›

Khóa luận Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)

pdf 76 trang thiennha21 18/04/2022 2781
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_kha_nang_uc_che_vi_khuan_gay_benh_mun_tru.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC MÃ SỐ: 52120401 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRỨNG CÁ Probionibacterium acnes CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. DƯƠNG THỊ BÍCH LÊ PHƯỢNG HIỆP MSSV: 12D720401113 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017
  2. LỜI CẢM ƠN Qua quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, em đã học hỏi được rất nhiều kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm quý báu từ quý Thầy, Cô và Bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Cô Ths. Dương Thị Bích - người hướng dẫn đề tài đã tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Quý Thầy Cô Bộ môn Vi Sinh-Ký Sinh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi, Thầy Nguyễn Văn Hiền, Cô Quách Thị Thu Hằng, Cô Nghị Ngô Lan Vi đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và truyền đạt những kinh nghiệm quý giá để em thực hiện tốt bài khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp gồm Thầy PGS. TS Trần Công Luận, Thầy PGS. TS Nguyễn Văn Bá, Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi đã nhận xét và đưa ra ý kiến giúp em hoàn thiện bài khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cha mẹ và những người thân yêu đã động viên, tiếp sức em trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn các bạn trong tập thể lớp ĐH Dược 7B và tất cả mọi người đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho mình trong suốt quá trình học tập. Cuối lời, xin kính chúc quý Thầy, Cô, Cha, Mẹ, Anh, Chị và các bạn luôn khoẻ mạnh và thành công trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 7 tháng 7 năm 2017 Lê Phượng Hiệp i
  3. LỜI CAM KẾT Em xin cam đoan đây là nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong bài khóa luận này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ khóa luận nào trước đây. Ngày 14 tháng 6 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Phượng Hiệp ii
  4. TÓM TẮT NỘI DUNG Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn đến khả năng đề kháng thuốc. Trong những năm gần đây, cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hoá cao. Vì vậy với mục tiêu đề tài là đánh giá và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes từ các bộ phận cây Trứng cá rất cần thiết. Lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được chiết xuất bằng hệ thống đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % thu được bốn loại cao chiết. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch trên dòng vi khuẩn P. acnes 134N lưu trũ tại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô. Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả các loại cao chiết từ bộ phận cây Trứng cá đều có hoạt tính ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N. Qua so sánh kích thước khoảng vô khuẩn, cao chiết từ lá Trứng cá có khả năng ức chế dòng vi khuẩn P. acnes 134N cao nhất trong bốn loại cao khảo sát, ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082 mm. Giá trị MIC của cao chiết từ lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P. acnes 134N là 10 mg/ml. Đồng thời tiến hành định tính các hợp chất sinh học trong cao chiết từ lá Trứng cá, kết quả thu được cao chiết ethanol từ lá Trứng cá có chứa hợp chất sinh học như flavonoid, saponin, tanin. Từ kết quả đề tài cho thấy, cao chiết ethanol từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non Trứng cá là một nguồn nguyên liệu tự nhiên, tiềm năng cho những nghiên cứu sâu hơn trong điều trị bệnh trứng cá, đặc biệt là nguyên nguyên liệu từ lá Trứng cá. Từ khóa: cây Trứng cá, Propionibacterium acnes, tính kháng khuẩn iii
  5. MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM KẾT ii TÓM TẮT NỘI DUNG iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ 3 2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá 3 2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá 4 2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay 5 2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES 9 2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes 9 2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes 10 2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ 12 2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá 12 2.3.2. Phân loại cây trứng cá 13 2.3.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá 13 2.3.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá 15 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 18 2.4.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới 18 2.4.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam 19 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20 iv
  6. 3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20 3.2.1. Nguyên vật liệu 20 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 20 3.2.3. Hóa chất và môi trường 20 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu 21 3.3.2. Cỡ mẫu 21 3.3.3. Phương pháp chọn mẫu 21 3.3.4. Nội dung nghiên cứu 22 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 31 3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 31 3.6. VẤN ĐỀ Y ĐỨC Error! Bookmark not defined. 3.7. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ 31 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1. KẾT QUẢ 32 4.1.1. Chiết cao 32 4.1.2. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes 32 4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá. 36 4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes 38 4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá 40 4.2. THẢO LUẬN 41 4.2.1. Chiết cao 41 4.2.2. Phân lập và định danh vi khuẩn 41 4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá 42 4.2.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes 43 4.2.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá 44 v
  7. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. KẾT LUẬN 46 5.2. ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 56 Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm 56 Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê 57 vi
  8. DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá 9 Bảng 2.2. Sản phẩm ngoại bào P. acnes 11 Bảng 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá 14 Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG agar 21 Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết trứng cá 30 Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá 32 Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá 32 Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao ethanol cây trứng cá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. 36 Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P. acnes. 39 Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá 40 vii
  9. DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn 5 Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes 10 Hình 2.3. Cây trứng cá 12 Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá 13 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá 23 Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ 26 Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết 29 Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm 31 Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple. 33 Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi 33 Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn 134N 34 Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn 134N 34 Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn 134N 35 Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N 35 Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml. 37 Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml 38 Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes 39 viii
  10. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infusion Broth DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid DPPH 2,2-diphenylpicrylhydrazyl ED50 Effective dose 50 IC50 Inhibitory concentration M. calabura Muntingia calabura L. MIC Minimum inhibitory concentration MBC Minimum bactericidal concentration P. acnes Proipionibacterium acnes TYEG Tryticase-Yeast extract-Heart extract-Glycerol v/v Volume per volume w/v Weight per volume ix
  11. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da mặt, lưng và ngực. Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý, thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân. Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh hay hen suyễn (Mallon et al., 1999). Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm (Park et al., 2004). Vi khuẩn P. acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002). Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được vi khuẩn P. acnes (Nguyễn Thanh Hùng, 2013) Kháng sinh, retinoid và một số chất khác như benzoyl peroxid, acid salicylic, acid azelaic và anpha-hydroxy cho tác dụng điều trị bệnh trứng cá thông thường (Leyden, 2003). Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da, lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003). Vì vậy việc tiếp cận các liệu pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn là rất cần thiết. Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á. Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk et al., 2005). Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin, 1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm. 1
  12. Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau: 1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) 2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. 2
  13. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ Bệnh trứng cá được mô tả sớm nhất trong các bài viết Hy Lạp cổ đại của bác sĩ Byzantine Aetius Amidenus. Từ “acne” xuất phát từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành acne và được sử dụng đến ngày nay (Humgara et al., 2013). Bệnh trứng cá là bệnh về da phổ biến nhất đặc biệt ở lứa tuổi thanh thiếu niên. Bệnh trứng cá không thể định nghĩa là bệnh truyền nhiễm vì vi khuẩn gây mụn không chỉ hiện diện trên da người bệnh mà còn trên da người khoẻ mạnh. Bệnh trứng cá được hình thành do sự tăng tiết chất nhờn, tế bào phễu bị sừng hoá làm tắc nghẽn cổ nang lông, sự gia tăng mật độ vi khuẩn bên trong nang lông và sử dụng tế bào chết cùng với chất nhờn phát triển tạo thành nhân mụn nhỏ (microcomedone) không thể phát hiện bằng mắt thường (Plewig và Kligman, 2000) 2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá Theo Phạm Hoàng Khâm (2011) bệnh trứng cá được chia thành 2 dạng là tổn thương không viêm như mụn đầu trắng (whitehead) và mụn đầu đen (blackhead) và dạng viêm bao gồm sẩn, mụn mủ, mụn bọc, mụn nang. - Mụn đầu đen hình thành do chất bã bài tiết và tế bào chết làm tắc lỗ nang lông nhưng bề mặt da hở nên nhân mụn bị không khí oxy hoá tạo màu đen. Nhìn vào nang lông thấy màu đen nên gọi là mụn đầu đen hay mụn có cấu trúc mở. - Mụn đầu trắng hình thành khi có quá nhiều chất dầu và tế bào chết gây bít tắc lỗ nang lông và không hở ra da, nên gọi là “nhân đóng”. Theo Hayashi et al., 2008 sử dụng hình thái và số lượng tổn thương phân chia bệnh thành 3 mức độ: nhẹ, trung bình và nặng - Bệnh trứng cá nhẹ: từ 0 - 5 nốt viêm, thương tổn là một vài mụn đầu trắng, mụn đầu đen. - Bệnh trứng cá trung bình: từ 6 - 20 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn đầu trắng, mụn đầu đen đồng thời có thêm sẩn, mụn mủ. - Bệnh trứng cá nặng: từ 21 - 50 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn mủ, nang, nốt sẹo. Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ: - Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules) - Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule) - Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess) - Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar) 3
  14. 2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật trên da và phản ứng viêm của tế bào chủ. Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là điều kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P. acnes đóng vai trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002). Ngoài ra còn các yếu tố khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí hậu, lạm dụng mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013) 2.1.2.1. Sự tăng sinh tiết bã nhờn Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc biệt ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng bàn chân. Có hai quá trình liên quan đến sự tổng hợp chất béo của bã nhờn: quá trình tổng hợp triglycerid, acid béo tự do, wax ester, sterol ester và quá trình tổng hợp squalen và cholesterol (Downie et al., 2004). Hầu hết các tuyến bã nhờn đổ vào nang lông trên bề mặt da để giữ ẩm cho làn da. Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã nhờn tiết nhiều chất nhờn trên mức cần thiết. Chất nhờn sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn đến tắc lỗ chân lông hình thành nhân trứng cá. Thành phần chất nhờn trên da bệnh nhân bệnh trứng cá thường có squalen và wax ester cao hơn bình thường và các acid béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường. Sự thiếu hụt acid linileic là yếu tố quan trọng gây mụn trứng cá (Downie et al., 2004). Acid linoleic điều khiển quá trình tiết của interleukin (IL-8), gây ra phản ứng viêm (Zouboulis, 2001) 2.1.2.2. Rối loạn bong sừng (sự sừng hoá bất thường ở lỗ chân lông) Rối loạn bong sừng là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần miệng lỗ chân lông kết chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành nhiều lớp tế bào chết xếp chồng lên nhau. Lớp tế bào chết này sẽ gây hẹp lỗ chân lông dẫn đến bít tắc lỗ chân lông tạo nên môi trường kỵ khí với nhiều chất nhờn thuận lợi cho vi khuẩn phát triển gây ra mụn (Thiboutot et al., 2009) 2.1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh trứng cá: Các chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P. acnes được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996). Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase. Trong 4
  15. dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P. granulosum và P. avidum không có khả năng sinh tryptophan, trong khi P. acnes cho kết quả dương tính. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P. acnes (Kishishita et al., 1980). 2.1.2.4. Phản ứng viêm Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các acid béo tự do và glycerol. Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông, thu hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977; Pawin et al., 1998) Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007) A. Nang tuyến bã nhờn bình thường B. Nhân mụn C. Nang bị vỡ do viêm 2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay Bệnh trứng cá liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh nên điều trị phức tạp việc điều trị phải dựa trên từng cá thể bệnh mức độ trầm trọng của bệnh, nguyên nhân gây bệnh mà sử dụng thuốc tại chổ hay toàn thân hoặc kết hợp cả hai để đạt hiệu quả cao. Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng kể nhưng thời gian điều trị kéo dài và kèm theo tác dụng phụ không mong muốn. 2.1.3.1. Sử dụng kháng sinh Theo một số phác đồ điều trị kháng sinh thường sử dụng là clindamycin, erythromycin, tetracylin. - Dung dịch clindamycin 1 % có hiệu quả trong việc làm giảm vi khuẩn P.acnes (thường gặp ở vùng da nhờn), có tác dụng tốt đối với mụn mủ, sẩn mủ, nhưng với nang mụn và nhân mụn thì thuốc ít có hiệu quả. - Dung dịch erythromycin 4 % có tác dụng giống clindamycin. Sau khi dùng khoảng 12 tuần, khoảng 2/3 bệnh nhân có kết quả tốt. 5
  16. - Khi điều trị kháng sinh tại chỗ thất bại (6 - 8 tuần), nên phối hợp kháng sinh toàn thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin 500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2 lần/ngày. Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes làm giảm viêm nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn (Shimonart và Dramaix, 2005). Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P. acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng kháng sinh của vi khuẩn P. acnes (Leyden, 1976). Năm 1979, Crawford cùng cộng sự đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P. acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ lệ mức 20 % .Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996. Theo một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P. acnes cao nhất với erythromycin và clindamycin. Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 %. Ở Hy Lạp, tỷ lệ P. acnes đề kháng cả hai loại erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002). Theo Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P. acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 %. Những loại kháng sinh điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000). Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc (Sheafer et al., 2001). Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan đến đột biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa Kỳ và Châu Âu (Ross et al., 2002). Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc nhóm macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin (Ross et al,. 2002). Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo phòng khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như sau lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %; minocyclin 0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các loại kháng sinh thường gây một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Vì vậy việc lựa chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và tuân thủ theo điều trị của thầy thuốc mới đạt kết quả mong muốn. 6
  17. 2.1.3.2. Các Peroxid Là loại thuốc sát khuẩn có tác dụng chống vi khuẩn gây mụn, kháng viêm, benzoyl peroxid làm giảm nhanh số lượng P. acnes tại vùng thương tổn đồng thời thuốc làm giảm lượng acid béo trên bề mặt da và ức chế tạo nhân trứng cá. Benzoyl peroxid có tác dụng tốt đối với trứng cá có viêm ở mức độ nhẹ hay trung bình. Nên dùng thuốc có nồng độ từ 2,5 - 5 % bôi vùng mặt, vùng lưng có thể dùng thuốc với nồng độ cao hơn từ 5 - 10 %, khởi đầu có thể bôi ngày 2 lần, khi bệnh giảm tuần bôi 1 - 2 lần. Nên sử dụng công thức có chất nền là nước (water-basedformulation) vì ít kích ứng da hơn loại cồn. Thuốc này thường gây kích thích da và lột da. Cần tránh nắng trong thời gian sử dụng thuốc vì ánh nắng làm cho da cháy đỏ, đen sạm (Simonart và Dramaix, 2005). Nếu dùng đồng thời với kem chống nắng có chứa acid paraaminobenzoic sẽ làm da sậm màu một thời gian (Lê Kim Duệ, 2000). 2.1.3.3. Dẫn chất vitamin A acid (tretionid, isoteinoin) Trước đây vitamin A được xem là yếu tố dinh dưỡng thuần tuý. Ngày nay được dùng như một liệu pháp điều trị các trường hợp bệnh trứng cá nặng hoặc trứng cá đề kháng trị liệu thông thường. Thuốc bôi retinoid: tretionin, adapalene và isotretinoin là loại thuốc có hiệu quả. Thuốc có tác dụng mềm da, ức chế sự phát triển vi khuẩn P. acnes và tạo điều kiện cho các thuốc kháng khuẩn tại chỗ phát huy tác dụng tốt hơn. Một số tác dụng không mong muốn của thuốc: - Khả năng gây quái thai là tác dụng không mong muốn cần lưu ý nhất. Thuốc có thể gây dị dạng trên hệ thống thần kinh trung ương, cơ quan thính giác, tuyến ức và hệ thống tim mạch thai nhi (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Các thuốc retinoid chống chỉ định cho phụ nữ mang thai và phụ nữ trong độ tuổi sinh sản (Yentzer et al., 2009). - Khô da và niêm mạc, làm da và niêm mạc dễ bị tổn thương và kích ứng, bệnh nhân cảm giác bỏng rát da trở nên đỏ, bong vẩy - Mụn mủ có thể xuất hiện sau khi bôi thuốc 1 đến 2 tuần do thuốc làm tăng sự thẩm thấu các chất trung gian hoá học gây viêm do P. acnes tiết ra và tạo điều kiện cho tụ cầu phát triển (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). 2.1.3.4. Các phương pháp khác - Acid azelic có tác dụng giống benzyol peroxid gây ức chế sự tổng hợp tế bào sừng, có hoạt tính chống lại bệnh trứng cá. Tác dụng không mong muốn là gia tăng sắc tố da sau viêm (Roebuck, 2006), dễ gây kích ứng da ngứa và có cảm giác bỏng tại chỗ (Layton, 2006). 7
  18. - Điều trị bằng công nghệ ánh sáng tia laser: sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ rộng. Tia laser cho thấy kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm nhiều nghiên cứu lâu dài và so sánh liệu pháp cũ (Sakamoto et al., 2010) - Bên cạnh đó thảo dược được dùng điều trị mụn trứng cá không chỉ có khả năng như một chất tiêu diệt vi sinh vật mà còn là những chất có khả năng ức chế sản sinh sản phẩm ngoại bào của P. acnes. Thảo dược dùng điều trị mụn trứng cá cho thấy tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hoá và ức chế hormon androgen (Sasiing et al., 2012). Một số nghiên cứu về hoạt chất từ thảo dược có tác dụng ức chế vi khuẩn P. acnes: + Nghiên cứu kem trị bệnh trứng cá có chứa 2 % flavonoid chiết từ vỏ cây Terminalia arjuna (họ Trâm Bầu) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P. acnes (đường đính vòng kháng > 17 mm) (Vijaylakshmi et al., 2011) + Theo Luangnarcumitchai (2007) khảo sát 19 loại tinh dầu cho kết quả có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes, trong đó tinh dầu xả có hoạt chất kháng khuẩn cao nhất, nồng độ ức chế tối thiểu 0,125 % v/v + Dịch chiết ethanol của lá sầu đâu Neem, trái nutmeg (họ Nhục Đậu Khấu), và hạt tiêu đen (Black pepper) bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch, mỗi giếng cho 0,5 ml dịch chiết. Đường kính vòng kháng vi khuẩn P. acnes lần lượt là 20 mm, 18 mm, 16 mm ở nồng độ 20 mg/ml (Charde et al., 2012) + Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, dịch chiết ethanol của lá cây Liễu đỏ Excoecaria cochinchinensis Lour và lá cây Xô thơm Salvia officinalis Lour (Họ hoa môi) nồng độ 5 % ức chế P. acnes với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 20,5 mm và 20,83 mm MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml (Brovelli et al., 2005) 8
  19. Tác dụng của các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá được trình bày ở bảng 2.1 như sau: Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá Bài tiết Sừng hoá phễu Vi khuẩn Phản ứng viêm chấtnhờn nang lông P. acnes Benzoyl peroxid - + +++ + Retinoid - ++ + + Clindamycin - + ++ - Antiandrogen ++ + - - Azelic acid - ++ ++ + Tetracycline - - ++ + Erythromycin - - ++ - Isotretinoin +++ ++ ++ ++ Ghi chú: (+++) tác dụng rất mạnh, (++) tác dụng mạnh, (++) tác dụng vừa, (+) tác dụng yếu, (-) không tác dụng (Hywel et al., 2011) 2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES 2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes Theo Douglas và Gunter (1946) vi khuẩn Propionibacterium acnes gây bệnh trứng cá phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Propionibacteriaceae Chi: Propionibacterium Loài: P. acnes P. acnes là một trong những vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da, chiếm khoảng 105 - 106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bã nhờn như: mặt, đầu, lưng và khoảng 102 tế bào/cm2 ở các vùng khác trên cơ thể (Leyden et al., 1998). Chúng sinh trưởng sâu bên dưới da, nhiều nhất trong các nang lông, nơi có nồng độ oxy thấp. Vi khuẩn P. acnes phát triển chậm, khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày trên môi trường nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp 37 oC, pH từ 5 - 8, trong điều kiện kỵ khí. Khuẩn lạc P. acnes mô cao màu vàng đục trên môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple. Khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,5 - 4 mm tuỳ thuộc vào thời gian và môi trường nuôi cấy (Kishishita, 1980) 9
  20. P. acnes thuộc vi khuẩn Gram dương, hình que, không sinh bào tử, các tế bào có đường kính 0,5 - 0,8 m và dài 3 - 4 m, có khả năng sản xuất acid propionic, nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hoá gelatin. P. acnes được trữ trong môi trường BHI có bổ sung 20 % glycerol, ở nhiệt độ -40 oC (Jappe et al., 2002) Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes ( Jappe et al., 2002) (a) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử; (b) Hình chụp dưới kính hiển vi quang học P. acnes có nhiều dạng khác nhau. Dựa vào quá trình lên men, sử dụng đường ribose, erythritol và sorbitol, quan sát được 5 type P. acnes khác nhau. Dựa trên xét nghiệm huyết thanh và phân tích thành phần đường trên thành tế bào, chia P. acnes thành hai dạng: type I (đường glactose tham gia cấu tạo thành tế bào) và type II (chỉ có đường manose trong cấu tạo thành tế bào) (Johnson và Cummins, 1972). Theo McDowel (2005) P. acnes được chia thành hai type I và II dựa vào khác biệt về kiểu gen dựa trên biến thể về kiểu gen (reca, hly). Gần đây, một dạng mới được mô tả là type III trên da người dị ứng. 2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes P. acnes là một trong những thành phần của hệ vi sinh vật bình thường trên da (Holdeman et al., 1977). Ở những người bệnh trứng cá, vi khuẩn này phát triển rất mạnh do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường yếm khí, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật này tăng nhanh mật số. Vi khuẩn P. acnes sản xuất các enzym ngoại bào và các sản phẩm có hoạt tính sinh học khác được xem là yếu tố quyết định độc lực và tương tác với hệ miễn dịch gây ra phản ứng viêm tạo nhân mụn (Webster, 1995). Theo Funke (1997) và Leyden (1998) P. acnes là nhân tố quan trọng gây bệnh trứng cá đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân trứng cá. Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase để tiêu hoá chất nhờn trong các nang lông sản sinh ra các acid béo tự do và acid propionic. Vi khuẩn P. acnes tồn tại trên mô và có 10
  21. thể gây huỷ mô do các các sản phẩm chuyển hoá (acetat, propionat, indol, porphyrin), enzym và các sản phẩm thoái dưỡng của glucose và fructose. Histamin, tryptamin và những chuỗi acid béo ngắn được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P. acnes, các chất này có thể gây ra tình trạng viêm (Csukas et al., 2004). Các enzym ngoại bào và các sản phẩm có hoạt tính sinh học là hai yếu tố quyết định động lực của P. acnes. Số lượng P. acnes bên trong nang lông tăng mạnh quá trình biến dưỡng diễn ra sản sinh nhiều acid béo tự do, các chất này khuếch tán qua thành nang lông kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch tự nhiên và chuỗi phản ứng viêm kích hoạt (Loveckova và Halikova, 2002). Ngoài ra chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các enzym thuỷ phân lysosom gây ra phản ứng viêm hạ bì. Vi khuẩn P. acnes có khả năng chống lại thực bào và có thể tồn tại trong đại thực bào một thời gian dài do cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn này có thể tồn tại thời gian dài trong mô, kích thích phản ứng viêm miễn dịch liên tục và lâu dài, gây viêm (Wester et al., 1985). Coates et al., 2002 cho rằng thành tế bào P.acnes chúng được bảo vệ bởi kháng sinh và hệ thống miễn dịch tế bào chủ (Coates et al., 2002) Bảng 2.2. Sản phẩm ngoại bào P. acnes Sản phẩm Cơ chế Vai trò Lipase Triglyceride Dinh dưỡng, sản xuất acid béo tự do, tăng kết dính với tế bào Phospholipase C Phospholipid Gây rối loạn chức năng mang tế bào Proteases Collagen, keratin Dinh dưỡng, tăng hoạt tính, sản sinh chemotaxins, phân huỷ protein, xâm lấn mô lân cận Hyaluronidase, Mucopolysaccharides Xâm lấn mô lân cận, xuất neruaminidase huyết dưới da Acid phosphatase Đường phosphat Dinh dưỡng Bacteriocins Kháng vi khuẩn khác Histamin, tryptamin Gây viêm cấp tính Eady et al., 1994 11
  22. 2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ 2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá Trứng cá có tên khoa học Muntingia calabura L., thuộc họ Trứng cá (Muntingiaceae). Tên gọi Trứng cá được đặt dựa trên các hạt li ti như trứng cá bên trong quả. Tại Việt Nam cây có nhiều tên gọi như: Trứng cá, cây Trứng cá, Mật sâm. Tuỳ theo từng quốc gia, cây Trứng cá có nhiều tên gọi khác nhau. Tên khác: capolin, palman, bersilana, jonote, puan (Mexico); capulin blanco (Costa Rica); chitató, maguito, chiriador, acuruco, tapabotija, nigua (Venezuela). Cây Trứng cá có nguồn gốc từ miền nam Mexico, Caribe, Trung Mỹ, miền tây Nam Mỹ về phía nam của Peru và Bolivia và khu vực châu Á (Chin, 1989). Cây Trứng cá có thể phát triển tốt trên vùng đất nghèo dinh dưỡng có khả năng chịu các điều kiện chua mặn và khô hạn. Được trồng rộng rãi phổ biến là loại cây ven đường tại Việt Nam, Malaysia, Phillipines. Hạt của cây được các loài chim và dơi ăn quả phát tán, giúp cải thiện các điều kiện đất và góp phần giúp các loài thực vật khác có thể sinh sống được ở vùng đất nghèo dinh dưỡng. Tuy nhiên, cây cũng có thể bị coi là loài xâm hại nguy hiểm do cây Trứng cá có thể cạnh tranh với các loài cây bản địa khác. Hình 2.3. Cây Trứng cá 2.3.2. Mô tả cây Trứng cá Cây Trứng cá là loại cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 7 - 12 m, phân cành lớn mọc ngang, các cành xếp chồng lên nhau và hơi rũ xuống. Vỏ thân hơi nhẵn, những cành non có lông màu xanh sậm, cành già màu nâu đen. Lá hình trái xoan, phiến lá không đều dài 7 - 12 cm, rộng 2 - 4 cm, đầu lá nhọn, mép kía răng cưa, hai mặt có lông, màu trắng nhạt mặt dưới, gân gốc 4, cuống lá dài 3 - 5 cm, có lông; lá kèm hình kim, gấp khúc. Hoa mọc đơn độc, tụ họp thành 2 - 3 cái ở kẽ lá, cuống hoa dài hơn cuống lá, cánh hoa hình xoan màu trắng, đài có 5 răng có lông dày ở hai mặt, tràng 5 cánh hình bầu dục, thắt lại ở móng; nhị nhiều đính trên trụ đĩa bao quanh bầu, chỉ nhị mảnh; bầu 12
  23. hình trứng có lông tuyến, 5 - 7 ô chứa nhiều noãn. Quả nạc tròn nhẵn, đường kính khoảng 1 - 1,5 cm, khi còn non màu xanh chuyển vàng rồi ứng đỏ và bóng láng khi chín, vị ngọt và mọng nước có mùi thơm đặc trưng, bên trong chứa nhiều hạt nhỏ (0,5 mm) màu vàng trong như trứng cá (Võ Văn Chi, 2004) Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá 2.3.2. Phân loại cây Trứng cá Trứng cá là loài duy nhất trong chi Muntingia, thực vật có hoa. Theo Vijayanand (2015) cây Trứng cá được phân loại như sau: Giới (kingdom): Plantae Bộ (order): Mavales Họ (family): Muntingiaceae Chi (genus): Muntingia L. Loài (species): M. calabura 2.3.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá 2.3.3.1. Lá Qua các tài liệu đã công bố từ năm 1997 cho tới nay về thành phần hoá học, các nhà hoá học phân lập được rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết lá Muntingia calbura L. như sau: Các hợp chất Flavonoid: Catechin, epigallocatechin gallate, acid gallic, acid protocatechuic, acid ferulic, quercitrin-2’’-O-gallate, pentagalloyl-hexoside II, kaempferol-3-O-galactoside, myricetin, acid isoferulic, quercetin, pinocembrin, rhamnetin, kaempferol, chyrsin I, chyrsin II, kaempferide, ermanin I, pinostrobin, (2R,3R)-3,5,7-trihydroxyflavanone, 7-hydroxyflavone, isokaemferide, 3,3’- dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 3,8-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 7- hydroxyisoflavon, 7,3’,4’-trimethoxyisoflavone, (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’- tetramethoxyflanvan (Mahmood et al., 2013). Các hợp chất khác: acid 3,4,5-trihydrobenzoic, lupenon, acid 2 ,3-dihydroxy-olean- 13
  24. 12en-28oic, -sitostenone, -sitosterol, -stimasterol, methy-4hydrobenzoat, acid isovanillic, p-nitrophenol, trans-methyl-p-coumarate, -anyremone (Mahmood et al., 2013). Theo nghiên cứu Aruna (2014) hàm lượng phenolic và flavonoid chiếm tỷ lệ cao trong dịch lá Trứng cá. Làm gia tăng khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa từ lá Trứng cá. 2.3.3.2. Quả Quả Trứng cá rất được trẻ em ưa thích có thể ăn quả ngay khi hái hoặc làm mứt với mùi thơm đặc trưng. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần các chất có chứa trong quả Trứng cá theo nghiên cứu của Vijayanand (2015) được thể hiện bảng 2.3 Bảng 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá Dung môi Hợp chất Ethanol Methanol Chloroform Nước Terpeoid - - - + Flavonoid + + - + Saponin - - + - Tanin + - + + Alkaloid - - - - Glucose + - + + Anthraquinon - - - - Glycosid tim - - - - Steroid - - - - Phenol + + - + Lipid - - - - Vijayanand (2015) Theo nghiên cứu Preethi (2010) dịch chiết từ quả tươi Trứng cá hàm lượng phenol tổng dao động từ 358 0,02 đến 1486 0,028 mg GAE/100 g khối lượng quả tươi. Từng kết quả đó cho thấy lượng phenolic/flavonoid dồi dào trong quả Trứng cá là tiềm năng nghiên cứu chất chống oxy hoá và kháng khuẩn. Theo Gomathi (2013) dịch chiết quả Trứng cá định lượng bằng phương pháp quang phổ cho kết quả chứa một lượng đáng kể vitamin C (33,6 AAE/g dịch chiết), vitamin E (14,7 mg TE/g dịch chiết), anthocyanin (82,4 mg CGE/g dịch chiết), flavonoid (173,2 mg RE/g dịch chiết). Ngoài ra một số chất khác như phytol (26,26 %), acid n- hexanacetic (11,97 %), acid cyclopropaneotanoic (10,26 %), γ-sitosterol (11,15 %), stigmasterol (7,20 %) và campesterol (4,47 %) là thành phần chính trong chiết xuất. Kết quả cho thấy quả Trứng cá là nguồn bổ sung chất dinh dưỡng có tiềm năng 14
  25. kháng viêm và chống oxy hoá. 2.3.3.3. Vỏ thân Qua các tài liệu đã công bố về thành phần hoá học các nhà khoa học phân lập được rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết vỏ thân Muntingia calbura L. như sau: Flavonoid: 8-hydroxy-7’,3’,4’,5’-tetramethoxyflavon; 8,4’-dihydroxy-7,3’,5’- trimethoxyflavon; 6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon; 5,7-dimethoxyflavon; 3,5- dihydroxy-6,7-dimethoxyflavan; (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan Hợp chất khác: -sitistenon; 6--gydroxystigmast-4-en-3-one, -sitosterol; acid syringic; acid vanillic, 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)propan-1-on, tetracosyl ferulate; hexacosanol (Mahmood et al., 2013) 2.3.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá Trong suốt nhiều thập kỉ qua các nhà khoa học trên khắp thế giới cố gắn khám phá và nghiên cứu nhiều tác dụng dược lí mà cây Trứng cá mang lại cho con người. Cây Trứng cá đã cho thấy nhiều tiềm năng dược phẩm mới trong tươi lai. Theo kinh nghiệm dân gian người dân Peru dùng lá sắc với nước sử dụng giảm đau dạ dày, sưng tuyến tiền liệt và hạ sốt giảm đau đầu (Morton (1987), Zakaria (2007b). Vỏ thân sử dụng như thuốc giảm sưng viêm (Zakaria, 2006). Tại Colombia hoa sử dụng như loại thuốc an thần, chống co giật, trầm cảm. Ở Mexico, cây trồng sử dụng điều trị bệnh sởi, nhọt miệng và đau dạ dày. 2.3.4.1. Độc tính cấp Độc tính cấp của M. calabura được nghiên cứu năm 2011 theo Sridhar (2011), dịch chiết methanol lá với liều 300 mg/kg, 500 mg/kg và 2000 mg/kg dùng theo đường uống của chuột. Quan sát hiện tượng trong 2 - 3 giờ đầu, tỷ lệ tử vong bắt đầu ghi nhận từ 24 giờ đến 14 ngày. Kết quả thu được không thấy có dấu hiệu độc tính cấp và tỷ lệ tử vong liều 2000 mg/kg dịch chiết là 0 %. Nghiên cứu khác về độc tính cấp của lá M. calabura thu hái tại Selangor, Malaysia thực hiện bởi Irahim (2012). Dịch chiết ethanol lá liều thử nghiệm 2000 và 5000 mg/kg dùng đường uống ở chuột. Tỷ lệ tử vong ghi nhận đến ngày 14 sau khi uống dịch chiết là 0 %, không nhìn thấy dấu hiệu lâm sàng về sự suy yếu của động vật, quan sát cấp độ tế bào về mô học, sinh hoá máu, công thức máu cho thấy không có sự bất thường nào ở chuột. Những phát hiện này cho thấy dịch chiết lá M. calabura không gây ra ngộ độc cấp tính dù ở liều cao (5000 mg/kg). Karthyaini và Suresh (2012) nghiên cứu độc tính cấp của quả M. calabura liều thử nghiệm giới hạn 1000 mg/kg và 2000 mg/kg không có dấu hiệu độc tính cấp hoặc tử vong ghi nhận cả hai mức liều. 15
  26. 2.3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào Những năm gần đây Chen et al., 2004 nghiên cứu độc tính tế bào của M. calabura, trong đó 15 hợp chất phân lập từ dịch chiết methanol vỏ thân đã được kiểm tra bằng các thí nghiệm gây độc tế bào. Hoạt động chống lại tế bào P-388, A549, và HT-29. Trong số các hợp chất phân lập, các hợp chất 8-hydroxy-7,3’,4’,5’- tetramethoxyflavane; 8,4’-dihydroxy-7,8’,5’-trimethoxyflanane; 5-dihydroxy-6,7- dimethoxyflavone; -sitostenone; acid vanillic; 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4- hydroxyphenyl) propran-1-on; tetracolsyl ferulate có hoạt tính chống lại tế bào P-388 với ED50 ghi nhận lần lượt là 3,56 g/ml; 3,71 g/ml; 9,39 g/ml; 6,28 g/ml; 10,72 g/ml; 15,62 g/ml và 3,27 g/ml đối chứng mithramycin (ED50 = 0,06 g/ml ). 2.3.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn Hợp chất phenolic có trong các bộ phận cây Trứng cá có khả năng kháng khuẩn cao. Theo nghiên cứu Yasunaka (2005) sử dụng cao chiết methanol lá và quả Trứng cá thu hái tại Veraceuz, Mexico cho khả năng kháng hai chủng vi khuẩn Ercherichia coli (C600) và Staphylococcus aureus (209P) ở nồng độ 100 mg/ml. Kết quả MIC thu được hai loại cao chiết methanol lá và methanol quả là trên hai dòng vi khuẩn Ercherichia coli, Staphylococcus aureus lần lượt là 512/1024 μg/ml và 128/256 μg/ml. Một nghiên cứu khác của Zakaria (2006) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá Trứng cá với các dung môi methanol, nước và chloroform. Cao chiết pha loãng các nồng độ khác nhau (10000, 40000, 70000 và 100000 ppm) thử nghiệm chống lại Corneybacterium, S. Aureus, Bacillus cereus, Proteus vulgaris, Staphylococcus epidermidis, Kosuria rhizophila, Shigella fleneri, E. Coli, Aermonashydrophila và Salmonella typhi bằng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch in vitro. Kết quả cho thấy cao chiết chloroform ít hiệu quả hơn so với cao chiết nước và methanol. Ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, dịch chiết nước ức chế sự phát triển của S. aureus và K. rhizophila trong khi dịch chiết methanol kháng lại vi khuẩn S. flexneri, B. cereus, S. aureus, P. vulgaris, A. hydrophila và K. rhizophila. Ở nồng độ 40000 ppm trở lên, dịch chiết nước hoạt tính kháng khuẩn tác động đối với vi khuẩn C. diphtheriae, P. vulgaris, S. epidermidis và A. hydrophila Một nghiên cứu khác thực hiện bởi Zakaria et al., 2007a khảo sát khả năng kháng dòng vi khuẩn Staphyloccocus aureus của 3 loại cao chiết từ lá trứng cá với các dung môi nước, chloroform, methanol. Kết quả cho thấy cả 3 loại cao chiết từ lá Trứng cá có hoạt tính kháng khuẩn các dòng S. aureus 29213 , S. aureus 33591, S. aureus 700699. Giá trị MIC ứng với 3 loại cao chiết nước, chloroform, methanol lần lược là 5 μg/ml ; 1,25 μg/ml và 2,5 μg/ml. Năm 2010, Zakaria tiếp tục các nghiên cứu 3 loại dịch chiết Trứng cá khảo sát khả năng kháng các chủng vi khuẩn khác như S. aureus 16
  27. ATCC 25923 [nhạy cảm methicilin], S. aureus ATCC 33591 [kháng methicilin], E. coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 10231, và Microsporum canis ATCC 36299 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả thu được chỉ cao chiết methanol ức chế sự phát triển của S. aureus ATCC 25923 và S. aureus ATCC 33591 với giá trị MIC là 1250 μg/ml và MBC là 2500 μg/ml. Cao chiết nước và chloroform không ức chế các chủng vi khuẩn C. albicans, M. canis, P. aeruginosa và E. coli. Cao chiết methanol lắc phân đoạn với các dung môi từ không phân cực đến phân cực (ether, ethylacetat, nước) khảo sát khả năng kháng khuẩn S. aureus ATCC 25923 và S. aureus ATCC 33591 các phân đoạn. Phân đoạn ethylacetat cho thấy khả năng kháng hai dòng vi khuẩn này với giá trị MIC và MBC ghi nhận được là 156 μg/ml và 313 μg/ml. 2.3.4.4. Hoạt tính chống oxy hoá Gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý sinh hoá trong cơ thể. Trong cơ thể luôn có sự cân bằng mật độ gốc tự do. Khi nồng độ gốc tự do tăng quá cao gây mất cân bằng, dẫn tới những tổn thương tế bào, phá huỷ protein, DNA đẩy nhanh quá trình lão hoá và gây ung thư. Để xác định tiềm năng chống oxy hoá của M. calabura được thực hiện bởi Zakaria et al., 2007b. Những lá Trứng cá thu hái từ Selangor, Malaysia phơi khô và chiết với dung môi nước. Tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp DPPH và superoxid anion kết quả cho thấy dịch chiết nước có khoảng 94,8 1,14 % và 83,70 2,05 % khả năng chống oxy hoá khi đo bằng 2 phép thử. Một nghiên cứu khác của Siddiqua (2010), dịch chiết methanol lá Trứng cá cho thấy khả năng chống oxy hoá bằng phương pháp DPPH với nồng độ ức chế IC50 = 22 g/ml cao hơn so với acid ascorbic có giá trị IC50 = 12 g/ml 2.3.4.5. Hoạt tính kháng viêm Lá Trứng cá có thể sử dụng như thức uống giống trà tác dụng điều trị giảm sưng viêm. Theo nghiên cứu Zakaria, (2007b) để điều trị viêm cấp do carrageenan gây ra sử dụng dịch chiết nước lá Trứng cá với nồng độ 10 %, 50 %, 100 % (tương đương với liều 27 mg/kg, 135 mg/kg và 270 mg/kg tương ứng). Kết quả thu được chứng minh rằng dịch chiết nước từ lá Trứng cá có hoạt tính chống viêm. Hoạt tính viêm ở mô do carageenan gây ra mất hoàn toàn sau 7 giờ ở nồng độ 10 % và 50 % dịch chiết nước, sau 6 giờ đối với nồng độ 100 %. Đặc biệt tại các nồng độ dịch chiết khả năng chống viêm cao hơn nhiều so với thuốc đối chứng ASA (100 mg/kg). 17
  28. 2.3.4.6. Hoạt tính bảo vệ tim mạch Báo cáo khả năng bảo vệ tim mạch lá trứng cá thực hiện bởi Nivethetha (2009). Dịch chiết lá Trứng cá với dung môi là nước có khả năng bảo vệ tim bằng cách làm giảm nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim (AST, ALT, LDH, CK, acid uric) ở chuột. Hoạt tính một số enzym giảm khi sử dụng dịch chiết nước lá Trứng cá ở nồng độ 200 và 300 mg/kg. 2.3.4.7. Hoạt tính chống bệnh đái tháo đường Theo Sirdhar (2011) cao chiết methanol lá Trứng cá có khả năng chống lại bệnh đái tháo đường với liều 300 mg/kg và 500 mg/kg. Liều 500 mg/kg cao methanol làm giảm lượng đường huyết từ 83,19 mg/dl (lúc 0 giờ) xuống 62,62 mg/dl (cuối 6 giờ). Hiệu quả đối với khả năng dung nạp glucose đường uống cũng được khảo sát. Kết quả cho thấy liều 500 mg/kg làm giảm lượng đường huyết trong 1 giờ (116,46 6,94 mg/dl) trong khi nhóm chỉ sự dụng kẹo cao su (144,73 7,86 mg/dl). Nghiên cứu khác về khả năng tăng đường huyết sau khi sử dụng Alloxan. Với liều 500 mg/kg cho thấy khả năng giảm đường huyết 37 % so với thuốc đối chứng glipizide 5 mg/kg. 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 2.4.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới Theo Zakaria (2006) tiến hành thử nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá Trứng cá lần bằng 3 dung môi khác nhau nước, methanol, chloroform bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả thu được dịch chiết nước có khả năng chống lại Staphylococcus aureus, Kosuria rhizophila, dịch chiết methanol có khả năng chống lại Shigella flexneri, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Aeromonas hydrophila, Kosuria rhizophila; các khả năng kháng khuẩn này không tìm thấy ở dịch chiết chloroform. Theo Zakaria (2011), tiến hành thử nghiệm các hoạt động chống oxy hoá và tăng sinh tế bào từ dịch chiết lá Trứng cá bằng 3 dung môi nước, chloroform, methanol được thực hiện trong nghiên cứu này. Đánh giá bằng phương pháp thử MTT ((2,4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim). Dịch chiết nước và methanol cho kết quả ức chế sự phát triển các tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HT-29, HL-60 và K-562 trong khi dịch chiết chloroform chỉ ức chế phát triển tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HL-60 và K-562. Bên cạnh đó tất cả dịch chiết từ các dung môi không ức chế sự gia tăng các tế bào bình thường 3T3, cho thấy sự an toàn khi sử dụng. Tất cả các dịch chiết ở nồng độ (20 g/ml, 100 g/ml, 500 g/ml) đều có hoạt tính chống oxy hoá, trong đó dịch chiết nước và methanol có hoạt tính chống oxy hoá cao hơn dịch chiết chloroform. Tổng hàm lượng phenolic trong 3 dung môi nước, methanol, 18
  29. chloroform lần lượt là 2970,4 6,6; 1279 6,1; 2978,1 4,3 mg/100g acid gallic. Theo Zakaria (2010) nghiên cứu xác định hoạt tính kháng khuẩn invitro của dịch chiết toàn phần và phân đoạn của lá Trứng cá. Lá trứng cá được chiết với 3 loại dung môi là nước, chloroform và methanol với tỷ lệ 1:20 (w/v) trong 72 giờ với quy trình lặp lại ba lần. Các dòng vi khuẩn khảo sát là Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Cadida albicans và Microsporum canis. Dịch chiết methanol ức chế Staphylococus aureus (MIC = 1250 g/ml, MBC = 1250 g/ml) và được xem là dịch hiệu quả nhất trong cả ba loại dung môi. Tiến hành chiết phân đoạn ethyl acetat hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đạt giá trị MIC 156 g/ml. 2.4.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam Trong nước, cây Trứng cá chủ yếu nghiên cứu về sinh thái, khả năng chống chịu và thực trạng cây ven đường. Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược học của các hợp chất polyphenol khai thác từ cây trứng cá với mục đích phục vụ lĩnh vực y dược còn rất ít. Các công bố nghiên cứu chủ yếu dựa vào thế giới và ứng dụng dân gian. Thực tế cho thấy tìm năng điều trị bệnh tim mạch, tiểu đường, gout và chống oxy hóa của các chất chiết từ cây Trứng cá là vô cùng phong phú nhưng vẫn chưa khai thác mạnh mẽ trong nước. Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu đặc tính dược liệu của chiết từ cây Trứng cá có ý nghĩa to lớn trong phòng và điều trị một số bệnh hiện nay là rất cần thiết. 19
  30. CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian : Thí nghiệm được thực hiện từ 12/2016 đến 4/2017 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm Dược liệu Khoa Dược- Điều Dưỡng trường Đại học Tây Đô. 3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nguyên vật liệu - Mẫu vi khuẩn: Dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N từ nghiên cứu “Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô. - Lá, vỏ thân, quả non, quả chín cây Trứng cá thu hái tại phường Thường Thạnh, quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ vào tháng 12 năm 2016. Lá và vỏ thân Trứng cá rửa sạch, sấy khô, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong túi nylon được xay nhỏ trước khi sử dụng cho nghiên cứu. Quả non, quả chín được rửa sạch, nhặt bỏ cuống, để ráo nước xay nhuyễn trước khi sử dụng cho nghiên cứu. 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại Phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại học Tây Đô, Phòng thí nghiệm Dược liệu - Trường Đại học Tây Đô. Các dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn P. acnes: đĩa Petri, que cấy, tủ cấy vi sinh vật, nồi hấp khử trùng, cân điện tử Ohaus (Mỹ), tủ sấy, tủ ủ vi sinh vật, tủ đông giữa mẫu Hitachi (Nhật Bản), bộ micropipet, bếp điện, máy ly tâm, ống Eppendorf, bình hút ẩm. Các dụng cụ thiết bị chiết mẫu: bếp điện, bình cầu, hệ thống sinh hàn, bếp đun cách thủy, cân phân tích Shimidzu (Nhật Bản), phễu hủy tinh, đũa thủy tinh, tủ lạnh bảo quản cao chiết, tủ sấy, cân hồng ngoại xác định độ ẩm. Các thiết bị và dụng cụ khác: máy vi tính lưu trữ dữ liệu, máy chụp hình, kính hiển vi Olympus CX - 21 (Nhật Bản) . 3.2.3. Hóa chất và môi trường 3.2.3.1. Hóa chất Ethanol 96 % (Trung Quốc), DMSO (Trung Quốc) Hoá chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn P. acnes : crystal violet, lugol, alcohol 95 %, safranine (Bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam). Hoá chất kiểm tra catalase: dung dịch oxy già (H2O2, 3 %). Thuốc thử Kovac’s dùng thử khả năng sinh indol (Mecrk). Đĩa kháng sinh levofloxacin 5 g/ml (Công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam). 20
  31. Hoá chất cần thiết khác 3.2.3.2. Môi trường phân lập vi khuẩn Vi khuẩn P. acnes được nuôi cấy trong môi trường Trypticase - Yeast Extract - Heart Extract - Glycerol Agar (Kishisita, 1980). Bảng 3.1. Công thức môi trường TYEG agar (Kishisita, 1980) Thành phần % Trypticase 1,5 Yeast extract 0,5 Heart extract Nisui 0,5 Glycerol 1,0 NaCl 0,2 K2HPO4 0,2 L-cystein-HCl 0,03 Bromocresol purple 0,002 Agar 1,5 pH 6,8 - Môi trường Trypticase soyar broth dùng để kiểm tra khả năng sinh indol. - Môi trường Trypticase soyar broth agar dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu. - Môi trường pepton dùng để thử khả năng làm dịch hóa gelatin và khả năng phản nitrat hóa 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu Phương pháp thực nghiệm khoa học 3.3.2. Cỡ mẫu Tổng số 4 mẫu thực vật từ các bộ phận Trứng cá (Muntingia calabura L.): lá, vỏ thân, quả chín và quả non được sử dụng trong nghiên cứu. 3.3.3. Phương pháp chọn mẫu Thu hái các bộ phận cây Trứng cá. - Lá: chọn lá không quá già hay quá non, không bị sâu bệnh. - Vỏ thân: chọn thân to không sâu bệnh và dùng dụng cụ bóc vỏ thân. - Quả chín: chọn quả chín đỏ đều màu hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh - Quả non: chọn quả non màu xanh lá hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh 21
  32. 3.3.4. Nội dung nghiên cứu 3.3.4.1. Phương pháp chiết Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kỹ thuật chiết. Một phương pháp chiết xuất thích hợp có thể được hoạch định một khi đã biết rõ thành phần hoá học của nguyên liệu, mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung áp dụng cho tất cả các hợp chất. Lựa chọn phương pháp chiết xuất có được cao toàn phần là công việc quan trọng để tránh phân huỷ hợp chất , tránh phản ứng phụ và các loại tạp sinh ra trong quá trình chiết. Trong quá trình chiết các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong điều kiện khác nhau. Các chất tan hoà tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dung dịch chiết, sự hoà tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (mô tế bào), các chất tan nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hoà tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất”. Nguyên liệu thực vật thường được chia nhỏ thành các tiểu phân có thể tiếp xúc với dung môi, trong khi các tế bào phía bên trong vẫn còn nguyên vẹn dung môi và chất tan phải đi qua vách tế bào. Vì thế, trong chiết xuất có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là: - Sự hoà tan - Sự khuếch tán - Sự thẩm thấu qua vách tế bào Các quá trình này thực hiện liên tục cho đến khi quá trình chiết kết thúc. Nguyên liệu phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung môi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với vách tế bào một cách dễ dàng, thúc đẩy quá trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao hiệu suất chiết. (Nguyễn Trọng Tuân, 2007). - Phương pháp chiết nóng đun hồi lưu Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao kết hợp bộ phận gia nhiệt và hệ thống sinh hàn. Do được chiết ở nhiệt độ cao nên khả năng hòa tan các chất tan và dung môi thường là cao nhất và quá trình hòa tan xảy ra nhanh. Đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường thông qua hệ thống ngưng tụ. Thiết bị chiết đun hồi lưu gồm: Hệ thống sinh hàn, bình cầu, bếp điện Ưu điểm: thiết bị đơn giản rẻ tiền, dễ thực hiện, phương pháp đơn giản Nhược điểm: không chiết được lượng lớn mẫu cây, nên chỉ thích hợp nghiên 22
  33. cứu phòng thí nghiệm, trong suốt quá trình chiết mẫu cây luôn có nhiệt độ bằng nhiệt độ sôi của dung môi nên không thích hợp cho các hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid hoặc tạo các tạp chất trong quá trình chiết. (Nguyễn Trọng Tuân, 2007) - Tiến hành Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá trình bày trong hình Bộ phận cây trứng cá Lá, vỏ thân Quả sống, quả chín Cắt nhỏ, sấy khô, xay nhuyễn, xác định độ ẩm Xay nhuyễn Ethanol 96 % trong 3 giờ ở 70 oC Dịch Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết chiết lá vỏ thân quả chín quả non Cao quả Cao quả Cao lá Cao vỏ thân chín non Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá Lá, vỏ thân, quả non và quả chín cây trứng cá tươi thu hái về rửa sạch. Sau đó lá và vỏ thân cây trứng cá làm khô bằng cách sấy khô đến khối lượng không đổi trong tủ sấy ở điều kiện 60 oC trong 6 giờ. Xay nhỏ lá và vỏ thân trứng cá bằng máy nghiền để tạo bột khô thu được ml, mt (g) Quả chín và quả sống để ráo nước, sau đó cân xác định khối lượng tươi ms, mc (g), bảo quản tủ lạnh. Chiết lá và vỏ thân khô: cho mẫu bột vào thau nhỏ làm ẩm dược liệu với một lượng dung môi vừa đủ, để dược liệu trương nở trong 30 phút. Dược liệu sau khi làm 23
  34. ẩm cho vào bình cầu thủy tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ 1:20 (w/v) và lắp hệ thống sinh hàn. Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3 cm. Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn. Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương đương 65 - 70 oC. Sau khi thấy tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3 giờ. Sau 3 giờ tắt bếp để dich chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông. Lặp lại 3 lần chiết, gộp các dịch chiết cô dung môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao, khối lượng cao và hiệu suất chiết. Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 oC. Quả non và quả sống: cho mẫu vào máy xay, bổ sung dung môi lượng vừa đủ, xay nhỏ tốc độ (10000 vòng/phút) trong 5 phút. Quả sau khi xay cho vào bình cầu thủy tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ 1:10 (w/v) và lắp hệ thống sinh hàn. Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3 cm. Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn. Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương đương 65 - 70 oC. Sau khi thấy tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3 giờ. Sau 3 giờ tắt bếp để dich chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông. Lặp lại 3 lần chiết, gộp các dịch chiết cô dung môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao, khối lượng cao và hiệu suất chiết. Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 oC - Chỉ tiêu theo dõi: độ ẩm nguyên liệu và hiệu suất chiết. + Độ ẩm nguyên liệu: độ ẩm là lượng nước tự do có trong nguyên liệu. Biết được độ ẩm là điều quan trọng trong công tác phân tích xác định chất lượng nguyên liệu. Dược liệu thường quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn của dược liệu. Ở độ ẩm này hay thấp hơn dược liệu có thể được an toàn trong quá trình lưu trữ. Để xác định độ ẩm ta có thể sử dụng nhiều phương pháp theo Trần Hùng (2010) như sấy, chưng cất. Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu nguyên liệu ở những điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu nguyên liệu. Tiến hành xác định độ ẩm: Phương pháp sấy Dùng tủ sấy: lấy một bình thủy tinh hình trụ có nắp mài, sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 oC. Cân vào bình một lượng chính xác khoảng 3 g dược liệu rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 2 - 3 giờ. Dùng kẹp lấy bình trụ ra, để vào bình hút ẩm, mở khóa hoặc hé mở nắp bình hút ẩm cho thông khí với bên ngoài trong 1 phút rồi đóng kín bình hút ẩm. Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút. 24
  35. Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu như trên cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5 mg. Tính kết quả độ ẩm theo công thức: − X = 100 % X: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm a: khối lượng dược liệu khi chưa sấy (g) b: khối lượng dược liệu khi sấy đến khối lượng không đổi (g) Dùng cân xác định độ ẩm: trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng máy. Đọc kết quả. Sau khi kết thúc thí nghiệm, phải để máy nguội khoảng 10 phút rồi mới thực hiện mẫu kế tiếp. + Hiệu suất chiết: hiệu suất chiết (H %) được xác định tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu sử dụng . Công thức hiệu suất: 1 H = 100 % 2 Trong đó : H: hiệu suất chiết (%); m1: khối lượng bột dược liệu khô; m2: khối lượng cao chiết sau khi cô dung môi 25
  36. 3.3.4.2. Nuôi cấy và nhận diện dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes Sơ đồ thí nghiệm Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P. acnes trữ ở nhiệt độ -40 oC Nuôi cấy dòng vi khuẩn trong môi trường TYEG broth Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn trên môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple 0,002 % Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn P. acnes trên môi trường thạch nghiêng TYEG Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ - Tiến hành (Kishisita et al., 1980) Ống nghiệm chứa môi trường TYEG borth hấp tiệt trùng ở 121 oC Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P. acnes trữ ở nhiệt độ 40 oC được đặt nhiệt độ thường 15 phút sau đó cấy vào môi trường TYEG broth, ủ ở 37 oC từ 5 - 7 ngày. Hút 30 µl dòng vi khuẩn trong tube cho vào ống nghiệm chứa môi trường TYEG broth Tiến hành cấy ria vi khuẩn từ môi trường TYEG broth lên đĩa thạch môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple 0,002 % ủ kỵ khí ở 37 oC từ 5 - 7 ngày Chọn khuẩn lạc có màu vàng, đục, mô cao hoàn toàn trên môi trường và làm môi trường từ tím chuyển sang vàng (do khuẩn lạc thuộc giống vi khuẩn Propionibacterium phát triển sinh acid propionic làm giảm pH của môi trường). Tiến hành nuôi cấy trên trên môi trường thạch nghiêng TYEG, ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Sau đó vi khuẩn được định danh bằng các phản ứng sinh hóa. Nhận diện dòng vi khuẩn bằng một số thử nghiệm hoá sinh Nhuộm Gram Tiến hành nhuộm Gram theo hướng dẫn sử dụng bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam Khoa 26
  37. - Chuẩn bị vết bôi: làm sạch kính mang vật bằng cồn 70 %, nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng vào giữ kính mang vật, dùng que cấy chuyển một ít vi khuẩn vào giọt nước tán nhẹ cho vi khuẩn hoà tan vào giọt nước, làm khô trong không khí. - Cố định mẫu: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần. - Nhuộm với dung dịch crystal violet, để 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô - Nhỏ cồn 95 % giữ khoảng 30 giây hoặc cho cồn chảy qua vết bôi vi khuẩn liên tục đến khi nước cồn chảy không còn màu rửa lại nước và thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không khí. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X. Thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2009) - Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch TYEG sau 48 giờ ủ. Hoà tan sinh khối vào giọt nước sẵn trên miếng lam. - Thêm vào một hoặc vài giọt H2O2 3 % - Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả: Nếu dương tính thì có hình thành bọt khí, nếu kết quả âm tính thì không có sự hình thành bọt khí. Kiểm tra sự hình thành indol (John Harley and Lansing Prescott, 2002) Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo indol từ việc phân giải acid amin trytophan bởi enzym tryptophanase. Indol sinh ra kết hợp với andehyde có trong thuốc thử Kovac’s tạo vòng màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường. Tiến hành - Cho vào ống nghiệm có nấp đậy 10 ml môi trường trypticase soyar broth (1 %), khử trùng 121 oC trong 15 phút, để nguội. - Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc cần kiểm tra chủng vào ống nghiệm chứa môi trường, đậy nắp, ủ kỵ khí 48 giờ ở 37 oC cho vi khuẩn phát triển. - Mỗi ống nghiệm cho 0,5 ml thuốc thử Kovac’s. - Đọc kết quả: Dương tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử Kovac’s chuyển sang màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường. Âm tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử Kovac’s không bị biến đổi. Khả năng phản nitrat hoá (John Harley and Lansing Prescott, 2002) Môi trường: Nước thịt pepton 100ml KNO3 1g pH= 7,2 - 7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 121 oC trong 30 phút. 27
  38. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá. Dùng vaselin bịt kín nút để ngăn oxy, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1 - 7 ngày và quan sát sự phát triển của vi khuẩn (tăng độ đục của dịch nuôi cấy, sinh khí NH3). Vi khuẩn có phát triển là phản ứng dương tính, không phát triển là phản ứng âm tính. Khả năng làm dịch hoá gelatin (John Harley and Lansing Prescott, 2002) Môi trường: Pepton 5g Gelatin 100 - 150g Nước cất 1000 ml pH= 7,2 - 7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 115 oC trong 20 phút. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18 - 24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ ống không cấy làm đối chứng, nuôi ở 37 oC trong thời gian 5 - 7 ngày. Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 oC trở xuống. Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái ổn định là phản ứng âm tính (không sinh gelatinase); nếu một phần hay toàn bộ gelatin hoá lỏng là phản ứng dương tính. Vi khuẩn P. acnes là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que, catalase dương tính, có khả năng sinh indol, tạo phản ứng phản nitrat và dịch hóa gelatin. 3.3.4.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) tiến hành có những điểm biến đổi phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm. 28
  39. Sơ đồ thí nghiệm Môi trường dịch chiết tim TSB agar Chủng 50 L huyền phù Propionibacterium acnes được nuôi 48 giờ, pha loãng đạt mật số 108 tế bào/ ml, trải mẫu, để ráo Tạo các giếng đường kính 6 mm Bơm 30 l các cao chiết lần lượt vào các giếng, ủ mẫu nhiệt độ phòng trong 30 phút cho cao chiết trong giếng khuếch tán. Ủ ở 37 oC, 48 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn. Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết Tiến hành thí nghiệm - Pha loãng cao chiết: các cao được pha lõang trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành các nồng độ khác nhau: cân 0,2 g cao cho vào 1ml DMSO ta được nồng độ 200 mg/ml, pha loãng thu được nồng độ 100 mg/ml, 50 mg/ml. - Chuẩn bị đĩa môi trường dịch chiết agar, dày 4mm. - Huyền phù P. acnes: các dòng vi khuẩn đã được nuôi cấy sau 48 giờ trong môi trường lỏng tăng sinh khối, sao cho mật số vi khuẩn khoảng 108 tế bào/ml (tương đương độ đục Mc Farland 0,5). - Hút 50 l huyền phù P. acnes (mật số 108 tế bào/ ml), trải mẫu lên đĩa môi trường TSB agar, để ráo. Đục 4 giếng đường kính 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 - 3 cm. - Bổ sung 30 l lần lượt các cao vào các giếng thạch. Đối chứng sử dụng levofloxacin 5 g/mL và đối chứng âm là DMSO. Tiến hành lần lượt ở các nồng độ khác nhau. - Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau đó, ủ kỵ khí, ở 37 oC trong 48 giờ. - Đọc kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn theo công thức : 29
  40. ĐK (mm) = D-d Trong đó ĐK: đường kính vòng vô khuẩn (mm). D: đường kính vòng sáng xung quanh giếng thạch (mm). d: đường kính giếng thạch (mm) Thí nghiệm lặp lại 3 lần lấy giá trị đường kính trung bình. 3.3.4.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn Propionibacterium acnes Mục tiêu: xác định nồng độ nhỏ nhất của cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, có thể ức chế vi khuẩn P. acnes. Nguyên tắc: xác định nồng độ thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes của cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method) của (Đỗ Trung Đàm, 2006). Tiến hành thí nghiệm Tương tự như thí nghiệm trên nhưng ở các mức nồng độ khác nhau theo dãy sau 40 mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml và 5 mg/ml. Đối chứng âm là DMSO. Đọc kết quả: nồng độ ức chế tối thiểu được xác định là nồng độ của cao chiết nhỏ nhất mà ở đó không thấy sự phát triển của vi khuẩn P. acnes chính là giá trị MIC của cao chiết trên vi khẩn P. acnes. 3.3.4.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết cho khả năng kháng khuẩn cao nhất Mục tiêu: xác định một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết có hiệu quả kháng khuẩn cao nhất từ cây Trứng cá Tiến hành thí nghiệm: tiến hành xác định một số hợp chất trong cao chiết Trứng cá như: nhóm flavonoid, saponin, tanin. Các hợp chất flavonoid, saponin, tanin được định tính bằng phương pháp trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết Trứng cá Hợp chất Thực nghiệm Hiện tượng Flavonoid 1 g cao chiết + 2 ml methanol + vài Dung dịch màu hồng tới đỏ hạt bột Mg + 0,5 ml HCl đđ Saponin 5 g cao chiết + 5 ml nước cất, đun Xuất hiện bọt bền ấm, lắc mạnh Tanin 1 g cao chiết + 20 ml nước cất, thêm Xuất hiện tủa xanh lá cây, vài giọt NaCl và FeCl3 10 % xanh đen Puguh et al., 2014 30
  41. 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu thí nghiệm được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS Satistics 20, phân tích ANOVA với độ tin cậy 95 %, các giá trị trung bình được so sánh bằng Duncan, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm được trình bày trong hình 3.4 Bộ phận cây Trứng cá Vi khuẩn P. acnes Đun hồi lưu Ethanol 96 % trong 3 giờ ở 70 oC Dịch chiết Nuôi cấy/ TYEG agar Bốc hơi trên bếp cách thủy Cao chiết Nhận diện Kháng khuẩn Định tính bộ phận kháng khuẩn cao nhất Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm 3.6. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ - Đưa ra các tiêu chí chọn mẫu. - Hiệu chỉnh các thiết bị trước khi sử dụng - Sử dụng các thiết bị độ chính xác cao - Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình 31
  42. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Chiết cao Sử dụng phương pháp chiết nóng đun hồi lưu và dung môi ethanol 96 % thu được các loại cao chiết với kết quả thể hiện như sau Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá Cao chiết Độ ẩm (%) Độ ẩm cao (%) Lá 12,8 17,38 Vỏ thân 13,0 15,00 Quả chín - 19,05 Quả non - 18,82 Nhận xét: độ ẩm nguyên liệu khô lá và vỏ thân cây Trứng cá dưới 13 % đạt theo mô tả độ ẩm dược liệu theo DĐVN IV. Độ ẩm trung bình của cao ở các bộ phân đều không quá 20 %, cao thu được ở dạng cao đặc theo PL1.1 DĐVN IV. Độ ẩm trong cao quả, chín là cao nhất trong bốn loại cao khảo sát (19,05 %). Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá Cao chiết Khối lượng Khối lượng Khối lượng Hiệu suất khô (g) tươi (g) cao toàn phần chiết (%) (g) Lá 207,75 - 90,04 43,34 Vỏ thân 212,65 - 70,74 33,27 Quả chín - 300 102,16 34,05 Quả non - 300 74,45 24,82 Nhận xét: khối lượng cao thu được cao nhất là ở quả chín (102,16 g) hiệu suất chiết các lá, vỏ thân, quả non và quả chín với dung môi ethanol 96 % bằng phương pháp đun hồi lưu lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 % và 24,82 % (so với khối lượng khô). Hiệu suất chiết cao từ lá Trứng cá cao nhất trong bốn loại cao (43,34 %) 4.1.2. Nuôi cấy và nhận diện vi khuẩn Propionibacterium acnes 4.1.2.1. Kết quả đặc điểm hình thái của dòng vi khuẩn nuôi cấy Đặc điểm khuẩn lạc Quan sát khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple cho thấy: dòng vi khuẩn sinh trưởng chậm, khuẩn lạc xuất hiện rõ sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, kích thước khuẩn lạc nhỏ. Dòng vi khuẩn 134N có màu vàng đậm, tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên. 32
  43. Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên. Màu sắc khuẩn lạc: khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple đều có màu vàng nhạt đến đậm. Kích thước khuẩn lạc: đường kính khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N có kích thước dao động 0,8 - 1,3 mm sau 5 - 7 ngày nuôi cấy. a b Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple. a. Dòng vi khuẩn 134N màu vàng đậm b. Dòng vi khuẩn 134N chụp nghiêng Đặc điểm tế bào vi khuẩn Quan sát hình thái của các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X (độ phóng đại 1000 lần) cho thấy dòng vi khuẩn có dạng que ngắn. Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi 33
  44. 4.1.2.2. Kết quả đặc điểm sinh hoá dòng vi khuẩn nuôi cấy Dòng vi khuẩn 134N thuộc vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím xanh của crystal violet), catalase dương tính (khuẩn lạc làm sủi bọt H2O2 3 %) Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn phân lập Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường trypticase soyar borth trong 24 giờ ở 37 oC, sau đó kiểm tra khả năng sinh indol bằng thuốc thử Kovac’s. Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn tạo được indol từ môi trường nuôi cấy chứa trytophan vì làm biến đổi màu thuốc thử Kovac’s từ vàng sang đỏ. Trong khi dòng đối chứng Staphylococcus aureus không có khả năng này. Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn a. Dòng vi khuẩn 134N tạo indol b. Đối chứng không tạo indol 34
  45. Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường pepton và o KNO3 ở 37 C, sau đó kiểm tra khả năng phản nitrat hóa. Kết quả thí nghiệm cho thấy, - dòng vi khuẩn phân lập có khả năng khử NO3 môi trường sinh khí NH3 và vẫn phát triển bình thường. Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn phân lập a. Dòng vi khuẩn 134N tạo phản ứng phản nitrat hóa b. Đối chứng âm Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 oC trở xuống. Dòng vi khuẩn 134N làm một phần bề mặt môi trường gelatin hoá lỏng lõm xuống phản ứng dương tính, đối chứng âm môi trường gelatin không chứa dòng vi khuẩn 134N. Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N a. Dòng vi khuẩn 134N làm dịch hóa gelatin b. Đối chứng âm 35
  46. 4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá. Khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết ethanol lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua kích thước khoảng vô khuẩn được trình bày bảng 4.3. Hiệu quả kháng khuẩn của các loại cao được khảo sát ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả cho thấy các loại cao lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá có khả năng ức chế dòng vi khuẩn P. acnes. Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao cây trứng cá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Loại cao Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Đối chứng Nồng độ cao chiết bằng ethanol (mg/ml) dương 50 100 200 Levofloxacin DMSO Vỏ thân 10,33 ± 0,577a 11,67 ± 1,155a 16,67 ± 2,309a 0 0 Quả chín 11 ± 0,000a 13,33 ± 1,528a 20 ± 1,000a 0 0 Quả non 11,67 ± 0,577b 18 ± 1,000b 20,67 ± 1,155b 0 8,67 ± 0,577b Lá 16,33 ± 2,082c 19 ± 0,000b 23 ± 1,732b 0 8,67 ± 0,577b p 0,032 0,000 0,010 0,000 Ghi chú: số liệu đường kính vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột, có số liệu có ít nhất 1 chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở ý nghĩa 5%. Đối chứng (-): DMSO cho đường kính kháng khuẩn bằng 0. 36
  47. Quả chín Quả sống Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml. Ghi chú: (1) nồng độ 200 mg/ml; (2) nồng độ 100 mg/ml; (3) nồng độ 50 mg/ml; (4) đối chứng âm DMSO; (5) đối chứng dương levofloxacin 37
  48. Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml a. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 200 mg/ml b. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 100 mg/ml c. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 50 mg/ml Nhận xét: qua kết quả thí nghiệm ở bảng 4.3 cho thấy cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N với kích thước khoảng vô khuẩn dao động từ 10,33 mm đến 23 mm. Các nồng độ cao Trứng cá đều có khoảng vô khuẩn lớn hơn so với kháng sinh đối chứng levofloxacin, cho thấy khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % cao hơn kháng sinh đối chứng Khi so sánh giữa các nồng độ, ở nồng độ 200 mg/ml tạo khoảng vô khuẩn cao nhất trong 3 nồng độ khảo sát đạt giá trị 16,67 ± 2,309 mm ở vỏ thân, 20 ± 1,000 mm ở trái chín, 20,67 ± 1,155 mm ở trái non và 23 ± 1,732 mm ở lá (mức ý nghĩa p = 0,032). Ở nồng độ 200 mg/ml cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96% tạo khoảng vô khuẩn trên dòng P. acnes 134N từ 16,67 mm đến 23 mm trong đó ức chế mạnh nhất ở cao chiết lá (khoảng vô khuẩn 23 mm) kế đến là trái non, trái chín và vỏ thân. Ở nồng độ 100 mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 19 ± 0,000 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 16,33 ± 2,082 mm. Kết quả phân tích cho thấy cao lá Trứng cá ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml hiệu quả ức chế dòng vi khuẩn 134N cao nhất, kích thước khoảng vô khuẩn trung bình ở từng nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml cao lá lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082mm. Từ đó sử dụng cao lá cho các thí nghiệm tiếp theo tìm MIC và định tính một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong cao lá Trứng cá. 4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes Dựa trên kết quả thí nghiệm trên, cao chiết từ lá Trứng cá được chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn P. acnes và nồng độ được khảo sát lần lượt là 40 mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml và 5 mg/ml. Đối chứng sử dụng: đối chứng âm 38
  49. là DMSO và đối chứng dương là levofloxacin (5µg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất mà tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn nên nồng độ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao. Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P. acnes. Nồng độ cao chiết Đường kính vòng vô khuẩn (mm) (mg/ml) 40 11 ± 1 20 9 ± 1 10 6 ± 0 5 - Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. (-) là không kháng khuẩn Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes Ghi chú: (1) nồng độ 5 mg/ml; (2) đối chứng dương levofloxacin; (3) nồng độ 10 mg/ml; (4) nồng độ 20 mg/ml; (5) nồng độ 40 mg/ml; (6) đối chứng âm DMSO. Nhận xét: ở nồng độ 40 mg/ml cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes với vòng vô khuẩn đạt 11 ± 1 mm. Nồng độ 20 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 9 ± 1 mm Nồng độ 10 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 6 ± 0 mm. Nồng độ 5 mg/ml không quan sát thấy hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết lá trứng cá vòng vô khẩn bằng 0 mm. Từ kết quả ta thấy nồng độ 10 mg/ml là nồng độ thấp nhất của cao chiết lá trứng cá có khả năng ức chế vi khuẩn P.acnes. 39
  50. 4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá Để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết ethanol, tiến hành định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học như flavonoid và saponin, tanin. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá Hợp chất Hiện tượng Kết Hình quả Flavonoid Dung dịch + màu đỏ Saponin Xuất hiện + bọt 2 1 Tanin Dung dịch + màu xanh đen Ghi chú: +: kết quả dương tính; 1: mẫu thử; 2: mẫu chứng. 40
  51. 4.2. THẢO LUẬN 4.2.1. Chiết cao Độ ẩm nguyên liệu khô lá Trứng cá (12,8 %) và vỏ thân cây Trứng cá (13 %) dưới 13 % đạt mức độ ẩm an toàn dược liệu theo tiêu chuẩn DĐVN IV.Việc xác định độ ẩm của mẫu khô trước khi tiến hành chiết xuất giúp biết được các điều kiện để xác định phương pháp chiết xuất phù hợp, nhằm thu được lượng cao chiết tối ưu. Ngoài ra, việc xác định độ ẩm của nguyên liệu còn tạo điều kiện để xác định nhiệt độ và thời gian sấy mẫu thích hợp để tiến hành chiết xuất có hiệu suất cao hơn theo Dương Phượng Liên và Nguyễn Nhật Minh Phương (2014) trong suốt quá trình sấy mẫu, nhiệt độ cao làm phá vỡ các cấu trúc tế bào bên trong của nguyên liệu, tạo điều kiện cho dung môi và nguyên liệu tiếp xúc tốt hơn, tăng hiệu suất chiết. Bên cạnh đó, quá trình sấy còn có tác dụng làm giảm độ ẩm của nguyên liệu giúp tăng tỷ lệ dung môi sử dụng với nguyên liệu. Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết, người ta thường dựa trên hiệu suất cao chiết. Hiệu suất chiết cao phản ánh sự tối ưu của việc kết hợp các điều kiện khác nhau trong phương pháp chiết. Kết quả hiệu suất chiết các lá, vỏ thân, quả non và quả chín với dung môi ethanol 96% bằng phương pháp đun hồi lưu lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 % và 24,82 % (so với khối lượng khô). Các kết quả hiệu suất chiết cao lá cao hơn so với nghiên cứu (Puguh et al., 2014) bằng phương pháp ngâm với dung môi ethanol hiệu suất chiết là 9,572 %, bên cạnh đó hiệu suất chiết cao nước là 11,928 % cao hơn khi chiết bằng ethanol. Nguyên nhân những khác biệt do phương pháp đun hồi lưu gia tăng hiệu quả hòa tan các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt hơn nên cho hiệu quả cao chiết cao hơn phương pháp ngâm. Hiệu suất chiết còn bị ảnh hưởng bởi các điều kiện khác nhau như nhiệt độ, thời gian sấy mẫu, mẫu thu hái những vùng khác nhau, thời gian thu hái khác nhau, loại dung môi. Độ chín của cấu tạo tế bào quả trứng cá ảnh hưởng quá trình chiết, mức độ phá vỡ mô tế bào một nhân tố cơ bản đẩy nhanh và làm triệt để tiến hành chiết xuất bởi dung môi, làm giải phóng nhiều chất hơn. 4.2.2. Phân lập và nhận diện vi khuẩn Qua kết quả thí nghiệm kiểm tra một số đặc điểm hình thái và sinh hoá của dòng vi khuẩn phân lập cho thấy những đặc điểm sau: 41
  52. - Trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple sau 72 giờ khuẩn lạc có hình dạng tròn, bìa nguyên, nhô cao hoàn toàn trên môi trường, màu vàng đậm . - Tế bào hình que, Gram dương, catalase dương tính, tạo indol từ trytophan, phản ứng phản nitrat hóa và làm dịch hóa gelatin. Những đặc điểm này phù hợp với công bố của Kishishita et al., 1980; Higaki et al., 2004 về đặc điểm của loài P. acnes. Theo Kishishita et al., 1980; Higaki et al., 2004 P. acnes có khuẩn lạc hình tròn, bìa nguyên, nhô cao hoàn toàn, màu vàng nhạt hoặc đậm trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple (khuẩn lạc phát triển chậm). Trong điều kiện kỵ khí tế bào hình que, Gram dương, không sinh bào tử. Vi khuẩn P. acnes có khả năng sản xuất nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hóa gelatin. Các loài giống Propionibacterium hiện diện trên da khác như: Propionibacterium avidum, Propionibacterium granulosum có những đặc điểm chung của giống Propionibacterium như khuẩn lạc có dạng tròn, bìa nguyên, mô, tế bào hình que, Gram dương và catalase dương tính. Ngoài ra các loài trong giống Propionibacterium có những đặc điểm khác biệt như: trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0.002% bromocresol purple, loài P. granulosum có màu nâu khuẩn lạc to (2 - 3mm). Cả hai loài P. avidum và P. granulosum không tạo được indol từ tryptophan. Vì vậy có thể kết luận rằng dòng vi khuẩn 134N từ nghiên cứu “ Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu tại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô là vi khuẩn Propionibacterium acnes. 4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá Khảo sát khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của các bộ phận cây Trứng cá cho thấy cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N với kích thước khoảng vô khuẩn dao động từ 10,33 mm đến 23 mm. Cây Trứng cá có tiềm năng kháng khuẩn vi khuẩn P. acnes trên các bệnh nhân trứng cá. Hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết cây Trứng cá có khả năng kháng khuẩn là do chứa các hợp chất flavonoid. Theo Cushnie và Andrew (2005) hầu hết các hợp chất flavonoid có tác dụng kháng khuẩn do: kiềm 42
  53. hãm và ngăn sự phân chia của vi khuẩn, ức chế enzym transpeptidase ngăn quá trình tổng hợp mucopeptid (yếu tố tạo sự bền vững của thành vi khuẩn); khi gắn lên màng vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng; ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic và RNA của vi khuẩn và ức chế hoạt động của hyaluronidase (enzym giúp vi khuẩn tấn công sang các tế bào lân cận) Kích thước khoảng vô khuẩn càng tăng khi nồng độ cao càng tăng cho thấy nồng độ cao sẽ tỷ lệ thuận với kháng khuẩn của cao. Ở từng nồng độ, cao Trứng cá tạo khoảng vô khuẩn với dòng vi khuẩn 134N có sự khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5 %. Trong các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml cao chiết từ lá trứng cá có kích thước khoảng vô khuẩn trung bình ở từng nồng độ lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082mm cho thấy khả năng kháng khuẩn dòng vi khuẩn 134N ở cao lá Trứng cá là cao nhất so với các loại cao còn lại. Kết quả kháng khuẩn dòng 134N ở cao chiết từ lá trứng cá nồng độ 200 mg/ml (khoảng vô khuẩn đường kính bằng 23 ± 1,732 mm) cao hơn với nghiên cứu của Sukatta et al., 2010 trên cao chiết vỏ trái chôm chôm (khoảng vô khuẩn đường kính bằng 18,83 ± 0,98 mm) và gần với kết quả cao chiết vỏ trái măng cụt khả năng kháng P. acnes với đường kính khoảng vô khuẩn 23,83 ± 0,98 mm cứu của Sukatta et al., 2010. Các nồng độ cao Trứng cá đều có khoảng vô khuẩn lớn hơn so với kháng sinh đối chứng levofloxacin, cho thấy khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % cao hơn kháng sinh đối chứng. Sự đề kháng của vi khuẩn P. acnes với các loại kháng sinh ngày càng gia tăng do sự lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá trong thời gian kéo dài (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013). Theo 2 nghiên cứu của Ross et al., 2001 và Ross et al., 2002 đột biến gen 16S và 23S rRNA chính là nguyên nhân gây ra việc đề kháng của P. acnes đối với các loại kháng sinh. Đặc biệt các kháng sinh như erythromycin và clindamycin tỷ lệ đề kháng càng gia tăng. Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolon (ciprofloxacin, levofloxacin ) đã được báo cáo gần đây với tỷ lệ đề kháng 9,6 % tại Ấn độ năm 2016 (Kabir et al., 2016). 4.2.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes của cao chiết từ lá cây Trứng cá là 10 mg/ml. Nhiều nghiên cứu khác của lá cây Trứng cá có khả năng ức chế 43
  54. vi khuẩn gây bệnh, theo Yasunaka (2005) cho rằng hoạt tính khác khuẩn của cao chiết lá Trứng cá được xác định bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chống lại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli (C600) và Staphyloccocus aureus (209 P) có nồng độ lần lượt là 512 µg/ml và 1024 µg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Trứng cá so sánh với các loại cao chiết khác trên cùng vi khuẩn P. acnes thông qua giá trị MIC. Giá trị MIC (10 mg/ml) trong thí nghiệm này cao hơn so với một số thực vật khác đã được công bố. Theo Kumar et al., 2007 dịch chiết hoa Lài trong dung môi ethanol ức chế vi khuẩn P. acnes với giá trị MIC là 5 mg/ml. Hay ở nghiên cứu khác của Fu et al., 2007 tinh dầu hoa Hương thảo (Rosmarinus offcinalis L.) hoạt tính kháng P. acnes có giá trị MIC 0,56 mg/ml. Dịch chiết nước từ E. cochinchinesis và S. offcinalis hoạt tính kháng P. acnes có giá trị MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml. Mặc khác khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Trứng cá cao hơn so với cao chiết ethyl acetat lá Ô môi có giá trị MIC = 30 mg/ml (Phùng Thị Yến Thanh, 2015) Trong thí nghiệm thực hiện, khảo sát hoạt tính kháng P. acnes của dịch chiết được tiến hành trên một dòng vi khuẩn không có sự khảo sát khả năng chống chịu của dòng vi khuẩn và kháng với kháng sinh levofloxacin là kháng sinh phổ kháng khuẩn rộng; điều này có thể giải thích tại sao khả năng kháng P. acnes của cao chiết ethanol lá Trứng cá này cao hơn so nghiên cứu khác. Mặc khác, giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá cao hơn so với các công bố trước là so phương pháp chiết xuất khác nhau, thành phần hoạt chất có trong các loài khác nhau và sử dụng loại dung môi khác nhau. 4.2.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá Kết quả phân tích định tính cho thấy trong cao chiết dịch chết ethanol của lá Trứng cá có sự hiện diện của các hợp chất như flavonoid, saponin, tanin. Kết quả này tương ứng với nghiên cứu của Puguh (2014). Theo Puguh (2014) dịch chiết lá Trứng cá có hàm lượng cao phenol cao như flavonoid, tanin, polyphenol. Flavonoid: là chất có cấu tạo khung kiểu C6-C3-C6. Flavonoid được biết là chất có tác dụng hạ đường huyết và phục hồi tế bào β của tuyến tụy, chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống dị ứng, điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh, kháng oxy hóa (Harleen et al., 2011). Saponin: trong tự nhiên nó thường tồn tại chủ yếu dạng vô định hình, hòa tan tốt trong cồn và nước, nhưng không hòa tan trong các dung môi hữu cơ không phân 44
  55. cực như benzen và n-hexan. Saponin có vị đắng chát và vô cùng độc hại, vì chúng gây chứng thiếu máu tán huyết. Tuy nhiên, ở một lượng nhỏ, dịch chiết thực vật chứa hợp chất saponin có khả năng ức chế sự gây viêm (Karr, 2007). Tanin: đặc trưng bởi vị đắng chát do đó những dịch chiết từ cây có tanin luôn có những vị này. Ngoài ra, hợp chất tanin có khả năng kháng E. coli và những vi khuẩn Gram dương gây hại là một đặc tính nổi bật của tanin (Kunwar, 2010). Tanin có nhiều hiệu quả sinh học cao như khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, chống đột biến, chống đái tháo đường và có vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mãn tính. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol lá trứng cá là do chứa hợp chất flavonoid, tanin, saponin. Theo Cushine và Andrew (2005) hầu hết các hợp chất flavonoid có tác dụng kháng khuẩn do: kiềm hãm và ngăn sự phân chia của vi khuẩn, ức chế enzym transpeptid ngăn quá trình tổng hợp mucopeptid (yếu tố tạo nên sự bền vững thành vi khuẩn), khi gắn lên màng vi khuẩn làm cho thay đổi tính thấm của màng, ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic và RNA của vi khuẩn và ức chế sự hoạt động của hyaluronidase (enzym giúp cho vi khuẩn tấn công sang các tế bào lân cận). Bên cạnh đó các vòng carbon 6 cạnh có gắn các nhóm OH cũng gây ảnh hưởng đến thành tế bào vi khuẩn. Các nhóm hợp chất này sẽ xuyên qua thành tế bào vi khuẩn sau đó bám chặt vào những cấu trúc ở kích thước phân tử trong tế bào vi sinh vật như protein và glycoprotein, điều này làm rối loạn quá trình sinh tổng hợp của các vi sinh vật đó gây chết vi sinh vật (Immin, 2006). Bên cạnh đó hợp chất tanin có khả năng kháng những vi khuẩn Gram dương gây hại là một đặc tính nổi bật của tanin (Kunwar, 2010). 45
  56. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN - Bốn bộ phận cây Trứng cá lá, vỏ thân, quả chín và quả non chiết suất bằng phương pháp đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % hiệu suất chiết thu được lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 %; 24,82 %. - Các loại cao chiết từ cây Trứng cá đều có khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N P. acnes. Trong đó cao chiết từ lá Trứng cá cho thấy hiệu quả kháng khuẩn cao nhất trong 4 loại cao với đường kính khoảng vô khuẩn dao động ở 3 nồng độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml từ 16,33 mm đến 23 mm. - Nồng độ MIC cao chiết lá trứng cá đối với dòng vi khuẩn 134N là MIC = 10 mg/ml. - Cao chiết ethanol từ lá trứng cá có chứa các hợp chất flavonoid, saponin và tanin. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá là do chứa hợp chất flavonoid, tanin, saponin. 5.2. ĐỀ NGHỊ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cây Trứng cá để gia tăng hiệu suất chiết. Nghiên cứu chiết xuất các phân đoạn từ lá Trứng cá và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Propionibacterium acnes của các cao phân đoạn. Phân lập các hợp chất tinh khiết cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất từ lá Trứng cá từ đó làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất dược phẩm có khả năng điều trị bệnh trứng cá. 46
  57. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arunasindhe M., Yadav D. and Chandrashekaz A. (2013). Antiodant and in vivo anti-hyperghicemic activity of Muntingia calabura leaves extracts. Der Pharmacia Lettre. Vol. 5. p. 427-435. 2. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nxb Y học Hà Nội. Hà Nội. PL1.1 3. Brovelli E. E. , Chansakaow S., Farias D., Hongratanaworakit T., Botero M., Vejabhikul S., Craker L. E. (2005). Antimicrobial Activity of Herbal extracts on Staphyloccocus aureusand Propionibacterium acnes. Proc. WOCMAP III, Vol. 5 .p. 97-104 4. Chanwitheesuk, Teerawutgulrag A. and Rakariyatham A. (2005). Screening of antioxidant activity and antioxidant compounds of some edible plants of Thailand. Food Chem. Vol. 92. p. 491-497 5. Charde Y. M., Sharma P. H., Choudhary N. G. and Avari J. G. (2012). Development and evaluation of herbal formulation for the treatment of acne. p. 2250-2260. 6. Chen J. J, Lin R.W., Duh (2004). Flavones and cytotoxic constituens from the stem bark of Muntingia calabura. Journal Chin Chem Soc. Vol. 51. p. 655-670. 7. Chen J.J, Lee H. H, Duh C. Y, Chen I. S (2005). Cytotoxic chalcones and flavonoids from the leaves of Muntingia calabura. PlantaMod.Vol. 7. p. 970. 8. Chin, W. Y. (1989). Aguide to the wayside trees of Singapore. BP Singapore sciene centre. p-145. 9. Coates P., Vyakrnam S., Eady E. A., Jones C. E. , Cove J. H., Cunliffe W. J. (2002). Prevalence of antibiotic-resistant propionibacteria on the skin of acne patients: 10-year servillance dât and snapshot distribution study. Br J Dermatol. Vol. 146. p. 840-848. 10. Csukas, Baniz B. ,Rozgonyi F. (2004). Studies on the cytotoxic effects of Propionibacterium acnes strains isolated from cornea. Microb Pathog.Vol. 36. p.171-174. 11. Cushnie and Andrew (2005). Antimicrobial activity of flavonoid. International Journal of Antimicrobial Agent. Vol. 26. p. 343-356. 47
  58. 12. Crawford, W. W., L. P. Crawford, R. B. Stoughton and R. C. Cronrll (1979). Laboratory induction and clinical occurrence of combined clindamycin and erythromycin resistance in Corynebacterium acnes. Journal Invest Dermatol. Vol. 72. p. 187-190. 13. Degitz, K., M. Placzek., C. Borelli and G. Plewig (2007). Pathophysiology of ance. J Dtsch Dermatol Ges Vol. 5. p. 316-320. 14. Đỗ Trung Đàm (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Viên Dược Liệu. Nhà Xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 15. Douglas and Gunter (1946). Propioibacterium acnes. Name and taxonomic classification. p. 1 16. Downie, M. M. T., R. Guy and T. Kealay (2004). Advance in sebaneous gland research: potential new approaches to acne management. International journal of cosmetic science.Vol. 26. p. 291-311. 17. Dreno, B., A. Reynaud, D. Moyse, H. Habert and H. Richet (2001). Erythromycin- resistant of cutaneous bacterial flora in acne. Eur journal Dermatol. Vol. 11. p. 549-553 18. Dương Thị Phượng Liên và Nguyễn Nhật Phương (2014). Ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến từ khả năng ly trích và sự ổn định anthocyanin từ bắp cải tím (Brassica oleracea). Tạp chí Nghiên cứu khoa học, trường Đại học Cần Thơ. Số 1. tr. 1-7 19. Eady and E. Ingham (1994). Propionibacterium acnes friend or foe. Rev Med Microbiol. Vol. 5. p. 163-173. 20. Fu, Y., Zu, Chen, Efferth, T., Liang, H., Liu, Z. (2007). Investigation of antibacterial activity of rosemary essential oil against Propionibacterium acnes with atomic force microscopy. Planta Medica. Vol.73.p.1275-1280 21. Funke, G., A.V. Graevenitz, J.E. Clarridge, and K.A. Bernard (1997). Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clinical Microbiol. Vol. 10. p.1 25-159. 22. Hamnerius, N. (1996). Acnes-aetiology and pathogenesis. Treatment of Acne. Vol.32.p.29-39 23. Hans B. , Kilian M. (2010). Population Genetic analysis of Propionibacterium acnes identifies a subpopulation and epidemic clones associates with Acne. PloS ONE.5. 48
  59. 24. Hana M. H., Camelia A., Suzan A.M., Simona-Carmen Litescu, Hala I., and Fatma U. A. (2013). Biological activities of the hydro-alchoholic and aqueous extracts of Achillea bieberster Afan. (Asteraceae) grown in Jordan. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. Vol.7. p. 1686-1694. 25. Harleen, K.S., Bimlesh, Sunil P., Prashant T., Manoj S., Pardeep S. (2011). A review of phytochemistry and pharmacology of flavonoid. Internationale pharmaceuricasciencia. 26. Hayashi N., Akamatsu H., Kawashima M. (2008). Acne Study Group. Establishment of grading criteria for acne severity. J Dermatol. Vol. 35. p. 255- 260. 27. Higaki S., Nakamura M., Morohashi M., Yamagishi T. (2004). Propionibacterium acnes biotypes and susceptibility to minocyline and keigai-rengyno-to. Int J Dermatol. Vol. 42. p. 103-107. 28. Holdeman, L.V., E.P. Cato and W.E.C. Moore. (1977). Anaerobe laboratory manual, 4th ed. Anaerobe Laboratory. 29. Hywel, C.W., P.D. Robert and G.Sarah. (2011). Acnes vulgaris Vol.379.p.361-372. 30. Humgra T., Tanzeel A., Farzama A. and Hina R. (2013). The historic panorama of ance vulgaris. International Journal of Advanced. Vol. 2. p.99-104. 31. Ibrahim , Abdulla M.A., Abdewahab S.I. (2012). Leaves extract of Muntingia calabura protects against gastric ulcer induced by ethanol in Sprague-Dawley rats. Clin Exp Pharmacol. 32. Immin P., Sinning C. H. and Meyer A. (2006). Drugs, their targets and the nature and number of drug targets. Drug Discovery. Vol.5.p.821-834. 33. Jappe, U., E. Ingham, J. Henwood and K.T.Holland (2002). Propionibacterium acnes and inflammation in acne. P.Acne Has T-cell Mitogenic Activity. British Journal of Dermatology. 34. Johnson, J.L and C.S Cummin. (1972). Cell wall composition and deoxyribonucleic acid similarities among the anaerobic coryneform, Classical propionibacterial and strains of Archnia propionica. J Bacteriol.Vol.109.p.1047-66. 35. John Harley and Lansing Prescott (2002). Laboratory Exercises in Microbiology 5th editon. The McGraw-Hill Companies. French. 49
  60. 36. Kabir Sardana, Tanvi Gupta, Bilpul Kumar, Hemant K.G. and Vijay K.G. (2016). Cross-sectional pilot study of antibiotic resistance in Propionibacterium acnes strains in Indian acne patients using 16S-RNA polymerase chain reaction: A comparison a mong treatment modalites inclucing antibiotics benzoyl peroxide and iso tretionin. Indian Journal of Dermatology. Vol. 61. p. 45-52. 37. Gomthi R., Anusuya N. and Mainan S. (2013). A dietary antioxidant supplementation of Jamaican cherries (Muntingia calabura L.) attenuates inflammatory related disorders. Food science an biotochnology. Vol. 22. p. 787- 794 38. Kar, A. (2007). Pharmaocgnosy and Pharmacobiotechnology. Revised-Expanded Second Edition. New Age International Limited Publishres New Delpji.p. 332-336. 39. Karthyaini, Suresh K. (2012). Pharmacognostic evaluation, in vitro antioxidant and in vivo anti-inflammatory studies of Muntingia calabura L J Global Trends Pharm Sci. Vol. 3. p. 805-811. 40. Kishishita, M., T.Ushijima, Y. Ozaki and Y.Ito. (1980). New Medium for Isolating Propionibacteria and Its Application to Assay of Normal Flora of Human Facial Skin. Applied and environment Microbiolog.p. 1100-1105 41. Keneda N., Pezzuto JM, Soejarto DD, Kinghorm AD, Farmsworth NR, Santisuk J, Tuchinda P, Udchachon J, Reutrakul V. (1991). New cytotoxic flavonoids from Muntingia calabura L. roots. Plant anticancer agents. 42. Kennedy, S.H., Y. Manevich and J. Biaglow. (1995). Benzoyl peroxide acts as a promoter of radiation induced maligant transformation in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 212 p.1118-1125. 43. Kunwar, R.M., Shrestha K.P. and Bussmann R.W. (2010). Traditional herbal medicine in far-west Nepal: a pharmacological appraisal. Journal of Ethnobiolology and Ethnomedicine. Vol. 6. p.35 44. Kumar, Jayaveera, Ashok Kumar, Umachigi, Vrushabendra Swamy, Kishore Kumar (2007). Antimicrobial effect of Indian medicinal plants against acne- inducing bacteria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. Vol.6.p.717-723. 45. Layton AM (2006). A review on the treatment of acne vulgaris. Int J Clin Pract. Vol.60.p.64-72. 46. Leyden, JJ. (1976). Antibiotic resistant acne.Vol.17.p.593-596. 50
  61. 47. Leyden J.J, McGinley K.J, and Vowels B. (1998). Propionibacterium acnes colonization in acne and noacne. Dematogogy. Vol.196.p.55-58. 48. Leyden, J. (2003). A review of combinatination therapies for the treatment of acne vulgaris. J. Am Acad Dermatol. Vol.49.p.200-210. 49. Lê Kinh Duệ (2000). Bệnh trứng cá. Bách khoa tòa thư bệnh học. Tập 3. NXB từ điển bách khoa.Tr 72-74 50. Loveckova, Y. and I. Havlikova (2002). A microbiological approach to acne vulgaris. Biomes Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. p. 29-32 51. Luangnarumitchai S., LamLerthon and Tiyaboonchai (2007). Antimicrobial activity of essential oils against five strains of Propionibacterium acnes. Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 34. p. 60. 52. Mahmood N., Nasir N.L.M., Rofiee M.S, Tohid S.F.M, Ching S.M (2013). Muntingias calabura: A review os its traditinal uses, chemical properties and pharmacological observations. 53. Mallon E., Newton JN., Klasen A, Stewart-Brown SL, Ryan T., Finlay AY (1999). The quality of life in acne: comparison with genaral medical conditions using generic question naire. British Journal of Dematology.Vol. 140. p. 672-676. 54. McDowell, A., S. Valanne and G. Ramage (2005). Propionibacterium acnes type I and II represent phylogenetically distinct groups. J Clin Microbiol. Vol. 43. p. 326- 34 55. Morton, J.F. (1987). Jamaica cherry. In Fruits of warm climates. Miani.p. 65-69. 56. Nishijima, S., I. Kurokama, N. Katoh, and K. Watanabe (2000). The bacteriology of acne vulgaris and antimicrobial susceptibility of Propionibacterium acnes and Staphylococcus epidermidis isolated from acne lesions. J Dermatol. Vol. 27. p. 318-323 57. Nivethetha M., Jayasris J., Brimaha P. (2009). Effects of Muntingia calabura L. on isoproterneol incluced myocardial infarcton. Singapore medical Journal. Vol. 50. p. 300-306. 58. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyển và Phạm Văn Ty (2009). Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục. Hà Nội. 59. Ngô Thu Vân và Trần Hùng (2011). Dược liệu học tập 1.tr. 42-43, 354-382. 51
  62. 60. Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng (2013). Tỷ lệ mắc Propionibacterium acnes và sự đề kháng in vitro đối với kháng sinh ở bệnh nhân mụn trứng cá thông thường tại bệnh viện da liễu TPHCM năm 2011-2012. Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 17. Phụ bản số 1. 61. Nguyễn Hữu Sáu (2010). Cập nhật điều trị mụn trứng cá. Tạp chí thông tin Y Dược. Số 7.Tr3-5 62. Nguyễn Trọng Tuân (2007). Bài giảng chiết xuất-Phần Phương pháp chiết xuất. Trường Đại học Cần Thơ. Khoa Khoa học-Cần Thơ.tr32. 63. Park Jumho, Lee Jongsung, Jung Eunsun, Park Yumi, Kim Kukhyun, Park Byughwa, Kim Jieun, Park Deokhoon (2004). In vitro antibacterial an anti- inflammatory effects of honokiol and magnolol against Propionibacterium sp European journal of Pharmacology. Vol. 496. p. 189-195. 64. Pawin, H., C. Beylot and M. Chivot (1998). Physiopathology of acnes vulgaris, new understanding of the treatments. Eur J Dermatol. Vol. 14. p. 4-12. 65. Plewig G, Kligman AM, editors. Acne and Rosacea. 3rd ed. New York: Springer- Verlag (2000). p. 744. 66. Priyam S., Shruti S., Nidhi M. and Naraya P.Y. (2014). New perpective on antiacne plant drug. Contribution to modern thẻapeutics. Biomed Res Int. 67. Preethi K., Vijayalaskshimi N., Shamma R. and Sasikumar J.M. (2010). Invitro antioxidant activity of extracts of fruits of Muntingia calabura L. From India. Pharmacognosy Journal. Vol. 2. p. 11-18. 68. Ross J. I., E. Carnegie, A. M. Snelling, P. Coates, J. H. Cove an E. A. Eady (2001). Prevalence of antibiotic resistant propionibacteria on the skin of acne patients form six Europan countries. JEASV.15. 69. Ross J. I., E. Carnegie and J. H. Cove (2002). Detection of transposons Tn5432- mediated macrolide- lincosamidestreptogramin B (MLSB) resistance in cutaneous propionibacteria from six European cities. J Antimicrob Chemother. Vol.49.p.165- 170. 70. Roebuck H (2006). Acne- intervence early. The nurse Practitioner. p. 24-45. 71. Phạm Văn Hiển (1997). Bệnh trứng cá. Nội san da liễu. số 4. 1997. 52