›

Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học cặn Metanol của loài sao biển đỏ Anthenea aspera

pdf 53 trang thiennha21 15/04/2022 5010
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học cặn Metanol của loài sao biển đỏ Anthenea aspera", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_can_metanol_cua_loai.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu thành phần hóa học cặn Metanol của loài sao biển đỏ Anthenea aspera

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC   VŨ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CẶN METANOL CỦA LOÀI SAO BIỂN ĐỎ ANTHENEA ASPERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ HÀ NỘI - 2017 Hà Nội – 2017
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC   VŨ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CẶN METANOL CỦA LOÀI SAO BIỂN ĐỎ ANTHENEA ASPERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Người hướng dẫn khoa học GV: Nguyễn Anh Hưng HÀ NỘI - 2017 Hà Nội – 2017
  3. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài khóa luận tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Anh Hưng, cùng các anh (chị) phòng Hóa sinh hữu cơ -Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Hóa học- trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã đào tạo và trang bị cho em những kiến thức cơ bản giúp em thực hiện khóa luận này. Đồng thời, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện để em có thể thực hiện khóa luận thành công. Trong quá trình thực hiện khóa luận, em không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong các thầy cô và các bạn nhiệt tình đóng góp ý kiến để đề tài của em được hoàn thiện hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Thu Hiền
  4. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học cặn Metanol của loài sao biển đỏ Anthenea aspera” là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa của thầy giáo Nguyễn Anh Hưng. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Vũ Thị Thu Hiền
  5. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1.Đặc điểm sinh học và phân bố của sao biển Anthenea aspera 3 1.2. Thành phần hóa học các loài thuộc lớp sao biển Asteroidea 4 1.2.1. Các hợp chất steroid 4 1.2.2. Nhóm hợp chất ceramide và cerebroside 8 1.2.3. Lipid, axit béo và axit amin 12 1.2.3.1. Lipid 12 1.2.3.2. Axit béo 13 1.2.3.3. Axit amin 15 1.2.4. Một số hợp chất khác 16 2.1. Nguyên liệu 17 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất. 17 2.2.1. Các phương pháp chiết mẫu. 17 2.2.1.1. Chọn dung môi chiết. 17 2.2.1.2. Quá trình chiết. 19 2.2.2. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ. 21 2.2.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí. 21 2.2.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. 21 2.2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc kí. 22 2.2.2.3.1. Sắc kí cột (C.C). 22 2.2.2.3.2. Sắc kí lớp mỏng 23 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. 23 2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). 24 2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS). 24
  6. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR). 25 2.3.3.1. Phổ 1H-NMR 25 2.3.3.2.Phổ 13C-NMR 25 2.3.3.3. Phổ DEPT 25 2.3.3.4. Phổ 2D-NMR 26 2.4. Quy trình phân lập các hợp chất 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD12. 30 3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD13. 32 3.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD14. 39 KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
  7. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT [α]D Độ quay cực Specific Optical Rotation 13C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H - NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H 1H COSY chemical shift correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc ký cột column chromatography DEPT Distortionless Enhancement by polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom 13 om bardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Quantum coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao Hight Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm Metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOSY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer chromatography
  8. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ Bảng 1.1. Danh sách một số loài Sao biển chi Anthenea 3
  9. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Ảnh minh họa mẫu sao biển Anthenea aspera. 17 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất 28 Hình 3.1. Phổ 1H NMR của hợp chất SD12 30 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất SD12 31 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất SD13 32 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất SD13 33 Hình 3.5. Phổ 13C -NMR của hợp chất SD13 34 Hình 3.6. Phổ COSY của hợp chất SD13 35 Hình 3.7. Phổ HMQC của hợp chất SD13 36 Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất SD13 37 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất SD14 40 Hình 3.10. Phổ 13C -NMR của hợp chất SD14 41
  10. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia ven biển, nằm ở bờ Tây của Biển Đông với dải bờ biển chạy dài trên 3260 km với diện tích hơn 1 triệu km2. Vùng biển nước ta có khoảng 3.000 hòn đảo lớn, nhỏ và 2 quần đảo xa bờ là Hoàng Sa và Trường Sa, được phân bố khá đều theo chiều dài của bờ biển đất nước.Các loài động vật thực vật biển Việt Nam rất phong phú gồm trên 12.000 loài sinh vật biển. Các nghiên cứu đã chứng minh nguồn lợi hải sản Việt Nam phong phú đa dạng bao gồm khoảng trên 2.000 loài cá, gần 6.000 loài động vật đáy, 653 loài tảo, 5 loài rùa, 12 loài rắn biển Trong đó, có một số nhóm sinh vật biển có giá trị kinh tế quan trọng như sao biển,cá, tôm, mực đã được xác định khu vực phân bố, trữ lượng và khả năng khai thác.Đặc biệt trong một số năm gần đây, các nhà khoa học Viện KHCN VN đã tìm được nhiều chất có giá trị dược liệu quý từ các loài hải miên, da gai, san hô, sứa biển Đây là hướng đi rất tích cực trong nghiên cứu, sử dụng hợp lý nguồn lợi sinh vật biển. Ngoài ra, việc thường xuyên nghiên cứu, biên tập Sách Đỏ Việt Nam cũng góp phần đáng kể vào việc bảo vệ nguồn lợi sinh vật biển. Trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Tuy nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta thì đến nay những công trình nghiên cứu trong nước vẫn còn ít và tản mát, đặc biệt là những nghiên cứu về lớp Sao biển (Asteroidea) . Lớp Asteroidea có khoảng 1800 loài Sao biển sống trên hành tinh, phân bố ở tất cả các đại dương trên thế giới gồm cả Thái Bình Dương, Đại Tây Dương, Ấn Độ Dương, Bắc Cực và các vùng đại dương phía Nam. Cho đến năm 2006, trên thế giới đã có khoảng 80 loài sao biển khác nhau được nghiên cứu về thành phần hóa học. Có khoảng 15-20 dược phẩm có nguồn gốc từ biển đang được thử nghiệm trong giai đoạn lâm sàng, và hầu hết là để điều trị ung thư, giảm đau hay chống viêm nhiễm. Trong các loài sinh vật biển, có một số ngành như ngành da gai, hải miên, động vật có vỏ rất phát triển hệ thống “hàng rào sinh học” đóng một vai trò quan trọng trong việc chống lại sự tấn công của các vi sinh vật, động thực vật kí sinh hay các động vật ăn thịt khác. Vũ Thị Thu Hiền 1 K39B – Sư phạm Hóa học
  11. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Cho đến nay, Việt Nam chưa có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học của sao biển. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học cặn Metanol của loài sao biển đỏ Anthenea aspera” . Vũ Thị Thu Hiền 2 K39B – Sư phạm Hóa học
  12. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: TỔNG QUAN 1.1.Đặc điểm sinh học và phân bố của sao biển Anthenea aspera Sao biển Anthenea aspera thuộc chi Anthenea, họ Oreasteridae, lớp Asteroidea, ngành Echinodermata (động vật da gai). Hiện nay, chi Anthenea có khoảng 31 loài. Chúng phân bố ở tất cả đại dương trên thế giới, đặc biệt phải kể đến các vùng biển Australia, Đông Thái Bình Dương, Bắc Mỹ và vùng biển nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương [2]. Bảng 1.1. Danh sách một số loài Sao biển chi Anthenea STT Tên loài STT Tên loài 1 Anthenea acanthodes 16 Anthenea mertoni 2 Anthenea acuta 17 Anthenea mexicana 3 Anthenea aspera 18 Anthenea obesa 4 Anthenea australiae 19 Anthenea obtusangula 5 Anthenea conjugens 20 Anthenea pentagonula 6 Anthenea crassa 21 Anthenea polygnatha 7 Anthenea crudelis 22 Anthenea regalis 8 Anthenea diazi 23 Anthenea rudis 9 Anthenea edmondi 24 Anthenea sibogae 10 Anthenea elegans 25 Anthenea spinulosa 11 Anthenea flavescens 26 Anthene tuberculosa 12 Anthenea globigera 27 Anthenea viguieri 13 Anthenea godeffroyi 28 Anthenea nuda 14 Anthenea granulifera 29 Anthenea obtusangula 15 Anthenea grayi 30 Anthenea pentagonula 31 Anthenea spinulosa Vũ Thị Thu Hiền 3 K39B – Sư phạm Hóa học
  13. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Loài sao biển Anthenea aspera chỉ thấy xuất hiện ở vùng biển Indo-Pacific bao gồm Nam Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Singapour và Bắc Australia, vùng nước nông. Cơ thể sao biển Anthenea aspera dẹp theo chiều lưng bụng, có cấu trúc cơ thể đối xứng, thường có hình sao hoặc đối xứng 5 cánh tỏa ra từ vùng trung tâm. Đường kính của một con sao biển Anthenea aspera trường thành khoảng 15-20 cm. Mặt lưng của chúng hơi lồi lên, màu sắc của chúng thay đổi từ cam đến đỏ, bụng phẳng, có miệng. Lỗ miệng có màu sặc sỡ. Bên trong quanh miệng là vòng ống nước, từ đó phát ra năm ống nước nhánh hình nan quạt tỏa ra năm cánh, mỗi ống nước nhánh có hai dãy chân ống. Sao biển Anthenea aspera, giống như tất cả các loài sao biển khác chúng di chuyển nhịp nhàng bởi hệ thống các chân ống được điều khiển bởi thân chính, chân ống cũng là nơi trao đổi khí. Sao biển di chuyển với tốc độ rất chậm từ 5 đến 10cm trong 1 phút.Thức ăn chủ yếu của sao biển Anthenea aspera là các loài có vỏ như trai, sò, ốc, vẹm biển hoặc san hô, các loài cá nhỏ, mực, tôm và các loài thân mềm khác. Khi thiếu thức ăn chúng ăn thịt cả đồng loại. Một số loài phát triển rất nhanh là nguyên nhân gây mất cân bằng sinh thái [3]. 1.2. Thành phần hóa học các loài thuộc lớp sao biển Asteroidea Cho đến nay đã có nhiều loài sao biển được nghiên cứu hoá học, đã phân lập và nhận dạng được nhiều chất, thuộc các nhóm chất khác nhau. Thành phần hóa học chính của các loài thuộc lớp sao biển này chủ yếu là các steroid và hợp chất của nitơ (ceramide, cerebroside, alkaloid, nucleoside ). Ngoài ra, còn chứa các thành phần khác như: carboxylic acid, triterpenoid, 1.2.1. Các hợp chất steroid Steroid là lớp chất phổ biến nhất ở sao biển, đặc biệt là nhóm steroid phân cực. Các steroid phân cực thường được chia làm 4 loại: polyhydroxysteroid, steroidsulfate, glycoside polyhydroxysteroid và các asterosaponin. Vũ Thị Thu Hiền 4 K39B – Sư phạm Hóa học
  14. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Năm 2003, từ loài sao biển Certonardoa semiregularis thu thập được ở gần đảo Komun, Hàn Quốc họ đã phân lập được 13 hợp chất polyhydroxysteroid mới đặt tên là certonardosterol A-M [18]. Mạch nhánh của các hợp chất (9), (10) lần đầu tiên được tìm thấy trong các hợp chất sterol bị oxi hoá trong tự nhiên. Năm 2004, tiếp tục nghiên cứu về loài sao biển Certonardoa semiregularis nhóm nghiên cứu này đã tách được thêm được 11 hợp chất polyhydroxysteroid mới (14-24). Trong đó, năm hợp chất (14), (15), (19-24) thuộc nhóm tetrol, một nhóm chất rất hiếm khi phân lập được từ các loài sao biển đã được nghiên cứu trước đây [15-16]. Năm 2005 từ loài sao biển Certonardoa semiregularis đã phân lập được 10 hợp chất glycoside mới, kí hiệu là certonardosides A-J (25-29) [17]. Vũ Thị Thu Hiền 5 K39B – Sư phạm Hóa học
  15. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Năm 2005, từ loài sao biển Culcita novaeguineae nhóm nghiên cứu Tang HF và cộng sự đã phân lập được một loạt các hợp chất asterosaponin mới, kí hiệu là novaeguinoside A (30), novaeguinoside I (31), novaeguinoside II (32) [15]. Ở hợp chất 32, phần mạch cacbonhydrat lại có mặt của L-arabinosyl. Đây là trường hợp rất hiếm xảy ra ở các hợp chất asterosaponin. Từ dịch chiết BuOH của loài sao biển này cũng đã phân lập được thêm 3 hợp chất asterosaponin mới khác kí hiệu là 33, 34, 35[16]. Vũ Thị Thu Hiền 6 K39B – Sư phạm Hóa học
  16. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Năm 2005, nhóm nghiên cứu Phạm Quốc Long và cộng sự đã bước đầu nghiên cứu về thành phần hóa học loài sao biển Anthenea pentagonula, thuộc họ Oreasteridae trong bộ Valvatida, phân lập được hai hợp chất steroid là 5α-cholestan- 3α-ol (36); 5α-cholest-7-en-3β-ol(37) và một cụm phân tử cerebroside [1]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Guang Donga và các cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của sao biển chỉ ra thành phần steroid là những chất chuyển hóa chủ yếu, bao gồm steroid polyhydroxy tự do và sulfonyl hóa. Ngoại trừ các miếng bọt biển, sao biển được coi là nguồn phong phú nhất của polyhydroxy steroid. Thông qua sự phân bố các steroid polyhydroxy có tầm quan trọng cao trong số các loài sinh vật biển. Nói chung, các steroid polyhydroxy có cấu trúc tương tự được tìm thấy ở hầu hết các loài sao biển. Hỗn hợp phức tạp. Phần lớn các steroid có chứa 3b, 6a (hoặc b), 8,15a (hoặc b), 16b pentahydroxy cholestane. Hạt nhân, đôi khi có thêm các nhóm OH ở các vị trí 4b,5a, 7a (hoặc b), và thỉnh thoảng ở 14a. Chuỗi (25S) -26-hydroxy thường là gặp chuỗi bên ít phổ biến được hydroxyl hóa ở C (24) với cấu hình (S). Trong một vài chuỗi bên, chức năng axit 26-carboxylic được tìm thấy là amit dẫn xuất của taurine. Polyhydroxy sterol thường xảy ra ở dạng sulfonyl hóa, và trong một vài trường hợp nó có dạng phosphoryl hóa. Vũ Thị Thu Hiền 7 K39B – Sư phạm Hóa học
  17. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Viện Hóa học các sản phẩm tự nhiên, viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu về Steroid và Glicoside của sao biển chỉ ra: có 5 glycosid steroid mới, luzonicosides BE (2-5), thuộc nhóm cấu trúc hiếm có của glycosid biển, có chứa các phân tử carbohydrate kết hợp với macrocycle, và một chuỗi carbohydrate chuỗi carbohydrate steroid glycosid, luzonicoside F (6) liên quan đã được phân lập từ con sao biển Echinaster luzonicus cùng với các cyclic steroid glycoside luzonicoside A (1) đã biết trước đó. Các cấu trúc của các hợp chất 2-6 được thiết lập bằng các kỹ thuật NMR và ESIMS rộng lớn cũng như các biến đổi hóa học. Luzonicoside A (1) ở nồng độ 0,01-0,1 μM đã được chứng minh là có hiệu lực. trong kích thích hoạt động lysosomal, tăng mức độ ROS nội bào và tổng hợp NO trong các đại thực bào chuột RAW 264.7. Luzonicoside D (4) ít hoạt động hơn trong các biotests này. 1.2.2. Nhóm hợp chất ceramide và cerebroside Có hơn 90 dẫn xuất ceramide đã được phân lập và xác định từ 16 loài sao biển. Ceramide là dạng đơn giản nhất của các sphingolipid. Các ceramide là một họ lipid có cấu tạo bởi một axit béo mạch dài gắn với các aminoancol kiểu sphingosine qua các liên kết amit, một trong những thành phần cơ bản cấu thành sphingomyelin ở lớp lipid kép ở màng tế bào. Cerebroside là glycosphingolipid – thành phần quan trọng trong cơ động vật và màng tế bào thần kinh. Chúng được cấu tạo bởi một ceramide gắn với một hoặc hai đường tại C-1. Hợp phần đường có thể là glucose hoặc galactose, và vì thế hai loại cerebrosie chính được gọi là glucocerebroside và galactocerebroside.Glucocerebroside là cerebroside chính được tìm thấy ở sao biển còn galactocerebroside thì rất hiếm khi có mặt . Một số lượng lớn các glucocerebroside được phân lập và nghiên cứu hoạt tính từ sao biển trong số đó có các chất có hoạt tính gây độc tế bào. Vũ Thị Thu Hiền 8 K39B – Sư phạm Hóa học
  18. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Ceramide Phytosphingosine Cerebroiside Năm 1988, từ loài sao biển Acanthaster planci, Kawano cùng các cộng sự đã phân lập được các hợp chất đều là các glucocerebroside, đặt tên là acanthacerebroside A (tên gọi khác là 1-glucopyranosyl-2-(2-hydroxy tetraco- sanoylamino)-1,3,4-hexadecanetriol) (38); acanthacerebroside C (1-glucopyranosyl -2-(2-hydroxy hexadecanoyl amino)-13-docosene-1,3,4-triol) (39); acantha- cerebroside D (40); acanthacerebroside E (41); acanthacerebroside F (42) [9] và hai hợp chất acathalactoside A, acathalactoside B (43-44), các hợp chất này được phân lập và chứng minh bởi sự nghiên cứu của nhóm tác giả Sugiyama và các cộng sự. Năm 1990, Kawano nghiên cứu về loài sao biển Acanthaster planci đã phân lập được một ceramide khác là acanthaganglioside A (46) [10]. 38 39 Vũ Thị Thu Hiền 9 K39B – Sư phạm Hóa học
  19. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 40 41 42 43 45 44 Năm 2002, từ loài sao biển Luidia maculata thu được ở vùng biển Hakata, Fukuoka, Nhật Bản, Satoshi và các cộng sự đã phân lập được hai hợp chất glucocerebroside mới là luidiacerebroside A (46), luidiacerebroside B (47) và các hợp chất cerebroside đã biết là: (1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3R,4E)-2-[(2R)-2- hydroxydocosanoylamino]-14-methyl-4-hexadecene-1,3-diol) (48), astrocere- broside B (49), acathacerebroside B (50) [13]. Vũ Thị Thu Hiền 10 K39B – Sư phạm Hóa học
  20. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Gần đây năm 2006, từ loài Sao biển Luidia maculata, Masanori và cộng sự đã phân lập được các hợp chất ceramide, ký hiệu là: LM Cer-1-1 (51); LM Cer-2-1 (52) và LM Cer-2-6 (53). Trong đó, hợp chất (51) lần đầu tiên được phân lập từ loài sao biển này. Các hợp chất trên đều thể hiện khả năng chống sự tăng lượng đường trong máu [12]. 46 47 48 49 Vũ Thị Thu Hiền 11 K39B – Sư phạm Hóa học
  21. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.2.3. Lipid, axit béo và axit amin 1.2.3.1. Lipid Lipid là thành phần quan trọng trong cơ thể sống, nó có chức năng là chất dự trữ năng lượng, khi oxy hóa. Một gam lipid có thể thu được 9,3Kcal, trong khi đó 1 gam gluxit hoặc protein chuyển hóa chỉ cho 4Kcal. Lipid cung cấp năng lượng rất cao cho cơ thể gấp 2,5 lần so với protein. Trong màng sinh học, lipid ở trạng thái liên kết với protein tạo thành hợp chất lipoproteid cấu tạo nên màng tế bào. Chính nhờ các tính chất của hợp chất này đã tạo cho màng sinh vật có được tính thẩm thấu chọn lọc, tính cách điện. Đó là những hợp tính hết sức quan trọng của tế bào sinh vật. Ngoài ra, lipid còn có thể liên kết với nhiều chất đơn giản khác thành những hợp chất có tính chất sinh học khác nhau. Những phức hợp đó có vai trò quan trọng trong các hoạt động thần kinh và bắp thịt. Vũ Thị Thu Hiền 12 K39B – Sư phạm Hóa học
  22. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Lipid không tan với nước, nhưng chúng có khả năng hòa tan nhiều loại vitamin quan trọng như : A, K, D, E và giúp ruột hấp thụ tốt hơn các loại sinh tố này. Vì thế nếu khẩu phần thiếu lipid lâu ngày thì động vật dễ mắc các bệnh thiếu vitamin đáng kể trên. Năm 2003, nhóm nghiên cứu của tác giả GS. TS Phạm Quốc Long và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng lipid tổng của 3 loài Sao biển : Sao biển Linckia laevigata , sao biển Culcita novaeguineae, sao biển Protoraester nodosus thu được ở vùng biển Quảng Ninh cho hàm lượng lipid tổng khá cao lần lượt là 2,32%, 1,59%, 1,85%. Năm 2013 nhóm nghiên cứu của tác giả Đoàn Lan Phương và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích hàm lượng lipit tổng thu nhận được cho thấy trong năm loài sao biển ( Arachaster typicus, Acanthasterplanci, Linckia laevigata, Culcita noveaguineae, Athenea aspera) được đưa vào phân tích thì có mẫu sao biển Anthenea aspera thu tại Cô Tô có hàm lượng lipit cao nhất 1,34%, và thấp nhất là sao biển Linckia laevigata thu tại Hải Vân-Sơn Trà 0,84%. Hàm lượng lipit các mẫu sao biển Culcita noveaguineae, Acanthaster planci và Arachaster typicus thu được lần lượt là 1,21; 0,90 và 0,95% so với trọng lượng mẫu tươi. Nhìn chung, các loài sao biển khác nhau có hàm lượng lipit tổng khác nhau, nhưng đều có hàm lượng lipit thấp. Năm 2016 nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Thị Thu Thủy và các cộng sự đã chỉ ra rằng năm loài sao biển ( Arachaster typicus, Acanthasterplanci, Linckia laevigata, Culcita noveaguineae, Athenea aspera) được thu thập từ vùng biển Việt Nam có thành phần lipid, axit amin và nguyên tố vi lượng. Thành phần axit béo của chúng giàu các axit béo không no thuộc nhóm ω-6 và ω-3 (20-40%) có lợi cho sức khỏe con người. 1.2.3.2. Axit béo Axit béo là hiđrocacbon no hoặc không no liên kết với một hoặc nhiều nhóm chức acid (-COOH). Phân tử tồn tại ở dạng mạch thẳng, mạch nhánh hay mạch vòng, có phân tử lượng lớn. Axit béo thường gặp là những axit béo có số C chẵn, Vũ Thị Thu Hiền 13 K39B – Sư phạm Hóa học
  23. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp mạch thẳng, có thể no hoặc không no. Ngoài nhóm chức axit, nó còn liên kết với một số nhóm chức khác như: rượu, xeton Trong tế bào sống, các axit béo thường không tồn tại ở dạng tự do mà hầu hết ở dạng kết hợp trong các lipit khác nhau như: triaxiglixerol, sáp, steric, các lipid phức tạp khác nhau. Khi nghiên cứu sao biển Culcita novaeguineae thu được tại vùng biển Nha Trang và sao biển Archaster typicus thu được tại vùng biển Quảng Ninh, nhóm nghiên cứu GS. TS. Phạm Quốc Long đã xác định thành phần axit palmitic (54) với hàm lượng khá cao tương ứng là 13,814% và 13,014%. Tuy nhiên, cùng loài sao biển đỏ trên thu được tại vùng biển Quảng Ninh lại cho hàm lượng axit palmitic thấp hơn nhiều (2,535 %). 55 Thành phần axit stearic (55) của 3 loại sao biển: sao biển Archaster typicus, sao biển đỏ Protoraester nodosus và sao biển Anthenea asper, thu được tại vùng biển Quảng Ninh, được nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu GS. TS. Phạm Quốc Long và cộng sự năm 2010 cho kết quả lần lượt là: 8,851%, 7,780% và 7,330%. 56 Thành phần axit oleic (56) của sao biển Linckia larvigata và sao biển Culcita novaeguineae thu được tại vùng biển Quảng Ninh, được nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu GS. TS Phạm Quốc Long và cộng sự năm 2010 cho kết quả lần lượt như sau: 19,044% và 18,113%. Vũ Thị Thu Hiền 14 K39B – Sư phạm Hóa học
  24. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 57 1.2.3.3. Axit amin Axit amin hay amino axit là hợp chất hữu cơ có chứa nhóm cacboxyl (- COOH) và nhóm amin (NH2), vừa có tính axit, vừa có tính bazơ. Theo quan điểm dinh dưỡng người ta chia axit amin thành 2 nhóm: axit amin không thay thế và axit amin thay thế. Động vật và con người không có khả năng tổng hợp một số axit amin mà phải lấy qua thức ăn, đó là các axit amin cần thiết hoặc không thay thế được như: arginine, methionine, phenyl alanine, Các axit amin này tham dự vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể như tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh, đổi mới các sợi cơ bắp, Do vậy, nhu cầu cho cơ thể bao giờ cũng chỉ đáp ứng đủ, thừa hoặc thiếu đều gây nên bất lợi cho cơ thể. Một số axit amin có trong các loài sao biển như axit amin glutamic (6,25 – 7,85 %), α-amino propionic (2,24 – 3,62 %), glycine (7,3 – 10,4 %), lysine (0,29 – 9,87 %), phenylalanine (0,17 -3,82 %), tuy nhiên cũng thấy rằng thành phần hàm lượng là có khác biệt. Năm 2013 nhóm nghiên cứu của tác giả Đoàn Lan Phương và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích hàm lượng axit amin tổng thu nhận được cho thấy trong năm loài sao biển ( Arachaster typicus, Acanthasterplanci, Linckia laevigata, Culcita noveaguineae, Athenea aspera) tất cả các mẫu sao biển đều chứa 09 loại axit amin thiết yếu là lysine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, thrionine, valine, tyrosine và histidine. Nhìn chung hàm lượng các axit amin thiết yếu trong năm loài sao đều chênh lệch không nhiều. Năm 2016 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Tuyến Anh và các cộng sự đã nghiên cứu năm loài sao biển ( Arachaster typicus, Acanthasterplanci, Linckia laevigata, Culcita noveaguineae, Athenea aspera) được thu thập từ vùng biển Việt Nam có 17 amino axit bao gồm 9 amino axit thiết yếu được tìm thấy Vũ Thị Thu Hiền 15 K39B – Sư phạm Hóa học
  25. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp trong tất cả các mẫu sao biển với hàm lượng cao. Ngoài ra còn có thành phần nguyên tố vi lượng được xác định ở mức độ khác nhau và cho thấy các loài sao biển này có chứa nhiều các vi khoáng thiết yếu. 1.2.4. Một số hợp chất khác Những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài sao biển cho thấy ngoài các steroid, ceramide và cerebroside thì còn có thể tìm thấy các hợp chất thứ cấp khác như dẫn xuất mycosporine, alkaloid, isoquinoline alkaloid, glycolipit, icosanoid, dẫn xuất taurine, dipeptid, anthraquinone, xanthosine, pyrrol và dẫn xuất triterpenoid. Năm 1957, từ loài sao biển Asterina pectinifera Wickberg và cộng sự đã phân lập được hợp chất 2-amino-3-hydroxy-1-propanesulfonic axit (57)vàasterina 330 (palythine-3-N-(2-hydroxyethyl) (58) [20]. O O HO SO OH 3 H N N HO OH NH2 57 HO HO 58 Vũ Thị Thu Hiền 16 K39B – Sư phạm Hóa học
  26. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu Mẫu sao biển được thu thập tại đảo Vạn Bội tháng 06/2012 và được PGS.TS. Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện HLKHCNVN xác định tên khoa học là Anthenea aspera. Tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Hình 1: Ảnh minh họa mẫu sao biển Anthenea aspera. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất. 2.2.1. Các phương pháp chiết mẫu. Sau khi tiến hành thu mẫu và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 2.2.1.1. Chọn dung môi chiết. Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong sinh vật biển có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận. Vũ Thị Thu Hiền 17 K39B – Sư phạm Hóa học
  27. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa. Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, Vũ Thị Thu Hiền 18 K39B – Sư phạm Hóa học
  28. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1- hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng. Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol. Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 2.2.1.2. Quá trình chiết. Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước. Vũ Thị Thu Hiền 19 K39B – Sư phạm Hóa học
  29. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - Chiết lôi cuốn theo hơi nước. Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật, sinh vật biển bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh. Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu đươc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Ví dụ: - Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Đragendroff và tác nhân Maye. - Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết. - Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. - Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, Vũ Thị Thu Hiền 20 K39B – Sư phạm Hóa học
  30. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 2.2.2. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ. Phương pháp sắc kí(Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 2.2.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí. Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh. Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí. 2.2.2.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir: n .b.C n = 1 b.C n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng. n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. b : Hằng số. Vũ Thị Thu Hiền 21 K39B – Sư phạm Hóa học
  31. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp C : Nồng độ của chất bị hấp phụ. 2.2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc kí. Trong phương pháp sắc kí, pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí. Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng. 2.2.2.3.1. Sắc kí cột (C.C). Đây là phương pháp sắc kí đơn giản nhất, phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ Vũ Thị Thu Hiền 22 K39B – Sư phạm Hóa học
  32. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30. Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 µm, Fujisilisa Chemical Ltd.). 2.2.2.3.2. Sắc kí lớp mỏng. Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu. 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp Vũ Thị Thu Hiền 23 K39B – Sư phạm Hóa học
  33. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh 2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm- 1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700 - 1750 cm-1. 2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS). Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau: - Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV. - Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ. - Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử. - Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Vũ Thị Thu Hiền 24 K39B – Sư phạm Hóa học
  34. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp - Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). 2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). 2.3.3.1. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất. 2.3.3.2.Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm. 2.3.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía 0 0 và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. Vũ Thị Thu Hiền 25 K39B – Sư phạm Hóa học
  35. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 2.3.3.4. Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: - Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. - Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. - Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. - Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Vũ Thị Thu Hiền 26 K39B – Sư phạm Hóa học
  36. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất bằng các phương pháp phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.4. Quy trình phân lập các hợp chất Các mẫu tươi của Anthenea aspera(10 kg) đã được cắt thành miếng nhỏ và ngâm chiết ba lần với ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40ºC. Dịch tổng thu được được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50ºC thu được 213 g cặn chiết tổng EtOH. Cặn chiết này được chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan (1L x 3), EtOAc (1Lx3) và methanol (1Lx3) thu được các cặn chiết tương ứng: 45 g cặn n- hexan kí hiệu: SDH, 68 g cặn etyl axetat kí hiệu: SDE và 96g cặn metanol kí hiệu: SDM. Cặn MeOH còn lại được chạy sắc ký trên silica gel rửa giải với diclometan/metanol (10:0-8:2) thu 11 phân đoạn được ký hiệu SDM1-SDM11. Phần SDM7 đã chạy cột silica gel và tách rửa giải với hệ diclometan/metanol (10:0- 9:0.1) thu được hợp chất SD12 (9 mg). Phần SDM4 đã chạy cột silica gel và tách rửa giải với hệ diclometan/metanol (10:0-9:0.1) thu được hợp chất SD13 (10 mg) và hợp chât SD14 (8 mg). Vũ Thị Thu Hiền 27 K39B – Sư phạm Hóa học
  37. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.1.Sơ đồ phân lập. 2.5. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được SD12: tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 3350C 1H NMR (DMSO d6): 5.44 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5), 7.38 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6), 11.0 (1H, NH) 13C NMR (DMSO d6): 100.2 (C-5), 142.1 (C-6), 151.5 (C-2), 164.3 (C-4). SD13: bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 1730C Vũ Thị Thu Hiền 28 K39B – Sư phạm Hóa học
  38. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1 H NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): 7,38-7,28 (m, 5H, H-Ar); 3,79 (dd, 1H, J = 4,5; 9,0 Hz, H-8); 3,33 (dd, 1H, J = 4,5; 14,5 Hz, H-7), 3,02 (dd, 1H, J = 9,0; 14,5 Hz, H-7). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): 173,8 (C-9); 137,3 (C-1); 130,4 (C- 3, C-5); 130,0 (C-2, C-6); 128,4 (C-4); 57,6 (C-8); 38,3 (C-7). SD14: bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 164-165 0C 1 H NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): 7,11 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-2, H-6); 6,79 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3, H-5); 3,13 (dd, 2H, J = 8,0; 7,0 Hz, H-8), 2,88 (dd, 2H, J = 8,0; 7,0 Hz, H-7). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): 157,7 (C-4); 130,8 (C-2, C-6); 128,5 (C-1); 116,7 (C-3, C-5); 42,3 (C-8); 34,0 (C-7). Vũ Thị Thu Hiền 29 K39B – Sư phạm Hóa học
  39. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD12. Hợp chất SD12 phân lập được có dạng tinh thể hình kim màu trắng, Phổ 1H NMR có tín hiệu của 1 proton sp2 tại 7,24 ppm. Phổ 13C xuất hiện tín hiệu của 4 cacbon trong đó có 2 cacbon có thể là C=O liên hợp nối đôi hoặc C của nối đôi có gắn OH, 1 CH của nối đôi. Có thể dự đoán SD12 là uracil, dữ liệu phổ của chất này hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phổ đã công bố của uracil [8]. Vũ Thị Thu Hiền 30 K39B – Sư phạm Hóa học
  40. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.1. Phổ 1H NMR của hợp chất SD12 Vũ Thị Thu Hiền 31 K39B – Sư phạm Hóa học
  41. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất SD12 Như vậy cấu trúc của hợp chất SD12 là: 3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD13. Hợp chất SD13 là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 173oC. Phổ 1H- NMR của hợp chất SD13cho biết có tín hiệu của 5 proton vòng thơm (7,38 -7,28 ppm), 1 nhóm CH (3,79 ppm, dd, J=4,5 và 9,0 Hz) đặc trưng cho dấu hiệu proton của nhóm CH liên kết với nitơ (NH) và 1 nhóm CH2 (3,33 ppm, dd, J = 4,5 và 14,5 Hz). Vũ Thị Thu Hiền 32 K39B – Sư phạm Hóa học
  42. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 33 K39B – Sư phạm Hóa học
  43. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.4. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 34 K39B – Sư phạm Hóa học
  44. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy có 9 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có có 2 cacbon bậc 4, 5 CH thuộc vòng thơm, 1 CH ngoài vòng và 1 nhóm 13 metylen (CH2). Đặc biệt trên phổ C-NMR còn cho thấy tín hiệu đặc trưng C=O axit tại C 173,8 ppm (C-9). Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 35 K39B – Sư phạm Hóa học
  45. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.6. Phổ COSY của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 36 K39B – Sư phạm Hóa học
  46. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.7. Phổ HMQC của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 37 K39B – Sư phạm Hóa học
  47. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất SD13 Vũ Thị Thu Hiền 38 K39B – Sư phạm Hóa học
  48. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Mặt khác kết hợp các dữ liệu phổ và tài liệu thu thập được [8] đã cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất SD13 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của chất phenyl alanine có cấu trúc hóa học là: 3.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD14. Hợp chất SD14 là chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 165ºC.Cũng tương tự như chất hợp chất SD13, phổ 1H-NMR của hợp chất SD14 cho biết có tín hiệu của 5 proton thuộc vòng thơm, 2 nhóm CH2 trong đó có một nhóm gắn với N. Kết hợp với các phổ 13C NMR, và MS có thể xác định cấu trúc của hợp chất SD14 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của chất tyramine. Vũ Thị Thu Hiền 39 K39B – Sư phạm Hóa học
  49. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.9. Phổ 1 H-NMR của hợp chất SD14 Vũ Thị Thu Hiền 40 K39B – Sư phạm Hóa học
  50. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất SD14 Hợp chất SD14 thu được có cấu trúc như sau: Vũ Thị Thu Hiền 41 K39B – Sư phạm Hóa học
  51. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN 1. Đã phân lập được 3 hợp chất từ cặn metanol loài sao biển đỏ Anthenea aspera. Các hợp chất uracil, phenyl alanine và tyramine , được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột hở silica gel. 2. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), hai chiều (COSY, HSQC, HMBC). Vũ Thị Thu Hiền 42 K39B – Sư phạm Hóa học
  52. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. GS. TS Phạm Quốc Long Tạp chí KHCN ISSN : 0866. 708X, tập 48, số 4a, (2010) 39-44. 2. Blunt J.W et al., Copp B.R , Munro M.H.G., Northcode P.T., Prinsep M. R- Marine natural products, Nat. Prod. Rep., 23 (2006) 26-78. 3. Chong Jiang, kennet G.Boyd, Andrew Mearns spragg- Two Diketopiperazines and One Halogenated Phenol from Cultures of the Marine Bacterium Pseudoalteromonas luteoviolacea,Natural Product Letters, (2000), 14 (6) 435-440 4. V. Costantino, C. de Rosa, E. Fattorusso, C. Imperatore, A. Mangoni, C. Irace, C. Maffettone, D. Capasso, L. Malorni, R. Palumbo, C. Pedone, Oreacerebrosides: Bioactive cerebrosides with a triunsaturated sphingoid base from the sea star Oreaster reticulatus, European Journal of Organic Chemistry, 2007 (2007) 5277-5283. 5. GS.TS Phạm Quốc Long “ Các hợp chất Steroid glycoside mới từ hai loài sao biển Việt Nam Acanthater planci và Echinaster luzonicus”. 6. “Cyclic Steroid Glycosides from the Starfish Echinaster luzonicus: Structures and Immunomodulatory Activities”.Kicha AA, Kalinovsky AI, Malyarenko TV, Ivanchina NV, Dmitrenok PS, Menchinskaya ES, Yurchenko EA, Pislyagin EA, Aminin DL, Huong TT, Long PQ, Stonik VA. 7. Ellis PD, Dunlap RB, Pollar AL, Seidman K, Cardin AD- Carbon-13 nuclear mag netic resonance of 5- substituted uracils, J.Am.Chem.Soc., 95(13) (1973) 4398-4403. 8. Klaus-Peter Adam- caffeic acid derivatives in fronds of the lady fern, Phytochemistry40, (05) (1995) 1577-1578. 9. Kawano, Y., Higuchi, R., Isobe, R., and Komori, T., “Biologically active glycosides from Asteroidea, XIII. Glycosphingolipids from the starfish Acanthaster planci, 2-Isolation and structure of six new cerebrosides. Liebigs Ann.Chem”, (1998) 19-24. 10. Kawano, Y., Higuchi, R., and Komori, T., “Biologically active glycosides from Asteroidea, XIX. Glycosphingolipids from the starfish Vũ Thị Thu Hiền 43 K39B – Sư phạm Hóa học
  53. Đại học Sư phạm hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Acanthaster planci,4-Isolation and structure of five new gangliosides. Liebigs Ann.Chem., (1990) 43-50. 11. Kicha AA, Ivanchina NV, Stonik VA., “Seasonal variations in the levels of polyhydroxysteroids and related glycosides in the digestive tissues of the starfish Patiria (=Asterina) pectinifera)”, Comparative Biochemistry and Physiology B, (2003), 136, 897-903. 12. Masanori Inagaki, Yuriko Ikeda, Satoshi Kawatake, Kazufumi Nakamura, Miyuki Tanaka, Eriki Misawa, Muneo Yamada, Ryuichi Higuchi, “Isolation and structure of four new ceramides from the starfish Luidia maculata”, (2006), 1647- 1649. 13. Satoshi, Kawatake, Nakamura, Kazufumi, Inagaki, Higuchi, Ryuichi, “Isolation and structure determination of six glucocerebrosides from the starfish Luidia maculata. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo)” (2002), 50(8) : 1091- 1096. 14. Polyhydroxysteroidal Glycosides from the Starfish Anthenea chinensis.Ning Ma†, Hai-Feng Tang*†, Feng Qiu*‡, Hou-Wen Lin§, Xiang-Rong Tian†‡ and Min-Na Yao† 15. Tang HF, Yi YH, Li L, Sun P, Zhang SQ, Zhao YP, “Three new asterosaponins from the starfish Culcita novaeguineaeand their bioactivity”,. Planta Medica, (2005), 71, 458-463. 16. Tang HF, Yi YH, Li L, Sun P, Zhang SQ, Zhao YP. , “Asterosaponins from the starfish Culcita novaeguineaeand their bioactivities”, (2006) Fitoterapia, 77, 28-34. 17.Wang W, Jang H, Hong J, Lee CO, Bae SJ, Shinm S, Jung JH, “New cytotoxic sulfates saponins from the starfish Certonardoa semiregularis”, Archives of Pharmacal Research, (2005) 28, 285-289. 18. Wang W, Li F, Park Y, Hong J, Lee Ch-O, Kong JY, Snin S, Im KS, Jung JH., “Bioactive sterols from the starfish Certonardoa semiregularis”, Journal of Natural Products, (2003) 66, 384-391. 19. Chemical Constituents and Bioactivities of Starfish by Guang Dong, Tunhai Xuc , Bin Yang, Xiuping Lina, Xuefeng Zhoua, Xianwen Yanga, and Yonghong Liu. 20. Wickberg, B.et, Acta Chem. Scand, (1957), 11, 506 (isol) Vũ Thị Thu Hiền 44 K39B – Sư phạm Hóa học