhưng ta cũng phải khảo sát để tránh tình trạng lãng phí dung môi. 1.4 Giới thiệu về kháng khuẩn, chống oxy hoá : 1.4.1 Tính kháng khuẩn : Kháng khuẩn là khả năng tiêu diệt vi khuẩn hoặc kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. Trong nội dung đồ án, tôi thử khả năng kháng khuẩn của 3 loại cao chiết lá xoài là: cao chiết lá khô, cao chiết lá tươi và tinh thể kết tinh trong cao chiết trên 5 loài vi khuẩn khác nhau là Bacillus cereus, Samonella, E. Coli, Staphylococcus và Pseudomonas. Một số vi khuẩn: ❖ Bacillus cereus Hình 1. 4: Vi khuẩn Bacillus Cereus GVHD: Lê Thị Thu Dung 17 SVTH: Phạm Thái Quang
  27. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bacillus cereus là loài trực khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố + Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. + Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày. Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. ❖ Staphylococcus aureus Staphylococcus là các cầu khuẩn được phát hiện vào năm1881 được tìm thấy không khí, bụi và thực phẩm, trú ở da và niêm mạc của người. Hình 1. 5: Vi khuẩn S. Aureus Độc tố - Enzym: + Khả năng gây bệnh do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme, có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm. GVHD: Lê Thị Thu Dung 18 SVTH: Phạm Thái Quang
  28. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 + Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15℃ hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là một protein ổn định nhiệt, phân giải protein của tế bào chủ và phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME). ❖ Escherichia coli Escherichia coli là một loại vi khuẩn hình roi được phát hiện vào năm 1885, thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng. Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ. Độc tố: gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng. Gây tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác, trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng. y nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể. Hình 1. 6: Vi khuẩn E. Coli ❖ Salmonella Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả, là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn, được phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh. Hình 1. 7: Vi khuẩn Salmonella GVHD: Lê Thị Thu Dung 19 SVTH: Phạm Thái Quang
  29. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiêt ra 2 loại độc tố: Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. Ngoại độc tố: Tác động vào thần kinh và ruột. ❖ Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người, lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch, gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết, gây viêm chân lông. Hình 1. 8: Vi khuẩn Pseudomonas Độc tố: Là vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết, gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan rõ rệt nhất là gan. 1.4.2 Tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá của cao chiết lá xoài : Các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết đã được nghiên cứu tác dụng sinh học trên cơ thể, có khả năng chống lại các gốc oxi hóa tự do, hạn chế các căn bệnh như ung thư, tim mạch, chống viêm, giảm đau, có khả năng tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể, chống lại các virut gây bệnh dời leo, thủy đậu, đặc biệt bệnh liên quan đến virus hepper đơn, virus Varicella zoster, nấm, vi khuẩn gram dương như bệnh thủy đậu, dời leo, viên lở loét do viêm nhiễm, mụn rột. Cơ chế là hạn chế sự phát triển của virus thông qua phá vỡ màng virus, đồng thời hạn chế sự tăng lên của virus, kích thích sự sản sinh của Inteferon trong máu, làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, kháng lại các virus Herpes simplex gây ra, lở miệng, mụn nhọt, hay rôm GVHD: Lê Thị Thu Dung 20 SVTH: Phạm Thái Quang
  30. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 xảy ở trẻ em, nếu sử dụng các dược phẩm điều chế từ hợp chất có thể chữa được bệnh nhanh chóng hiệu quả, đặc biệt kết hợp sử dụng giữa thuốc uống và thuốc bôi da. Bên cạnh đó, stress oxy hoá là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất kháng oxy hoá. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hoá sớm. Các hợp chất thiên nhiên như flavonoids với nhiều gốc –OH tự do có tác dụng ổn định đường huyết cho cơ thể và giảm cholesterol xấu, chống lại các gốc oxy hoá tự do. 1.4.3 Một số ứng dụng trong dược – mỹ phẩm : Hình 1. 5 Thuốc bôi da, thuốc viên nang Các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết lá xoài đã được áp dung vào nhiều sản phẩm như thuốc bôi da và thuốc uống. Tuy nhiên, vì cao chiết lá xoài còn có khả năng kháng viêm, chống oxy hoá nên nếu nghiên cứu rộng hơn có thể áp dụng vào kem, sữa rửa mặt trị mụn, selrum hoặc các sản phẩm giúp chăm sóc da mặt, se khít lỗ chân lông. Bên cạnh đó còn có thể phát triển các hợp chất trong cao chiết theo hướng như một loại thực phẩm chức năng giúp tăng cường hệ miễn dịch, bồi bổ sức khoẻ. GVHD: Lê Thị Thu Dung 21 SVTH: Phạm Thái Quang
  31. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bên cạnh đó, nếu kết quả định tính trong sản phẩm thô có sự xuất hiện của hỗn hợp chất sinh học mangiferin thì ta có thể tiến hành tinh chế mangiferin từ cao lá xoài theo phương pháp sau : • Tinh chế mangiferin Mangiferin thô 1. Hoà tan với Ethanol 80% 2. Đun sôi, t = 70 – 80 OC, 2h O 3. Làm nguội, t = 55 C 4. Bổ sung than hoạt tính Dịch chiết A 5. Lọc than Dịch chiết B 6. Cô dịch 7. Kết tinh, t = 4 – 8 OC, qua đêm 8. Lọc, rửa 9. Sấy t = 60 OC Mangiferin Tinh khiết Hình 1.10: Sơ đồ quy trình tinh chế Mangiferin từ cao chiết lá xoài Nếu kết quả định tính trong sản phẩm thô có sự xuất hiện của hỗn hợp chất sinh học mangiferin thì ta tiến hành tinh sạch mangiferin. Hòa tan mangiferin thô với ethanol 80% theo tỉ lệ dung môi : nguyên liệu lá 100 : 1(l/kg), chuyễn hỗn hợp vào Becher đun trên bếp khuấy từ, đun sôi lăn tăn đến nhiệt độ 70 - 80oC và giữ trong 2h. Sau đó, làm nguội hỗn hợp xuống 55oC và bổ sung than hoạt tính. GVHD: Lê Thị Thu Dung 22 SVTH: Phạm Thái Quang
  32. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bổ sung than hoạt tính : Khi sản xuất thuốc bằng phương pháp chiết xuất từ dược liệu, ở giai đoạn tinh chế, để làm sạch dung dịch khỏi các chất bẩn, chất màu người ta thường dùng than hoạt tính để tẩy màu, loại bỏ một số tạp chất lẫn trong sản phẩm thô. Than hoạt được bổ sung theo tỉ lệ 5%, có nghĩa cứ 10g sản phẩm thô sẽ bổ sung 0,5g than hoạt tính. Tiếp tục đun sôi 30 - 60 phút để than hoạt hấp thụ các chất màu, chất bẩn. Ta được dịch chiết A. Lọc than : Sau khi đun đến thời gian, thu dịch chiết C và lọc nóng bằng thiết bị lọc chân không. Để quá trình lọc đạt hiệu quả tốt, cần bổ sung thêm bột trợ lọc và giấy lọc. Thu dịch lọc, ta được dịch chiết B. Cô đặc : Dịch chiết B được đem đi cô đặc trong thiết bị cô chân không đến 1/5 thể tích dịch chiết. Thu dịch, kết tinh lạnh 4 - 8oC qua đêm để mangiferin lắng xuống. Dùng nước RO và Cloroform để rửa tủa bằng thiết bị lọc chân không, để đảm bảo hiệu quả tinh sạch mangiferin tinh khiết nên rửa nước 3 lần và rửa lại bằng Ethanol 1 lần để loại hết những hợp chất không cần thiết. Sấy : sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 60oC trong tủ sấy. Sản phẩm cuối cùng thu được có dạng bột màu vàng ánh kim nhạt có thể là mangiferin tinh khiết. Hình 1.11: Mangiferin thô Hình 1.12: Mangiferin tinh chế GVHD: Lê Thị Thu Dung 23 SVTH: Phạm Thái Quang
  33. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng, thiết bị, dụng cụ, hoá chất nghiên cứu: Đối tượng: mẫu lá xoài tại huyện Long Điền, thành phố Bà Rịa, tỉnh BRVT. Dụng cụ, thiết bị: Bảng 2. 1 Dụng cụ cần thiết STT Dụng cụ STT Dụng cụ 1 Becher 50ml 12 Bình lọc chân không 2 Becher 100ml 13 Soxhlet 3 Becher 250ml 14 Cô quay chân không 4 Becher 500ml 15 Bếp điện 5 Erlen 250ml 16 Cân điện 6 Ống nhỏ giọt 17 Nồi đun cách thuỷ 7 Ống đong 10ml 18 Máy sấy 8 Phễu lọc không đuôi 19 Tủ sấy 9 Phễu Bucher 20 Muỗng thuỷ tinh 10 Giấy lọc 21 Vi quản 11 Ống nghiệm 22 Dũa thuỷ tinh GVHD: Lê Thị Thu Dung 24 SVTH: Phạm Thái Quang
  34. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bảng 2. 2 Hoá chất cần dùng STT Hoá chất STT Hoá chất STT Hoá chất 1 Etanol 5 n-butanol 9 HCl đặc 2 Mg 6 Acid 10 FeCl3 Acetic 3 Aceton 7 Cloroform 11 TLC 4 H2O 8 NaOH 12 H2SO4 2.2 Quy trình chiết tách tạo cao lá xoài: Xử lý nguyên liệu: Lá xoài được thu hái ở Long Điền, BRVT. Thời gian hái vào buổi trưa, từ tháng 1/2019 đến tháng 4/2019. Chọn lá là lá già có màu xanh thật đậm. Lá được rửa thật sạch để loại bỏ tạp chất (sương, bụi bậm, thuốc trừ sâu, ), sấy khô trong tủ sấy ở 600C đến khi khối lượng không đổi, xay hơi nhuyễn thành những chút nhỏ, gần thành bột. Hình 2. 2 Lá xoài khi thu hái Hình 2. 1 Bột lá xoài khô GVHD: Lê Thị Thu Dung 25 SVTH: Phạm Thái Quang
  35. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Lá xoài Sấy khô Xay gần thành bột Bột lá xoài khô Loại bỏ cành và các mảng lá to Bột cây còn lại Ngâm lạnh với Aceton để loại bỏ Tannin. Lọc lấy bột cây Bột cây còn lại Ngâm dầm với Ethanol 80% Dịch chiết Cô cạn Cao chiết Hình 2. 3 Sơ đồ quá trình tạo cao chiết lá xoài Giải thích quy trình : a) Chiết xuất tạo cao chiết lá xoài Xử lí nguyên liệu : Lá xoài sau khi thu nhập được sấy khô ở nhiệt độ 60oC với mục đích bảo quản dược liệu khỏi bị nhiễm mốc, vi khuẩn, bị tác động bởi enzym và hạn chế các biến đổi hóa học có thể xảy ra trong dược liệu như bị thủy phân, oxy hóa, đồng phân hóa. Sau khi sấy khô, nghiền nhỏ nguyên liệu bằng máy xay sinh tố, xay nhỏ gần thành bột. GVHD: Lê Thị Thu Dung 26 SVTH: Phạm Thái Quang
  36. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Chiết hồi lưu : bột lá xoài sau khi xay cho vào túi, chiết hồi lưu 12 giờ bằng hệ thống Soxhlet với dung môi là Ether dầu hoả nhằm loại bỏ chất béo và tinh dầu trong lá. Ngâm lạnh : lấy bột lá ngâm lạnh với Aceton trong 30 giờ để loại bỏ Tanin (nhiệt độ 8 – 10oC). Hình 2. 4 Ngâm dầm trong cồn 80% Hình 2. 5 chưng cất bằng hệ thống Soxhlet Hình 2. 6 Lọc thu lấy dịch chiết Ngâm dầm : lọc lấy bột còn lại, đem ngâm dầm trong Etanol 80% trong khoảng 12 giờ. Loại bỏ dung môi : lọc lấy dịch chiét đem đi cô cạn bằng máy Cô quay chân không (áp suất thấp) để loại bỏ dung môi thu được cao chiết màu xanh đen. GVHD: Lê Thị Thu Dung 27 SVTH: Phạm Thái Quang
  37. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Hình 2. 7 Hệ thống máy cô quay chân không Có thể đem dịch chiết để qua đêm ở nhiệt độ 10 – 150C để tạo cắn nếu muốn lắng tạo Mangiferin dạng tinh thể từ cao chiết. Lọc : quá trình phân riêng 2 pha rắn-lỏng ra khỏi nhau bằng cách cho hỗn hợp đi qua thiết bị lọc chân không, thu được sản phẩm thô, thời gian được rút ngắn nhờ lực hút chân không. Sau đó, ta thu được cao chiết lá xoài như hình 2.8 dưới đây : Hình 2. 8 Cao chiết lá xoài GVHD: Lê Thị Thu Dung 28 SVTH: Phạm Thái Quang
  38. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 2.3 Khảo sát điều kiện chiết tách tối ưu 2.3.1 Lựa chọn dung môi Ta cân chính xác 5 cốc có khối lượng như nhau là 15g bột lá xoài khô và tiến hành trích ly cùng một điều kiện như nhau ở những bước đầu. Tuy nhiên, đến giai đoạn ngâm dầm, ta tiến hành ngâm dầm với 5 loại dung môi khác nhau với độ phân cực tăng dần: - n-hexan - Chloroform - Etyl Acetat - Ethanol - Methanol Tiến hành ngâm dầm trong 12h. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi và tính toán kết quả. 2.3.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Trong quá trình trích ly, nồng độ của dung môi càng lớn thì chất tan càng dễ khuếch tán vào trong dung môi [Nguyễn Bin, 2005]. Tuy nhiên đến một ngưỡng nhất định dung môi sẽ bị bão hoà, nên cần khảo sát để tránh lãng phí dung môi bằng cách : Cân chính xác một số túi bột lá xoài với khối lượng là 15g. Tiến hành trích ly trong cùng một điều kiện như nhau ở những bước ngâm dầm. Tuy nhiên, đến giai đoạn ngâm dầm, ta tiến hành ngâm dầm với những thể tích dung môi khác nhau theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi lần lượt là 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11 và 1/12 (g/ml). Ngâm dầm trong 12h. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi nhận và tính toán kết quả. 2.3.3 Khảo sát nồng độ của dung môi : Một loại dung môi có thể được pha loãng ra nhiều nồng độ khác nhau. Việc pha loãng này nhằm mục đích điều chỉnh độ phân cực của dung môi cho sát với độ phân cực của hợp chất ta cần trích ly, từ đó tăng hiệu suất chiết tách. Bên cạnh đó pha loãng dung môi cũng giúp ta tiết kiệm được dung môi và chi phí. GVHD: Lê Thị Thu Dung 29 SVTH: Phạm Thái Quang
  39. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Tiến hành chuẩn bị thí nghiệm như 2 khảo sát trước. Tuy nhiên đến giai đoạn ngâm dầm, ta ngâm dầm bột lá xoài bằng dung môi với các nồng độ thay đổi khoảng 10%, thực hiện từ 4 – 5 lần. Sau đó ngâm dầm trong 12 tiếng. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi nhận và tính toán kết quả. 2.3.4 Khảo sát thời gian ngâm dầm : Đối với kĩ thuật ngâm dầm, một lượng dung môi chỉ có thể hoà tan một lượng nhất định chất tan, nên thông thường kĩ thuật ngâm dầm chỉ được áp dung trong khoảng từ 10 – 24 tiếng. Chính vì thế ta cần phải khảo sát thời gian ngâm dầm nhằm mục đích đạt hiệu suất trích ly tối ưu, tránh gây mất thêm thời gian mà không thu được thêm cao chiết. Tiến hành thực nghiệm qua 3 lần, chuẩn bị thí nghiệm như trên : - Lần 1 : khảo sát thời gian ngâm dầm từ 6 – 15 tiếng. Ta chọn bước nhảy rộng là 3 tiếng nhằm mục đích xác định mốc thời gian thu được cao chiết cao nhất. - Lần 2 : lựa chọn mốc thời gian thu được cao chiết cao nhất từ lần 1 làm chuẩn. Sau đó tiến hành khảo sát với bước nhảy hẹp hơn là 2 tiếng xoay quanh mốc thời gian đó. Xem xét sự thay đổi của 2 tiếng trước và sau mốc thời gian này. Tiếp tục chọn ra mốc thời gian thu được khối lượng cao chiết lớn nhất. - Lần 3 : tiến hành khảo sát mốc thời gian đã chọn ở lần thứ 2 với bước nhảy hẹp hơn là 1 tiếng. Xem xét sự thay đổi khối lượng cao chiết của 1 tiếng trước và sau mốc thời gian đó. Ghi nhận và tính toán kết quả trung bình nhằm tránh sai số. 2.4. Phương pháp định tính thành phần hoá học cao lá xoài bằng phương pháp màu đặc trưng: ➢ Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm GVHD: Lê Thị Thu Dung 30 SVTH: Phạm Thái Quang
  40. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol, ). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn. ❖ Nhận biết Steroid – triterpenoid: dùng thuốc thử Liebermann – Burchard: • Anhidrid acetic 1 ml • H2SO4 đậm đặc  Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính. ➢ Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật. Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform, Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine). Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như ca cao, cà phê, ). Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc. ❖ Thuốc thử Alkaloid: dùng Thuốc thử Wagner: - I2 1,27 g GVHD: Lê Thị Thu Dung 31 SVTH: Phạm Thái Quang
  41. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 - KI 2 g - H2O vừa đủ 100 ml  Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch alcol, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát. ➢ Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa, Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. ❖ Thuốc thử Flavnoid: o Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính. Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát. o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau. Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút. ➢ Khảo sát sự hiện diện của saponin ❖ Định tính saponin trong môi trường acid, base: - Thuốc thử: HCl 0,1N NaOH 0,1N GVHD: Lê Thị Thu Dung 32 SVTH: Phạm Thái Quang
  42. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 - Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử. - Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. - Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm. - Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid. - Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid. ➢ Khảo sát sự hiện diện của Mangiferin có trong cao chiết lá xoài Theo tài liệu [1] các hợp chất có chứa Mangiferin cao có thể được định tính bằng cách: Hoà tan khoảng 0,01 g chế phẩm trong 10 ml hỗn hợp aceton - nước (1:1), thêm 0,01 g magnesi (TT) và 1 ml acid hydrocloric (TT), sau 10 phút sẽ xuất hiện màu vàng cam. Qua đó ta có thể rút ra một vài phương pháp định tính cao chiết lá xoài: Trong một Erlen 250ml, cho vào cao chiết thô (5 gam) và dietyl eter (30 ml), khuấy trộn đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự chiết với dietyl eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết lần cuối không màu. Vậy sẽ có dịch chiết dietyl eter. Phần bã không tan được giữ lại để thực hiện phần tiếp theo. Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết với 3 x 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình long có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter. Lấy lớp nước kiềm cho becher, trung hoà bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi trung tính, sẽ thấy tủa. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hoà tủa này vào 5ml Etanol 80O và chia dung dịch này vào đều trong 5 ống nghiệm: Ống 1: Dùng làm ống đối chứng. Ống 2: Acid hoá với dung dịch HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu thấy có màu đỏ, có thể là Flavonoid. GVHD: Lê Thị Thu Dung 33 SVTH: Phạm Thái Quang
  43. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Ống 3: Phản ứng với dung dịch FeCl3, nếu có màu xanh đậm Akaloid. Ống 4: Phản ứng FeCl3 – dung dịch HCl đậm đặc. Ống 5: Phản ứng với dung dịch NaOH 5%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có Antraglycosid. 2.5. Phương pháp quang phổ GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này GC/MS các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm Hình 2. 9 Hệ thống GCMS Nguyên tắc hoạt động: Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (API, ESI hay APPI), sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu dò. GVHD: Lê Thị Thu Dung 34 SVTH: Phạm Thái Quang
  44. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học: 2.6.1 Phương pháp đo vòng kháng khuẩn : Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C. đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6mm sao cho mỗi giếng cách nhau 2-3 cm. Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy : trong đồ án này nhằm phù hợp với điều kiện nuôi cấy 5 loài vi khuẩn kể trên, chúng ta sử dụng môi trường MHA. Công thức : MHA 19,5g Agar 7g Cách pha chế : Cân đúng khối lượng các thành phần đã cho, định mức lên 500 ml. Sau đó đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6. Hấp 121oC/15 phút, sau đó để nguội 45 – 50oC đổ 20ml/đĩa. Chuẩn bị : Cắt giấy lọc có đường kính 6mm (15 đĩa), hấp ở 121ºC trong 15 phút, sấy ở 150oC trong 10 phút. Tiến hành thí nghiệm : Dùng pipet man hút 100μl vi khuẩn E. Coli (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đó chang đều trên mặt thạch MHA đã khô ổn định, chờ khô bề mặt. Đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm bão hòa tinh dầu nguyên chất, dung dịch 5% tinh dầu và chờ khô rồi đặt lên mặt thạch đã chang vi khuẩn, đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng, các đĩa xung quanh thấm tinh dầu nguyên chất và dung dịch 5%. Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (10oC) khoảng 4 – 8h để tinh dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18giờ. GVHD: Lê Thị Thu Dung 35 SVTH: Phạm Thái Quang
  45. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Dung dịch 5% cao chiết : cao chiết lá xoài được hòa tan trong DMSO 2%, sử dụng chất nhũ hóa là Tween 80 0,2%. Bổ sung 50μL dịch chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10휇g/ml, Tetracyclin 30 휇g/ml, Amoxilin 10휇g/ml); đối chứng âm là DMSO. Đọc kết quả Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức : BK (mm) = D – d Trong đó: D: đường kính vòng vô khuẩn (mm) d: đường kính lỗ khoan thạch (mm) Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình. Tiến hành xác định với các nồng độ khác nhau bằng cách pha loãng dung dịch cao. - Ống nghiệm 1: Pha loãng 1,6g cao chiết bằng 1ml dung dịch DMSO 100%. - Ống nghiệm 2: Pha loãng 0,5 ml từ ống 1 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%. - Ống nghiệm 3: Pha loãng 0,5 ml từ ống 2 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%. - Ông nghiệm 4: Pha loãng 0,5ml từ ống 3 bằng 0,5ml dung dịch DMSO 5%. - Ống nghiệm 5: Kháng sinh tetracyclin pha loãng. - Ống nghiệm 6: Kháng sinh Ampicillin pha loãng. - Ống nghiệm 7: Dung dịch DMSO 100%. 2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá : Một phương pháp đo quang phổ đã được phát triển để xác định định lượng khả năng chống oxy hóa. Xét nghiệm dựa trên việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách GVHD: Lê Thị Thu Dung 36 SVTH: Phạm Thái Quang
  46. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa. Có mối quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Mối quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với nhiều phân loại. Phương pháp thực nghiệm: đánh giá tổng năng lực chống oxy hóa bằng cách cho một lượng 0,1 ml dung dịch mẫu chứa một loại chất khử (trong ethanol) đã được kết hợp trong một ống Eppendorf với 1 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M, natri phosphat 28 mM, và 4 m M amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ ở 95 °C trong 90 phút. Sau khi các mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, độ hấp thụ của dung dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Một dung dịch trắng điển hình chứa 1 ml dung dịch thuốc thử và thể tích thích hợp của cùng dung môi được sử dụng cho mẫu và được ủ trong cùng điều kiện với các mẫu còn lại. GVHD: Lê Thị Thu Dung 37 SVTH: Phạm Thái Quang
  47. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hoá quá trình tạo cao chiết lá xoài 3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi : Bảng 3. 1: Khối lượng cao chiết thu được theo dung môi Tên dung Khối lượng cao chiết thu STT Hiệu suất thu hồi (%) môi được (g) 1 N - hexan 3, 076 20,50 2 Cloroform 3, 942 26,28 3 Etyl Acetat 5, 825 38,83 4 Ethanol 6, 957 46,38 5 Methanol 7, 602 50,68 Việc lựa chọn dung môi trong quá trình trích ly hết sức quan trọng, cần đảm bảo trích ly được các chất mong muốn với hiệu suất cao, chất lượng tinh dầu tốt, đáp ứng yêu cầu kinh tế. Năm loại dung môi khác nhau được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát bao gồm N – hexan, Cloroform, Etyl Acetat, Ethanol và Methanol. Kết quả thể hiện ở bảng dưới đây cho thấy, đối với các dung môi phân cực lớn như methanol, ethanol hiệu quả thu cao chiết cao, đặc biệt là Metanol hiệu suất lớn nhất đạt 50,68%. Trong khi đó, các dung môi không phân cực là N-hexan và cloroform, hiệu suất thu hồi giảm rõ rệt với giá trị tương ứng là 20,50% và 26,28%. (%) Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo dung môi 60 40 46.38 50.68 38.83 20 26.28 20.5 0 N - hexan Cloroform Etyl Acetat Ethanol Methanol Hình 3. 1: Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo dung môi GVHD: Lê Thị Thu Dung 38 SVTH: Phạm Thái Quang
  48. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Mặc dù đều là các dung môi khá rẻ tiền và cho khả năng trích ly cao lá xoài tốt hơn, nhưng Methanol là một dung môi độc, không thân thiện với môi trường. Chính vì thế ta chọn dung môi là Ethanol. Ưu điểm của dung môi này là rẻ tiền, ít độc, thân thiện với môi trường sống và dễ thu hồi. 3.1.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Trong quá trình trích ly, sử dụng lượng dung môi càng lớn thì hiệu quả trích ly càng cao do khả năng khuếch tán của cấu tử vào dung môi càng lớn. [Nguyễn Bin, 2005]. Tuy nhiên, ở một ngưỡng nhất định nào đó hiệu suất thu hồi sẽ tăng lên không đáng kể dù lượng dung môi tiếp tục tăng. Đồng thời, việc sử dụng nhiều dung môi lại gây tốn dung môi, tốn thời gian và năng lượng để đuổi dung môi sau trích ly. Do đó, việc xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là yếu tố rất cần thiết. Các tỷ lệ lần lượt được khảo sát là 1/7, 1/8, 1/9 và 1/10, 1/11 và 1/12. Kết quả được thể hiện như bảng 3.2 sau: Tỷ lệ nguyên Khối lượng cao chiết Hiệu suất thu STT liệu/dung môi thu được (g) hồi (%) 1 1/7 4,731 31,54 2 1/8 5,823 38,82 3 1/9 6,826 45,51 4 1/10 7,069 47,13 5 1/11 7,074 47,16 6 1/12 7,082 47,21 Bảng 3. 2 Tỉ lệ cao chiết thu được theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi GVHD: Lê Thị Thu Dung 39 SVTH: Phạm Thái Quang
  49. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (%) 50 45.51 47.13 47.16 47.21 40 38.82 31.54 30 20 10 0 1/7 1/8 1/9 1/10 1/11 1/12 Hình 3. 2 Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và khối lượng cao chiết thu được Theo biểu đồ hình 3.2 ta thấy khối lượng cao chiết thu được có xu hướng tăng dần khi ta tăng dần lượng dung môi đưa vào. Khi thể tích dung môi tăng lên, các phân tử tạo cao chiết càng có điều kiện thuận lợi để khuếch tán vào trong dung dịch. Tuy nhiên, lượng dung môi đạt đến một giá trị nhất định thì hiệu suất cao chiết thu được không có sự thay đổi nhiều. Ở đây, khi tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đạt 1/10 và 1/12 thì hiệu suất cao chiết lần lượt là 47,16% và 47,21% thể hiện xu hướng giảm và chững lại. Giá trị này có ý nghĩa về mặt thống kê, hiệu suất thu cao chiết thay đổi nhưng không đáng kể khi tiếp tục lượng dung môi thêm vào. Do đó, để đảm bảo tính kinh tế và thời gian thích hợp nhất, tôi lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 cho tiến trình nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3 Kết quả khảo sát nồng độ của dung môi : Khi sử dụng dung môi là Ethanol (cồn) chúng ta có thể pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau. Điều này nhằm thay đổi độ phân cực của dung môi gần sát hơn với độ phân cực của các hợp chất thiên nhiên có trong lá xoài, giúp việc chiết tách dễ dàng hơn và khối lượng cao chiết thu được cũng cao hơn. Bên cạnh đó, phương pháp GVHD: Lê Thị Thu Dung 40 SVTH: Phạm Thái Quang
  50. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 ngâm dầm cần sử dụng một lượng lớn dung môi nên pha loãng sẽ giúp ta tiết kiệm dung môi và kinh phí. Trong nội dung bài đồ án này, ta khảo sát các nồng độ dung môi khác nhau là 96%,90%,80%,70% và 60%. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây : Bảng 3. 3 Tỉ lệ khối lượng cao chiết thu được theo nồng độ dung môi Khối lượng cao chiết Hiệu suất thu hồi STT Nồng độ dung môi thu được (g) (%) 1 96% 6,931 (46,21%) 46,21 2 90% 6,919 (46,13%) 46,13 3 80% 6,916 (46,11%) 46,11 4 70% 6,811 (45,41%) 45,41 5 60% 6,769 (45,13%) 45,13 Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dung môi và khối lượng cao chiết thu được (%) 46.5 46.21 46.13 46.11 46 45.5 45.41 45.13 45 44.5 96% 90% 80% 70% 60% Hình 3. 3 Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dung môi và khối lượng cao chiết thu được Ta có thể thấy qua hình 3.4 nồng độ dung môi ảnh hưởng đến khối lượng cao chiết thu được theo xu hướng là giảm dần. Điều này là do khi dung môi được pha loãng với nước, H+ trong nước rất linh động làm thay đổi tính phân cực của Etanol, giúp dung môi dễ dàng lôi kéo những hợp chất thiên nhiên ra khỏi nguyên liệu. Tuy GVHD: Lê Thị Thu Dung 41 SVTH: Phạm Thái Quang
  51. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 nhiên, nếu ta pha loãng đến một mức độ nào đó, độ phân cực của dung môi giảm mạnh, không còn tương thích với độ phân cực của các hợp chất ta cần tách trong lá thì hiệu suất chiết tách sẽ bị giảm rõ rệt (như trong hình là từ 46,11% giảm còn 45,41%). Bên cạnh đó, hình 3.4 cũng cho ta thấy các nồng độ dung môi Etanol từ 96% đến 80% cũng không có sự thay đôỉ đáng kể về hiệu suất tách chiết. Do đó ta chọn nồng độ dung môi Etanol là 80%. 3.1.4 Kết quả lựa chọn thời gian ngâm dầm : Thời gian ngâm dầm phụ thuộc vào nguyên liệu, dung môi và nồng độ của dung môi. Thông thường, khi thời gian ngâm càng dài thì hiệu suất thu được cao chiết càng tăng. Tuy nhiên, đến một ngưỡng thời gian nhất định, việc tăng thời gian ngâm không làm tăng hiệu quả của việc tách cao chiết. Mặt khác, thời gian ngâm quá lâu còn làm tốn kém về mặt thời gian. Do vậy, xác định thời gian ngâm dầm thích hợp cũng là một yếu tố cần thiết. Việc khảo sát thời gian ngâm dầm được tiến hành theo 3 đợt, sau mỗi đơt khảo sát khoảng thời gian khảo sát thu hẹp dần nhằm tiết kiệm thời gian tìm điều kiện tối ưu cho quy trình. Hiệu quả thu cao chiết được trình bày theo số liệu của bảng 3.4 dưới đây. Bảng 3. 4 Khối lượng cao chiết thu được theo thời gian ngâm dầm Đợt Thời gian Khối lượng cao Hiệu suất thu hồi STT khảo ngâm dầm chiết thu được (g) (%) sát (h) 1 6 3, 421 22,80 2 9 5,212 34,75 Lần 1 3 12 7,078 ~ 47,16 4 15 7,235 48,23 5 10 6,024 40,16 Lần 2 6 12 7,075 ~47,16 GVHD: Lê Thị Thu Dung 42 SVTH: Phạm Thái Quang
  52. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 7 14 7,070 47,13 8 11 7,065 47,10 9 Lần 3 12 7,074 ~47,16 10 13 7,180 47,86 Cũng qua bảng 3.4 ta thấy thời gian ngâm dầm là 12h thích hợp nhất. Điều này thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 3.4 dưới đây với kết quả cân được từ 3 bảng 3.2, 3.3, 3.4. Riêng với mốc thời gian 12h ta tính trung bình cộng để tránh sai số nhiều: (%) Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được 60 47.1 47.16 47.86 50 47.13 48.23 40.16 40 34.75 30 22.8 20 10 0 6h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h Hình 3. 4 Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được 3.2 Kết quả định tính: Phản ứng màu đặc trưng: [3] Hoà tan cao chiết lá xoài bằng Etanol 80O, sau đó tiến hành định tính như chương 2: - Ống 2 : Tác dụng với HCl đậm đặc, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu cam. Có sự xuất hiện của Flavonoids. - Ống 3 : Tác dụng với FeCl3, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu xanh đậm. Có sự xuất hiện của Alkaloids. GVHD: Lê Thị Thu Dung 43 SVTH: Phạm Thái Quang
  53. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 - Ống 4 : Tác dụng với HCl và một ít bột Mg, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng xanh. Có sự hiện diện của Mangiferin. - Ống 5 : Tác dụng với NaOH 5%, dung dịch từ màu vàng nhạt trở nên đậm hơn. Có sự xuất hiện của Antraglycoside. Hình 3. 5: Phản ứng màu đặc trưng Nhận ra sự có mặt của C=O, OH của phenol, phản ứng đặc trưng của một Alkaloid, Flavonoid, Antraglycosid thường thấy trong các hợp chất thiên nhiên. 3.3 Kết quả xác định cấu tử bằng GCMS Trong nghiên cứu này, thành phần hóa học của cao lá xoài được xác định bởi quang phổ GCMS vì phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, có thể phát hiện và phân tích tổng quát để sàng lọc và so sánh các hoạt chất khác nhau. Hình 3. 6: Phổ GCMS so sánh GVHD: Lê Thị Thu Dung 44 SVTH: Phạm Thái Quang
  54. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Cao lá Xoài chiết bằng n-hexane Độ tương hợp TT Rt Tên chất Hàm lượng Mass khối phổ 1 4.043 Diacetone alcohol 5.704 116 906 2 14.517 Neophytadiene 11.99 278 915 3 14.566 Hexa-hydro-farnesol 3.166 228 830 3,7,11,15-tetramethyl-2- 4 14.717 2.187 296 874 hexadecen-1-ol 5 14.879 3-Octadecyne 3.782 250 827 6 15.522 Palmitic acid 1.089 256 827 7 17.161 Phytol 1.474 296 837 8 17.433 Linolenic acid 6.100 278 852 9 20.259 Lupeol 36.18 426 826 10 20.616 Diethylhexyl adipate 9.707 370 845 Methyl (Z)-5,11,14,17- 11 24.587 1.386 318 768 eicosatetraenoate 12 25.252 Dioctyl terephthalate 8.631 390 844 13 26.332 Squalene 1.862 410 831 14 34.468 -Sitosterol 3.227 414 744 GVHD: Lê Thị Thu Dung 45 SVTH: Phạm Thái Quang
  55. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Kết quả quang phổ GCMS được so sánh với dữ liệu theo tài liệu tham khảo [7], tại các peak đặc trưng 15,888 (0,423%); 17,433 (6.1%); 20,16 (9,707%); và 24,587 (1,386%) cho thấy kết quả chiết cao lá xoài thể hiện các peak đặc trưng tương đối gần. Tuy nhiên, các dữ liệu này không quá sát với kết quả tài liệu tham khảo, điều này có thể giải thích do quá trình chiết chưa thực hiện được chính xác giai đoạn tạo tinh lá xoài, sản phẩm còn lẫn nhiều tạp chất, dẫn đến nhiều sai lệch trong kết quả đo quang phổ. GVHD: Lê Thị Thu Dung 46 SVTH: Phạm Thái Quang
  56. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Hình 3. 7: Phổ GCMS của cao chiết lá xoài GVHD: Lê Thị Thu Dung 47 SVTH: Phạm Thái Quang
  57. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Hình 3. 8: Phổ GCMS mở rộng của cao chiết lá xoài GVHD: Lê Thị Thu Dung 48 SVTH: Phạm Thái Quang
  58. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 3.4 Hoạt tính của cao chiết lá xoài tách được: 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn : Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá xoài được khảo sát bằng phương pháp đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết càng mạnh và ngược lại. Bảng 3. 5: Đường kính vòng kháng khuẩn Đường kính vòng tròn kháng khuẩn (mm) STT Nồng độ Bacillus E. Samonella Staphylococus Pseudomonas cereus Coli 1 Tetracylin 12 4 11 9 8 2 Ampicillin - 7 6 - 7 3 DMSO 5% - - - - - Cao lá xoài tươi 4 1600mg/ml 4,3 4,5 5,5 5 4,3 5 800mg/ml 2,16 1,5 2,66 2,83 2,5 6 400mg/ml 1,16 1,25 1,13 1 1,25 7 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,8 Cao lá xoài khô 1 1600mg/ml 4,15 4,2 5,33 4,32 4,12 2 800mg/ml 2,12 1,33 2,60 2,75 2,13 3 400mg/ml 1,10 1,20 1,10 0,90 1,22 4 200mg/ml - 0,72 0,62 0,72 0,73 Bột lá xoài GVHD: Lê Thị Thu Dung 49 SVTH: Phạm Thái Quang
  59. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 1 1600mg/ml 4,05 4 5,2 4,3 4,1 2 800mg/ml 2,10 1,2 2,50 2,55 2,2 3 400mg/ml 1,12 1,20 1,12 0,9 1,15 4 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,7 Chú thích: “-“ có nghĩa không có khả năng kháng khuẩn, kết quả 0,02mm Số liệu khảo sát đường kính vòng kháng khuẩn áp dụng cho 5 loại khuẩn khá phổ biến đó là: Samonella, Bacillus cereus, E. Coli, Staphylococcus và Pseudomonas. Số liệu cung cấp về khảo sát ở điều kiện tương tự với 3 hoạt chất khác là: dạng cao chiết lá khô, dạng cao chiết lá tươi và dạng bột của cao chiết để so sánh. Kết quả khảo sát được trình bày như bảng 3.7 cho thấy tất cả 3 dạng cao chiết từ lá xoài đều có khả năng kháng các vi khuẩn đã lựa chọn và khả năng kháng khuẩn tăng dần theo nồng độ cao chiết tăng, Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ái Lan khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao lá xoài non [hiệu quả hạ glucose huyết của cao chiết lá xoài non (mangifera indica l.) trên chuột bệnh đái tháo đường]. Tuy nhiên, dữ liệu nêu trên cũng cho thấy dạng cao chiết thay đổi (cao hoặc bột) không làm ảnh hưởng đến độ mạnh yếu của khả năng kháng khuẩn của hợp chất do đường kính vòng tròn vô khuẩn dao động trong khoảng nhỏ. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu lá tươi cho cao chiết lá có khả năng kháng khuẩn tốt hơn, có thể do trong lá tươi có chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn hơn từ hợp chất nhóm phenolic và flavonoid. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu lá khô có thể khiến hàm lượng này hao hụt bớt. Tuy nhiên, việc đánh giá này cần những số liệu sâu hơn về hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng. Đối với các chủng khuẩn khác nhau, độ mạnh yếu của khả năng kháng khuẩn thể hiện khá rõ nét. Ở nồng độ thấp, 200mg/ml cao lá xoài không có khả năng kháng Samonella, đối với các chủng khuẩn còn lại, hoạt tính kháng khuẩn cũng thể hiện yếu không rõ ràng. Tuy nhiên, với hoạt chất thương mại như Ampicilin cũng không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn do Samonella là một chủng khuẩn tương đối mạnh. Khi GVHD: Lê Thị Thu Dung 50 SVTH: Phạm Thái Quang
  60. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 nồng độ cao chiết tăng lên 8 lần (1600mg/ml), độ mạnh của vòng kháng khuẩn tăng lên đáng kể, so với Ampicilin (không kháng Samonella và E. Coli) thì khả năng kháng Bacillus cereus, Staphylococus, Pseudomonas lần lượt là 7 ± 0,3 mm, thì khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài đạt khoảng 60 %. So với Tetracylin (cũng có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn) thì hoạt chất kháng khuẩn của cao lá xoài chỉ đạt khoảng 30%. Với những dữ liệu hiện tại, hoạt tính kháng khuẩn của cao lá xoài thể hiễn rõ, đa dạng với các chủng khuẩn, tuy nhiên cần có các phương pháp thử chuyên sâu hơn để đưa ra những kết luận rõ ràng hơn. Cao lá tươi Cao lá khô Bột lá xoài Samonella Bacillus cereus E. Coli GVHD: Lê Thị Thu Dung 51 SVTH: Phạm Thái Quang
  61. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Staphylococus Pseudomonas Hình 3. 9: Kết quả đo vòng kháng khuẩn Nhận xét: Qua bảng 3.8 ta nhận thấy khả năng kháng khuẩn giảm dần từ dạng cao lá tươi, đến cao lá khô và cuối cùng là dạng bột. điều này có thể lí giải do quá trình tạo cao chiết lá khô hoặc dạng bột chúng ta sử dụng nhiệt độ quá nhiều lần làm phân huỷ, mất đi hoặc biến tính khả năng kháng khuẩn của các hợp chất thiên nhiên có trong lá, làm giảm đi tính kháng khuẩn. Bên cạnh đó, ta cũng thấy xu hướng kháng khuẩn cũng giảm theo chiều giảm của nồng độ cao chiết. Riêng với khuẩn Samonella nồng độ 200 uml/mg không thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn. Điều này là do nồng độ của cao chiết lá quá thấp và Samonella cũng là một dòng khuẩn mạnh. Cả 3 dạng chiết đều kháng khuẩn E. Coli, Staphylococcus Aureus mạnh nhất ( > 5mm), nguyên nhân là do trong các dạng chiết này có thể đều chứa hàm lượng lớn Mangiferin, là một hợp chất có tính kháng khuẩn E. Coli và Staphylococcus Aureus mạnh với mức nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) lần lượt là 6,25mg/ml và 50 mg/ml [1]. 3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa Các chất kháng oxy hoá tự nhiên thường là hỗn hợp của nhiều cấu tử có cấu trúc hóa học và nhóm chức khác nhau, vì vậy chúng thường kháng oxy hóa theo nhiều chức năng và phương thức khác nhau. Do đó, một phương pháp đánh giá (một mô hình khảo sát) chỉ mô tả một khía cạnh nào đó của khả năng kháng oxy hóa. Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng phương pháp phosphomolybdenum. GVHD: Lê Thị Thu Dung 52 SVTH: Phạm Thái Quang
  62. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Bảng 3. 6: Mật độ quang của đường chuẩn acid gallic C (흁g/ml) 10 20 30 40 50 A 0,217 0.301 0.432 0.576 0.709 (mg/ml) y = 0.1259x + 0.0693 R² = 0.99238 0.8 0.709 0.7 0.6 0.432 0.5 0.576 0.4 0.301 0.3 0.217 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 Hình 3. 10: Biểu đồ phương trình đường chuấn Acid Galic Bảng 3. 7: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ Một số loại lá Mật độ quang Lá Chè xanh 9,3 Lá Lô hội 1,371 Lá Neem 0.93 Lá Xoài 0.413 GVHD: Lê Thị Thu Dung 53 SVTH: Phạm Thái Quang
  63. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 ĐỘ HẤP THỤ QUANG 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 lá chè xanh lá lô hội lá neem lá xoài Hình 3. 11: So sánh độ hấp thụ quang của một số lá Nhận xét: Ở các loại lá, độ hấp thụ quang ở nồng độ 10 휇g/ml của cao lá Chè xanh cao nên lực kháng oxy hóa của cao lá Chè xanh vượt trội so với các lá còn lại. Cao lá xoài có lực kháng oxy hóa thấp nhất, thấp hơn lá Neem và lá Lô Hội. Nhưng tóm lại cao lá xoài vẫn có khả năng kháng oxy hoá (cần được khảo sát thêm về tiềm năng kháng oxy hóa theo các nồng độ khác nhau và bằng các phương pháp khác). GVHD: Lê Thị Thu Dung 54 SVTH: Phạm Thái Quang
  64. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ a. Kết luận Cao chiết lá xoài được chiết được chiết xuất với dung môi Ethanol 80%, với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10 và được ngâm dầm trong 12h sẽ cho hiệu suất cao chiết thu được cao nhất. Hiệu suất thu được gần 47,16%. Cao chiết lá xoài có chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên như carbonhydrate, Tannin, Akaloids, saponin, steroid, glycoside, flavonoids và protein có tác dụng chống viêm, trị kiết lị, tiêu chảy, cầm máu, rửa vết thương, kháng khuẩn nấm có thể sử dụng trong thuốc bôi da, trị rối loạn đường ruột với nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm, thân thiện với môi trường sống, hoá chất dễ thu hồi có thể dễ dàng áp dụng và công nghiệp với quy mô lớn. b. Kiến nghị Chính vì tiềm năng to lớn về mặt y học và nguyên liệu dễ tìm trong tỉnh BRVT nhưng chưa được khai thác triệt để nhằm mang lại những phương thuốc mới được chiết xuất từ các hợp chất thiên nhiên, thay thế cho kháng sinh trong tương lai và đem lại lợi ích kinh tế từ lá xoài – một thứ xưa nay bị xem là phế phẩm của nông nghiệp- cho tỉnh nhà, chúng ta nên tiếp tục nghiên cứu và phát huy đề tài theo những hướng xa hơn, sâu rộng hơn trong nhiều lĩnh vực, điển hìn - Tối ưu phương pháp chiết tách và tạo cao chiết để đạt được hiệu suất cao hơn trong thời gian ngắn hơn, để dễ dàng đưa vào quy mô công nghiệp. - Nghiên cứu tìm ra cho hết tất cả các hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết lá xoài có ích đối với con người, áp dụng vào y – dược học. - Tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp và thương mại hoá sản phẩm. GVHD: Lê Thị Thu Dung 55 SVTH: Phạm Thái Quang
  65. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Hoá Dược – Mangiferin, Hội đồng dược điển Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội 2. Đỗ Huy Bích, Đặng Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển – Viện Dược Liệu, Vũ Ngọc Lỗ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, năm 2004. Cây Thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà Xuất Bản khoa học và Kĩ thuật Hà Nội, tập II, trang 1015 – 1020. 3. Nguyễn Kim Phi Phụng, năm 2007, Phương pháp cô lập chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, thành phố Hồ Chí Minh, 20 – 21. 4. Nguyễn Viết Tựu -Phân viện Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh. Quy trình công nghệ chiết xuất mangiferin từ lá xoài. Tạp chí dược liệu tập 1, số 2/1996 trang 56-57. 5. Phạm Gia Khôi và Phạm Xuân Sinh (1991), “Nghiên cứu chiết xuất vả xác định Flavonoid mangiferin trong lá xoài”, Tạp chí dược học (số 5), 8, 19 6. Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, 2012, Hà Nội 7. Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ Đào Thắng, Trần Văn Sung, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, Viện Hóa học-Viện Khoa học và Công Nghê Việt Nam, “ Các kết quả tiếp theo về thành phần hóa học của cây Chóc máu Salacia Chinensis”, Tạp chí Hóa học, T.47 (4A), trang 192 - 196, 2009. 8. Trần Thị Phương Anh, Nguyễn Tiến Bân, Lê Kim Biên (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 9. Trương Thế Quang, Giáo trình Tin thống kê sinh học (Biostatistical Informatics), Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Dân Lập Văn Lang, trang 32-33 10. Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục, Hà Nội GVHD: Lê Thị Thu Dung 56 SVTH: Phạm Thái Quang
  66. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 11. Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà Xuất Bản khoa học và kĩ thuật Hà Nội, tập II Tài liệu tiếng Anh 12 Bito T. et al (2002), “Flavonoids differentially regular IFN gamma induced ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of action”, FEBS Letters, vol. 520, pp. 145-152. 13 Chongming Wu, Jingyao Shen, Pingping He, Yan Chen, Liang Li, Liang Zhang, Ye Li, Yujuan Fu, Rongji Dai, Weiwei Meng, and Yulin Deng (2012), “The α-Glucosidase inhibiting isoflavones isolates from Belamcanda chinensis leaf extract”, Rec. Nat. Prod., vol. 6:2, pp. 110-120. 14 Elliott Middleton J. R. et al. (2000), “The effects of flavonoids on Mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease and cancer”, Pharmacol. Rev., vol. 52, pp. 673-751. 15 Ian S. E. Bally, April 2006. Mangifera Indica (MANGO). Species profiles for Pacific Island Agroforestry, ver. 3.1, p 1-5, htpt: www. Traditionaltree.org 16 Jeffrey B. harborne FBS and Herber Baxter (1999), The hand book of natural flavonoids, Vol 2. 17 Julia F. Morton, Miami, FL. Fruits of warm climates. Morton J, 1987, p 221- 239 18 Flora of China Editorial Committee (2008), Flora of china vol 11, Missouri Botanical Garden Press and Science Press, China, 338 - 339. 19 Hasbarinda Binti Hasan, 11 - 2008. Chemical constituents of the twigs of Mangiferin Indica (manga telor). Bachelor of science (Hons) chemistry faculty of applied science university technology mara. 20 Jieping Qin, Jiagang Deng, Xu Feng, Qin Wang, Shengbo Wang (2008), “Quantitative” RP - LC Analysis of Mangiferin and Homomagiferin in GVHD: Lê Thị Thu Dung 57 SVTH: Phạm Thái Quang
  67. Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019 Mangiferin indica L.Leaves and in Mangifera persiciforma C.Y.Wu et T.L Ming Leaves”, Chromatographia, 68 (11-12), 21 KA Shah, MB Patel, RJ Patel, PK Parmar. Mangifera indica (Mango). Department of Pharmacognosy, K.B. Raval College of Pharmacy, Shertha, Gandhinagar, Gujarat, India, p.328-324 22 Macleoad A.J; Pieris N.M (1984) “Comparison of the volatile components of some mango cultivars”, Phytochemistry, 23, 361 – 366 23 Muruganandan S, Gupta S, Kataria M, Lal J, Gupta Pk (2001), “Mangiferin protects the streptozotocin-induced oxidative damage to cardiac and renal tissues in rats”, Toxicology 176,165 - 173. 24 Muhammad Najumul IsLamKhan, 1992. Studies in the chemical constitents of flowers and root bark of mangifera indica L. Department of Chemistry university of Karach, Karachi, Pakistan, March, p 35- 75. 25 M. J. Tunon, M. V. Garcia-Mediavilla, S. Sanchez-Campos, and J. Gonzalez- Gallego (2009), “Potential of flavonoids as anti-inflammatory agents: modulation of pro-inflammatory gene expression and signal transduction pathways”, Current Drug Metabolism, vol. 10, no. 3, pp. 256– 271. 26 Miller, A.L. (1996), “Antioxidant Flavonoids: Structure, Function and Clinical Usage”, Alternative Medicine Review, vol. 2(1), pp. 103-111 S. K. Singh, Y. Kumar, S. Sadish Kumar, V. K. Sharma, K. Dua, and A. Samad – D. J. College of Pharmacy, 2009 May – Jun, Antimicrobial Evaluation of Mangiferin Analogues. Niwari road, Modinagar – 201, India, ITS Paramedical College (Pharmacy), Muradnagar, Ghaziabad, J Pharm Sci, 71(3), p 328 – 331. GVHD: Lê Thị Thu Dung 58 SVTH: Phạm Thái Quang