›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid từ lá cây đu đủ (Carica Papaya)

pdf 56 trang thiennha21 15/04/2022 5910
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid từ lá cây đu đủ (Carica Papaya)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_flavonoid_tu_la_cay_du_du_ca.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần flavonoid từ lá cây đu đủ (Carica Papaya)

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC CAO THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ HÀ NỘI - 2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC CAO THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI - 2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, các anh chị và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới: PGS.TS Nguyễn Văn Bằng, người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. TS Phạm Hải Yến, người đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị trong phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình em thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn giúp đỡ, cổ vũ và động viên em trong suốt thời gian qua. Vĩnh Phúc, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Cao Thị Thu Thảo
  4. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc kí cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mas Spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mas Spectrometry HMBCHeteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQCHeteronuclear Multiple Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử mhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mas Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy ME Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  5. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây đu đủ 33 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất CP3 và CP4 34 Hình 4.1.a: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP3 36 Hình 4.1.b: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP3 37 Hình 4.1.c: Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất CP3 37 Hình 4.1.d: Cấu trúc hóa học của hợp chất CP3 38 Bảng 4.1.1: Bảng số liệu phổ của hợp chất CP3 39 Hình 4.2.a: PHổ 1H của hợp chất CP4 40 Hình 4.2.b: Phổ 13C của hợp chất CP4 41 Hình 4.2.c: Phổ 13C và DEPT của hợp chất CP4 41 Hình 4.2.d: Cấu trúc hóa học của hợp chất CP4 42 Bảng 4.2.1: Bảng số liệu phổ của hợp chất CP4 43
  6. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1.Tổng quan chung về cây đu đủ (Carica papaya) 3 1.1.1. Mô tả 3 1.1.2. Phân bố 4 1.1.3. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ 4 1.1.4. Tình hình nghiên cứu về thành phần h a học của cây đu đủ trong nước 8 1.2. Giới thiệu về lớp chất flavonoid 13 1.2.1. Giới thiệu chung 13 1.2.2. Các nhóm flavonoid 13 1.2.2.1. Flavon và flavonoid 13 1.2.2.2. Flavanonol 15 1.2.2.3. Izo flavonoid 15 1.2.2.4. Auron 16 1.2.2.5. Anthocyanin 16 1.2.2.6. Catechin 17 1.2.2.7. Leucoanthocyanidin 17 1.2.2.8. Rotenoid 18 1.2.2.9. Neoflavonoid 18 1.3. Tổng quan chung về phương pháp chiết 19 1.3.1 Đặc điểm chung của chiết 19 1.3.2. Qúa trình chiết thực vật 19 1.3.2.1. Chọn dung môi chiết 19 1.3.2.2. Qúa trình chiết 20 1.4. Tổng qua chung về phương pháp sắc ký 21 1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 21
  7. 1.4.2. Cơ sở của quá trình sắc ký 22 1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký 22 1.4.3.1. Sắc ký cột 25 1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng 26 1.5. Một số phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. 27 1.5.1. Phổ hồng ngoại(Infrared spectroscopy, IR) 27 1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 27 1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 27 1.5.4. Phổ 1H-NMR 28 1.5.5. Phổ 13C-NMR: 28 1.5.6. Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 28 1.5.7. Phổ 2D - NMR 28 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Mẫu thực vật 30 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 30 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng 30 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế 30 2.2.3. Sắc ký cột 30 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 30 2.4. Dụng cụ và hóa chất 31 2.4.1. Dụng cụ 31 2.4.2. Hóa chất 31 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 32 3.1. Phân lập các hợp chất 32 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất 34 3.2.1. Hợp chất CP3 34
  8. 3.2.2.Hợp chất CP4 35 CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 36 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất CP3 36 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất CP4 39 KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
  9. MỞ ĐẦU Thế giới thực vật rất phong phú và đa dạng, n cung cấp cho con người nguồn tài nguyên vô cùng quý giá đặc biệt là những hợp chất c hoạt tính sinh học. Các hợp chất thứ cấp được phân chia thành các nh m cơ bản như: terpenoid, alcaloid, steroid, flavonoid Trong quá trình tiến h a của mình, hợp chất thứ cấp đ ng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và phát triển của thực vật, g p phần bảo vệ thực vật trước sự tấn công của động vật ăn cỏ, vi khuẩn, các điều kiện bất lợi của môi trường Vì vậy các hợp chất thứ cấp c hoạt tính sinh học đ ng một vai trò hết sức quan trọng trong việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, cây trồng, các thuốc bảo vệ thực vật, các chất kích thích, điều hoà sinh trưởng động thực vật và làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm. Cho đến nay, cây thuốc và động vật làm thuốc đã được nhiều dân tộc trên thế giới sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau. Theo thống kê sơ bộ, ở một số nước châu Á và châu Phi, 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền trong việc chăm s c sức khỏe cơ bản. Ở nhiều nước phát triển, 70 % đến 80 % dân số đã sử dụng các cây thuốc hoặc chế phẩm của n . Các loài thảo mộc đã được sử dụng trong dân gian, được chứng minh bởi các nghiên cứu dược lý đã tạo ra nhiều loại thuốc Tây. Trong vài thập kỉ qua, với các bài thuốc dân gian trong đ dược liệu cổ truyền đ ng vai trò là nguồn nguyên liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc. Hơn nữa việc nghiên cứu h a học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc c ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất, lý giải công dụng ngăn ngừa bệnh đã được sử dụng trong các bài thuốc dân tộc, và phát hiện các hợp chất thể hiện hoạt tính giúp định hướng trong bào chế và phát hiện các thuốc mới. 1
  10. Việt Nam được đánh giá là nước đứng thứ 16 trên thế giới về sự phong phú và đa dạng sinh vật. Trong đ , hệ thực vật cũng rất phong phú và đa dạng. Sự đa dạng về các loài cây thảo dược ở Việt Nam đã g p phần không nhỏ cho sự phát triển nghành y học cổ truyền của nước ta, bên cạnh đ n cũng đ ng g p một vai trò rất lớn đối với nghành y học hiện đại. Hiện nay các nhà khoa học rất quan tâm đến các hợp chất c hoạt tính sinh học trong thực vật. Việc nghiên cứu về thành phần h a học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc c giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý và hiệu quả c tầm quan trọng đặc biệt. Theo hướng nghiên cứu trên, kh a luận tập chung nghiên cứu, phân lập các hợp chất Flavonoid trong lá cây đu đủ (carica papaya), nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới, cũng g p phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền. 2
  11. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan chung về cây đu đủ (Carica papaya) 1.1.1. Mô tả - Tên khoa học: Carica papaya L. - Họ: Caricaceae hay Papayae - Chi: Carica Cây đu đủ cao khoảng 3 đến 7m, đường kính gốc có thể đạt 30cm. Thân thẳng, ít hoặc không phân nhánh, mang nhiều sẹo lá, các đốt sít nhau. Lá đơn, mọc thành chùm ở ngọn cây, sắp xếp theo đường xoắn ốc bao quanh ở đỉnh, có bản rộng. Lá chia thành nhiều thùy, thường số thùy lá ổn định khi cây đã đạt 8-9 lá với số thùy biến động từ 7-9 thùy. Phiến lá đạt kích thước từ 60-100cm. Cuống lá đạt độ dài từ 70-90 cm. Hoa của cây đu đủ thường có ba loại: hoa đực, hoa cái, hoa lưỡng tính. Hoa mọc ở nách lá, thời gian từ khi hoa nở đến khi tàn là 3-5 ngày, thường nó chỉ nở vào ban đêm. Quả thuộc loại quả thịt, hình dáng và độ lớn quả thay đổi tùy giống, hình dạng quả thường gặp: dài, ovan, lê, tròn Khi quả chưa chín c màu xanh chuyển sang xanh đậm, xanh sữa và khi chín có màu vàng hoặc màu vàng da cam, vàng sẫm. Quả đu đủ trung bình có 300-500 hạt, tùy thuộc vào việc thụ phấn và ngoại cảnh tác động thì lượng hạt trong quả có thể nhiều hay ít. Hạt già c màu đen hoặc xám và thường chìm trong nước, bên ngoài hạt có lớp vỏ lụa mỏng bao quanh. Rễ của cây đu đủ là loại rễ chùm, rễ đâm nhánh mạnh khi điều kiện thuận lợi nhưng mọc xuống sâu kém. Đu đủ không có rễ cái mà chỉ có rễ con, trên cây có hai loại rễ: rễ cố định và rễ hút. Rễ nhỏ mềm, giòn, dễ bị tổn thương do cơ giới cũng như ngập úng hoặc khô hạn. Rễ thường phân bố rất nông, tập trung trong tầng đất 0-30 cm. 3
  12. 1.1.2. Phân bố Nguồn gốc cây đu đủ là vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau đ được phổ biến đi khắp nơi. Hiện nay, cây đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới và vùng nhiệt đới ẩm châu Á trong phạm vi 32o Bắc - 32oNam, ở những nơi c nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 15oC. Tuy nhiên với những tiến bộ trong công tác chọn và tạo giống đã tạo ra một số giống tương đối chịu lạnh. Ở Việt Nam đu đủ được trồng ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng như Hà Tây, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tuyên Quang, Hưng Yên, Tiền Giang, Bình Dương. Trên thế giới trồng nhiều đu đủ như ở Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Úc, Mỹ 1.1.3. Nhữ g ghi cứu ề h h i h học củ cây đu đủ Các phương pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dược lý của thực vậy được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2,8, 13, 21]. Hoạt tính sinh học của các bộ phận của cây đu đủ như lá, quả, nhựa được các nhà khoa học trên thế giới công bố khá phong phú. Tác dụ g h chế i h ả . Năm 1978, Gopalakrishnan và cộng sự nghiên cứu tác dụng hạn chế sinh sản của đu đủ, thử nghiệm bằng cách cho chuột đang thì sinh sản và đang mang thai ăn các phần khác nhau của cây đu đủ. Chuột được cho ăn tự nhiên, không bị thúc ép và kết quả ghi nhận quả đu đủ xanh c tác dụng làm ngưng chu kỳ rụng trứng và gây trụy thai. Hoạt tính này giảm khi quả chín và progesterone thêm vào thực phẩm giúp tái tạo sự cân bằng, các bào thai chưa bị trụy tiếp tục phát triển bình thường [19]. Năm 2000, Lohiya N và cộng sự nghiên cứu trên in vitro. Dịch chiết từ hạt đu đủ bằng chloroform, benzen, methanol và ethylacetat được thử nghiệm về hoạt tính trên độ di động của tinh trùng ghi nhận tác động diệt tinh 4
  13. trùng, tác động này tùy thuộc vào liều lượng: sự di động của tinh trùng giảm nhanh xuống còn < 20% và ngưng hẳn sau 20-25 phút ở mọi nồng độ thử nghiệm. Xét nghiệm qua kính hiển vi ghi nhận c sự thay đổi rõ rệt nơi màng plasma ở đầu tinh trùng và ở giữa thân tinh trùng, các tinh trùng này mất hẳn khả năng truyền giống [23]. Cùng năm 2000, Pathak N và cộng sự nghiên cứu phần chiết bằng benzen từ hạt đu đủ, khi thử trên chuột bạch tạng cho thấy: trọng lượng chuột, trọng lượng dịch hoàn, tinh nang, nhiếp hộ tuyến không thay đổi, nhưng độ di động của tinh trùng, số lượng tinh trùng đều giảm và số tinh trùng dị dạng gia tăng kéo dài trong 60-150 ngày [26]. Tác dụ g cu g Năm 2001, Sripanidkulchai và cộng sự công bố nghiên cứu tinh nhựa đu đủ (Papaya latex extract=PLE) được thử nghiệm trên tử cung chuột (in vitro) vào những giai đoạn khác nhau của chu kỳ rụng trứng và giai đoạn mang thai: PLE gây gia tăng sự co thắt của tử cung trong giai đoạn trước khi rụng trứng và rụng trứng. Tác dụng gây co thắt cao nhất ở giai đoạn cuối của kỳ mang thai, tương ứng với lúc nồng độ estrogen lên cao nhất. Nhựa đu đủ được cho là c chứa một hoạt chất gây co thắt tử cung, hoạt chất này c thể là một hỗn hợp các men, alkaloid tác động trên tử cung qua các thụ thể α- adrenergic [30]. Tác dụ g i iểu. Năm 2001, Sripanidkulchai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ rễ đu đủ, cho chuột uống liều 10mg/kg, gây gia tăng khối lượng nước tiểu tống xuất ra ngoài (p< 0,01), so sánh được với hydrochlorothiazid, và sự tống xuất các chất điện giải trong nước tiểu cũng c các thông số tương tự. Hoạt tính này được giải thích là do ở lượng muối khoáng tương đối cao trong dịch chiết [30]. 5
  14. Tác dụ g há g i h há g . Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá đu đủ c tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và Staphylococcus aureus. Cao chiết từ vỏ và hạt c tác dụng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri. Benzyl isothiocyanate phân lập từ đu đủ, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella. Rễ đu đủ c tác dụng kháng khuẩn yếu [1]. Năm 2011, Rahman và cộng sự nghiên cứu dịch chiết bằng ethanol 95% của lá và thân đu đủ được thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dương tại nồng độ 5 và 10 mg/ml. ết quả chất chiết từ lá c khả năng kháng khuẩn tốt hơn chất chiết từ thân. Nồng độ ức chế tối thiểu của lá 1250 - 5000 μg/l, của thân 1250 - 10000 μg/l [28]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine c khả năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml (với IC50 > 128 µg/ml) [6]. Tác dụ g ị u ƣớu u g hƣ. Năm 2001, tác giả Phạm im Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ c tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [9]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ c tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô B, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, 6
  15. ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [3]. Năm 2002, Rahmat và cộng sự đã kiểm tra khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, ung thư gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene tách chiết từ quả đu đủ và dưa hấu, và nước ép quả đu đủ. ết quả, nước ép quả đu đủ và lycopene tinh khiết đã ức chế tế bào ung thư gan Hep G2 với IC50 tương ứng là 20 mg/ml và 22,8 µg/ml. Tuy nhiên, nước ép quả đu đủ và lycopene tinh khiết đều không ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MDA-MB-21. Lycopene chiết từ quả đu đủ không ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào khác [12]. Năm 2006, Rumiyati và cộng sự đã chứng minh trong lá đu đủ c chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs c khả năng gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/ml. Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein c chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D. Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63%. Các kết quả này cho thấy RIPs c khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thư [27]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ c khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô B (IC50 = 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/ml). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh c hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô B, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [6]. 7
  16. Năm 2015, Marline Nainggolan và asmiru công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa Đu đủ đực c tác dụng gây độc tế bào trên MCF-7 dòng tế bào ung thư vú [14]. Tác dụ g chống oxi hóa. Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiều loại bệnh trong cơ thể, trong đ c ung thư. Gốc tự do được tạo ra trong cơ thể bởi nhiều cách khác nhau như: ô nhiểm môi trường, chất ph ng xạ, thuốc-h a chất, căng thẳng thần kinh Năm 2010, Srikanth và cộng sự dùng nước để chiết các chất c trong lá đu đủ. Chất chiết thu được đem thử hoạt tính chống oxy h a bằng các phương pháp khác nhau như: DPPH, 2,2-azinobis- (3-ethyl benzothiazoline-6- sulphonate), axit nitric, superoxit, hydroxylion và lipid peroxidase. Giá trị IC50 tương ứng của các phương pháp là: 198, 185, 244, 323, 461 và 922µg/ml [31]. Các ác dụ g dƣ c hác. Ngoài những hoạt tính sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh c tác dụng như kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng giảm thời gian đông máu, kháng viêm Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm của dịch chiết cồn từ lá cây đu đủ [15]. Năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết lá đu đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở chuột [32]. Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpaine trong lá đu đủ [7]. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá đu đủ. ết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ 8
  17. lệ tương ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [5]. Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá đu đủ. Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene- 3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol. Trong đ , sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ [10]. Hình 1.2: β- sitosterol Hình 1.3: co te o Hình 1.4: te c in Hình 1.5: Cycloart-25-ene-3β,24 (R/ )-diol Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá đu đủ bằng các dung môi c độ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Trong đ carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được chiết ra từ lá đu đủ [6]. 9
  18. 1.1.5. T h h h ghi cứu ề h h h h học củ cây đu đủ g i ƣớc Trên thế giới, Năm 1965, Govindachari Go, Nagarajan và Viswanathan đã xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alkaloid được chiết xuất từ lá đu đủ [20]. Hình 1.6: Carpaine Hình 1.7: Pseudocarpaine Năm 1979, Chung - Shih Tang đã phân lập được 2 alkaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá đu đủ [16]. Cấu trúc của chúng. N N H Hình 1.8: Dehydrocarpaine I Hình 1.9: Dehydrocarpaine II Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là prunasin và sambunigrin trong lá và thân đu đủ [17]. 10
  19. Hình 1.10: Prunasin Hình 1.11: Sambunigrin Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: axit caffeic: axit p - coumari; axit protocatechuic; kaempfero; quercetin và 5,7- dimethoxycoumair. Cấu trúc phân tử của một số phenolic trong lá đu đủ như sau [11]. Hình 1.12: 5,7 - dimethoxycoumair Hình 1.13: Axit protocatechuic Hình 1.14: Axit chlorogenic 11
  20. Năm 2008 rishna .L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần h a học các bộ phân cây đu đủ [22]. Quả: Protein, chất béo, xenluloza, carbohydrate, chất khoáng, Ca, P, Fe, vitamin C, B, B2, niacin và carotene, amino axit, acit citric, acid malic(quả xanh), linalool, benzylisothiocyanate, cis và trans 2,6-dimethyl -3,6 epoxy-7 octen-2-ol, alkaloid, carpain, benzy-β-D-glucoside, 2-phenylethyl-β- D-glucoside, 4-hydroxyphenyl-2 ethyl -β-D-glucoside và 4 đồng phân benzyl-β-D-glucoside. Nước ép quả: N-butyric, n-haxanoic và n-octanoic acid, lipid, các acid myristic, palmatic, stearic, lioleic, linolenic, cis-vaccenic và oleic. Hạt: acid fatty, protein, chất xơ, dầu, carpaine, benzylisothiocyanate, benzylglucosinolate, glucotropacolin, benzylthiourea, hentriacontane, β-sitosterol, caricin và enzym myrosin. Rễ: carposide và enzym myrosin. Lá: alkaloid carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II, choline, carposide, vitamin C,E. Vỏ cây: β-sitosterol, glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol. Nhựa mủ: Enzym proteolytic, papain và chemopapain, glutamine cyclotransferase, chymopapain A,B và C, peptid A và B và lysozyme. Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố Nghiên cứu thành phần h a học của hoa Đu đủ ở Nigeria. Cho kết quả trong hoa chứa saponin(0.07%), alkaloid(0.05%), tannin(0.002%) và flavonoid(2.8%). Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [29]. 12
  21. Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan , asmirul công bố kết quả trong hoa đu đủ đực c chứa các thành phần gồm triterpenoids / steroid, flavonoid, tannin, và glycosides, saponin [24]. 1.2. Giới hiệu ề ớ ch f id 1.2.1. Giới hiệu chu g Flavonoid là một nh m hợp chất poliphenol, chúng đa dạng về cấu trúc h a học và tác dụng sinh học. Flavonoid c mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt là trong các tế bào thực vật, c bộ khung h a học là C6 - C3 -C6 , trong C6 là vòng benzen. Chúng được phân loại dựa theo nh m C3 và các glicosit của n c màu vàng nhạt, màu ngà antoxianin, antoxianiđin đỏ, xanh, tía và các dạng không màu như: isoflavon, catecin và leucoantoxianiđin, là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào. Các flavonoid là dẫn xuất của 2 - phenyl chroman (flavan). Các phân lớp trong đ được xác định bởi sự biến đổi trạng thái oxy h a của phần C3. 1.2.2. Các nhóm flavonoid 1.2.2.1 Flavon và flavonol C công thức cấu tạo như sau: 13
  22. Nhóm flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Trong thực vật, chúng thường không tồn tại dưới dạng dưới dạng tự do mà chúng thường tồn tại dưới dạng glycozit. Trong quá trình phân lập hóa thực vật, một số flavon thường thấy khá nhiều như quercetin( phổ biến rộng rãi nhất), primuletin, fisten. 14
  23. 1.2.2.2 Flavanonol Flavononol có tên gọi khác là flavanon-3-ol hay dihydroflavonol. Các hợp chất flavononol thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin. 1.2.2.3 Izo flavonoid Izo flavonoid được chia thành 3 nhóm nhỏ là: Izoflavon, Izoflavanon và Izoflavan. 15
  24. 1.2.2.4. Auron Có công thức cấu tạo chung như sau: 1.2.2.5. Anthocyanin Các anthocyanidin có thể chia thành 3 nhóm: Pelargonidin, xyanidin và delfinidin 16
  25. 1.2.2.6. Catechin Là dẫn xuất flavan-3-ol. Chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang do có hai trung tâm cacbon bất đối. Như các cặp catechin và epicatechin. Trong đ chỉ có (+) - catechin và (-) - epicatechin xuất hiện trong thiên nhiên 1.2.2.7. Leucoanthocyanidin Là những flavan-3, 4-diol, có hai hợp chất phổ biến nhất là: 17
  26. 1.2.2.8. Rotenoid Rotenon là chất đặc trưng nhất,có công thức cấu tạo như sau: 1.2.2.9. Neoflavonoid 18
  27. 1.3 Tổng quan chung về hƣơ g há chiết 1.3.1 Đặc điểm chung của chiết Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa lẫn với nó. - Chiết nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ của một dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. - Có thể dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp. thường được dùng trong phân ly các hợp chất thiên nhiên. 1.3.2 Quá trình chiết thực vật 1.3.2.1 Chọn dung môi chiết Dung môi phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, c tính trơ, không độc, không dễ bốc cháy Các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây c độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Các dung môi dùng trong quá trình chiết cần được lựa chọn rất cẩn thận. Nếu dung môi có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vậy nên những dung môi này được chưng cất để được dạng sạch trước khi sử dụng. Có một vài chất dẻo thường bị lẫn trong dung môi như: tributylphostphat và tri-n-butyl axetylcitrat, diankyl phtalat. Chúng có thể bị lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong quá trình bảo quản. Metanol và cloroform thường chứa dioctylphtalat [di-( 2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat ]. Chất này sẽ gây nên sự sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu thực vật. Mặt khác chất này còn thể 19
  28. hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây (lá, thân, rễ, hoa ), người ta thường chọn những dung môi như: clorofom, metylenclorit và metanol. Metanol và etanol 80% là dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Nghiên cứu cho rằng các dung môi thuộc nh m rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform thấp hơn, chúng c thể rửa các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan được phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol, các chất này cũng sẽ bị hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước c đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Để thu dịch chiết thô từ cây người ta ít khi sử dụng nước mà thay vào đ sử dụng dung dịch nước của metanol. Sau khi chiết thì dung môi được tách ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 400C, với những hóa chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện được ở nhiệt độ cao hơn. 1.3.2.2 Quá trình chiết Thường sử dụng một trong hai phương pháp sau: + Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình Xohlet: Là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn trong một thời gian rồi rút ra + Chiết ngâm: Là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật. Được tiến hành như sau: Ban đầu ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian, sau đ chiết dung môi ra (chiết nguội). 20
  29. Mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ, sau lấy chất chiết ra. Vì vậy bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục. Lưu ý, sau khi chiết 3 lần dung môi, cặn thu được hầu như không còn chứa những chất có giá trị nữa. Để kết thúc quá trình chiết, người ta xác định bằng một số cách như sau: - Với các ancanoid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Dragedoff, Mayer. - Flavonoid thường là những chất có màu, vì vậy khi dịch chảy ra mà không có màu thì chứng tỏ rằng đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. - Đối với các chất béo khi chiết, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp theo sẽ thể hiện sự kết thúc của quá trình chiết. - Với các lacton sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sự xuất hiện của các hydrat cacbon khi cho phản ứng với anilin axetat. Và từ đ c thể xác định được khi nào thì quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt được hiệt quả cao nhất có thể 1.4 Tổng quan chung về hƣơ g há ắc ký Phương pháp sắc ký (chromatography) là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, n được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ n i chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 1.4.1 Đặc điểm chung củ hƣơ g há ắc ký Sắc ký là phương pháp dựa vào sự phân bố khác nhau giữa hai pha động và pha tĩnh để tách, phân li, phân tích các chất 21
  30. Sắc ký gồm hai pha là pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính tan, tính bị hấp thụ ). Các chất khác nhau sẽ bị ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ làm lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. 1.4.2 Cơ ở của quá trình sắc ký Định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir: là định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần). Gn = n∞bC ∕ (1 + bC) n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng. n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đ . b - hằng số. C - nồng độ của chất bị hấp phụ. 1.4.3 Phân lo i các hƣơ g há ắc ký Trong phương pháp sắc ký: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh thường là chất lỏng hoặc rắn. Theo bản chất của hai pha sử dụng: - Pha tĩnh c thể là chất rắn hoặc chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lí, n c thể nạp nén vào trong một cột. + Pha tĩnh là chất lỏng: c thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang. - Pha động c thể là chất lỏng hoặc chất khí. 22
  31. + Pha động là chất khí: thí dụ trong sắc ký khí. Trong trường hợp này chất khí gọi là khí mang hay khí vecto. + Pha động là chất lỏng: thí dụ trong sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. Theo bản chất của hiện tượng sảy ra trong quá trình phân tách chất. - Sắc ký phân chia. + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí. + Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất mỏng với chiều dày rất mỏng, chất mỏng này được nối h a học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn. - Sắc ký hấp thụ. + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí. + Pha tĩnh là chất rắn: đ là những hạt rắn nhuyễn mịn, c tính trơ được nhồi trong một ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng các hạt silicagel hoặc alumin. - Sắc ký trao đổi ion. + Pha động chỉ c thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, c cấu tạo h a học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nh m chức hoá học ở dạng ion. C hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. - Sắc ký lọc gel + Pha động chỉ c thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, đ là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt c nhiều lỗ rỗng. - Sắc ký ái lực + Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột c nh m h a học kết dính bằng liên kết cộng h a trị. Một protein c ái lực với nh m h a học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở. 23
  32. + Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. - Sắc ký lỏng cao áp. ỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột c khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã c sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ c nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải c một áp lực tác động lên cột để c được một tốc độ chảy thích hợp. Phân loại sắc ký theo cấu hình. Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng Trong sắc ký giấy: + Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos. + Pha động: là chất lỏng. Trong sắc ký lớp mỏng: + Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silicagel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. + Pha động luôn luôn là chất lỏng. - Sắc ký cột hở cổ điển + Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc kí sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở đầu dưới gắn một khóa. + Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt trên bề mặt của pha tĩnh. + Pha động là dung môi liên tục được r t vào đầu cột. Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Theo cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành những nhóm nhỏ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. 24
  33. 1.4.3.1 Sắc ký cột Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại là pha tĩnh gồm các loại là silicagen (c kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ thì hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. hi độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ c kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC) nếu lực trọng trường không đủ lớn gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Trong các sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, nghĩa là phụ thuộc vào hỗn hợp của chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Dựa vào sự khác nhau về Rf này mà người ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ của chất so với tỷ lệ của chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (từ 1/5 - 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức là phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20- 1/30. Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silicagen rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì sẽ đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. 25
  34. C hai cách để đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này thì chất hấp phụ sẽ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đ dung que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đ dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. - Cách 2: Nhồi cột ướt, chất hấp phụ được đưa hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đ đưa dần dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột cần phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gẫy, dò. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và làm ảnh hưởng đến tiến độ công việc. 1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (S LM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. S LM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagen trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, S LM còn được dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng S LM điều chế (bản được tráng silicagen dày hơn), c thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng silicagen có chứa các chất tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. 26
  35. 1.5. Một số hƣơ g há xác định c u trúc của các h p ch t hữu cơ. 1.5.1 Phổ hồng ngo i(Infrared spectroscopy, IR) Để xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, người ta dựa vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm -OH tự do trong nhóm cacbonyl khoảng 1700- 1750 cm-1 1.5.2 Phổ khối ƣ ng (Mass spectroscopy, MS) Có các phổ khối lượng sau: - Phổ EI - MS (Electron ImpactIonization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV. - Phổ ESI - MS ( Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) có tên là phổ phun mù điện tử Được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI - MS, do đ phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ. - Phổ FBA (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đ , phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử. - Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. 1.5.3 Phổ cộ g hƣởng từ h t nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) Các phương pháp phổ NMR (Phổ proton và phổ cacbon) có nguyên lý chung là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Và đặc trưng của phân tử còn được xác định vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). 27
  36. 1.5.4 Phổ 1H-NMR Trong phổ này thì độ chuyển dịch hóa học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin mà ta c thể xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất. 1.5.5 Phổ 13C-NMR: Thang đo của phổ 13C-NMR lad ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm. 1.5.6 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ này cho chúng ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn sẽ bị biến mất. Tín hiệu của CH 0 và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Trên phổ DEPT 900 chỉ có thể xuất hiện của các CH. 1.5.7 Phổ 2D - NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: - Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H- NMR, còn trục kia là 3C - NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. - Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) (1H - 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. 28
  37. - Phổ HMBC (Heteronuclear Muliple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. 29
  38. CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu lá đu đủ (Carica papaya L) được thu hái tại Lập Thạch, Vĩnh Phúc vào tháng 8 năm 2017. 2.2 Phƣơ g há hâ ập các h p ch t 2.2.1 Sắc ký lớp mỏng Được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60GF254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. 2.2.2 Sắc ký lớp mỏ g điều chế SKLM điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại c hai bước sóng 254nm và 365nm, hoặc cắt bìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ n ng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đ cạo lớp silicagen có chất, phản hấp thụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp. 2.2.3 Sắc ký cột Được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường (0,040-0,063, Merck) và silicagel pha đảo YMC (30-50 µm,Fijisilisa Chemical Ltd.). 2.3 Phƣơ g há xác định c u trúc hóa học các h p ch t Phương pháp chung để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ là sử dụng các phương pháp xác định các thông số vật lý, các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: + Phổ cộng hưởng từ nhân một chiều (1D) 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 30
  39. 2.4. Dụng cụ và hóa ch t 2.4.1. Dụ g cụ Các dụng cụ dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch bao gồm: + Bình chiết + Máy cô quay chân không + Đèn tử ngoại hai bước s ng 254 nm và 365nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Các loại cột sắc ký: các cột thủy tinh (Duran-Đức) + Bếp điện 2.4.2 H ch +Dung môi hữu cơ thông thường như n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol là loại dung môi kỹ thuật và được chưng cất lại trước khi sử dụng. + Bản mỏng pha thường/pha đảo: bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). + Silica gel pha thường c cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck)/pha đảo RP-18 cỡ hạt 75; 150 m (Fuji Silysia Chemical Ltd.). + Diaion HP-20 (Nhật Bản). 31
  40. CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Phân lập các h p ch t Mẫu lá Đu đủ đực được nghiền thành bột (2,5kg) được chiết bằng metanol (3 5 lít) kết hợp sử dụng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 30 p). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được 152,0 g cao chiết metanol. Cao chiết này được hòa vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố với dung môi n-hexan (3x1 lít), diclometan (3x1 lít) và etyl axetat (3x1 lít) Các dịch chiết này được cất để loại bỏ dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n-hexan (50 g), diclometan ( 22 g), etyl axetat (30 g) và phân đoạn nước (18.0 g). Phần cặn etyl axetat (30 g) đưa qua sắc ký cột sillica gel rửa giải bằng hệ dung môi diclometan/metanol với độ phân cực tăng dần (diclometan/metanol, 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 1/1 v/v) thu được 5 phân đoạn tương ứng là CP-E1 (3,0 g); CP-E2 (5,2 g); CP-E3 (4,8 g); CP-E4 (6,1 g) và CP-E5 (8,2 g). Phân đoạn CP-ET3 (4,8 g) được phân tách bằng cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hỗn hợp metanol/nước (1.2/1, v/v) thu được phân đoạn CP-E3A (25 mg) và CP-E3B (37 mg). Hợp chất CP3 (11 mg) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải (metanol/nước: 1/1, v/v) từ phân đoạn CP-E3A (25 mg). Hợp chất CP4 (9,2 mg) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải (metanol/nước: 1/1, v/v) từ phân đoạn CP-E3B (37 mg). 32
  41. Bột lá đu đủ (2,5kg) Chiết MeOH Cao chiết methanol (152g) Bổ sung nước(1L) n-Hexan(3x1L) Diclometan(3x1L) )) Etyl n-Hexan(50g) Diclometan(22g) axetat (3x1L) Etyl axetat(30g) Nước(18g) Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiế các hâ đ n từ á cây đu đủ 33
  42. Cặn etylaxetat(30g) Silicagel CC Diclometan/metanol 50/1 25/1 10/1 5/1 1/1 CP-E1(3g) CP-E2(5,2g) CP-E3(4,8g) CP-E4(6,1g) CP-E5(8,2g) Sắc ký pha đảo MeOH – H2O(1.2/1) CP-E3A(25mg) CP-E3B(37mg) CP3 CP4 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các h p ch t CP3 và CP4 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các h p ch t 3.2.1. H p ch t CP3 Quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside: Hợp chất CP3 được phân lập dưới dạng bột màu vàng, M = 464, C12H20O12. 34
  43. 1H-NMR δ 6,20 (d, J = 2,0 Hz) , 6,40 (d, J = 2,0 Hz). 7,66 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,80 (d, J = 8,0 Hz) , 7,52 (d, J = 2,0 Hz) , 5,36 (d, J = 7,5 Hz), 3,57 (t, J = 8,5 Hz), 3,36 (br s), 3,65 (br s), 3,32 (m) và 3,37 (m). 5,36 (d, J = 7,5 Hz) 13C-NMR  156,28 (C-2), 133,50 (C-3), 177,46 (C-4), 161,20 (C-5), 98,64 (C-6), 164,11 (C-7), 93,47 (C-8), 156,23 (C-9), 103,90 (C-10), 121,09 (C-1′), 115,96 (C-2′), 144,78 (C-3′), 148,42 (C-4′), 115,16 (C-5′), 121,94 (C- 6′) , 101,85(C-1′′), 71,20 (C-2′′), 73,19 (C-3′′), 67,90(C-4′′), 75,80 (C-5′′) , 60,12 (C-6′′). 3.2.2.H p ch t CP4 (Quercetin-3-sulphate) Hợp chất CP4 dạng bột màu vàng, CTPT C15H10O10S; M= 382 1 H-NMR H 7,56 (1H, d, J = 2,0 Hz), H 6,79 (1H, d, J = 8,5 Hz) , H 7,64 (1H, br d, J = 8,5 Hz) , H 6,18 (1H, br s) , H 6,38 (1H, , br s) 13C-NMR δ: 156,65(C-2), 132,37(C-3), 177,65(C-4), 161,21(C-5), 98,60(C-6), 164,14(C-7), 93,42(C-8), 156,18(C-9), 104,05(C-10), 121,69(C- 1’), 115,21(C-2’), 144,80(C-3’), 148,52(C-4’), 115,65(C-5’), 121,37(C-6’) 35
  44. CHƢƠNG 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định c u trúc hóa học của h p ch t CP3 Hợp chất CP3 cũng được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Phổ 1H- NMR của hợp chất CP3 cho thấy đây là một hợp chất flavon glycoside. Trên phổ 1H-NMR của CP3 xuất hiện 2 tín hiệu điển hình của hai proton C-6 và C- 8 của vòng A δ 6,20 (d, J = 2,0 Hz) và 6,40 (d, J = 2,0 Hz). Ba tín hiệu proton của vòng thơm tương tác hệ ABX xuất hiện tại δ 7,66 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,80 (d, J = 8,0 Hz) và 7,52 (d, J = 2,0 Hz) chứng tỏ vòng B đã thế các vị trí C-1′, C-3′, C-4′. Thêm vào đ , các tín hiệu proton của đơn vị đường xuất hiện tại δ 5,36 (d, J = 7,5 Hz), 3,57 (t, J = 8,5 Hz), 3,36 (br s), 3,65 (br s), 3,32 (m) và 3,37 (m). Tín hiệu tại  5,36 (d, J = 7,5 Hz) của proton anomeric với hằng số tương tác spin lớn (J = 7,5 Hz) gợi ý đây là một phân tử c cấu hình β. Hình 4.1.a: Phổ 1H - NMR của h p ch t CP3 36
  45. Hình 4.1.b: Phổ 13C-NMR của h p ch t CP3 Hình 4.1.c: Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của h p ch t PC3 37
  46. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của CP3 xuất hiện tín hiệu 21 nguyên tử cacbon, ngoài 15 nguyên tử cacbon đặc trưng của khung flavon còn lại 6 nguyên tử cacbon của 1 phân tử đường: 15 cacbon của khung flavon tại  156,28 (C-2), 133,50 (C-3), 177,46 (C-4), 161,20 (C-5), 98,64 (C-6), 164,11 (C-7), 93,47 (C-8), 156,23 (C-9), 103,90 (C-10), 121,09 (C-1′), 115,96 (C-2′), 144,78 (C-3′), 148,42 (C-4′), 115,16 (C-5′), 121,94 (C-6′) và 6 cacbon của đường tại  101,85(C-1′′), 71,20 (C-2′′), 73,19 (C-3′′), 67,90 (C-4′′), 75,80 (C- 5′′) và 60,12 (C-6′′). So sánh số liệu phổ 13C-NMR của CP3 với hợp chất quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside [10] ta thấy hoàn toàn phù hợp đặc biệt là số liệu của gốc đường galactopyranosyl. Như vậy, từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [10] hợp chất CP3 được xác định là quercetin-3-O-β-D- galactopyranoside có cấu trúc như hình 4.1.d Từ tất cả các số liệu nêu trên có thể xác định hợp chất CP3 chính là hợp chất flavon glycoside với CTPT C21H20O12 và M= 464 OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O OH O OH OH O OH HO Hình 4.1.d: C u trúc hóa học của h p ch t CP3 38
  47. Bảng 4.1.1: Bảng số liệu phổ của h p ch t CP3 a,c * a,b a,b H C C [1] C mult. (J in Hz) 2 156.5 156.28 - 3 133.7 133.50 - 4 177.6 177.46 - 5 161.1 161.20 - 6 98.8 98.64 6.20 d (2.0) 7 164.2 164.11 - 8 93.7 93.47 6.40 d (2.0) 9 156.4 156.23 - 10 104.0 103.90 - 1′ 121.3 121.09 - 2′ 116.1 115.96 7.52 d (2.0) 3′ 144.8 144.78 - 4′ 148.4 148.42 - 5′ 115.3 115.16 6.80 d (8.0) 6′ 122.0 121.94 7.66 dd (2.0. 8.0) 1′′ 102.0 101.85 5.36 d (7.5) 2′′ 71.3 71.20 3.57 t (8.5) 3′′ 73.2 73.19 3.36 brs 4′′ 67.9 67.90 3.65 brs 5′′ 75.9 75.80 3.32 * 6′′ 60.2 60.12 3.37 * a b c * đo t ong DMSO; 125 MHz; 500 MHz; * tín hiệ bị chập; C ố iệ phổ củ Quercetin-3-O-- D-galactopyranoside 4.2. Xác định c u trúc hóa học của h p ch t CP4 Hợp chất CP4 được phân lập từ dịch chiết metanol cây ổi thu được dưới dạng bột màu vàng. Phổ 1H-NMR của CP4 khá giống CP3 cho thấy đây 39
  48. là một hợp chất flavonoid với vùng các tín hiệu H từ 6,18 ppm đến 7,64 ppm. Sự xuất hiện 3 tín hiệu proton của vòng thơm với hệ tương tác spin ABX tại H 7,56 (1H, d, J = 2,0 Hz), H 6,79 (1H, d, J = 8,5 Hz) và H 7,64 (1H, br d, J = 8,5 Hz) cho thấy 2 nh m thế vào vòng B phải nằm ở vị trí C-3′ và C-4′. Trên vòng A, các giá trị H 6,18 (1H, br s) và H 6,38 (1H, , br s) khẳng định vòng A bị thế 4 vị trí và 2 proton còn lại ở vị trí meta với nhau. Hình 4.2.a: Phổ 1H của h p ch t CP4 40
  49. Phổ 13C-NMR của CP4 cũng xuất hiện tín hiệu của 15 cacbon như PS2 và đều thuộc vùng cộng hưởng của các vòng thơm, bằng các phổ DEPT xác định được CP4 c 5 cacbon bậc 3 (CH) và 10 cacbon bậc 4 (C). Các giá trị C 156,18 và 104,05 điển hình cho C-9 và C-10 trên vòng A của các hợp chất flavonoid c nối đôi tại C-2/C-3. Bên cạnh đ 2 giá trị độ chuyển dịch h a học C 98,60 và 93,42 cho thấy vòng A còn c thêm 1 nh m OH tại vị trí C-7. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của CP4 và PS2 (quercetin) ta thấy tương tự nhau ngoại trừ vị trí C-2 và C-3 thấy c sự khác biệt đáng kể gợi ý c nh m thế khác hydroxy (OH) liên kết với C-3. H h 4.2. : Phổ 13C củ h ch CP4 41
  50. Hình 4.2.c: Phổ 13C và DEPT của h p ch t CP4 Phân tích chi tiết các dữ kiện phổ thu được và so sánh với số liệu phổ 13C-NMR của chất quercetin-3-sulphate trong tài liệu đã công bố [4] ta thấy hoàn toàn phù hợp. Như vậy, hợp chất CP4 được xác định là quercetin-3- sulphate một hợp chất đã biết được phân lập từ loài Flaveria chloraefolia [4]. CP4 c công thức phân tử là C15H10O10S và M= 382 OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O O S OH O OH O H h 4.2.d. C u úc h học củ h ch CP4 42
  51. Bả g 4.2.1: Số iệu hổ củ h ch CP4  d,f C * a,b [1]  d, e H C C mult. (J in Hz) 2 156.6 156.65 - 3 132.3 132.37 - 4 177.7 177.65 - 5 161.3 161.21 - 6 98.4 98.60 6.18 brs 7 163.9 164.14 - 8 93.3 93.42 6.38 brs 9 156.1 156.18 - 10 104.1 104.05 - 1′ 121.6 121.69 - 2′ 115.1 115.21 7.56 d (2.0) 3′ 144.7 144.80 - 4′ 148.3 148.51 - 5′ 115.9 115.65 6.79 d (8.5) 6′ 121.6 121.37 7.64 brs d (8.5) a đo t ong DMSO; b100 MHz; e125 MHz; f500 MHz; * tín hiệ bị * a,b chập; C quercetin-3-sulphate [5]. 43
  52. KẾT LUẬN Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, đã phân lập được hai hợp chất thuộc loại flavonoid từ lá cây đu đủ là: Hợp chất: CP3 (quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside) và CP4 (Quercetin-3-sulphate) được phân lập từ dịch chiết etylaxetat. Cấu trúc của hợp chất CP3 và CP4 trên được xác định bằng phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều( 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT 90, DEPT 135). H ch CP3: quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside C21H20O12 và M= 464 OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O OH O OH OH O OH HO H ch CP4: Que ce i -3-sulphate C15H10O10S và M= 382 OH 5' 1' HO O 3' 7 9 2 OH 10 5 4 O O S OH O OH O 44
  53. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đỗ Huy B ch Đặ g Qu g Chu g (2006) Cây th ốc và động vật àm th ốc ở Việt N m. Nhà xuất bản hoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827. [2]. Đỗ T u g Đ (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp củ th ốc, Nxb Y học, Hà Nội. [3]. Đỗ Thị Thả (2006) Nghiên cứ xác định khả năng phòng chống ng thư và bản chất hó học củ một ố cây th ốc Việt N m. Luận án tiến sĩ sinh học. [4]. Gi g Thị Ki Li Đỗ Thị Lệ Uy . hảo át thành ph n hoá học củ một ố dịch chi t t ho đ đủ đ c th hái t i à N ng .Tạp chí hoa học Công nghệ ĐHĐN; Số: Số 03(88) 2015; Trang 119. [5]. H Thị B ch Ngọc T Thị Huyề Ng Nguyễ Vă Mùi (2007) iề t hợp chất c otenoid t ong một ố th c vật củ Việt N m. Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên và công nghệ, 23, pp 130-134. [6]. Hồ Thị H (2014) Nghiên cứ ho t tính inh học củ một ố hợp chất chi t tách t á đ đủ(C ic p p y inn). Luận án tiến sĩ. Đại học Bách khoa Hà nội. [7]. Nguyễ Tƣờ g Vâ Đặ g Hồ g Vâ Ph Gi Khôi T M h B h Ph Quốc Ki h (1983) Chi t x ất và xác định c p ine k oid củ á đ đủ, Tạp chí dược học số 4. [8]. Nguyễ Vă Đ Nguyễ Viế Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứ hó học cây th ốc, Nxb Y học, Hà Nội. [9]. Ph Ki Mã cộ g ự (2001) Nghiên cứ th ốc P n c in ức ch dùng t ong điề t ị ng thư. Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), pp 58-62. 45
  54. [10]. T Th h H T ị h Thị Điệ (2012) Hai cycloratane t ite pene n đ tiên phân ập t á đ đủ (c ic p p y .). Tạp chí h a học, tập 50 (4A), pp 166-169. [11]. A e C i i D ie A e i i Giu e e D’A c ge Pietro Tagliatesta (2007)Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L. leaf. Journal of food composition and analysis, vol 20, pp 584-590. [12]. Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd. Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002).Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines. Journal of Medical Sciences.vol 2.Isuae 2.page 55-58. [13]. Abrham W.B., (1978), Techniques of Animal and Clinical toxicology. Med. Pub. Chicago, p 55 - 68. [14]. Beverly A. Teicher, (1997), Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval, Humana Press, Totowa, New Jersey. [15]. Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave. Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 - 173. [16]. Chung-Shih Tang (1979) New m c ocyc ic Δ1-piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II. Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652. 46
  55. [17]. David S., Seigler, Guido F., Pauli, Adolf Nahrstedt, Rosemary Leen (2002) Cyanogenic allosides and glucosides from passiflora edulis and carica papaya.Phytochemistry, vol 60, pp 873-882. [18]. Eno AE, Owo OI, Itam EH, Konya RS, (2000), Blood pressure depression by the fruit juice of Carica papaya (L.) in renal and DOCA- induced hypertension in the rat, Phytother Res, Jun;14(4):235-9. [19]. Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66-70. [20]. Govindachari T.R., Naga rajan K. and Viswanathan N. (1965) Carpaine and pseudocarpaine. Tetrahedron letters No 24, pp 1907- 1916. [21]. John R., Van (1998), “Mech ni m of ction of Non te vid nti inf mm to y g”, The American Jour. of Med. March 30, vol 104 (3A) p.2s -3s. [22]. Krishna K.L., Paridhavi M. and Jagruti A Patel (2008) Review on nutritional,medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.). Natural product radiance, vol 7(4), pp 364-373. [23]. Lohiya NK, Kothari LK, Manivannan B, Mishra PK, Pathak N, (2000), Human sperm immobilization effect of Carica papaya seed extracts: an in vitro study, Asian J Androl. Jun;2(2):103-9. [24]. Marline Nainggolan and Kasmirul. Cytotoxicity activity of male Carica papaya L. flowers on MCF-7 breast cancer cells. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research,2015, 7(5):772-775 , ISSN : 0975-7384 [25]. Maisarah A.M., Nurul Amira B., Asmah R. and Fauziah O (2013) Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya. International Food Research Journal,20(3), pp 1043-1048. 47
  56. [26]. Pathak N,Mishra PK, Manivannan B, Loyhia NK, (2000), Stertility due to inhibition of sperm motility by oral administration of benzene chromatographic fraction of the chloroform extract of the seeds of Carica papaya in rats, Phytomedicine, 7, 325-333. [27]. Rumiyati, Sismindari dan Ariyani (2006) Effect of protein fraction of Carica papaya L. leaves on the expressions of p53 and Bcl - 2 in breast cancer cells line. Majalah Farmasi Indonesia, 17 (4), pp 170 - 176. [28]. Rahman S., Imran M., Muhammad N., Hassan N., Chisthi A.K., Khan A.F., Sadozai K.S. and Khan S.M (2011) Antibacetial screening of leaves and stem of Carica papaya. Journal of Medicinal Plants Research, vol 5(20), pp 5167-5171. [29]. Stephen Chinwendu. Ukpabi Emmanuel O.Chukwu Henry C.Ezikpe Chizaram (2015). Chemical Composition Of Carica Papaya Flower (Paw-Paw). International Journal of Scientific Research and Engineering Studies (IJSRES). Volume 2 Issue 3, ISSN: 2349-8862. [30]. Sripanidkulchai B, Wongpanich V, Laupattarakasem P, Suwansaksri J, Jirakulsomchok D, (2001), Diuretic effects of selected Thai indigenous medicinal plants in rats. J Ethnopharmacol. May;75(2-3):185-90. [31]. Satrija F, Nansen P, Bjorn H, Murtini S, He S., (1994), Effect of papaya latex against Ascaris suum in naturally infected pigs. J Helminthol. Dec;68(4):343-6. [32]. Victor Njoku O. and Chidi Obi (2009) Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. Afican Journal of Pure and Applied chemistry, vol 3(11), pp 228-233. 48