›

Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây tầm bóp (Physalis angulata)

pdf 55 trang thiennha21 15/04/2022 5740
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây tầm bóp (Physalis angulata)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_d.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây tầm bóp (Physalis angulata)

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== PHẠM HỒNG VÂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN ĐICLOMETAN CỦA CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ 1 HÀ NỘI, 2017
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ==== PHẠM HỒNG VÂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN ĐICLOMETAN CỦA CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Người hướng dẫn khoa học TS. HOÀNG LÊ TUẤN ANH HÀ NỘI,2 2017
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Hoàng Lê Tuấn Anh, đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình viết luận văn. Em chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, các anh, chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc – viện Hóa sinh biển – viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập, tận tình truyền đạt kiến thức và kĩ năng cần thiếtcho em. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu mà còn là hành trang quý giá để em bước vào đời một cách vững chắc Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Hóa sinh biển luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 4 năm 2017 Phạm Hồng Vân 3
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata)” Dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Lê Tuấn Anh là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên Phạm Hồng Vân 4
  5. MỤC LỤC 1 LỜI CẢM ƠN 1 2 LỜI CAM ĐOAN 4 3 MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU 6 4 MỞ ĐẦU 7 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 9 6 CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 7 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM 38 8 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 42 9 KẾT LUẬN 52 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 5
  6. MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp 4 Hình 1.2: Các hợp chất Flavonoids 8 Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides 15 Hình 2.1: Mẫu cây Tầm bóp 28 Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Tầm bóp 33 Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 36 Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1 37 Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 38 Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 38 Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 39 Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2. 41 Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2 42 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 42 Hình 4.2.4: Phổ HSQC của hợp chất 2 43 Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2 43 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các hợp chất Withanolides 8 Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo . 39 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo . 44 6
  7. MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật. Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc dân gian và trong đời sống của con người. Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là một nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm với mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong sinh hoạt của con người. Thiên nhiên không chỉ là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm mà còn là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới. Trong quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh. Trong đó có cây tầm bóp – Loại thực vật được sử dụng như dược liệu quý, sử dụng phổ biến có tác dụng thanh nhiệt, tiêu đờm, chủ trị các chứng bệnh như cảm sốt, yết hầu sưng đau, là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp: ‘‘Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây tầm bóp (Physalis angulata)’’ Với mục đích nghiên cứu thành phần diclometan từ lá cây tầm bóp và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập. Từ đó tạo cơ sở cho những 7
  8. nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam. Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền y học. Nhiệm vụ chính của đề tài là : 1. Thu mẫu cây tầm bóp (Physalis angulata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn điclometan từ lá cây tầm bóp (Physalis angulata). 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 8
  9. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu tổng quan 1.1.1 Thực vật học Giới thiệu về thực vật học Tên thực vật : Physalis angulata Tên thường gọi: Tầm bóp (Thù lù canh, bôm bốp, lồng đèn ) Phân loại khoa học Giới Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ Solanales Họ Solanaceae Chi Physalis Loài P. angulata 1.1.2 Mô tả thực vật Tầm bóp là cây thân thảo hằng niên, mọc hoang quanh năm. Thân: Thân cao 50 - 100 cm, phân nhiều cành. Đường kính thân tròn, 1-2 cm. Lá: Lá mọc so le, hình bầu dục, chia thùy hay không, dài 30 - 35mm, rộng 20 - 40mm; cuống lá dài từ 15 - 30mm. 9
  10. Hoa: Hoa mọc đơn độc ở nách lá, có cuống mảnh, dài khoảng 1 cm. Đài hình chuông, có lông, chia ra từ phía giữa thành 5 thùy, tràng hoa màu vàng tươi hay màu trắng nhạt, có khi điểm những chấm màu tím ở gốc hoa. Đài đồng trưởng bao lấy quả nên có tên là quả lồng đèn. Quả: Quả mọng tròn, nhẵn, lúc non màu xanh, khi chín màu đỏ, có đài cùng lớn với quả, dài 3-4 cm, rộng 2 cm, bao trùm lên ở ngoài như cái túi, hạt nhiều hình thận. Ruột quả có nhiều không gian rổng, khi bóp quả vỡ phát ra tiếng “bộp”. Hạt: Quả chứa nhiều hạt nhỏ nhỏ hình thận, hạt có ngoại nhũ khi chín ăn có vị chua, ngọt. Cây ra hoa kết quả quanh năm. [1][3] Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp 10
  11. 1.1.3 Phân bố và sinh thái Các loài trong Chi Physalis thường là cây thân thảo đứng sống một năm hay nhiều năm. Hầu hết các loài yêu cầu ánh nắng mặt trời đầy đủ và khí hậu khá ấm áp và chịu nhiệt độ nóng. Một số loài rất nhạy cảm với sương giá, nhưng có một số loài chẳng hạn như loài thù lù Trung Quốc, P. alkekengi, chịu đựng được nhiệt độ rất lạnh và sống được qua mùa đông. Các loài trong Chi thù lù có đặc trưng là quả khi chín có màu cam và tương tự về kích thước, hình dạng và cấu trúc giống như quả nhãn lồng (chùm bao) với ruột quả có nhiều ngăn rộng và một số loài có quả ruột đặt giống như quả cà chua, là loại quả ăn được với tên gọi là quả anh đào đất (Groundcherry). Ở Việt Nam, cây Tầm bóp không rõ xuất hiện từ lúc nào, nhưng đã từ lâu nó đã trở thành cây mọc hoang dại trên mọi miền đất nước và được người dân dùng làm rau ăn và dùng làm thuốc trong dân gian để chữa bệnh. Thực tế cho thấy cây mọc ở vùng có độ cao so với mặt nước biển ăn bùi và thơm hơn cây mọc ở vùng đồng bằng, đặc biệt là khi cần làm thuốc người ta thường tìm đến cây rau Tầm bóp của các vùng núi cao.[2] 1.1.4 Tính vị và công dụng của cây tầm bóp Tính vị: Toàn cây có vị đắng, tính mát, không độc. Quả có vị chua. Công dụng : Bộ phận sử dụng làm thuốc là toàn cây có tác dụng kháng khuẩn, chống ung thư, chống đông máu, chống bệnh bạch huyết,chống nấm và vi khuẩn, chống loại nấm nguyên sinh antimycoplasmique, ( loại vi khuẩn không có vách tế bào ), chống co thắt, chống ung bướu, kháng virus, hạ đường máu , hạ huyết áp , điều 11
  12. hòa miễn dịch ( điều hòa biến đổi một số tế bào miễn nhiễm hoạt động quá mức), kích thích miễn dịch, thường dùng trị cảm sốt, yết hầu sưng đau, ho nhiều đờm, phiền nhiệt nôn nấc Quả Tầm bóp ăn được và dùng chữa đờm nhiệt sinh ho, thủy thũng và đắp ngoài chữa đinh sang, rễ tươi nấu với tim lợn, chu sa dùng ăn chữa được chứng đái đường. [3][4] Một số bài thuốc khác Dùng ngoài trị nhọt vú, đinh độc, đau bìu dái: dùng 40-80g cây tươi giã vắt lấy nước cốt uống, bã thì dùng đắp; hoặc nấu nước rửa. Dùng trị viêm họng, khan tiếng, ho khan, ho có đờm đặc [4], trị tiểu ít, ban đỏ, thủy đậu (trái rạ), bệnh tay chân miệng, cúm gia cầm: liều dùng 15 - 30 g cành mang hoa lá khô (tươi 50 - 100 g) sắc uống trong ngày. Dùng 3 - 5 ngày liền. Lá cây tầm bóp rất tốt cho dạ dày, do đó ngoài việc dùng tầm bóp làm thuốc chữa bệnh người ta còn dùng thứ cây này như một vị rau ăn hàng ngày. Rau tầm bóp ăn hơi đắng nhưng thanh mát dễ ăn. Những người hay lênh đênh sông nước nên ăn quả này thường xuyên vì lượng Vitamin C và B1, tiền vitamin A trong quả tầm bóp rất cao nên rất tốt cho cơ thể, có thể chữa bệnh Scorbut vì trên biển không có hoa quả. Ngoài ra quả tầm bóp còn có thể phòng ngừa các bênh về đường tiết niệu và viêm thận ví dụ sỏi thận, sỏi bàng quang và chữa bệnh gút rất tốt. Ở Ấn Độ, toàn cây được sử dụng làm thuốc lợi tiểu; lá được dùng trị các rối loạn của dạ dày. Ở Africa, họ ăn lá cây đã được nấu chín hoặc dùng như một tấm băng để băng các vết thương bị nhiễm trùng. 1.1.5 Thành phần hóa học 12
  13. Theo nghiên cứu của Chothani và Vaghasiya chỉ ra rắng quả tầm bóp có chứa 61,4% nước trái cây và 76,7% độ ẩm. Nó cũng chứa đường, tannin, khoáng chất, protein, pectin và một lượng vitamin tốt cho cơ thể (24,45 mg / 100 ml nước trái cây). Hạt giống gồm 2 phần là dầu và protein. Phần dầu có chứa axit béo, tức là palmitic, stearic, oleic, linoleic và chứa một lượng nhỏ axit béo hexadecen và axit béo hydroxyl [19]. Thành phần khi chiết dịch cây cho thấy, cây có chứa một số hợp chất loại Flavonoid và Withanolides. Ngoài ra còn có chlorogenic acid, cholin, xocarpanolid, myricetin, phygrin. [20] 1.1.5.1. Các hợp chất Flavonoids Nghiên cứu về thành phần Physalis angulata đã phân lập được 6 hợp chất (1-6): Myricetin 3-O-neohesperidoside (1) [13], Luteolin-7-O d-glucopyranosideH (2) [14], Quercetin (3), Querc444etin 3-O-methyl ether (4), Kaempferol 7-OH- rhamnoside (5), Isoquercetrin (6) [7]. (2) (1) OH Glc H 13
  14. (3) R1=R2=R3=H (4) R1=R2=H,R3 = MeO (5) R1=Rha, R2=R3=H (6) Hình 1.2: Các hợp chất Flavonoids 1.1.5.2. Các hợp chất Withanolides Phân lập được 33 hợp chất (7-39) từ thành phần Physalis angulata gồm có : Bảng 1.1: Các hợp chất Withanolides KH Chất TLTK 7 Aminophysalin A 20 8 Physangulidine A 20 9 Physangulidine B 20 10 Physangulidine C 20 11 Physagulin P 9 14
  15. 12 Physagulin Q 9 13 Physagulin I 6 14 Physagulin M 6 15 Physagulin L 11 16 Physagulin O 11 17 Physagulin K 11 18 Physagulin N 6 19 Physagulin H 20 20 14e-Physagulin P 9 21 Physagulins J 20 22 Physagulins N 11 23 Physanolide A 20 24 Physalin P 20 25 Physalin D 20 26 Physalin H 20 27 Physalin G 20 28 Physalin W 8 29 Withangulatin G 8 30 Withangulatin D 8 31 Withangulatin I 20 32 Withangulatin F 8 33 Withagulatin B 8 34 Withagulatin C 8 35 Withagulatin E 8 15
  16. 36 Withagulatin H 8 37 6a-Chloro-5,6-dihydro-5b-hydroxyphysalin B 20 38 5a-Ethoxy-5,6-dihydro-6b-hydroxyphysalin B 20 39 (6a,14b,15a,17a,22R)-22,26-Epoxy-6,14,17-trihydroxy- 11 1,26-dioxoergosta-2,4,24-trien-15-ylacetate (7) (8) 98 0 (9) (10) 16
  17. (11) (12) (13) (14) (15) (16) 17
  18. H (17) (19) H AcO MeO (18) R= β-H (20) (21) (22) 18
  19. (23) MeO H H (24) (25) (31) (28) 19
  20. (33) OH (34) H H (35) (32) OH MeO H (36) (39) 20
  21. (37) (38) Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides 1.1.6 Hoạt tính sinh học - Hoạt tính chống viêm , giảm đau và hạ sốt : Theo nghiên cứu Murad và các cộng sự đã nghiên cứu về chiết xuất thô và phân đoạn chloroform của các cây thuộc chi Physalis cho thấy khả năng chống viêm giảm đau rất tốt. Khả năng hạ sốt của chiết xuất thô và phận đoạn chloroform không đáng kể [13] - Hoạt tính gây độc tế bào: Kheng Leong Ooi, Tengku Sifzizul Tengku Muhammad, Shaida Fariza Sulaiman thử nghiệm độc tính của physalin F cho thấy hiệu quả ức chế đáng kể phụ thuộc vào liều lên tế bào T-47D với giá trị EC50 thấp hơn (3,60 μg / ml) so với chiết xuất thô. Phân tích biểu hiện mRNA cho thấy sự đồng điều chế gen c-myc và caspase-3-apoptotic trong các tế bào đã được điều trị với mức biểu hiện tại 9 và 12 giờ điều trị. Cơ chế gây độc này được khẳng định lại bởi quá trình phân mảnh DNA và phosphatidylserine bên ngoài.[ 15] - Hoạt tính “in vitro”: Theo nghiên cứu của Kashima và các cộng sự chỉ ra rằng các chiết xuất dầu thô của cả hai bộ phận trên không và rễ từ dịch chiết của cây Tầm bóp có tác dụng chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, sởi, [16]. Riêng 21
  22. tại Nhật có một số nghiên cứu chú trọng đến các hoạt tính “in vitro” chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, Herpes simplex I, sởi, ban hồng, trái rạ và cả HIV-I (do ức chế sao chép ngược). - Hoạt tính chống ung thư: Nghiên cứu tại Viện khảo cứu các hợp chất thiên nhiên thuộc ĐH y khoa Kaohsiung (Thượng Hải) về hoạt tính chống ung thư gan của Physalis angulata ghi nhận các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng ethanol được đánh giá về hoạt tính chống ung thư gan trên các dòng tế bào Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 ghi nhận hoạt tính chống ung thư do gây ra hiện tượng tế bào tự hủy (apoptosis) phối hợp với những rối loạn chức năng của các mitochondria nơi màng tế bào bị ung thư. Tác dụng diệt bào này không xảy ra nơi các tế bào gan lành mạnh . - Nghiên cứu tại khoa vi trùng và miễn dịch học, ĐH y khoa quốc gia Cheng Kung (Thượng Hải) ghi nhận các dịch chiết từ Physalis angulata có những hoạt tính điều hòa hệ miễn dịch như cải thiện đáp ứng blastogenesis (lý thuyết cho rằng các đặc điểm di truyền được chuyển từ cha mẹ sang con cái bằng mầm nguyên sinh); kích hoạt các tế bào T; gia tăng đáp ứng kháng thể [5]. - Nghiên cứu tại Nhật (khoa dược, ĐH Fukuoka) ghi nhận phần trên mặt đất của cây Tầm bóp (Physalis angulata) có hoạt tính diệt được một số ký sinh trùng, đặc biệt nhất là Trypanosoma cruzi - tác nhân gây bệnh Chagas do con Rệp hun lây truyền - Ngoài ra , cây Tầm bóp còn có một số hoạt tính : chống oxy hóa, chống sốt rét và hoạt tính NF-κB [12]. 22
  23. 1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật 1.2.1 Chọn dung môi chiết Chọn dung nôi khả năng hoà tan tối đa các hoạt chất và tối thiểu các tạp chất trong dược liệu. Chất lượng của dung môi - Dễ thấm và hoà tan chọn lọc (hoà tan nhiều dược chất, ít tạp chất). - Trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn trong quá trình bảo quản - Không bị phân huỷ bới nhiệt độ cao và không gây cháy nổ - Phải bay hơi được khi cần cô đặc dịch chiết. - Không làm thành phẩm có mùi vị đặc biệt Các dung môi hay được sử dụng - Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ ) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và methanol - Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để chiết dịch thô từ cây. - Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit. Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những sản phẩm mong muốn. - Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit 23
  24. của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.2.2 Quá trình chiết Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi cuốn theo hơi nước Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau: - Với các ankaloit , có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer, - Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. - Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. - Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với 24
  25. aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon. Từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao. 1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ Sắc ký là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. 1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, ). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. 1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. 25
  26. Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung dịch ) khi nhiệt độ không đổi N∞ .b.C n = 1+b.C n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh. N∞ : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó. b: Hằng số. C: Nồng độ của chất bị hấp phụ. 1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký • Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh: sắc ký lỏng và sắc ký khí. • Phân loại theo cơ chế của quá trình tách : Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion và Sắc ký rây phân tử. • Phân loại theo cách hình thành sắc đồ: phương pháp tiền lưu, phương pháp đẩy,phương pháp rửa giải. • Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. 1.3.3.1 Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp[1]. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút 26
  27. lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. 1.3.3.2 Sắc ký cột Đây là phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều nhất. Chất hấp phụ (pha tĩnh) bao gồm các loại silicagen (độ hạt khác nhau). Pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion, chất hấp phụ được nhồi vào cột (chủ yếu là cột thủy tinh, ngoài ra còn có cột kim loại inox). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lí thuyết càng nhỏ , khả năng tách càng thấp và ngược lại. Có thể điều chỉnh tốc độ chảy tăng lên hoặc giảm đi tùy theo độ hạt chất hấp phụ (Độ hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy cũng giảm đi). Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), giải pháp khi đó để hết hiện tượng tắc người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Tỷ lệ L/D rất quan trọng, thể hiện khả năng tách cột (với L- chiều cao cột và D- Đường kính cột). Nó phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp nhất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ sự khác nhau này mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp từ 1/5 đến 1/10, còn nếu tách tinh thì tỷ lên này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách. 27
  28. Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagen rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột. Nếu tách tinh, người ta đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. Việc nhồi cột bằng chất hấp phụ cũng hết sức quan trọng, có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: + Nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chấp hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Tiếp theo, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. + Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Lưu ý: • Khi nhồi cột không được có bọt khí bên trong. Vì nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách. • Tốc độ chảy của dung môi phải đảm bảo liên tục và vừa phải. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc. 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 1.4.1. Phổ IR Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả. Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức 28
  29. xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Ví dụ: dao động hóa trị của nhóm cacbonyl C=O trong andehyt/xeton là 1650 - 1800 cm-1, trong anhydrit là 1750 - 1870 cm-1; nhóm C=C của anken là 1600 - 1650 cm-1; nhóm C≡C của ankin là 3150 cm-1; nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 2500 - 3500 cm-1; nhom C-O-C là 1150 - 1250 cm-1. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hóa học coi như “ dấu vân tay’’, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng. Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, lượng chất cần cho phép đo là 2-3 mg và khó thu hồi lại. Do đó, với lượng chất thu được ít từ các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại thường được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác. 1.4.2 Phổ khối lượng Cơ sở của phương pháp phổ khổi lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phần tử mang năng lượng cao. Sau đó, phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định được phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. Khi ion hóa mẫu theo các phương pháp khác nhau sẽ thu được các phổ khối lượng các nhau. Một số phương pháp thường được sử dụng: 29
  30.  Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) phương pháp va chạm electron. Sử dụng chùm electron để “bắn phá’’ phân tử mẫu ở trạng thái hơi. Electron va chạm với các phân tử trung hòa làm bật ra electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay phân tử trung hòa nhỏ. Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV.  Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) phổ phun điện tử. Phổ này thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI - MS. Dung dịch mẫu sẽ được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân không dưới điện trường. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hơi dung môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các phân tử bị “ vỡ’’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít mảnh phân tử và có cường độ lớn hơn. Phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp.  Phổ FAB - MS (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) phương pháp bắn phá nhanh bằng nguyên tử ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.  Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy) cũng cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra, hiện nay còn sử dụng các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ như: GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng, toàn bồ hệ thống GC - MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu; LC - MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp này rất hiệu quả khi phân tích thành phần hỗn hợp chất. 30
  31. 1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp vật lí hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử dựa vào sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại tập hợp thành phân tử. Vì vậy, phổ NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có phương pháp nào có thể nhận biết được. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng NMR , song Hidro và Cacbon là phổ biến nhất Có nhiều kĩ thuật xác định NMR khác nhau được áp dụng nhưng mỗi kĩ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc người ta có thể đo một hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H và 13C) trong các phổ một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT), hay trong các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY, HETCOR, Long - range HETCOR, NOESY) 1.4.3.1. Phổ 1H - NMR: Phổ 1H-NMR cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Ví dụ: các proton liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6-8 ppm; các proton trong ankan thường chuyển dịch trong vùng 0-2 ppm Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang 31
  32. ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. 1.4.3.2. Phổ 13C-NMR: Phổ 13C-NMR cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Ví dụ: cacbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm; cacbon liên kết với oxi (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm). 1.4.3.3. Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH, CH3 0 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu của các CH. 1.4.3.4. Phổ 2D – NMR Đây là các kí thuật phổ cho phép xác định tương tác của của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau: Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) ( 1H - 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): đây là loại phổ cho biết mối tương quan giữa proton - proton với nhau như: proton gem (geminal, hai proton cùng gắn trên một cacbon); proton vic (vicinal, hai proton gắn trên hai cacbon kề nhau). Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. 32
  33. Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): sử dụng kĩ thuật ngược lại với phổ HETCOR. Phổ HSQC khảo sát hạt nhân 1H trục hoành ghép cặp với 13C trục tung. Các tín hiệu trên phổ cũng như cách giải phổ tương tự phổ HETCOR. Các tương tác trực tiếp H - C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nó dùng để xác định các proton nhằm vào các tín hiệu tương tác qua hai và ba nối không xuất hiện tín hiệu qua một nối. Phổ giúp gián tiếp biết được các khung sườn các cacbon thông qua các tương tác proton. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): biểu diễn các tương tác xa của các proton trong không gian chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Ngoài ra người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Kỹ thuật này được tiến hành bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trưởng cộng hưởng của một proton xác định, khi đó, các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và có tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn. Như đã đề cập ở trên, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta cần sử dụng phương pháp phổ kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học, phân tích, so sánh Các phân tử càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chiều dài các mạch hay đối với phân tử có các đơn vị đường thì để xác định chính xác loại đường cần sử dụng phương pháp so sánh GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như t 33
  34. CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu cây tầm bóp được thu tại Tỉnh Thái Bình , Việt Nam vào tháng 8/2015. Mẫu được TS.Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam giám đinh. Mẫu tiêu bản (TB14.2015) được lưu giũ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình 2.1: Mẫu cây Tầm bóp 34
  35. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo. Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hoạt chất được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan) • Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, đô ̣ dicḥ chuyển hóa hoc̣ (δ) của các proton đươc̣ xác đinh trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuôc̣ vào mứ c đô ̣lai hóa của nguyên tử cũng như đăc̣ trưng riêng của từ ng phân tử . Mỗi loaị proton công̣ hưở ng ở môṭ trường khác nhau và vì vâỵ chúng đươc̣ biểu diêñ bằ ng môṭ đô ̣dicḥ chuyển hóa hoc̣ khác nhau. Dưạ vào những đăc̣ 35
  36. trưng của đô ̣ dicḥ chuyển hóa hoc̣ cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác đinḥ đươc̣ cấ u trúc hóa hoc̣ của hơp̣ chấ t. • Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiêụ vacḥ phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon se ̃ công̣ hưở ng ở môṭ trườ ng khác nhau và cho môṭ tín hiêụ phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đươc̣ tính bằ ng ppm và vớ i dải thang đo rông̣ hơn so với phổ proton (từ o ppm đến 240 ppm). • Phổ DEPT : Phổ này cho ta những tín hiêụ phổ phân loaị các loaị cacbon khác nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiêụ của cacbon bâc̣ bố n biến mấ t. Tín hiêụ phổ của CH và CH3 nằ m về môṭ phía và của CH2 về môṭ phía trên phổ DEPT 1350. Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuấ t hiêṇ tín hiêụ phổ của các CH. • Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diêñ các tương tác xa của H và C trong phân tử . Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từ ng phầ n của phân tử cũng như toàn bô ̣phân tử đươc̣ xác đinḥ về cấ u trúc. • Phổ NOESY: Phổ này biểu diêñ các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhấ t đinḥ trong không gian. Dưạ vào kết quả phổ này, có thể xác đinḥ đươc̣ cấ u trúc không gian của phân tử . Độ quay cực đo trên máy JASCO DIP -1000 KUY polarimeter. 2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.3.1 Dụng cụ Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm: + Bình chiết 30 lít 36
  37. + Phễu chiết 2 lít + Máy cô quay chân không + Đèn từ ngoại 2 bước sóng 254nm và 368nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thường và pha ngược các loại đường kính + Dung dịch thuốc thử + Bếp điện 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectromecter. 2.4 Hóa chất + Silica gel 60 (0,04 – 0.063 nm) Merck. + Slica gel pha đảo ODS hoặc YMC RP18 (150 µm, FuJisilisa Chemical Ldt). + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck). + Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck). + Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetate, clorofoc, hexan, axetone, v.v 37
  38. CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Phân đoạn diclometan được hòa tan bằng lượng tối thiểu dung môi metanol, bổ sung silica gel (tỉ lệ 1/1,5 về khối lượng), trộn đều rồi cất loại metanol đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được tiến hành sắc ký trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thưởng với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần diclometan/metanol (từ 0% đến 100% metanol, mỗi lần 1 lít) thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A5. Phân đoạn A2 (2,0 g) tiếp tục được phân tách thành 3 phân đoạn nhỏ hơn, ký hiệu là A2A – A2C, trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải diclometan/metanol (tỉ lệ 20/1 về thể tích, 4,5 L). Phân đoạn A2A được phân tách thành 2 phân đoạn A2A1 và A2A2 bằng cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải diclometan/acetone (tỉ lệ 20/1 về thể tích, 2,0 L). Tiến hành tinh chế phân đoạn A2A1 trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải diclometan/metanol (tỉ lệ 30/1 về thể tích, 1,5 L) thu được hợp chất VPA30 (21 mg). Hợp chất VPA31 (25 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn A2A2 trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan/aceton (tỉ lệ 5/1 về thể tích, 1,5L). 38
  39. Phân đoạn Diclometan Sắc ký cột pha thường diclometan/metanol ( 0% đến 100% methanol) A1 A2 A3 A4 A5 (2 g) Sắc ký cột pha thường diclometan\metanol:20\1 A2A A2B A2C Sắc ký cột pha thường diclometan/acetone 20/1 A2A1 A2A2 Sắc ký cột pha thường Sắc ký cột pha thường Diclometan/methanol 30/1 n-hexan/aceton 5/1 Hợp chất 2 Hợp chất 1 VPA30 VPA31 (21 mg) (25 mg) Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Tầm bóp 39
  40. 3.2. Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất 3.2.1. Hợp chất 1 (Physalin B) - Công thức phân tử: C28H30O9. - Khối lượng phân tử: 510,54. 1 - Phổ proton H-NMR ( MeOD, 500 MHz) H: 5,91 (1H, dd, J = 2,0, 10,0 Hz, H-2); 6,78 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 10,0 Hz, H-3); 2,86 (1H, d, J = 4,5 Hz, Ha- 4); 3,27*(1H, Hb-4); 5,58 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-6); 2,37 (1H, m, Ha-7); 2,19*(1H, Hb-7); 2,20*(1H, H-8); 2,92 (1H, m, H-9); 2,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, Ha-11); 1,22*(1H, Hb-11); 2,40 (1H, m, Ha-12); 1,60*(1H, Hb-12); 2,22 (1H, brs, H-16); 1,22 (3H, s, H-19); 1,97 (3H, s, H-21); 4,55 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-22); 2,04 (2H, m, H-23); 2,45 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-25); 4,51 (1H, dd, J = 4,5, 13,5 Hz, Ha-27); 3,79 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-27); và 1,27 (3H, s, H-28). (* tín hiệu trùng lấp) 13 - Phổ cacbon C-NMR (MeOD, 125 MHz) C: 205,7 (C-1), 127,4 (C-2), 146,2 (C-3), 32,7 (C-4), 134,0 (C-5), 124,5 (C-6), 24,2 (C-7), 40,4 (C-8), 33,2 (C- 9), 52,7 (C-10), 24,8 (C-11), 25,8 (C-12), 79,67 (C-13), 107,5 (C-14), 208,1 (C- 15), 5,.4 (C-16), 80,3 (C-17), 172,3 (C-18), 17,9 (C-19), 81,0 (C-20), 21,5 (C-21), 76,9 (C-22), 33,1 (C-23), 31,1 (C-24), 51,0 (C-25), 166,7 (C-26), 60,7 (C-27) và 26,5 (C-28). 3.2.2. Hợp chất 2 (Physalin F) - Công thức phân tử C28H30O10 - Khối lượng phân tử M= 526,54 1 - Phổ proton H-NMR ( MeOD, 500 MHz) H: 6,01 (1H, dd, J = 2,5, 10,0 Hz, H-2); 6,68 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 10,0 Hz, H-3); 3,00 (1H, dt, J = 3,0, 15,5 40
  41. Hz, Ha-4); 2,06*(1H, Hb-4); 3,26 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-6); 2,57 (1H, dt, J = 3,5, 15,5 Hz, Ha-7); 1,85 (1H, dd, J = 11,5, 15,5 Hz, Hb-7); 2,26 *(1H, H-8); 2,63 (1H, dd, J = 9,5, 11,5 Hz, H-9); 2,26*(1H, Ha-11); 1,17 (1H, dd, J = 10,0, 15,0 Hz,, Hb-11); 2,34 (1H, dd, J = 5,0, 17,0 Hz, Ha-12); 1,52 (1H, dd, J = 12,0, 17,0 Hz, Hb-12); 2,19*(1H, H-16); 1,30 (3H, s, H-19); 1,95 (3H, s, H-21); 4,53 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-22); 2,05 (1H, d, J = 3,5 Hz, Ha-23); 2,01 (1H, brs, Hb-23); 2,43 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-25); 4,50 (1H, dd, J = 4,5, 13,5 Hz, Ha-27); 3,75 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-27) và 1,26 (3H, s, H-28). (* tín hiệu trùng lấp) 13 - Phổ cacbon C-NMR (MeOD, 125 MHz) C: 205,9 (C-1), 127,8 (C-2), 146,3 (C-3), 33,3 (C-4), 61,7 (C-5), 64,8 (C-6), 37,4 (C-7), 34,3 (C-8), 50,0 (C-9), 50,8 (C-10), 23,5 (C-11), 25,7 (C-12), 79,4 (C-13), 107,0 (C-14), 207,5 (C-15), 56,2 (C-16), 80,1 (C-17),172,2 (C-18), 15,5 (C-19), 81,0 (C-20), 21,5 (C-21), 77,0 (C-22), 33,0 (C-23), 31,1 (C-24), 50,8 (C-25), 166,7 (C-26), 60,7 (C-27) và 26,5 (C-28). 41
  42. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện 3 tín hiệu proton olefin tại 5,91 (1H, dd, J = 2,0, 10.0 Hz); 6,78 (1H, ddd, J = 2,5, 5.0, 10,0 Hz) và 5,58 (1H, d, J = 6,5 Hz); 3 tín hiệu nhóm methyl tại 1,26 (s), 1,30 (s) và 1,95 (s). Phổ cacbon 13C-NMR và HSQC cho phép xác định tín hiệu của 28 tín hiệu cacbon với 10 tín hiệu cacbon không liên kết với hydro C (4 tín hiệu nhóm cacbonyl tại 205,7, 208,1, 172,3 và 166,7; 1 tín hiệu cacbon olefin 134,0; 4 tín hiệu cacbon liên kết với oxi tại 107,5, 81,0, 80,3, 79,7); 10 tín hiệu cacbon metin CH (3 tín hiệu cacbon olefin tại 146,2, 127,4, 124,5; 1 tín hiệu cacbon oximetin tại 76,9); 5 tín hiệu cacbon metylen CH2 (1 tín hiệu cacbon oxymetylen tại 60,7) và 3 tín hiệu nhóm metyl CH3 tại 26,5, 21,5 và 17,9. Các số liệu cho thấy đây là 1 hợp chất dạng secosteroit (còn gọi là các chất dạng physalin). So sánh số liệu phổ của hợp chất 1 với số liệu phổ của hợp chất physalin B [10] thấy khá phù hợp (Bảng 4.1). Sự sai khác xảy ra 42
  43. là do dung môi đo phổ khác nhau, CDCl3 của 1 so với DMSO của hợp chất physalin B. Các vị trí liên kết được khẳng định lại dựa vào tương tác HMBC (Hình 4.1.1). Từ c ác bằng chứng phổ nêu trên có thể khẳng định hợp chất 1 chính là physalin B, 1 hợp chất có thành phần chính trong cây tầm bóp. Hình 4.1.2: Phổ proton 1H của hợp chất 1 43
  44. Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 44
  45. Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo d a,b a,c No, δC δC DEPT δH (mult,, J in Hz) HMBC 1 202,6 205,7 CO 2 127,1 127,4 CH 5,91 (dd, 2,0, 10,0) 4, 10 3 146,4 146,2 CH 6,78 (ddd, 2,5, 5,0, 10,0) 1, 5 4 32,5 32,7 CH2 2,86 (d, 4,5)/ 3.27* 5 135.8 134.0 C 6 123.6 124.5 CH 5.58 (d, 6.5) 7, 8 7 24,6 24,2 CH2 2,19* /2,37 (m) 8 40,3 40,0 CH 2,20* 9 33,3 33,2 CH 2,92 (m) 11, 12 45
  46. 10 52,2 52,7 C 11 24,6 24,8 CH2 1,22*/2,03 (d, 2,0) 12 25,7 25,8 CH2 1,60 /2,40 (m) 13 78,4 79,7 C 14 106,5 107,5 C 15 209,6 208,1 CO 16 54,4 56,4 CH 2,22 (br s) 14, 15 17 80,9 80,3 C 18 172,0 172,3 CO 19 17,0 17,9 CH3 1,22 (s) 1, 5, 9, 10 20 80,5 81,0 C 21 21,9 21,5 CH3 1,97 (s) 17, 20, 22 22 76,5 76,9 CH 4,55 (d, 2,0) 17, 20, 25, 26 23 31,6 33,1 CH2 2,04 (m) 24 30,7 31,1 C 25 49,6 51,0 CH 2,45 (d, 4,0) 26 167,5 166,7 CO 27 60,8 60,7 CH2 3,79 (d, 13,5)/ 4,51 (dd, 4,5, 13,5) 14, 25 28 24,6 26,5 CH3 1,27 (s) 16, 23, 24, 25,26 a) b) c) Đo trong CDCl3, 125 MHz, 500 MHz, * tín hiệu bị trùng lấp; 46
  47. 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 Chất tham khảo Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC của 2 cho thấy đây cũng là 1 hợp chất dạng secosteroid (Bảng 4.2). So sánh số liệu phổ của 1 và 2 thấy sự khác nhau chủ yếu xảy ra ở vị trí C-5 và C-6. Sự chuyển dịch về phía trường mạnh của 2 tín hiệu C-5 (61,7) và C-6 (64,8) cho thấy nối đôi ở vị trí C-5 và C-6 của chất 1 đã chuyển hóa thành cầu epoxy trong chất 2. Các vị trí liên kết được khẳng định lại bằng phổ HMBC. Từ bằng chứng phổ trên, có thể khẳng định hợp chất 2 là physalin F, 1 hợp chất đã được phân lập từ loài này [17]. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là lần đầu tiên số liệu phổ đầy đủ của hợp chất physalin F được công bố. 47
  48. Hình 4.2.2: Phổ proton 1H của hợp chất 2 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 48
  49. Hình 4.2.4: Phổ HSQC của hợp chất 2 Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2 49
  50. Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo d a,b a,c No, δC δC DEPT δH (mult,, J in Hz) HMBC 1 204,3 205,9 CO 2 127,1 127,8 CH 6,01 (dd, 2,5, 10,0) 4, 10 3 142,8 146,3 CH 6,68 (ddd, 2,5, 5,0, 10,0) 1, 5 4 35,1 33,3 CH2 2,24*/ 3,00 (dt, 3,0, 15,5) 5 76,3 61,7 C 6 72,5 64,8 CH 3,26 (d, 3,0) 7, 8 7 26,6 37,4 CH2 1,85 (dd, 11,5, 15,5)/ 2,57 (dt, 3,5, 15,5) 8 38,2 34,3 CH 2,26* 9 29,8 50,0 CH 2,63 (dd, 9,5, 11,5) 11, 12 10 53,4 50,8 C 11 24,7 23,5 CH2 1,17 (dd, 10,0, 15,0)/ 2,26 * 12 25,7 25,7 CH2 1,52 (dd, 12,0, 17,0)/ 2,34 (dd, 5,5, 17,0) 13 78,5 79,4 C 14 106,8 107,0 C 15 209,8 207,5 CO 16 53,8 56,2 CH 2,19* 17 80,4 80,1 C 18 171,8 172,2 CO 19 13,2 15,5 CH3 1,30 (s) 1, 5, 9, 10 20 80,6 81,0 C 21 21,6 21,5 CH3 1,95 (s) 17, 20, 22 22 76,3 77,0 CH 4,53 (d, 2,0) 17, 20, 24 23 31,2 33,0 CH2 2,01 (br s)/ 2,05 (d, 3,5) 24 30,4 31,1 C 50
  51. 25 49,3 50,8 CH 2,43 (d, 4,0) 26 167,3 166,7 CO 27 60,4 60,7 CH2 3,75 (d, 13,5)/ 4,50 (dd, 4,5, 13,5) 25 28 24,4 26,5 CH3 1,26 (s) 16, 23, 24, 25 a) b) c) Đo trong CDCl3, 125 MHz, 500 MHz, * tín hiệu bị trùng lấp; Nghiên cứu của Hsu và cộng sự chứng minh rằng physalin B có hoạt tính với các dòng tế bào u ác tính A375 và A2058 (IC50 thấp hơn 4,6 µg/mL). Các kết qủa cho thấy physalin B có thể gây chết tế bào ung thư theo chương trình qua con đường trung gian NOXA, caspase-3 và mitochondria, nhưng không gây ra chết theo chương trình với các tế bào nguyên sợi da người và các tế bào myoblast. Do đó, physalin B có triển vọng để phát triển thành chất điều trị hiệu quả u ác tính. Hợp chất Physalin F (1 chất secosteroid) cũng được ghi nhận như 1 chất có thể đóng vai trò là tác nhân ngăn ngừa và/hoặc điều trị ung thư bởi cơ chế kích hoạt chết theo chương trình thông qua sự hoạt động theo con đường caspase-3 và c-myc trong tế bào T-47D. Trước đấy, năm 2012, Wu và cộng sự cũng đã thông báo khả năng gây ra chết theo chương trình với dòng tế bào ung thư thận người A498. Do đó, physalin F giống như 1 tác nhân kháng ung thư tiềm năng cần tiến hành nghiên cứu lâm sàng. 51
  52. KẾT LUẬN - Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 02 hợp chất từ phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp Physalin B Physalin F - Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR (500 MHz), 13C- NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90), hai chiều (HSQC và HMBC), MS kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo. Dựa vào những ứng dụng thực tiễn, hoạt tính của các lớp chất có trong loài này và kết quả các phân đoạn nghiên cứu tôi mong muốn sẽ có những nghiên cứu sâu hơn về cây tầm bóp 52
  53. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân, (2003), “Danh mục các loài thực vật Việt Nam”, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tập 2. 2. Võ Văn Chi(1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học . 3. Bùi Xuân Chương, Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, , Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004) , “cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, Tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội, 875-876 4. Bùi Xuân Chương, Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, , Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội. Tiếng Anh 5. American Journal of Chinese Medicine 20-1992. 6. F. Abe, S. Nagafuji, M. Okawa, J. Kinjo, (2006) Chem. Pharm. Bull., 54, 1226. 7. A. A. Augustine, O. Ufuoma, Planta Med (2013), 79, PJ5. 8. A. G. Damu, P.-C. Kuo, C.-R. Su, T.-H. Kuo, T.-H. Chen, K. F. Bastow, K.-H. Lee, T.-S. Wu, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1146. 9. H. Ding, Z. Hu, L. Yu, Z. Ma, X. Ma, Z. Chen, D. Wang, X. Zhao, Steroids 2014, 86, 32. 53
  54. 10. A.H. Januário, E.R. Filho, R.C.L.R. Pietro, S. Kashima, D.N. Sato, S.C. França, (2002) “Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae)” Phytotherapy Research, 16, 445-448 11. Q.P. He, L. Ma, J.-Y. Luo, F.-Y. He, L.-G. Lou, L.-H. Hu (2007), “In vitro antimycobacterial activities of Physalis angulata L.”, Chem. Biodiversity, 4, 443. 12. Murad Ali Khan, Haroon Khan, Sarwar Khan, Tahira Mahmood, Pir Mohammad Khan & Abdul (June 2009), “Anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activities of Physalis minima Linn”, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 632–637. 13. N. Ismail, M. Alam, (2001), “Fitoterapia”, 72, 676. 14. X. Li, C. Zhang, W. Li, D. Wu, L. Tang, Y. Xin, (2013) “Fitoterapia” , 87, 43. 15. Md. Moniruzzaman, Shambhunath Bose, Young-Mi Kim, Young-Won Chin, Jungsook Cho , (2016) , “ The ethyl acetate fraction from Physalis alkekengi inhibits LPS-induced pro-inflammatory mediators in BV2 cells and inflammatory pain in mice”, Journal of Ethnopharmacology , JEP9934. 16. Kheng Leong Ooi, Tengku Sifzizul Tengku Muhammad, Shaida Fariza Sulaiman, (2013), “Physalin F from Physalis minima L. triggers apoptosis-based cytotoxic mechanism in T-47D cells through the activation caspase-3- and c-myc- dependent pathways”, Journal of Ethnopharmacology 150, 382–388. 17. R. C. L. R. Pierro, S. Kashima', D. N. Sato, A. H. januario', S. C. Franca, Phytomedicine (2002) , Antimycobacterial Physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae),Vol. 7(4), pp. 335-338. 54
  55. 18. L.R. Row, N.S. Sarma, K.S. Reddy, T. Matsuura, R. Nakashima, (1978) “The structure of Physalins F and J from Physalis angulata and P. lancifolia” Phytochemistry, Vol 17, 1647-1650 19. H U Vaghasiya, Daya L Chothani( December 2012), “A phyto- pharmacological overview on Physalis minima Linn”, Indian Journal of Natural Products and Resources Vol. 3(4), pp. 477-482. 20. Wen-Na Zhang, Wang-Yu Tong (2016), “Chemical Constituents and Biological Activities of Plants from the Genus Physalis”, Chem. Biodiversity, 13, 48 – 65. 55