Khóa luận Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)

76 trang thiennha21 18/04/2022 11413

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_toi_uu_hoa_quy_trinh_chiet_xuat_alkaloid_trong_cay.pdf

Nội dung text: Khóa luận Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC TP. Hồ Chí Minh – 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE) Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc TP. Hồ Chí Minh - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Chữ ký SV DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH
LỜI CẢM ƠN Khơng cĩ thành cơng nào mà khơng cĩ những bàn tay dìu dắt và giúp đỡ. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu của trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo cơ hội và điều kiện để em cĩ thể thực hiện đề tài này. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Cơ PGS. TS Võ Thị Bạch Huệ Cơ Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc đã dìu dắt và chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và giúp em hồn thành khĩa luận này. Em xin cảm ơn Thầy, Cơ trong hội đồng đã đồng ý phản biện cho đề tài của em. Em cũng xin gởi lời cảm ơn tới các anh chị kỹ thuật viên bộ mơn đã giúp đỡ vào tạo điều kiện về cơ sở vật chất và dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này. Em xin gởi lời cảm ơn đến các Thầy, Cơ ở các bộ mơn của khoa Dƣợc – trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành đã cho em mƣợn thiết bị, dụng cụ và hĩa chất nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu. Em xin trân trọng cảm ơn.
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT 2 1.1.1. Catharanthus 2 1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don 3 1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don 6 1.1.4. Các Vinca alkaloid chính 10 1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, định tính và định lƣợng alkaloid 14 1.2.1. Chiết xuất 14 1.2.2. Định tính 18 1.2.3. Định lƣợng 20 1.3. Tối ƣu hĩa bằng phần mềm 22 1.3.1. Giới thiệu chung 22 1.3.2. Phƣơng pháp tối ƣu hĩa 22 1.3.3. Phần mềm tối ƣu hĩa Modde 5.0 23 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Dung mơi, hĩa chất 24 2.1.3. Trang thiết bị 25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết 26 2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 28 i
2.2.3. Tối ƣu hĩa quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn 30 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết 32 3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 32 3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm 34 3.1.3. Xác định khối lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dị khối phổ (MS ) 34 3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml bằng phƣơng pháp quang phổ 35 3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc 36 3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 38 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật 38 3.2.2. Định tính alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 40 3.2.3. Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn 43 3.3. Tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn 49 3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tối ƣu hĩa 49 3.3.2. Kết quả tối ƣu hĩa 51 3.3.3. Phân tích tƣơng tác ảnh hƣởng giữa các yếu tố 54 3.3.4. Kết quả dự đốn 56 3.4. Bàn luận 57 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1. Kết luận 58 4.2. Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh ng tiếng Việt 1 VB Vinblastin 2 VC Vincristine 3 SKLM Sắc ký lớp mỏng 4 UV-Vis Ultra violet–visible Tử ngoại – khả kiến High-performance liquid 5 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography Electrospray Ionization - Phƣơng pháp khối phổ với 6 ESI-MS Mass Spectrometer ion hĩa phun điện 7 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1. Cơng thức cấu tạo Vinblastin 10 Hình 1. 2. Cơng thức cấu tạo Vincristin 12 Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung mơi hữu cơ trong mơi trƣờng kiềm 15 Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid 16 Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu 29 Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2) 33 Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin 34 Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc 35 Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol 36 Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastine sulfat 37 Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn 39 Hình 3. 7. Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) trong dịch chiết (T) cây Dừa cạn 41 Hình 3. 8. Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết 43 Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 44 Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A) 46 Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid tồn phần (dịch B) 47 Hình 3. 12. Sắc ký đồ so sánh dung mơi chiết tách alkaloid base tồn phần (dịch B) 48 Hình 3. 13. Sắc ký đồ của các dung dịch trong thí nghiệm 51 Hình 3. 14. Kết quả thể hiện mức ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hĩa 53 Hình 3. 15. Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng 53 Hình 3. 16. Đƣờng cong thể hiện tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát 54 Hình 3. 17. Đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đốn và kết quả thực tế 56 iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2. 1. Dung mơi và hĩa chất cần dùng 24 Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng 25 Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc 27 Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi 31 Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng pháp hĩa học 32 Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin 36 Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu 40 Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1) 44 Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bƣớc 2 46 Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 48 Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hĩa đã xây dựng đƣợc 50 Bảng 3. 8. Kết quả các thơng số đánh giá mơ hình thiết kế tối ƣu hĩa 52 Bảng 3. 9. Điều kiện tối ƣu hĩa dự đốn 56 Bảng 3. 10. Kết quả thực hiện 3 lần điều kiện tối ƣu 57 v
Khĩa luận tốt nghiệp dƣợc s đại học - Năm ọc 2017 – 2018 Tố ƣu ĩ quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace) Dƣơng P ƣơng Quỳnh Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, ung thƣ đã trở thành căn bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con ngƣời. Tuy nhiên, các thuốc điều trị ung thƣ vẫn cịn hạn chế. Từ những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà khoa học đã tìm ra đƣợc cơng dụng giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid trong Dừa cạn. Thế nhƣng, hàm lƣợng các alkaloid này trong cây khơng nhiều, vì vậy, nhằm xác định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ĩ quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)” đã đƣợc thực hiện. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Dƣợc liệu là tồn cây Dừa cạn khơ mua tại hiệu thuốc đơng y trên đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ơng, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Chất đối chiếu là vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin của cơng ty Cipla Pharma. Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đề tài đã hồn thành các mục tiêu đƣa ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau: - Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hĩa học, SKLM, khối phổ MS. Sử dụng vinblastin này làm chất đối chiếu trong định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu. Khảo sát đƣợc cực đại hấp thụ và xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin bằng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis. - Định tính sơ bộ dƣợc liệu Dừa cạn bằng phƣơng pháp soi bột và định tính các alkaloid trong bột Dừa cạn bằng phƣơng pháp hĩa học và sắc ký lớp mỏng. - Khảo sát các dung mơi và xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) với dung mơi chiết ban đầu là ethanol 80 %, dung mơi loại chlorophyll là hexan và dung mơi chiết tách alkaloid base từ dịch acid là chloroform. - Tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde 5.0 và đã chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung mơi/ dƣợc liệu là 5:1 (tt/kl), thời gian ngâm lạnh là 18 giờ và pH kiềm hĩa là 8. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sau 2 tháng, đề tài đã đã thực hiện đƣợc 3 mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm, khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Từ khĩa: Dừa cạn, tối ƣu hĩa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid.
Final essay for the degree of BS Pharm - Academic year 2017 – 2018 Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace) Duong Phuong Quynh Adviser: M.S.Pharm. Nguyen Thi Hong Phuc INTRODUCTION These days, cancer has become a life-threatening disease. However, the cancer treatment is still limited. Since the 1960s, scientists have found a therapeutic use of the vinca alkaloid which is extracted from Catharanthus roseus. However, the content of these alkaloids in the plant is not much, so to determine the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle, the subject "Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace" was done. MATERIALS AND METHOD Material: Dried periwinkle plants was purchased at herbal medicine store on Hai Thuong Lan Ong Street, District 5, Ho Chi Minh City. The comparator is vinblastine sulfate extracted from the Cytoblastin injection solution of Cipla Pharma. Method: Determination of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle. RESULTS AND DISCUSSTION The project has achieved the following objectives and results: - Determination of vinblastine from injection by: chemical reaction, thin layer chromatography, mass spectrometry. Use vinblastine (which had been determinated) as a comparator to do alkaloid qualitative analysis in dried periwinkle plant. Determination vinblastine's wavelength of maximum absorbance and preparation of calibration curve of vinblastine by UV-Vis spectroscopy. - Preliminary qualification of dried periwinkle powder and carry out the qualitative analysis of alkaloid in dried periwinkle powder by chemical method and thin layer chromatography. - Investigating the solvents and complete the alkaloid extraction proceduce (orientation of vinblastine) with an initial extraction solvent is ethanol 80%, chlorophyll removal solvent is hexane and the solvent using to extract based alkaloid from an acidic solution is chloroform. - Optimizing the proceduce to extract alkaloid from periwinkle plant using Modde 5.0 and selecting the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle: ratio of solvent and dried periwinkle powder 5: 1 (v/w), extracting duration is 18 hours and pH is 8. CONCLUSION After 2 months of researching on the subject, the essay have finished 3 target: determination of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in dried periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle. Keywords: Periwinkle, Catharanthus roseus, optimizing conditions, alkaloid, vinblastine.
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, khi thế giới ngày càng phát triển, con ngƣời ta tập quen dần với lối sống hiện đại hơn. Tuy nhiên, cũng từ những lối sống hiện đại này lại kéo theo những hệ lụy khác nghiêm trọng ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Con ngƣời của thế kỉ 21 càng ngày càng bị đe dọa bởi các chứng bệnh nguy hiểm, mà một trong số đĩ là ung thƣ. Khác với ngày xƣa, ung thƣ ngày nay đã trở thành một căn bệnh thế kỉ, đe dọa đến tính mạng của hàng trăm triệu ngƣời trên khắp thế giới. Dù là căn bệnh nguy hiểm nhƣng đến nay, ung thƣ chỉ đƣợc điều trị triệt để khi phát hiện bệnh ở những giai đoạn sớm. Tuy nhiên, giới hạn các thuốc điều trị và giá cả các thuốc này đã khiến cho việc điều trị trở nên càng khĩ khăn hơn. Thuốc điều trị ung thƣ, từ trƣớc đến nay đều khá đắt đỏ bởi vì việc nghiên cứu các loại thuốc này vẫn cịn hạn chế và địi hỏi phải cĩ nguồn kinh phí lớn. Tuy nhiên, vào những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà khoa học đã khám phá ra đƣợc cơng dụng thần kì giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid (đặc biệt là vinblastin và vincristin) trong Dừa cạn, một lồi cây tƣơng đối thân quen, từ đĩ mở ra một hƣớng đi mới cho việc nghiên cứu các loại thuốc chống ung thƣ. Các hợp chất vinca alkaloid trong cây Dừa cạn cĩ tác động tốt trong điều trị ung thƣ, thế nhƣng hàm lƣợng các alkaloid này trong cây khơng nhiều. Vì vậy, nhằm nghiên cứu và xác định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, chúng tơi đã thực hiện đề tài “Tố ƣu ĩ quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn”, với các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xác định vinblastin từ thuốc tiêm. - Khảo sát các hợp chất alkaloid trong Dừa cạn. - Tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT 1.1.1. Catharanthus Chi Dừa cạn Madagascar (danh pháp khoa học: Catharanthus) là một chi gồm 8 lồi cây thân thảo sống lâu năm, trong số này cĩ 7 lồi là đặc hữu của Madagascar. Trong thực tế, các lồi trong chi này chia sẻ cùng một tên gọi chung (Dừa cạn) với các lồi trong chi Vinca (Dừa cạn Châu Âu). Các lồi trong chi: + Catharanthus coriaceus Markgr, 1970. + Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon, 1948. + Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon, 1949. + Catharanthus ovalis Markgr, 1970. +Catharanthus pusillus (Murray) G. Don, 1837. + Catharanthus roseus (L.) G. Don, 1837: Dừa cạn, trƣờng xuân hoa, hải đằng, bơng dừa. + Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon, 1949. + Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon, 1949. Số lƣợng nhiễm sắc thể cho tất cả các lồi Catharanthus đều là 2n = 16. Trong các lồi của chi Catharanthus thì Catharanthus roseus là lồi cĩ giá trị ứng dụng và kinh tế cao nhất. Ngồi việc đƣợc biết đến nhƣ một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng trong y học dân gian nhƣ một loại thuốc chống đái tháo đƣờng, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thƣơng mau lành, chống viêm mắt, làm se da và ngày nay ngƣời ta cịn tìm đƣợc một cơng dụng hết sức quan trọng của lồi Catharanthus roseus, đĩ là khả năng điều trị bệnh ung thƣ rất hiệu quả. 2
1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don 1.1.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G. Don; Vinca roseus L.; Lochnera rosea Reich. Tên gọi khác: Trƣờng xuân hoa, dừa tây, bơng dừa, hải đằng, phjắc pĩt đơng (Tày), dƣơng giác, Madagascar periwinkle, pervenche de Madagascar. Bậc phân loại thực vật: Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa Mơi (Lamiidae) Bộ: Trúc Đào (Apocynales) Họ: Trúc đào (Apocynaceae) Chi: Catharanthus Lồi: Catharanthus roseus (L.) G. Don [30] 1.1.2.2. Bộ phận dùng Lá Dừa cạn đƣợc phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở 30-50 oC đến khơ. Lá chiếm 20-25 % so với tồn cây. Lá phải chứa ít nhất 0,7 % alkaloid tồn cây. Rễ chiếm 14,5 % so với tồn cây [3]. 1.1.2.3. Đặc điểm thực vật Dừa cạn là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm, phân nhiều cành thẳng đứng, cây cĩ bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên, mọc thành bụi. Lá mọc đối, thuơn dài, đầu hơi nhọn, phía cuống hẹp, nhọn, dài 3-8 cm, rộng 1-2,5 cm, khơng cĩ nhựa mủ. 3
Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở kẽ lá phía trên, đài hợp thành ống ngắn. Tràng hợp hình đinh. Phiến cĩ 5 thùy, 5 nhị đính trên tràng, 2 lá nỗn hợp với nhau ở vịi. Quả gồm 2 quả đại, dài 2,5-5 cm, rộng 2-3 mm, mọc thẳng đứng hơi ngả sang hai bên, trong cĩ 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt cĩ những mụn nổi thành hàng dọc. Mùa hoa, quả gần nhƣ quanh năm [6]. 1.1.2.4. Phân bố và trồng trọt Chi Catharanthus G. Don cĩ nguồn gốc ở đảo Madagascar với 8 lồi, trừ lồi C. pusillus (Murr.) G. Don cĩ thể tìm thấy rải rác ở Ấn Độ và Srilanca. Từ Madagascar, mọc hoang và đƣợc trồng ở nhiều nƣớc nhiệt đới cũng nhƣ ơn đới. Ở nƣớc ta, dừa cạn mọc hoang khá nhiều ở vùng bãi cát ven biển từ Hải Phịng đến Kiên Giang. Nơi tập trung nhiều nhất là các tỉnh Kiên Giang, đảo Phú Quốc và Cơn Đảo, cĩ nhiều ở Thanh Hĩa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam – Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên. Ở nguyên quán, cây cịn mọc cả ở những vùng đồi, savan cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1500 m. Dừa cạn là lồi cây ƣa sáng, ƣa ẩm và cĩ khả năng chịu đƣợc hạn. Cây ra hoa, quả nhiều hằng năm. Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào. Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đơng Âu. Những năm gần đây, xuất khẩu sang Pháp thƣờng xuyên hơn nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [3]. 1.1.2.5. Cơng dụng chủ yếu Trong dân gian Từ xa xƣa, Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau. Lồi cây này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học dân gian. Ở Madagascar, chiết xuất của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ một loại thuốc an thần, hạ huyết áp, sát trùng và thuốc điều trị tiểu đƣờng. Ở Ấn Độ, chiết xuất từ lá của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng để xử lý vết ong đốt. 4
Ở Trung Quốc, Dừa cạn đƣợc biết đến nhƣ một lồi cây giúp lợi tiểu, trị ho và làm săn se niêm mạc. Ở Trung và Nam Mỹ, Dừa cạn đƣợc sử dụng để chữa viêm mắt và đau họng. Ở Việt Nam, Catharanthus roseus từ lâu đã đƣợc dùng để hạ huyết áp, trị đái tháo đƣờng, điều kinh, chữa lỵ, thơng tiểu tiện. Cĩ ngƣời dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi cĩ hiệu quả. Cách dùng: Thƣờng dùng thân và lá phơi khơ sắc uống, cĩ thể dùng tới 50 g [4]. Trong y học hiện đại Nghiên cứu về dƣợc lý đã tiết lộ rằng Dừa cạn cĩ chứa hơn 70 loại alkaloid (indol alklaloids) khác nhau và mang đến hiệu quả trong điều trị các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ tử cung, u ác tính, u lympho Hodgkin và khơng Hodgkin [25]. Catharanthus alkaloids ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ bằng cách liên kết với các tubulin trong quá trình phân bào. Catharanthus alkaloids cũng gây nên apoptosis (trình tự hủy diệt của tế bào theo chƣơng trình cĩ sẵn trong gen). Chúng cũng ức chế sự lây lan của nhiều loại ung thƣ khác nhau [10, 11]. Chiết xuất từ cây Dừa cạn cho các tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn và vi nấm khác nhau. Theo một vài nghiên cứu, các hợp chất trong cây Dừa cạn cĩ tác động kháng khuẩn trên một số các vi khuẩn chọn lọc [12, 18]. Các nhà khoa học hiện đại đã tiến hành nghiên cứu và chứng minh đƣợc khả năng điều trị tiểu đƣờng của các alkaloid trong lồi cây này [17, 28]. Khơng những vậy, một vài nghiên cứu khác đã chứng minh đƣợc tác dụng hạ huyết áp và lipid huyết của chiết xuất từ lá Dừa cạn. Các chiết xuất từ lá Dừa cạn cĩ thể đƣợc dùng làm thuốc hoặc bổ sung vào chế độ ăn đối với những ngƣời cĩ nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp [9]. Bên cạnh đĩ, chiết xuất từ cây Dừa cạn cịn cĩ các tác dụng khác nhƣ làm lành vết thƣơng nhanh chĩng [21], điều trị tiêu chảy [16]. 5
1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don 1.1.3.1. Alkaloid a. Khái niệm Đã từ lâu các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất tự nhiên, những hợp chất tự nhiên, những hợp chất này thƣờng là những acid hoặc những chất trung tính. Nhƣng đến năm 1819, dƣợc sĩ Wilhelm Meissner mới đề nghị xếp các chất cĩ tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhĩm riêng và gọi là alkaloid, do đĩ ngƣời ta ghi nhận Meissner là ngƣời đầu tiên đƣa ra khái niệm về alkaloid: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, cĩ chứa nitơ, cĩ phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra”. Sau này, Polonopski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ cĩ chứa nitơ, đa số cĩ nhân dị vịng, cĩ phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đơi khi trong động vật, thƣờng cĩ dƣợc lực tính mạnh và cho những phản ứng hĩa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”. Tuy nhiên, cũng cĩ một số chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng nitơ khơng ở dị vịng mà ở mạch nhánh nhƣ: ephedrin trong Ma hồng, capsaicin trong ớt, hordenin trong mầm mạch nha, colchicin trong hạt cây tỏi độc [5] b. Phân loại Alkaloid là những base bậc 1, bậc 2 hay bậc 3, đơi khi các alkaloid cĩ nitơ bậc 4. Hầu hết các alkaloid cĩ nitơ tham gia vào nhân dị vịng nhƣng cũng cĩ alkaloid mà nitơ ở ngồi vịng. Ngày nay, ngƣời ta thƣờng chia các alkaloid ra thành các loại: Alkaloid thật: Những alkaloid đƣợc tạo nên từ acid amin và nitơ nằm trong dị vịng là và gọi là những chất tạo ra từ acid amin. Protoalkaloid: Nitơ nằm ở mạch thẳng. Pseudoalkaloid: là những chất đƣợc tạo ra do sự ngƣng tụ amoniac với các hợp chất khơng cĩ nitơ. 6
Ngồi ra, ngƣời ta cũng phân loại alkaloid dựa theo cấu trúc của nhân: Alkaloid khơng cĩ nhân dị vịng: Những alkaloid thuộc nhĩm này cĩ nitơ nằm ở mạch thẳng, cịn gọi là “protoalkaloid”. Alkaloid cĩ nhân dị vịng: Các alkaloid loại này cĩ thể cĩ một vịng hay nhiều vịng. Alkaloid cĩ nhân sterol: Các alkaloid steroid cĩ một khung cyclopentanoperhydrophenantren và cĩ 1 hoặc 2 nitơ trong mạch nhánh đã đĩng vịng ở vị trí C17 hoặc vị trí C3. Chúng là dẫn chất của dãy cholestan hoặc là dẫn chất của dãy pregnan. Alkaloid cĩ cấu trúc terpen: Ngƣời ta mới thấy rất ít alkaloid cĩ cấu tạo monoterpen và sesquiterpen, cấu tạo diterpen cĩ nhiều hơn nhĩm mono và sesquiterpen. Cũng cĩ nhiều tác giả phân loại alkaloid theo họ thực vật [5]. 1.1.3.2. Tính chất chung của alkaloid a. Lý tính Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên cơng thức cấu tạo cĩ oxy, nghĩa là trong cơng thức cĩ C, H, N, O, những alkaloid này thƣờng ở thể rắn ở nhiệt độ thƣờng. Những alkaloid khơng cĩ oxy thƣờng ở thể lỏng (coniin, nicotin, spartein ), tuy nhiên cũng cĩ vài chất trong thành phần cấu tạo cĩ oxy vẫn ở thể lỏng nhƣ arecolin (C8H13NO2), pilocarpin (C10H14N2O2) và cĩ vài chất khơng cĩ oxy ở thể rắn nhƣ sempervirin (C19H16N2), concessin (C24H40N2). Các alkaloid ở thể rắn thƣờng kết tinh đƣợc và cĩ điểm chảy rõ ràng, nhƣng cũng cĩ một số alkaloid khơng cĩ điểm chảy vì bị phá hủy ở nhiệt độ trƣớc khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi đƣợc và thƣờng vững bền, khơng bị phá hủy ở nhiệt độ sơi nên cất kéo đƣợc bằng hơi nƣớc để lấy ra khỏi dƣợc liệu. Mùi vị: Đa số alkaloid khơng cĩ mùi, cĩ vị đắng và một số ít cĩ vị cay nhƣ capsaicin, piperin, chavicin 7
Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều khơng màu trừ một số ít alkaloid cĩ màu vàng nhƣ berberin, palmatin, chelidonin Độ tan: Nĩi chung các alkaloid base khơng tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung mơi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, ether, chloroform, Trái lại, muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc, hầu nhƣ khơng tan trong các dung mơi hữu cơ ít phân cực. Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid cĩ khả năng quay cực (vì trong cấu trúc cĩ carbon khơng đối xứng), thƣờng tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền [5]. b. Hĩa tính Hầu nhƣ alkaloid đều cĩ tính base yếu, song cũng cĩ chất cĩ tác dụng nhƣ base mạnh và cĩ khả năng làm xanh giấy quỳ. Cĩ vài trƣờng hợp ngoại lệ, những alkaloid khơng cĩ phản ứng kiềm và cá biệt cũng cĩ chất cĩ phản ứng acid yếu. Tác dụng với các acid, alkaloid cho các muối tƣơng ứng. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra các muối phức. Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid, chia làm 2 loại: Phản ứng tạo tủa: Cĩ hai nhĩm thuốc thử tạo tủa với alkaloid: o Nhĩm thuốc thử I cho tủa rất ít tan trong nƣớc. Tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thƣờng là anion phức hợp của thuốc thử.  Thuốc thử Valse - Mayer (K2HgI4– Kali tetraiodomercurat): Cho tủa trắng hay vàng nhạt.  Thuốc thử Bouchardat (Iodo –Iodid): Cho tủa nâu.  Thuốc thử Dragendorff (KBiI4– Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng cam đến đỏ.  Thuốc thử Bertrand (Acid silicotungstic): Cho tủa trắng hay trắng ngà.  Thuốc thử Hager (Acid picric): Cho tủa màu vàng đến đỏ cam. 8
o Nhĩm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể.  Dung dịch vàng clorid, acid picrolonic, acid styphnic.  Dung dịch platin clorid.  Dung dịch nƣớc bão hịa acid picric. Phản ứng tạo màu: Cĩ một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau, do đĩ ngƣời ta cùng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết cĩ alkaloid hay khơng, cịn phản ứng tạo màu cho biết cĩ alkaloid nào trong đĩ [5]. 1.1.3.3. Alkaloid trong Catharanthus roseus (L.) Dừa cạn là một nguồn dƣợc liệu cĩ giá trị điều chế các indol alkaloid monoterpenoid. Cĩ khoảng 90 alkaloid khác nhau đƣợc tổng hợp từ lồi cây này, trong số đĩ các alkaloid thì G.H. Svohada và cộng sự (1991) đã phân loại thành nhiều nhĩm hĩa học: a. Alkaloid dưới dạng monomer Alkaloid thuộc nhân indol: alstonin (vỏ rễ), amorosin (rễ), catharantin (lá, rễ) Alkaloid thuộc nhĩm 2-acyl indol: perividin (lá), perivin (lá, rễ), perosin (lá, rễ), reserpin, ajmalicin (rễ), tetrahydroalstonin, serpentin (rễ), akuammin. Alkaloid thuộc nhĩm oxindol: mitraphylin (lá, rễ). Alkaloid thuộc nhĩm α-methylen indolin: akuammicin (rễ), lochnericin (lá), Các alkaloid khác: amocalin (rễ), pericalin (rễ), perimivin (lá), virosin (rễ) [5]. b. Alkaloid dưới dạng dimer Alkaloid thuộc nhĩm nhỏ dimer idol – indolin: desacetyl – vincaleucoblastin (lá), isoleurosin (lá), leurocristin (lá, rễ), leurosidin (lá, rễ), leurosin (lá, rễ), leurosivin (rễ), neuleurocristin (lá), rovidin (lá), neoleurosidin (lá), vinaleucoblastin (lá, rễ). Alkaloid thuộc nhĩm nhỏ dimer khác: carosidin (lá, rễ), vincamicin (lá), vindolidin (lá), vincarodin (lá), vindolicin (lá), vinosidin (rễ), vinsedicin (hạt) [3]. 9
1.1.4. Các Vinca alkaloid chính Trong Dừa cạn cĩ chứa khá nhiều alkaloid, tuy nhiên các vinca alkaloid lại đĩng vai trị quan trọng giúp hình thành giá trị điều trị bệnh và giá trị thị trƣờng của cây này. Vinca alkaloid là tập hợp các alkaloid cĩ khả năng kháng mitotic và kháng microtubule. Chúng cĩ tác động ngăn chặn liên kết beta-tubulin trong quá trình phân chia tế bào ung thƣ. Từ đĩ cĩ vai trị quan trọng trong điều trị ung thƣ. Hai vinca alkaloid chủ yếu hay đƣợc sử dụng đĩ là vinblastin và vincristin. Ngồi ra cịn một số các vinca alkaloid khác nhƣ vindesine, vinorelbine, vincaminol, vineridine và vinburnine cũng đang đƣợc nghiên cứu và đƣa vào liệu trình điều trị. 1.1.4.1. Vinblastin (VB) Cơng thức phân tử: C46H58N4O9. Vinblastin là methyl (3aR,4R,5S, 5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9 - [32]indol-9-yl ]-5-hydroxy-8-methoxy-6-methyl-3a,4,5,5a,6,11,12,13a-octahydro- 1H-indolizino [31] carbazol-5-carboxyl. Vinblastin cịn cĩ tên gọi khác là vincaleucoblastine. CH3 OH N N H CH3 O CH3 N H H H O O O H C OH 3 O H C O N 3 O CH CH3 3 Hình 1. 1. Cơng thức cấu tạo Vinblastin 10
a. Đặc điểm Là tinh thể hình kim, kết tinh từ methanol. Trọng lƣợng phân tử: 810,989 g/mol. Điểm chảy: 211-216 oC Bƣớc sĩng hấp thụ cực đại của vinblastin trong ethanol là 214 nm và 259 nm. Khơng tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat, chloroform [3]. Vinblastin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, tạo ra khí nitơ oxit [24]. b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng Vinblastin là vinca alkaloid đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1958 bởi Robert Noble và Charles Thomas Beer tại đại học Western Ontario từ Dừa cạn [22]. Trong số các tác dụng dƣợc lý đƣợc nghiên cứu của VB thì hoạt tính chống ung thƣ đƣợc nghiên cứu và đƣa vào ứng dụng nhiều nhất. Mặc dù cơ chế tác dụng của hợp chất này cịn chƣa thật sáng tỏ, nhƣng cĩ lẽ vinblastin thể hiện tác dụng độc tế bào bằng cách ức chế sự tạo thành các vi ống trên thoi gián phân, dẫn đến ngừng phân chia tế bào ở pha giữa (pha M). Ở nồng độ cao, vinblastin cịn thể hiện nhiều tác dụng phức tạp trên tổng hợp acid nucleic và protein .VB cĩ tác dụng chống ung thƣ cịn do tác động đối với chuyển hĩa của glutamat và aspartat [2]. Vinblastin đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ: Ung thƣ vú [29], ung thƣ phổi [15], ung thƣ bàng quang [26], ung thƣ tinh hồn [14], ung thƣ các dịng tế bào máu (bệnh máu ác tính), ung thƣ cổ và ung thƣ dạng nấm da [3] Từ năm 1970, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành cơng việc điều trị bệnh Letterer-Siwe (bệnh hệ lƣới lan tỏa nhiều phủ tạng) bằng VB [23]. Vinblastin cĩ mặt trong liệu trình điều trị hội chứng mơ bào (là hội chứng rối loạn hiếm gặp gây ra bởi sự phát triển bất thƣờng của một loại tế bào máu trắng gọi là mơ bào) ở trẻ em. Khơng chỉ ở trẻ em, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng vinblastin để điều trị hội chứng này ở ngƣời lớn và nghiên cứu cho kết quả khả quan [27]. 11
Vinblastin cũng cĩ mặt trong danh sách các thuốc đƣợc dùng để trị bệnh Hodgkin (một loại ung thƣ hạch, bệnh ung thƣ máu bắt đầu trong hệ bạch huyết) ở giai đoạn III và IV. Thay vì dùng riêng lẻ, ngƣời ta hay phối hợp sử dụng đồng thời 4 thuốc là mechloretamin, vinblastin, procabazine và prenisone để điều trị căn bệnh này [13]. Vinblastin cịn đƣợc dùng để điều trị bệnh leukemia cấp, u lympho khơng Hodgkin, lympho mơ bào (u lympho mơ bào), u sùi dạng nấm, sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh và u Wilm. Vào năm 2016, các nhà khoa học Canada đã nghiên cứu đƣợc rằng, vinblastin mang đến hiệu quả điều trị cũng nhƣ thể hiện ít độc tính trên các trẻ em bị u thần kinh đệm cấp thấp [19]. 1.1.4.2. Vincristin (VC) Cơng thức phân tử: C46H56N4O10 Vincristin là methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-(acetyloxy)-12-ethyl-4- [33]nonadeca-4(12),5,7,9-tetraen-13-yl]-8-formyl-10-hydroxy-5-methoxy-8,16- diazapentacyclo[34]nonadeca-2(7),3,5,13-tetraene-10-carboxylate. Vincristin cịn cĩ tên gọi khác là leurocristine. N OH C2H5 N N H CH3OOC C2H5 N OCOCH OH3C 3 H OH COOCH 3 CHO Hình 1. 2. Cơng thức cấu tạo Vincristin 12
a. Đặc điểm Là tinh thể hình phiến Điểm chảy: 218-220 oC Trọng lƣợng phân tử: 824,972 g/mol Bƣớc sĩng hấp thụ cực đại trong ethanol là 220 nm, 255 nm và 296 nm. Khơng tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat, chloroform [3]. b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng Vincristin là một alkaloid chống ung thƣ cĩ tác dụng kích ứng mạnh các mơ. Cơ chế tác dụng cịn chƣa đƣợc biết thật chi tiết nhƣng vincristin là chất ức chế mạnh tế bào. Thuốc liên kết đặc hiệu với tubulin là protein ống vi thể, phong bế sự tạo thành các thoi phân bào cần thiết cho sự phân chia tế bào. Do đĩ vincristin cĩ tính đặc hiệu cao trên chu kì tế bào, và ức chế sự phân chia tế bào ở kì giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt đƣợc tế bào, cịn ở nồng độ thấp, làm ngừng phân chia tế bào. Do thuốc cĩ tính đặc hiệu với kì giữa của sự phân chia tế bào nên độc lực của tế bào thay đổi theo thời gian tiếp xúc với thuốc, nhờ cĩ nửa đời thải trừ dài và độ lƣu giữ thuốc cao trong tế bào nên khơng cần phải truyền kéo dài. Cũng nhƣ VB, VC phối hợp với các chất khác trong điều trị bệnh leukemia cấp, bệnh Hodgkin, u lympho khơng Hodgkin, sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh và u Wilm. Vincristin cũng tỏ ra cĩ ích trong điều trị bệnh leukemia mạn, sarcom Ewing, u sùi dạng nấm, sarcom Kaposi, các sarcom mơ mềm, sarcom xƣơng, u melanin, đa u tủy, ung thƣ lá nuơi, ung thƣ trực tràng, não, vú, cổ tử cung, ung thƣ tuyến giáp và ung thƣ phổi [2]. Vincristin cũng gây độc thần kinh, tuy nhiên khơng mạnh nhƣ vinblastin. 13
1.2. P ƣơng p áp c ết xuất, địn tín và địn lƣợng alkaloid 1.2.1. Chiết xuất Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung nhƣ sau: Alkaloid nĩi chung là những base yếu, thƣờng tồn tại trong cây dƣới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vơ cơ, đơi khi cĩ dạng kết hợp với tanin nên phải tán nhỏ dƣợc liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phĩng alkaloid khỏi muối của nĩ bằng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh. Hầu hết các alkaloid base khơng tan trong nƣớc nhƣng lại dễ tan trong dung mơi hữu cơ ít phân cực. Trái lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và khơng tan trong các dung mơi ít phân cực. Mặt khác cịn tùy theo tính chất của alkaloid nhƣ loại bay hơi hoặc khơng bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết thích hợp. Thơng thƣờng, ngƣời ta sử dụng một trong 4 phƣơng pháp sau đây để chiết tách alkaloid từ dƣợc liệu [5]. 1.2.1.1. Chiết bằng dung mơi hữu cơ trong mơ trƣờng kiềm Dƣợc liệu đƣợc tán nhỏ rồi tẩm bột dƣợc liệu với dung dịch kiềm trong nƣớc. Chiết bột dƣợc liệu đã kiềm hĩa nhƣ trên bằng dung mơi hữu cơ khơng phân cực thích hợp, dung mơi này dùng để hịa tan các alkaloid base vừa đƣợc giải phĩng. Cất thu hồi dung mơi hữu cơ dƣới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cơ đặc với dung dịch acid lỗng. Các alkaloid đƣợc chuyển sang dạng muối tan trong nƣớc, cịn mỡ, sắc tố và sterol ở lại dung mơi hữu cơ. Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hĩa để chuyển alkaloid sang dạng base, lắc với dung mơi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid base. Sau khi lấy riêng lớp dung mơi hữu cơ chứa alkaloid base, ngƣời ta thƣờng loại nƣớc bằng muối trung tính khan nƣớc (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung mơi hoặc bốc hơi dung mơi sẽ thu đƣợc alkaloid thơ [5]. 14
Bột dƣợc liệu (2-5 g) - Kiềm hĩa vừa đủ ẩm - Chiết bằng 20-30 ml dung mơi hữu cơ ở nhiệt độ phịng hoặc bằng Sohxlet Dịch chiết dung mơi hữu cơ - Lắc dịch với dung dịch acid lỗng Dịch chiết nƣớc acid - Kiềm hĩa đến pH = 10 - Chiết bằng 20-30 ml dung mơi hữu cơ Dịch chiết dung mơi hữu cơ - Bốc hơi đến cắn khơ Cắn alkaloid base Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung mơi hữu cơ trong mơi trƣờng kiềm 1.2.1.2. Chiết bằng dung dịch acid lỗng trong cồn hoặc trong nƣớc (P ƣơng pháp STAS-OTTO) Thấm ẩm bột dƣợc liệu bằng dung mơi chiết xuất. Chiết bột dƣợc liệu bằng dung mơi chiết xuất. Các alkaloid trong dƣợc liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung mơi trên. 15
Cất thu hồi dung mơi hoặc bốc hơi dung mơi dƣới áp suất giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc cịn lại. Trong mơi trƣờng acid, ether thƣờng hịa tan 1 số hợp chất chứ khơng hịa tan alkaloid. Sau khi tách lớp ether, kiềm hĩa dung dịch nƣớc rồi lấy alkaloid base đƣợc giải phĩng ra bằng một dung mơi hữu cơ thích hợp. Cất thu hồi dung mơi hữu cơ rồi bốc hơi tới khơ sẽ thu đƣợc cắn alkaloid thơ [5]. Bột dƣợc liệu (2-5 g) - 20 ml dung mơi chiết - Đun 15 phút, lọc (2 lần x 20 ml) Dịch chiết nƣớc acid - Kiềm hĩa đến pH = 10 - Chiết với dung mơi hữu cơ Dịch chiết dung mơi hữu cơ - Acid hĩa bằng acid lỗng (5 ml x 2 lần) Dịch chiết nƣớc acid Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid 1.2.1.3. Chiết bằng cồn acid Cĩ một số alkaloid trong dƣợc liệu tồn tại dƣới dạng muối tan tốt trong cồn ở mơi trƣờng trung tính. Do đĩ, sau khi tán nhỏ dƣợc liệu ở kích thƣớc thích hợp đem thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic tới kiệt alkaloid. Quy trình tiếp theo đƣợc thực hiện tƣơng tự [5]. 16
Bột dƣợc liệu (2-5 g) - 20 ml – 30 ml cồn cĩ 5% acid - Đun hồi lƣu 10 phút, lọc (2 lần x 20 ml) Dịch chiết cồn acid - Trung hịa đến pH 5-6 - Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn - Hịa tan cắn trong nƣớc nĩng (10 ml x 2 lần), lọc Dịch chiết nƣ ớc acid - Kiềm hĩa đến pH = 10 - Chiết bằng dung mơi hữu cơ Dịch chiết dung mơi hữu cơ - Chiết với dung dịch acid Dịch chiết nƣớc acid Hình 1. 5. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cồn acid 1.2.1.4. Chiết bằng cất kéo ơ nƣớc Đây là phƣơng pháp dùng để chiết tách những alkaloid bay hơi đƣợc nhƣ coniin, nicotin, spartein Sau khi sấy khơ dƣợc liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid dạng muối ra dạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi dƣợc liệu theo phƣơng pháp cất kéo bằng hơi nƣớc [5]. 17
Bột dƣợc liệu (10 g) - Kiềm hĩa sau đĩ cất kéo theo hơi nƣớc - Hứng vào bình cĩ sẵn dung dịch acid lỗng Dịch cất (50 ml) - Kiềm hĩa đến pH = 10 - Chiết với dung mơi hữu cơ Dịch chiết dung mơi hữu cơ - Bay hơi dung mơi Cắn alkaloid Hình 1. 6. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cất kéo hơi nƣớc 1.2.2. Định tính 1.2.2.1. Định tính trên tiêu bản thực vật Muốn xác định xem trên tiêu bản thực vật cĩ alkaloid hay khơng và cĩ ở vị trí nào thì ngƣời ta hay dùng thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid). Vì protid cũng cĩ thể cho kết tủa với thuốc thử này nên để kết luận chắc chắn thì thƣờng tiến hành song song hai tiêu bản: Tiêu bản 1: Ngay sau khi mới cắt, nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, đợi một lúc rồi soi kính hiển vi sẽ thấy kết tủa màu nâu. Tiêu bản 2: Đem ngâm tiêu bản vào cồn tartric, sau đĩ rửa sạch cồn tartric, đặt lên phiến kính rồi nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, để một lúc rồi đem soi kính. Nếu tế bào cĩ chứa alkaloid thì alkaloid đã hịa tan trong cồn và trên vi phẫu 2 khơng quan sát thấy tủa nâu. Cịn nếu vẫn thấy tủa thì phải nghĩ ngay tới tủa của protid [5]. 18
1.2.2.2. Địn tín trong dƣợc liệu và trong các chế phẩm a. Định tính bằng thuốc thử chung Để phát hiện alkaloid trong dƣợc liệu bằng các thuốc thử chung, thƣờng ngƣời ta chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phƣơng pháp chiết thích hợp rồi dùng các thuốc thử để phát hiện và đánh giá sơ bộ sự cĩ mặt của chúng trong dƣợc liệu. Tùy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp. Các phản ứng với thuốc thử chung thƣờng đƣợc thực hiện với muối alkaloid trong mơi trƣờng nƣớc acid. Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vơ định hình cĩ màu sắc khơng đặc trƣng thay đổi tùy theo thuốc thử. Với một số thuốc thử, tủa này cĩ thể tan lại trong một lƣợng thuốc thử thừa. Các thuốc thử thƣờng dùng là Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendorff, Hager và acid tannic [5]. b. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) SKLM đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp phát hiện sự cĩ mặt, đồng thời đánh giá sơ bộ thành phần alkaloid của dƣợc liệu khi sử dụng các hệ dung mơi thích hợp. Tiến hành sắc ký song song với 1 alkaloid chuẩn cịn cho phép nhận định sự cĩ mặt của một alkaloid nào đĩ trong dƣợc liệu. SKLM cịn hữu dụng trong việc xác định 1 dƣợc liệu khi sắc ký so sánh với dƣợc liệu chuẩn. Pha tĩnh: Trong định tính alkaloid bằng SKLM, ta thƣờng dùng silica gel G, F254, GF254 .Các pha tĩnh khác nhƣ nhơm oxyd, silica gel pha đảo đơi khi cũng đƣợc dùng. Dung mơi khai triển: Dung mơi khai triển sắc ký alkaloid thƣờng là hỗn hợp 2 hay 3 dung mơi hữu cơ, từ phân cực yếu tới phân cực trung bình. Đơi khi, các dung mơi phân cực mạnh hơn nhƣ butanol, ethanol, methanol, nƣớc, các acid nhƣ acid acetic, acid formic cũng đƣợc dùng đối với alkaloid phân cực mạnh. Mẫu thử thƣờng là alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base tồn phần đƣợc hịa tan trong các dung mơi ít phân cực và dễ bay hơi. Các hệ dung mơi khai triển sắc ký thƣờng dùng cho alkaloid là: 19
CHCl3– MeOH – NH4OH (50:9:1) n-butanol – CH3COOH – NH4OH (4:1:5) Cyclohexane – CHCl3– dietylamine (5:4:1) CHCl3– MeOH (4:1) Phát hiện vết: Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký, ngƣời ta thƣờng phun hoặc nhúng với thuốc thử Dragendorff. Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền vàng cam. Cách phát hiện thơng thƣờng nhƣ soi đèn UV (254 nm và 365 nm) hoặc hơ trong hơi iod cũng đƣợc dùng nhƣ là phƣơng pháp bổ sung nhƣng khơng đặc hiệu. Ghi nhận kết quả: Ghi nhận số lƣợng các vết quan sát đƣợc trên sắc ký đồ về màu sắc với các phƣơng pháp phát hiện, Rf và tỉ lệ tƣơng đối của các vết alkaloid trong hỗn hợp [5]. 1.2.3. Địn lƣợng 1.2.3.1. P ƣơng p áp cân Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng khi đã chiết đƣợc alkaloid tinh khiết, nghĩa là đã loại đƣợc hồn tồn những tạp chất kèm theo. Phạm vi sử dụng: Áp dụng với những alkaloid cĩ tính base rất yếu, vì những alkaloid này khơng chuẩn độ đƣợc bằng phƣơng pháp acid-base, do hằng số điện ly quá bé sẽ khơng cĩ bƣớc nhảy trên đƣờng cong chuẩn độ nên khơng quan sát đƣợc sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị. Thực hiện: Khi định lƣợng, ngƣời ta phải chiết đƣợc alkaloid tinh khiết bằng một dung mơi thích hợp, đem bốc hơi dung mơi, sấy cắn đến khối lƣợng khơng đổi rồi đem cân [5]. 20
1.2.3.2. P ƣơng p áp trung ị (t ừa trừ) Phạm vi sử dụng: Thƣờng dùng nhiều với những alkaloid họ Cà, áp dụng với các alkaloid chiết ra ở dạng base. Thực hiện: Sau khi đã cĩ dịch chiết alkaloid base, cĩ thể tiến hành định lƣợng bằng cách lắc alkaloid trong dung mơi hữu cơ với lƣợng chính xác acid chuẩn độ dƣ, sau đĩ định lƣợng acid thừa bằng kiềm tƣơng ứng, hoặc làm bốc hơi dung mơi hữu cơ, cắn alkaloid cịn lại đƣợc định lƣợng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Chỉ thị thƣờng dùng trong phƣơng pháp chuẩn độ thừa trừ này là metyl da cam hoặc metyl đỏ [5]. 1.2.3.3. P ƣơng p áp chuẩn độ trong mơ trƣờng khan Phạm vi sử dụng: Áp dụng với các alkaloid cĩ tính base rất yếu. Thực hiện: Hịa tan alkaloid vào dung mơi khơng phải nƣớc, thƣờng dùng acid acetic khan (gọi là mơi trƣờng khan). Sau đĩ dùng acid percloric để định lƣợng và chỉ thị là tím tinh thể [5]. 1.2.3.4. P ƣơng p áp đo qu ng Phạm vi sử dụng: Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng với các alkaloid cĩ màu tự nhiên hoặc các alkaloid cĩ thể tác dụng với thuốc thử hoặc biến đổi để tạo thành các chất cĩ màu. Thực hiện: - Đối với các alkaloid cĩ màu tự nhiên, cĩ thể đo trực tiếp màu dung dịch - Với những alkaloid khơng thể tạo thành dung dịch cĩ màu để định lƣợng trực tiếp, ngƣời ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa cĩ màu, sau đĩ tách riêng tủa và hịa tan trong dung mơi thích hợp để thu đƣợc dung dịch cĩ màu để định lƣợng. - Một số alkaloid cĩ thể biến đổi để tạo thành một dẫn chất cĩ màu hoặc dùng phản ứng giáng phân alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết rồi cho tác dụng với thuốc thử tạo ra dung dịch cĩ màu để định lƣợng [5]. 21
1.2.3.5. P ƣơng p áp sắc ký lỏng hiệu năng c o (HPLC) Phạm vi sử dụng: Áp dụng cho nhiều alkaloid khác nhau. Thực hiện: Để tến hành định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC cần: - Cĩ alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn. - Xây dựng phƣơng pháp chiết kiệt alkaloid trong dƣợc liệu đáp ứng đủ nhu cầu định lƣợng. - Xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký trên máy HPLC (pha tĩnh, pha động, detector, tốc độ dịng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) [5]. 1.3. Tố ƣu ĩ bằng phần mềm 1.3.1. Giới thiệu chung Trong điều kiện chiết, ngồi bản chất của mẫu chiết thì kết quả của quá trình chiết cịn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố bên ngồi. Vì vậy, cần tối ƣu hĩa các điều kiện này để đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tối ƣu hĩa cĩ thể đƣợc định nghĩa là quá trình tìm kiếm các yếu tố ảnh hƣởng để hạm mục tiêu đạt lớn nhất hoặc nhỏ nhất theo mong muốn, trong khi vẫn đáp ứng đủ các điều kiện ban đầu. 1.3.2. P ƣơng p áp tố ƣu ĩ Thơng thƣờng, cĩ 2 phƣơng pháp để tối ƣu hĩa một mơ hình : - Phƣơng pháp cổ điển (phƣơng pháp thực nghiệm một biến số): ta thay đổi lần lƣợt từng yếu tố (biến độc lập) để thu đƣợc kết quả (biến phụ thuộc), thực hiện lần lƣợt với từng yếu tố. Phƣơng pháp này tƣơng đối đơn giản nên chỉ áp dụng cho mơ hình cĩ từ một đến hai biến độc lập. Phƣơng pháp khơng cĩ hiệu quả trong các mơ hình nhiều yếu tố. - Phƣơng pháp tối ƣu hĩa bằng phần mềm chuyên dụng: phƣơng pháp này cho phép xây dựng đƣợc các mơ hình cĩ nhiều yếu tố ảnh hƣởng. Đánh giá đƣợc sự ảnh hƣởng nhiều hay ít giữa các yếu tố, từ đĩ xác định đƣợc kết quả dự đốn bằng các phép tính tốn trong phần mềm. Cĩ nhiều phần mềm chuyên dụng cho việc tối ƣu hĩa nhƣ MODDE, JMP, Design – Expert [8]. 22
1.3.3. Phần mềm tố ƣu ĩ Modde 5.0 Modde 5.0 là phần mềm tối ƣu hĩa đƣợc phát triển bởi Umetrics AB. Đây là phần mềm đƣợc xây dựng để thiết kế và đánh giá các thử nghiệm với nhiều biến số khác nhau. Phần mềm này giúp ngƣời sử dụng định hƣớng cải thiện và tối ƣu hĩa đƣợc các sản phẩm cũng nhƣ quy trình với lƣợng thử nghiệm tối thiểu, do đĩ giảm đƣợc cơng sức và tiết kiệm đƣợc thời gian hơn so với dùng các phƣơng pháp đắt tiền khác. Phần mềm Modde cĩ những cơng dụng nhƣ sau: - Thiết kế thử nghiệm. - Phân tích dữ liệu và đánh giá kết quả. - Dự đốn và tối ƣu hĩa quy trình [20]. 23
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đố tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Dược liệu (Tồn cây Dừa cạn) Dƣợc liệu đƣợc thu mua tại hiệu thuốc đơng y trên đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ơng, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu dƣợc liệu sau khi sơ chế đƣợc sấy khơ. Dƣợc liệu khơ đƣợc xay nhỏ đến dạng bột thơ. Bảo quản trong bao nylon kín. Alkaloid định hướng chiết từ thuốc tiêm: Vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa 1 mg vinblastin sulfat) của cơng ty Cipla Pharma. Thành phần của dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/10ml: Vinblastin sulfat 1mg Natri clorid 9 mg Benzyl alcohol 0,9% v/v Nước cất pha tiêm vừa đủ thể tích 2.1.2. Dung mơi, hĩa chất Bảng 2. 1. Dung mơi và hĩa chất cần dùng Stt Tên dung mơi, hĩa chất Xuất xứ 1 Chloroform Trung Quốc 2 Dicloromethan Trung Quốc 3 Ethyl acetat Trung Quốc 4 Hexan Trung Quốc 5 Toluen Trung Quốc 6 Methanol Trung Quốc 7 Ethanol 50%, 80%, 96% Việt Nam 8 Amoniac đậm đặc Trung Quốc 9 Acid hydrochloric Trung Quốc 24
2.1.3. Trang thiết bị Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng Stt Tên thiết bị Model Hãng sản xuất 1 Bếp cách thủy WNB 14 Memmert (Đức) 2 Cân phân tích 0,1mg Entris 224I-1S Sartorius (Đức) 3 Đèn UV 254 nm & 365 nm UVP10 Spectroline (Mỹ) 4 Máy đo quang UV UV 1800 Shimadzu (Nhật) 5 Tủ hood BS-122 Tran Vu (Việt Nam) 6 Máy xay An Phú Tân (Việt Nam) 7 Tủ sấy UN 110 Memmert (Đức) 8 Máy cơ quay RV 10 Control IKA (Đức) 9 Kính hiển vi CX 22 Olympus (Nhật) 25
2.2. P ƣơng p áp ng ên cứu 2.2.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết Sử dụng dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa 1 mg vinblastin sulfat) của cơng ty Cipla Pharma. 2.2.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin a. Phương pháp hĩa học Chuẩn bị mẫu: Hút 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa 1 mg vinblastin sulfat), pha lỗng với nước cất vừa đủ 10 ml. Sau khi chuẩn bị mẫu nhƣ trên, tiến hành định tính alkaloid bằng phƣơng pháp hĩa học với các thuốc thử chung alkaloid. b. Sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị mẫu: + Mẫu 1: Thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa 1 mg vinblastin sulfat). + Mẫu 2: Hút chính xác 1 ml dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin cho vào bình định mức 20 ml, thêm nước cất đến vạch. Acid hĩa dịch nƣớc với HCl 1M (TT) đến pH 1-2, sau đĩ kiềm hĩa dung dịch bằng amoniac đậm đặc (TT) đến pH 9- 10. Chiết vinblastin base trong dung dịch bằng chloroform. Cơ thu hồi bớt dung mơi. Tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng và quan sát ở những điều kiện khác nhau. 2.2.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) của phần 2.2.1.1. 2.2.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của alkaloid chiết đƣợc Thực hiện đo khối phổ của mẫu dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm bằng hệ ESI- MS/MS (Phƣơng pháp ion hĩa phun điện). Ghi nhận lại phổ đồ và xác định số khối của hoạt chất trong mẫu thử. 26
2.2.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/ 10 ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ Chuẩn bị mẫu: + Mẫu 3: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (cĩ chứa 1 mg vinblastin sulfat) vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch để thu đƣợc dung dịch cĩ nồng độ 0,001 g/l (1 ppm) + Mẫu 4: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1. Cơ dịch chloroform đến cắn. Hịa tan cắn với methanol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol đến vạch. Tiến hành quét phổ của 2 mẫu trên bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 để khảo sát cực đại hấp thụ của các mẫu này. 2.2.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn của alkaloid sulfat trong nƣớc Chuẩn bị mẫu: Tiến hành chuẩn bị 6 dung dịch mẫu nhƣ sau để thu đƣợc các dung dịch cĩ nồng độ (g/l) khác nhau. Trộn 5 ống thuốc tiêm lại, lắc đều cho đồng nhất. Hút lƣợng thuốc tiêm nhƣ sau: Dung dịch 1: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 50 ml. Dung dịch 2: Hút chính xác 18 ml dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml. Dung dịch 3: Hút chính xác 14 ml dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml. Dung dịch 4: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 100 ml. Dung dịch 5: Hút chính xác 16 ml dung dịch 4 pha vào bình định mức 20 ml. Dung dịch 5: Hút chính xác 12 ml dung dịch 4 pha vào bình định mức 20 ml. Thêm nước cất vừa đủ thể tích. Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc Dung dịch 1 2 3 4 5 6 Nồng độ thu đƣợc (g/l) 0,002 0,0018 0,0014 0,001 0,0008 0,0006 27
Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 và vẽ đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastin sulfat. 2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 2.2.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật Soi bột: Quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị) trƣớc khi soi trên kính hiển vi. 2.2.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu dừa cạn a. Phương pháp hĩa học Chuẩn bị mẫu: Lấy 3 g bột dƣợc liệu cho vào một bình nĩn nút mài, làm ẩm bột dƣợc liệu bằng amoniac đậm đặc (TT) trong 30 phút. Thêm 30 ml chloroform (TT), lắc kỹ trong 30 phút, lọc vào bình lắng gạn. Chiết 3 lần bằng dung dịch acid hydrocloric 2 % (TT), mỗi lần với 5 ml, thu đƣợc dịch chiết acid. Tiến hành thử với các thuốc thử chung alkaloid để xác định sự cĩ mặt của alkaloid. b. Sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị mẫu: + Mẫu chuẩn: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1. + Mẫu thử: Chuyển dung dịch acid đã chiết ở phần phản ứng hĩa học cịn lại vào bình gạn, kiềm hĩa bằng amoniac đậm đặc (TT) tới pH 9-10, lắc với chloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết chloroform, cơ trên cách thủy đến cịn khoảng 5 ml. Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định sự cĩ mặt của alkaloid. 28
2.2.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn Quy trình chiết alkaloid cơ bản: Bột dƣợc liệu - Ngâm lạnh với dung mơi chiết 1 Bƣớc 1 - Cơ thu hồi bớt dung mơi, lọc Dịch lọc - Lắc phân bố với dung mơi 2 để loại Bƣớc 2 chlorophyll. - Loại bỏ dịch dung mơi Dịch nƣớc cịn lại - Chiết với dung mơi 3 Bƣớc 3 Dịch chiết dung mơi Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu Tiến hành khảo sát các dung mơi thích hợp cần dùng để thu đƣợc quy trình ổn định và phù hợp nhằm chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Các bƣớc tiến hành khảo sát đƣợc tiến hành nhƣ sau: a. Khảo sát dung mơi chiết ở bước 1 (theo hình 2.1) Tiến hành khảo sát dung mơi chiết bƣớc 1 theo quy trình chiết với các dung mơi: + Ethanol 50 % + Ethanol 80 % + Ethanol 96 % Các dung mơi dùng ở bƣớc 2 và 3 tùy chọn. Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2) và tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc. 29
b. Khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bước 2 (theo hình 2.1) Sau khi đã khảo sát xong dung mơi chiết bƣớc 1, chiết alkaloid trong Dừa cạn bằng dung mơi đã chọn, sau đĩ tiến hành khảo sát dung mơi 2 loại chlorophyll theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) với các dung mơi sau: + Hexan + Toluen + Ethyl acetat + Dicloromethan Dùng dung mơi tùy ý để chiết ở bƣớc 3. Ghi nhận lại khối lƣợng tủa (m1) sau khi loại chlorophyll và khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2). Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc. c. Khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bước 3 (theo hình 2.1) Dùng các dung mơi đã khảo sát đƣợc ở mục (a), (b) và tiến hành khảo sát tiếp dung mơi để chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) nhƣ trên. Khảo sát dung mơi chiết alkaloid base với các dung mơi sau: + Chloroform + Ethyl acetat + Dicloromethan Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2) thu đƣợc. Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc. 2.2.3. Tố ƣu ĩ quy trìn c ết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn Từ kết quả nghiên cứu sơ bộ ở trên, ta cĩ thể chọn đƣợc các dung mơi thích hợp để thu đƣợc quy trình chiết alkaloid ổn định và phù hợp. Để chiết xuất đƣợc alakloid từ cây Dừa cạn, ta dùng phƣơng pháp ngâm lạnh, tuy nhiên, hiệu suất của phƣơng pháp này lại phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau nhƣ thời gian chiết xuất, 30
dung mơi chiết xuất, tỉ lệ dung mơi và dƣợc liệu, nhiệt độ chiết Vì vậy, tiến hành tìm những điều kiện chiết tối ƣu để thu đƣợc lƣợng alkaloid tồn phần nhiều nhất. Áp dụng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm với 3 yếu tố độc lập: Tỷ lệ dung mơi và dƣợc liệu, thời gian ngâm lạnh (giờ), pH dùng để kiềm hĩa. Yếu tố phụ thuộc hay thơng số tối ƣu hĩa là khối lƣợng alkaloid tồn phần cân đƣợc (g). Giá trị các yếu tố độc lập và khoảng biến thiên đƣợc trình bày ở bảng 2.4 [7]. Sử dụng phần mềm Modde 5.0 theo mơ hình D-Optional để thiết kế 13 thí nghiệm chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đĩ thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm tại mức độ cơ bản của các yếu tố. Thực hiện 16 thí nghiệm đã thiết kế, nhập số liệu thu đƣợc và phân tích kết quả dựa trên các phân tích tốn học của phần mềm Modde 5.0. Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi Ký Mức Mức Mức Khoảng biến Stt Yếu tố hiệu cơ bản trên (+) dƣới (-) thiên ( ) Tỷ lệ dung mơi 1 và dƣợc liệu X1 10:1 15:1 5:1 5 (ml/g) Thời gian ngâm 2 X2 24 30 18 6 lạnh (giờ) pH dùng để 3 X3 9,0 10,0 8,0 1,0 kiềm hĩa 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết 3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 3.1.1.1. P ƣơng p áp ĩ ọc Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.1.1, sau đĩ lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml. - Ống 1 (Ống chứng): Khơng thêm thuốc thử. - Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT). - Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT). - Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT). - Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT). - Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT). Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1 (ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.1: Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng pháp hĩa học Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á 1 Khơng thêm thuốc thử 2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++ 3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++ 4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng + 5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng + 6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++ Chú thích: (+) dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút (+++) Cĩ tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2. Nhận xét: Khi cho thêm các thuốc thử vào, thấy xuất hiện kết tủa và dung dịch bị đục, chứng tỏ trong mẫu thuốc tiêm Cytoblastin cĩ alkaloid. 32
3.1.1.2. Sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (b) phần 2.2.1.1 và tiến hành sắc ký với điều kiện: - Bản mỏng: Silica gel F254. - Dung mơi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1). - Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff. (a) (b) (c) (d) Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2) (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff 33
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng bƣớc sĩng 254 nm, vết vinblastin sulfat trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và vết của dịch chiết từ thuốc tiêm (2) cĩ Rf bằng nhau và hiện màu tím lơ. Đồng thời, sắc ký đồ của 2 dung dịch sau khi phun thuốc thử Dragendorff cho 2 vết màu cam. 3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm Thực hiện chiết nhƣ mẫu 2, thu đƣợc dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm. 3.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng p ƣơng p áp sắc ký lỏng g ép đầu dị khối phổ (MS ) Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu nhƣ phần 2.2.1.3. Tiến hành đo khối phổ của mẫu thử bằng hệ ESI-MS/MS (Phƣơng pháp ion hĩa tia điện). - Thời gian chạy: 1 phút - Năng lƣợng ion hĩa: 70 eV - Tốc độ dịng: 2 ml/ phút Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin Nhận xét: Sau khi quan sát phổ khối của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin, ta thấy số khối của hoạt chất trong dịch thử là [M] = 811,36 m/z và [M+1] = 812,50 m/z. Phổ khối ESI-MS của chất thử cho pic ion phân tử, ở dạng [M+1] với cƣờng độ khá mạnh, các pic ion phân tử với số khối phù hợp với trọng lƣợng phân tử lý thuyết của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V là M = 811,0 g/mol [1]. 34
Kết luận: Từ kết quả của các mục 3.1.1, 3.1.2 và 3.1.3 cĩ thể khẳng định rằng trong thuốc tiêm Cytoblastin cĩ chứa vinblastin. 3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 2.2.1.4. Tiến hành quét phổ để tìm cực đại hấp thụ của vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin, thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Mẫu 1: Cĩ cực đại hấp thụ tại bƣớc sĩng λ= 258,0 nm, A = 0,327. - Mẫu 2: Cĩ cực đại hấp thụ tại bƣớc sĩng λ= 258,0 nm, A = 0,127. Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc 35
Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol Nhận xét: Mẫu 3 và mẫu 4 đều cĩ cực đại hấp thụ tại max = 258 nm. Vậy chọn bƣớc sĩng 258 nm để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử. 3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 ở bƣớc sĩng 258 nm, kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2: Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin Mẫu Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ 1 0,0020 0,641 2 0,0018 0,576 3 0,0014 0,441 4 0,0010 0,319 5 0,0008 0,259 6 0,0006 0,197 36
0.7 0.6 0.5 0.4 y = 317.0x + 0.003 0.3 R² = 0.999 Độ hấp thu A hấp Độ thu 0.2 0.1 0 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 Nồng độ vinblastine sulfate (g/l) Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastine sulfat Trắc nghiệm t: Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b theo phƣơng trình hồi quy: y = 317x + 0,003. Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng cĩ ý nghĩa thống kê”. HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj cĩ ý nghĩa thống kê”. - t0,05 (n-2) = 2,77. - t0 = 0,86 t0,05 (n-2) = 2,77  chấp nhận HA  hệ số a cĩ ý nghĩa thống kê. Trắc nghiệm f: Kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy. Giả thuyết H0: Bj = 0 “Phƣơng trình hồi quy khơng tƣơng thích”. HA: Bj ≠ 0 “Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích”. - f0,05 = 7,71. - f = 8910,16 > f0,05  chấp nhận HA  phƣơng trình hồi quy tƣơng thích. 37
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat theo phƣơng trình y = 317x, R2= 0,999 trong khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006 - 0,002 g/l. Nhận xét chung: Ta chiết vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng cách chuyển vinblastin ở dạng muối thành vinblastin base và dùng dung mơi hữu cơ để chiết vinblastin base ra khỏi dung dịch. Sau khi tiến hành định tính dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin và dịch chiết đƣợc từ thuốc tiêm thì kết quả cho thấy cĩ alkaloid trong cả 2 dung dịch. Đồng thời, khi xác định khối lƣợng phân tử của chất đã chiết đƣợc bằng phƣơng pháp MS, ta thấy khối lƣợng phân tử của chất đã chiết tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V (M = 811,0 g/mol). Chứng tỏ cĩ alkaloid (định tính vinblastin) trong dịch chiết này. Khảo sát cực đại hấp thụ của chất đã chiết và vinblastin sulfat trong thuốc tiêm, ta thấy cả 2 mẫu đều cĩ cực đại hấp thụ tại 258 nm. Chọn bƣớc sĩng 258 nm là bƣớc sĩng để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử. Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat trong mơi trƣờng nƣớc ở khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006-0,002 g/l. 3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật Bột Dừa cạn tồn cây cĩ màu vàng nhạt, khơng mùi, vị đắng. Các cấu tử đƣợc tìm thấy trong bột dƣợc liệu gồm cĩ: mảnh bần, mảnh mơ mềm cĩ chứa tinh bột, mảnh mạch vịng, mạch xoắn, mạch vạch, lơng che chở đơn bào hay đa bào. Nhận xét: Bột dƣợc liệu Dừa cạn cĩ các cấu tử đặc trƣng của bột cây Dừa cạn theo DĐVN V [1]. 38
(a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn (a) Mảnh bần (b) Mảnh mơ mềm cĩ tinh bột (c) Mạch vịng (d) Mạch xoắn (e) Mạch vạch (f) Lơng che chở đơn bào 39
3.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.2.1. Phản ứng hĩa học Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.2.2, sau đĩ lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml. - Ống 1 (Ống chứng): Khơng thêm thuốc thử. - Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT). - Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT). - Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT). - Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT). - Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT). Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1 (ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.3: Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu bằng phƣơng pháp hĩa học Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á 1 Khơng thêm thuốc thử 2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++ 3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++ 4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng + 5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng ++ 6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++ Chú thích: (+) Dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút (+++) Cĩ tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2 Nhận xét: Dịch chiết cho phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử chung alkaloid, điều đĩ chứng tỏ trong mẫu dƣợc liệu cĩ chứa alkaloid. 40
3.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị 2 mẫu nhƣ mục (b) phần 2.2.2.2 và tiến hành sắc ký với điều kiện: - Bản mỏng: Silica gel F254. - Dung mơi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1). - Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff. (a) (b) (c) (d) Hình 3. 7. Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) trong dịch chiết (T) cây Dừa cạn (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff 41
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng bƣớc sĩng 254 nm, sắc ký đồ của dịch chiết từ cây Dừa cạn (T) cho vết tƣơng đƣơng với vết trên sắc ký đồ của vinblastin (C). Đồng thời, khi phun thuốc thử Dragendorff, trên sắc ký đồ của 2 dung dịch cho 2 vết màu cam cĩ cùng Rf. Nhận xét chung: Từ kết quả thực nghiệm ở các mục 3.2.2.1, 3.2.2.2 thu đƣợc: + Khi thực hiện phản ứng hĩa học, dịch chiết Dừa cạn cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử chung alkaloid, chứng tỏ đƣợc rằng Dừa cạn cĩ chứa các hợp chất alkaloid. + Khi tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu là vinblastin (đã xác định đƣợc trong mục 3.2.1) thì chứng minh đƣợc rằng trong mẫu dịch chiết Dừa cạn cĩ chứa vinblastin, một vinca alkaloid cĩ trong cây Dừa cạn. Vậy mẫu dƣợc liệu đã thu mua ở trên là mẫu cây Dừa cạn. 42
3.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn Bột dƣợc liệu (50 g) - Ngâm lạnh với dung mơi 1 - Rút dịch chiết, cơ bớt dung mơi để đƣợc cao lỏng - Lọc Dịch lọc - Lắc phân bố với dung mơi 2 (10 ml x 3 lần) Dịch dung mơi (A) Dịch nƣớc cịn lại - Acid hĩa bằng HCl 2% đến pH = 1-2 - Cơ thu hồi dung mơi - Kiềm hĩa bằng NH3 đđ đến pH = 10 Cắn khơ (m1) - Chiết bằng dung mơi hữu cơ 3 Dịch dung mơi (B) Triển khai SKLM Định tính alkaloid bằng - Cơ thu hồi dung mơi thuốc thử chung và SKLM - Sấy đến khối lƣợng khơng đổi Cao khơ (m2) Hình 3. 8. Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết 3.2.3.1. Khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1) Thực hiện chiết bột Dừa cạn với ethanol 50%, 80% và 96% theo quy trình chiết xuất hình 3.8. Sử dụng dung mơi khảo sát ở bƣớc 2 là Toluen và bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá bằng cách xác định khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của các dịch chiết (dịch B) cũng nhƣ các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quy trình chiết xuất. Thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.4: 43
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1) Stt Dung mơi chiết Khối lƣợng cao alkaloid 1 Ethanol 50 % tồn0,4976 phần (g) 2 Ethanol 80 % 0,5013 3 Ethanol 96 % 0,4797 (a) (b) (c) (d) Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích: (C) Vinblastine đối chứng (50) Cao chiết với ethanol 50 % (80) Cao chiết với ethanol 80 % (96) Cao chiết với ethanol 96 % 44
Nhận xét: Hiệu suất chiết cao alkaloid trong trƣờng hợp chiết bằng ethanol 50 % và 80 % là gần bằng nhau, trên sắc ký đồ dịch chiết từ ethanol 50 % cũng cĩ các vết tƣơng đƣơng với các vết của dịch chiết từ ethanol 80 %. Trong khi đĩ, cao alkaloid thu đƣợc khi chiết bằng ethanol 96 % ít hơn, đồng thời cũng cĩ ít vết trên sắc ký đồ hơn so với 2 dịch chiết trên. Vậy ethanol 50 % hoặc 80 % sẽ thích hợp để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn hơn ethanol 96%. Tuy nhiên, trong quá trình chiết, sau khi cơ loại bỏ dung mơi ở bƣớc 1, khi lọc cao lỏng, phần cao lỏng ethanol 50% khĩ lọc hơn phần cao lỏng ethanol 80% vì cĩ nhiều tủa li ti gây tắc lọc, do đĩ gây khĩ khăn cho quá trình chiết xuất. Vậy chọn ethanol 80% làm dung mơi chiết ở bƣớc 1. 3.2.3.2. Khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bƣớc 2 (theo hình 2.1) Thực hiện chiết bột Dừa cạn, sau đĩ khảo sát khả năng loại chlorophyll của 4 dung mơi khác nhau. Sử dụng dung mơi bƣớc 1 là dung mơi đã khảo sát đƣợc ở mục 3.2.3.1, dung mơi ở bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá các dung mơi này dựa trên: Cao alkaloid tồn phần, sắc ký đồ của dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A), định tính alkaloid trong dịch A, sắc ký đồ của dịch alkaloid tồn phần (dịch B). 45
Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bƣớc 2 Dung mơi loại Khố lƣợng alkaloid Định tính alkaloid Stt chlorophyll tồn phần (g) cĩ trong dịch A 1 Hexan 0,5081 (-) 2 Toluen 0,5067 (+) 3 Ethyl acetat 0,5013 (+) 4 Dicloromethan 0,4831 (++) Chú thích: (-) Dung dịch trong suốt (+) Dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút (a) (b) (c) (d) Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A) (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích: (H): Dịch hexan (T): Dịch toluen (E): Dịch ethyl acetat (D): Dịch dichloromethan 46
(a) (b) (c) (d) Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid tồn phần (dịch B) (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích: (H): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng hexan (T): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng toluen (E): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng ethyl acetat (D): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng dichloromethan Nhận xét : Khi xét cao alkaloid tồn phần thu đƣợc, các trƣờng hợp đƣợc loại chlorophyll bằng dung mơi hexan và toluen cho lƣợng alkaloid nhiều hơn so với 2 trƣờng hợp cịn lại. Tuy nhiên, khi định tính alkaloid trong phần dịch A, ta thấy chỉ cĩ dịch chiết hexan khơng cho kết tủa với thuốc thử chung alkaloid, cịn 3 dịch cịn lại đều cho kết tủa với thuốc thử chung. Đồng thời trên sắc ký đồ của dịch A, sau khi nhúng thuốc thử Dragendorff, các bản khác đều xuất hiện các vết cho màu cam với thuốc thử, chỉ cĩ dịch hexan là khơng, chứng tỏ trong các dịch toluen, ethyl acetat và dicloromethan cĩ chứa alkaloid. Cĩ nghĩa là alkaloid cĩ thể hịa tan trong các dung mơi này, gây thất thốt lƣợng alkaloid tồn phần. Vậy chọn hexan là dung mơi để loại chlorophyll ở bƣớc 2. 47
3.2.3.3. Khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 (theo hình 2.1) Thực hiện khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 với 3 dung mơi khác nhau là Chloroform, Ethyl acetat và Dicloromethan. Dung mơi sử dụng ở bƣớc 1 và 2 là các dung mơi khảo sát đƣợc ở 2 mục 3.2.3.1 và 3.2.3.2. Đánh giá kết quả khảo sát dựa trên khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của dịch alkaloid (dịch B) và các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất. Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 Stt Dung mơi chiết tách alkaloid base Khố lƣợng alkaloid tồn phần (g) 1 Dichloromethan 0,4895 2 Chloroform 0,4952 3 Ethyl acetat 0,4737 N (a) (b) (c) (d) Hình 3. 12. Sắc ký đồ so sánh dung mơi chiết tách alkaloid base tồn phần (dịch B) (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích: (D): Dịch dicloromethan (C): Dịch chloroform (E): Dịch ethyl acetat 48
Nhận xét: Lƣợng cao alkaloid tồn phần chiết với dung mơi chloroform cao hơn khi chiết với dung mơi dicloromethan và ethyl acetat. Ngồi ra, chloroform là dung mơi ít hỗn hịa với ethanol nhất, dễ chiết hơn 2 dung mơi cịn lại. Chọn chloroform làm dung mơi chiết ở bƣớc 3. Nhận xét chung: Theo kết quả của 3 phần 3.2.3.1, 3.2.3.2 và 3.2.3.3, ta chọn đƣợc các dung mơi nhƣ sau: - Dung mơi chiết ban đầu: Ethanol 80% - Dung mơi loại chlorophyll: Hexan - Dung mơi chiết tách alkaloid base từ dịch acid: Chloroform Từ đĩ, ta xây dựng đƣợc quy trình chiết alkaloid đầy đủ nhƣ sau: - Bƣớc 1: Ngâm lạnh 50 g dƣợc liệu với ethanol 80% trong thời gian xác định. Rút dịch chiết và cơ bớt dung mơi đến khi thu đƣợc cao lỏng tồn phần. Lọc. - Bƣớc 2: Dịch lọc đƣợc đem đi lắc phân bố với 30 ml dung mơi hexan để loại bỏ chlorophyll. Sau khi lắc với dung mơi sẽ thu đƣợc 2 phần dịch là dịch dung mơi và dịch nƣớc. - Bƣớc 3: Dịch nƣớc đƣợc acid hĩa với HCl 2% (TT) đến pH 1-2, thử bằng giấy quỳ tím. Sau đĩ, kiềm hĩa bằng dung dịch amoniac (TT) đến khoảng pH 10, thử độ pH bằng giấy quỳ tím. Sau khi đã kiềm hĩa, dung dịch đƣợc lắc với 100 ml dung mơi chiết xuất chloroform. Dịch dung mơi đƣợc thu vào bình định mức 100 ml, thêm chloroform vừa đủ (dịch B). 3.3. Tối ƣu ĩ quy trìn c ết xuất lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn 3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tố ƣu ĩ Dùng phần mềm Modde 5.0 theo mơ hình D-Optional, ta thiết kế đƣợc 13 thí nghiệm chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đĩ thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm tại mức độ cơ bản của các yếu tố. 49
Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hĩa đã xây dựng đƣợc Tỷ lệ giữa dung Khố lƣợng cao Thời gian Stt mơ / dƣợc liệu pH kiềm hĩa alkaloid tồn phần ngâm (giờ) (ml/g) (g) (ml/g) 1 5:1 18 8 0,5921 2 15:1 18 8 0,3851 3 5:1 30 8 0,5307 4 15:1 30 8 0,4801 5 5:1 18 10 0,5184 6 15:1 18 10 0,3332 7 5:1 30 10 0,4932 8 15:1 30 10 0,4831 9 5:1 18 9 0,5387 10 5:1 24 8 0,5079 11 5:1 24 10 0,5184 12 10:1 18 10 0,4451 13 10:1 24 9 0,4580 14 10:1 24 9 0,4496 15 10:1 24 9 0,4328 16 10:1 24 9 0,4515 50
3.3.2. Kết quả tố ƣu ĩ Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng, sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ sau: (a) (b) (c) (d) Hình 3. 13. Sắc ký đồ của các dung dịch trong thí nghiệm (a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣ ới ánh sáng UV 254 nm (c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff 51
Từ các số liệu thực nghiệm, sử dụng phần mềm Modde 5.0, thu đƣợc các thơng số tối ƣu hĩa nhƣ bảng 3.8: Bảng 3. 8. Kết quả các thơng số đánh giá mơ hình thiết kế tối ƣu hĩa Stt Thơng số Kết quả 1 Lack of fit (giá trị p) 0,157 2 R2 0,972 3 R2 điều chỉnh 0,930 4 Q2 0,767 5 p của mơ hình > F 0,005) thì mới cĩ thể bỏ qua sai số trong hệ thống phần mềm (vì sai số khơng đáng kể). Dựa theo bảng 3.8, hệ số lack- of-fit của mơ hình thiết kế là 0,157, lớn hơn 0,005, vì vậy, ta cĩ thể cho rằng sai số trong hệ thống phần mềm là khơng đáng kể, cĩ thẻ bỏ qua các sai số này. Nhận thấy, R2 = 0,972 (R2 < 0,995), điều đĩ cho thấy sự tƣơng quan của tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu, thời gian ngâm và pH kiềm hĩa gần nhƣ cĩ ý nghĩa với độ tin cậy 95% (p < 0,05). 52
Hình 3. 14. Kết quả thể hiện mức ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hĩa Theo nhƣ kết quả thể hiện mức độ ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hĩa, ta nhận thấy các yếu tố tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu (X1), thời gian ngâm (X2) và pH kiềm hĩa (X3) đều cĩ ảnh hƣởng đến khối lƣợng alkaloid tồn phần thu đƣợc. Trong đĩ, tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu cĩ ảnh hƣởng lớn nhất, pH kiềm hĩa cĩ ảnh hƣởng ít nhất. Ngồi ra, tƣơng tác giữa tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm cũng cĩ ảnh hƣởng đến khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc. Hình 3. 15. Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng 53
Từ đĩ, ta xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng cong của mơ hình: Y=0,4484 0,0558X1 0,0181X2 0,0135X3 0,0429X1X2 Trong đĩ: - Y là khối lƣợng alkaloid tồn phần thu đƣợc. - X1 là tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu. - X2 là thời gian ngâm lạnh. - X3 là pH dùng để kiềm hĩa. Đƣờng cong cho thấy mối quan hệ giữa các biến độc lập và biến phụ thuộc là đáng tin cậy 95% và hệ sơ tƣơng quan R2 = 0,972. 3.3.3. P ân tíc tƣơng tác ản ƣởng giữa các yếu tố Hình 3. 16. Đƣờng cong thể hiện tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát 54
3.3.3.1. Ản ƣởng của tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu lên khố lƣợng alkaloid tồn phần Theo nhƣ đƣờng cong, ta thấy tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu càng tăng thì khối lƣợng alkaloid tồn phần càng giảm. Điều này cho thấy rằng alkaloid cĩ thể hịa tan trong dung mơi với một tỉ lệ nhất định. Khi quá nhiều dung mơi, alkaloid cĩ thể khơng tăng hoặc giảm. Đây cĩ thể là do các yếu tố bên ngồi tác dụng vào, hoặc do sự khơng bền vững của một vài alkaloid trong mơi trƣờng chiết. 3.3.3.2. Tƣơng tác g ữa tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm Theo sơ đồ, ta thấy ở những pH khác nhau, tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm cĩ sự tƣơng tác với nhau. Khi tăng thời gian ngâm, khối lƣợng alkaloid tồn phần tăng lên đến một giới hạn rồi giảm dần. Điều này cĩ thể là do tƣơng tác của tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu lên thời gian ngâm. 3.3.3.3. Ản ƣởng của yếu tố pH kiềm hĩa pH là yếu tố ít cĩ ảnh hƣởng nhất lên khối lƣợng alkaloid tồn phần tạo thành. Thêm vào đĩ, pH cũng ít cĩ ảnh hƣởng lên hai biến số cịn lại là tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu và thời gian ngâm. Tuy nhiên, cĩ thể nhận thấy, khi tăng pH, khối lƣợng alkaloid sẽ giảm dần đến một giới hạn rồi khơng giảm nữa. Điều này cĩ thể giải thích là do khi tăng pH lên cao, việc tạo thành tủa trong dung dịch gây mất mát một phần alkaloid. 55
3.3.4. Kết quả dự đốn Hình 3. 17. Đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đốn và kết quả thực tế Kết quả dự đốn và kết quả thực tế đều nằm trong vùng cho phép với R2 = 0,877 Dựa vào phần mềm tối ƣu hĩa Modde 5.0, thu đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn nhƣ sau: Bảng 3. 9. Điều kiện tối ƣu hĩa dự đốn Khố lƣợng alkaloid tồn phần Stt Yếu tố Giá trị dự đốn (g) 1 Tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu (ml/g) 5:1 2 Thời gian ngâm (giờ) 18 0,5841 3 pH kiềm hĩa 8 Thực hiện lại 3 lần thử nghiệm với điều kiện tối ƣu hĩa đã dự đốn đƣợc, đánh giá điều kiện tối ƣu hĩa đã dự đốn. 56
Bảng 3. 10. Kết quả thực hiện 3 lần điều kiện tối ƣu Stt Số lần Khố lƣợng alkaloid tồn phần t u đƣợc (g) 1 Lần 1 0,6021 2 Lần 2 0,5794 3 Lần 3 0,5869 Nhận xét: Thực nghiệm cho kết quả p = 0,029 < 0,050 với khoảng tin cậy là 95%, vậy kết quả cĩ ý nghĩa thống kê. 3.4. Bàn luận Trong việc thực hiện đề tài,chúng tơi đã gặp một vài khĩ khăn nhƣ sau: Vì là dƣợc liệu lấy tồn thân nên hàm lƣợng alkaloid ở từng bộ phận của cây là khác nhau. Vậy nên, mặc dù đã kiểu sốt sơ bộ về kích thƣớc dƣợc liệu nhƣng lƣợng alkaloid tồn phần của từng thực nghiệm vẫn cĩ thể bị ảnh hƣởng bởi sự khơng đồng nhất bột dƣợc liệu. Việc sử dụng phƣơng pháp định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp cân và định tính sơ bộ qua sắc ký lớp mỏng vẫn cịn nhiều hạn chế và sai lệch trong quá trình thực hiện, định lƣợng bằng phƣơng pháp cân rất dễ sai số và cĩ mức độ đáng tin cậy chƣa cao. Việc sử dụng các acid và base khác nhau để chuyển dạng alkaloid cũng phần nào ảnh hƣởng đến khối lƣợng alkaloid tồn phần tạo thành. Tuy nhiên vì thời gian khơng cho phép nên vẫn chƣa thể thực hiện khảo sát sự ảnh hƣởng của các acid và base này lên khối lƣợng alkaloid tồn phần tạo thành. Phƣơng pháp chiết ngâm lạnh và lắc phân bố cĩ hiệu suất khơng đƣợc cao so với các phƣơng pháp khác, tuy nhiên lại dễ thực hiện với số lƣợng mẫu lớn. Việc lắc phân bố cĩ thể gặp nhiều sai số trong quá trình lắc nên khi lắc phải cẩn thận. 57
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau 2 tháng thực hiện, đề tài đã hồn thành các mục tiêu đƣa ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau: - Xác định đƣợc vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hĩa học, sắc ký lớp mỏng, khối phổ MS và sử dụng vinblastin này làm chất đối chiếu trong định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu. Đồng thời cũng khảo sát đƣợc cực đại hấp thụ của vinblastin và xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin bằng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis. - Định tính sơ bộ dƣợc liệu Dừa cạn: + Soi bột và tìm thấy các cấu tử chính của bột Dừa cạn. + Định tính các alkaloid trong bột Dừa cạn bằng phƣơng pháp hĩa học và sắc ký lớp mỏng. - Khảo sát các dung mơi và xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn. Kết quả đã chọn đƣợc các dung mơi: + Dung mơi chiết ban đầu: Ethanol 80 %. + Dung mơi loại chlorophyll: Hexan. + Dung mơi chiết tách alkaloid base từ dịch acid: Chloroform. - Tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde 5.0, nhận thấy các yếu tố: tỷ lệ dƣợc liệu/ dung mơi, thời gian ngâm và pH kiềm hĩa đều cĩ ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn. Và đã chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn là: + Tỷ lệ dung mơi/ dƣợc liệu (tt/kl): 5:1 + Thời gian ngâm lạnh: 18 giờ + pH kiềm hĩa: 8 58
4.2. Kiến nghị Vì thời gian thực hiện cĩ hạn, nếu tiếp tục, chúng tơi sẽ dựa trên những kết quả đã đạt đƣợc từ nghiên cứu này để: Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) bằng các phƣơng pháp: chuẩn độ acid-base trong mơi trƣờng khan, quang phổ UV-Vis, HPLC. Dùng quy trình chiết alkaloid đã tối ƣu hĩa để chiết alkaloid tồn phần, sau đĩ phân lập và tinh chế các alkaloid cĩ giá trị trong y học nhƣ vinblastin, vincristin và ajmacilin. Ứng dụng quy trình chiết alkaloid từ cây Dừa cạn ở nhiều nguồn thu hái khác nhau và đánh giá hàm lƣợng alkaloid tồn phần (định hƣớng vinblastin) cĩ trong dƣợc liệu ở các nguồn này. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 974- 975, 1144-1146. 2. Bộ Y tế (2017), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1467-1468. 3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đồn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Tồn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 689-694. 4. Võ Văn Chi (2000), Cây thuốc trị bệnh thơng dụng, Nhà xuất bản Thanh Hĩa, Thanh Hĩa, tr. 115-116. 5. Phạm Thanh Kỳ (2015), Dược liệu học tập II, Bộ Y Tế, Hà Nội, tr. 9-174. 6. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 307-309. 7. Trần Văn Thanh (2002), Nghiên cứu chiết xuất ajmacilin từ rễ Dừa cạn (Catharanthus roseus G. Don) và bào chế viên nén ajmacilin, Luận án tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 8. A JMP, Marcel Proust (2012), "Modeling and multivariate methods", JMP Inc., Cary, pp. 1-9. 9. Naznin Ara, Mamunur Rashid, MS Shah Amran (2009), "Comparison of hypotensive and hypolipidemic effects of Catharanthus roseus leaves extract with Atenolol on Adrenaline induced hypertensive rats ", Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 22, pp. 267-271. 10. Rajesh Arora (1998), Biotechnological Studies in Catharanthus roseus L (G) Don vis-à-vis Secondary Metabolite Production, PhD, Lucknow and Chaudhary Charan Singh.
11. Rajesh Arora, Poonam Malhotra, Ajay K Mathur, Archna Mathur, Cm Govil, Ps Ahuja (2009), "Anticancer Alkaloids of Catharanthus roseus: Transition from Traditional to Modern Medicine", Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive and Therapeutic Perspective, pp. 293-310. 12. S. Balaabirami, S.Patharajan (2012), "Invitro antimicrobial and antifungal activity of Catharanthus roseus leaves extract against important pathogenic organisms", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4, pp. 487-490. 13. Bonadonna, Gianni, Zucali, Roberto, Monfardini, Silvio, de Lena, Mario, Uslenghi, Carlo (1975), "Combination chemotherapy of Hodgkin's disease with adriamycin, bleomycin, vinblastine, and imidazole carboxamide versus MOPP", Cancer, 36(1), pp. 252-259. 14. Lawrence H Einhorn, John Donohue., (1977), "Cis-diamminedichloroplatinum, vinblastine, and bleomycin combination chemotherapy in disseminated testicular cancer", Annals of internal medicine, 87(3), pp. 293-298. 15. PA Ellis, IE Smith, JR Hardy, MC Nicolson, DC Talbot, SE Ashley, K Priest (1995), "Symptom relief with MVP (mitomycin C, vinblastine and cisplatin) chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer", British journal of cancer, 71(2), pp. 366. 16. Kyakulaga A. Hassan, Alinda T. Brenda, Vudriko Patrick, Ogwang E. Patrick (2011), "In vivo antidiarrheal activity of the ethanolic leaf extract of Catharanthus roseus Linn. (Apocyanaceae) in Wistar rats", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(15), pp. 1797-1800. 17. M. A. Islam, M. Afia Akhtar, M. R. I. Khan, M. S. Hossain, M. K. Alam, M. I. I. Wahed, B. M. Rahman, A. S. M. Anisuzzaman, S. M. Shaheen, Maruf Ahmed (2009), "Antidiabetic and Hypolipidemic Effects of Different Fractions of Catharanthus Roseus (Linn.) on Normal and Streptozotocin-induced Diabetic Rats", JOURNAL OF SCIENTIFIC RESEARCH, 2, pp. 334-344
18. Kratika Kumari, Sharmita Gupta (2011), "Antifungal properties of leaf extract of Catharanthus roseus (G.) Don", American Journal of Phytomedicine and Clinical Therapeutics. 19. Alvaro Lassaletta, Katrin Scheinemann, Shayna M. Zelcer, Juliette Hukin, Beverley A. Wilson, Nada Jabado, Anne Sophie Carret, Lucie Lafay-Cousin, Valerie Larouche, Cynthia E. Hawkins, Gregory Russell Pond, Ken Poskitt, Daniel Keene, Donna L. Johnston, David D. Eisenstat, Rahul Krishnatry, Matthew Mistry, Anthony Arnoldo, Vijay Ramaswamy, Annie Huang, Ute Bartels, Uri Tabori, Eric Bouffet (2016), "Phase II Weekly Vinblastine for Chemotherapy-Nạve Children With Progressive Low-Grade Glioma: A Canadian Pediatric Brain Tumor Consortium Study", Journal of Clinical Oncology, 34(29), pp. 3537-3543. 20. Giuseppe Musumarra, Salvatore Scire (2001), "MODDE, Version 5.0, available from UMETRICS AB", Journal of Chemometrics, pp. 199-200. 21. B.S. Nayak, M. Anderson, L.M. Pinto Pereira (2007), "Evaluation of wound- healing potential of Catharanthus roseus leaf extract in rats", Fitoterapia 78, pp. 540–544. 22. R.L. Noble, C.T. Beer, J.H. Cutts (1958), "Role of chance observations in chemotherapy: Vinca rosea", Annals of the New York Academy of Sciences, 76(3), pp. 882–894. 23. Al Rashid (1970), "Successful treatment of an infant with Letterer-Siwe disease with Vinblastine sulfate", Clinical Pediatrics 9(8), pp. 494–496. 24. N.Irving Sax (1984), Dangerous Properties of Industrial Materials, Van Nostrand Reinhold Company, New York. 25. Magdi El-Sayed, Young H. Choi, M. Frédérich, Sittiruk Roytrakul1, Rob Verpoorte (2004), "Alkaloid accumulation in Catharanthus roseus cell suspension cultures fed with stemmadenine", Biotechnology Letters 26, pp. 793– 798.
26. CN Sternberg, A Yagoda , HI Scher, RC Watson, N Geller, HW Herr, MJ Morse, PC Sogani, ED Vaughan, N Bander (1989), "Methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin for advanced transitional cell carcinoma of the urothelium. Efficacy and patterns of response and relapse", Cancer, 64(12), pp. 2448-2458. 27. A Tazi, G Lorillon, J Haroche, A Neel, S Dominique, A Aouba, J.D Bouaziz, C de Margerie-Melon, E BugnE , V Cottin, T Comont, C Lavigne, J.E Kahn, J Donadieu, S Chevret (2017), "Vinblastine chemotherapy in adult patients with langerhans cell histiocytosis: a multicenter retrospective study", Orphanet J Rare Dis, 12(1), pp. 95. 28. Robert Verpoorte, A. Contin, J. Memelink (2002), "Biotechnology for the production of plant secondary metabolites", Phytochemistry Reviews, 1(1), pp. 13-25. 29. Widowati, Wahyu, Mozef, Tjandrawati, Risdian, Chandra, Yellianty, Yellianty (2013), "Anticancer and free radical scavenging potency of Catharanthus roseus, Dendrophthoe petandra, Piper betle and Curcuma mangga extracts in breast cancer cell lines", Oxidants and Antioxidants in Medical Science, 2(2), pp. 137- 142. 30. "Classification for Kingdom Plantae Down to Species Catharanthus roseus (L.) G. Don", O14, .
ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA DƢỢC TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHĨA LUẬN THEO Ý KIẾN ĐĨNG GĨP CỦA HỘI ĐỒNG Tên đề tài khĩa luận: Tối ƣu hĩa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace). Họ và tên sinh viên: DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH Giảng viên hƣớng dẫn: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc Khĩa luận đã đƣợc bổ sung, sửa chữa các nội dung sau: 1. Bổ sung chi tiết thiếu trong Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt. 2. Bổ sung tài liệu tham khảo các mục 1.2.1, 1.2.2 và 1.2.3 và phần chọn các yếu tố độc lập ở mục 2.2.3. 3. Bổ sung R2 của đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đốn và kết quả thực tế . 4. Chia các tài liệu tham khảo ra thành các mục Tiếng Việt, Tiếng Anh và Web. 5. Chỉnh sửa các giá trị của yếu tố “Tỷ lệ dung mơi/dƣợc liệu”. Giảng v ên ƣớng dẫn Sinh viên thực hiện Chủ tịch Hộ đồng Giáo viên phản biện