›

Khóa luận Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)

pdf 63 trang thiennha21 18/04/2022 4331
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_phan_lap_xac_dinh_cau_truc_cua_mot_so_hop_chat_sap.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÊ THỊ THANH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR. FUSCIDISCUS K. KOMATSU, S. ZHU & S.Q. CAI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÊ THỊ THANH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR. FUSCIDISCUS K. KOMATSU, S. ZHU & S.Q. CAI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa : QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. Nguyễn Thị Duyên 2. PGS.TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng Hà Nội - 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của tôi tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS. Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài khóa luận này. Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được học tập, nghiên cứu tại khoa suốt 5 năm học qua. Cán bộ nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt PGS.TS. Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và trồng cây Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)”, mã số: KHCN-TB.16C/13-18, do ThS. Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm đã hỗ trợ kinh phí để thực hiện nghiên cứu. Gia đình, bạn bè những người luôn luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Dù nhận được nhiều hướng dẫn và giúp đỡ nhưng bài khóa luận này không tránh khỏi những thiết sót. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để bài khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng 4 năm 2018 Sinh viên Lê Thị Thanh @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BLC Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu BuOH Butanol CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Dicloromethan DCMLC Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu DL/DM Dược liệu/Dung môi EtOH Ethanol GLUT4 Protein màng tế bào ở cơ vân, cơ tim, mỡ và mô khác (Glucose transporter type 4) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LPS Lipopolysaccharid M Khối lượng phân tử (Mass) m/z Khối lượng/điện tích MeOH Methanol Mp. Điểm nóng chảy (Melting Point) MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PCA Phản ứng phản vệ thụ động (Passive Cutaneous Anaphylaxis) PRT4 Pseudoginsenosid Rf Hệ số lưu SKĐ Sắc ký đồ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLR4 Receptor của LPS (Tool-Like Receptor) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor) Treg Regulary T cells TT Thứ tự UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible) v/v Thể tích/ Thể tích VKH&CNVN Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam WLC Phân đoạn nước Sâm Lai Châu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam 5 Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam 8 Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam 9 Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam 9 Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam 10 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất LC05 và MR2 26 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1 30 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 4 Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus. 13 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu 20 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng 21 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol 23 Hình 3.4. Sắc ký đồ của MR2 và LC05. 25 Hình 3.5. Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2). 28 Hình 3.6. Kết quả TLC LC07 với phân đoạn butanol. 29 Hình 3.7. Công thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) 32 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 2 1.1.1. Vài nét về chi Panax L. 2 1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 2 1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 3 1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 4 1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 4 1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 10 1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu 11 1.2.1. Đặc điểm thực vật 12 1.2.2. Phân bố 13 1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam 13 1.2.4. Thành phần hóa học 14 1.2.5. Tác dụng sinh học 14 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng 15 2.2. Hoá chất, thiết bị 15 2.2.1. Hoá chất 15 2.2.2. Thiết bị 15 2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 16 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. 2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập 16 2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 17 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol 20 3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu 20 3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết. 22 3.1.3. Hằng số phân lập các hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 24 3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Sâm Lai Châu. 25 3.2.1. Biện luận cấu trúc LC05 25 3.2.2. Biện luận cấu trúc LC07 28 3.3. Bàn luận 32 3.3.1. Về chiết xuất 32 3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế - xã hội ngày càng phát triển và hiện đại hơn, kéo theo đó là nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho con người ngày càng tăng. Một trong những sản phẩm chăm sóc sức khỏe con người đó là dược phẩm. Với sự phát triển của khoa học công nghệ tiến bộ, các nhà khoa học luôn muốn tối ưu hóa công dụng của thuốc và hạn chế tối đa tác dụng phụ của thuốc đó. Một trong các biện pháp hữu hiệu đang được áp dụng đó là tạo ra các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với con người. “Sâm” là từ rất quen thuộc mà hay được dùng để nói về các loài dược liệu quý hiếm thuộc chi Panax L Có lẽ khi nghe đến Sâm ai cũng biết đến những công dụng tuyệt vời của nó như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường huyết [53]. Cũng vì những công dụng đáng nể đó, các loài Sâm luôn được chú trọng tìm kiếm, nghiên cứu và phát triển. Việt Nam nổi tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv), đây là một trong những loài Sâm có hàm lượng saponin rất cao. Năm 2013, Phan Kế Long cùng cộng sự đã phát hiện ra một thứ Sâm mới được đặt tên là Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus), bậc phân loại dưới loài của Sâm Việt Nam ở huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38]. Mặc dù các nghiên cứu sơ bộ cho thấy Sâm Lai Châu cũng chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại những hiệu quả đáng chú ý, song cho đến nay, còn khá ít những nghiên cứu chi tiết về thứ Sâm này. Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus) chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai)” với 2 mục tiêu cần đạt được: 1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n-butanol. 2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  11. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. 1.1.1. Vài nét về chi Panax L. Chi Nhân Sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới hiện đã biết chắc chắn có 14 loài và 1 dưới loài (thứ-var.). Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và Tây-Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P. trifoliatus) [6,32,33]. Vùng Đông Bắc Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây-Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P. notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P. pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) trên thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng, P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14o 15’ vĩ độ Bắc [6]. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P. notoginseng) và Nhân Sâm (P. ginseng) [6]. Ba loài mọc tự nhiên và đang cần phải bảo tồn là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P. stipuleanatus Tsai & Feng) và đặc biệt là Sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) – loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6]. Cho đến gần đây, loại Sâm Lai Châu, một cây thuốc mới, ít được biết đến ở Việt Nam đã được Phan Kế Long cùng cộng sự (2013) xác định gần nhất với thứ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai), một thứ mới cho khoa học của loài Sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv) [38]. 1.1.2. Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. Sâm Việt Nam là một loài mới của chi Panax L., họ Nhân Sâm (Araliaceae), @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  12. là loài thứ 20 thuộc chi Panax được phát hiện trên thế giới và là loài thứ 3 của chi Panax L. được tìm thấy và công bố chính thức ở Việt Nam. Đây là loài đặc hữu của hệ thực vật Việt Nam (Theo Trung tâm Sâm Việt Nam - 1993) [54]. Về phân loại Sâm Việt Nam [53]: - Giới: Plantae - Ngành: Magnoliophyta - Bộ: Apiales - Họ: Araliaceae - Chi: Panax - Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv. - Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu. - Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng 1.1.3. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. Cây thân thảo sống nhiều năm, cao đến 1 m. Thân rễ mập có đường kính 3,5 cm, không có rễ, có củ gần hình cầu, đường kính 5 cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1-4 thân. Thân nhẵn cao 40-80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn, có những rãnh nhỏ dọc theo chiều dọc. Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7-12 cm (ít khi 15 cm). Lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8-14 cm, rộng 3-5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5-2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít khi 8-11) cập dọc theo gân chính và gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn. Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5-2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Tán hoa đường kính 2,5-4 cm, có 50-120 hoa. Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3-4 mm. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%). Quả khi chín thường màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7-10 mm, rộng 4-6 mm [4]. Sâm Việt Nam mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm 15°C-18°C. Sâm Việt Nam có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây Sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  13. lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ Sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây Sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi, tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu Sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của Sâm [53]. Hình 1.1. Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv [55]. 1.1.4. Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. Cây Sâm được phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên, đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700-2000 m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam là có Sâm này. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578 m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 m, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng [53]. 1.1.5. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. Thành phần chủ yếu trong các loài thuộc chi Panax L. nói chung hay Sâm Việt Nam nói riêng là saponin sâm hay còn gọi là ginsenosid. Loại và tỷ lệ ginsenosid khác nhau giữa các loài và giữa các bộ phân của loài. Theo nghiên cứu tổng quan về Sâm Việt Nam – Panax vietnamensis đã công bố gần 50 hợp chất saponin gồm các dẫn xuất của các dạng protopanaxadiol, ocotillol, oleanolic, panaxatriol và dammarenediol [20]. Các cấu trúc saponin này có từ 2-6 phân tử đường, chủ yếu là đường 6 cạnh gồm glucose, xylose và rhamnose. Ngoài các ginsenosid, trong các bộ phận khác nhau của Sâm Việt Nam còn có chứa polyacetylen, polysaccharid, flavonoid, daucosterin, chất nhầy, acid amin, chất đắng, vitamin, cholin, pectin, dầu béo và tinh dầu [4]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  14. 1.1.5.1. Cấu trúc các saponin Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. a. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol. Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam [20] TT Tên R1 R2 Kiểu cấu trúc 2 1 6 1 1 Ginsenosid Rb1 -Glc - Glc -Glc - Glc A 2 1 6 1 2 Ginsenosid Rb2 -Glc - Glc -Glc - Ara(p) A 2 1 6 1 3 Ginsenosid Rb3 -Glc - Glc -Glc - Xyl A 4 Ginsenosid Rc -Glc2-1Glc -Glc6-1Ara(f) A 5 Ginsenosid Rd -Glc2-1Glc -Glc A 6 Gypenosid XVII -Glc -Glc6-1Glc A 7 Notoginsenosid Fa -Glc2-1Glc2-1Xyl -Glc6-1Glc A 2 1 6 1 6 1 8 Notoginsenosid R4 -Glc - Glc -Glc - Glc - Xyl A 2 1 6 2 1 6 9 Quinquenosid R1 -Glc - Glc -Ac -Glc - Glc -Ac A hoặc -Glc2-1Glc hoặc -Glc2-1Glc 10 Yesanchinosid J -Glc2-1Glc -Glc6-1Glc6-1Xyl A 6| Ac 11 Ginsenosid Re -Glc6-1Rha -Glc B 12 Ginsenosid 20- -Glc2-1Glc -Glc B gluco-Rf 13 Ginsenosid Rg1 -Glc -Glc B 14 Ginsenosid 20(S)- -Glc -H B Rh1 15 Ginsenosid Rh5 -Glc -CH3 B @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  15. 2 1 16 Vina-ginsenosid R8 -Glc - Glc -Glc C TT Tên R1 R2 R3 Kiểu cấu trúc 2 1 17 Quinquenosid L2 -Glc - Glc -Glc - D 2 1 18 Notoginsenosid R1 -H -Glc - Xyl -Glc E 6 19 Notoginsenosid R6 -H -Glc -Glc - E 1αGlc 20 Pseudo-ginsenosid -H -Glc2-1Rha -Glc E RS1 6| Ac 2 1 21 Vina-ginsenosid R4 -Glc - Glc -H -Glc E @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  16. Bảng 1.1. Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol trong Sâm Việt Nam (tiếp) TT Tên R1 R2 Kiểu cấu trúc 22 24(S)-Vina- -Glc2-1Glc -Glc F ginsenosid R9 23 24(R)-Vina- -Glc2-1Glc -Glc F ginsenosid R9 (= Majorosid F1) 24 Vina-ginsenosid -Glc2-1Glc -Glc G R13 25 Ginsenosid Rh4 -Glc - H TT Tên R1 R2 Kiểu cấu trúc 26 Ginsenosid 20(R)- -Glc - K Rh1 27 Vina-ginsenosid -Glc -Glc M R25 28 Vina-ginsenosid -Glc - N R12 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  17. b. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol Bảng 1.2. Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol trong Sâm Việt Nam [20] TT Tên R1 R2 2 1 29 24(S)-Majonosid R1 -Glc - Glc -H 2 1 30 24(S)-Majonosid R2 -Glc - Xyl -H 31 Protopanaxatriol oxid II -H -H 2 1 32 24(S)-Pseudo-ginsenosid F11 -Glc - Rha -H 6| Ac 33 24(S)-Pseudo-ginsenosid RT4 -Glc -H 2 1 34 Vina-ginsenosid R1 -Glc - Rha -H 2 1 35 Vina-ginsenosid R2 -Glc - Xyl -H 2 1 4 36 Vina-ginsenosid R5 -Glc - Xyl -αGlc -H 2 1 37 Vina-ginsenosid R6 -Glc - Xyl -H 6 1 αGlc 2 1 38 Vina-ginsenosid R14 -Glc - Xyl -OH @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  18. c. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic trong Sâm Việt Nam [20] TT Tên R1 R2 R3 R4 R5 39 Ginsenosid Ro (= -Glc -H -H -H -Glc Chikusetsusaponin V) 40 Chikusetsusaponin -H -H -H -H -Glc IVa 41 Hemslosid-Ma3 -Glc -Ara(p) -H -H -Glc d. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol Bảng 1.4. Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol trong Sâm Việt Nam [20] TT Tên R1 R2 42 Vina-ginsenosid R10 -Glc -OH 2 1 43 Vina-ginsenosid R11 -Glc - Xyl -OH @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  19. e. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol Bảng 1.5. Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol trong Sâm Việt Nam [20] TT Tên R1 R2 2 1 44 Vina-ginsenosid R3 -Glc -Glc - Glc 1.1.5.2. Cấu trúc các polyacetylen Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là chuỗi C7H15 [18,21,34]. 1.1.6. Tác dụng sinh học của các hợp chất có trong Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv. Do có thành phần chính gồm các ginsenosid cho nên các các dụng sinh học của Sâm hầu hết đều do ginsenosid đem lại. - Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương Sâm Việt Nam liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [1]. - Tác dụng chống trầm cảm Sâm Việt Nam có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50-100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, majonosid R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2; 12,5 mg/kg [1]. - Tác dụng tăng sinh lực Sâm Việt Nam có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [1]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  20. - Tác dụng sinh thích ứng + Trong stress vật lý, cho chuột nhắt uống Sâm Việt Nam liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37°C-42°C) và lạnh (- 5°C) làm kéo dài thời gian sống thêm cả chuột thí nghiệm [1]. + Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm Natri barbital giảm đi 30%. Sâm Việt Nam liều uống 50-100 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid R2 tiêm trong màng bụng liều 3,2; 12,5 mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [1]. - Tác dụng chống oxy hóa Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não, gan và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin Sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05-0,5 mg/ml có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [1]. - Tác dụng kích thích miễn dịch Bột chiết Sâm Việt Nam liều uống 500 mg/kg và majonosid R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng [1]. Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm và majonosid R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm tăng tác dụng thực bào với E. coli [1]. - Tác dụng phục hồi máu Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, Sâm Việt Nam có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm [1]. - Các tác dụng dược lý khác Sâm Việt Nam còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan, có tác dụng chống viêm và ức chế sự phát triển vi khuẩn Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [1]. 1.2. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu – Sâm Lai Châu Năm 2003, Zhu và cộng sự đã mô tả một thứ mới có tên khoa học Panax @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  21. vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai, bậc phân loại dưới loài của Panax vietnamensis. Thứ này được phát hiện tại vùng Jinping, phía nam tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Gần đây Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã phát hiện thứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai Châu, Việt Nam và được gọi tên là Sâm Lai Châu [38]. 1.2.1. Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm. Cây mang hoa cao khoảng 0,5-0,8 m. Thân rễ nạc, dài 15-20 cm hoặc hơn. Thân mọc thẳng, hình trụ, đường kính 5-8 mm, lõi thân xốp. Lá kép chân vịt, mọc vòng (3)-4(5-6) lá ở ngọn thân với 5-(6-7) lá chét. Các lá chét không đều nhau, lá ở giữa to và nhỏ dần sang hai bên. Cuống lá dài 7-12 cm, có khi lên tới 14 cm, không có lá kèm hoặc lá kèm nhỏ. Cuống lá chét dài (0,3)-0,8- 1,4 cm, gốc có lông hình móc, dài khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, kích thước 8-12 x 2,5-3 cm. Mũi lá nhọn, dài 1,5-2 cm. Gốc lá hình nêm, mép lá khía răng cưa. Lá có (6)-8-(10) cặp gân, gân chính và các gân bên đều phủ lông hình móc thưa, dài khoảng 2 mm. Cụm hoa tán đơn hình cầu, đường kính 2,5-4 cm, mang khoảng 50- 120 hoa. Cuống tán hoa dài 25-35 cm. Cuống hoa dài 1,5-2 cm. Hoa màu xanh nhạt hay vàng nhạt, mẫu 5, hiếm khi mẫu 6. Đài hoa hình tam giác, dài khoảng 0,2 mm. Tràng thuôn, rời nhau, dài khoảng 2 mm. Đế hoa lúc đầu hơi lồi, sau phẳng và sẫm màu dần. Nhị hoa màu trắng, hơi thò. Chỉ nhị hình sợi mảnh, dài khoảng 2,5 mm. Bầu 2 ô, 2 vòi nhụy, phát triển thành quả, 1 ô thường tiêu biến. Quả dẹt, kích thước 7 x 6 mm, màu nâu đỏ đến nâu tím với núm nhụy màu đen khi chín [38]. Sâm Lai Châu ra hoa vào tháng 6-7, quả trưởng thành vào tháng 10-11, quả chín vào tháng 5-6 năm sau [38]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  22. Hình 1.2. Hình ảnh của Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus [38]. 1.2.2. Phân bố Sâm Lai Châu xuất hiện trong giới hạn diện tích nhỏ của huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu. Chúng được tìm thấy trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ [38]. Sâm Lai Châu phân bố ở độ cao 1900 m, thuộc phần trên của đai núi thấp và phần dưới của đai núi cao. Nơi đây có độ tàn che ít nhất 70%, bao gồm các loài cây phổ biến thuộc các họ: Orchidaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae, Moraceae, Fagaceae, Acanthaceae và Fabaceae. Các loại đá mẹ ở đây là sa thạch rắn biến chất sâu sắc pha trộn với đá phiến sét [38]. 1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam Theo Phan Kế Long và cộng sự (2014), hai thứ Sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh, P. vietnamensis Ha & Grushv. var. vietnamensis) của loài Sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv) có quan hệ chị em [3]. Cụ thể khi so sánh khoảng cách di truyền giữa loài Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam (hay Sâm Ngọc Linh) thì khoảng cách di truyền rất thấp (0,7%) và số vị trí nucleotide sai khác của 2 loài này là 4 nucleotide [7]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  23. 1.2.4. Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm Lai Châu còn rất hạn chế. Theo nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004), phần thân rễ Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidiscus có chứa các hợp chất ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, notoginsenosid R2, majonosid R2, ginsenosid Ro [20,52]. Ngoại trừ notoginsenosid R2, các ginsenosid Rb1, ginsenosid Rc, ginsenosid Rd, ginsenosid Re, ginsenosid Rg1, ginsenosid Ro cũng là những thành phần hóa học có chứa trong Sâm Việt Nam (mục 1.1.5). Bảng 1.6. Cấu trúc hóa học của notoginsenosid R2 Tên R1 R2 R3 R4 TLTK 2 1 Notoginsenosid R2 -H -Glc - Xyl -H -H [20,52] 1.2.5. Tác dụng sinh học Theo tìm hiểu các nghiên cứu, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác dụng sinh học của Sâm Lai Châu. Tuy nhiên, dựa vào kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm Lai Châu [52] và các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền giữa Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam [3,7] ta có thể cho những dự đoán rằng Sâm Lai Châu cũng có các tác dụng sinh học tương tự như Sâm Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  24. CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng - Dược liệu nghiên cứu là thân rễ của Sâm Lai Châu được cung cấp bởi Chủ nhiệm đề tài KHCN-TB.16C/13-18, ThS. Phạm Quang Tuyến vào tháng 10/2016. Dược liệu thu về được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50oC đạt độ ẩm khoảng 5%, xay nhỏ và bảo quản trong túi nylon kín làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học. 2.2. Hoá chất, thiết bị 2.2.1. Hoá chất Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: Cồn 70%, nước cất hai lần, dung môi n-butanol, methanol, aceton, dicloromethan. Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.). Chất hấp phụ SephadexTM LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ). Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất. 2.2.2. Thiết bị - Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI). - Tủ sấy Memmert, Binder-FD115. - Bếp điện, bếp đun cách thủy. - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR. - Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV. - Máy siêu âm Power sonic 405. - Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary, Khoa phân tích - Viện Dược liệu. - [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  25. - Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN. 2.3. Phƣơng pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập Thân rễ Sâm Lai Châu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70%. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc. Cao này được hòa lại với nước và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần dicloromethan, n- butanol thu được các phân đoạn tương ứng. Các hợp chất trong thân rễ Sâm Lai Châu được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp. Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp. Tiến hành: + Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải. + Chuẩn bị cột: cột sắc ký rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Lót một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch. Mở khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột. Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-10 giờ). Chú ý không được để cột bị khô dung môi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  26. + Nạp mẫu lên cột: Nạp mẫu khô: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột. Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ nhàng dọc quanh thành cột. Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt cột. + Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải. Dịch rửa giải được hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau. Các phân đoạn chứa chất được tinh chế. 2.3.2. Phƣơng pháp xác định và nhận dạng cấu trúc Đối với các hợp chất tinh khiết được phân lập thường sử dụng các phương pháp phổ hiện đại kết hợp với các đặc trưng hóa lý và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố của các chất đã biết để xác định cấu trúc. - Các đặc trưng hóa lý gồm: điểm chảy. - Các phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1H và 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối (MS), a. Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [8]. b. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C ) được đặt trong một @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  27. từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay [8]. Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-240 ppm [8]. Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton [8]. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [8].  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  28. proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba tới 7 đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó [8]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử [8]. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) [8].  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [8]. Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [8]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  29. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết các phân đoạn Sâm Lai Châu và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol 3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Sâm Lai Châu 800 g Sâm Lai Châu được xay nhỏ chiết ngấm kiệt với cồn 70%, tại nhiệt độ phòng, với tỉ lệ DL/DM: 1/10, 3 lần, mỗi lần một tuần. Sau đó, gộp dung môi và cô áp suất giảm thu được cao tổng (365 g, hiệu suất chiết so với dược liệu khô là: 45,63%). Sau đó, chiết phân đoạn 3 lần 350 g cao tổng với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: dicloromethan (DCM) và butanol (BuOH). Gộp dung môi và cô dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn DCM (DCMLC: 3,2 g), phân đoạn butanol (BLC: 150,2 g) và phân đoạn nước (WLC: 195,0 g) được biểu diễn như hình 3.1. Bột Sâm Lai Châu (800 g) Cồn 70%, DL/DM:1/10 Ngấm kiệt x 3,3 tuần, To phòng Cao tổng (365 g) Hòa 350 g cao tổng với 2 lít nước Chiết phân lớp 3x với DM: DCM/ BuOH (1/1) Gộp DM cô dưới áp suất giảm Loại bỏ DCM Loại bỏ butanol Cao DCM Cao BuOH Cao nước (DCMLC: 3,2 g) (BLC: 150,2 g) (WLC: 195,0 g) Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  30. Sau khi chiết phân đoạn, tiến hành TLC (xem hình 3.2) để so sánh Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam. Kết quả TLC và sơ đồ chiết cho một số kết quả sau: + Kết quả chiết cao phân đoạn cho thấy hàm lượng cao phân đoạn butanol có hàm lượng cao thứ hai và thấp hơn so với phân đoạn nước nhưng kết quả TLC (với hệ dung môi đặc trưng để phát hiện các saponin trong Sâm) thì số lượng các vết chất nhiều nhất. Mặt khác định hướng nghiên cứu phân lập các saponin chính nên nhóm đề tài hướng đến việc phân lập các hợp chất có trong phân đoạn butanol. + Kết quả TLC cho thấy số lượng vết chất cũng như mức độ đậm của từng vết chất ở hai thứ Sâm Lai Châu và Sâm Việt Nam tuy có sự khác nhau nhất định nhưng có thể nhận thấy rằng, cả hai đều chứa một số vết có Rf tương đương. A B 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát hiện bằng thuốc thử H2SO4 trong cồn tuyệt đối, hơ nóng. Hệ dung môi: BuOH-acid acetic-Nước (5:4:1) Trong đó: Hình A: SKĐ phát hiện tại UV 366 nm Hình B: SKĐ phát hiện tại ánh sáng thường 1: Cao phân đoạn nước Sâm Lai Châu 4: Cao phân đoạn dicloromethan Sâm 2: Cao tổng Sâm Lai Châu Lai Châu 3: Cao phân đoạn butanol Sâm Lai Châu 5: Cao phân đoạn butanol Sâm Việt Nam @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  31. 3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết. 120 g cao phân đoạn butanol Sâm Lai Châu tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH-H2O (100%-5:1:0,01-0:2:1) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là: BLC1-7. Tiếp tục sắc ký cột pha thường phân đoạn BLC4 (5,2 g) với hệ dung môi DCM-MeOH-H2O (3:1:0,01) thu được 3 phân đoạn ký hiệu là: BLC4.1-4.3. Phân đoạn BLC4.1 được tiến hành sắc ký cột pha đảo C18 với hệ dung môi MeOH-H2O (1:3) thu được hợp chất LC05 (7,8 mg). Phân đoạn BLC7 (240 mg) được tiến hành tiến hành sắc ký cột mini với chất hấp phụ silica gel RP-18, hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (3:1), kết tinh lại thu được hợp chất LC07 (4,8 mg). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  32. Cao BLC (120 g) - CC: silica gel - DM: DCM/MeOH/H2O (100%-5/1/0,01-0/2/1) BLC1 BLC4 BLC7 (5,2 g) (240 mg) - CC: silica gel - DM: DCM/MeOH/H2O (3/1/0,01) - CC: RP18 - DM: MeOH/H2O (3/1) BLC4.1 BLC4.2 BLC4.3 - CC: RP18 - DM: MeOH/H2O LC07 (1/3) LC05 (4,8 mg) (7,8 mg) Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol 23 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  33. 3.1.3. Hằng số phân lập các hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu Hợp chất LC05: phân lập được dạng bột vô định hình không màu, có Mp. 181-183ºC. ESI-MS m/z: 787,5 [M+H]+ 1 H-NMR (500MHz, methanol-d4) δH: 4,89 (d, J = 7,5 Hz, H1΄΄), 4,47 (d, 7,5Hz, H1΄), 3,84 (overlap, H24), 4,12 (dd, J = 4,0 & 7,5Hz, H6), 3,13 (t, J = 15,5Hz, H3), 3,48 (overlap, H12), 1,01 (s, H28), 1,20 (s, H21), 1,14 (s, H27), 1,13 (s, H26), 1,01 (s, H29), 1,34 (s, H19), 1,29 (s, H30), 0,99 (s, H18). 13 C-NMR (125MHz, methanol-d4) δC: 103,9 (C1΄΄), 103,8 (C1΄), 88,9 (C24), 88,5 (C20), 80,6 (C2΄), 79,6 (C6), 77,6 (C3), 79,4 (C3΄), 75,6 (C2΄΄), 78,3 (C3΄΄), 80,0 (C5΄), 66,9 (C5΄΄), 71,3 (C12), 71,3 (C25), 71,3 (C4΄), 72,1 (C4΄΄), 62,9 (C6΄), 62,0 (C5), 53,3 (C14), 49,5 (C13), 51,1 (C9), 50,2 (C17), 41,9 (C8), 45,2 (C7), 40,5 (C4), 40,4 (C10), 40,3 (C1), 32,8 (C15), 32,6 (C11), 33,3 (C22), 31,4 (C28), 29,4 (C23), 27,5 (C2), 26,5 (C21), 29,1 (C27), 26,2 (C16), 26,1 (C26), 16,5 (C29), 17,3 (C19), 18,1 (C30), 18,0 (C18). Hợp chất LC07: phân lập được dạng bột vô định hình màu trắng, Mp. 170- 171ºC. ESI-MS m/z: 1132,2 [M+Na]+ 1 H-NMR (500MHz-CD3OD) δH: 5,16 (1H, t, J = 7,0 Hz, H24), 4,70 (1H, d, J = 8,0 Hz, H1΄), 4,61 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄΄), 4,46 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄΄΄), 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄), 3,81 & 4,09 (2H, dd, 1,5, 6,5 Hz, H6΄΄΄), 3,59 (1H, t, J = 6,5 Hz, H2΄), 3,21 (1H, H3), 3,22 (1H, H12), 1,09 (3H, s, H28), 1,71 (3H, s, H26), 1,39 (3H, s, H21), 1,65 (3H, s, H27), 0,95 (3H, s, H30), 0,88 (3H, s, H19), 0,95 (3H, s, H29), 1,03 (3H, s, H18). 13 C-NMR (125MHz-CD3OD) δC: 132,3 (C25), 126,0 (C24), 91,3 (C3), 84,9 (C20), 71,9 (C12), 57,6 (C5), 52,9 (C17), 52,4 (C14), 51,1 (C9), 49,7 (C13), 40,9 (C8), 40,6 (C4), 40,3 (C1), 37,9 (C10), 36,8 (C22), 35,9 (C7), 31,5 (C11), 30,8 (C15), 28,4 (C28), 27,3 (C2), 27,3 (C16), 25,9 (C26), 23,9 (C23), 22,5 (C21), 19,3 (C6), 18,0 (C27), 17,4 (C30), 16,7 (C19), 16,7 (C29), 16,3 (C18). GlcI: 104,5 (C1΄), 81,1 (C2΄), 77,9 (C3΄), 77,7 (C5΄), 71,9 (C4΄), 62,8 (C6΄). GlcII: 104,9 (C1΄΄), 78,3 (C3΄΄& C5΄΄), 76,3 (C2΄΄), 62,8 (C6΄΄). GlcIII: 98,1 (C1΄΄΄), 75,1 (C2΄΄΄), 78,3 (C3΄΄΄), 71,7 (C4΄΄΄), 76,8 (C5΄΄΄), 70,3 (C6΄΄΄). GlcIV: 105,4 (C1΄΄΄΄), 78,5 (C1΄΄΄΄), 78,3 (C1΄΄΄΄), 75,3 (C1΄΄΄΄), 71,5 (C1΄΄΄΄), 63,1 (C1΄΄΄΄). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  34. 3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ Sâm Lai Châu. 3.2.1. Biện luận cấu trúc LC05 Hợp chất LC05 phân lập được có dạng vô định hình màu trắng, nóng chảy ở o nhiệt độ 181-183 C. Kiểm tra bằng TLC với chất đối chiếu là majonoid R2, kết quả cho thấy sắc ký đồ của hợp chất LC05 và của chất đối chiếu majonosid R2 trùng nhau (hình 3.4). n-BuOH-CH3COOH-H2O CH2Cl2-MeOH-H2O Aceton-nước (4:1:5; lớp trên) (65:35:10; lớp dưới) (1,2:1) Hình 3.4. Sắc ký đồ của MR2 và LC05 1: MR2 2: LC05. A: Phun thuốc thử H2SO4 10%/Ethanol, quan sát dưới ánh sáng thường. B: Phun thuốc thử H2SO4 10%/Ethanol, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm. Phổ khối ESI-MS cho tín hiệu positive tại m/z: 787,5 [M+H]+ cho dự đoán một công thức phân tử là C41H70O14 có giá trị M theo tính toán là 786,5. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất LC05 cho tín hiệu singlet của 8 nhóm methyl tại δH 0,99 (3H, s, H18), 1,34 (3H, s, H19), 1,20 (3H, s, H21), 1,13 (3H, s, H26), 1,14 (3H, s, H27), 1,01 (6H, s, H28, H29) và 1,29 (s, H30). Tín hiệu proton chuyển dịch về trường thấp tại δH 3,13 (1H, t, 15,5Hz, H3), 3,48 (1H, overlap, H12), 3,84 (1H, overlap, H24), 4,12 (1H, dd, 4,0 & 7,5Hz, H6). Phổ 1H-NMR cho 2 tín hiệu anomeric proton tại δH 4,47 (1H, d, 7,5Hz, H-1΄) và 4,89 (1H, d, 7,5 Hz, H- 1΄΄). Hằng số tương tác của các anomeric proton là 7,5 xác định cấu hình β của đường glucose và xylose. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  35. Phổ 13C và DEPT cho tín hiệu 41 carbon gồm: 30 tín hiệu thuộc aglycon là triterpenoid và 11 carbon thuộc phần đường gợi ý cấu trúc của hai đường 5xC và 13 6xC. Mặt khác trên phổ C-NMR cho tín hiệu của hai anomeric carbon tại δC 103,8 và 103,9 và hai tín hiệu hydroxymethylen tại δC 62,9 và 66,9 là hai tín hiệu tương ứng của C-6Glc và C-5Xyl. Phổ DEPT cho xác định 8 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 17 nhóm CH và 6 carbon bậc 4. Các vị trí carbon được xác định thông qua việc phân tích phổ 1D-NMR thực nghiệm và gán các vị trí tương ứng trong dữ liệu phổ của hợp chất majonosid R2 [5,35] (xem bảng 3.1). Như vậy, kết quả phân tích dữ liệu phổ MS, NMR và so sánh kết quả TLC của hợp chất LC05 chính là majonosid R2 có công thức như hình 3.5. Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất LC05 và MR2 a,d Majonosid R2 LC05 T 13C- T 1H-NMRa, b [5] NMR 1H-NMR 13C-NMR DEPT c,b [35] 1 39,5 40,3 CH2 2 27,7 27,5 CH2 3 3,14 (t, J = 10,8Hz) 78,0 3,13 (t, J = 15,5Hz) 77,6 CH 4 40,1 40,5 Cq 5 61,4 62,0 CH 4,12 (dd, J = 4,0 & 6 4,12 (t, J = 7,6Hz) 79,4 79,6 CH 7,5Hz) 7 44,8 45,2 CH2 8 41,0 41,9 Cq 9 50,2 51,1 CH 10 39,5 40,4 Cq 11 32,2 32,6 CH2 12 3,40 (overlap) 70,8 3,48 (overlap) 71,3 CH 13 49,0 49,5 CH 14 52,2 53,3 Cq 15 32,4 32,8 CH2 16 25,8 26,2 CH2 17 49,4 50,2 CH @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  36. 18 0,96(s) 17,7 0,99 (s) 18,0 CH3 19 1,37 (s) 17,1 1,34(s) 17,3 CH3 20 87,0 88,5 Cq 21 26,9 1,20 (s) 26,5 CH3 22 32,5 33,3 CH2 23 28,6 29,4 CH2 24 3,84 (overlap) 88,3 3,84 (overlap) 88,9 CH 25 70,0 71,3 Cq 26 1,14 (s) 26,5 1,13 (s) 26,1 CH3 27 1,14 (s) 28,9 1,14 (s) 29,1 CH3 28 0,99 (s) 31,6 1,01 (s) 31,4 CH3 29 0,99 (s) 16,6 1,01 (s) 16,5 CH3 30 1,32 (s) 17,8 1,29 (s) 18,1 CH3 Glc (1→6) C 1΄ 4,47 (d, J = 7,2Hz) 103,4 4,47 (d, J = 7,5Hz) 103,8 CH 2΄ 79,8 80,6 CH 3΄ 78,7 79,4 CH 4΄ 71,2 71,3 CH 5΄ 80,2 80,0 CH 6΄ 62,8 62,9 CH2 Xyl (1→2) Glc 1΄΄ 4,89 (d, J = 7,2Hz) 104,8 4,89 (d, J = 7,5Hz) 103,9 CH 2΄΄ 75,7 75,6 CH 3΄΄ 78,6 78,3 CH 4΄΄ 71,6 72,1 CH 5΄΄ 67,1 66,9 CH2 a, b c, b đo trong methanol-d4 và máy NMR-400MHz, đo trong pyridine –d5 và máy a, d NMR-400MHz, đo trong methanol-d4 và máy NMR-500MHz . @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  37. Hình 3.5. Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2). 3.2.2. Biện luận cấu trúc LC07 Hợp chất LC07 phân lập được dạng bột màu trắng, có nhiệt nóng chảy tại 170-171ºC. A B A B 1 2 1 2 1 2 1 2 Pha thường, DM: n-BuOH- Pha đảo, DM: MeOH-H2O CH3COOH-H2O (4:1:5, lớp trên) (3:1) Hình 3.6. Kết quả TLC LC07 với phân đoạn butanol Trong đó: 1: BLC 2: LC07 A: Phun thuốc thử H2SO4 10%/Ethanol, quan sát dưới ánh sáng thường B: Phun thuốc thử H2SO4 10%/Ethanol, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  38. Phổ khối ESI-MS cho tín hiệu positive tại m/z 1132,2 [M+Na]+, gợi ý một công thức phân tử C54H92O23 có giá trị M theo tính toán là: 1108 đvC. Hợp chất LC07 thu được chất rắn dạng bột. Phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu chồng chập tại vùng trường cao điển hình của một hợp chất có khung dammaran, trong đó có 8 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δH 1,03 (H-18), 0,88 (H-19), 1,39 (H-21), 1,71 (H-26), 1,65 (H-27), 1,09 (H-28), 0,95 (H- 29) và 0,95 (H-30), một nối đôi thế ba lần với sự có mặt của tín hiệu proton methin tại δH 5,16 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24). Hai tín hiệu của hai nhóm methyl dịch chuyển mạnh về phía trường thấp hơn tại δH 1,71 (H-26) và 1,65 (H-27) gợi ý rằng chúng đều được gắn vào nối đôi. Các tín hiệu proton trong trường thấp δH 3,09-4,57 đặc trưng cho sự có mặt của các proton oxymethin và oxymethylen của 4 phân tử đường cũng như proton oxymethin khác (xem bảng 3.2). Phổ 1H-NMR của hợp chất LC07 cho tín hiệu 4 proton anomeric tại δH: 4,70 (1H, d, J = 8,0 Hz, H1΄), 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄), 4,61 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄΄) và 4,46 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1΄΄΄΄), cho phép xác định cấu trúc của 4 phân tử đường trong phân tử. Hằng số tương tác của các anomeric proton là 7,5 và 8,0 Hz xác định cấu hình beta của các phân tử đường này. Ngoài ra, khi phân tích tương tác của các proton anomeric trên phổ HMBC cho các tín hiệu tương tác như sau: H1΄→C3 (δ 91,3): xác định vị trí liên kết đường tại C3. H1΄΄ →C2΄ (δ 81,1): xác định vị trí liên kết đường của phân tử GlcII tại vị trí C2΄. H1΄΄΄ →C20 (δ 84,9): xác định vị trí liên kết đường GlcIII tại C20. H1΄΄΄΄ →C6΄΄΄ (δ 70,3): xác định vị trí liên kết đường của phân tử GlcIV tại vị trí C6΄΄΄. Như vậy dựa trên kết quả phân tích phổ 1D, 2D-NMR và phổ MS của LC07, kết hợp tài liệu tham khảo [15] có thể kết luận hợp chất LC07 là 3-O-[β-D- glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-[β-D-glucopyranosyl (1→6)-β- D-glucopyranosyl]-3β, 1 2β, 20β- trihydroxydammar-24-ene hay ginsenosid Rb1. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  39. Bảng 3.2. Dữ liệu phổ hợp chất LC07 và Rb1 a b Rb1 LC07 13C- C 13C- NMR 1H-NMR DEPT HMBC NMR [15] 1,03 (1H) 1 39,2 40,3 CH 1,76 (1H) 2 1,75 (1H) 2 26,7 27,3 CH 1,92 (1H) 2 3 89,0 91,3 3,21 (1H) CH C3→H1΄ 4 40,1 40,6 - Cq 5 56,4 57,6 0,80 (1H, brd, J = 11,5 Hz) CH 1,51 (1H) 6 18,5 19,3 CH 1,59 (1H) 1,32 (1H) 7 35,2 35,9 CH 1,59 (1H) 2 8 39,8 40,9 - Cq 9 50,3 51,1 1,50 (1H) CH 10 37,0 37,9 - Cq 1,06 (1H) 11 30,8 31,5 CH 1,60 (1H) 2 12 70,2 71,9 3,22 (1H) CH 13 49,5 49,7 1,75 (1H) CH 14 51,7 52,4 - Cq 1,26 (1H) 15 30,8 30,8 CH 1,83 (1H) 2 2,01 (1H) 16 26,7 27,3 CH 1,36 (1H) 2 17 51,4 52,9 2,31 (1H) CH 18 16,1 16,3 1,03 (3H, s) CH3 19 16,4 16,7 0,88 (3H, s) CH3 20 83,3 84,9 - Cq 21 22,5 22,5 1,39 (3H, s) CH3 1,56 (1H) 22 36,3 36,8 CH 1,82 (1H) 2 2,17 (1H) 23 23,3 23,9 CH 2,07 (1H) 2 24 125,9 126,0 5,16 (1H, t, J = 7,0 Hz) CH 25 131,0 132,3 - Cq 26 25,9 25,9 1,71 (3H, s) CH3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  40. 27 18,1 18,0 1,65 (3H, s) CH3 28 28,2 28,4 1,09 (3H, s) CH3 29 16,7 16,7 0,95 (3H, s) CH3 30 17,5 17,4 0,95 (3H, s) CH3 GlcI 1΄ 105,1 104,5 4,70 (1H, d, J = 8,0 Hz) CH H1΄→ C3 2΄ 83,5 81,1 3,59 (1H, t, J = 6,5 Hz) CH 3΄ 77,9 77,9 3,37 (1H) CH 4΄ 71,5 71,9 3,22 (1H) CH 5΄ 78,1 77,7 3,29 (1H) CH 3,88 (1H) 6΄ 62,8 62,8 CH 3,66 (1H) 2 GlcII 1΄΄ 105,9 104,9 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz) CH H1΄΄→C2΄ 2΄΄ 77,1 76,3 3,24 (1H) CH 3΄΄ 78,3 78,3 3,58 (1H) CH 4΄΄ 71,6 71,6 3,75 (1H) CH 5΄΄ 78,3 78,3 3,23 (1H) CH 3,83 (1H) 6΄΄ 62,7 62,8 CH 3,65 (1H) 2 GlcIII 1΄΄΄ 98,1 98,1 4,61 (1H, d, J = 7,5 Hz) CH H1΄΄΄→C20 2΄΄΄ 74,9 75,1 3,14 (1H, t, J = 8,0 Hz) CH 3΄΄΄ 78,3 78,3 3,58 (1H) CH 4΄΄΄ 71,7 71,7 3,22 (1H) CH 5΄΄΄ 77,1 76,8 3,45 (1H) CH 3,81 (1H, m) 6΄΄΄ 69,7 70,3 CH 4,09 (1H, dd, 1,5, 6,5) 2 GlcIV 1΄΄΄΄ 105,3 105,4 4,46 (1H, d, J = 7,5 Hz) CH H1΄΄΄΄→C6΄΄΄ 2΄΄΄΄ 75,3 75,3 3,23 (1H) CH 3΄΄΄΄ 78,3 78,3 3,55 (1H) CH 4΄΄΄΄ 71,7 71,5 3,75 (1H) CH 5΄΄΄΄ 79,3 78,5 3,58 (1H) CH 3,83 (1H) 6΄΄΄΄ 62,8 63,1 CH 3,63 (1H) 2 a b đo trong pyridine, đo trong CD3OD. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  41. Hình 3.7. Công thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) 3.3. Bàn luận 3.3.1. Về chiết xuất Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt, sử dụng dung môi ethanol 70% như đã trình bày ở trên. Phương pháp này được lựa chọn vì đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, dung môi ethanol dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc, chiết được hầu hết các chất trong dược liệu. Tuy nhiên dung môi này không chọn lọc nên dịch chiết ethanol chứa nhiều nhóm chất khác nhau. Vì vậy, để thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất, dịch chiết ethanol từ dược liệu tiếp tục được chiết phân đoạn thành các phân đoạn dicloromethan, n-butanol, nước. 3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất Sau khi sắc ký cột pha thường và pha đảo từ cao phân đoạn butanol Sâm Lai Châu thu được 2 hợp chất tinh khiết được nhận dạng cấu trúc là: majonosid R2 và ginsenosid Rb1. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2004) [52].  Majonosid R2 Như vậy, trong Sâm Lai Châu có chứa thành phần majonosid-R2 (MR2). MR2 cũng có mặt trong Sâm Việt Nam ở dạng đồng phân 24(S)-majonoside R2. MR2 là saponin thuộc nhóm ocotillol, hàm lượng trong Sâm Việt Nam khá cao, nhưng chỉ có ở phần thân rễ (không có ở phần khí sinh), chiếm tới hơn 5% (khoảng 35-42% hàm lượng saponin tổng số) [50,9]. Đây là loại saponin đặc trưng cho Sâm Việt Nam, không có trong các cây Sâm Panax có giá trị khác như: Nhân Sâm, Tam Thất và Sâm Hoa Kỳ. Dược điển Việt Nam IV quy định dùng MR2 để @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  42. kiểm tra Sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [2]. MR2 có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, là hợp chất tiêu biểu quyết định những tác dụng dược lý đặc thù của Sâm Việt Nam và những tác dụng này đã được công bố qua một số nghiên cứu, điển hình như: - Tác dụng chống viêm Một nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh MR2 đã được chuyển hóa thành pseudoginsenosid RT4 (PRT4) và ocotillol nhờ vi khuẩn ruột người. Do đó, Jeong và cộng sự (2015) đã đo được hiệu quả chống viêm của MR2 và các chất chuyển hóa của chúng trên lipopolysaccharid (LPS) - yếu tố kích thích đại thực bào phúc mạc chuột. MR2, PRT4, và ocotillol ức chế lipopolysaccharid, qua đó ức chế sự kích thích hoạt động của yếu tố sao mã NF-κB gây ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm, yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và interleukin-1 (IL-1). Ba yếu tố này cũng ức chế sự biểu hiện cyclooxygenase-2. Trong đó, ocotillol ức chế mạnh nhất khả năng gây viêm của các đại thực bào. Dựa trên những kết quả này, MR2 đường uống có thể được chuyển hóa thành ocotillol qua PRT4, và các chất chuyển hóa, đặc biệt là ocotillol, có thể ức chế sự viêm bằng cách ức chế sự kết hợp LPS với TLR4 đối với các đại thực bào [22,31]. Ví dụ như ocotillol chuyển đổi có thể cải thiện bệnh viêm đại tràng bằng cách khôi phục sự cân bằng các tế bào Th17/ Treg [31]. - Tác dụng chống stress Trong những con chuột bị stress về tâm lý, MR2 cũng làm giảm đáng kể các rối loạn liên quan đến căng thẳng như: giảm thời gian ngủ, hình thành tổn thương dạ dày) [1,50]. - Tác dụng chống ung thư MR2 cho thấy hoạt động chống khối u mạnh trên da chuột và u gan [50]. Cụ thể MR2 đã thể hiện khả năng chống lại khối u rất mạnh mẽ trên thử nghiệm ung thư giai đoạn 2 ở gan chuột bằng cách sử dụng N-nitrisodiethylamine làm chất khởi tạo và Phenobarbital như chất thúc đẩy. Hơn nữa, MR2 thể hiện hiệu quả ức chế đáng chú ý đối với thử nghiệm ung thư da giai đoạn 2 ở chuột [28,29]. Bên cạnh đó, MR2 cũng có tác dụng ức chế đáng kể đối với kháng nguyên sớm Epstein-Barr (EVB-EA) do Phorbol acetate gây ra [29,50] (EVB-EA là virus gây viêm họng mà 97% dân số thế giới đã từng nhiễm và virus này gây nên nguy cơ ung thư vòm họng). - Tác dụng bảo vệ tế bào gan @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  43. Theo Tran và cộng sự (2001), trong số các hợp chất được phân lập, majonosid R2 - loại saponin chính trong Sâm Việt Nam, cho thấy có hoạt tính bảo vệ gan mạnh, chống lại sự chết tế bào do D-galactosamin (D-GaIN)/tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gây ra ở tế bào gan chuột được nuôi cấy [46].  Ginsenosid Rb1 Kết quả chỉ ra rằng, Sâm Lai Châu có chứa thành phần ginsenosid Rb1. Ginsenosid Rb1 cũng là thành phần có mặt trong Sâm Việt Nam [20]. Không chỉ có mặt trong Sâm Việt Nam, ginsenosid Rb1 cũng là một loại saponin có ở các loài Sâm khác và đã được phân lập xác định hàm lượng. Trong Sâm Việt Nam, hàm lượng Rb1 tích lũy được đều trong toàn cây với mức đáng kể (khoảng 2% ở phần dưới mặt đất và khoảng 1% ở phần khí sinh) [9]. Ginsenosid Rb1 là saponin đóng vai trò quan trọng trong nhiều tác dụng dược lý của các loài sâm. - Tác dụng chống ung thư Trong một nghiên cứu, Wang và cộng sự (2007) đã kiểm tra tính gây độc tế bào của 10 ginsenosid, trong đó có Rb1 phân lập từ quả của P. ginseng, hướng tới các dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm dòng tế bào ung thư vú (ví dụ tế bào MCF-7), dòng tế bào ung thư phổi (ví dụ tế bào H838), và dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (ví dụ các tế bào LNCaP và PC3) [48]. Dựa trên kết quả của nghiên cứu, các ginsenosid Rb1 có ít hoặc không có ảnh hưởng đến tăng trưởng và tăng sinh tế bào. Tuy nhiên, hợp chất K – ginsenosid chuyển hóa của Rb1 cho thấy có độc tính tế bào và ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thư như các tế bào u ác tính B16-BL6 ở chuột và kích hoạt các tế bào hình sao ở gan một cách phụ thuộc liều, hợp chất K làm thay đổi hình thái và gây chết tế bào theo chương trình ở nồng độ trong giới hạn 24-40 mM [30,47]. - Tác dụng ức chế miễn dịch và chống viêm Ginsenosid Rb1 điều biến sự tăng sinh các tế bào lympho gây ra bởi các mitogen lympho bào T và lympho bào B, lipopolysaccharid, cũng như cytokine IL- 2 (kích hoạt mạnh sự tăng sinh tế bào lympho) [16]. Ginsenosid Rb1 cũng tác dụng ức chế mạnh sản xuất TNF-α ở các đại thực bào được kích thích bằng lipopolysaccharid (LPS) [17,42]. Hơn nữa, ginsenosid Rb1 cũng có thể ngăn chặn sự sản sinh các cytokine viêm khác, như IL-6 và IL-1b [42] và do đó Rb1 có tính chống viêm và ức chế miễn dịch in vitro. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  44. - Tác dụng hạ huyết áp Theo Chen và cộng sự (1996), ginsenosid Rb1 gây ra sự tăng sản xuất NO [14]. Với tác dụng là giãn nở các mạch máu và giữ cho máu bơm đều đặn thông qua hệ thống tuần hoàn, NO giúp bảo vệ các mô cơ trơn của mạch máu khỏi sự co thắt có hại, điều hòa sự tái hấp thu nước của cơ thể, giúp duy trì và ổn định huyết áp. Đồng thời khi hệ thống mạch máu được tăng cường, NO có thể làm giảm khối xơ vữa và tiểu huyết cầu, ngăn chặn các khối máu vón mục, làm tăng cường lưu thông máu tự do khắp cơ thể. - Tác dụng trên thần kinh trung ương Ginsenosid Rb1 có tác động lên trên hệ thần kinh trung ương, và có thể điều chỉnh sự dẫn truyền thần kinh [12,41]. Các hệ cholinergic được biết là liên quan đến khả năng học tập, trí nhớ. Scopolamine là chất đối kháng thụ thể cholinergic, nó có thể gây rối loạn chức năng và cơ chế hoạt động của hệ cholinergic dẫn đến thiếu hụt trí nhớ. Kết quả từ các nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng Rb1 ngăn chặn sự thiếu hụt trí nhớ gây ra bởi Scopolamine [13,49]. Ginsenosid Rb1 cũng cho thấy có khả năng đảo ngược tình trạng mất trí nhớ do Scopolamine bằng cách cải thiện hoạt động của hệ cholinergic và có hiệu quả bảo vệ thần kinh [39]. Ginsenosid Rb1 làm gia tăng sự phát triển thần kinh của tế bào thần kinh của vỏ não [27]. Rb1 có thể mở rộng các sợi trục và dây thần kinh trong các tế bào thần kinh cần được bù đắp và sửa chữa mạng lưới thần kinh bị hư tổn, ví dụ, khi bộ não mất trí nhớ [27]. Ginsenosid Rb1 còn được chứng minh bảo vệ neuron khỏi các kích thích độc hại, ví dụ, Glutamate và stress oxy hóa gây ra bởi Hydrogen peroxide và thúc đẩy tăng độ dài sợi trục và số lượng tế bào dopaminergic sau khi tiếp xúc với 1-methyl- 4-phenylpyridinium, là một chất chuyển hóa có hoạt tính chọn lọc độc hại đối với tế bào thần kinh dopaminergic in vitro [39,40]. Ginsenosid Rb1 dường như có thể đảo ngược cái chết của tế bào do 1-methyl-4-phenylpyridinium [43]. Các tác dụng có lợi của ginsenosid Rb1 là chủ yếu làm trung gian thông qua việc dọn các gốc tự do và cải thiện sự chuyển hóa năng lượng [39] cũng như khả năng ngăn chặn sự xâm nhập Ca2+ vào các tế bào thần kinh và ức chế sự hoạt động kênh Na+ [26]. Do khi Ca2+ đi vào quá mức có thể kích hoạt một số tế bào liên quan dẫn đến chết tế bào [40,41]. - Tác dụng hạ đường huyết Đối với bệnh tiểu đường, các ginsenosid Rb1 đã được chứng minh có tác @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  45. dụng chống bệnh đái tháo đường, chủ yếu được nghiên cứu trong mô hình động vật tiểu đường loại 1 do kháng sinh Streptozocin gây ra [19,25]. Hơn nữa, ginsenosid Rb1 dường như cải thiện sự kháng insulin bằng cách giảm độc tính trong cơ và gan, từ đó làm giảm nồng độ đường huyết. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu về các tác dụng đối với thuốc hạ áp của Rb1 để phân loại các ginsenosid này như là các thuốc chống tiểu đường tiềm năng mà không có tác dụng phụ [45]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  46. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ 800 g bột thân rễ Sâm Lai Châu bằng phương pháp chiết xuất đơn giản thu được phân đoạn butanol (365 g). Lấy 350 g phân đoạn butanol để phân lập hợp chất thu được hai hợp chất tinh khiết là LC05 (7,8 mg) và LC07 (4,8 mg). Tiếp theo sử dụng phương pháp đo phổ hiện đại đã xác định được LC05 và LC07 lần lượt là majonosid R2 và ginsenosid Rb1. 2. Kiến nghị Tiếp tục các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài dược liệu quý Sâm Lai Châu để bổ sung thêm cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài hiện đang rất hạn chế. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Tập 1, 986-993, Tập II, 410-415. 101, 704 – 714. 2. Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Y học. 3. Phan Kế Long và cộng sự (2014), “Mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng MATK và ITS-rDNA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(2), 327-337. 4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 809. 5. Trần Minh Ngọc và cộng sự (2009), “Phân lập majonosid R2 và vina-ginsenosid R2 từ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) để làm chuẩn”, Tạp chí Dược học 2(394), 48-50. 6. Nguyễn Tập (2005) “Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu 10(3), 71 – 76. 7. Đỗ Minh Thành (2014), Nghiên cứu đặc điểm di truyền của loại Sâm mới Panax sp. thu ở phong thổ Lai Châu, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Đại học Thái Nguyên, Việt Nam. 8. Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học, I, NXB Y học. 9. Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh Mai, Trương Thị Chiên, Phạm Thế Hải, Phạm Hương Sơn (2017), “Đánh giá sinh trưởng và thành phần hoạt chất của Sâm Việt nam (Panax vietnamensis) trồng ở Quảng Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 33(2), 227-232. 10. Lê Thị Hồng Vân và cộng sự (2013), “Phân lập và thiết lập chất chuẩn majonosid-R2 từ Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv)”, Tạp chí Dược học 53(8). 11. Bùi Xuân Vững, Cơ sở phân tích sắc ký, 2-3. B. Tài liệu Tiếng Anh 12. Attele, A. S., Wu, J. A., and Yuan, C.-S. (1999), “Ginseng pharmacology. Multiple constituents and multiple actions”, Biochemical Pharmacology 58, 1685–1693. 13. Benishin, C. G., Lee, R., Wang, L. C. H., and Liu, H. J. (1991), “Effects of ginsenoside Rb1 on central cholinergic metabolism”, Pharmacology 42, 223–229. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 14. Chen, X. (1996), “Cardiovascular protection by ginsenosides and their nitric oxide releasing action”, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 23, 728–732. 15. Cho Jin-Gyeong et al (2010), "Physicochemical Characterization and NMR assignments of ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, and Rd isolated from Panax ginseng", Journal of Ginseng Research 34 (2), 113-12. 16. Cho, J. Y., Kim, A. R., Yoo, E. S., Baik, K. U., and Park, M. H. (2002), “Ginsenosides from Panax ginseng differentially regulate lymphocyte proliferation”, Planta Medica 68, 497–500. 17. Cho, J. Y., Yoo, E. S., Baik, K. U., Park, M. H., and Han, B. H. (2001), “In vitro inhibitory effect of protopanaxadiol ginsenosides on tumor necrosis factor (TNF)-α production and its modulation by known TNF-α antagonists”, Planta Medica 67, 213–218. 18. Choi Sang Jin et al (2008), “Effects of a polyacetylene from Panax ginseng on Na+ currents in rat dorsal root ganglion neurons”, Brain Research 1191, 75-83. 19. Choi, K. T. (2008), “Botanical characteristic, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C.A. Meyer”, Acta Pharmacological Sinica 29, 1109-1118. 20. Christensen, L. P. (2009), “Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects”, Advances in Food and Nutrition Research 55, 1043-4526. 21. Chun Liang et al (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells", Bulletin of the Korean Chemical Society 32, 3513-3518. 22. Jeong J. J, et al. (2015), “Anti-inflammatory effects of vina-ginsenoside R2 and majonoside R2 isolated from Panax vietnamensis and their metabolites in lipopolysaccharide-stimulated macrophages”, International Immunopharmacology 28, 700-706. 23. Kang, S. Y., Kim, S. H., Schini-Kerth, V. B., and Kim, N. D. (1995a), “Dietary ginsenosides improve endothelium-dependent relaxation in the thoratic aorta of hypercholesterolemic rabbit”, General Pharmacology 26, 483–487. 24. Kang, S. Y., Schini-Kerth, V. B., and Kim, N. D. (1995b), “Ginsenosides of the protopanaxatriol group cause endothelium-dependent relaxation in the rat aorta”, Life Sciences 56, 1577–1586. 25. Kim Ki Hyun (2011), “Anti-neuroinflammatory constituents from the root extract of Paris verticillata”, Canadian Journal of Chemistry 89(4), 441-445. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 26. Kim, N. D., Kang, S. Y., and Schini, V. B. (1994), “Ginsenosides evoke endothelium-dependent vascular relaxation in rat aorta”, General Pharmacology 25, 1071–1077. 27. Kim, Y. C., Kim, S. R., Markelonis, G. J., and Oh, T. H. (1998b), “Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate- induced neurodegeneration”, Journal of Neuroscience Research 53, 426–432. 28. Konoshima, T., Takasaki, M., Ichiishi, E., Murakami, T.,Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N. M., Kasai, R., Yamasaki, K. (1999), “Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Cancer Letters 147(1-2), 6-11. 29. Konoshima, T., Takasaki, M., Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N. M., Kasai, R., Yamasaki, K. (1998), “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. (I).”, Biological Pharmaceutical Bulletin 21(8), 834-8. 30. Lee, S.-J., Ko, W.-G., Kim, J.-H., Sung, J.-H., Lee, S.-J., Moon, C.-K., and Lee, B.-H. (2000), “Induction of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochrome c-mediated activation of caspase-3 protease”, Biochemical Pharmacology 60, 677–685. 31. Lee, S. Y. et al (2015), “Ocotillol, a Majonoside R2 Metabolite, Ameliorates 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic Acid-Induced Colitis in Mice by Restoring the Balance of Th17/Treg Cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(31), 31-7024. 32. Linné, C. (1735), Systema Naturae, Leyden. 33. Linné, C. (1753), Species Plantarum, Stockholm. 34. Lutomski J., Luan T.C. and Hoa T.T. (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family. Part IV", Herba Polonica 38(3), 137-140. 35. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Ryoji Kasai, Aiko Ito, Kazuo Yamasaki and Osamu Tanaka (1993), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in Vietnam. I”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 41(11), 2010-2014. 36. Park, E.-K., Shin, Y.-W., Lee, H.-U., Kim, S.-S., Lee, Y.-C., Lee, B.-Y., and Kim, D.-H. (2005), “Inhibitory effect of ginsenoside Rb1 and compound K on NO and prostaglandin E2 biosynthesis of RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide”, Biological Pharmaceutical Bulletin 28, 652–656. 37. Park, E. K.,Choo, M.-K., Han, M. J., and Kim, D.-H. (2004), "Ginsenoside Rh1 possesses antiallergic and anti-inflammatory activities", International Archives of Allergy and Immunology 133, 113-120. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. 38. Phan Ke Long et al (2013), "Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai I. morphology, ecology, distribution and conservation status", Proceeding of the 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-active compounds, 65-73. 39. Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., and Rausch, W.-D. (2004b), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on mesencephalic dopaminergiccells stressed with glutamate”, Brain Research 1021, 41–53. 40. Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., Ishige, K., and Rausch, W.-D. (2004a), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on survival and neurite growth of MPPþ-affected mesencephalic dopaminergic cells”, Journal of neural transmission 111, 37–45. 41. Rausch, W.-D., Liu, S., Gille, G., and Radad, K. (2006), “Neuroprotective effects of ginsenosides”, Acta Neurobiologiae Experimentalis 66, 369–375. 42. Rhule, A., Navarro, S., Smith, J. R., and Shepherd, D. M. (2006), “Panax notoginseng attenuates LPS-induced pro-inflammatory mediators in RAW264.7 cells”, Journal of Ethnopharmacology 106, 121–128. 43. Rudakewich, M., Ba, F., and Benishin, C. G. (2001), “Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb1 and Rg1”, Planta Medical 67, 533–537. 44. Scott, G. I., Colligan, P. B., Ren, B. H., and Ren, J. (2001), “Ginsenosides Rb1 and Re decrease cardiac contraction in adult rat ventricular myocytes: Role of nitric oxide”, British Journal of Pharmacology 134, 1159–1165. 45. Shang, W., Yang, Y., Jiang, B., Jin, H., Zhou, L., Liu, S., and Chen, M. (2007), “Ginsenoside Rb1 promotes adipogenesis in 3T3-L1 cells by enhancing PPARg2 and C/EBPa gene expression”, Life Sciences 80, 618–625. 46. Tran, Q. L., Adnyana, I. K., Tezuka, Y., Nagaoka, T., Tran, Q. K., and Kadota, S. (2001), "Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity", Journal of Natural Products 64, tr 456–461. 47. Wakabayashi, C., Murakami, K., Hasegawa, H., Murata, J., and Saiki, I. (1998), “An intestinal bacterial metabolite of ginseng protopanaxadiol saponins has the ability to induce apoptosis in tumor cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications 246, 725–730. 48. Wang, W., Zhao, Z.-J., Rayburn, E. R., Hill, D. L., Wang, H., and Zhang, R. (2007), “In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationships of natural products isolated from fruits of Panax ginseng”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 59, 589–601. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 49. Yamaguchi, Y., Haruta, K., and Kobayashi, H. (1995), “Effects of ginsenosides on impaired performance induced in the rat by Scopolamine in a radial-arm maze”, Psychoneuroendrocrinology 20, 645–653. 50. Yamassaki, K. (2000), “Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Pharmaceutical Biology 38, 16-24. 51. Zhu, S. et al (2003), “A new variety of the Genus Panax from Southern Yunnan, China and its nucleotide sequences of 18S Ribosoma RNA Gene”, Journal of Japanese Botany 78(2), 86-94. 52. Zhu, S., Zou, K., Fushimi, H., Cai, S., and Komatsu, K. (2004), “Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs”, Planta Medical 70, 666–677. C. Trang Web 53. Wikimedia, ngày 5 tháng 2 năm 2018 54. Cục sở hữu trí tuệ Việt Nam, ngày 20 tháng 3 năm 2018, 545472580180013B989?OpenDocument 55. Công ty cổ phần Dược Quảng Nam, ngày 1 tháng 5 năm 2018, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. PHỤ LỤC MẪU TIÊU BẢN CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - SÂM LAI CHÂU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. Phụ lục 1. Mẫu tiêu bản Sâm Lai Châu (Viện Nghiên cứu Lâm sinh) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. Phụ lục 2. Phổ của hợp chất LC05 (majonosid R2) Phụ lục 2.1. Phổ khối ESI-MS của hợp chất LC05 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. Phổ 1H-NMR Phụ lục 2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất LC05 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. Phổ 13C-NMR Phụ lục 2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất LC05 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  57. Phổ DEPT Phụ lục 2.4. Phổ DEPT của hợp chất LC05 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  58. Phụ lục 3. Phổ của hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) Phụ lục 3.1. Phổ khối ESI-MS của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  59. 1 Phổ H -NMR Phụ lục 3.2. Phổ H1-NMR của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  60. 13 Phổ C -NMR Phụ lục 3.3. Phổ C13-NMR của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  61. Phổ DEPT Phụ lục 3.4. Phổ DEPT của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  62. Phụ lục 3.5. Phổ HSQC của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  63. Phụ lục 3.6. Phổ HMBC của hợp chất LC07 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU