Đề tài Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng viêm phổi không điển hình do vi khuẩn ở trẻ em

170 trang yendo 4520

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng viêm phổi không điển hình do vi khuẩn ở trẻ em", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

de_tai_nghien_cuu_mot_so_dac_diem_dich_te_hoc_lam_sang_viem.pdf

Nội dung text: Đề tài Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng viêm phổi không điển hình do vi khuẩn ở trẻ em

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi là nguyên nhân mắc và tử vong hàng đầu ở trẻ em dưới 5 tuổi. Theo báo cáo của Qũy Nhi đồng Liên hiệp quốc (UNICEF) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 2 triệu trẻ em tử vong vì viêm phổi mỗi năm trên tồn thế giới [19]. Tử vong do viêm phổi chiếm 19% trong tổng số trẻ tử vong dưới 5 tuổi ở các nước phát triển [186]. Căn nguyên của viêm phổi trẻ em thường do vi rút, vi khuẩn và các sinh vật khác [189]. Trong đĩ, tác nhân gây viêm phổi khơng điển hình chiếm một vai trị quan trọng [38], [54], [209]. Tuy nhiên, ở các nước đang phát triển trong đĩ cĩ Việt Nam cịn chưa được nghiên cứu nhiều [15],[16]. Theo Forest và cs, tỷ lệ mắc viêm phổi khơng điển hình trong số viêm phổi mắc phải cộng đồng ở châu Mỹ khoảng 22% và tỷ lệ được điều trị là 91%. Châu Âu tỷ lệ mắc là 28%, tỷ lệ được điều trị là 74%. Ở châu Mỹ La tinh, tỷ lệ mắc là 21% và tỷ lệ được điều trị là 57%. Tại châu Á/ Phi, tỷ lệ mắc là 20%, tỷ lệ được điều trị là 10% [74]. Viêm phổi điển hình do Streptococus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Moracella catarhalis nhạy cảm với một số dịng kháng sinh cefalosporin, β lactam trong khi viêm phổi khơng điển hình do Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) và Legionella pneumophila(L. pneumophila) chủ yếu nhạy cảm với dịng kháng sinh nhĩm macrolide, quinolone và tetracycline [65], [93] [203]. Chẩn đốn nguyên nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình khĩ khăn do phải nuơi cấy trong mơi trường đặc biệt, phương pháp huyết thanh học thì cho kết quả muộn (sau 10-14 ngày), tỷ lệ dương tính thấp [56], [167]. Sự phát triển vượt bậc của kỹ thuật khuyếch đại gen (PCR) đã giúp chẩn đốn chính xác, nhanh chĩng nguyên nhân vi khuẩn gây bệnh [40], [45], [64]. Tại Việt Nam, kỹ thuật chẩn đốn PCR chỉ làm được ở một số bệnh viện tuyến trung ương và các trung tâm y tế lớn. Viêm phổi khơng điển hình đa số phải điều
2 trị theo kinh nghiệm. Điều này làm gia tăng chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kéo dài thời gian điều trị [7], [106]. Viêm phổi khơng điển hình do M. pneumoniae, C. pneumoniae cĩ thể lâm sàng nhẹ hoặc tự giới hạn [106], [161]. Viêm phổi do L. pneumophila hay gây viêm phổi nặng, tỷ lệ tử vong cao [141]. Viêm phổi khơng điển hình nặng được mơ tả trong các trường hợp: suy đa tạng [57], [116], cĩ biểu hiện ngồi phổi như: tổn thương hệ thần kinh [38], huyết học [100], tổn thương tim, tổn thương da, rối loạn điện giải; Mắc bệnh mạn tính, suy giảm miễn dịch [67]; Đồng nhiễm với vi khuẩn khác hoặc vi rút [90], [120]. Ở Việt Nam, viêm phổi khơng điển hình ở trẻ em cĩ xu hướng tăng lên, nhất là do M. pneumoniae [9], [15], [16]. Viêm phổi do C. pneumoniae và L. pneumophila chưa được quan tâm nghiên cứu. Tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học, biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của viêm phổi khơng điển hình ở trẻ em nhập viện vì viêm phổi, áp dụng kỹ thuật chẩn đốn nguyên nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình bằng phương pháp sinh học phân tử PCR đa mồi (Multiplex-PCR) cĩ kiểm chứng bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) là nghiên cứu cĩ tính cấp thiết và vấn đề nghiên cứu cĩ tính phổ biến. Chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng viêm phổi khơng điển hình do vi khuẩn ở trẻ em” nhằm hai mục tiêu nghiên cứu sau đây: 1. Mơ tả một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của viêm phổi khơng điển hình do Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila ở trẻ em điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 07/ 2010 đến 3/2012. 2. Xác định một số yếu tố liên quan đến tình trạng nặng của bệnh viêm phổi khơng điển hình do vi khuẩn ở trẻ em.
3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Một số khái niệm  Viêm phổi khơng điển hình Viêm phổi do M. pneumoniae đã được cơng nhận từ nhiều năm trước khi nhận dạng bản chất của tác nhân gây bệnh. Sự thất bại trong việc sử dụng sulfonamides hoặc penicillin để điều trị viêm phổi đã phân biệt được tác nhân gây viêm phổi do M. pneumoniae hay viêm phổi điển hình do phế cầu (pneumococci). Việc khơng đáp ứng với trị liệu kháng khuẩn đã được nghĩ là “khơng điển hình” (atypical). Thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi để nĩi tới bệnh viêm đường hơ hấp do M. pneumoniae đối với con người [212]. Sau đĩ, các tác nhân khác gây bệnh cảnh lâm sàng tương tự đã được đưa vào nhĩm viêm phổi khơng điển hình như C. pneumoniae, L. pneumophila [11].  Đồng nhiễm Thơng thường một bệnh nhiễm trùng chỉ do một mầm bệnh gây ra. Khi đồng thời cùng một lúc cĩ hai hay nhiều mầm bệnh cùng phối hợp tác động gây bệnh. Khi đĩ gọi là nhiễm trùng hỗn hợp hay đồng nhiễm [8].  Bội nhiễm Trong khi bệnh đang tiến triển, chưa khỏi lại cĩ mầm bệnh khác nhờ điều kiện thuận lợi đĩ mà xâm nhập cùng gây bệnh thì gọi là nhiễm trùng thứ phát hay bội nhiễm [8].  Viêm phổi khơng điển hình đơn thuần Bệnh nhân mắc viêm phổi chỉ do một tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình gây nên.  Viêm phổi khơng điển hình đồng nhiễm trong nhĩm Bệnh nhân mắc viêm phổi do từ hai tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình gây nên.  Viêm phổi khơng điển hình đồng nhiễm ngồi nhĩm Tình trạng trẻ mắc viêm phổi do hai hay nhiều tác nhân vi sinh gây nên, trong đĩ một tác nhân là do ít nhất một trong ba vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình gây nên.
4 1.2. Lịch sử nghiên cứu viêm phổi khơng điển hình do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila. 1.2.1. Viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae Vi khuẩn Mycoplasma đầu tiên được phân lập từ mơi trường nuơi cấy bệnh phẩm viêm phổi ở bị cĩ tên Mycoplasma mycoides do Nocad và Roux cơng bố năm 1898 [160]. Năm 1930, Klieneberger mơ tả Mycoplasma là vi khuẩn dạng L, khơng cĩ thành tế bào, sống cộng sinh với các vi khuẩn cĩ thành tế bào khác [122]. Dienes và Edsall lần đầu tiên đã phân lập được Mycoplasma từ một ổ áp xe hạch ở người vào năm 1937 [61]. Năm 1938, Reimann mơ tả ca bệnh nhiễm Mycoplasma ở người, với thuật ngữ viêm phổi khơng điển hình tiên phát [180]. Năm 1941, Eaton đã thành cơng trong việc gây viêm phổi ở chuột bởi các mẫu đờm lấy từ bệnh nhân bị viêm phổi khơng điển hình tiên phát [66]. Vi sinh vật này được đặt tên là tác nhân Eaton, lúc đầu được cho là virut cho đến khi Liu (1957) phát hiện các kháng sinh cĩ thể tác động lên nĩ [132]. Năm 1961, Marmion và Goodburn cơng nhận tác nhân Eaton là PPLO và nĩ khơng phải là vi rút [140]. Đến năm 1963, Chanock và cộng sự đã thành cơng trong việc nuơi cấy tác nhân Eaton trong mơi trường khơng cĩ tế bào và gọi nĩ là M. pneumoniae [48]. Trong các lồi Mycoplasma gây bệnh ở người, M. pneumoniae được nghiên cứu nhiều nhất. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về sinh học tế bào, đáp ứng miễn dịch, các kỹ thuật phát hiện M. pneumoniae trong phịng thí nghiệm, dịch tễ học và vai trị gây bệnh đường hơ hấp của M. pneumoniae [212]. 1.2.2. Viêm phổi do Chlamydia pneumoniae Năm 1965 Woolridge lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn tại ổ viêm kết mạc ở trẻ nhỏ tại Đài Loan và được đặt tên là TW 183 [227]. Đến năm 1983 Grayston lần đầu tiên phân lập được Chlamydia từ bệnh phẩm đường hơ hấp với tên gọi AP-39 [88]. Sau đĩ được đổi tên là TWAR và được sử dụng trong các phịng xét nghiệm. Grayston cho rằng bệnh đã lưu hành trong dân cư từ nhiều thập kỷ trước [87]. Hiện nay, tên C. pneumoniae vẫn được sử dụng trong đa số các ấn phẩm khoa học [161].
5 1.2.3. Viêm phổi do Legionella pneumophila Năm 1943 lần đầu tiên vi khuẩn L. pneumophila được phân lập bởi Tatlok [201]. MacDade và cs (1977) đã sử dụng phương pháp cơ lập rickettsia để phát hiện Legionella [146]. Năm 1979 các chi của Legionella được Fraser phân lập từ ổ dịch xảy ra ở Phyladelphya – Mỹ [78]. Dondero [62], Glick [83] nhận ra mơi trường truyền bệnh qua nguồn khơng khí ơ nhiễm, tháp làm mát, hệ thống nước. Katz (1987) phát hiện mơi trường thích hợp cho sự nhân lên của Legioella là 25- 420c, tối ưu là 350c [117]. Năm 1996 Fields đã cơng bố Legionella là vi khuẩn ký sinh nội bào trong nguyên sinh động vật nước ngọt cũng như động vật cĩ vú [71]. Benson (1998) phân chia Legionella thành các lồi và các typ huyết thanh [36]. 1.3. Đặc điểm dịch tễ học viêm phổi khơng điển hình do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila 1.3.1. Đặc điểm dịch tễ học viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae  Tác nhân vi sinh Mycoplasma pneumoniae . Vị trí và phân loại Mycoplasma pneumoniae Vào những năm 1960, Mycoplasma được xếp vào nhĩm Mollicutes [212]. Phân loại hiện nay trong lớp Mollicutes bao gồm 4 dưới lớp, 5 họ, 8 bộ và khoảng 200 lồi đã được biết đến và được phát hiện ở người, động vật cĩ xương sống, động vật chân đốt và thực vật. M. pneumoniae là một thành viên trong họ Mycoplasmataceae và dưới lớp Mycoplasmatales [21]. . Hình thái học và cấu trúc của Mycoplasma pneumoniae Cấu trúc tế bào Mycoplasma pneumoniae M pneumoniae là loại vi sinh vật rất nhỏ cĩ cấu trúc 300-500 nm. Các vi khuẩn này thiếu thành tế bào do vậy chúng cĩ nhiều hình và mềm dẻo. Khuẩn lạc điển hình của M. pneumoniae khi nuơi cấy trong mơi trường được làm giàu như thạch SP4 hiếm khi vượt quá 100µm và phải sử dụng kính hiển vi đa lập thể mới quan sát được đặc điểm hình thái của chúng [21], [212].
6 Hình 1.1: Nhĩm khuẩn lạc Mycoplasma pneumoniae hình cầu phát triển trên mơi trường thạch SP4 [212]. Cấu trúc phân tử Mycoplasma pneumoniae Bộ gen của M. pneumoniae đã được Himmelreich giải trình tự vào năm 1996, bao gồm 816.394bp với 687 gen [103]. Cấu trúc gen học của M. pneumoniae gồm khoảng 800-850 cặp KB, chứa một gen RNA, cấu trúc RNA được sắp xếp theo thứ tự 5’-16S -23S - 5S - 3. Trong nhân cĩ hai loại protein rất quan trọng gây ra đáp ứng miễn dịch là protein kết dính P1 và protein kết dính gián tiếp lên các tế bào bằng cách nhận diện các glycolypid trên bề mặt hoặc các sialoglycosaccharide alpha 2-3 nằm trên các glycoprotein [145]. Cấu trúc cơ quan bám dính Mycoplasma pneumoniae Bám dính vào biểu mơ của cơ quan hơ hấp là một bước quan trọng để M. pneumoniae lây nhiễm và xâm nhập thành cơng. Cơ quan này nằm ở một đầu của vi khuẩn, bao gồm một mạng các protein bám dính và các protein cần thiết khác. Protein bám dính chủ yếu (cytadhesin) tập trung dày đặc trên bề mặt của cơ quan này là protein P1 [193]. Hình 1.2: Cấu trúc cơ quan bám dính của Mycoplams pneumoniae [127]
7  Cơ chế gây bệnh Mycoplasma pneumoniae Cơ chế bệnh sinh của M. pneumoniae cĩ liên quan đến nhiều thành phần, bao gồm quá trình kết dính giữa vi sinh vật và tế bào, sự tiết các chất H2O2 và O, sự hình thành các tự kháng thể [82], [123]. Đại thực bào Kích thích Đáp ứng miễn Ơ xy dịch tối thiểu trên Kích hoạt bề mặt hơ hấp Cytokine Th2 - Type Bạch cầu Chấn thương trực Viêm mạnh trung tính Biểu mơ hơ hấp tiếp – yếu Tường lửa Viêm phổi Cytokine Th2- Type Vận chuyển thụ động trong vịng tuần hồn Hen Chất trung gian hoa học Tế bào B Mạch máu Điều chế miễn dịch Cung cấp cho cơ quan xa Đặc điểm ngồi phổi( sự lấp mạch) Đặc điểm ngồi phổi ( gián tiếp) Gồm các cytokine tại chỗ Đặc điểm ngồi phổi (trực tiếp) Hình 1.3. Sơ đồ sinh bệnh học của viêm phổi, hen suyễn, và các biểu hiện ngồi phổi do nhiễm trùng Mycoplasma [156]. Cĩ 2 đặc tính liên quan đến sinh bệnh học của M. pneumoniae gây bệnh ở người: vi khuẩn cĩ ái lực chọn lọc trên tế bào biểu mơ đường hơ hấp, bám dính vào đầu sợi lơng mao biểu mơ đường hơ hấp, di chuyển nhanh, gây ra bong tế bào biểu mơ đường hơ hấp. Ngồi ra, vi khuẩn sản xuất ra hydrogen peroxid,
8 một chất gây phá hủy tế bào, phá huỷ của màng hồng cầu. Sinh bệnh học của M. pneumoniae cĩ liên quan đến hoạt động của các cytokin [139]. Mycoplasma cĩ yếu tố tự miễn dịch, cĩ thể giải thích cho những biểu hiện ngồi phổi [29], [82]. Nồng độ của các tự kháng thể tương quan thuận với mức độ nặng của bệnh [65]. Phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và việc kích thích sản xuất cytokine càng nhiều, bệnh cảnh lâm sàng và tổn thương phổi càng trầm trọng [115]. Cơ chế sinh bệnh học các biểu hiện ngồi phổi do nhiễm trùng M. pneumoniae được phân thành ba loại: thứ nhất, loại trực tiếp, sản xuất cytokine tại chỗ; thứ hai, loại gián tiếp, điều chế miễn dịch - tự miễn dịch; thứ ba, loại gây tắc mạch máu, viêm mạch, huyết khối hoặc tình trạng tăng đơng hệ thống. Cuối cùng, gây ra các loại biểu hiện trực tiếp ngồi phổi [156].  Nguồn truyền nhiễm Mycoplasma pneumoniae M. pneumoniae cĩ ở khắp nơi trong tự nhiên, gây ra nhiều loại bệnh ở động vật. Ở người, M. pneumoniae khơng thuộc hệ vi khuẩn chí của đường hơ hấp, việc phát hiện vi khuẩn này ở đường hơ hấp cĩ ý nghĩa lâm sàng nếu cĩ kèm theo triệu chứng viêm đường hơ hấp. Vi khuẩn này sống trong họng và dịch tiết hơ hấp nhiều ngày trước khi khởi bệnh và tồn tại nhiều tuần sau đĩ. Ở giai đoạn lui bệnh chúng cịn hiện diện trong dịch tiết hơ hấp 6 – 8 tuần nữa. Nếu bệnh nhân ho thì đây là nguồn lan truyền mầm bệnh ra cộng đồng [115], [212].  Phương thức lây truyền Mycoplasma pneumoniae Nhiễm khuẩn M. pneumoniae lây truyền từ người sang người qua đường hơ hấp từ các dịch tiết đường hơ hấp khi ho, hắt hơi. Trẻ em tuổi đến trường là vật chủ trung gian quan trọng nhất lây lan trong và ngồi gia đình [115], [212].  Giai đoạn ủ bệnh Thời gian ủ bệnh cĩ xu hướng âm ỉ trung bình khoảng 3 tuần [212].  Tính cảm nhiễm và miễn dịch . Tính cảm nhiễm Nhiễm trùng M. pneumoniae xảy ra ở cả người lớn và trẻ em với mức độ bệnh khu trú hoặc bệnh dịch. Tỷ lệ mắc cao gặp ở lứa tuổi học sinh [77], [212].
9 Những trẻ em bị suy giảm hệ thống miễn dịch hay dùng thuốc ức chế miễn dịch cĩ nguy cơ cao bị viêm phổi nặng khi nhiễm M. pneumoniae [34]. . Tính miễn dịch Nhiều phản ứng xảy ra sau khi nhiễm M. pneumoniae. Kháng thể đặc hiệu IgM xuất hiện sớm nhất khoảng 1 tuần sau khi khởi bệnh, tiếp theo là IgA và sau cùng là IgG [212]. Các kháng thể đặc hiệu do các protein kết dính kích thích tạo ra (IgM, IgA) sẽ ức chế sự kết dính giữa M. pneumoniae và các tế bào biểu mơ đường hơ hấp giúp hạn chế các tổn thương xảy ra. IgA trong dịch tiết hơ hấp cĩ tác dụng lớn hơn IgA trong huyết thanh trong việc chống lại nhiễm trùng tái phát do Mycoplasma. Một số biến chứng ngồi phổi xảy ra do nhiễm trùng Mycoplasma cĩ liên quan đến cơ chế miễn dịch, khơng phải trực tiếp do nhiễm khuẩn. Chức năng miễn dịch bị biến đổi gây ra bởi M. pneumoniae cĩ thể tạo điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng với các vi sinh vật khác giải thích lý do đồng nhiễm dẫn đến bệnh nặng [28]. Miễn dịch đối với M. pneumoniae thường tạm thời và tái phát thường xuyên [209]. Miễn dịch kéo dài khoảng bốn năm [70]. Những người cĩ kháng thể sẽ được bảo vệ sau khi bị tái nhiễm M. pneumoniae [212].  Phân bố và sự lưu hành . Phân bố theo tuổi Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, phổ biến nhất ở tuổi đi học 5- 14 tuổi [212]. Hình 1.4. Tỷ lệ viêm phổi do nhiễm Mycoplasma pneumoniae theo tuổi [75]
10 . Phân bố theo mùa Bệnh xảy ra bất cứ thời điểm nào trong năm nhưng cĩ xu hướng bùng phát vào cuối hè và mùa thu. Ở các nước ơn đới bệnh xảy ra vào đầu mùa thu và đỉnh cao vào mùa đơng [167], [212]. Dịch tễ của M. pneumoniae xảy ra cĩ tính chu kỳ từ 4 - 8 năm. Xu hướng thường xuyên hơn ở những quần thể kín như quân đội, nhà tù, trại trẻ. Các dịch bệnh cĩ thể kéo dài 1-2 năm trong các cộng đồng lớn hơn [212]. . Phân bố theo địa lý Dịch bệnh xuất hiện ở tất cả các quốc gia. Dịch tễ học về bệnh chủ yếu được nghiên cứu ở Hoa Kỳ, châu Âu và Nhật Bản [24], [70], [169], [212]. Ở Mỹ, nhiễm trùng do M. pneumoniae chiếm từ 15 - 20% các trường hợp viêm phổi mắc phải ở cộng đồng. Đặc biệt vào mùa hè cĩ thể gây 50% trong tổng số viêm phổi mắc phải ở cộng đồng [212]. Ở châu Âu, báo cáo từ 10 quốc gia trong Liên minh châu Âu, từ cuối năm 2010 đến 2012, một số nước châu Âu đã trải qua sự bùng phát nhiễm M. pneumoniae. Một số dịch liên quan đến tình trạng kháng macrolid của M. pneumoniae [70]. Dịch bệnh từ 4,1/100.000 dân (10/2010) tăng lên 23,1/100.000 dân (10/2011) [24], [40], [208]. Ở Phần Lan từ năm 1995 đến 2011, cĩ 22.835 trường hợp đã được thơng báo. Dịch bệnh trước đĩ xảy ra trong những mùa đơng năm 2000-2002 và năm 2004-2006. Đỉnh cao trong năm 2005 (1881 trường hợp, 36/100.000 dân) [169]. Một nghiên cứu đa quốc gia ở châu Á (2005) cho thấy M. pneumoniae là nguyên nhân quan trọng gây viêm phổi mắc phải ở cộng đồng trong đĩ trẻ em chiếm 22,3% [158]. . Giới tính Tỷ lệ nhiễm M. pneumoniae ở cả hai giới là tương đương. Ở Tecumseh, tỷ lệ nhiễm ở phụ nữ cao hơn do họ tiếp xúc gần với trẻ em [75]. . Chủng tộc Hầu như khơng cĩ sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm bệnh cũng như triệu chứng lâm sàng của viêm phổi giữa các chủng tộc [212].
11 . Nghề nghiệp Tỷ lệ nhiễm cao trong các tân binh, các bà mẹ cĩ con ở tuổi đến trường, ở những người làm việc trong mơi trường bệnh viện [212]. . Yếu tố kinh tế xã hội Ở những quốc gia kinh tế phát triển, cĩ điều kiện vệ sinh cao, phơi nhiễm với M. pneumoniae bị trì hỗn đến cuối thời thơ ấu, khi bị bệnh dễ biểu hiện nhiều triệu chứng nặng hơn [212]. 1.3.2. Đặc điểm dịch tễ học viêm phổi do Chlamydia pneumoniae  Tác nhân vi sinh Chlamydia pneumoniae . Vị trí và phân loại Chlamydia pneumoniae Chlamydia gồm hai chi Chlamydia và Chlamydophila thuộc họ Chlamydiaceae, bộ Chlamydiales. C. pneumoniae là một trong 4 lồi thuộc họ Chlamydiaceae gây bệnh cho người. . Hình thái, cấu trúc Chlamydia pneumoniae Cấu trúc tế bào Chlamydia pneumoniae Chlamydia là sinh vật bắt buộc phải sống trong tế bào vật chủ. Vách của Chlamydia cĩ cấu tạo giống vách của vi khuẩn Gram âm, với lipopolysaccharide ở màng ngồi [124]. Hình thức khác thường Hình 1.5: Sơ đồ mơ phỏng Chu trình nhân lên của Chlamydia tiểu thể cơ bản EB (Elementary Body) truyền nhiễm và tiểu thể dạng lưới RB (reticulate body) khơng truyền nhiễm [20].
12 Tiểu thể cơ bản - Elementary Body (EB) ở dạng đặc biệt khơng hoạt động, tồn tại trong mơi trường ngoại bào. Bên trong tế bào, thể lưới - reticulate body (RB) ở dạng hoạt động và cĩ khả năng sinh sản. Chlamydia cần adenosine triphosphate (ATP) và nguồn chất dinh dưỡng từ một tế bào chủ để trao đổi chất và nhân lên [161]. Cấu trúc kháng nguyên Chlamydia pneumoniae Chlamydia cĩ nhiều kháng nguyên protein đặc hiệu cho chi, cho lồi và cho typ huyết thanh [20]. - Lipopolysaccharide (LPS): đặc hiệu chung cho chi. LPS đĩng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiễm trùng Chlamydia [20]. - Protein chính ở màng ngồi (MOMP) – protein 40 kilo Dalton (KDa) là kháng nguyên (KN) nổi trội ở màng ngồi do gen omp1 quy định [20]. - Phức hợp protein màng ngồi (omc) được hình thành bởi 3 protein: MOMP và 2 protein giàu cystein omcA và omcB [182]. - Protein màng ngồi đa hình thái (PMP) là một nhĩm protein (20 protein) nằm ở bề mặt [20]. - Hệ thống dịch tiết type III: khi được hoạt hĩa, protein của Chlamydia được bơm vào trong bào tương của tế bào chủ, tạo tín hiệu cho tế bào chủ chuyển chất dinh dưỡng vào cho thể vùi. Các protein này cịn tham gia vào quá trình ly giải tế bào chủ để giải phĩng EB [20]. - Protein shock nhiệt (Hsp) Hsp 10, Hsp60 và Hsp 70 cĩ tính sinh miễn dịch cao nên cĩ vai trị chủ yếu trong cơ chế bệnh sinh và tham gia gây bệnh tự miễn dịch, dẫn đến xơ hĩa [20]. Chlamydia cĩ chứa 60 protein màng được tiết từ bộ máy màng tiết loại III. Chúng tham gia tiếp xúc với các tế bào chất của tế bào chủ và để lưu trữ tế bào chất tạo điều kiện thuận lợi cho sự tăng trưởng Chlamydia [20]. Cấu trúc phân tử Chlamydia pneumoniae Bộ gen của C. pneumoniae chủng J39 và chủng CUL 039 đã được giải trình tự. Bộ gen của C. pneumoniae là 1,13.106 Bp (base pair). Bộ gen của Chlamydia tương đối bền vững, ít sắp xếp lại [20].
13  Cơ chế gây bệnh Chlamydia pneumoniae Những biểu hiện bệnh lý của nhiễm Chlamydia là do miễn dịch của cơ thể quyết định. Miễn dịch tế bào được cho là quan trọng trong phản ứng quá mẫn dẫn đến tổn thương mơ, đặc biệt ở nhiễm trùng tiềm tàng và tái diễn. . Về đáp ứng kháng thể Cơ chế hình thành hai loại kháng thể: đặc hiệu nhĩm chống LPS và đặc hiệu lồi IgG, IgM và IgA cĩ trong huyết thanh và trong dịch tiết tại chỗ chống kháng nguyên MOMP. IgM xuất hiện sớm, cĩ thể duy trì ở các nhiễm trùng phức tạp, IgA là dấu hiệu của nhiễm trùng tiềm tàng [20]. . Về đáp ứng tế bào Ở nhiễm trùng cấp tính, tế bào bạch cầu đa nhân đáp ứng nhanh để bất hoạt Chlamydia. Tiêu diệt vi khuẩn nhờ chức năng của tế bào lympho T. Cả hai loại tế bào CD4 và CD8 đều cĩ vai trị bảo vệ. Tế bào CD4 lympho “hỗ trợ” th1 đặc hiệu MOMP đĩng vai trị quan trọng trong miễn dịch [21]. . Về các cytokin Tế bào biểu mơ nhày nhiễm Chlamydia tạo ra nhiều cytokin bao gồm IL - 1α, IL - 6, IL - 8, GRO – α, GM - CS F (granulocyte – Macrophage colonystimulating factor) – yếu tố kích thích tập hợp đại thực bào – tế bào hạt. Các Interferon, đặc biệt TNF – α (Tumor necrosis factor –anpha) gĩp phần quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống nhiễm trùng do Chlamydia [20].  Nguồn bệnh Chlamydia pneumoniae Con người là nguồn chứa C. pneumoniae. Bệnh lây từ người sang người hoặc từ động vật bị bệnh sang người khơng qua vector truyền bệnh [124].  Phương thức lây truyền Chlamydia pneumoniae C. pneumoniae lây truyền từ người này sang người khác qua dịch tiết đường hơ hấp [124], [161]. Nhiễm trùng cĩ thể đạt được qua đường truyền bệnh từ những người mang trùng khơng triệu chứng [187]. Vi khuẩn khơng lây truyền qua đường tình dục [161].
14  Giai đoạn ủ bệnh Chlamydia pneumoniae Giai đoạn ủ bệnh của C. pneumoniae là một vài tuần. Khoảng thời gian 3 tuần được chứng minh giữa phơi nhiễm và bệnh trong đợt bùng phát C. pneumoniae [124].  Tính cảm nhiễm và miễn dịch Chlamydia pneumoniae . Tính cảm nhiễm Mọi người đều cĩ khả năng cảm nhiễm cao với bệnh, lên tới 50% người trưởng thành cĩ kháng thể chống lại C. pneumoniae. Bệnh gặp ở cả hai giới và ở mọi nhĩm tuổi [124], [162]. . Tính miễn dịch Nhiễm trùng với C. pneumoniae đã gây ra các đáp ứng huyết thanh miễn dịch IgM, IgA, IgG. Người nhiễm C. pneumoniae phát triển đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được chứng minh bởi thử nghiệm chuyển đổi lymphocyte ở máu ngoại vi hoặc lymphocyte hoạt dịch [124]. Sau khi nhiễm bệnh, sẽ cĩ miễn dịch đặc hiệu với vi khuẩn nhưng thời gian miễn dịch khơng bền, hầu hết người bị nhiễm và tái nhiễm trong suốt cuộc đời [124], [162]. Kháng thể từ nhiễm trùng đầu tiên thường bị mất trong vịng khoảng 5 năm và tái nhiễm với C. pneumoniae đã được chứng minh dựa trên theo dõi huyết thanh thu thập được trong suốt nhiều năm [226].  Phân bố và sự lưu hành Chlamydia pneumoniae . Phân bố theo tuổi Nhiễm trùng xuất hiện chủ yếu ở tuổi học đường [97]. Tỷ lệ mắc dưới 5 tuổi là 1-3%; 5-9 tuổi là 10- 40% ; 10 đến 15 tuổi là 19-35% [93], [187]. Ở châu Á, tỷ lệ mắc C. pneumoniae là 4,6% tại một nghiên cứu đa trung tâm, trong đĩ trẻ em chiếm 4,1% trong các nguyên nhân gây viêm phổi mắc phải cộng đồng [158]. . Phân bố theo giới Phân bố theo giới là như nhau ở trẻ dưới 15 tuổi [124].
15 . Phân bố theo địa dư C. pneumoniae phân bố trên tồn thế giới. Các nghiên cứu huyết thanh người trưởng thành từ 10 khu vực khác nhau trên thế giới thấy tần suất cao hơn ở dân cư vùng nhiệt đới. Tại Mỹ và nhiều quốc gia khác, C. pneumoniae lưu hành trong huyết thanh của trên 50% dân cư [74]. Ước tính số trường hợp viêm phổi do C. pneumoniae tại Mỹ là 300.000 trường hợp mỗi năm, tác nhân gây bệnh được ước tính gây ra 10-20% viêm phổi mắc phải cộng đồng (CAP) ở người trưởng thành [208]. Trên tồn cầu, Forest phân tích sử dụng 2 cơ sở dữ liệu quốc tế cho thấy rằng tỷ lệ viêm phổi mắc phải cộng đồng do C. pneumoniae từ 4337 bệnh nhân là 8% ở Bắc Mỹ, 7% ở châu Âu, 6% ở châu Mỹ La tinh và 5% ở châu Á [74]. . Phân bố theo thời gian Bệnh xảy ra theo chu kỳ mỗi 4-8 năm [124], [162]. Bệnh xảy ra quanh năm, cĩ xu hướng tăng vào mùa hè. Tỷ lệ cao hơn C. pneumoniae được ghi nhận từ tháng sáu đến tháng mười [173]. 1.3.3. Đặc điểm dịch tễ học viêm phổi do Legionella pneumophila  Tác nhân vi sinh Legionella pneumophila . Vị trí và phân loại Legionella pneumophila Lồi L. pneumoniae thuộc chi Legionella họ Legionellaceaea. Hiện nay chi Legionella gồm ít nhất 50 lồi và 71 type huyết thanh. Số lượng các lồi và nhĩm huyết thanh của Legionellae tiếp tục tăng [72]. Cĩ ít nhất 24 trong số này cĩ liên quan với bệnh ở người. Phần lớn bệnh do Legionella ( 90%) được gây ra bởi L. pneumophila, L. pneumophila huyết thanh nhĩm 1 chịu trách nhiệm hơn 84% các trường hợp viêm phổi [157]. . Hình thái học và cấu trúc Cấu trúc tế bào L. pneumophila Vi khuẩn đa hình thái, hiếu khí, thường gặp dạng trực khuẩn Gram âm (bắt màu yếu), đơi khi gặp hình cầu hoặc hình sợi. Kích thước thay đổi 0,3- 0,9 µ m x 2- 20 µ m. Hình thể thay đổi theo những điều kiện nuơi cấy và mơi trường nuơi cấy khác nhau. Vi khuẩn di động, cĩ một lơng ở một đầu, khơng sinh nha bào, khơng cĩ vỏ [166].
16 Màng tế bào của L. pneumophila chứa một lipopolysaccharide (LPS) tạo đáp ứng miễn dịch của vật chủ [33]. Hình 1.6. Hình ảnh prokaryote của L. pneumophila [6] Các kháng nguyên nằm trên màng tế bào giúp xác định nhĩm khác nhau trong chi Legionella. L. pneumophila nhĩm 1 LPS cũng cĩ một kháng nguyên O. Kháng nguyên O là yếu tố quyết định các đặc tính của nhĩm trong chi [161]. Cấu trúc phân tử Legionella pneumophila Cấu trúc di truyền của bộ gen Legionella được nghiên cứu qua thời gian dài. Trong 5 năm 4 trình tự gen của L. pneumophila nhĩm 1 đã hồn thành bao gồm Philadenphia nhĩm 1 [30], Paris strans gây ra 12 % bệnh ở Pháp [146], dịng Lens stran gây bùng phát dịch lớn ở Pháp và chủng Corby stran [112]. Năm 2010, dịng 570-CO-H đã được giải trình tự [82]. Kích thước bộ gen từ 3,3 – 3,5 Mb, số lượng gen dự đốn 3001 – 3259, nội dung G+C 38%, tỷ lệ phần trăm của vùng mã hĩa 88 -92% [46], [82].  Cơ chế gây bệnh Legionella pneumophila . Độc lực và khả năng gây bệnh Độc tố là yếu tố quan trọng đối với khả năng nhiễm và nhân lên của L. pneumophila bên trong amip. Một số các yếu tố độc lực khác cĩ thể giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể con người. Sự tương tác giữa độc lực của Legionella với các tế bào thực bào cĩ thể chia thành các bước [33]: - Gắn các vi sinh vật lên thụ thể trên bề mặt tế bào nhân điển hình. - Xâm nhập của vi sinh vật vào tế bào thực bào. - Thốt khỏi sự tấn cơng diệt khuẩn.
17 - Hình thành một khơng bào sao chép (một ngăn bên trong tế bào cho quá trình sao chép của vi khuẩn). - Nhân nội bào và giết chết các tế bào chủ. Khi Legionella thâm nhập vào phổi của người bệnh, vi khuẩn bị thực bào bởi đại thực bào ở túi phổi. Tuy nhiên, chỉ chủng độc hại cĩ thể nhân lên bên trong tế bào thực bào và ức chế sự hợp nhất của phagosome với lysosome. Vi khuẩn cĩ thể sau đĩ lây nhiễm tới các đại thực bào khác. Như vậy vi khuẩn tăng lên rất nhanh trong phổi [33]. Trong quá trình thực bào, Legionella bắt đầu các hoạt động sau: - Sự ức chế của cụm oxy hĩa - Giảm axit hĩa phagosome - Chặn sự trưởng thành của phagosome - Thay đổi sự di chuyển trong bào quan Vào trong amip: thụ thể trung gian hấp thu, địi hỏi dot/icm, thụ thể Gal/ GalNAc Dạng nhân lên trong sự kết hợp lưới nội chất Ra khỏi amip: hoại tử- hình thành lỗ rỗng Cạn kiệt Amimo axit Tích tụ ppGpp Pha khơng di động Sự biểu hiện gen Vào đại thực bào: địi hỏi nội bào di động Actin phụ thuộc, dot/icm Ra khỏi đại thực bào: hình thành lỗ rỗng, hoại tử Apotosis Hình 1.7. Vịng đời của L. pneumophila trong các đại thực bào động vật nguyên sinh và con người [72]. Do đĩ, Legionella ngăn chặn các hoạt động diệt khuẩn của thực bào và biến đổi các phagosome thành chỗ thích hợp cho quá trình nhân lên của chúng. Vi khuẩn này cĩ thể thốt khỏi tế bào chủ bằng cách ly giải thơng qua sự hình thành các lỗ trên màng hoặc vẫn nằm bên trong amip [152].
18 . Cấu trúc bề mặt liên quan đến khả năng gây bệnh Cấu trúc bề mặt đĩng một vai trị quan trọng trong việc gây bệnh của Legionella. Cùng với roi và pili, một số vi khuẩn cĩ liên quan đến việc tuân thủ, xâm nhập của Legionella vào đại thực bào phế nang và động vật nguyên sinh. Những protein này bao gồm: • Protein màng ngồi lớn (MOMP) • Protein sốc nhiệt (Hsp60) • Sự lây nhiễm chủ yếu của protein potentiator. Cấu trúc này là những protein bao gồm: protein màng ngồi lớn (MOMP), protein sốc nhiệt (Hsp60), sự lây nhiễm chủ yếu của protein potentiator [77].  Nguồn bệnh Legionella pneumophila Legionella sống ở khắp mọi nơi, đặc biệt hay cư trú trong mơi trường nước [72], [217]. Legionella cĩ thể sống sĩt và phát triển trong mơi trường tế bào amip, như vậy vi khuẩn cĩ khả năng sống dai dẳng trong tự nhiên [218].  Phương thức lây truyền Legionella pneumophila Vi khuẩn Legionella cĩ thể được phát tán thơng qua những hạt nước nhỏ li ty. Một nguồn nước ơ nhiễm (ví dụ như một đài phun nước) cĩ các giọt nước cĩ chứa Legionella thường được gọi là các sol khí [33]. Khơng cĩ bằng chứng lây truyền bệnh từ người sang người [218].  Thời kỳ ủ bệnh Legionella pneumophila Thời kỳ ủ bệnh trung bình của bệnh Legionella là 2-10 ngày [165].  Tính cảm nhiễm và miễn dịch Legionella pneumophila . Tính cảm nhiễm Đa số bệnh nhân tiếp xúc với L. pneumophila nhưng khơng cĩ triệu chứng. Người lớn tuổi dễ cĩ nguy cơ mắc bệnh. Trẻ em viêm phổi do Legionella ít gặp thường xảy ra sau 4 tuổi [165]. Những trẻ dùng thuốc ức chế hệ thống miễn dịch (cấy ghép hoặc hĩa trị liệu) cũng cĩ nguy cơ cao nhiễm bệnh [141].
19 . Tính miễn dịch Việc bảo vệ vật chủ chống lại Legionella dựa chủ yếu vào cơ chế miễn dịch qua trung gian tế bào. Ít nhất hai loại protein được sản xuất bởi L. pneumophila cĩ thể gây ra miễn dịch qua trung gian tế bào, đĩ là các protein tiết chính (MSP, 39 kDa) và protein màng ngồi (ompS, 28 kDa) [72]. Tái nhiễm L. pneumophila đã được báo cáo ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch nặng. Miễn dịch bẩm sinh bao gồm các tế bào vật chủ và cytokine, được sản xuất bởi các đại thực bào được kích thích bởi các kháng nguyên của vi khuẩn. Các đại thực bào kích hoạt tế bào lympho sản xuất cytokine, chẳng hạn như interferon nhằm hạn chế sự phát triển và lây lan của vi khuẩn nội bào [79].  Phân bố và sự lưu hành Legionella pneumophila . Phân bố theo tuổi Trẻ em viêm phổi do Legionella ít gặp thường xảy ra sau 4 tuổi [165]. . Phân bố theo giới: bệnh gặp ở nam giới cao hơn nữ giới [217]. . Phân bố theo địa lý Bệnh Legionella xảy ra trên tồn thế giới. Đa số các trường hợp bệnh Legionella đã được xác định ở các nước nhiệt đới. Tại Mỹ, khoảng 8.000 – 18.000 trường hợp mắc bệnh Legionnaires nhập viện hàng năm [166], [184]. Theo CDC giai đoạn 1980-1998 cĩ 360 người mắc mỗi năm [35]. Theo số liệu của Tập đồn cơng tác châu Âu về tỷ lệ nhiễm Legionella - (EWGLI) năm 2007 cĩ 5.907 trường hợp. Năm 2008 là 5.960 trường hợp [114]. . Phân bố theo mùa Tỷ lệ bệnh Legionella thay đổi theo mùa, cao nhất trong tháng mùa hè và mùa thu [33], [72]. Trường hợp nhiễm trùng bệnh viện xảy ra quanh năm, khơng cĩ mơ hình theo mùa. . Chủng tộc: Khơng cĩ mối liên hệ thống nhất giữa chủng tộc và nguy cơ mắc bệnh do Legionella. Nhiễm bệnh do Legionella mắc phải ở cộng đồng ở người da đen cao hơn người da trắng [198].
20 . Yếu tố kinh tế xã hội Tình trạng kinh tế xã hội cĩ thể liên quan với nguy cơ mắc Legionella (hút thuốc lá, du lịch, bệnh cơ bản) [166]. Bệnh viện là nơi truyền bệnh Legionella. Hệ thống nước cấp và nước thải, các dụng cụ tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân là nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh [166]. Đi du lịch là yếu tố nguy cơ lây lan bệnh liên quan đến 21% trường hợp nhiễm bệnh L. pneumophila tại Hoa Kỳ và 30% ở châu Âu [114]. Thuốc lá làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh Legionella từ 2 - 4 lần so với người khơng tiếp xúc với thuốc lá. Khĩi thuốc làm giảm vai trị của thực bào phế nang đối với vi khuẩn L. pneumophila [118], [217]. 1.4. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và điều trị viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila 1.4.1. Đặc điểm lâm sàng viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila Theo Esposito S. [68] và Cunha B. A. [54], trên lâm sàng, viêm phổi do M. pneumoniae, C. pneumoniae khơng phân biệt được với viêm phổi gây ra bởi vi khuẩn hoặc virus khác. M. pneumoniae là một tác nhân gây viêm phổi với các mức độ bệnh nặng nhẹ khác nhau [29], [59]. Các bệnh nhiễm trùng hơ hấp do C. pneumoniae xuất hiện nhẹ khơng cĩ triệu chứng hoặc cấp tính, nhưng thường là một căn bệnh mạn tính [161], [215]. Sau giai đoạn ủ bệnh khoảng 2- 3 tuần, bệnh khởi phát từ từ và nhẹ, sau đĩ tăng dần và rầm rộ với các triệu chứng: ớn lạnh, sốt. Nhiễm trùng do M. pneumoniae thường sốt cao, rét run, mệt mỏi, khĩ chịu, đau đầu. Trẻ lớn hay gặp đau họng, ngứa họng, ho, khàn tiếng, đau cơ, đau ngực. Nghe phổi cĩ thể thấy ran ẩm, ran phế quản. Gõ đục khu trú ở một vùng của phổi [12]. Ho khan và đau đầu xuất hiện sớm ở giai đoạn khởi bệnh. Ho nhiều, khàn tiếng, ho đờm trắng sau vài ngày rồi kéo dài một tháng hoặc hơn. Đau
21 họng hay gặp. Các triệu chứng cơ năng thường râm rộ, trội hơn các triệu chứng thực thể, thường nghèo nàn, xuất hiện muộn [9]. Khám phổi cĩ thể khơng phát hiện gì trong khi đã cĩ tổn thương rộng rãi trên phim xquang phổi. Đơi khi cĩ thể giảm thơng khí khu trú do đơng đặc phổi. Tràn dịch màng phổi hoặc xẹp phổi là những biểu hiện hiếm gặp [9]. Đa số trẻ bị bệnh thường nhẹ, cĩ khả năng tự hồi phục. Ít bệnh nhân tiến triển nặng lên, suy hơ hấp cấp và tử vong [187]. Các biểu hiện ngồi phổi hay gặp là: viêm tai, viêm màng nhĩ, phát ban, mề đay, giảm tiểu cầu, viêm màng não, thiếu máu nhẹ [29]. Các biểu hiện ngồi phổi hiếm khi xảy ra: Bệnh thiếu máu hemolytic, đơng máu nội quản, huyết khối, hội chứng kiệt sức, viêm màng ngồi tim, viêm cơ tim, hội chứng Stevens Johnson, các biểu hiện hệ thần kinh: Viêm màng não, viêm não, rối loạn tâm thần, hội chứng (HC) Guillain - Barre, mất điều hồ tiểu não, hội chứng cuống não, HC giống bại liệt [212]. C. pneumoniae liên kết với một số bệnh như viêm khớp phản ứng, ban đỏ dạng nốt, hội chứng Guillain-Barré và gợi ý liên quan đến phản ứng viêm khớp, hội chứng Reiter [93], [124], [173]. Hình 1.8: Diễn biến lâm sàng M. pneumoniae [75]. M. pneumoniae và C. pneumoniae cịn là tác nhân khởi phát hen và làm tăng độ nặng của cơn hen và bệnh hen [29], [93], [204].
22 L. pneumophila gây ra hai bệnh thực thể riêng biệt: viêm phổi và sốt Pontiac. Sốt Pontiac thường nhẹ hơn, bệnh nhân cĩ sốt, đau cơ, khơng viêm phổi, khơng cần điều trị. Bệnh Legionella cĩ biểu hiện lâm sàng: bất thường về hệ thần kinh trung ương (nhức đầu, rối loạn tinh thần, bệnh não, hơn mê); bất thường về tim (nhịp tim tương đối chậm); biểu hiện tiêu hĩa (tiêu chảy, đau bụng); tổn thương gan (tăng men gan) và thận (đái máu vi thể, tăng creatinine); bất thường điện giải (giảm phosphate và giảm natri máu) [33]. Biểu hiện ngồi phổi của Legionella cĩ thể tổn thương ở lách, gan, thận, cơ tim, xương và tủy xương, khớp, hạch bạch huyết bẹn, trong lồng ngực, thần kinh và đường tiêu hĩa [33]. 1.4.2. Đặc điểm cận lâm sàng viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila 1.4.2.1. Huyết học - Cơng thức máu: đa số các nghiên cứu cho thấy số lượng bạch cầu bình thường hoặc tăng nhẹ 10.000- 20.000/mm3. Một số trường hợp, tăng nhẹ bạch cầu ưa axit [192]. - Tốc độ lắng máu: thường tăng nhẹ. 1.4.2.2. Sinh hĩa máu - CRP cĩ thể tăng nhẹ nhưng khơng phải là dấu hiệu đặc hiệu trong nhiễm vi khuẩn M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila. - Thay đổi về sinh hĩa máu: phosphataza kiềm tăng, hạ natri máu, tăng men gan, tăng creatinin và phosphokinaza, hạ phosphat máu, hồng cầu niệu, protein niệu cĩ thể gặp trong nhiễm khuẩn do Legionella [197]. 1.4.2.3. Xquang (XQ) phổi Những hình ảnh Xquang hay gặp trong viêm phổi khơng điển hình: - Thâm nhiễm phổi thường một phía, đơn độc thuỳ dưới [224]. - Đơng đặc thuỳ phổi, xẹp phổi thường được thấy ở một bên phổi [93] - Tổn thương lưới hoặc xâm nhập tổ chức kẽ chủ yếu ở thuỳ dưới cĩ thể giống bệnh u hạt trong lao, nấm, bệnh sacoid.
23 - Hạch to đơi khi nhầm với bệnh ác tính, ít gặp. - Tràn dịch màng phổi biểu hiện trong khoảng 20 -25% bệnh nhân nhiễm vi khuẩn nội bào cĩ viêm phổi. Vách hĩa màng phổi hoặc ổ cặn mủ màng phổi hiếm gặp, ở những người cĩ hệ miễn dịch suy giảm [52], [197]. Cải thiện hình ảnh Xquang thường chậm hơn cải thiện về lâm sàng từ 5 - 7 ngày. Sự bất thường trên phim xquang cĩ thể kéo dài 3- 4 tháng mới trở về bình thường [197]. 1.4.2.4. Xét nghiệm vi khuẩn học - Cấy máu Cấy máu cĩ thể phân lập được vi khuẩn L. pneumophila từ máu nhưng độ nhạy thấp [197]. - Nhuộm Gram L. pneumophila là sinh vật nhỏ, bắt màu gram âm nhạt màu [33]. Đối với M. pneumoniae nhuộm khơng kết quả vì vi khuẩn khơng cĩ vách tế bào nên chúng khơng bắt màu khi nhuộm [212]. - Nuơi cấy Bệnh phẩm nuơi cấy là dịch tiết đường hơ hấp như: đờm, dịch phổi, dịch màng phổi. Phân lập vi khuẩn địi hỏi mơi trường nuơi cấy đặc biệt (mơi trường canh thang PPLO nuơi cấy vi khuẩn M. pneumoniae [72]; mơi trường tế bào bào thai gà hoặc chuột nhắt trắng, Hella 229 và Hep 2 nuơi cấy tìm C. pneumoniae [181]; mơi trường BCYE - Buffered Charcoal Yeast Extract agar, đây là mơi trường thạch cĩ than hoạt nuơi cấy phát hiện L. pneumophila). L. pneumohila thường mọc sau 3- 5 ngày [197]. Phương pháp nuơi cấy M. pneumoniae thường cho kết quả muộn sau 7-21 ngày [212]. 1.4.2.5. Phương pháp huyết thanh học Chẩn đốn huyết thanh học nhiễm trùng đường hơ hấp do nhiễm M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila cĩ giá trị trong việc chẩn đốn và nghiên cứu dịch tễ học. Các phương pháp đĩ là: Kỹ thuật cố định bổ thể (Complement Fixation – CF), Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immuno
24 Fluorescence Assay – IFA), Kỹ thuật miễn dịch gắn men (Enzyme Immuno Assay – EIA), Kỹ thuật ngưng kết hạt (Partical Agglutination – PA). Xét nghiệm huyết thanh dương tính khi - M. pneumoniae hiệu giá kháng thể tăng gấp 4 lần trong xét nghiệm huyết thanh kép hoặc lớn hơn hoặc bằng 1/32 trong xét nghiệm đơn. Tỷ lệ dương tính từ 50 -70 % sau 7- 10 ngày bệnh nhân nhiễm bệnh. - C. pneumoniae: IgM cĩ hiệu giá tăng 1/16 hoặc IgG tăng gấp 4 lần trong mẫu huyết thanh kép hoặc tăng 1/512 bằng phương pháp MIF. Khơng phát hiện được kháng thể sau khi khởi phát bệnh vài tuần, cũng khơng loại trừ được viêm phổi do Chlamydia cấp vì kháng thể IgM dương tính sau 6 tuần và IgG tăng đến 8 tuần sau nhiễm trùng tiên phát [86], [162]. - L. pneumophila: hiệu giá kháng thể lớn hơn hoặc bằng 1/256 cĩ giá trị chẩn đốn bệnh Legionella. Hiệu giá kháng thể địi hỏi tăng gấp 4 lần - lớn hơn hoặc bằng 1/128 sau 4 - 8 tuần. 1.4.2.6. Phương pháp phát hiện kháng nguyên Các thử nghiệm phát hiện kháng nguyên của vi khuẩn gồm: miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, miễn dịch điện di đối lưu, miễn dịch thấm và miễn dịch gắn men phát hiện kháng nguyên. Những kỹ thuật này ít được sử dụng bởi độ nhạy thấp và phản ứng chéo với các Mycoplasma khác cĩ mặt trong đường hơ hấp [56], [212]. Phát hiện kháng nguyên Legionella trong nước tiểu bằng phản ứng ELISA, miễn dịch phĩng xạ, ngưng kết Latex [184]. Kháng nguyên trong nước tiểu chỉ sử dụng cho L. pneumophila (nhĩm 1). Ưu điểm: đơn giản, nhanh, thu thập nước tiểu đơn giản hơn khạc đờm [33]. Kỹ thuật của Kohler và Milstein nhằm phát triển các kháng thể đơn dịng cho C. pneumoniae qua phản ứng kiểm tra kháng thể huỳnh quang trực tiếp Direct immunofluorescence assays (DFA) [226]. Phát hiện L. pneumophila trực tiếp bằng phương pháp DFA từ đờm: cho kết quả nhanh sau 2-4 giờ nhưng độ nhạy thấp, độ đặc hiệu cao 96 - 99%. Kết quả test nhanh DFA âm tính sau 4-6 ngày.
25 1.4.2.7. Phương pháp DNA dị Kỹ thuật lai DNA (DNA probes) để chẩn đốn nhiễm trùng do M. pneumoniae được Razin phát triển vào những năm đầu thập niên 80 [179]. Các đoạn gen 16s rRNA được sử dụng, các đoạn dị cĩ chứa rDNA, gen dị được đánh dấu I125 cho một đoạn trình tự đặc hiệu rRNA của M. pneumoniae [56]; trình tự gen rRNA đặc hiệu cho C. pneumoniae, gen MOMP và các protein màng ngồi giàu cysteine 60-kDa gen [124]. Gần đây, một kỹ thuật khuếch đại cĩ hiệu lực hơn, đĩ là kỹ thuật PCR, khơng liên quan đến đồng vị phĩng xạ, cĩ độ nhạy lớn hơn dẫn đến việc ngừng sử dụng những kỹ thuật lai DNA này. Nhìn chung, các xét nghiệm này thường giới hạn về độ nhạy và độ đặc hiệu, cho kết quả muộn, chỉ cĩ giá trị chẩn đốn hồi cứu. 1.4.2.8. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gen (hay một đoạn DNA) trong một thời gian ngắn. Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính (Denaturation): Ở nhiệt độ cao 90 – 950C (cao hơn Tm của DNA khuơn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau. Đoạn khuơn DNA cĩ các đoạn dài gồm nhiều nucleotid giống nhau, hoặc tỷ lệ (G+C) càng cao, cĩ nhiệt độ biến tính Tm cao hơn. Giai đoạn này kéo dài khoảng 1 phút. Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Ở nhiệt độ khoảng 550c – 650C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuơn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn này kéo dài khoảng 45 – 54 giây. Giai đoạn tổng hợp (Extension): Nhiệt độ 70 – 720C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzym DNA polymerase. Enzym DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuơn theo nguyên lý Chargaff, tạo
26 nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA. Thơng thường, với thời gian 2 phút tổng hợp được những đoạn DNA kích thước dưới 2kb. Bởi PCR dựa trên nguyên lí khuyếch đại một đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn nên PCR cĩ độ đặc hiệu rất cao. Mặc dù độ nhạy của phản ứng chỉ đạt từ 75-85% nhưng đây vẫn được coi là một xét nghiệm quan trọng nhất để chẩn đốn bởi độ đặc hiệu và giá trị của phản ứng dương tính là 100% [64]. Ưu điểm của phương pháp PCR là cĩ thể phát hiện được AND của vi khuẩn, cho kết quả dương tính sớm, khơng địi hỏi vi khuẩn phải cịn sống [214]. Thử nghiệm PCR đa mồi để phát hiện các tác nhân gây bệnh khơng điển hình khác như C. pneumoniae, M. pneumoniae, L. pneumophila cĩ ý nghĩa thực tế [204]. Kết quả cho thấy các xét nghiệm multiplex - PCR là nhạy cảm, hữu ích, giá rẻ và giúp chẩn đốn nhanh chĩng bệnh nhân viêm phổi [168]. 1.4.3. Điều trị viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila M. pneumoniae là loại vi khuẩn khơng cĩ vách, C. pneumoniae, L. pneumophila là vi khuẩn nội bào nên tất cả các loại kháng sinh họ betalactam, cephalosporin đều khơng cĩ tác dụng. Chúng chỉ nhạy cảm với các kháng sinh họ macrolide như: erythromycin, clarythromycin, azithromicin, họ tetracycline và họ quinolone. Tuy nhiên, tetracycline khơng dùng cho trẻ dưới 8 tuổi và quinolone chỉ định cân nhắc cho trẻ dưới 15 tuổi [42]. Mặc dù viêm phổi do Legionella cĩ thể biểu hiện lâm sàng nhẹ, hầu hết bệnh nhân địi hỏi phải nhập viện với liệu pháp kháng sinh tiêm [72]. Các kháng sinh như doxycyclin, azithromycin, quinolone, telithromycin cĩ hiệu quả điều trị nhờ sinh khả dụng tốt, sự xâm nhập vào tế bào đại thực bào tốt, thời gian bán hủy dài [197]. Fluoroquinolon được gợi ý trong những trường hợp nặng. Liệu trình kháng sinh từ 14 - 21 ngày phụ thuộc vào mức độ nặng và tiến triển lâm sàng của bệnh [42].
27 Tính kháng kháng sinh erythromicin của M. pneumoniae sinh ra do đột biến điểm xảy ra ở vùng V của 23S rARN như A2063G và A2064G [142], [151]. Đối với erythromycin là kháng sinh được dùng rất phổ biến ở châu Âu để chống lại nhĩm vi khuẩn khơng điển hình, tỷ lệ kháng là 17% năm 2006 [144], [153], [200] đã trở nên phổ biến ở trẻ em năm 2012 [150]. Ngồi ra, các nghiên cứu thực nghiệm cũng đã báo cáo tác dụng cĩ lợi của corticosteroid trên nhiễm Mycoplasma [126], [226]. Liều uống prednisolon 1mg/kg trong giai đoạn sớm. Nếu khơng tác dụng chuyển methylprednisolon 10mg/kg trong 2, 3 ngày đến 1 tuần, hoặc globulin miễn dịch Ig 1g/kg/ ngày [227]. 1.5. Nghiên cứu viêm phổi khơng điển hình, viêm phổi khơng điển hình nặng ở trẻ em và các yếu tố liên quan 1.5.1. Tình hình nghiên cứu viêm phổi khơng điển hình ở trẻ em 1.5.1.1. Thế giới Trên thế giới, ban đầu những nghiên cứu nhiễm trùng M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila tập trung trên đối tượng người lớn [72], [111], [161], [212]. Các tác giả thấy rằng nhiễm trùng do M. pneumoniae, C. pneumoniae cĩ thể xuất hiện ở cả đường hơ hấp trên và đường hơ hấp dưới, xảy ra ở cả người lớn và trẻ em với mức độ bệnh địa phương (endemic) hoặc bệnh dịch (epidemic) [187], [212]. L. pneumophila hay gây bệnh nặng ở người lớn, hiếm gặp ở trẻ dưới 4 tuổi [72], [166], [184], [203]. Tới năm 1978, Steven [55] đã nghiên cứu trên 45 trẻ viêm phổi do M. pneumoniae, năm 1990 Graystone [89] đã nghiên cứu viêm phổi do C. pneumoniae giúp giải thích rất nhiều trường hợp viêm phổi do “căn nguyên bí ẩn” ở trẻ em. Các tác giả Hauksdottir, Lind đã cĩ những cơng trình theo dõi, tổng kết trên qui mơ lớn trong vịng 10 tới 50 năm, đem lại cái nhìn tổng quát về đặc điểm dịch tễ cũng như đặc điểm lâm sàng của bệnh trong những thập niên cuối của thế kỉ XX [95], [130].
28 Các nghiên cứu về dịch tễ học huyết thanh của viêm phổi do M. pneumoniae, C. pneumoniae ở trẻ em được lồng trong nghiên cứu quần thể dân cư rộng lớn và trong thời gian dài cho thấy tỷ lệ mắc cao được thấy ở lứa tuổi học sinh 5 – 15 tuổi [161], [212]. Nhiễm M. pneumoniae chiếm từ 15 - 20% tổng số các trường hợp viêm phổi mắc phải ở cộng đồng [212]; Nhiễm C. pneumoniae bắt đầu tăng ở tuổi đi học đạt đến 30 - 40% ở tuổi thanh niên [161]. Nghiên cứu đa trung tâm xem xét tần suất nhiễm M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila trên 1756 bệnh nhân cĩ các dấu hiệu và triệu chứng của viêm phổi mắc phải cộng đồng tại 12 trung tâm y tế ở châu Á. Cĩ 23,5% các trường hợp viêm phổi cộng đồng liên quan với nhiễm M. pneumoniae, C. pneumoniae, và L. pneumophila được tìm thấy trong 12,2%, 4,7% và 6,6% các trường hợp, trong đĩ tỷ lệ nhiễm ở trẻ em với M. pneumoniae là 22,3%, C. pneumoniae là 4,6% [158].  Viêm phổi do Mycoplasma pneumoniae Tại Seattle từ 1972 – 1977, tỷ lệ nhiễm trung bình ở trẻ 5 – 9 tuổi là 8%; tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em dưới 5 tuổi bằng ½ ở lứa tuổi học đường và nhĩm từ 15 – 19 tuổi cĩ tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với các nhĩm tuổi nhỏ. Theo Foy H. M., tần suất nhiễm M. pneumoniae là 5/1000 ở nhĩm 5 -9 tuổi; 2/1000 ở nhĩm dưới 5 tuổi và 1/1000 ở nhĩm vị thành niên [76]. Ở Ba Lan từ 1970 - 1997, hầu hết các bệnh nhân là trẻ em ở độ tuổi mẫu giáo và trường học với các triệu chứng lâm sàng của nhiễm trùng đường hơ hấp, 87% trong số đĩ được nhập viện [188]. Mặc dù tỷ lệ mắc nhiễm trùng M. pneumoniae khơng thay đổi lớn theo mùa nhưng tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi do M. pneumoniae thường cao nhất trong mùa hè [10]. Tuy nhiên, sáu vụ dịch do Mycoplasma đã được ghi nhận ở Warsaw trong những nghiên cứu vào mùa thu đơng năm 1970-1971, 1975- 1976, 1980-1981, 1985-1986, 1991-1992, và 1995-1996 [188]. Tại Hàn Quốc, nghiên cứu dài hạn trong 18 năm, sáu vụ dịch đã được quan sát trong khoảng thời gian 3-4 năm. Các dịch bệnh trước năm 1996 đạt đỉnh điểm vào mùa hè, trong khi các bệnh dịch sau năm 1996 tập trung vào mùa thu hoặc mùa đơng [69].
29 Trong 3 năm (2010 - 2012) cĩ nhiều vụ dịch M. pneumoniae xảy ra vào mùa thu đơng trên thế giới, đặc biệt ở các nước châu Âu, Châu Á [24], [40], [69], [70], [169], [208]. Vụ dịch năm 2011 xảy ra ở hầu hết bệnh nhân tuổi học đường ở Phần Lan [169]. Tại Lyon - Pháp trong thời gian nghiên cứu 2010 - 2011, PCR M. pneumoniae được thực hiện trên tổng số 11.302 mẫu bệnh phẩm hơ hấp, chủ yếu là từ trẻ em, với 53,4% số bệnh nhân ở độ tuổi dưới 16 tuổi [70].  Viêm phổi do Chlamydia pneumoniae Các nghiên cứu dịch tễ học huyết thanh của các tác giả trong thập niên 90 của thế kỷ XX, cho thấy C. pneumoniae gây bệnh cho mọi lứa tuổi, tỷ lệ mắc C. pneumoniae ở độ tuổi dưới 5 tuổi từ 1- 3%, trẻ em trong độ tuổi đi học 5 – 9 tuổi: 4-10%; 10 -15 tuổi: 19 -35% [25]. Nghiên cứu tại Phần Lan, C. pneumoniae là tác nhân gây 10% trong 201 trẻ viêm phổi: nhĩm trẻ 5-9 tuổi: 9%, trên 10 tuổi: 31%. Trong dân số nghiên cứu, tỷ lệ viêm phổi do C. pneumoniae là 2,3: 1000 dân [97]. Grayston 1994 nghiên cứu trên quần thể 1057 trẻ em ở Seattle cho thấy: nhĩm trẻ 5 tuổi: 1-3%; nhĩm 5-9 tuổi: 10 - 40%; nhĩm 10 - 15 tuổi:19-35% [88]. Theo Herrmann B, tỷ lệ nhiễm cao hơn ở trẻ em Sudan: nhĩm trẻ 6 tháng -11 tuổi: 18 - 27%, khơng cĩ sự khác biệt giữa hai giới [98]. Nghiên cứu đa trung tâm ở trẻ em châu Á: nhĩm 3-12 tuổi: 16%; nhĩm dưới 6 tuổi:15%, nhĩm trên 6 tuổi:18%, trong đĩ 20% cĩ đồng nhiễm M. pneumoniae [91].  Viêm phổi do Legionella pneumophila L. pneumophila là một nguyên nhân hiếm gặp ở trẻ em trước 4 tuổi. Đến nay, tần suất mắc bệnh ở trẻ em là khơng được biết [203]. Tại Mỹ, bệnh do Legionella ở trẻ em thấp hơn người lớn. Năm 2008, báo cáo của CDC bệnh ngày càng tăng. Trong 23.076 trường hợp mắc L. pneumophila từ năm 1990 – 2005 cĩ 375 trường hợp (1,7%) là trẻ em. Nhĩm trẻ 15-19 tuổi: 44,3%; Nhĩm trẻ dưới một tuổi:18,1%. Trong một nghiên cứu phân tích gộp năm 2006 cĩ 76 trường hợp báo cáo bệnh ở trẻ em, dưới 2 tháng: 19%, 2-12 tháng tuổi: 19%: 1 tuổi - 18 tuổi 62% [194]. Khơng cĩ thơng tin về tỷ lệ bệnh do Legionella ở trẻ em các nước khác [165].
30 Greenberg D. [89] dựa trên các tài liệu báo cáo trường hợp bệnh do Legionnella ở trẻ em trên các dữ liệu quốc tế. Tác giả phân tích dịch tễ học, đặc điểm lâm sàng và điều trị của 76 trường hợp nhiễm trùng do Legionella ở trẻ em. Hầu hết các báo cáo đều từ Bắc Mỹ và châu Âu. Sốt, ho, thở nhanh là những triệu chứng phổ biến nhất. Tỷ lệ tử vong chung là 33%. Ở châu Á, nghiên cứu đa trung tâm tại Thái Lan, Prapphal N. [171]: tần suất mắc viêm phổi do M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila ở trẻ trên 2 tuổi cho thấy tỷ lệ mắc L. pneumophila 0,4%. Hsu C. M. (1996) nghiên cứu dịch tễ học huyết thanh của trẻ em Đài Loan cho tỷ lệ bệnh do Legionella ở trẻ em từ 12-18 tháng thấp hơn so với trẻ lớn từ 7-18 tuổi [105]. Ở người lớn, nhiễm trùng do vi khuẩn L. pneumophila cĩ hai hình thức khác nhau: bệnh Legionnaire biểu hiện lâm sàng viêm phổi nặng hơn và sốt Pontiac biểu hiện bệnh nhẹ hơn. Hai hình thức này đã được ghi nhận ở trẻ em, và những tác động lâm sàng giống như ở người lớn. Tuy nhiên, Holmberg và cs (1993) cảnh báo rằng "tồn bộ các biểu hiện ở trẻ em chưa được biết" [101]. Trong những năm gần đây, dịch bệnh do L. pneumophila tăng cao ở các quốc gia châu Âu [70]. Ở Latvia tần suất mắc bệnh từ 0,08/100.000 dân năm 2001 đã tăng lên 1,35/100.000 dân năm 2011, trong đĩ trẻ em dưới 17 tuổi chiếm tỷ lệ 0,5%. Bệnh mắc cao vào tháng mùa thu 8,9 [70]. Yếu tố nguy cơ cho nhiễm trùng nặng do L. pneumoniae ở trẻ em là: suy giảm miễn dịch sau dùng corticoide hoặc trị liệu ung thư, suy giảm miễn dịch tiên phát hay mắc bệnh phổi mạn tính [54]. Như vậy, đặc điểm dịch tễ học lâm sàng viêm phổi khơng điển hình do M. pneumoniae và C. pneumoniae trên trẻ em đã được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới. Các vụ dịch M. pneumoniae và C. pneumoniae diễn ra trong cộng đồng dân cư trên tồn thế giới đều cĩ ảnh hưởng nhiều trên trẻ em. Các nghiên cứu đa quốc gia, đa trung tâm, dài hạn đã cho chúng ta cái nhìn tổng quan về dịch tễ học lâm sàng của bệnh. Tuy nhiên, dịch tễ học viêm phổi do L. pneumophila ở trẻ em vẫn cịn là ẩn số cả trong khu vực Đơng nam châu Á và thế giới.
31 1.5.1.2. Việt Nam Việt Nam cĩ số trường hợp viêm phổi trẻ em nhiều thứ 9 trên thế giới và khoảng 4000 trẻ em Việt Nam chết vì viêm phổi, chiếm 12% tử vong chung ở trẻ dưới 5 tuổi [19]. Về mặt chẩn đốn căn nguyên viêm đường hơ hấp dưới cấp tính hay viêm phổi cộng đồng do M. pneumonia, C. pneumoniae và L. pneumophila chưa cĩ cơ sở y tế nào quan tâm đến. Lác đác cĩ một vài nghiên cứu đề cập tới việc sử dụng kỹ thuật chẩn đốn huyết thanh học để phát hiện viêm phổi do M. pneumonia, C. pneumoniae. Từ năm 1991 Lê Quốc Thịnh lần đầu tiên sử dụng kỹ thuật ELISA trong chẩn đốn M. pneumoniae tại Việt Nam [14]. Sau đĩ các tác giả Lê Đình Nhân (2005) [9], Nguyễn Thị Thoa (2004- 2005) đã ứng dụng kỹ thuật ELISA để chẩn đốn tác nhân M. pneumoniae, C. pneumoniae gây viêm phổi khơng điển hình ở trẻ em khu vực Miền Nam, Miền trung Việt Nam [15], [16]. Vai trị của M. pneumonia trong bệnh lý hen phế quản trẻ em cũng được quan tâm nghiên cứu [4]. Phương pháp này địi hỏi hai lần lấy máu nên khĩ thực thi và cũng chỉ cĩ tác dụng nghiên cứu hồi cứu và cĩ tính chất đánh giá dịch tễ nhiều hơn. Kỹ thuật sinh học phân tử - PCR đơn mồi (PCR nested) mới đây được ứng dụng ở một số bệnh viện và viện nghiên cứu lớn trong nước. Năm 2006, Phan Lê Thanh Hương và cs đã lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR đơn mồi kết hợp nuơi cấy và phản ứng ELISA trong chẩn đốn tác nhân M. pneumoniae gây viêm đường hơ hấp dưới ở trẻ em [106]. Sau này, các tác giả Lê Nhật Minh, Trần Hải Âu và cs (2008) lần đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện C. pneumoniae gây viêm đường hơ hấp trong bệnh phẩm dịch họng của bệnh nhân viêm đường hơ hấp cấp [7]. Nguyễn Thị Vân Anh (2011) đã sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đốn tác nhân M. pneumoniae gây nhiễm khuẩn hơ hấp dưới cấp tính ở trẻ em. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra tính ưu việt của phương pháp chẩn đốn và tỷ lệ mắc M. pneumoniae trong số trẻ mắc viêm phổi điều trị tại bệnh viện ở Miền Bắc Việt Nam [1], [106]. Tuy nhiên kỹ thuật mới chỉ được thực hiện ở các trung tâm lớn, bệnh viện lớn và chưa phổ biến ở các tỉnh thành trong cả nước [10].
32 Về tần suất mắc bệnh, các nghiên cứu huyết thanh học đã kết luận tỷ lệ mắc viêm phổi do M. pneumonia chiếm tỷ lệ khơng nhỏ trong số viêm phổi mắc phải ở trẻ em nhập viện [9], [14], [15], [16]. Theo Lê Quốc Thịnh tỷ lệ 3,1% nhĩm dưới 5 tuổi [14]. Lê Đình Nhân và cs (năm 2005) 31,4% ở nhĩm tuổi từ 4- 15 tuổi [9]. Tạ Thị Hiền (2011) tỷ lệ nhiễm M. pneumoniae của bệnh nhân trong cơn hen cấp là 54,8%, ngồi cơn là 25%, trong đĩ, hen mức độ nặng cĩ tỷ lệ nhiễm M. pneumoniae cao chiếm 83,3% [4]. Bằng kỹ thuật PCR, tỷ lệ viêm đường hơ hấp dưới cấp tính do M. pneumonia ở trẻ em nhập viện từ 16- 20,6% [1], [106]. Lê Nhật Minh, Trần Hải Âu và cs (2008) lần đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện C. pneumoniae gây viêm đường hơ hấp trong bệnh phẩm dịch họng của bệnh nhân viêm đường hơ hấp cấp, cho thấy tỷ lệ nhiễm C. pneumoniae là 16%, trong đĩ dưới 15 tuổi chiếm 37,5% [7]. Về lâm sàng, theo Phan Lê Thanh Hương: sốt, viêm họng, ho khan và thở nhanh là các triệu chứng chính của bệnh (100%; 100%, 86,5%; 94%) [106]. Tương tự, Nguyễn Thị Vân Anh nhận xét ho và sốt là hai triệu chứng cơ năng thường gặp nhất ở trẻ viêm phổi do M. pneumoniae (91,6% và 87,5%). Đa số bệnh nhân (72,9%) đều ho trước khi đến viện ít nhất 1 tuần, cĩ 31,2% bệnh nhân ho kéo dài trên 2 tuần, trong đĩ ho khan chiếm 72,9%. Triệu chứng sốt gặp ở nhĩm trẻ trên 5 tuổi cĩ tỷ lệ sốt trên 390c trong ngày đầu vào viện cao hơn so với nhĩm trẻ dưới 5 tuổi. Đa số trẻ nhỏ dưới 5 tuổi khi nghe phổi đều cĩ tiếng ran ẩm hoặc ran nổ ở một hoặc cả hai bên phổi (90,9%). Trong khi đĩ, cĩ đến 30,8% trẻ trên 5 tuổi khơng cĩ ran hoặc chỉ thấy được tiếng phổi thơ khơng rõ ràng. Suy hơ hấp là triệu chứng ít gặp trong viêm phổi do M. pneumoniae. Trong đĩ, trẻ nhỏ cĩ tỷ lệ suy hơ hấp lớn hơn so với trẻ lớn (18,1% so với 7,7%) [1]. Theo Nguyễn Thị Kim Thoa, các thể lâm sàng thường gặp do M. pneumoniae ở trẻ em: viêm phổi chiếm 63,6%, viêm phế quản 24,2%. C. pneumoniae gây viêm phổi (54,2%), viêm phế quản (41,7%), viêm thanh khí phế quản (4,2%). Ho kéo dài là triệu chứng nổi bật, kế tiếp là sốt, thở nhanh và rút lõm lồng ngực [15], [16].
33 Về mặt điều trị, ở Việt Nam các trường hợp viêm phổi khơng điển hình thường được chẩn đốn, điều trị như viêm phổi điển hình, nên việc điều trị thường kéo dài và tốn kém [106]. Nhìn chung, các nghiên cứu mới chỉ quan tâm đến tần suất mắc bệnh và một số đặc điểm lâm sàng viêm phổi do M. pneumonia ở nhĩm trẻ nhập viện tại một số tỉnh thành của Việt Nam. Kỹ thuật sinh học phân tử PCR mới được triển khai ở một số trung tâm, bệnh viện lớn chuyên sâu [1], [4]. Trên thế giới, xét nghiệm Multiplex - PCR được đánh giá là nhạy cảm, hữu ích, giá rẻ, và giúp chẩn đốn nhanh chĩng bệnh nhân viêm phổi nhưng chưa được áp dụng tại Việt Nam. Như vậy, ở nước ta chưa cĩ nghiên cứu nào được thực hiện với cả 3 căn nguyên M. pneumonia, C. pneumoniae và L. pneumophila gây viêm phổi cấp hay viêm đường hơ hấp dưới cấp ở trẻ em. Nước ta chưa cĩ đầy đủ số liệu dịch tễ như tỷ lệ mắc bệnh hàng năm, sự thay đổi type của M. pneumoniae và C. pneumoniae hay sự xuất hiện của chủng M. pneumoniae và C. pneumoniae kháng Macrolide như các quốc gia phát triển khác. Tuy nhiên, dù chưa phát hiện được chủng M. pneumoniae kháng thuốc nhưng nguy cơ xuất hiện chủng kháng thuốc luơn tiềm ẩn vì tình trạng lạm dụng kháng sinh cũng như khĩ khăn trong chẩn đốn tác nhân gây bệnh viêm phổi khơng điển hình dẫn tới tình trạng điều trị muộn, bao vây, điều trị theo kinh nghiệm vẫn cịn phổ biến. 1.5.2. Nghiên cứu viêm phổi khơng điển hình nặng và các yếu tố liên quan 1.5.2.1. Căn nguyên vi khuẩn Hầu hết các viêm phổi do M. pneumoniae đều đáp ứng với liệu pháp kháng sinh thích hợp. Ít khi cĩ diễn tiến nặng, chỉ 3- 4% số người nhiễm M. pneumoniae bị viêm phổi nặng, suy hơ hấp cấp, đe dọa tính mạng, hội chứng suy hơ hấp cấp tiến triển, tỷ lệ tử vong chung thấp (dưới 0,1%) [151], [176]. Viêm phổi do C. pneumonae thường nhẹ, đáp ứng với điều trị ngoại trú [161], ít gặp trường hợp nặng, liên quan đến tình trạng đồng nhiễm, cĩ biểu hiện ngồi phổi, các bệnh đi kèm hoặc tổn thương hệ miễn dịch [92], [93], [124].
34 Viêm phổi do L. pneumophila là bệnh đứng thứ 2, sau viêm phổi do phế cầu gây viêm phổi nặng địi hỏi phải điều trị tích cực [226]. Tỷ lệ tử vong của bệnh Legionnella phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của bệnh, sự phù hợp trong việc điều trị diệt vi khuẩn ban đầu và các yếu tố vật chủ. Tỷ lệ tử vong cĩ thể cao 40-80/100 bệnh nhân và cĩ thể được giảm xuống cịn 5 – 30/100 tùy thuộc vào điều trị thích hợp và tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của những dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng. Đối với người cĩ hệ miễn dịch bình thường, tỷ lệ tử vong thường là trong phạm vi 10-15% [217]. 1.5.2.2. Tình trạng đồng nhiễm Những nghiên cứu lâm sàng trên người lớn đã thấy rằng ngày càng gia tăng tình trạng đồng nhiễm trong viêm phổi mắc phải cộng đồng. Tình trạng đồng nhiễm M. pneumoniae, C. pneumoniae với vi khuẩn và virus khác khơng phải hiếm gặp [93], [187], [189]. Tỷ lệ đồng nhiễm giữa M. pneumoniae và C. pneumoniae được thơng báo khoảng 20% [91]. Đã cĩ một vài báo cáo về nhiễm trùng M. Pneumoniae và C. pneumoniae trên bệnh nhân HIV dương tính [155]. Vi khuẩn cĩ khả năng hoạt động như một đồng yếu tố trong bệnh hơ hấp nặng [51]. Nhiễm trùng M. pneumoniae cĩ thể xảy ra trước hay sau nhiễm trùng đường hơ hấp với các virus hay với vi khuẩn khác (ví dụ S. pyogenes và Neisseria meningitides) [115]. M. pneumoniae làm suy giảm miễn dịch và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn thâm nhập vào biểu mơ hơ hấp, gây tổn thương tế bào biểu mơ, giảm tiết chất nhầy đường hơ hấp [115]. Giả thuyết, tình trạng đồng nhiễm được coi là yếu tố làm tăng nặng trong viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn đã được chứng minh bởi Gutiérrez và cs [90]. Nghiên cứu trên 493 bệnh nhân viêm phổi, tác giả đã ghi nhận các biến chứng: tràn dịch màng phổi, xẹp phổi, sốc nhiễm trùng, giảm oxy máu địi hỏi phải thở máy, tử vong gặp ở những bệnh nhân với viêm phổi do tác nhân đồng nhiễm (39,3%) cao hơn so với (18,6%) những bệnh nhân viêm phổi do một tác nhân (OR = 2,84; 95% CI 1,24- 6,54, p = 0,02). Kết luận này cũng đã được chứng minh bởi Kim C. trong 113 bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình do M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila cĩ đồng nhiễm virut tại quần thể dân tại một trại tỵ nạn trong đĩ cĩ trẻ em. Tỷ lệ đồng
35 nhiễm với ít nhất một virut là 54%, đồng nhiễm với nhiều vi rút là 32,8%, tình trạng đồng nhiễm vi rút cĩ liên quan đến mức độ nặng của bệnh [120]. Kết luận này cũng đã được ghi nhận trên nhĩm trẻ viêm phổi do C. pneumoniae cĩ đồng nhiễm vi khuẩn bởi Schmidt [190]. 1.5.2.3. Mắc các bệnh kèm theo Các nghiên cứu trên người lớn thấy rằng: mắc các bệnh kèm theo: hen, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, các bệnh ác tính, tim mạch, tiểu đường, suy giảm miễn dịch là yếu tố làm tăng tình trạng nặng của bệnh [187], [93], [67]. Từ những năm 1970, các thầy thuốc lâm sàng đã coi nhiễm trùng là yếu tố nguy cơ trong sinh bệnh học của hen. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu để tìm hiểu mối liên quan của nhiễm M. pneumoniae và C. pneumoniae đến mức độ nặng của hen [113]. Biscardi báo cáo 20% (24/119) bệnh nhân cĩ tiền sử hen trước đĩ đã đồng thời nhiễm M. pneumoniae cấp và làm tăng nặng thêm bệnh hen phế quản [37]. Vì vậy, dựa trên các tài liệu hiện tại, M. pneumoniae được coi là kích hoạt các đợt cấp của bệnh hen và gây ra 3,3% - 50% tình trạng trầm trọng của bệnh [218]. Sau này, Sebastian L đã chứng minh rằng mắc các bệnh mãn tính như hen biểu hiện nghiêm trọng ở nhĩm cĩ nhiễm M. pneumoniae cao hơn cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm khơng nhiễm M. pneumoniae (15/22 vs 12/36, p = 0,01; OR 4,29, 95% CI 1,38- 13,32) [191]. Kết luận này cũng được chứng minh trên trẻ em [113]. 1.5.2.4. Điều trị đặc hiệu muộn Điều trị đặc hiệu muộn được nhấn mạnh liên quan cĩ ý nghĩa thống kê đến tỷ lệ tử vong của viêm phổi do L. pneumoniae ở người lớn [67], [96]. Giả thuyết này đã được chứng minh bởi Gacouin A., thời gian bị bệnh trước khi nhập ICU dài hơn 5 ngày (OR 7.46; 95% CI 1,17-47,6) là những yếu tố nguy cơ tử vong của viêm phổi do L.pneumophyla [80]. 1.5.2.5. Biểu hiện ngồi phổi Nhiều báo cáo ca bệnh hay loạt bệnh viêm phổi khơng điển hình cĩ biểu hiện ngồi phổi nặng như: biểu hiện thần kinh, huyết tán, bệnh tim, viêm đa khớp, tổn thương da, rối loạn điện giải, suy đa tạng cĩ liên quan đến tình trạng nặng, thậm chí tử vong [195], [223]. Theo Rautonen và cs, trẻ em nhiễm
36 M. pneumoniae cĩ khả năng bị chết hoặc cĩ di chứng thần kinh nghiêm trọng cao hơn gấp 7 lần so với những đứa trẻ khác, đứng thứ hai sau các trường hợp nhiễm Herpes simplex [178]. Theo Bitnun A., M. pneumoniae chiếm 31 trong số 159 trẻ viêm não, trong đĩ di chứng thần kinh xảy ra ở 48% - 64% các trường hợp [38]. Hoek [100] nhận định, tan máu tự miễn sau nhiễm M. pneumoniae là nguyên nhân dẫn tới tình trạng nặng của bệnh nhân nhập viện. 1.5.2.6. Các yếu tố khác Liên quan đến tình trạng nặng của viêm phổi khơng điển hình như: mối liên hệ giữa tải lượng vi khuẩn và mức độ nghiêm trọng lâm sàng đã được chứng minh bởi Nilsson A. [159], tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn M. pneumoniae với macrolide [135]. Miyashita N ghi nhận, khi bệnh nhân nhập viện cĩ các biểu hiện lâm sàng như: tăng bạch cầu, tổn thương phổi 2 bên, tràn dịch màng phổi, tăng nồng độ LDH, ALT, AST, và giảm protid máu [151]; Hsieh [103], Lieberman D [129] tăng IL6, TNF liên quan đến tình trạng nặng, tử vong của bệnh. Ngồi ra, nghiên cứu các yếu tố giúp tiên lượng nặng trong viêm phổi do L. pneumophila, theo Elebiary [67]: suy hơ hấp, thở máy, hạ natri máu 30 mg/dl, Albumin máu giảm; theo Muđoz Martínez [154]: suy đa cơ quan, Tkatch L. S [202]: địi hỏi thở máy, biến chứng áp xe phổi, vách hĩa, tràn dịch màng phổi cĩ liên quan đến tiên lượng nặng của viêm phổi do L. pneumophila. Như vậy, cĩ rất nhiều yếu tố liên quan đến mức độ nặng của viêm phổi khơng điển hình ở người lớn. Trên trẻ em, yếu tố đồng nhiễm đã được chứng minh là yếu tố nguy cơ của viêm phổi khơng điển hình nặng. Các yếu tố khác chưa được quan tâm nghiên cứu trên trẻ em, đặc biệt là viêm phổi do L. pneumophila. Tại Việt Nam, chưa cĩ nghiên cứu nào đề cập đến các yếu tố liên quan đến mức độ nặng của viêm phổi do M. pneumonia, C. pneumoniae và L. pneumophila ở trẻ em.
37 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Các bệnh nhân viêm phổi, gây ra do các tác nhân vi sinh khác nhau, tuổi từ 12 tháng đến 15 tuổi điều trị tại khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2010 đến tháng 3/2012. - Các bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình (VPKĐH), gây ra do ít nhất một trong 3 lồi vi khuẩn là M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila, tuổi từ 12 tháng đến 15 tuổi, điều trị tại khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2010 đến tháng 3/2012. Dưới đây gọi tắt là “VPKĐH do vi khuẩn”. - Các bệnh nhân VPKĐH, gây ra do ít nhất một trong 3 lồi vi khuẩn M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila, được chẩn đốn bệnh thể nặng, dưới đây gọi tắt là “VPKĐH nặng”. 2.2. Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu dịch tễ học, lâm sàng thực hiện tại khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương và khoa Dịch tễ viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. - Nghiên cứu cận lâm sàng được thực hiện tại khoa Sinh hĩa, Huyết học, Sinh học phân tử Bệnh viện Nhi Trung ương và Phịng xét nghiệm vi khuẩn hơ hấp Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7/2010 đến tháng 3/2012. 2.4. Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 2.4.1. Ca bệnh viêm phổi: đạt đủ tiêu chuẩn sau: Bệnh nhân được chẩn đốn viêm phổi theo tiêu chuẩn WHO, dẫn theo tài liệu của Bộ Y tế [2]. - Ho - Sốt: thân nhiệt ≥ 37,5oC. - Thở nhanh - X- quang phổi cĩ hình ảnh thâm nhiễm nhu mơ phổi: rải rác hai bên, tập trung từng thùy, phân thùy, thâm nhiễm mơ kẽ hoặc hình ảnh hỗn hợp. Gia đình bệnh nhi đồng ý tham gia nghiên cứu.
38 2.4.2. Ca bệnh viêm phổi khơng điển hình do vi khuẩn: đạt các tiêu chuẩn sau: Bệnh nhân được xác định là viêm phổi ( xem mục 2.4.1). Trong bệnh phẩm dịch hơ hấp hoặc mẫu huyết thanh kép cĩ phát hiện ít nhất dấu ấn của một trong ba lồi vi khuẩn sau: M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila. Gia đình bệnh nhi đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.4.3. Ca bệnh viêm phổi khơng điển hình thể nặng: đạt các tiêu chuẩn sau: Bệnh nhi được chẩn đốn xác định là VPKĐH do vi khuẩn ( mục 2.4.2). Bệnh nhân được chẩn đốn VPKĐH ở thể nặng, xác định theo đúng “tiêu chuẩn chẩn đốn viêm phổi nặng” của Hiệp hội Bệnh nhiễm trùng Nhi khoa Mỹ [42]. - Viêm phổi: Thở nhanh (theo tuổi) [2]. - Viêm phổi nặng: a. Khi cĩ một dấu hiệu chính trở lên: + Cần thơng khí nhân tạo + Sốc nhiễm khuẩn b. Hoặc khi cĩ hai trong các dấu hiệu sau: + Rút lõm lồng ngực + Hạ huyết áp + Thở nhanh ( theo tuổi) + Tràn dịch màng phổi + Ngừng thở + SPO2 < 90% thở khí trời + Rối loạn ý thức + Tỷ lệ PaO2/FiO2 < 250 + Thâm nhiễm nhiều thùy phổi (từ 2 thùy phổi trở lên) Gia đình bệnh nhi đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.4.4. Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu: những bệnh nhân sau đây khơng được đưa vào danh sách đối tượng nghiên cứu: Các trường hợp viêm phổi điển hình. Các trường hợp viêm phổi đồng nhiễm với vi khuẩn khác hoặc virus sẽ khơng được xét trong phần các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng khi nghiên cứu VPKĐH do 3 lồi vi khuẩn.
39 Các trường hợp viêm phổi mắc phải ở bệnh viện, coi như một nhiễm khuẩn bệnh viện (vào bệnh viện điều trị bệnh khác, sau 48 giờ mắc viêm phổi). Gia đình bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu. Những trường hợp nhà nghiên cứu xét thấy cần đưa ra khỏi danh sách nghiên cứu. 2.4.5. Chịu trách nhiệm chẩn đốn và lấy đối tượng vào nghiên cứu - Trưởng khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương là người chịu trách nhiệm cuối cùng cho các trường hợp chẩn đốn xác định ca bệnh viêm phổi, VPKĐH, VPKĐH nặng do các tác nhân M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila. - Nghiên cứu sinh là người chịu trách nhiệm chính cho việc lựa chọn đối tượng vào nghiên cứu hoặc loại trừ đối tượng khơng đạt yêu cầu. 2.5. Phương pháp nghiên cứu: 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mơ tả loạt bệnh ( case series) tiến cứu, theo dõi dọc, cĩ kết hợp phân tích nhằm xác định một số yếu tố liên quan tới tình trạng VPKĐH nặng. 2.5.2. Cỡ mẫu nghiên cứu  Với mục đích tìm hiểu thêm tỷ lệ mắc VPKĐH do ba loại vi khuẩn M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila trong số bệnh nhi nhập viện (Bệnh viện Nhi Trung ương, 2010 – 2012) được chẩn đốn mắc viêm phổi, chúng tơi sử dụng cơng thức tính cỡ mẫu tối thiểu, áp dụng cho trường hợp nghiên cứu ước tính một tỷ lệ của Tổ chức Y tế Thế giới - WHO ước lượng tỷ lệ phần trăm - một nhĩm [13]. 2 p (1 p ) n Z 1 / 2 ( p . ) 2 Trong đĩ: . n Số trẻ mắc viêm phổi do mọi nguyên nhân đáp ứng đúng yêu cầu ca bệnh để sàng lọc ra các ca VPKĐH do 3 loại vi khuẩn nghiên cứu.
40 . Z(1- α/2) Là giá trị tới hạn tin cậy với hệ số tin cậy (1-α) phụ thuộc vào giá trị α được chọn. Chúng tơi chọn α =0,05, tương đương ta cĩ Z(1- α/2) =1,96. . p Tỷ lệ mắc viêm phổi do M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila, ước tính theo nghiên cứu tiến cứu về tỷ lệ mắc VPKĐH tại bệnh viện. Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng giá trị p = 0,18 (p=18%), dựa vào tỷ lệ mắc VPKĐH trong số những trẻ nhập viện vì viêm phổi, lấy từ số liệu nghiên cứu tại một bệnh viện ở Thái Lan [171]. . q q= 1-p. Ta cĩ q = 1- 0,18 = 0,82. . p.ε Là độ chính xác tương đối, mong muốn. Chúng tơi chọn ε = 16 % hay ε = 0,16. Áp dụng cơng thức trên ta cĩ: 2 p (1 p ) 2 0,18 (1 0,18 ) n Z 1 / 2 = (1,96 ) = 684 ( p . ) 2 (0,18 .0,16 ) 2 Theo tính tốn số lượng mẫu tối thiểu cần là 684 bệnh nhi viêm phổi, cộng thêm 5% bệnh nhi dự kiến cĩ thể bỏ cuộc trong quá trình nghiên cứu là 34. Như vậy cỡ mẫu tối thiểu cho nhĩm đối tượng nghiên cứu là 718 trẻ mắc viêm phổi. Trên thực tế, chúng tơi đã lựa chọn vào danh sách nghiên cứu 722 trẻ bệnh đáp ứng đủ tiêu chuẩn tại mục 2.4.1.  Với mục đích nghiên cứu mơ tả loạt bệnh cĩ kết hợp phân tích để xác định một số yếu tố liên quan tới các trường hợp VPKĐH nặng trên bệnh nhi, chúng tơi sử dụng tồn bộ số ca bệnh được chẩn đốn là VPKĐH (215 ca) xuất hiện trong suốt thời kỳ nghiên cứu (7/2010 – 3/2012), trong số đĩ cĩ 97 trường hợp được chẩn đốn xác định là VPKĐH nặng. 2.5.3. Cách chọn mẫu vào nghiên cứu  Nguồn đối tượng bệnh nhân: Trẻ từ 12 tháng tuổi tới 15 tuổi, với chẩn đốn ban đầu là viêm phổi, vào điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ những địa phương khác nhau
41 trên cả nước.  Cách chọn bệnh nhân cho mục tiêu 1: Từ các trường hợp viêm phổi vào khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương. Tại đây đối tượng được đưa vào danh sách nghiên cứu theo cách chọn mẫu thuận tiện, theo quy luật cách hai bệnh nhân chọn một bệnh nhân (hệ số k=3, tính theo số liệu bệnh nhân viêm phổi vào viện năm trước liền kề năm nghiên cứu chia cho tổng số cỡ mẫu tối thiểu tính được) áp dụng cho nghiên cứu loạt bệnh, tiến cứu, theo dõi dọc trên cơ sở hồ sơ nhập viện hàng ngày, bắt đầu từ tháng 7/2010 đến 3/2012, khi đạt đủ số lượng ca bệnh theo cỡ mẫu tối thiểu được tính tốn là 722. Với từng ca bệnh, sau khi được chẩn đốn xác định là viêm phổi, mẫu bệnh phẩm được lấy và gửi đi xét nghiệm. Kết hợp giữa lâm sàng và cận lâm sàng, các trường hợp được chẩn đốn là VPKĐH do vi khuẩn đã được ghi nhận và đưa vào danh sách đối tượng nghiên cứu. Sau đĩ đối tượng được theo dõi dọc cho tới khi ra viện hoặc tử vong. Các trường hợp ra viện được theo dõi, đánh giá lại về lâm sàng và xét nghiệm mẫu máu lần 2 vào thời điểm khoảng 1 tháng sau ngày ra viện. Các chỉ số về nhân chủng học và tiền sử sinh đẻ, bệnh tật, tiêm chủng, gia đình được thu thập 1 lần khi vào viện. Các chỉ số về lâm sàng, cận lâm sàng được thu thập trong suốt quá trình điều trị.  Cách chọn bệnh nhân cho mục tiêu 2: Là cách chọn thuận tiện bằng cách lấy tồn bộ số đối tượng bệnh nhi VPKĐH, bao gồm cả VPKĐH nặng. Trong số 722 bệnh nhi được chẩn đốn viêm phổi trong giai đoạn từ 7/2010 đến 3/2012, chúng tơi chọn ra các trường hợp xác định là VPKĐH đạt đủ tiêu chuẩn vào nghiên cứu, kết quả đã lấy ra được 215 bệnh án thỏa mãn đủ tiêu chuẩn. Từ 215 trường hợp VPKĐH này, qua theo dõi dọc, tiến cứu, đối chiếu với tiêu chuẩn chúng tơi tiếp tục chọn ra 97 trường hợp VPKĐH nặng. Như vậy, sẽ cĩ 118 trường hợp VPKĐH thể khơng nặng được đưa vào danh sách phân tích so sánh với các trường hợp VPKĐH nặng để xác định các yếu tố liên quan tới tình trạng nặng của bệnh nhi VPKĐH điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
42 Việc thu thập số liệu được thực hiện trong suốt quá trình nghiên cứu, tuy nhiên việc phân tích cuối cùng để cĩ kết luận cho cơng trình nghiên cứu chỉ được thực hiện khi kết thúc nghiên cứu, với đầy đủ dữ liệu về chẩn đốn lâm sàng, cận lâm sàng và vi sinh của tất cả các đối tượng nghiên cứu. 2.6. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Thu nhận vào viện và phân loại bệnh nhi viêm phổi do các tác nhân khác nhau ( N = 722) - Khám lâm sàng - Xét nghiệm cận lâm sàng - Làm PCR, IgM M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila Sàng lọc VPKĐH do M.pneumoniae, C.pneumoniae, L. pneumophila (n = 215) Mục tiêu 1: Nghiên cứu mơ tả đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng VPKĐH do M. pneumoniae, C. pneumoniae, Mục tiêu 2: Nghiên cứu mơ tả kết hợp L. pneumophila phân tích xác định yếu tố ảnh hưởng (n = 215) tới VPKĐH nặng do 3 vi khuẩn (n = 215) Nhĩm bệnh nhi Nhĩm bệnh nhi VPKĐH nặng VPKĐH khơng nặng (n1 = 97) (n2 = 118) Phân tích so sánh Các yếu tố liên quan tới tình trạng VPKĐH Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
43 2.7. Các chỉ số nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá các chỉ số nghiên cứu 2.7.1. Chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 1 2.7.1.1. Cách thức thu thập số liệu mơ tả đặc điểm dịch tễ học: thơng qua phỏng vấn bệnh nhân hoặc cha, mẹ bệnh nhân.  Phần hành chính Khai thác: tên, tuổi (ngày, tháng, năm sinh), giới, địa chỉ, học vấn, thơng tin gia đình (tên, nghề nghiệp, trình độ văn hĩa của bố mẹ). Tuổi của trẻ được tính theo quy ước của WHO [2], chia làm các nhĩm tuổi sau: - Trẻ 1 tới 2 tuổi: từ trịn 12 tháng tuổi đến 1 tuổi 11 tháng 29 ngày. - Trẻ 2 tới 5 tuổi: từ trịn 2 tuổi đến 4 tuổi 11 tháng 29 ngày. - Trẻ 5 tới 10 tuổi: từ trịn 5 tuổi đến 9 tuổi 11 tháng 29 ngày. - Trẻ ≥ 10 tuổi đến trịn 15 tuổi: từ trịn 10 tuổi đến trịn 15 tuổi.  Khai thác yếu tố dịch tễ + Địa dư: phân vùng nơng thơn, thành thị, miền núi + Phân bố theo mùa bao gồm: mùa xuân ( tháng 2-4), mùa hè ( tháng 5 - 7), mùa thu ( tháng 8- 10), mùa đơng (11-12). + Học vấn của bố, mẹ: tiểu học: từ hết lớp 5 trở xuống, THCS: từ hết lớp 9 trở xuống, THPT: từ hết lớp 12 trở xuống, trên THPT: từ trung cấp, đại học và sau đại học. + Nghề nghiệp của bố, mẹ: nơng nghiệp, cán bộ, tự do buơn bán. + Mơi trường sống (đi học, ở nhà, tiếp xúc khĩi thuốc lá, nguồn nước ăn và sinh hoạt, số con trong gia đình, diện tích nhà ở, dùng điều hịa). + Thu nhập bình quân (người/ tháng). Thu nhập thấp dựa trên tiêu chuẩn hộ nghèo theo quyết định số 09/2011/QĐ-TTg ngày 30/01/2011 của Thủ tướng Chính phủ ban hành chuẩn hộ nghèo, hộ cận nghèo áp dụng cho giai đoạn 2011-2015 [17]. Nơng thơn ≤ 400.000/người/ tháng, thành phố ≤ 500.000/ người/ tháng.  Hỏi tiền sử + Tiền sử sản khoa: can thiệp sản khoa (đẻ thường, mổ đẻ, dùng kẹp lấy thai); đẻ non tháng (dưới 37 tuần thai); đủ tháng (37- dưới 42 tuần thai); đẻ già tháng (trên 42 tuần thai); cân nặng thấp (dưới 2,5 kg); đẻ ngạt (sau sinh 1
44 phút khơng khĩc, tím tái hoặc phải cấp cứu thở ơ xy, thở máy), nhiễm trùng sơ sinh (do bệnh viện chẩn đốn). + Tiền sử nuơi dưỡng: bú mẹ hồn tồn trong 6 tháng đầu, nuơi nhân tạo, ăn sam. + Tiền sử tiêm chủng theo chương trình tiêm chủng Quốc gia phịng sáu bệnh: lao, bạch hầu (3 mũi), ho gà (3 mũi), uốn ván (3 mũi), bại liệt (3 lần), sởi (1 mũi). + Tiền sử phát triển: tinh thần, vận động. Đánh giá chậm phát triển dựa vào tiền sử bệnh tật được chẩn đốn bởi bác sỹ chuyên khoa trước đĩ. + Tiền sử bệnh tật: bệnh bẩm sinh (tim, phổi, cơ quan khác), bệnh hơ hấp (hen, dị ứng). Đánh giá dựa vào kết luận của bác sỹ chuyên khoa trước đĩ. + Tiền sử dùng thuốc: trước khi đến viện (nhĩm kháng sinh, số ngày dùng). + Tiền sử gia đình (người sốt ho trong 4 tuần qua, người mắc hen, dị ứng). 2.7.1.2. Cách thức thu thập số liệu mơ tả lâm sàng Mơ tả lâm sàng bệnh viêm phổi thơng qua phỏng vấn bệnh nhân hoặc cha mẹ trẻ. Khám tổng quát phát hiện các triệu chứng và dấu hiệu tồn thân, cơ năng, thực thể.  Các dấu hiệu tồn thân Đánh giá tình trạng ý thức, cân nặng, chiều cao, nhịp thở, mạch, nhiệt độ, SpO2.  Các dấu hiệu cơ năng bao gồm + Ho (thời gian xuất hiện, mức độ, tính chất của ho cĩ đờm hay khơng đờm, diễn biến trong quá trình điều trị). - Ho khan: tiếng ho trong, khơng cĩ đờm - Ho đờm: ho thường xuyên cĩ đờm, cĩ thể khạc ra đờm cĩ màu trong hoặc trắng đục, vàng, xanh. + Sốt (thời gian xuất hiện, mức độ) được định nghĩa là khi thân nhiệt của trẻ ≥ 37,5oC khi cặp nhiệt độ ở nách cộng thêm 0,50c. - Sốt nhẹ: từ 380 đến dưới 3805 - Sốt vừa: từ 3805 đến dưới 390c - Sốt cao: từ 390c trở lên + Khàn tiếng
45  Các dấu hiệu thực thể + Đánh giá dinh dưỡng Phân độ suy dinh dưỡng theo phân loại của WHO 2007 [220]. Chia theo thang điểm Z score - Bình thường từ - 2SD đến + 2SD - Thừa cân > + 2SD - Suy dinh dưỡng (gày cịm) cân nặng < - 2SD Đánh giá theo hướng dẫn của WHO 2006 [219] về đánh giá triệu chứng lâm sàng được xác định như sau: - Thở nhanh, khĩ thở + Thở nhanh: đếm nhịp thở trong 1 phút khi trẻ nằm yên để xác định thở nhanh khi tần số thở tăng lớn hơn tần số thở sinh lý. Nhịp thở ≥ 40 lần/phút với trẻ từ 1 tới 5 tuổi. Nhịp thở ≥ 30 lần/phút với trẻ trên 5 tuổi. + Khĩ thở: là thở khơng bình thường, được mơ tả như: thở nhanh, cĩ tiếng thở khác thường, ngực hay bụng di động khác thường. - Thở gắng sức: phập phồng cánh mũi, co kéo cơ hơ hấp, rút lõm lồng ngực. - Ngừng thở: cơn ngừng thở ngắn hoặc khơng thở. + Tiếng ran ở phổi (phổi cĩ ran hay ran ẩm, nổ, rít, ngáy). Ran ở phổi được đánh giá ở tất cả trường phổi (phía trước, sau, trên dưới, rốn phổi cũng như vùng rìa phổi hai bên). + Thay đổi rung thanh (tăng trong trường hợp viêm phổi cĩ tổn thương đơng đặc, giảm trong trường hợp cĩ tràn dịch màng phổi). + Rút lõm lồng ngực: đối với trẻ dưới 5 tuổi: là dấu hiệu phần dưới lồng ngực lõm vào khi trẻ hít vào. + Các dấu hiệu khác cĩ thể gặp trong viêm phổi do M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila để cĩ thêm những gợi ý lâm sàng hữu ích giúp chẩn đốn những trường hợp viêm phổi M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila. - Phát ban. - Hạch to, thiếu máu.
46 - Rối loạn tiêu hĩa (nơn, tiêu chảy, đau bụng, vàng da). Ỉa chảy: số lần ỉa lỏng trên 3 lần/ ngày. - Rối loạn tim mạch (tim to, tràn dịch màng ngồi tim, rối loạn nhịp tim trên lâm sàng, suy tim cấp do viêm cơ tim). Tim to được đánh giá trên phim chụp tim phổi thẳng, chỉ số tim/ ngực trên 50%. Tràn dịch màng tim: diện tim to trên phim Xquang tim phổi thẳng và siêu âm tim cĩ dịch màng tim. Nhịp tim nhanh: nhịp tim nhanh tính theo lứa tuổi: 12 tháng : trên 120 nhịp/ phút + Rối loạn về thần kinh (kích thích, co giật, hơn mê, liệt). + Rối loạn về huyết học (thiếu máu tan máu, giảm hoặc tăng tiểu cầu).  Chỉ số đánh giá diễn biến bệnh + Thời gian bị bệnh. + Kháng sinh dùng trước khi vào viện (loại kháng sinh, số ngày dùng thuốc). + Kháng sinh dùng trong thời gian nằm viện (loại kháng sinh, số ngày dùng thuốc). + Kháng sinh dùng sau khi ra viện (loại kháng sinh, số ngày dùng thuốc). + Thời gian được dùng kháng sinh đặc hiệu (nhĩm macrolid hoặc tetracyclin, hoặc quinolon). + Thời gian thở ơ xy, thở máy + Thời gian hết triệu chứng lâm sàng + Tiến triển bệnh: khỏi, đỡ, tử vong 2.7.1.3. Cách thức thu thập số liệu cận lâm sàng  Cơng thức máu Được làm tại khoa huyết học của bệnh viện bằng máy ABX Micros ES60 do Nhật Bản sản xuất. Các thơng số bao gồm: số lượng bạch cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu, cơng thức bạch cầu. + Số lượng bạch cầu
47 - Giảm: dưới 4,0 x 109/L. - Bình thường: 4,0 ÷ 8,0 x 109/L. - Tăng: ≥ 8,0 x 109/L [18]. + Thiếu máu: dựa vào nồng độ huyết sắc tố (Hemoglobin-Hb): - Thiếu máu nhẹ: Trẻ 6 tháng tới 6 tuổi: Hb: 90 ÷ 110 g/L. Trẻ từ 6 tới 14 tuổi: Hb: 90 ÷ 120 g/L. - Thiếu máu trung bình: Hb: 60 ÷ 90 g/L. - Thiếu máu nặng: Hb dưới 60 g/L [18].  CRP Xác định bằng phương pháp đo độ đục tại khoa sinh hĩa bệnh viện bằng máy Olympus AU 2700. Giá trị bình thường từ 0- 7 mg/l, gọi là tăng khi CRP ≥ 8 mg/l.  Sinh hĩa máu Khí máu, điện giải đồ, đường, ure, creatinin, ALT, AST nếu bệnh nhân cĩ viêm phổi nặng được thực hiện trên máy GEM 3000 của Mỹ tại khoa Sinh hĩa Bệnh viện Nhi trung ương. Giá trị bình thường của người Việt Nam [5] Khí máu: PH 7,391 ± 0,019 SGOT 13,5 – 28,2 U/l PCO2 38,5 ± 2,47 mmHg SGPT 10,8 – 25,8 U/l SB 29,3 ± 1,2 m mol/l Natri 135 -142 mmol/l BB 47,6 ± 3,01 m mol/l Kali 3,5 – 5 mmol/l BE 0 ± 1.93 mmol/l Chlo 95 – 108 mmol/l Ure 2,5 – 6,7 mmol/l Canxi 2,03 – 2,6 mmol/l Creatinin 44 – 106 µmol/l Canxi ion 1,1 – 1,2 mmol/l Đường 4,4 – 6,1 mmol/l  Định lượng globulin miễn dịch IgA, IgG, IgM, IgE được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch đo độ đục tại khoa sinh hĩa bằng máy Olympus AU 2700, làm cùng thời điểm xét nghiệm cơng thức máu, CRP. +Bệnh phẩm: huyết thanh, huyết tương chống đơng bằng Heparin, EDTA. + Tiến hành: bệnh phẩm được quay ly tâm tách huyết thanh (huyết tương) và phân tích tự động trên máy Olympus AU2700.
48 + Nhận định kết quả: nhận định kết quả giá trị bình thường [44]. Ig A 0,7 -1,7 g/l Ig M 0,93 – 1,56 g/l Ig G 7 – 10,7 g/l  Xét nghiệm huyết thanh học Phát hiện IgM kháng M. pneumoniae, IgM kháng C. pneumoniae và IgM kháng L. pneumophila trong máu tại 2 thời điểm khi vào viện và sau 3 tuần đến 1 tháng. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của Nhà sản xuất Vircell (Spain) dựa trên nguyên lý kỹ thuật miễn dịch gắn men, được tĩm tắt: + Xử lý huyết thanh bệnh nhân Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu được lấy mẫu máu tĩnh mạch vào ngày thứ 7 trở đi kể từ ngày khởi bệnh. Mẫu máu thứ 2 cách mẫu máu thứ nhất ít nhất 2 tuần. Mẫu máu được tách huyết thanh, sau đĩ tiến hành xét nghiệm, kết quả sẽ cho trong vịng 3 giờ. Trong trường hợp chưa thực hiện được xét nghiệm trong vịng 72 giờ thì huyết thanh sẽ được bảo quản ở nhiệt độ âm (từ -200C đến -700C). + Nhận định kết quả Kết quả dương tính được tính tốn theo cơng thức: [OD mẫu/OD giới hạn] x 10 > 11  Multiplex-PCR + Nguyên lý phản ứng Phát hiện đồng thời M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila trong dịch hơ hấp. Kỹ thuật PCR đa mồi được thực hiện để cùng một lúc cĩ thể phát hiện được 1 trong 3 tác nhân vi khuẩn đích (gây viêm phổi khơng điển hình) vì trong PCR đa mồi cả 3 cặp gen mồi đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn cần tìm được sử dụng vì thế cĩ thể xác định đồng thời 1 trong 3 loại vi khuẩn hoặc cả 3 loại vi khuẩn trong bệnh phẩm đường hơ hấp. Khi sản phẩm PCR đa mồi khơng rõ ràng (nghi ngờ), bệnh phẩm sẽ được làm lại bằng PCR đơn mồi hoặc PCR Nested để khẳng định. + Bệnh phẩm Bệnh phẩm đường hơ hấp được lấy bằng tăm bơng (đối với trẻ trên 5
49 tuổi). Dùng tăm bơng miết mạnh khu vực 2 Amidan hoặc thành sau vịm họng, sau đĩ nhúng tăm bơng vào mơi trường vận chuyển đã chuẩn bị sẵn. Đối với trẻ nhỏ dưới 5 tuổi dùng dịch tỵ hầu (phương pháp hút chân khơng). Bộ dụng cụ của mỗi trẻ bao gồm: một sonde hút vơ khuẩn, một bơm tiêm 5 ml, một đơi găng vơ khuẩn. Nghiên cứu viên đã tiến hành đưa sonde qua đường mũi của bệnh nhân, dùng ống thơng plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngồi của bệnh nhân để hút dịch. Sau đĩ, bệnh phẩm được bảo quản trong mơi trường chuyển về phịng xét nghiệm. Tất cả bệnh phẩm được bảo quản ở -70oc cho tới khi tiến hành phân tích. + Các bước tiến hành: - Xử lý bệnh phẩm lấy bằng tăm bơng: xử lý thơ (để bảo quản mẫu, chưa tách DNA). - Tách DNA (sử dụng Kit tách chiết QIAgen hoặc Sepagene) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - Chương trình PCR đa mồi: Chu trình phụ: [960C x 3’; 550C x 45’’; 720C x 1’] x 3 cycles Chu trình chính: [940C x 1’; 550C x 1’; 720C x 1’] x 35 cycles Kéo dài: 720C x 10’; giữ mẫu 150C - Điện di sản phẩm PCR, đọc kết quả trong máy UVP. + Nhận định kết quả: mẫu được xác định là dương tính khi trên điện đồ sản phẩm PCR cho một băng AND duy nhất tương ứng một đoạn gen đặc hiệu cho M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila. Các xét nghiệm được tiến hành tại Phịng xét nghiệm vi khuẩn hơ hấp Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.  X-quang tim phổi Được chụp theo phương pháp kĩ thuật số thực hiện trên máy X-quang Shimadzu R-20J.  Siêu âm phổi màng phổi Thực hiện trên máy siêu âm Toshiba NemioXG khi cĩ nghi ngờ tràn dịch màng phổi.
50  CT scanner lồng ngực Thực hiện trên máy GE hispeed khi cĩ tổn thương nghi ngờ u, nang hoặc hỗn hợp.  Nuơi cấy vi khuẩn từ dịch tỵ hầu bằng phương pháp cấy đếm Bệnh phẩm được nuơi cấy và phân lập theo qui trình của WHO. + Bệnh phẩm Chất dịch hơ hấp lấy bằng cách hút chân khơng nhẹ: cách này thay thế cho cách ngốy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thơng plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngồi của bệnh nhân để hút dịch. + Các bước tiến hành Bệnh phẩm được bảo quản vào ống nghiệm vơ khuẩn và đưa ngay tới phịng xét nghiệm, được pha lỗng với nồng độ 10-2 10-3 10-4 10-510-6 10-7. Sau đĩ bệnh phẩm pha lỗng được nuơi cấy trên mơi trường thạch máu 5%, thạch socola. Kết quả đọc sau 24 - 48 giờ. + Nhận định kết quả: kết quả được gọi là dương tính khi số lượng vi khuẩn đạt ≥107 CFU/ml.  Xét nghiệm virus đường hơ hấp Vi rút RSV, cúm AB, Rhinovirus, Adenovirus được phát hiện bằng kỹ thuật RT- PCR thực hiện tại phịng nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh nhiễm trùng – Bệnh viện Nhi Trung ương. + Bệnh phẩm Chất dịch hơ hấp lấy bằng cách hút chân khơng nhẹ: cách này thay thế cho cách ngốy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thơng plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngồi của bệnh nhân để hút dịch. + Các bước tiến hành: Bệnh phẩm được bảo quản trong mơi trường vận chuyển theo quy trình, mang đến khoa vi sinh và giữ ở nhiệt độ - 700. Tiến hành kỹ thuật RT- PCR dựa trên primer của Carla Osiwy (1998). Trong kỹ thuật này chúng tơi áp dụng phản ứng sử dụng Taqman probe.
51 - Bước 1. Tiến hành tách genome: ARN của virut được tách triết bằng bộ Qiamp Viral RNA Mini kit. - Bước 2. Tiến hành chạy PCR trên máy Biorad. Các thành phần của phản ứng RT-PCR được tiến hành theo Kit SuperSckip III One- Step của hãng Invitrogen, chu trình nhiệt được tiến hành trên máy iCycler của Biorad. - Bước 3. Lấy sản phẩm PCR điện di trên Gel Garose, đọc kết quả. + Nhận định kết quả: Mẫu được xác định là dương tính khi trên điện đồ sản phẩm PCR cho một băng ARN duy nhất tương ứng một đoạn gen đặc hiệu cho RSV, Rhinovirus, Adenovirus hoặc virut cúm. 2.7.2. Các chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 2 Các chỉ số liên quan đến mức độ nặng của viêm phổi khơng điển hình do 3 loại vi khuẩn nghiên cứu: + Mối liên quan giữa thời gian từ khi khởi bệnh đến khi nhập viện với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa loại kháng sinh dùng trước khi nhập viện với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa các dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa các thể lâm sàng viêm phổi với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa các bệnh đi kèm với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa tình trạng dinh dưỡng, tiêm chủng, các bệnh đi kèm với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu, CRP, cytokin IL6, tình trạng miễn dịch (IgA, IgM, IgG, IgE) với mức độ nặng của bệnh. + Mối liên quan giữa tình trạng đồng nhiễm vi khuẩn khác, vi rút với mức độ nặng của bệnh (dự kiến đây là yếu tố chính cĩ liên quan đến tình trạng nặng của bệnh).
52 2.8. Phương tiện nghiên cứu Mẫu bệnh án nghiên cứu (theo phụ lục 3). Phần mềm thu thập số liệu EpiData 3.1. Phần mềm phân loại suy dinh dưỡng WHO Anthro 2007 Phần mềm phân tích số liệu Stata 10, SPSS 13. 2.9. Phương pháp xử lý số liệu nghiên cứu Thống kê mơ tả: Các biến số định lượng được kiểm tra phân phối của số liệu. Đối với các biến định lượng cĩ phân bố chuẩn, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được sử dụng để trình bày. Đối với các biến định lượng khơng cĩ phân bố chuẩn, giá trị trung vị và các phạm vi (giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất) được sử dụng để trình bày. Các biến số phân loại được trình bày bằng bảng phân bố tần số và tỷ lệ phần trăm. Thống kê phân tích Kiểm định t khơng ghép cặp được sử dụng để so sánh hai giá trị trung bình. Kiểm định χ2, Fisher exact test được sử dụng để so sánh các tỷ lệ. Tính tỷ suất chênh OR để tìm hiểu mối liên quan giữa các yếu tố liên quan đã được trình bày ở trên và tình trạng nặng của bệnh. Hồi quy logistics được sử dụng để xác định mối liên quan giữa các yếu tố với tình trạng nặng của bệnh để khống chế gây nhiễu. Kiểm định Hosmer-Lemeshow được sử dụng để kiểm định tính phù hợp của mơ hình. Mơ hình được xem là phù hợp khi giá trị p của kiểm định này lớn hơn 0,05. Các kiểm định thống kê được thực hiện với mức ý nghĩa 5%. 2.9.1. Ước tính tỷ lệ mắc bệnh trong nghiên cứu dịch tễ học, lâm sàng
53 2.9.2. Tỷ suất chênh (OR) trong nghiên cứu mơ tả loạt bệnh Tỷ suất chênh là số đo dùng để so sánh độ chênh của bệnh xảy ra trong nhĩm phơi nhiễm và khơng phơi nhiễm. Cơng thức tính OR đối với các mẫu độc lập: Độ chênh của phơi nhiễm trong nhĩm bệnh ad OR = . = Độ chênh của phơi nhiễm trong nhĩm khơng bệnh bc Trong đĩ: - a: là số cá thể cĩ phơi nhiễm và mắc bệnh. - b: là số các thể cĩ phơi nhiễm và khơng mắc bệnh. - c: là số cá thể khơng phơi nhiễm và mắc bệnh. - d: là số cá thể khơng phơi nhiễm và khơng mắc bệnh. 2.9.3. Khoảng tin cậy (CI) của tỷ suất chênh OR Khoảng tin cậy 95% đối với OR nĩi lên rằng nhà nghiên cứu cĩ thể tin đến 95% là khoảng tin cậy tính được cĩ chứa giá trị thật của OR trong quần thể nghiên cứu từ đĩ mẫu được rút ra. 2.9.4. Kiểm định giả thuyết dùng OR - Khả năng mắc viêm phổi khơng điển hình nặng ở các trẻ cĩ phơi nhiễm với yếu tố liên quan lớn hơn OR lần khả năng mắc viêm phổi khơng điển hình nặng ở các trẻ khơng phơi nhiễm với yếu tố liên quan. - Khi trị số của OR khác 1 thì cĩ sự liên quan giữa viêm phổi khơng điển hình nặng và yếu tố liên quan. Trị số OR càng lớn thì sự kết hợp giữa viêm phổi khơng điển hình nặng và yếu tố liên quan càng mạnh. - Khi khoảng tin cậy khơng chứa 1 thì ta loại bỏ giả thuyết Ho, nghĩa là “sự kết hợp giữa yếu tố liên quan và viêm phổi khơng điển hình nặng cĩ ý nghĩa thống kê ở ngưỡng xác suất p (p < 0,05 nếu là khoảng tin cậy 95%)”. Nếu khoảng tin cậy quá rộng thì ít cĩ giá trị thực tế, cần thận trọng khi phiên giải kết quả. - Khi trị số của OR = 1 thì khơng cĩ sự kết hợp giữa viêm phổi nặng và yếu tố liên quan vì độ chênh của phơi nhiễm trong nhĩm nặng sẽ bằng độ chênh của phơi nhiễm trong nhĩm khơng nặng. - Khi OR nhỏ hơn 1 thì cĩ kết hợp âm tính (nghĩa là cĩ hiệu quả bảo vệ) giữa yếu tố liên quan và viêm phổi khơng điển hình nặng.
54 2.9.5. Trắc nghiệm chính xác Fisher’s Trắc nghiệm chính xác Fisher’s dùng để so sánh các tỷ lệ dưới dạng dữ kiện nhị thức và với bất kỳ cỡ mẫu nào, cho giá trị chính xác của p trong khác biệt quan sát. 2.9.6. Mơ hình hồi quy đa biến Logistic Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố liên quan tới viêm phổi khơng điển hình nặng bằng mơ hình hồi quy logistic. Phân tích đa biến: các yếu tố liên quan được tìm thấy trong phân tích đơn biến tiếp tục đưa vào phân tích đa biến bằng phương pháp từng bước (step - wise approach) để loại các yếu tố gây nhiễu, đồng thời xác định xem yếu tố liên quan nào trong nhĩm gĩp phần tăng khả năng mắc viêm phổi khơng điển hình nặng 2.10. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu được thơng tin và giải thích rõ ràng về mục đích, quyền lợi và nghĩa vụ khi tham gia vào nghiên cứu. - Nghiên cứu dựa trên các biện pháp chẩn đốn và điều trị truyền thống đúng quy định của Bộ Y tế, khơng gây nguy hiểm thêm cho bệnh nhân - Chỉ nghiên cứu những đối tượng tự nguyện tham gia. - Đảm bảo bí mật của người cung cấp thơng tin. - Thơng báo kết quả cho người tham gia nghiên cứu biết. - Kết quả nghiên cứu chỉ phục vụ cho sức khỏe cộng đồng và bệnh nhân, ngồi ra khơng nhằm mục đích nào khác. - Việc tiến hành nghiên cứu cĩ xin phép và được sự chấp thuận của Hội đồng chấm đề cương luận án của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Hội đồng y đức của Bệnh viện Nhi Trung ương.
55 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng của bệnh viêm phổi khơng điển hình do vi khuẩn ở trẻ em Nghiên cứu sàng lọc trên 722 bệnh nhi viêm phổi chung đến khám và điều trị tại khoa Hơ hấp Bệnh viện Nhi Trung ương, kết quả phát hiện 215 trường hợp viêm phổi khơng điển hình do các vi khuẩn M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila gây nên. 3.1.1. Đặc điểm dịch tễ học chung của viêm phổi khơng điển hình 3.1.1.1. Tỷ lệ các loại viêm phổi chung Bảng 3.1. Tỷ lệ các loại viêm phổi chung Loại viêm phổi Số lượng Tỷ lệ % Viêm phổi điển hình do vi khuẩn 82 11,35 Viêm phổi do virus 80 11,08 Viêm phổi điển hình do vi khuẩn phối hợp virus 14 1,93 Viêm phổi khơng điển hình do vi khuẩn 215 29,8 Viêm phổi khơng rõ căn nguyên 331 45,84 Tổng cộng 722 100 Tỷ lệ mắc viêm phổi khơng điển hình trong tổng số các trường hợp viêm phổi chung là 29,8%.
56 3.1.1.2. Phân loại các trường hợp viêm phổi theo tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình Bảng 3.2. Phân loại viêm phổi khơng điển hình Phân loại viêm phổi khơng điển hình Số lượng Tỷ lệ % VPKĐH đơn thuần: do hoặc M. pneumoniae, 144 67 hoặc C. pneumoniae, hoặc L. pneumophila VPKĐH VPKĐH đồng nhiễm trong nhĩm: do M. 10 4,63 trong nhĩm pneumoniae và C. pneumoniae hoặc M. 4,63 pneumoniae và L. pneumophila hoặc C. pneumoniae và L. pneumophila VP khơng điển hình do vi khuẩn + VP điển hình 38 17,6717,67 do vi khuẩn VPKĐH 8,84 đồng nhiễm VP khơng điển hình do vi khuẩn + VP do virut 19 8,84 ngồi nhĩm 1,86 VP khơng điển hình do vi khuẩn + VP điển hình 4 1,86 do vi khuẩn + VP do virut Tổng số 215 100 Tỷ lệ đồng nhiễm là 33%, trong đĩ đồng nhiễm với vi khuẩn khác và vi rút chiếm tỷ lệ 28,37% (Bảng 3.2). Bảng 3.3. Phân loại các trường hợp viêm phổi theo tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi khơng điển hình (n=215) Loại nhiễm(*) M. pneumoniae C. pneumoniae L. pneumophila Tổng Đơn nhiễm 175 13 12 200 Đồng nhiễm 15 M. pneumoniae + 14 14 0 14 C. pneumoniae M. pneumoniae + 1 0 1 1 L. pneumophila C. pneumoniae + 0 0 0 0 L. pneumophila M. pneumoniae + 0 0 0 0 C. pneumoniae + L. pneumophila Tổng số nhiễm 190 27 13 215 Tỷ lệ %( Số nhiễm/ 722) 26,3 3,7 1,8 29,8 (*) Các mẫu cĩ thể nhiễm vi khuẩn khác hoặc vi rút Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh chủ yếu do M. pneumoniae là 26,3%; C. pneumoniae và L. pneumophila phát hiện được với tỷ lệ thấp (3,7%; 1,8%).
57 3.1.1.3. Phân bố viêm phổi khơng điển hình theo tuổi Bảng 3.4. Tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình phân bố theo tuổi Bệnh nhân dương tính VPKĐH Số bệnh Tuổi nhân được Số BN Tỷ lệ % xét nghiệm 2 đến 5 tuổi 133 47 35,3 > 5 đến 10 tuổi 66 39 59,1 > 10 tuổi 21 9 42,8 Tổng 722 215 29,8 Kết quả bảng 3.4 xét trong 722 bệnh nhân được sàng lọc cho thấy viêm phổi khơng điển hình gặp ở mọi lứa tuổi, trong đĩ lứa tuổi thường gặp nhất là trẻ từ 5 – 15 tuổi, đặc biệt nhĩm tuổi 5 -10 tuổi gặp tỷ lệ cao nhất. Viêm phổi điển hình viêm phổi khơng điển hình 60 54.24 50 37.67 40 35.7 35.81 30 22.33 Tỷ% lệ 20 7.5 10 2.56 4.19 0 Dưới 2 tuổi >2 tuổi - 5 tuổi >5 tuổi - 10 tuổi > 10 tuổi Biểu đồ 3.1. Phân bố theo tuổi của viêm phổi điển hình và khơng điển hình (n = 722) Tại biểu đồ 3.1, nhĩm viêm phổi điển hình, tỷ lệ trẻ mắc cao nhất là ở nhĩm dưới 2 tuổi, trong khi tỷ lệ nhĩm từ 5 tuổi trở lên thấp hơn rất nhiều (khoảng 10%). Tuy nhiên, ở nhĩm viêm phổi khơng điển hình, tỷ lệ trẻ trên 5 tuổi mắc bệnh khá cao, chiếm 26,5%. Tần suất mắc theo tuổi trong nhĩm dương tính cao hơn ở nhĩm dưới 5 tuổi. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,001).
58 3.1.1.4. Phân bố theo giới 59% Nam N÷ 41% Biểu đồ 3.2. Phân bố bệnh nhân theo giới( n = 215) Biểu đồ 3.2 cho thấy tỷ lệ nhiễm viêm phổi khơng điển hình ở trẻ nam và nữ khơng cĩ sự khác biệt (p = 0,378; χ2 test). 3.1.1.5. Phân bố theo mùa Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ nhiễm viêm phổi khơng điển hình theo mùa (n= 145) Biểu đồ 3.3 cho thấy bệnh gặp ở cả bốn mùa, trong đĩ mùa xuân - hè mắc cao hơn mùa thu – đơng. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê p=0,003 ( χ2 test).
59 3.1.1.6. Phân bố theo các tháng trong năm Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ nhiễm viêm phổi khơng điển hình theo tháng trong năm ( n= 145) Biểu đồ 3.4 cho thấy bệnh viêm phổi khơng điển hình gặp quanh năm, cao nhất vào tháng 3,6,10. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,0001; Fisher exact test).
60 3.1.1.7. Đặc điểm gia đình của bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình Bảng 3.5. Đặc điểm gia đình của bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình Số lượng Đặc điểm Tỷ lệ % (n = 215) Địa dư Nơng thơn 87 40,47 Miền núi 23 10,7 Thành phố 105 48,84 Học vấn bố ≤ THPT 153 71,16 Trên THPT 62 28,84 Học vấn mẹ ≤ THPT 154 71,63 Trên THPT 61 28,37 Nghề nghiệp bố Nơng nghiệp 60 27,91 CBCC 78 36,28 Tự do 77 35,81 Nghề nghiệp mẹ Nơng nghiệp 61 28,37 CBCC 82 38,14 Tự do 71 33,49 Tiếp xúc mơi trường tập thể Cĩ 138 64,19 Khơng 77 35,81 Trong tổng số 215 bệnh nhi mắc viêm phổi khơng điển hình, chỉ cĩ 23 bệnh nhi ở miền núi, chiếm tỷ lệ 10,7% (Bảng 3.5). Hầu hết bố mẹ các bệnh nhân cĩ học vấn trung học phổ thơng và khoảng 2/3 số bệnh nhi tiếp xúc mơi trường tập thể.
61 3.1.1.8. Đặc điểm mơi trường sống của bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình Bảng 3.6. Đặc điểm mơi trường sống của bệnh nhân viêm phổi khơng điển hình Đặc điểm mơi trường sống Số lượng (n=215) Tỷ lệ (%) Khĩi bụi Cĩ 44 20,47 Khơng 171 79,53 Thuốc lá Cĩ 78 36,28 Khơng 137 63,72 Sử dụng điều hịa (trong vịng 1 tháng qua) Cĩ 101 46,98 Khơng 114 53,02 Nguồn nước sử dụng Nước máy 122 56,74 Nước giếng 93 43,26 Bảng 3.6 cho thấy trẻ mắc viêm phổi khơng điển hình sống trong mơi trường cĩ khĩi bụi là 20,47%. Trẻ sống trong mơi trường cĩ tiếp xúc khĩi thuốc lá mắc bệnh là 36,28%. Một nửa số trẻ mắc bệnh viêm phổi khơng điển hình sống trong mơi trường điều hịa trong vịng một tháng trước khi mắc bệnh và sử dụng nguồn nước máy sinh hoạt.
62 3.1.2. Đặc điểm dịch tễ học của viêm phổi khơng điển hình trong nhĩm và viêm phổi khơng điển hình đồng nhiễm ngồi nhĩm. 3.1.2.1. Đặc điểm gia đình Bảng 3.7. So sánh sự khác biệt về đặc điểm gia đình giữa VPKĐH trong nhĩm và VPKĐH đồng nhiễm ngồi nhĩm VPKĐH VPKĐH đồng nhiễm Tổng Trong nhĩm ngồi nhĩm Đặc điểm p Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ 215 n=154 % n=61 % Tuổi 0,27 Dưới 2 tuổi 53 65,43 28 34,57 81 > 2 tuổi – 5 tuổi 55 71,43 22 28,57 77 > 5 tuổi – 10 tuổi 39 81,25 9 18,75 48 > 10 tuổi 7 77,78 2 22,22 9 Giới 0,11 Nữ 69 77,53 20 22,47 89 Nam 85 67,46 41 32,54 126 Địa dư 0,70 Nơng thơn 60 68,97 27 31,03 87 Miền núi 16 69,57 7 30,43 23 Thành phố 78 74,29 27 25,71 105 Học vấn bố 0,62 Tiểu học 18 78,26 5 21,74 23 THCS 32 66,67 16 33,33 48 THPT 57 69,51 25 30,49 82 Trên THPT 47 75,81 15 24,19 62 Học vấn mẹ 0,55 Tiểu học 16 84,21 3 15,79 19 THCS 31 68,89 14 31,11 45 THPT 62 68,89 28 31,11 90 Trên THPT 45 73,77 16 26,23 61
63 VPKĐH VPKĐH đồng nhiễm Tổng Trong nhĩm ngồi nhĩm Đặc điểm Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ p 215 n=154 % n=61 % Nghề nghiệp bố 0,41 Tự do 22 61,11 14 38,89 36 Nơng nghiệp 44 73,33 16 26,67 60 CBCC 56 71,79 22 28,21 78 Khác 32 78,05 9 21,95 41 Nghề nghiệp mẹ 0,36 Tự do 31 63,27 18 36,73 49 Nơng nghiệp 45 73,77 16 26,23 61 CBCC 59 71,95 23 28,05 82 Khác 19 82,61 4 17,39 23 Tiếp xúc mơi trường tập thể 0,79 Cĩ 56 72,73 21 27,27 77 Khơng 98 71,01 40 28,99 138 Tổng số con trong gia đình 0,77 1 con 64 73,56 23 26,44 87 2 con 70 71,43 28 28,57 98 > 2 con 20 66,67 10 33,33 30 Bảng 3.7 cho thấy VPKĐH đồng nhiễm ngồi nhĩm cĩ tỷ lệ cao ở trẻ dưới 2 tuổi, gấp 2 lần so với nhĩm trẻ 5 tuổi -10 tuổi. Tỷ lệ VPKĐH đồng nhiễm ngồi nhĩm ở bệnh nhi sống ở nơng thơn và miền núi cao hơn so với bệnh nhi sống ở thành thị. Bố mẹ làm nghề tự do cĩ con mắc VPKĐH đồng nhiễm ngồi nhĩm cao hơn so với các nghề khác. Gia đình đơng con (trên 2 con) cĩ tỷ lệ mắc VPKĐH đồng nhiễm ngồi nhĩm cao nhất. Tuy nhiên, sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p > 0,05).