Khóa luận Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2

56 trang thiennha21 18/04/2022 4660

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_xay_dung_quy_trinh_bradford_phan_tich_protein_tong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2

z [Date]  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021  1
z  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. VŨ THỊ THƠM ThS. VŨ VÂN NGA HÀ NỘI – 2021 
LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này là thành quả đánh dấu sự kết thúc 5 năm rèn luyện miệt mài trên giảng đường Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN, là tiền đề trang bị cho sinh viên chúng em những kỹ năng, kiến thức quý báu trước khi bước chân vào con đường lập nghiệp. Vì vậy, nó có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với mỗi sinh viên. Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, ngoài những kỹ năng, kiến thức và sự nỗ lực của chính mình, bản thân em còn nhận được sự giúp đỡ tận tình từ các thầy cô giáo, các giáo viên hướng dẫn cùng sự cổ vũ, động viên của gia đình, bạn bè. Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã đồng hành cùng em trong suốt chặng đường học vừa qua. Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS. Vũ Thị Thơm – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, hướng dẫn và truyền thụ đến em niềm đam mê học tập, nghiên cứu y sinh. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths. Vũ Vân Nga – Giảng viên Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở, người đã luôn đồng hành, tận tâm hướng dẫn và chỉ dạy những kiến thức, kỹ năng cần thiết, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các cán bộ giáo viên bộ môn Y Dược Học Cơ Sở và các thầy cô, cán bộ Trường Đại học Y Dược đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng một số biomarker ở bệnh nhân bị bệnh võng mạc mắt do đái tháo đường”, mã số nhiệm vụ NĐT.69/CHN/19 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn cổ vũ, động viên và khuyến khích em trong suốt chặng đường học tập vừa qua. Xin chúc cho những điều tốt đẹp nhất luôn luôn đồng hành cùng cuộc sống của mọi người. Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa
LỜI CAM ĐOAN Em tên là: Nguyễn Ngọc Hòa MSSV: 16100085 Là sinh viên lớp QHY 2016 ngành Dược học Em xin cam đoan đề tài: “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương ở các bệnh nhân Đái tháo đường type 2” là một công trình nghiên cứu độc lập dưới sự đồng hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn: TS. Vũ Thị Thơm và Ths. Vũ Vân Nga – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở. Ngoài ra không có bất cứ sự sao chép của người khác. Đề tài, nội dung báo cáo thực tập là sản phẩm mà em đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN. Các số liệu, kết quả trình bày trong báo cáo là hoàn toàn trung thực, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ luật của bộ môn và nhà trường đề ra nếu như có vấn đề xảy ra. Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường IFG Rối loạn đường huyết lúc đói (Impaired fasting glucose) IGT Rối loạn dung nạp glucose (Impaired glucose tolerance) HbA1c Lượng glucose gắn với hemoglobin (Hemoglobin glycated) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) GDM Đái tháo đường thai kỳ (Gestational diabetes mellitus) ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) BN Bệnh nhân OD Mật độ quang (Optical density) BL Mẫu trắng (Blank)
DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người 4 lớn không có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 5 Bảng 2.1. Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng 19 Bảng 3.1. OD nền khay 96 giếng 21 Bảng 3.2. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 22 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.3. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 23 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.4. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 24 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.5. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p- 25 value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/10 Bảng 3.6. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 26 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.7. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 27 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.8. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 28 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.9. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p- 29 value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20
Bảng 3.10. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị 32 p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20 Bảng 3.11. Vị trí tra mẫu protein chuẩn và mẫu thử vào khay 96 giếng 32 Bảng 3.12. OD đo được của khay 96 giếng gồm protein chuẩn và mẫu 33 BN Bảng 3.13. Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN 34 ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Bảng 3.14. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị 34 p-value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ Bảng 3.15. OD của mẫu protein BN ĐTĐ 34 Bảng 3.16. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu đã pha loãng 300 35 lần (μg/mL) Bảng 3.17. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu BN ban đầu (g/L) 35 Bảng 3.18. Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp 37 Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E.
DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương 8 Hình 3.1. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 22 μg/mL Hình 3.2. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 23 960 μg/mL Hình 3.3. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 24 1920 μg/mL Hình 3.4. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 25 μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số P Hình 3.5. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 26 μg/mL Hình 3.6. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 27 μg/mL Hình 3.7. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 28 1920 μg/mL Hình 3.8. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 29 μg/mL sau kiểm định trị số P Hình 3.9. Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ 30 lệ 1/10 sau kiểm định trị số P Hình 3.10. So sánh 2 đường chuẩn tối ưu nhất tại 2 tỉ lệ 1/10 và 1/20 30 Hình 3.11. Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ 33
[Date] MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Đái tháo đường 2 1.1.1. Dịch tễ bệnh ĐTĐ 2 1.1.2. Khái niệm 2 1.1.3. Triệu chứng và biến chứng 3 1.1.4. Chẩn đoán 3 1.1.5. Phân loại 6 1.2. Tổng quan về protein huyết tương người 7 1.2.1. Khái niệm về huyết tương người 7 1.2.2. Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người 7 1.2.3. Chức năng của các protein trong huyết tương 9 1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương 10 1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein 10 1.3.1. Phương pháp Western blot- Định lượng protein bằng phương pháp kháng thể 11 1.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ 11 1.3.3. Định lượng protein bằng phương pháp đo quang 12 1.4. Tổng quan về phương pháp Bradford 13 1.4.1. Giới thiệu chung 13 1.4.2. Cơ chế 13 1.4.3. Thuốc thử 14 1.4.4. Ưu điểm và hạn chế 14 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 16 2.1.3. Hóa chất 16 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2.1. Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân 16 2.2.2. Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản và lưu trữ 16 2.2.3. Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford 17 2.2.4. Xác định nồng độ protein trong mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng phương pháp Bradford 20 2.3. Phương pháp xử lý số liệu. 21 2.4. Đạo đức nghiên cứu 21 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford 22 3.2. Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford 33 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo nồng độ protein huyết tương bằng phương pháp Bradford 39 3.4. Một số lưu ý 40 3.5. Một số hạn chế của đề tài 41 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[Date] ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh không lây nhiễm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người dân trên toàn thế giới, gây những tác động lớn đến toàn thế giới ở thế kỷ XXI. Tại Việt Nam, hiện có tới 3,53 triệu người đang “chung sống” với căn bệnh ĐTĐ, và mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử vong vì các biến chứng liên quan [2, 7]. Trong đó, đa phần là ĐTĐ type 2, chiếm đến 90 – 95 % số lượng bệnh nhân mắc phải. Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trò quan trọng trong sinh lý cơ thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đoán phổ biến trong y học và các dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ các quyết định điều trị [15]. Định lượng protein huyết tương là một bước quan trọng để xử lý các mẫu protein, phân lập và xác định đặc tính; đây là bước tiên quyết trước khi gửi protein để phân tích và phân tách sắc ký, điện di hoặc hóa miễn dịch [8, 13]. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp dùng để định lượng nồng độ protein huyết tương, trong đó, các xét nghiệm protein đo màu, chẳng hạn như xét nghiệm Bradford, xét nghiệm Lowry, xét nghiệm axit bicinchoninic và xét nghiệm biuret được sử dụng rộng rãi. Mỗi thử nghiệm đều có những ưu điểm và nhược điểm liên quan đến độ nhạy, tính dễ thực hiện, khoảng tuyến tính, độ chính xác và sự thay đổi giữa những phòng thí nghiệm khác nhau [13]. Điểm mấu chốt là bất kỳ phương pháp nào được sử dụng để định lượng nồng độ protein thì đều cần được hiệu chuẩn thường xuyên [19]. Phương pháp Bradford phân tích protein là một phương pháp có thể thực hiện nhanh, ứng dụng được ở nhiều nơi với các hóa chất, thiết bị cơ bản, chi phí thấp, có độ nhạy cao. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình Bradford tối ưu định lượng nồng độ protein huyết tương 2. Ứng dụng được quy trình để phân tích nồng độ protein ở các BN ĐTĐ type2 1
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Đái tháo đường 1.1.1. Dịch tễ bệnh ĐTĐ Đái tháo đường là một bệnh không lây nhiễm đang có sự gia tăng nhanh chóng tỉ lệ mắc và các biến chứng trên toàn cầu. Trên thế giới, năm 2015, ngoài 415 triệu người (độ tuổi từ 20- 79) đang mắc bệnh đái tháo đường, có 318 triệu người trưởng thành bị rối loạn dung nạp glucose, khiến họ có nguy cơ cao mắc bệnh trong tương lai [18]. Đến năm 2019, ĐTĐ đứng thứ 3 trong tổng số 10 nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và là nguyên nhân thứ tư gây tử vong ở phụ nữ [11]. Tại Việt Nam, năm 2015, ước tính có 3,5 triệu người trưởng thành từ 20–79 tuổi mắc ĐTĐ, là nguyên nhân gây ra 53.400 ca tử vong. Các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở người trưởng thành Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2016 là 3,7–6,0% [18]. Mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử vong vì các biến chứng liên quan ĐTĐ [2]. Dự báo, số người mắc bệnh có thể tăng lên 6,3 triệu vào năm 2045. Với những số liệu nói trên, Việt Nam được xếp nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới với tỷ lệ bệnh nhân tăng 5,5% mỗi năm. Tuy nhiên, theo Bộ Y tế cả nước mới có chỉ có 29% người bệnh ĐTĐ được quản lý tại các cơ sở y tế, trong khi số chưa được quản lý theo số liệu thống kê năm 2015 là 71% [2]. 1.1.2. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng mạn tính xảy ra khi cơ thể sản xuất không đủ insulin hoặc không thể sử dụng insulin, và được chẩn đoán dựa vào nồng độ glucose máu. Insulin là một loại hormone được sản xuất trong tuyến tụy, có chức năng vận chuyển glucose từ máu đi vào các tế bào của cơ thể để chuyển hóa thành năng lượng. Việc thiếu hoặc hoạt động không hiệu quả của insulin ở một người bị bệnh đái tháo đường có nghĩa là glucose vẫn lưu thông trong máu nhưng không được vận chuyển vào các tế bào. Theo thời gian, nồng độ cao của glucose trong máu (được gọi là tăng đường huyết) gây ra tổn thương nhiều mô trong cơ thể, dẫn đến sự phát triển của các biến chứng sức khỏe gây tàn phế và đe dọa tính mạng [7, 18]. 2
1.1.3. Triệu chứng và biến chứng Sự tăng đường huyết mạn tính của bệnh đái tháo đường có liên quan đến tổn thương lâu dài, rối loạn chức năng và suy các cơ quan khác nhau, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu [5]. Một số quá trình có liên quan đến sự phát triển của bệnh đái tháo đường bao gồm sự phá hủy tự miễn dịch của các tế bào β tuyến tụy dẫn đến việc bài tiết insulin không đầy đủ hoặc do những bất thường dẫn đến sự kháng lại hoạt động của insulin làm giảm phản ứng của mô đối với insulin tại một hoặc nhiều điểm trong con đường hoạt động phức tạp của hormone. Hai yếu tố này thường cùng tồn tại ở cùng một bệnh nhân [5]. Sự thiếu insulin hoạt động trên các mô đích là cơ sở gây ra những bất thường trong chuyển hóa carbohydrate, chất béo và protein trong bệnh đái tháo đường. Các triệu chứng của tăng đường huyết rõ rệt bao gồm “4 nhiều”: đái nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, gầy sút cân nhiều và mờ mắt. Hậu quả cấp tính, đe dọa tính mạng của bệnh nhân là tăng đường huyết với nhiễm toan ceton hoặc tình trạng tăng thẩm thấu do tăng glucose máu. Các biến chứng lâu dài của bệnh ĐTĐ bao gồm bệnh võng mạc với khả năng mất thị lực; bệnh thận dẫn đến suy thận; bệnh thần kinh ngoại biên với nguy cơ loét bàn chân, cắt cụt chi và khớp; và bệnh thần kinh tự trị gây ra các triệu chứng tiêu hóa, sinh dục, tim mạch và rối loạn chức năng tình dục. Bệnh nhân mắc ĐTĐ có tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, động mạch ngoại biên và mạch máu não do xơ vữa động mạch tăng. Tăng huyết áp và các bất thường về chuyển hóa lipoprotein cũng thường thấy ở những người bệnh ĐTĐ.[5] 1.1.4. Chẩn đoán 1.1.4.1. Đối tượng nguy cơ cao “Tiền ĐTĐ” là một thuật ngữ thực tế được dùng để chỉ tình trạng rối loạn đường huyết lúc đói (Impaired Fasting Glucose), rối loạn dung nạp glucose (Impaired Glucose Tolerance) hoặc hemoglobin glycated (HbA1c) từ 6,0% đến 6,4%, mỗi loại đều khiến người bệnh có nguy cơ cao phát triển bệnh ĐTĐ và các biến chứng của bệnh [4]. 3
Nên theo dõi tình trạng cơ thể thường xuyên để sàng lọc và chẩn đoán sớm ĐTĐ. Các thử nghiệm chẩn đoán xác định ĐTĐ nên được xem xét và thực hiện ở các đối tượng sau: Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người lớn không có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association)[4] 1. Thử nghiệm nên được xem xét ở người thừa cân hoặc béo phì (chỉ số khối cơ thể BMI ≥25 kg / m 2 hoặc ≥23 kg / m 2 ở người Mỹ gốc Á) người lớn có một hoặc nhiều yếu tố nguy cơ sau: • Người thân cấp một như cha, mẹ, anh, chị, em ruột mắc bệnh ĐTĐ • Chủng tộc / dân tộc có nguy cơ cao (ví dụ: Người Mỹ gốc Phi, Người Latinh, Người Mỹ bản địa, Người Mỹ gốc Á, Người dân đảo Thái Bình Dương) • Tiền sử bệnh tim mạch • Tăng huyết áp (≥140/90 mmHg hoặc đang điều trị tăng huyết áp) • Mức cholesterol HDL 250 mg / dL (2,82 mmol / L) • Phụ nữ mắc hội chứng buồng trứng đa nang • Không hoạt động thể chất • Các tình trạng lâm sàng khác liên quan đến kháng insulin (ví dụ: béo phì nặng, acanthosis nigricans) 2. Bệnh nhân tiền ĐTĐ (HbA1c ≥5,7% [39 mmol / mol], IGT, hoặc IFG) nên được kiểm tra hàng năm. 3. Những phụ nữ được chẩn đoán mắc ĐTĐ thai kỳ (Gestational Diabetes Mellitus) nên làm xét nghiệm suốt đời ít nhất 3 năm một lần. 4. Đối với tất cả các bệnh nhân khác, xét nghiệm nên bắt đầu từ 45 tuổi. 5. Nếu kết quả bình thường, việc thử nghiệm nên được lặp lại tối thiểu trong khoảng thời gian 3 năm, có cân nhắc việc thử nghiệm thường xuyên hơn tùy thuộc vào kết quả ban đầu và tình trạng rủi ro. 4
1.1.4.2. Chẩn đoán xác định ĐTĐ Trừ khi có chẩn đoán lâm sàng rõ ràng (ví dụ: bệnh nhân đang trong cơn khủng hoảng tăng đường huyết hoặc có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết và đường huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg / dL [11,1 mmol/L]), chẩn đoán yêu cầu hai kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu [21] hoặc trong hai mẫu thử nghiệm riêng biệt. Nếu sử dụng hai mẫu thử nghiệm riêng biệt, thì thử nghiệm thứ hai, có thể là lặp lại thử nghiệm ban đầu hoặc thử nghiệm khác, được thực hiện ngay lập tức. Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 [4] 1. Đường huyết lúc đói ≥126 mg/dL (7,0 mmol/L). Bệnh nhân nhịn ăn, (không nạp calo trong ít nhất 8 giờ) * HOẶC LÀ 2. Glucose huyết tương thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L). Thử nghiệm phải được thực hiện theo mô tả của WHO, sử dụng một lượng đường chứa tương đương 75 g glucose khan hòa tan trong nước *. HOẶC LÀ 3. HbA1c ≥6,5% (48 mmol / mol) * HOẶC LÀ 4. Ở một bệnh nhân có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết, glucose huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L). * - Trong trường hợp không có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết (bao gồm tiểu nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, sụt cân không rõ nguyên nhân), chẩn đoán đòi hỏi hai kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu hoặc trong hai mẫu xét nghiệm riêng biệt. 5
1.1.5. Phân loại Việc chẩn đoán rõ một trường hợp mắc ĐTĐ nhóm nào là một việc không dễ dàng vì có những trường hợp có sự chuyển biến, nên với nhiều bệnh nhân chỉ có thể đưa ra thông tin định nhóm ở thời điểm khám khi đó. Ví dụ như một bệnh nhân mắc ĐTĐ thai kì, sau sinh tiếp tục tăng đường huyết và có thể chuyển chẩn đoán thành ĐTĐ type 2 [4]. Phân loại ĐTĐ được Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) trình vào năm 1997 và được WHO phê chuẩn và sử dụng đến thời điểm này. Dựa trên cơ chế bệnh sinh, ĐTĐ được phân thành 3 thể chính: • Đái tháo đường type 1 Trước đây ĐTĐ type 1 còn được gọi với các thuật ngữ như ĐTĐ phụ thuộc insulin hoặc ĐTĐ khởi phát ở tuổi vị thành niên. Thể bệnh này chỉ chiếm 5–10% những người mắc bệnh ĐTĐ. Nó là kết quả của sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào beta đảo tụy, do sự tương tác giữa tính nhạy cảm di truyền, miễn dịch rối loạn và các yếu tố môi trường [24]. Ở dạng bệnh ĐTĐ này, tốc độ phá hủy tế bào β khá nhanh ở các bệnh nhân ít tuổi, đặc biệt là trẻ em và thanh thiếu niên, nhiễm toan ceton có thể là biểu hiện đầu tiên của bệnh. Do tế bào beta bị phá hủy, bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, vì vậy, sử dụng insulin là điều trị bắt buộc. • Đái tháo đường type 2 ĐTĐ type 2 chiếm 90–95% những người mắc bệnh ĐTĐ, trước đây được gọi là bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin hoặc bệnh ĐTĐ khởi phát ở người lớn. Thể bệnh này và các biến chứng của bệnh là những ví dụ điển hình về các bệnh đa nguyên và phức tạp do sự tương tác giữa nhiều yếu tố di truyền và môi trường [24]. Những người bệnh không xảy ra sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào β mà họ thiếu insulin tương đối và tình trạng đề kháng insulin. Do đó, sự bài tiết insulin bị khiếm khuyết ở những bệnh nhân này và không đủ để bù đắp cho tình trạng kháng insulin. Tình trạng kháng insulin có thể cải thiện khi giảm cân và / hoặc điều trị bằng thuốc làm giảm đề kháng insulin nhưng hiếm khi được phục hồi trở lại bình thường. • Đái tháo đường thai kỳ (GDM) GDM đã được định nghĩa là bất kỳ mức độ không dung nạp glucose nào khi khởi phát hoặc ghi nhận đầu tiên trong thời kỳ mang thai. Định nghĩa được áp dụng cho dù tình trạng này có kéo dài sau khi mang thai hay không và không loại trừ khả 6
năng không dung nạp glucose không được phát hiện có thể đã xảy ra trước hoặc bắt đầu đồng thời với thời kỳ mang thai. 1.2. Tổng quan về protein huyết tương người 1.2.1. Khái niệm về huyết tương người Máu là một mô lỏng bao gồm khoảng 55% chất lỏng được gọi là huyết tương và 45% tế bào máu. Ba loại tế bào chính trong máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. 92% huyết tương bao gồm nước và 8% còn lại bao gồm protein, chất chuyển hóa và ion. Huyết tương của người khỏe mạnh thường là dịch màu vàng nhạt, trong suốt và thay đổi theo tình trạng sinh lý trong cơ thể, ví dụ như sau khi ăn, huyết tương có màu vàng đậm hơn và sẽ nhạt đi thành vàng chanh sau khoảng vài giờ sau đó. Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trò quan trọng trong sinh lý cơ thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đoán phổ biến trong y học và các dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ các quyết định điều trị [15]. Huyết tương có thể được tách ra khỏi máu toàn phần bằng quá trình ly tâm, tức là quay máu toàn phần với chất chống đông máu trong máy ly tâm. Huyết tương nhẹ hơn, vì vậy nó tạo thành lớp màu vàng phía trên, trong khi các tế bào máu dày đặc hơn rơi xuống phía dưới. Huyết tương thu được được đông lạnh trong vòng 24 giờ để bảo tồn chức năng của các yếu tố đông máu và các globulin miễn dịch. Huyết tương được rã đông trước khi sử dụng và có thời hạn sử dụng 1 năm [15]. Thành phần huyết tương thường bao gồm: • Chất đông máu, chủ yếu là fibrinogen, hỗ trợ quá trình đông máu • Các protein huyết tương, chẳng hạn như albumin và globulin, giúp duy trì áp suất thẩm thấu keo ở khoảng 25 mmHg • Các chất điện giải như natri, kali, bicarbonat, clorua và canxi giúp duy trì độ pH trong máu • Các globulin miễn dịch giúp chống lại nhiễm trùng và các lượng nhỏ khác nhau của các enzym, hormone và vitamin 1.2.2. Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người Protein huyết tương đại diện cho một phần quan trọng của proteome người. Nồng độ protein trong huyết tương người bình thường rơi vào khoảng 60-70 g/L. Người ta ước tính rằng huyết tương có thể chứa tới 40.000 loại protein khác nhau, 7
mỗi loại có một chức năng hoặc một bộ chức năng cụ thể, mỗi loại nằm dưới sự kiểm soát di truyền riêng biệt và mỗi loại có sự thay đổi nồng độ cụ thể trong các điều kiện sinh lý và bệnh lý khác nhau. Nồng độ bình thường của protein huyết tương bao gồm một phạm vi rất rộng từ vài microgam đến vài gam trên 100 mL huyết tương. Các protein huyết tương có chức năng như các enzym, chất ức chế proteinase, kháng thể, yếu tố đông máu, thành phần bổ thể, tiền chất kinin và các chất vận chuyển hormone, vitamin, kim loại, lipid và các chất khác cần thiết cho chức năng bình thường của cơ thể [3]. Trong đó, một số protein hàm lượng cao chiếm đến 99% protein tổng số như Albumin, IgG, transferrin, lipoprotein Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương [22] Các protein cấu thành nên hệ protein huyết tương có thể được phân loại theo chức năng thành ba lớp khác nhau. • Lớp đầu tiên chứa nhiều protein có vai trò chức năng trong máu. Chúng bao gồm albumin huyết tương người (chiếm khoảng một nửa protein tổng số); apolipoprotein, có vai trò quan trọng trong vận chuyển lipid và cân bằng nội môi; các protein giai đoạn cấp tính của phản ứng miễn dịch bẩm sinh; và các protein đông máu. • Lớp thứ hai là các protein rò rỉ mô không có chức năng chuyên dụng trong tuần hoàn. Ví dụ như các enzym như aspartate aminotransferase (ASAT) và alanin aminotransferase (ALAT), được sử dụng để chẩn đoán các bệnh gan, hay troponin tim. 8
• Lớp thứ ba là các phân tử tín hiệu như hormone protein nhỏ (ví dụ, insulin) và cytokine, thường có lượng rất thấp ở trạng thái ổn định và được điều chỉnh khi cần thiết [12] 1.2.3. Chức năng của các protein trong huyết tương Các protein trong huyết tương đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh lý và bệnh lý xảy ra trong cơ thể người [15]. Dưới đây là một số chức năng tiêu biểu: • Chức năng miễn dịch: bao gồm các Ig và các bổ thể tham gia vào các quá trình bảo vệ cơ thể như thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên, giúp hệ miễn dịch nhận biết và tiêu diệt các tác nhân lạ như vi khuẩn hoặc virus • Cung cấp dinh dưỡng: Protein huyết tương là nguồn chính cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể khi được yêu cầu. • Chức năng xúc tác: Enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phức tạp trong các quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể • Chức năng điều hòa: Những protein này tuy có hàm lượng nhỏ, nhưng chúng vai trò rất quan trọng trong cơ thể, bao gồm các hormone, các cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme Nhìn chung, các protein này có thời gian lưu hành trong huyết tương khá ngắn. Chúng được tiết ra để điều hòa các phản ứng, sau đó được pha loãng để làm giảm nồng độ xuống mức hoạt động không hiệu quả. • Áp suất thẩm thấu và cân bằng nước: Protein huyết tương giúp cân bằng áp suất thẩm thấu vào khoảng 25 mm Hg. Albumin huyết tương chủ yếu chịu trách nhiệm cho chức năng này vì trọng lượng phân tử thấp và lượng định lượng so với các protein khác. Tuy nhiên, trong tình trạng mất protein như trong các bệnh thận, một tỷ lệ lớn nước di chuyển đến các mô có thể gây ra phù. • Chức năng đệm: Protein huyết tương đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ pH của cơ thể, bằng cách thực hiện quá trình asampholytes. • Vận chuyển lipid: Một trong những chức năng quan trọng nhất của protein huyết tương là cung cấp lipid và các chất hòa tan lipid trong cơ thể. Các axit béo và bilirubin được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, trong khi cholesterol và phospholipids được chuyển bởi các lipoprotein, globulin cũng vận chuyển các vitamin tan trong chất béo. 9
• Vận chuyển các muối phức hợp khác: Protein huyết tương cũng giúp vận chuyển các kim loại và các chất khác, ví dụ như thyroxine, v.v. Ngoài ra, trong huyết tương còn có các sản phẩm rò rỉ mô: Đây là những protein thường hoạt động trong các tế bào nhưng có thể được giải phóng vào huyết tương do hậu quả của sự chết hoặc tổn thương mô. Những protein này là những dấu hiệu chẩn đoán quan trọng nhất, được ứng dụng rất nhiều trong y học chẩn đoán và theo dõi điều trị, ví dụ như creatine kinase hoặc myoglobin được sử dụng trong chẩn đoán nhồi máu cơ tim 1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương Protein là cỗ máy phân tử chịu trách nhiệm thực hiện hầu hết các chức năng xúc tác và cấu trúc, cũng như nhiều tín hiệu của cơ thể sống. Do đó, phép đo protein mang lại nhiều cơ hội để phát hiện và xác định đặc điểm của các trục trặc phân tử liên quan đến bệnh tật và sự tiến triển của nó như biểu hiện ở từng bệnh nhân. Do máu và huyết tương là những mẫu bệnh phẩm lâm sàng chiếm ưu thế áp đảo để phân tích phân tử thường quy, các phân tử hiện diện trong máu có tiềm năng chẩn đoán rộng nhất. Trong đó, protein thường có ý nghĩa lâm sàng lớn nhất. Protein cung cấp một bức tranh toàn cảnh về tình trạng hiện tại của bệnh nhân. Các xét nghiệm protein hiện tại cung cấp nhiều thông tin lâm sàng, bao gồm chẩn đoán xác định các biến cố cấp tính. Ví dụ: troponin tim được giải phóng vào máu sau nhồi máu cơ tim, dự đoán nguy cơ bệnh tật (Protein phản ứng C (CRP) tăng trong bệnh mạch vành) và phát hiện bệnh tái phát (thyroglobulin trong ung thư tuyến giáp di căn sau khi cắt bỏ tuyến giáp) [6] Những thành công này đã làm dấy lên hy vọng về các xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng mới và cải tiến cho nhiều chỉ định bệnh và do đó, đã góp phần khẳng định ý nghĩa của việc nghiên cứu, phát hiện ra các dấu ấn sinh học protein huyết tương mới. 1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein Có nhiều phương pháp để định lượng hàm lượng protein trong mẫu. Trên thực tế một phương pháp với ưu điểm tuyệt đối không tồn tại: các phương pháp sẽ đều có ưu điểm và nhược điểm. Việc lựa chọn một phương pháp thích hợp sẽ phụ thuộc vào bản chất của protein có trong mẫu, vào độ tinh khiết của dịch chiết, vào độ nhạy và độ chính xác cần thiết và tốc độ mong muốn. Các phương pháp thường 10
được sử dụng để xác định nồng độ protein là: phương pháp đo quang, khối phổ và phương pháp kháng thể. 1.3.1. Phương pháp Western blot- Định lượng protein bằng phương pháp kháng thể Western blot là kĩ thuật rất quan trọng dùng trong sinh học phân tử và tế bào, mục đích là tách và xác định một protein cụ thể từ một hỗn hợp gồm nhiều protein phức tạp[7]. Western blot thường được sử dụng trong nghiên cứu để phân tách và xác định protein. Trong kỹ thuật này, một hỗn hợp các protein được phân tách dựa trên trọng lượng phân tử thông qua điện di trên gel. Những kết quả này sau đó được chuyển đến một màng tạo ra một dải cho mỗi protein. Sau đó, màng được ủ với các kháng thể nhãn đặc trưng cho protein quan tâm. Kháng thể không liên kết bị rửa sạch chỉ để lại kháng thể liên kết với protein quan tâm. Vì các kháng thể chỉ liên kết với protein cần quan tâm, nên chỉ có thể nhìn thấy một dải. Độ dày của dải tương ứng với lượng protein hiện có; do đó đo độ dày dải được dùng để định lượng protein hiện có[14]. Mặc dù Western blot là phương pháp đơn giản, dễ thao tác nhưng có thể phát sinh nhiều vấn đề dẫn đến kết quả không như mong muốn. Các vấn đề có thể bao gồm: dải bất thường hoặc không mong muốn, không có dải, dải mờ hoặc tín hiệu yếu, nền cao trên vết mờ và vết loang lổ hoặc không đồng đều. Ngoài ra, sử dụng kháng thể, kháng nguyên hoặc chất đệm cũng có thể gây ra một vài sai sót trong kết quả đo. Nếu một kháng thể không phù hợp được sử dụng, kể cả chính hoặc phụ, thì dải sẽ không hiển thị. Nồng độ của kháng thể cũng phải phù hợp; nếu nồng độ quá thấp, tín hiệu có thể không nhìn thấy được. Cần đảm bảo rằng các bộ đệm được sử dụng trong suốt quá trình chạy đều mới và không bị nhiễm bẩn[14] 1.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ Khối phổ là một kỹ thuật phân tích có thể cung cấp cả thông tin định tính (cấu trúc) và định lượng (khối lượng phân tử hoặc nồng độ) về các phân tử chất phân tích sau khi chúng chuyển đổi thành ion[17] Cơ sở của khối phổ đối với các hợp chất hóa học (chủ yếu là các chất hữu cơ) là sự bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion mang điện tích (+) hoặc (-), hoặc các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao, theo như sơ đồ sau: 11
ABCD + e ABCD+ + 2e >95% ABCD2+ + 3e ABCD3+ + 4e Quá trình ion hóa này cần năng lượng bắn phá khoảng 10eV, sự phá vỡ này còn phụ thuộc vào cấu tạo chất, năng lượng và phương pháp sử dụng. Ion phân tử có số khối m/e. Phương pháp khối phổ chính là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác số khối đó [17]. Khối phổ là một trong những phương pháp nhạy cảm nhất trong hóa học phân tích, và ứng dụng của nó trong proteomics đã nhanh chóng được mở rộng sau khi giải trình tự bộ gen người. Khối phổ hiện nay là phương pháp tiếp cận chủ đạo để xác định và định lượng protein và các biến đổi sau vận chuyển, ở quy mô nhỏ hoặc trong toàn bộ proteome với độ chính xác cao[16]. Tuy nhiên, phương pháp này hiện vẫn ít được sử dụng tại Việt Nam do yêu cầu về kỹ thuật và giá thành cao. 1.3.3. Định lượng protein bằng phương pháp đo quang Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng phù hợp đi qua một dung dịch chất màu, các phân tử hấp thụ sẽ hấp thụ một phần năng lượng chùm sáng, một phần ánh sáng truyền qua dung dịch. Xác định cường độ chùm ánh sáng truyền qua đó ta có thể xác định được nồng độ của dung dịch. Đây là nguyên tắc chung của các phương pháp đo quang giúp định lượnh nồng độ protein có trong mẫu. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bouger-Lambert- Beer: Khi chiếu một chùm bức xạ đơn sắc (cường độ bức xạ ban đầu là I0) đi qua một lớp dung dịch có bề dày l và có nồng độ là C, thì cường độ bức xạ I sau khi đi qua dung dịch bị giảm đi do quá trình hấp thụ, phản xạ, tán xạ Độ hấp thụ quang của một dung dịch đối với một chùm sáng đơn sắc tỷ lệ thuận với độ dày truyền quang và nồng độ chất tan trong dung dịch. Công thức: A = ɛ x l x C Trong đó: A là độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng λ, l là độ dày truyền quang C là nồng độ mẫu (mol/L) ɛ là hệ số hấp thụ phân tử hay hệ số tắt phân tử (L/mol*cm) Các phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích hàm lượng protein là các xét nghiệm của Biuret, Bradford, Kjendahl, Lowry, Smith và Warburg- 12
Christian. Tuy nhiên, nhiều tác giả khuyến nghị thử nghiệm đo quang phổ của Bradford (1976) vì nhiều ưu điểm của nó nếu so sánh với các phương pháp khác. 1.4. Tổng quan về phương pháp Bradford 1.4.1. Giới thiệu chung Định lượng hàm lượng protein tổng số thường là một bước quan trọng và phổ biến đối với nhiều ứng dụng trong nghiên cứu hóa sinh nói chung và thực hành phòng thí nghiệm lâm sàng thông thường. Trước khi bắt tay vào bất kỳ loại phân tích protein nào, điều quan trọng là phải định lượng chính xác lượng protein trong mẫu. Hiện nay có rất nhiều công cụ phân tích khác nhau (quang phổ, sắc ký, phân cực, v.v.), được phát triển để xác định protein tổng số nhưng phương pháp đo quang vẫn được sử dụng rộng rãi. Phương pháp đo quang phổ định lượng protein là phương pháp sử dụng quang phổ UV và quang phổ khả kiến để xác định nhanh chóng nồng độ của protein, so với chất chuẩn. Trong trường hợp cần đo nhiều mẫu, và, hoặc khối lượng và nồng độ mẫu bị hạn chế, có thể sử dụng các chế phẩm của thuốc nhuộm Coomassie hay còn được gọi là phương pháp Bradford. Phương pháp Bradford là một phương pháp phổ biến vì tính nhanh chóng, độ nhạy và độ đặc hiệu tốt. 1.4.2. Cơ chế Thuốc nhuộm thường được dùng trong phương pháp Bradford là Coomassie Brilliant Blue G-250. Cơ chế cơ bản của xét nghiệm là sự liên kết của thuốc nhuộm ở pH axit bằng tương tác tĩnh điện với các axit amin cơ bản được proton hóa (lysine, arginine và histidine) và bằng các liên kết kỵ nước với các axit amin thơm (phenylalanine, tyrosine, tryptophan) [8]. Trong môi trường axit, khi chưa liên kết với protein, Coomassie Brilliant Blue G-250 có màu đỏ, hấp thu ánh sáng mạnh nhất tại bước sóng 470nm. Liên kết của thuốc nhuộm với protein, tạo ra phức hợp protein-thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 595 nm [9]. Quá trình liên kết thuốc nhuộm hầu như hoàn thành trong khoảng 2 phút với độ ổn định màu tốt trong 1 giờ [8]. Xác định nồng độ protein được thực hiện bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Thông thường, các dung dịch tiêu chuẩn của albumin huyết tương bò (Bovine Serum Albumin) được sử dụng để tạo đường chuẩn của độ hấp thụ so với nồng độ khối lượng. Giả sử chất phân tích-protein phản ứng theo cách tương tự như tiêu chuẩn BSA, thì có thể xác định được nồng độ chưa biết [10]. 13
1.4.3. Thuốc thử Hòa tan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50 mL etanol 95% và thêm 100 mL axit photphoric 85% trong khi khuấy liên tục. Khi thuốc nhuộm đã hòa tan, cho vừa đủ 1 lít nước cất. Thuốc thử bền đến một tháng ở nhiệt độ phòng; tuy nhiên, để bảo quản trong thời gian dài, nên giữ ở 4°C, nếu xuất hiện kết tủa, lọc trước khi sử dụng [8]. 1.4.4. Ưu điểm và hạn chế 1.4.4.1. Ưu điểm • Các ưu điểm của xét nghiệm Bradford bao gồm dễ sử dụng, độ nhạy tương đối và thuốc thử có giá thành thấp, hoạt động ổn định trong thời gian dài. Hơn nữa, thể tích thuốc thử có thể được giảm bớt và phép thử có thể được thực hiện trong đĩa 96 giếng. • Độ hấp thụ của dung dịch màu ổn định trong 60–90 phút ở nhiệt độ phòng. Xét nghiệm có thể được sử dụng với nhiều loại protein và polypeptit có trọng lượng phân tử lớn hơn 3000 và có thể phát hiện dưới 1,0 μg protein[20] 1.4.4.2. Hạn chế Ngoài những ưu điểm kể trên, phương pháp Bradford cũng tồn tại một vài hạn chế như sau: Thuốc nhuộm Bradford Coomassie Brilliant Blue G-250 làm ố các cuvet hoặc các giếng, do đó, các cuvet hoặc giếng chỉ nên được sử dụng một lần duy nhất và bỏ đi sau khi làm thí nghiệm. Sự liên kết thuốc nhuộm phụ thuộc vào hàm lượng axit amin cơ bản có thể khác nhau giữa các protein. Một vấn đề khác đối với phương pháp này là các dung dịch protein đậm đặc có thể tạo thành kết tủa khi tiếp xúc với thuốc thử nhuộm. Nếu điều này được quan sát thấy, dung dịch protein cần được pha loãng để xác định nồng độ protein. Hơn nữa, phương pháp này cũng phá hủy protein, có nghĩa là một khi mẫu protein đã phản ứng với thuốc nhuộm, thì protein không thể được sử dụng cho các xét nghiệm khác. 14
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu máu tĩnh mạch được thu thập từ các bệnh nhân điều trị đái tháo đường type 2 tại Khoa Nội tổng hợp, bệnh viện E. Máu toàn phần sau khi được ly tâm, thu lấy huyết tương, chia nhỏ thành những lượng vừa phải trong ống Eppendorf, bảo quản trong tủ âm sâu ở nhiệt độ -30℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Bệnh nhân được chẩn đoán mắc ĐTĐ theo hướng dẫn chẩn đoán của ADA 2020, dựa vào 1 trong 4 tiêu chuẩn dưới đây: Glucose huyết tương lúc đói≥ 126 mg/dL (hay 7 mmol/L). Bệnh nhân phải nhịn ăn (không uống nước ngọt, có thể uống nước lọc, nước đun sôi để nguội) ít nhất 8 giờ (thường phải nhịn đói qua đêm từ 8 -14 giờ) Glucose huyết tương ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống 75g (oral glucose tolerance test: OGTT) ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L). Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống phải được thực hiện theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới: Bệnh nhân nhịn đói từ nửa đêm trước khi làm nghiệm pháp, dùng một lượng glucose tương đương với 75g glucose, hòa tan trong 250-300 ml nước, uống trong 5 phút; trong 3 ngày trước đó bệnh nhân ăn khẩu phần có khoảng 150-200 gam carbohydrat mỗi ngày. HbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol). Xét nghiệm này phải được thực hiện ở phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế. Ở bệnh nhân có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết hoặc mức glucose huyết tương ở thời điểm bất kỳ ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L). Nếu không có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết (bao gồm tiểu nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, sụt cân không rõ nguyên nhân), xét nghiệm chẩn đoán a, b, d ở trên cần được thực hiện lặp lại lần 2 để xác định chẩn đoán. Thời gian thực hiện xét nghiệm lần 2 sau lần thứ nhất có thể từ 1 đến 7 ngày. Trong điều kiện thực tế tại Việt Nam, nên dùng phương pháp đơn giản và hiệu quả để chẩn đoán đái tháo đường là định lượng glucose huyết tương lúc đói 2 lần ≥ 15
126 mg/dL (hay 7 mmol/L). Nếu HbA1c được đo tại phòng xét nghiệm được chuẩn hóa quốc tế, có thể đo HbA1c 2 lần để chẩn đoán ĐTĐ [1]. Ngoài ra, BN không mắc các bệnh viêm gan, suy thận và BN tự nguyện tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân: Bệnh nhân ĐTĐ type 1, ĐTĐ thai kì và Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng nghiên cứu của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Đại học Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.3. Hóa chất Tất cả các hóa chất được sử dụng trong thử nghiệm Bradford đều có độ tinh sạch cao, đáp ứng các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Các hóa chất sử dụng được liệt kê chi tiết tại phụ lục 1. 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong quá trình thử nghiệm Bradford gồm được ghi ở phụ lục 2. Trước khi được sử dụng trong quá trình thử nghiệm Bradford, thiết bị, dụng cụ được chuẩn bị kỹ lưỡng, độ tinh sạch cao, đảm bảo đáp ứng chất lượng, hạn chế sai số ít nhất. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân Việc thu thập mẫu máu được thực hiện bởi các cán bộ y tế chuyên môn đảm bảo lấy đúng, đủ lượng mẫu. Các đối tượng nghiên cứu trước đó đã nhận được hướng dẫn rõ ràng về việc nhịn ăn cách 8 tiếng và các chế độ nghỉ ngơi cần thiết. Máu xét nghiệm được lấy ở tĩnh mạch, đánh số và cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông Lithium heparin. Heparin liên kết với antithrombin III, vừa làm tăng tốc độ bất hoạt của thrombin và các yếu tố đông máu khác vừa không làm biến đối giá trị của điện giải và protein toàn phần [23]. Mẫu máu sau khi lấy được ly tâm, tách huyết tương vào ống eppendorf 1,5mL và vận chuyển bằng tủ vận chuyển mẫu chuyên dụng đến phòng nghiên cứu của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Đại học Y dược, bảo quản lạnh ở -30oC đến khi phân tích. 2.2.2. Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản và lưu trữ 16
Sau khi lấy máu, ngay lập tức được ly tâm ở tốc độ thấp 3000-4000 vòng/phút trong vòng 10 - 15 phút để tránh vỡ hồng cầu. Thu mẫu huyết tương vào ống eppendorf 1,5mL và vận chuyển bằng tủ vận chuyển mẫu chuyên dụng đến phòng nghiên cứu của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Đại học Y dược, bảo quản lạnh ở -30oC đến khi phân tích. Kí hiệu mẫu: ống eppendorf chứa huyết tương phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Các mẫu huyết tương sẽ được rã đông trước khi tiến hành thử nghiệm Bradford. 2.2.3. Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford Hàm lượng protein trong mẫu huyết tương của bệnh nhân đái tháo đường type 2 được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 được pha theo đúng tỷ lệ khuyến nghị [8]. Protein chuẩn được sử dụng để dựng đường chuẩn là Albumin huyết tương bò (Bovine Serum Albumin (BSA)) dạng bột được pha thành dung dịch đã biết trước nồng độ. Quá trình pha dung dịch chuẩn gốc được tiến hành như sau: o Cân 3,84 g BSA, hòa tan trong 3mL nước cất. Thu được dung dịch BSA gốc có nồng độ 3840 mg/mL. Giữ ở -20oC. o Hút 100μL vào ống Eppendorf, thêm vào 900 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 1000 μL dung dịch BSA 3840 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 3840 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 1920 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 1920 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 960 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 960 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 480 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 480 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 240 μg/mL. 17
o Hút 50 μL dung dịch BSA 240 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 120 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 120 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 60 μg/mL. o Hút 50 μL dung dịch BSA 60 μg/mL vào ống Eppendorf, thêm vào 50 μL nước, Vortex để trộn đều, thu được 100 μL dung dịch BSA 30 μg/mL. Đường chuẩn được dựng bằng cách đo độ hấp thụ OD tại bước sóng 595nm ở các nồng độ khác nhau của phức hợp thuốc thử- protein chuẩn. Quy trình tiến hành thử nghiệm Bradford được tối ưu hóa bằng cách dựng đường chuẩn các dãy nồng độ protein chuẩn khác nhau với tỷ lệ thể tích mẫu thử/ tổng thể tích giếng 1/10 và 1/20, mỗi mẫu được lặp lại 2 lần. Sử dụng phân tích hồi quy để chọn ra đường chuẩn phù hợp nhất ứng với quy trình tiến hành thử nghiệm tương tự. Đường chuẩn được chọn có hệ số R2 ≥ 0,95. Phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p-value được sử dụng để xác định độ tin cậy của các hệ số trong đường chuẩn. Giá trị p-value được so sánh với mức ý nghĩa thống kê (α), chọn mức α bé hơn hoặc bằng 5%, giá trị p-value nhỏ hơn α = 5% có nghĩa là có hơn 95% khả năng kết quả của đường chuẩn là không phải do ngẫu nhiên mà có, do đó làm kết quả đáng tin cậy hơn. Các bước thực hiện thí nghiệm được tiến hành như sau: - Bước 1: Tiến hành pha thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 theo công thức dành cho 100mL ở phụ lục 3. • Các bước pha thuốc nhuộm: o Cân chính xác 10 mg phẩm màu Coomassie Brilliant Blue cho vào cốc có mỏ. o Dùng pipet thủy tinh hút lấy 5mL ethanol 95% cho vào cốc đựng Coomassie Brilliant Blue. o Đũa thủy tinh khuấy đều để phẩm màu tan trong ethanol. Cho dung dịch này vào ống đong. o Dùng pipet thủy tinh khác hút lấy 10mL dung dịch Phosphoric acid 85% cho vào ống đong đựng dung dịch ethanol 95% và Coomassie Brilliant Blue. 18
o Đũa thủy tinh khuấy đều chúng đến khi tan hết, thêm vừa đủ 100mL nước, khuấy đều. o Lọc bỏ cặn, thu lấy dung dịch o Dung dịch thu được cho vào ống đựng tối màu, bảo quản trong 20 độ C và ổn định trong ít nhất 2 tuần. - Bước 2: Tiến hành pha loãng dung dịch protein chuẩn 3840 μg/mL thành các dung dịch protein có nồng độ: 0, 30, 60, 120, 240, 480, 960, 1920, 3840 μg/mL trong các ống Eppendorf 1.5 mL. o Hút vào ống Eppendorf 20 μL dung dịch protein chuẩn nồng độ 3840 μg/mL. o Hút vào ống Eppendorf 10 μL protein chuẩn nồng độ 3840 μg/mL, thêm vào ống này 10 μL nước cất, trộn đều bằng máy vortex, thu được dung dịch protein chuẩn 1920 μg/mL. o Hút vào ống Eppendorf 10 μL protein chuẩn nồng độ 1920 μg/mL, thêm vào ống này 10 μL nước cất, trộn đều bằng máy vortex, thu được dung dịch protein chuẩn 960 μg/mL. o Tiếp tục như vậy cho đến khi thu được protein nồng độ 30 μg/mL. o Dung dịch protein chuẩn 0 μg/mL sử dụng chính là nước cất. - Bước 3: Tiến hành tra mẫu và thuốc thử vào khay 96 giếng theo đúng vị trí. o Tổng thể tích giếng là 200 μL, tỷ lệ protein/ thể tích giếng được chọn là 1/10 và 1/20: o Với tỷ lệ 1/10, giếng bao gồm 20 μL protein chuẩn/ 180 μL thuốc thử, mỗi mẫu được lặp lại 2 lần o Với tỷ lệ 1/20, giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn/ 190 μL thuốc thử, mỗi mẫu được lặp lại 2 lần o BL: blank- mẫu trắng • Mẫu được tra theo đúng vị trí bảng dưới đây: 19
Bảng 2.1. Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng Tỷ lệ 1/10 Tỷ lệ 1/20 Tỷ lệ 1/10 Tỷ lệ 1/20 Tỷ lệ 1/10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A BL BL BL BL BL BL BL BL BL BL B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C 30 30 30 30 120 120 120 120 240 240 D 60 60 60 60 240 240 240 240 480 480 E 120 120 120 120 480 480 480 480 960 960 F 240 240 240 240 960 960 960 960 1920 1920 G 480 480 480 480 1920 1920 1920 1920 3840 3840 - Bước 4: Ủ trong 2 phút và tiến hành đo OD bằng máy đo OD Epoch 2, máy được đặt ở bước song hấp thụ 595nm, ghi nhận kết quả Bước 5: Xây dựng, phân tích đường chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel, lựa chọn đường chuẩn thích hợp nhất với R bình phương hiệu chỉnh cao nhất. Quy trình được tối ưu dựa vào đường chuẩn đã chọn. 2.2.4. Xác định nồng độ protein trong mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng phương pháp Bradford Sử dụng quy trình đã được tối ưu về giới hạn nồng độ mẫu thử, tỷ lệ thể tích mẫu thử/ tổng thể tích giếng, 40 mẫu protein huyết tương bệnh nhân trước tiên được pha loãng với tỷ lệ 1/300, lượng mẫu và tổng thể tích giếng theo đúng tỷ lệ 1/20. Huyết tương được pha loãng bằng dung dịch đệm PBS 1X và nước cất theo đúng tỷ lệ. Mẫu huyết tương được pha loãng 1/300 lần: Chuẩn bị 40 ống Eppendorf, ghi số thứ tự mẫu, ngày thực hiện và tỷ lệ pha loãng trên thành ống và nắp ống Chuẩn bị đủ lượng dung dịch đệm PBS 1X cần: o 5.94 mL PBS 10X o 53.46 mL nước cất o Trộn đều thu được dung dịch đệm PBS 1X Sau khi đã có dung môi pha loãng, tiến hành lấy vào mỗi ống Eppendorf đã ghi đầy đủ thông tin 3 μL Thêm vào mỗi ống 897 μL PBS 1X 20
Vortex từng ống để trộn đều, thu được mẫu protein huyết tương bệnh nhân đã pha loãng 300 lần. Cho lần lượt 10μL protein chuẩn và protein huyết tương đã pha loãng của 40 mẫu theo đúng thứ tự vào giếng thiết kế trước, sau đó thêm 190μL thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, mỗi mẫu thực hiện 2 lần, ủ trong 2 phút. Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 595nm, ghi nhận kết quả. Dựng đường chuẩn bằng Microsoft Excel. Sử dụng phương trình tuyến tính để tính ra nồng độ protein có trong mẫu. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu. Sau khi tiến hành các thí nghiệm, kết quả được nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. 2.4. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu hoàn toàn không gây hại, không gây nguy hiểm cho người bệnh Nghiên cứu không làm gián đoạn quá trình điều trị của người bệnh. Toàn bộ thông tin của bệnh nhân chỉ được thu thập nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu, được bảo mật hoàn toàn cho đối tượng nghiên cứu. 21
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford Kết quả đo OD nền khay 96 giếng: Bảng 3.1. OD nền khay 96 giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 0,048 0,049 0,049 0,049 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 B 0,049 0,049 0,048 0,049 0,050 0,049 0,049 0,049 0,049 0,048 C 0,048 0,049 0,049 0,049 0,050 0,048 0,049 0,049 0,049 0,048 D 0,048 0,049 0,048 0,049 0,048 0,048 0,049 0,050 0,049 0,048 E 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,050 0,049 0,049 0,049 0,049 F 0,048 0,048 0,049 0,049 0,050 0,049 0,048 0,051 0,049 0,049 G 0,048 0,048 0,049 0,048 0,049 0,049 0,048 0,049 0,049 0,049 H 0,048 0,048 0,048 0,048 0,048 0,049 0,048 0,048 0,048 0,048 Nhận thấy rằng OD của các giếng trống trong khay 96 giếng là tương đối đều nhau. Do vậy, OD giếng trống không ảnh hưởng nhiều đến kết quả OD của mẫu protein. Với mỗi tỉ lệ thể tích mẫu và tổng thể tích giếng khác nhau, dựng đường chuẩn ở các dải nồng độ tương ứng với 5 điểm. Ở tỉ lệ 1/10, 3 đường chuẩn được dựng để tìm ra đường chuẩn tối ưu nhất. Kết quả đo OD và cách tính toán để dựng đường chuẩn ở dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Nồng độ BL 0 30 60 120 240 480 120 (μg/mL) OD lần 1 0,208 0,219 0,313 0,395 0,485 0,661 0,804 0,416 OD lần 2 0,219 0,224 0,327 0,385 0,494 0,662 0,779 0,461 OD trung 0,2135 0,2215 0,320 0,390 0,4895 0,6615 0,7915 0,4385 bình OD đã trừ BL 0,0080 0,1065 0,1765 0,2760 0,4480 0,5780 0,2250 22
Từ số liệu chạy phân tích, chúng tôi có kết quả biểu đồ 3.1 thể hiện tỉ lệ pha loãng 1/10 và dãy đường chuẩn nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL 0.5 y = 0,0018x + 0,0453 0.4 R² = 0,9746 0.3 OD 0.2 0.1 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.1. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL Kết quả đo OD protein chuẩn và cách tính toán để dựng đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL ở tỷ lệ 1/10 được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Nồng độ BL 0 30 60 120 240 480 120 (μg/mL) OD lần 1 0,208 0,220 0,452 0,571 0,749 0,904 1,000 0,766 OD lần 2 0,218 0,222 0,465 0,581 0,743 0,927 1,017 0,782 OD trung bình 0,213 0,221 0,4585 0,576 0,746 0,9155 10,085 0,774 OD đã trừ BL 0,0080 0,2455 0,3630 0,5330 0,7025 0,7955 0,5610 23
Từ số liệu chạy phân tích, chúng tôi có kết quả biểu đồ 3.2 thể hiện tỉ lệ pha loãng 1/10 và dãy đường chuẩn nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL 0.9 0.8 y = 0,0007x + 0,1328 0.7 R² = 0,8841 0.6 0.5 OD 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.2. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL Kết quả đo OD protein chuẩn và cách tính toán để dựng đường chuẩn của dãy nồng độ độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL ở tỷ lệ 1/10 được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Nồng độ BL 0 30 60 120 240 480 120 (μg/mL) OD lần 1 0,223 0,232 0,602 0,759 0,921 0,992 1,042 0,933 OD lần 2 0,210 0,226 0,563 0,786 0,925 1,000 1,054 0,936 OD trung bình 0,2165 0,229 0,5825 0,7725 0,923 0,996 1,048 0,936 OD đã trừ BL 0,0125 0,366 0,556 0,7065 0,7795 0,8315 0,7195 24
Từ số liệu chạy phân tích, chúng tôi có kết quả biểu đồ 3.2 thể hiện tỉ lệ pha loãng 1/10 và dãy đường chuẩn nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL. 1 0.9 y = 0,0003x + 0,2382 R² = 0,7104 0.8 0.7 0.6 0.5 OD 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.3. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Tại 3 đường chuẩn dựng được từ 3 dãy nồng độ khác nhau ở tỉ lệ 1/10, hệ số R2 của đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL cao nhất, 0,9746, còn hệ số R2 của 2 đường chuẩn còn lại đều nhỏ hơn 0,95. Điều này cho thấy rằng mô hình hồi quy tuyến tính của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL phù hợp với tập dữ liệu đến 97,46%, hay nói cách khác, 97,46% biến thiên OD được giải thích bởi nồng độ. 2,54% còn lại được giải thích bằng các biến ngoài mô hình và sai số ngẫu nhiên. Vì vậy, đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL được chọn làm đường chuẩn tối ưu ở tỉ lệ 1/10. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p-value cho đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL ở tỉ lệ 1/10, thu được kết quả như sau: 25
Bảng 3.5. Giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/10 p-value Hệ số tự do 0,11065595 Hệ số của nồng độ 0,00173193 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/10, thu được các giá trị như ở bảng 3.5. Giá trị p của hệ số tự do > 0,05, có thể thấy hệ số tự do trong phương trình hồi quy không có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương trình tuyến tính của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau khi bỏ qua hệ số tự do được sử dụng làm đường chuẩn tối ưu nhất trong tỷ lệ 1/10. 0.6 y = 0,002x 0.5 R² = 0,932 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 50 100 150 200 250 300 Hình 3.4. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số p Với tỉ lệ 1/20, tương tự như tỉ lệ 1/10, 3 đường chuẩn được dựng với 3 dãy nồng độ khác nhau: Kết quả đo OD protein chuẩn và cách tính toán để dựng đường chuẩn của dãy nồng độ độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL ở tỷ lệ 1/20 được thể hiện ở bảng 3.6. 26
Bảng 3.6. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Nồng độ BL 0 30 60 120 240 480 120 (μg/mL) OD lần 1 0,215 0,232 0,289 0,317 0,368 0,522 0,583 0.325 OD lần 1 0,232 0,233 0,285 0,302 0,35 0,472 0,561 0.344 OD trung 0,2235 0,2325 0,287 0,3095 0,359 0,497 0,572 0.3345 bình OD đã trừ đi BL 0,09 0,0635 0,086 0,1355 0,2735 0,3485 0,111 Sử dụng kết quả OD đã tính toán được, chúng tôi tiến hành vẽ đường chuẩn cho dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, kết quả đường chuẩn thu được được biểu diễn ở hình 3.5. 0.3 y = 0,0011x + 0,0188 0.25 R² = 0,9905 0.2 0.15 OD 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.5. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL Kết quả đo OD protein chuẩn và cách tính toán để dựng đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL ở tỷ lệ 1/20 được thể hiện ở bảng 3.7. 27
Bảng 3.7. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Nồng độ BL 0 120 240 480 960 1920 480 (μg/mL) OD lần 1 0,222 0,229 0,354 0,387 0,579 0,770 0,876 0,566 OD lần 2 0,228 0,234 0,34 0,442 0,591 0,772 0,916 0,548 OD trung 0,225 0,2315 0,347 0,4145 0,585 0,771 0,896 0,557 bình OD đã trừ BL 0,0065 0,122 0,1895 0,36 0,546 0,671 0,332 Sử dụng kết quả OD đã tính toán được, chúng tôi tiến hành vẽ đường chuẩn cho dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, kết quả đường chuẩn thu được được biểu diễn ở hình 3.6 0.7 0.6 y = 0,0005x + 0,047 R² = 0,9716 0.5 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.6. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL Kết quả đo OD protein chuẩn và cách tính toán để dựng đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL ở tỷ lệ 1/20 được thể hiện ở bảng 3.8. 28
Bảng 3.8. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Nồng độ BL 0 240 480 960 1920 3840 960 (μg/mL) OD lần 1 0,227 0,224 0,434 0,572 0,766 0,869 0,972 0,764 OD lần 2 0,221 0,225 0,449 0,457 0,735 0,89 0,989 0,717 OD trung 0,224 0,2245 0,4415 0,5145 0,7505 0,8795 0,9805 0,7405 bình OD đã trừ BL 0,0005 0,2175 0,2905 0,5265 0,6555 0,7565 0,5165 Sử dụng kết quả OD đã tính toán được, chúng tôi tiến hành vẽ đường chuẩn cho dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL, kết quả đường chuẩn thu được được biểu diễn ở hình 3.7. 0.8 0.7 y = 0,0003x + 0,1073 0.6 R² = 0,8864 0.5 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.7. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Ở tỉ lệ 1/20, có 2 đường chuẩn có hệ số R2 lớn hơn 0.95, đó là đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL và 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p-value cho 29
2 đường chuẩn này để nhận thấy rõ hơn hệ số tự do và hệ số của nồng độ trong phương trình hồi quy có ý nghĩa thống kê hay không. Với đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20, kết quả được thể hiện ở bảng 3.9 Bảng 3.9. Giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20 p-value Hệ số tự do 0,083605 Hệ số của nồng độ 0,000392 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số p tính toán giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20, thu được các giá trị ở bảng 3.9. Như vậy, p-value của hệ số tự do trong phương trình > 0,05, do đó không có ý nghĩa thống kê, phương trình được viết lại như sau: 0.3 y = 0,0012x 0.25 R² = 0,9699 0.2 0.15 OD 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.8. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau kiểm định trị số P. Với đường chuẩn Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20, kết quả được thể hiện ở bảng 3.10. 30
Bảng 3.10. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p- value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20 P-value Hệ số tự do 0,177686 Hệ số của nồng độ 0,002044 Như vậy, hệ số tự do trong phương trình > 0,05, do đó không có ý nghĩa thống kê, phương trình được viết lại như sau: 0.7 0.6 y = 0,0006x 0.5 R² = 0,9426 0.4 OD 0.3 0.2 0.1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.9. Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/10 sau kiểm định trị số P Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL sau kiểm định T-test So sánh 2 đường chuẩn ở tỷ lệ 1/20 sau khi đã kiểm định T-test, hệ số R2 của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL đáp ứng yêu cầu phương pháp đề ra, >0.95, do đó, đường chuẩn này được sử dụng làm đường chuẩn tối ưu nhất trong tỷ lệ 1/20. So sánh 2 đường chuẩn tối ưu nhất tại 2 tỉ lệ 1/10 và 1/20 để lựa chọn ra đường chuẩn tối ưu quy trình Bradford. 31
TỶ LỆ 1/10 0.6 0.5 y = 0,002x 0.4 R² = 0,932 0.3 OD 0.2 0.1 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) TỶ LỆ 1/20 0.3 0.25 y = 0,0012x 0.2 R² = 0,9699 0.15 OD 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.10. So sánh 2 đường chuẩn tối ưu nhất tại 2 tỉ lệ 1/10 và 1/20 Hệ số R2 của đường chuẩn ở tỉ lệ 1/20 lớn hơn 0,95, do vậy đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL ở tỷ lệ 1/20 được sử dụng để làm kết quả của quá trình tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford. Như vậy, quá trình thử nghiệm Bradford để xác định nồng độ protein huyết tương người tuân theo các bước khi xây dựng đường chuẩn của dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL ở tỷ lệ 1/20, bao gồm: • Tiến hành pha loãng dung dịch protein chuẩn 3840 μg/mL thành các dung dịch protein có nồng độ: 0, 30, 60, 120, 240 μg/mL trong các ống Eppendorf 1,5 mL. • Tiến hành tra mẫu chuẩn, mẫu thử và thuốc thử vào khay 96 giếng theo đúng vị trí, mỗi mẫu thực hiện 2 lần, mỗi giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn hoặc protein thử/ 190 μL thuốc thử. 32
3.2. Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford Tỉ lệ pha loãng protein huyết tương được chọn là 1/300. Giải thích cho mức độ pha loãng này như sau: nồng độ protein huyết tương của người bình thường rơi vào khoảng 60-70g/l, trong khi đó khoảng tuyến tính của đường chuẩn là 0-240 μg/mL. Như vậy, pha loãng 300 lần thì nồng độ protein huyết tương mẫu sẽ nằm trong khoảng tuyến tính. Sử dụng OD protein chuẩn để vẽ đường chuẩn trong thử nghiệm đo nồng độ protein toàn phần của BN ĐTĐ, với dãy nồng độ protein chuẩn 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/20, mỗi mẫu được lặp lại 2 lần. Các mẫu protein BN được tra lần lượt vào các giếng theo thứ tự được ghi ở bảng 3.11 với quá trình tra mẫu được tiến hành như sau: Tiến hành tra mẫu chuẩn, mẫu thử và thuốc thử vào khay 96 giếng theo đúng vị trí, mỗi mẫu thực hiện 2 lần, theo đúng vị trí ghi ở bảng, mỗi giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn hoặc protein thử/ 190 μL thuốc thử. Bảng 3.11. Vị trí tra mẫu protein chuẩn và mẫu thử vào khay 96 giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BL BL 7 7 36 36 61 61 91 91 123 123 B 0 0 13 13 41 41 67 67 92 92 127 127 C 30 30 16 16 45 45 72 72 101 101 134 134 D 60 60 21 21 48 48 73 73 115 115 138 138 E 120 120 23 23 49 49 76 76 117 117 139 139 F 240 240 26 26 50 50 83 83 119 119 143 143 G 60 60 29 29 58 58 86 86 120 120 150 150 H 33 33 59 59 89 89 121 121 163 163 Kết quả OD đo được của khay 96 giếng bao gồm OD của protein chuẩn và protein mẫu BN được thể hiện dưới bảng 3.12. 33
Bảng 3.12. OD đo được của khay 96 giếng gồm protein chuẩn và mẫu BN 0,263 0,267 0,588 0,580 0,561 0,585 0,621 0,567 0,492 0,564 0,554 0,559 0,268 0,267 0,576 0,554 0,560 0,568 0,557 0,581 0,478 0,507 0,577 0,584 0,337 0,378 0,556 0,551 0,590 0,500 0,568 0,567 0,564 0,552 0,577 0,587 0,381 0,393 0,560 0,586 0,509 0,523 0,587 0,561 0,583 0,602 0,449 0,528 0,423 0,411 0,579 0,546 0,561 0,544 0,568 0,560 0,596 0,598 0,551 0,551 0,553 0,553 0,560 0,568 0,586 0,562 0,552 0,558 0,560 0,568 0,577 0,590 0,380 0,397 0,594 0,569 0,586 0,524 0,571 0,580 0,570 0,585 0,574 0,525 0,590 0,600 0,538 0,545 0,597 0,568 0,554 0,559 0,580 0,586 Chúng tôi sử dụng số liệu OD đo được của protein chuẩn để tính toán và dựng đường chuẩn, cách tính được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Nồng độ OD lần 1 OD lần 2 OD trung bình OD trừ BL BL 0,263 0,267 0,265 0 0,268 0,267 0,2675 0,0025 30 0,337 0,338 0,3375 0,0725 60 0,381 0,393 0,387 0,122 120 0,423 0,411 0,417 0,152 240 0,553 0,553 0,553 0,288 60 0,380 0,397 0,3885 0,1235 Đường chuẩn được dựng dựa thể hiện mối quan hệ giữa OD đã trừ BLvà nồng độ protein, được biểu diễn ở đồ thị 3.14. 34
0.35 y = 0,0013x 0.3 R² = 0,9717 0.25 0.2 OD 0.15 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 300 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.11. Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ Dùng phương pháp kiểm định trị số P cho đường chuẩn vừa dựng, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.14. Bảng 3.14. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số p tính toán giá trị p- value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ p-value Hệ số tự do 0,271905 Hệ số của nồng độ 0,005534 Từ bảng số liệu thu được, có thể thấy p-value của hệ số tự do trong phương trình > 0,05, do vậy hệ số tự do này không có ý nghĩa thống kê. Phương trình được viết không sử dụng hệ số tự do Từ OD đo được ở khay 96 giếng, chúng tôi tính toán ra OD trung bình của lần tra mẫu, sau đó trừ đi OD của mẫu BL để thu OD thực của mẫu protein BN ở bảng 3.15. 35
Bảng 3.15. OD của mẫu protein BN ĐTĐ Mã OD Mã OD Mã OD Mã OD Mã OD BN BN BN BN BN 7 0,319 36 0,306 61 0,308 91 0,338 123 0,329 13 0,300 41 0,292 67 0,299 92 0,298 127 0,304 16 0,289 45 0,306 72 0,280 101 0,269 134 0,303 21 0,308 48 0,283 73 0,251 115 0,290 138 0,309 23 0,298 49 0,289 76 0,288 117 0,291 139 0,299 26 0,299 50 0,312 83 0,309 119 0,292 143 0,290 29 0,317 58 0,313 86 0,290 120 0,283 150 0,311 33 0,330 59 0,304 89 0,277 121 0,306 163 0,318 Dùng OD thu được ở bảng 3.15 và hồi quy sử dụng phương trình đường chuẩn ở đồ thị 3.14, chúng tôi thu được nồng độ protein huyết tương trong mẫu thử sau khi đã pha loãng 300 lần như sau: Bảng 3.16. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu đã pha loãng 300 lần (μg/mL) Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng BN độ BN độ BN độ BN độ BN độ 7 245,38 36 235,00 61 236,92 91 260,00 123 253,08 13 230,77 41 224,62 67 230,00 92 228,85 127 233,85 16 221,92 45 235,00 72 215,38 101 206,92 134 232,69 21 236,92 48 217,31 73 193,08 115 223,08 138 237,69 23 228,85 49 221,92 76 221,15 117 223,85 139 230,00 26 230,00 50 240,00 83 237,69 119 224,62 143 223,08 29 243,46 58 240,38 86 223,08 120 217,31 150 238,85 33 253,85 59 233,85 89 212,69 121 235,38 163 244,23 36
Từ nồng độ protein đã pha loãng 300 lần (tính theo μg/mL), sẽ tính ra nồng độ protein của mẫu lúc chưa pha loãng, kết quả được thể hiện ở bảng 3.17. Bảng 3.17. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu BN ban đầu (g/L) Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng Mã Nồng BN độ BN độ BN độ BN độ BN độ 7 73,62 36 70,50 61 71,08 91 78,00 123 75,92 13 69,23 41 67,38 67 69,00 92 68,65 127 70,15 16 66,58 45 70,50 72 64,62 101 62,08 134 69,81 21 71,08 48 65,19 73 57,92 115 66,92 138 71,31 23 68,65 49 66,58 76 66,35 117 67,15 139 69,00 26 69,00 50 72,00 83 71,31 119 67,38 143 66,92 29 73,04 58 72,12 86 66,92 120 65,19 150 71,65 33 76,15 59 70,15 89 63,81 121 70,62 163 73,27 Sử dụng kết quả thu được ở bảng trên để so sánh với nồng độ protein đo ở bệnh viện E như một tiêu chuẩn. Độ lệch tính theo % giữa nồng độ protein đo bằng phương pháp Bradford so với sử dụng máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800 được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.18. Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E. Độ Độ Độ Độ Độ Mã Mã Mã Mã Mã lệch lệch lệch lệch lệch BN BN BN BN BN (%) (%) (%) (%) (%) 7 3,69 36 6,16 61 2,50 91 19,82 123 8,15 13 3,44 41 0,91 67 7,13 92 7,77 127 2,26 16 3,55 45 4,44 72 6,75 101 6,65 134 3,84 21 0,73 48 17,04 73 19,78 115 4,67 138 0,54 23 5,18 49 3,23 76 4,39 117 8,51 139 12,75 26 6,15 50 20,81 83 3,25 119 4,96 143 0,86 29 7,25 58 1,15 86 6,54 120 1,23 150 10,57 33 19,36 59 12,24 89 1,61 121 13,35 163 1,34 37
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016, chúng tôi tính được giá trị trung bình độ lệch là 6,9% với độ lệch chuẩn là 5,8%. Như vậy, nhìn tổng thể, sự khác biệt giữa nồng độ protein huyết thanh BN đo bằng thử nghiệm Bradford và đo ở bệnh viện E là 6,9 ± 5,8 %. Cũng từ dữ liệu thu được, có thể thấy 9/40 kết quả thu được có độ lệch trên 10% so với nồng độ protein đo ở bệnh viện E. Không hoàn toàn rõ ràng tại sao những khác biệt này lại phát sinh; tuy nhiên, sự khác biệt của phương pháp, hóa chất, thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm cũng như bản thân người thực hiện có thể là nguyên nhân dẫn đến sai khác này. Do đó, luôn nên xây dựng khoảng tham chiếu bình thường cho thử nghiệm Bradford và chấp nhận các giá trị tính toán một cách thận trọng. Sử dụng kiểm định T-student để so sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E với 0, kết quả thu được như ở bảng 3.19. Bảng 3.19. So sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E với 0 So với Độ lệch % 0 Gía trị trung bình 6,86375 0 Phương sai 33,79813686 0 Số mẫu 40 2 df 39 P(T<=t) 0,000000002 Kết quả so sánh thể hiện ở bảng 3.19 cho thấy rằng sự khác biệt giữa giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E với 0 có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Như vậy, hai phương pháp được sử dụng để xác định nồng độ protein có kết quả khác biệt. Vì vậy, để xác thực hơn kết quả protein đo bằng phương pháp Bradford, chúng tôi khuyến nghị tiến hành xác định thêm khoảng tham chiếu bình thường cho phương pháp. Với các kết quả đã trình bày, chúng tôi muốn đưa ra một quy trình tối ưu nhất cho thử nghiệm Bradford xác định nồng độ protein trong phòng thí nghiệm, sử dụng nó như một phương pháp hỗ trợ xét nghiệm hóa sinh tại bệnh viện, so sánh giữa các lô thí nghiệm khác nhau và là bước đầu trước khi gửi protein để phân tích và phân tách sắc ký, điện di hoặc hóa miễn dịch. Chúng tôi tin rằng kết quả của chúng tôi sẽ 38
hữu ích khi quyết định lựa chọn Bradford là phương pháp phân tích định lượng protein. 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo nồng độ protein huyết tương bằng phương pháp Bradford Trong quá trình tiến hành thử nghiệm xác định nồng độ protein huyết tương bệnh nhân ĐTĐ, chúng tôi nhận thấy có những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm là: • Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm. • Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn. • Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn. • Do vận chuyển mẫu không đúng cách • Lấy mẫu không đúng theo thể tích yêu cầu • Pha loãng mẫu không chuẩn • Ghi không chính xác chỉ số. • Thao tác đo không chính xác Sai số là điều không thể tránh khỏi trong bất kỳ thử nghiệm nào. Tuy vậy, việc loại bỏ các yếu tố gây nhiễu kết quả là yêu cầu chung để đảm bảo kết quả chính xác nhất. Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành những biện pháp, kĩ thuật để hạn chế các nguy cơ sai sót ở trên. Để hạn chế những sai sót thuộc về quá trình chuẩn bị trước khi thực hiện thử nghiệm, chúng tôi đã tiến hành các quá trình như sau: • Mẫu protein huyết tương lấy từ máu bệnh nhân được các cán bộ y tế nhiều kinh nghiệm tại Khoa Nội tổng hợp Bệnh viện E thực hiện. • Quá trình ly tâm, tách mẫu huyết tương được thực hiện tại Khoa Hóa sinh Bệnh viện E là một cơ sở có chuyên môn kĩ thuật cao về phân tích, bảo quản, xử lý mẫu bệnh phẩm, với đầy đủ các trang thiết bị cần thiết và đội ngũ cán bộ được đào tạo bài bản, có trình độ chuyên môn cao. • Mẫu được vận chuyển trong tủ vận chuyển chuyên dụng, bảo đảm nhiệt độ lưu trữ mẫu. Quá trình vận chuyển mẫu được thực hiện nhanh, trong quãng đường ngắn dưới sự giám sát chặt chẽ của các cán bộ chuyên môn của Trường Đại học Y Dược. • Bảo quản mẫu: mẫu protein huyết tương BN được bảo quản trong tủ âm sâu - 30℃. 39
• Thuốc thử, chuẩn bị vật tư, thiết bị sử dụng trong suốt quá trình được tính toán kỹ lưỡng, chuẩn bị đầy đủ trước khi tiến hành phân tích mẫu Để hạn chế những sai sót khi thực hiện thử nghiệm, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị hiện đại, đảm bảo yêu cầu cho nghiên cứu, quá trình tiến hành thử nghiệm được chuẩn bị trước, lên kế hoạch đầy đủ, mẫu được phân tích lặp lại bảo đảm kết quả tốt, có cán bộ chuyên môn giám sát quá trình phân tích mẫu. Sau mỗi lần thực hiện, ghi nhận toàn bộ sự việc xảy ra và tiến hành đánh giá, phân tích kết quả đạt được. Việc đảm bảo chất lượng thí nghiệm được thực hiện đầy đủ các bước từ trước, trong và sau khi có kết quả giúp giảm thiểu các sai sót của thí nghiệm. 3.4. Một số lưu ý Xét nghiệm protein Bradford phổ biến do dễ thực hiện và độ nhạy tương đối. Sự tuyến tính hóa trên toàn bộ phạm vi nồng độ protein thu được bằng quy trình pha loãng 300 lần, dãy nồng độ chuẩn 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL ở tỷ lệ 1/20 đã trình bày ở trên giúp đơn giản hóa thêm việc thử nghiệm. Các đỉnh độ hấp thụ của phức hợp xanh protein-thuốc nhuộm và thuốc nhuộm đỏ ở dạng tự do lần lượt là ở bước sóng 595 và 470 nm. Nên đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm, để đạt được độ nhạy tối đa đối với sự thay đổi nồng độ protein. Quan trọng là, quy trình đã được cải tiến giúp người sử dụng có thêm những lợi thế sau so với quy trình chung của phương pháp Bradford ban đầu do nhà sản xuất kit xét nghiệm nêu ra, đó là: • Tăng độ chính xác. • Độ nhạy được tăng lên, do đó có thể xác định được dưới 240 μg/mL BSA trong xét nghiệm • Qúa trình thực hiện đơn giản. Tuy nhiên, tỷ lệ pha loãng mẫu 300 lần là mức được áp dụng chung cho tất cả các mẫu. Để đáp ứng tính tuyến tính hóa cho tất cả các mẫu, một số ít các mẫu đo được nằm ngoài khoảng tuyến tính nên được pha loãng với tỷ lệ cao hơn và được đo lại. 40
3.5. Một số hạn chế của đề tài Do ảnh hưởng của dịch bệnh và thời gian giãn cách xã hội, mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh chưa được thu thập đầy đủ. Vì vậy, đề tài chưa xây dựng được khoảng tham chiếu bình thường cho phương pháp Bradford. 41
KẾT LUẬN 1. Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình phân tích protein bằng phương pháp Bradford với dãy nồng độ chất chuẩn là 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL và tỷ lệ mẫu chuẩn và thuốc thử là 1/20. 2. Áp dụng thành công quy trình để xác định được nồng độ protein tổng số của 40 bệnh nhân với đường chuẩn tối ưu xây dựng được. So với kết quả đo nồng độ protein được thực hiện bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E, kết quả thu được bằng thử nghiệm Bradford tạo nên sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, và phần tram độ lệch giữa 2 phương pháp là 6,9 ± 5,8 %. KIẾN NGHỊ Trong quá trình nghiên cứu và xử lý kết quả, chúng tôi kiến nghị sẽ pha loãng mẫu và tiến hành đo độ hấp thụ quang OD cho các mẫu nằm ngoài dải tuyến tính của đường chuẩn để kết quả chính xác nhất. 42
[Date] TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y Tế (2017) Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường tip 2. Hà Nội. 2. Cục Quản lý khám, Bộ Y Tế (2020), Tình hình đái tháo đường. Tiếng Anh 3. Alper, C.A.(1974)Plasma protein measurements as a diagnostic aid. N Engl J Med. 291(6): p. 287-90. 4. American Diabetes, A.,( 2020)2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2020. Diabetes Care. 43(Suppl 1): p. S14- S31. 5. American Diabetes, A.(2010)Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 33 Suppl 1: p. S62-9. 6. Anderson, N.L.( 2010) The clinical plasma proteome: a survey of clinical assays for proteins in plasma and serum. Clin Chem. 56(2): p. 177-85. 7. Bass, J.J., et al.( 2017)An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27(1): p. 4-25. 8. Bradford, M.M.( 1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: p. 248-54. 9. Chial, H.J. and A.G. Splittgerber (1993)A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213(2): p. 362-9. 10. de Moreno, M.R., J.F. Smith, and R.V. Smith (1986), Mechanism studies of coomassie blue and silver staining of proteins. J Pharm Sci. 75(9): p. 907-11. 11. Diseases, G.B.D. and C. Injuries (2020), Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 396(10258): p. 1204- 1222. 12. Geyer, P.E., et al.( 2017) Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Mol Syst Biol. 13(9): p. 942.
13. Krohn, R.I.( 2002) The colorimetric detection and quantitation of total protein. Curr Protoc Cell Biol. Appendix 3: p. Appendix 3H. 14. Liu, Z.Q., T. Mahmood, and P.C. Yang (2014) Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6(3): p. 160. 15. Mathew, J., P. Sankar, and M. Varacallo( 2021)Physiology, Blood Plasma, in StatPearls: Treasure Island (FL). 16. Pagala, V.R., et al.( 2015) Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278: p. 281-305. 17. Paul, F.E., F. Hosp, and M. Selbach (2011) Analyzing protein-protein interactions by quantitative mass spectrometry. Methods. 54(4): p. 387-95. 18. Rahelic, D.( 2016) [7th Edition of Idf Diabetes Atlas Call for Immediate Action]. Lijec Vjesn. 138(1-2): p. 57-8. 19. Sapan, C.V., R.L. Lundblad, and N.C. Price (1999) Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl Biochem. 29(2): p. 99-108. 20. Sedmak, J.J. and S.E. Grossberg (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250. Anal Biochem. 79(1- 2): p. 544-52. 21. Selvin, E., et al.( 2018) Prognostic Implications of Single-Sample Confirmatory Testing for Undiagnosed Diabetes: A Prospective Cohort Study. Ann Intern Med. 169(3): p. 156-164. 22. Tirumalai, R.S., et al.( 2003) Characterization of the low molecular weight human serum proteome. Mol Cell Proteomics 2(10): p. 1096-103. 23. Vaught, J.B.( 2006) Blood collection, shipment, processing, and storage. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15(9): p. 1582-4. 24. Xie, F., J.C. Chan, and R.C. Ma (2018) Precision medicine in diabetes prevention, classification and management. J Diabetes Investig. 9(5): p. 998- 1015.
Phụ lục 1. Hóa chất sử dụng trong thử nghiệm Bradford STT Tên hóa chất Mục đích sử dụng 1 Thuốc nhuộm Bradford Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 2 Albumin huyết tương bò BSA Protein chuẩn 3 Nước cất Dung dịch protein nồng độ 0 μg/mL, pha loãng proein mẫu chuẩn, mẫu thử 4 Dung dịch đệm PBS Pha loãng protein mẫu thử Phụ lục 2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thử nghiệm Bradford STT Thiết bị, dụng cụ Mục đích sử dụng 1 Ống Eppendorf 1,5 mL Đựng protein chuẩn, mẫu thử protein 2 Micropipet loại 20, 200, 1000 µL, đầu côn pipet Hút chính xác thể tích thích hợp tương ứng 3 Ống đong, cốc có mỏ, đũa thủy tinh Dụng cụ để pha thuốc thử 4 Ống Falcon 50mL, bên ngoài được bọc bằng Đựng thuốc thử giấy bạc tránh ánh sáng 5 Cân phân tích sartorius TE214S, giấy cân, thìa Cân chính xác cân 6 Máy Vortex VX-200 Trộn thuốc thử, lắc trộn mẫu protein 7 Máy đo quang phổ Microplate Epoch ™ 2 Đo độ hấp thụ quang 8 Máy cất nước 1 lần Stuart Merit water still Thu nước cất W4000 9 Máy ly tâm spindown 7000 vòng/phút D1008 Lắc mẫu ống Eppendorf DLAB 3
10 Tủ lạnh bảo quản mẫu 400 lít FIOCCHETTI Bảo quản mẫu chuẩn và MEDIKA 400 mẫu thử Phụ lục 3. Công thức thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 Công thức 1000mL dung dịch[4] Quy đổi công thức 100 mL dung dịch cần để tiến hành thử nghiệm 1. Coomassie Brilliant Blue G-250: 1. Coomassie Brilliant Blue: 10 100mg mg 2. Ethanol 95%: 50mL 2. Ethanol 95%: 5mL 3. Phosphoric acid 85%: 100mL 3. Phosphoric acid 85%: 10mL 4. Nước vừa đủ: 1000mL 4. Nước vừa đủ: 100mL 5. Thuốc thử được bảo quản ở 20 ° C 5. Thuốc thử được bảo quản ở 20 và ổn định trong ít nhất 2 tuần ° C và ổn định trong ít nhất 2 tuần