›

Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)

pdf 57 trang thiennha21 15/04/2022 3010
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_so_bo_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_diclom.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC CHỬ THỊ PHƯƠNG THU KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN DICLOMETAN CÂY MỎ QUẠ CUDRANIA TRICUSPIDATA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Người hướng dẫn khoa học TS. HOÀNG LÊ TUẤN ANH HÀ NỘI - 2017
  2. LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS. Hoàng Lê Tuấn Anh và các anh chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Với tất cả lòng kính trọng, em xin cảm ơn thầy giáo PGS - TS. Nguyễn Văn Bằng đã tận tình chu đáo, dạy bảo và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường ĐHSP Hà Nội 2 , đặc biệt là các thầy cô trong khoa Hóa Học của trường đã tạo điều kiện giúp đỡ và dạy dỗ em trong quá trình học tập ở trường. Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp, mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 4 năm 2017 Sinh viên Chử Thị Phương Thu
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)” là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Lê Tuấn Anh. Các số liệu, kết quả trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực, chính xác và không trùng với kết quả đã được công bố. Nếu có bất cứ vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, tháng 4 năm 2017 Sinh viên Chử Thị Phương Thu
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về cây Mỏ quạ 4 1.1.1. Thực vật học 4 1.1.2. Mô tả cây 4 1.1.3. Phân bố và sinh thái 6 1.1.4. Bộ phận dùng 6 1.1.5. Tính vị, công dụng 6 1.1.6. Thành phần hóa học 7 1.1.7. Hoạt tính sinh học 12 1.2. Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật 14 1.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp chiết 14 1.2.2. Cơ sở của quá trình chiết 14 1.2.3. Quá trình chiết mẫu thực vật 15 1.2.3.1. Chọn dung môi chiết 15 1.2.3.2. Các phương pháp chiết 18 a, Chiết lỏng - lỏng 18 b, Chiết lỏng - rắn 18 c, Chiết pha rắn 18 1.2.3.3. Quá trình chiết 19 1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ 20 1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 20 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký 21 1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký 22 1.3.3.1. Sắc ký cột 22
  5. 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng 24 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 24 1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) 24 1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) 25 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 28 1.4.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 28 1.4.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (phổ 2D - NMR) 29 CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Mẫu thực vật 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 32 2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 32 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 33 3.1. Phân lập các hợp chất 35 3.2. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất 37 3.2.1. Hợp chất 1: Aurantiamide acetate 37 3.2.2. Hợp chất 2: Aurantiamide 37 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 38 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 43 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
  6. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-1H COSY Chemical Shif Correlation Spectroscopy 1H-13C HETCOR Phổ COSY dị hạt nhân 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Tow - Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography CI-MS Phổ khối lượng ion hóa học Chemmical Ionization DEPT Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy ESI-MS Phổ khối lượng phun điện tử. Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy FI-MS Phổ khối lượng ion hóa thường Field Ionization HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây, thân, lá, hoa Mỏ quạ 5 Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ 36 Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất 1 39 Hình 4.1.2: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 1 39 Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C-NMR của hợp chất 1 40 Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 40 Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 41 Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 43 Hình 4.2.2: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 2 44 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C-NMR của hợp chất 2 44 Hình 4.2.4: Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2 45 DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo 42 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo 45
  8. MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa do đó có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng. Thiên nhiên Việt Nam là một kho tài nguyên vô giá với nguồn dược liệu phong phú bao gồm nhiều loại cây có thể dùng là thuốc chữa bệnh cho con người. Theo những nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học, Việt Nam có gần 11000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Trải qua nhiều năm nghiên cứu, tính đến nay Việt Nam đã có hơn 3800 loài thực vật bậc cao và bậc thấp (kể cả nấm) được sử dụng làm thuốc [3]. Từ xa xưa, cha ông ta đã có truyền thống về việc sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh, do đó những cây thuốc dân gian đã đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Tiếp nối truyền thống đó, những năm gần đây, việc tìm kiếm các hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh là xu hướng ngày càng tăng và thu hút nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Ngày nay, những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao được phân lập từ cây cỏ được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp như: sản xuất phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm, dược phẩm Cùng với sự phát triển của khoa học – công nghệ, ngành công nghiệp tổng hợp hóa dược ngày càng phát triển mạnh mẽ. Nó tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó nâng cao sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, cũng không vì thế mà các thảo dược mất đi chỗ đứng trong Y học. Chúng được sử dụng với vai trò mới là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp, hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghiệp bán tổng hợp nhằm tìm kiếm các dược phẩm mới phục vụ việc chăm sóc sức khỏe con người. Theo các số liệu thống kê hiện nay có khoảng 60 - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong 1
  9. giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ thiên nhiên [16]. Từ đó, nhiều loại thuốc đã được chiết xuất từ dược liệu Việt Nam như: rutin, D.strophantin, berberm, polmatin, L-tetrahydropalmatin, Trong số những loài thực vật đã và đang được sử dụng làm dược liệu quý có cây Mỏ quạ (tên khoa học là Cudrania tricuspidata). Theo Đông y, Mỏ quạ có vị đắng nhẹ, tính mát. Có tác dụng lương huyết (làm mát máu), hoạt huyết phá ứ (thông mạch máu, tan máu tụ), chủ trị chấn thương sưng đau, phong thấp lưng gối đau mỏi, phụ nữ kinh bế, còn chữa lao phổi, viêm gan, [22]. Đặc biệt trong thành phần của cây có chứa các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào, chống oxi hóa, bảo vệ thần kinh, kháng viêm và kháng insulin ở gan trong các tế bào HepG2, chống béo phì, Vậy nên đây là một cây thuốc quý, cần được nghiên cứu để tìm hiểu tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở tìm kiếm các phương thuốc mới điều trị các bệnh liên quan. Tuy nhiên cho đến nay chỉ có một vài nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Mỏ quạ tại Việt Nam. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nêu trên nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata)” Mục đích của đề tài là nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới điều trị bệnh cũng như giải thích tác dụng chữa bệnh của các loài thảo mộc ở Việt Nam. Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền Y học. 2
  10. Để thực hiện điều đó, đề tài được tiến hành với những nhiệm vụ chính như sau: 1. Thu mẫu lá cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata), xử lí mẫu và tạo dịch chiết. 2. Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata). 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 3
  11. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Mỏ quạ 1.1.1. Thực vật học Phân loại thực vật học của cây Mỏ quạ được xác định như sau: Giới : Plantae Angiospermae Eudicots Rosids Bộ : Rosales Họ : Moraceae Tông : Moreae Chi : Cudrania (Maclura) Loài : C. tricuspidata 1.1.2. Mô tả cây [1],[22],[23] Mỏ quạ có tên khoa học là Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur, thuộc họ Dâu tằm – Moraceae. Tên gọi khác: hoàng lồ, vàng lồ, xuyên phá thạch, cây chá, mỏ quạ ba mũi, cây bớm, sọng vàng, cây dâu gai, Mỏ quạ là loài cây bụi, sống tựa, thân mềm yếu, nhiều cành, cành dài và mềm. Thân có nhựa mủ trắng như sữa. Có khi mọc thành cây nhỡ cao tới 8m, cây chịu khô hạn rất khỏe. Rễ cây là rễ trụ, có nhiều nhánh, mọc ngang, rất dài, cứng, nếu gặp đá có thể xuyên qua được (do đó con có tên “xuyên phá thạch”). Thân và cành có rất nhiều gai, gai già hơi cong quặp xuống như mỏ con quạ nên được gọi là cây Mỏ quạ. Vỏ thân màu tro nâu, trên có nhiều bì khổng màu trắng. Lá mọc so le, hình trứng thuôn, hai đầu nhọn, mặt lá nhẵn, bóng, mép nguyên, nhấm có vị tê tê ở lưỡi (đặc điểm), có phiến xoan, đầu mũi dài, gốc tù, gân bên 6-7 đôi, dài khoảng 3-8 cm, rộng khoảng 2,5-3 cm. 4
  12. Cuống lá mảnh, có lông, cuống dài 10-13 mm. Cụm hoa hình cầu, đường kính 7-10 mm, màu vàng nhạt, mọc thành đôi hay mọc đơn độc ở nách lá. Hoa đơn tính đực cái khác gốc. Hoa đực có 4 lá đài, 4 nhị, hoa cái có 4 lá đài, 1 nhụy dài. Cây ra hoa vào tháng 4-5, có quả vào tháng 5-7. Quả màu hồng họp thành quả kép, quả nạc hình cầu mềm hơi cụt ở đầu, khi chín màu đỏ, hạt nhỏ. Hình 1.1: Cây, thân, lá, hoa Mỏ quạ 5
  13. 1.1.3. Phân bố và sinh thái Chi Cudrania có khoảng 10 loài, thường phân bố ở vùng khí hậu nhiệt đới. Ở Việt Nam dự đoán có khoảng 5 loài. Mỏ quạ là loài phân bố ở các nước nhiệt đới Á châu, Đông Phi châu, Úc châu. Xuất hiện nhiều ở Hàn Quốc (chủ yếu ở phía Nam), Trung Quốc, Nhật Bản, Australia Ở nước ta, cây mọc hoang ở đồi núi, ven đường và được trồng làm hàng rào từ Lào Cai, Vĩnh Phú đến Quảng Trị, Lâm Đồng và Đồng Nai [24], [25]. Mỏ quạ thuộc loài cây bụi gai, ưa sáng, khả năng chịu hạn tốt. Cây mọc hoang rải rác trong các trảng cây bụi ở đồi, đất sau nương rẫy và được trồng làm hàng rào ở đồi hoang hay đất vườn. Cây ra quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt, tái sinh cây chồi khỏe sau khi bị chặt [4]. 1.1.4. Bộ phận dùng Rễ, lá và quả. Lá thu hái quanh năm, bỏ cuống, dùng tươi hoặc nấu cao. Rễ phơi hoặc sấy khô. 1.1.5. Tính vị, công dụng Tính vị: lá nhấm có vị hơi tê ở lưỡi, vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng hoạt huyết khư phong, thư cân hoạt lạc. Công dụng: Mỏ quạ có tác dụng dược lí rất đa dạng. Theo Đông y, Mỏ quạ có vị đắng nhẹ, tính mát. Có tác dụng lương huyết (làm mát máu), hoạt huyết phá ứ (thông mạch máu, tan máu tụ), chủ trị chấn thương sưng đau, phong thấp lưng gối đau mỏi, phụ nữ kinh bế, còn chữa lao phổi, viêm gan, [22]. Chữa kinh giản, lên cơn hàng ngày hoặc 3 - 4 ngày/ lần: mỏ quạ 20g, thảo quả 20g, hạt cau 20g, sắc uống. 6
  14. Trị bệnh ho hoặc khạc đờm ra máu, bệnh lao phổi: mỏ quạ 40g, bách bộ 20g, dây rung rúc 30g, hoàng liên ô rô 20g, sắc uống. Trị các vết thương phần mềm: cây mỏ quạ tươi, hái về rửa sạch và bỏ cuống, giã nhỏ và đắp vào vết thương. Hàng ngày, lấy lá trầu không nấu nước, pha thêm một chút đường phèn (khoảng 8g) hòa tan vào nước và rửa vết thương, sau đó đắp thuốc mới lên. Duy trì làm như vậy trong khoảng 3 - 5 ngày là vết thương lành. + Nếu vết thương thường xuyên bị hở: đắp 2 bên dính lại, 1 lần/ngày. + Nếu thịt chậm đầy ở phần bị thương, vết thương lâu khép miệng: lấy lá mỏ quạ tươi và lá bòng bong một lượng bằng nhau, giã nát và đắp lên vết thương. Rửa chỗ bị thương và thay thuốc ngày 1 lần. Sau khoảng 3 - 4 ngày, giã thêm lá hàn the cùng 1 lượng như thế, dùng hỗn hợp của 3 loại đắp lên vết thương, duy trì việc thay thuốc hàng ngày. Sau khoảng 2 - 3 ngày, thêm vào thuốc bột phấn của cây chè (sao khô) 16g, phấn cây cau (sao khô) 20g, phèn phi 4g, bồ hóng 8g. Dùng hỗn hợp này rắc đều lên vết thương đến khi đóng vảy và róc thì dừng [26]. Rễ cây mỏ quạ được dùng trong nhân dân làm thuốc khứ phong, hoạt huyết, phá ứ, chữa ứ tích lâu năm, bế kinh. Ngày dùng 10-30 g rễ dưới dạng thuốc sắc. Phụ nữ có thai không dùng được. 1.1.6. Thành phần hóa học Trong những nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Mỏ quạ cho thấy, thành phần hóa học chủ yếu trong cây là flavonoid, tanin pyrocatechic và acid hữu cơ và một số hợp chất khác. Yang Hee Jo và các cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất từ rễ cây C. tricuspidata chiết suất bằng diclometan (CH2Cl2) và etyl axetat (EtOAc) dựa 7
  15. vào phương pháp quang phổ đã tìm được 31 hợp chất gồm: 2,6- dihydroxyxanthone (1), isogentisin (2), alloathyriol (3), laxanthone-I (4), isocudraniaxanthone A (5), isocudraniaxanthone B (6), 1,3,5-trihydroxy-4- prenyl- xanthone (7), cudraxanthone H (8), cudratricusxan- thone K (9), dulxanthone B (10), macluraxanthone B(11), cudracuspixanthone A (12), cudratricusxan- thone A (13), gerontoxanthone I (14), maclura- xanthone C (15), alvaxanthone (17), isoalvaxanthone(18), cudraxanthone L (19), toxyloxanthone C (20), 2-deprenylrheediaxanthone B (21), 8- prenylxanthone(22), cudraxanthone M (23), cudratrixanthone H (24), cudracuspixanthone B (25), cudracuspi- xanthone C (26), cudraxanthone B (27), cudracus- pixanthone D (28), and cudraxanthone A (30), cudracuspixanthone G (31). Các hợp chất có công thức cấu tạo như sau [19]: 8
  16. Jaeyoung Kwon và các cộng sự đã phân lập các hợp chất từ vỏ gốc cây và quả C. tricuspidata và xác định được 70 hợp chất trong đó có 21 hợp chất mới có công thức như sau [12]: 9
  17. 32 33 34 35 R=CH3 37 38 36 R=H 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Yang Hee Jo và các cộng sự đã nghiên cứu chất isoflavonoid ức chế tụy lipase từ quả chưa chín và chín của cây C. tricuspidata. Tất cả các hợp chất cô lập từ quả C.tricuspidata trong nghiên cứu này thuộc về một nhóm flavonoid. Chúng có thể được chia nhỏ lại theo vị trí của phần phenyl vào flavonoid (2-phenylchroman) và isoflavonoid (3-phenylchroman). Và đã xác định được 30 hợp chất. Đó là genistein (53), orobol (54), 7,4’-dimethoxy-5- hydroxyisoflavone (55), genistin (56), oroboside (57), 3’-O-methylorobol-7- glucoside (58), sphaerobioside (60), wighteone (61), gancaonin A (62), 4’,5,7-trihydroxy isoflavonone (63), 5,7,3’,4’-tetrahydroxy-68- diprenylisoflavone (64), alpinumisoflavone (65), 4’-O- methylalpinumisoflavone (66), 5,3’,4’-trihydroxy-6’’,6’’-dimethylpyrano- 10
  18. [2’’,3’’;7,6]isoflavone (67), scandenone (68), derrone (69) , derrone-4’-O- methylether (70), isochandalone (72), ulexin B (73), ulexone B (74), (+)- dihydrokaempferol (75), (+)-taxifolin (76), (2R, 3R)-7-(β- glucopyranosyloxy)-2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H1- benzopyran-4-one (77), astragalin (78), hirsutrin (79), populnin (80), nicotiflorin (81), và rutin (82). Các hợp chất 53-74 là isoflavonoid và hợp chất 75-82 là flavonoid [20]. Chúng có cấu tạo như sau: 53 54 58 78 55 59 79 56 66 80 57 81 65 60 82 67 69 75 70 77 71 61 62 68 63 64 74 73 72 76 11
  19. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng các hợp chất phenonlic, bao gồm các loại xathone, flavonoid và kaempferol là những thành phần chính của lá cây C. tricuspidata. Kaempherol, kaempherpl 7-O-glucopyranoside, narigin 7-O-glucopyranoside, 5-O-methyl genistein, β,-sitosterol, β,-sitosterol glucoside cũng đã được phân lập từ thân cây và lá của C. tricuspidata. 1.1.7. Hoạt tính sinh học Trong cây Mỏ quạ chứa glycoprotein, xanthone, và flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm, bao gồm chống oxy hoá, ức chế enzyme monoamin oxidase (MAO) A, hiệu quả bảo vệ thần kinh, chống huyết khối [8], bảo vệ gan, neuroprotective - xơ vữa động mạch và chống viêm. Chống oxi hóa: các chất flavonoid là những chất oxi hóa chậm, chúng có tác dụng ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do. Do đó, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa cao, tác dụng đến nhiều hệ enzim và ít độc đến cơ thể. Khi đưa vào cơ thể, các chất này gây lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp thông qua các enzym, hệ thống thần kinh, nội tiết Chống viêm: Cudratricusxanthone A là một xanthone prenylated, được phân lập từ C. tricuspidata, có nhiều tác dụng sinh học và điều trị. Cudratricusxanthone A đã ức chế các enzyme tổng hợp oxit nitric (iNOS) và cyclooxygenase (COX) -2, giảm sản xuất ra nitơ oxit có nguồn gốc từ iNOS và prostaglandin E2 có nguồn gốc COX-2 trong tế bào vi mô BV2 kích thích LPS. Hợp chất này cũng làm giảm yếu tố hoại tử khối u-α, interleukin (IL) - 1β, và IL-12; Ức chế sự phosphoryl hóa và sự xuống cấp của IκB-α. Cudratricusxanthone A còn có tác động ức chế đối với hoạt động gắn kết ADN kappa B của nhân tố k. Tóm lại, kết quả chứng minh rằng cudratricusxanthone A có tác dụng chống viêm bằng cách ức chế sự sản sinh 12
  20. các chất trung gian pro-inflammatory do lipopolysacchairide (LPS) thông qua ức chế các con đường NF-κB và MAPK trong tế bào vi mô BV2. Do đó, nó có thể là một ứng cử viên hóa trị liệu tiềm năng để quản lý rối loạn thoái hoá cơ tim [8]. Cudratricusxanthone A (CTXA) là một xanthone được phân lập từ sự phân tách dẫn chất EtOH của C. tricuspidata có tác dụng ức chế mạnh chống oxy hoá, chống ung thư mạnh mẽ trong các tế bào ung thư vú. Theo nghiên cứu của Soo-Myeong Jeon và cộng sự, ảnh hưởng của CTXA đối với sự di chuyển tế bào và apoptosis đã được đánh giá trong các dòng tế bào ung thư vú của MCF-7 và MDA-MB-231. CTXA đã có tác dụng chống khối u trên các tế bào ung thư vú bằng cách ngăn chặn sự di chuyển và xâm lấn của tế bào và gây ra sự chết tế bào theo chương trình in vitro. Các khả năng của CTXA để gây ra apoptosis bằng cách kích hoạt con đường truyền tín hiệu apoptotic liên quan đến ty thể và ức chế sự xâm nhập và di chuyển tế bào bởi MMP-9. Nó có thể là một loại thuốc chống khối u mới cho điều trị ung thư vú [18]. Dong-Cheol Kim và cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra rằng chiết xuất methanol C. tricuspidata đã ức chế cả sản sinh NO và PGE2 trong tế bào vi mô BV2. Cudraflavanone D , được cô lập từ chiết xuất này, đã làm giảm đáng kể sự biểu hiện protein của synthase NO và cyclooxygenase-2, và giảm nồng độ NO và PGE2 trong các tế bào vi mô BV2 tiếp xúc với lipopolysaccharide. Cudraflavanone D cũng làm giảm sản xuất IL-6, TNF-α, IL-12, và IL-1β, ngăn chặn sự dịch chuyển hạt nhân của heterodimers NF-κB (p50 và p65) bằng cách gián đoạn quá trình phân hủy và phosphoryl hóa chất ức chế IκB-α, Và ức chế liên kết NF-κB. Ngoài ra, cudraflavanon D đã ức chế sự phosphoryl hóa của kinase N-terminal kinase (JNK) và đường p38 MAPK. Nghiên cứu này chỉ ra rằng cudraflavanone D có thể là một ứng cử viên thuốc tiềm năng cho việc chữa bệnh viêm thần kinh [10]. 13
  21. Lá C. tricuspidata (CTe) có tác dụng ức chế mạnh trên hoạt tính PTP1B và ức chế đáng kể sự tích tụ chất béo trong tế bào 3T3-L1. Hơn nữa, điều trị CTe làm giảm đáng kể lượng đường trong máu và cải thiện sự tiết insulin có thể đại diện cho một chất liệu chữa bệnh hứa hẹn chống lại bệnh tiểu đường và béo phì. Ngoài ra, trong quả của C. tricuspidata chứa 1 lượng 6,8-diphenyl genistein cải thiện nhiều thông số của bệnh béo phì HFD. Đặc biệt, DPG làm giảm đáng kể chất béo mào tinh và các triglyceride huyết thanh tăng lên do HFD. 1.2. Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật [7], [11], [14] 1.2.1. Đặc điểm chung của phương pháp chiết Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó. Mục đích của chiết: + Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu gọi là chiết làm giàu. + Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên. 1.2.2. Cơ sở của quá trình chiết Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng. 14
  22. Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA = CA/CB KA: Hằng số phân bố. CA,CB: Nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn vào nhau. 1.2.3. Quá trình chiết mẫu thực vật Mẫu thực vật sau khi được thu hái, rửa sạch, thái nhỏ, làm khô và xay thành bột mịn. Sau đó tùy thuộc vào đối tượng có trong mẫu khác nhau (đặc tính của các chất phân cực, chất có độ phân cực trung bình, chất không phân cực ) mà chọn dung môi và hệ dung môi thích hợp. 1.2.3.1. Chọn dung môi chiết Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỉ lệ nhất định để tạo ra hệ thống dung môi mới. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận. Yêu cầu đối với dung môi dùng cho quá trình chiết: Nó phải hòa tan các chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với các chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Nếu các dung môi lẫn các tạp chất có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Ví dụ: 15
  23. + Một số chất dẻo như diankyl phatalat, tri-n-butyl-axetylhidrat, tributyl phosphat có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa. + Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này có thể làm sai lệch kết quả phân tích trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thậm chí nó còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và làm bẩn dịch chiết của cây. Vì vậy, những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Những dung môi hay được sử dụng + Clorofoc, metylen clorit, và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ ). Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc. + Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng, dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của clorofoc thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. 16
  24. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này sẽ bị hòa tan đồng thời. Thường dung môi còn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ: trechlonolide A được chuyển thành trechlonolide B bằng các quá trình metyl hóa khi đun nóng với metanol và chưa một ít axit, erythroxylum novogranatense chiết trong metanol nóng cũng phân hủy tạo 1 - hydroxyltropacocain. + Người ta ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol. + Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. + Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường axit. Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về các đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất không mong muốn. Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 - 40 0C với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 17
  25. 1.2.3.2. Các phương pháp chiết a, Chiết lỏng - lỏng Chiết lỏng - lỏng là một kĩ thuật tách đơn giản nhất và trung thực nhất. Nó được sử dụng để làm sạch hoặc tách một cấu tử riêng hoặc một loại các cấu tử khỏi mẫu mẹ. Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp. Đối với các mẫu nước dung môi chiết phải không tan trong nước. Có hai quá trình chiết lỏng - lỏng khác nhau là chiết không liên tục (chiết đoạn) và chiết liên tục. b, Chiết lỏng - rắn Chiết lỏng rắn được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn như thực vật, đất, các mẫu sinh học, bằng dung môi thích hợp. Chất phân tích trong mẫu vật rắn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích. Tùy thuộc vào tính phân cực của chất cần tách ta lựa chọn dung môi chiết. Quá trình chiết lỏng - rắn có thể tiến hành theo phương pháp chiết đoạn hay chiết liên tục. c, Chiết pha rắn Chiết pha rắn là quá trình chiết bao gồm một pha rắn và một pha lỏng. Các cấu tử cần quan tâm và các chất cản trở nằm trong pha lỏng. Khi cho chảy qua cột nhồi chất hấp lưu, các cấu tử cần quan tâm được lưu giữ lại trên chất hấp lưu, sau đó chất cần quan tâm được rửa giải ra khỏi cột nhờ dung môi thích hợp hay ngược lại các chất cản trở được lưu giữ trên chất hấp lưu còn các cấu tử cần quan tâm không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột. 18
  26. 1.2.3.3. Quá trình chiết Hầu chết các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng bình chiết Xoclet - Chiết sắc với dung môi nước - Chiết lôi cuốn theo hơi nước + Quá trình chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet: đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. + Chiết ngâm: là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không tốn nhiều công sức và thời gian. Thiết bị được sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh. Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó mới lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như sau: Với các ankaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer, 19
  27. Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon. Từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao. 1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ [2], [7] 1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân li, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh thành các thành phần để phân tích, nhận biết, tinh chế hoặc định lượng hỗn hợp hay các thành phần. Trong sắc ký luôn có hai pha là pha động và pha tĩnh. Trên thế giới hiện nay phổ biến sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất phụ như silicagel, YCM, ODS, Al2O3, ) còn pha động thường được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng) hay chất khí (sắc ký khí). Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp thụ, tính tan ). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký (cột, bản phẳng ) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp. Do 20
  28. khả năng bị hấp thụ và phản hấp thụ khác nhau hay do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh mà tạo nên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc với các chất trong pha tĩnh. Mặt khác, các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký từ lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp thụ và phản hấp thụ. Kết quả chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh. Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau. Nhờ đó người ta có thể tách các chất khác nhau ra khỏi nhau qua quá trình sắc ký. 1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Trong điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch: n∞.b.C n = 1+b.C n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh. N∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. b: Hằng số. C: Nồng độ của chất bị hấp phụ. 21
  29. 1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành các nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký người ta chia thành các phương pháp chủ yếu sau: 1.3.3.1. Sắc ký cột (CC) Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (độ hạt khác nhau). Pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion, Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh, ngoài ra còn có cột bằng kim loại inox). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó, người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa chiều cao cột (L) và đường kính cột (D) rất quan trọng. Nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ sự khác nhau này mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. 22
  30. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp từ 1/5 đến 1/10, còn nếu tách tinh thì tỷ lên này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách. Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột. Nếu tách tinh, người ta đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. Việc nhồi cột bằng chất hấp phụ cũng hết sức quan trọng, có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: + Cách 1: Nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Tiếp theo, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt. + Cách 2: Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột cần lưu ý: không được có bọt khí bên trong. Vì nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc. 23
  31. 1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng (TLC) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. TLC được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài việc sử dụng TLC để định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng TLC để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng TLC điều chế có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, sau khi chạy sắc ký người ta có thể cạo riêng phần silicagen có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%. 1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2], [15] Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà sử dụng các phương pháp phổ thích hợp. Ngoài ra, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, sắc kí so sánh [5], [6]. 1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả. Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi 24
  32. hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Bức xạ hồng ngoại có độ dài sóng từ 0,8 đến 1000 μm và chia ra thành 3 vùng: 1. Cận hồng ngoại (near infrared) λ = 0,8 - 2,5 μm 2. Trung hồng ngoại (medium infrared) λ = 2,5 - 50 μm 3. Viễn hồng ngoại (far infrared) λ = 50 - 1000 μm Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Ví dụ: dao động hóa trị của nhóm cacbonyl C=O trong andehyt/xeton là 1650 - 1800 cm-1, trong anhydrit là 1750 - 1870 cm-1; nhóm C=C của anken là 1600 - 1650 cm-1; nhóm C≡C của ankin là 3150 cm-1; nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 2500 - 3500 cm-1; nhom C-O-C là 1150 - 1250 cm-1. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hóa học coi như “dấu vân tay’’, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng. Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, lượng chất cần cho phép đo là 2-3 mg và khó thu hồi lại. Do đó, với lượng chất thu được ít từ các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại thường được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác. 1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) Đây là phương pháp nghiên cứu cấu trúc của các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên nguyên tắc khối lượng phân tử của một chất sẽ bằng tổng khối lượng phân tử của các ion được tạo thành do quá trình phá vỡ phân tử. 25
  33. Cơ sở của phương pháp phổ khổi lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phần tử mang năng lượng cao. Sau đó, phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định được phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. Hiện nay có nhiều kĩ thuật để biến các phân tử trung hòa thành ion. Nói chung phương pháp ion hóa được thực hiện theo hai loại: - Ion hóa tướng khí: mẫu biến thành dạng hơi rồi đưa vào buồng ion hóa (va chạm electron, proton, ion, ) để biến các phân tử trung hòa thành các ion. - Ion hóa theo kĩ thuật giải hấp phụ (giải hấp thường, giải hấp 252Cf, bắn phá nguyên tử hay ion hóa nhanh, giải hấp laser). Khi ion hóa mẫu theo các phương pháp khác nhau sẽ thu được các phổ khối lượng các nhau. Một số phương pháp thường được sử dụng:  Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) phương pháp va chạm electron. Sử dụng chùm electron để “bắn phá’’ phân tử mẫu ở trạng thái hơi. Electron va chạm với các phân tử trung hòa làm bật ra electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay phân tử trung hòa nhỏ. Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV.  Phổ CI - MS ( Chemmical Ionization) phương pháp ion hóa học. Cho dòng phân tử khí va chạm với một dòng ion dương hoặc ion âm. Trong kĩ thuật CI, ngoài mẫu và khí mang còn một lượng lớn khí thử đưa vào buồng ion hóa. Phổ MS thu được có số lượng các ion ít hơn và cường độ cao hơn. 26
  34.  Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) phổ phun điện tử. Phổ này thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI - MS. Dung dịch mẫu sẽ được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân không dưới điện trường. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hơi dung môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các phân tử bị “vỡ’’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít mảnh phân tử và có cường độ lớn hơn. Phổ thu được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp.  Phổ FI - MS (Field Ionization) phương pháp ion hóa thường. Sử dụng một điện trường mạnh để làm bật ra electron từ phân tử. Nguồn ion được tạo ra nhờ một kim loại nhỏ có đường kính vài micromet làm Anot gắn ngay phía trước khe và buồng ion hóa.  Phổ FAB - MS (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) phương pháp bắn phá nhanh bằng nguyên tử ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.  Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy) cũng cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra, hiện nay còn sử dụng các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ như: GC - MS (sắc ký khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng, toàn bộ hệ thống GC - MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu; LC - MS (sắc ký lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp này rất hiệu quả khi phân tích thành phần hỗn hợp chất. 27
  35. 1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance , NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp vật lí hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử dựa vào sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại tập hợp thành phân tử. Vì vậy, phổ NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử bằng cách cho ta biết về số lượng nguyên tử khác biệt về mặt từ tính có trong phân tử nghiên cứu. Có nhiều kĩ thuật xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau được áp dụng. Mỗi kĩ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc người ta có thể đo một hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H và 13C) như trong các phổ một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT), hay trong các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY, HETCOR, Long - range HETCOR, NOESY) 1.4.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều  Phổ 1H - NMR: phổ 1H-NMR cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Ví dụ: các proton liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6-8 ppm; các proton trong ankan thường chuyển dịch trong vùng 0-2 ppm Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 28
  36. ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.  Phổ 13C-NMR: phổ 13C-NMR cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Ví dụ: cacbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm; cacbon liên kết với oxi (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).  Phổ DEPT (Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer): phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH và 0 CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu của các CH. 1.4.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (phổ 2D - NMR) Đây là các kĩ thuật phổ cho phép xác định tương tác của của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:  Phổ 1H - 1H COSY (HOMOCOSY) ( 1H - 1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): đây là loại phổ cho biết mối tương quan giữa proton - proton với nhau như: proton gem (geminal, hai proton cùng gắn trên một cacbon); proton vic (vicinal, hai proton gắn trên hai cacbon kề nhau). Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.  Phổ 1H - 13C HETCOR: phổ COSY dị hạt nhân được gọi là HETCOR. Đây là phổ cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu 1H trục tung với tín hiệu 29
  37. của cacbon 13C trục hoành. Do có độ dịch chuyển hóa học trên phổ 1H - NMR, 13C - NMR khác nhau trên hai chiều nên nó không đối xứng qua đường chéo như phổ COSY. Trong phổ đồ của HETCOR không có tín hiệu của cacbon tứ cấp. Từ các peak của phổ 13C trục hoành kẻ xuống nếu gặp tín hiệu giao thì cacbon đó có thể có H gắn trực tiếp vào nó hoặc H tương đương hóa học với nhau. Từ đó góp phần xây dựng nên phân tử chất.  Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): sử dụng kĩ thuật ngược lại với phổ HETCOR. Phổ HSQC khảo sát hạt nhân 1H trục hoành ghép cặp với 13C trục tung. Các tín hiệu trên phổ cũng như cách giải phổ tương tự phổ HETCOR. Các tương tác trực tiếp H - C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.  Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nó dùng để xác định các proton nhằm vào các tín hiệu tương tác qua hai và ba nối không xuất hiện tín hiệu qua một nối. Phổ giúp gián tiếp biết được các khung sườn các cacbon thông qua các tương tác proton.  Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): biểu diễn các tương tác xa của các proton trong không gian chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian.  Ngoài ra người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Kỹ thuật này được tiến hành bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định, khi đó, các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và có tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn. 30
  38. Như đã đề cập ở trên, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta cần sử dụng phương pháp phổ kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học, phân tích, so sánh Các phân tử càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chiều dài các mạch hay đối với phân tử có các đơn vị đường thì để xác định chính xác loại đường cần sử dụng phương pháp so sánh GC - MS (sắc ký khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu, LC - MS (sắc ký lỏng - khối phổ) với các đường chuẩn dự kiến. 31
  39. CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Lá cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata) được thu tại Hồng Lý, Vũ Thư, Thái Bình vào tháng 4 năm 2015 và được TS. Trần Thị Phương Anh - Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản (TB15.2015) đã được lưu giữ tại Phòng thảo dược của Viện Hóa sinh biển, VAST. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 4,5 kg mẫu khô cây Mỏ quạ, được cắt nhỏ, phơi khô, xay thành bột mịn rồi được ngâm chiết với metanol với sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 60 phút ở 40-50 oC, 3-5 lần). Lớp dung môi metanol được lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cất loại dung môi metanol bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu được 200 g cặn chiết metanol. 200 g cặn chiết metanol mẫu Mỏ quạ thu được ở trên được phân bố đều vào 2 phễu chiết có chứa 1L nước cất. Sau đó, bổ sung vào mỗi phễu chiết 1L diclometan, lắc đều rồi để phân lớp qua đêm (3 lần). Lớp diclometan (dưới) được lọc qua giấy lọc rồi cất loại diclometan bằng thiết bị cất quay chân không áp suất giảm thu được 80,0 g cặn diclometan. Lớp nước (trên) được loại bỏ dung môi còn sót lại và nước thu được 30,0 g cặn nước. 2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo. Sắc ký lớp mỏng (TLC): thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất 32
  40. bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hoạt chất được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan) Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại propton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. 33
  41. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm) Phổ DEPT (Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH 0 và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu của các CH. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. Phổ NOESY (Nucler Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử. Độ quay cực đo trên máy JASCO DIP - 1000 KUY polarimeter. 34
  42. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Phân đoạn diclometan được hòa tan bằng lượng tối thiểu dung môi metanol, bổ sung silicagel (tỉ lệ 1/1,5 về khối lượng), trộn đều rồi cất loại metanol đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được tiến hành sắc ký trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần hexan/acetone (từ 0% đến 100% aceton, mỗi lần 1 lít) thu được 8 phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A8. Phân đoạn A7 (7,2 g) được phân tách thành 4 phân đoạn nhỏ hơn (A7A – A7D) trên cột sắc ký sử dụng silicagel pha đảo C-18 với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (tỉ lệ 2,5/1 về thể tích, 2,5 L). Phân đoạn A7C (1,8 g) được phân tách trên cột sắc ký sử dung silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải hexan/diclometan/metanol (tỉ lệ 4/10/0.1 về thể tích, 2,0 L) thu được 4 phân đoạn nhỏ, ký hiệu là A7C1 – A7C4. Hợp chất MQ21 (11 mg) và MQ 23 (8 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn A7C2 trên cột sắc ký sử dụng silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải hexane/ethyl acetate (tỉ lệ 2/1 về thể tích, 1,2L) 35
  43. Cặn diclometan (80 g) Sắc ký cột pha thường Hexan/acetone: 0-100% aceton (1L) A7 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A8 7.2g Sắc ký cột pha đảo Acetone/nước:2,5/1 (2,5 L). A7C A7A A7B A7D 1.8g Sắc ký cột pha thường Hexan/diclometan/metanol: 4/10/0.1 (2 L) A7C1 A7C2 A7C3 A7C4 Sắc ký cột pha thường Hexane/ethyl acetate: 2/1 (2L). Chất 1:MQ21 Chất 2: MQ 23 (11mg) (8mg) Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ 36
  44. 3.2. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất 3.2.1. Hợp chất 1: Aurantiamide acetate + Bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử: C27H28N2O4 (M=444) + Số liệu phổ của hợp chất 1: tham khảo bảng 4.1. 3.2.2. Hợp chất 2: Aurantiamide + Công thức phân tử: C25H26N2O3 (M=402) + Số liệu phổ của hợp chất 2: tham khảo bảng 4.2. 37
  45. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 Phổ 1H-NMR của 1 cho thấy sự có mặt của 15 proton của ba hệ thống AA'BB'C; hai nhóm NH ở 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz) và 5,97 (1H, d, J = 8,0 Hz); hai proton oxymetylen ở δH 3,92 (1H, dd, J = 11,5 và 5,0 Hz, H-10a) và 3,82 (1H, dd, J = 11,5và 4,0 Hz, H-10b) và một metyl ở δH 2,04 (s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt 27 cacbon, bao gồm ba cacbonyl cacbon ở δC 170,79 (nhóm chức năng của ester), 170,28 và 167,13 (amide functional group); hai metin ở δC 54,99 và 49,47; oxymetylen ở δC 64,60; hai metyl benzyl tại δC 38,42 và 37,45; 18 cacbon của hệ thống AA'BB'C bao gồm ba nguyên tử cacbon bậc bốn ở δC 136,71; 136,63 và 133,68; và nhóm metyl ở δC 20,79. Dữ liệu phổ của 1 tương tự với dữ liệu của aurantiamide acetate [13]. Tương tác HMBC giữa H-3 (δH 2,75) và C-2 (δC 49,47) / C-4 (δC 137,6) / C-10 (δC 64,60); H-12 (δH 2,04) và C-11 (δC 170,79); H-6a (δH 2,04) và C-11 (δC 170,79) đã khẳng định vị trí của nhóm acetyl ở C-10. Dựa trên các bằng chứng trên, cấu trúc của 1 đã được làm sáng tỏ như aurantiamide acetate, một hợp chất được biết trước đây đã được phân lập từ các loài cây khác nhau, như Aspergillus penicilloides, hai loài tảo (Cystoseira corniculata và Acanthospora specifera) và một số họ của cây cao : Euphorbiaceae (Euphorbia fischeriana và Croton hieronymi), Piperaceae (Piper aurantiacum), Leguminosae (Medicago polymorpha và Pongamia glabra), Sterculiaceae (Pterospermum heyneanum), Morinagaceae (Moringa oleifera) và Rutaceae (Zanthoxylum setulosum) [13]. Dựa vào các bằng chứng phổ trên có thể khẳng định hợp chất 1 là Aurantiamide acetate với công thức phân tử C27H28N2O4 (M=444). 38
  46. Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất 1 Hình 4.1.2: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 1 39
  47. Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13C-NMR của hợp chất 1 Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 40
  48. Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1 41
  49. Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo # a,b a,c C  C  C  H (J = Hz) HMBC (HC) 1 171.2 170.28 - NH 5.97(d, 8.0) 1 2 50.4 49.47 4.34 (m) 3 38.4 37.45 2.75 (t, 6.0) 2, 4,5,9,10 4 137.6 136.64 - 5,9 129.7 128.65 6,8 129.8 128.77 7.06 - 7.45 (m) 7 127.8 126.76 3.92 (dd, 11.5, 5.0) 10 65.5 64.60 3 3.82 (dd, 11.5, 4.0) 11(COCH3) 171.8 170.79 - 12(COCH3) 21.8 20.79 2.04 s 11 13 55.9 54.99 4.78 (m) 1,14,21,22 NH 6.75 (d, 8.0) 14 14 168.1 167.13 - 15 134.6 133.68 - 16,20 128.0 127.06 7.71 (d, 7.0) 17,19 129.6 128.59 7.06 - 7.45 (m) 18 132.9 131.93 7.52 (t, 7.5) 3.22 (dd, 14.0, 6.0) 21 39.4 38.42 13,22,23,27 3.06 (dd, 14.0, 8.5) 22 137.7 136.71 - 23,27 130.1 129.14 24,26 130.3 129.30 7.06 - 7.45 (m) 25 128.2 127.15 a b c đo trong CDCl3, đo tại 125 MHz, đo tại 500 MHz 42
  50. 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 Phổ 1H-NMR của 2 cũng cho thấy sự hiện diện của 15 proton của ba hệ thống AA'BB'C; hai nhóm NH ở δH 6,78 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,92 (1H, d, J 13 = 8,0 Hz); hai proton oxymethylen ở δH 3,43 (2H, m). Trên phổ C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt 25 cacbon , bao gồm hai cacbonyl cacbon ở δC 170,78 và 167,17 (amide functional group); hai metin ở δC 55.25 và 52.88; oxymetylen ở δC 63,54; hai metyl benzyl ở δC 38,69 và 36,88; 18 cacbon của hệ thống AA'BB'C bao gồm ba nguyên tử cacbon bậc bốn ở δC 137,27; 136,79 và 133.59. Số liệu phổ của 2 tương tự như 1, ngoại trừ sự biến mất của nhóm acetyl. Dựa trên những bằng chứng này, cấu trúc của 2 đã được xác định là aurantiamide, một hợp chất đã biết trước đây được tìm thấy trong các cây thuộc họ Piperaceae (Piper aurantiacum) [21]. Từ các phân tích phổ trên, có thể khẳng định hợp chất 2 là aurantiamide với công thức phân tử C25H26N2O3 (M=402). Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 43
  51. Hình 4.2.2: Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 2 Hình 4.2.3: Phổ cacbon 13C-NMR của hợp chất 2 44
  52. Hình 4.2.4: Phổ cacbon DEPT của hợp chất 2 Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo # a,b a,c C  C  C DEPT  H (J = Hz) 1 171.2 170.78 CO - NH - - - 5.92 (d, 8.0) 2 50.4 52.88 CH 4.09 (m) 2.78 (dd, 14.0, 7.5) 3 38.4 36.88 CH2 2.69 (dd, 13.5, 7.0) 4 137.6 136.79 C - 5,9 129.7 128.66 CH 6,8 129.8 128.88 CH 7.07 - 7.45 (m) 7 127.8 126.64 CH 45
  53. 10 65.5 63.54 CH2 3.43 (m, 2H) 11 - - - - 12 - - - - 13 55.9 55.25 CH 4.76 (ddd, 16.0, 8.0, 6.0) NH - - - 6.78 (d, 7.5) 14 168.1 167.17 CO - 15 134.6 133.59 C - 16,20 128.0 127.08 CH 7.71 (d, 7.0) 17,19 129.6 128.57 CH 7.07 - 7.45 (m) 18 132.9 131.75 CH 7.52 (t, 7.5) 3.26 (dd, 13.5, 5.5) 21 39.4 38.69 CH2 3.04 (dd, 13.5, 3.5) 22 137.7 137.27 C - 23,27 130.1 129.38 CH 24,26 130.3 129.15 CH 7.07 - 7.45 (m) 25 128.2 127.21 CH a b c # Đo trong CDCl3, đo tại 125 MHz, đo tại 500 MHz, C của aurantiamide 46
  54. KẾT LUẬN 1. Bằng phương pháp sắc ký kết hợp bao gồm: sắc ký cột nhồi chất hấp phụ silicagel pha thường, silicagel pha đảo, sắc ký lớp mỏng pha thường, sắc ký lớp mỏng pha đảo, và sử dụng các hệ dung môi khác nhau đã phân lập được 2 hợp chất từ phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata) kí hiệu là MQ 21 và MQ 23. 2. Bằng việc sử dụng các phương pháp hóa lí kết hợp bao gồm: phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng với phương pháp phổ khối lượng đã phân lập và xác định được cấu trúc 2 hợp chất từ phân đoạn diclometan cây Mỏ quạ (Cudrania tricuspidata). Cấu trúc hóa học của chúng được xác định là: Aurantiamide acetate ( MQ 21) và Aurantiamide ( MQ 23). Aurantiamide acetate Aurantiamide 47
  55. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Y học. 2. PGS.TS Nguyễn Hữu Đĩnh (2013), PGS.TS Đỗ Đình Rãng, Hóa học hữu cơ, Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội. 4. Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội. 5. Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, nhà xuất bản Y học Hà Nội. 6. Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển II, nhà xuất bản Y học Hà Nội. Tiếng anh 7. Cannell, R. J. P (1998), Natural Products Isolation. 8. Chi-Su Yoon, Dong-Cheol Kim, Tran Hong Quang, Jungwon Seo, Dae Gill Kang, Ho Sub Lee, Hyuncheol Oh and Youn-Chul Kim (2016), “A Prenylated Xanthone, Cudratricusxanthone A, Isolated from Cudrania tricuspidata Inhibits Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammation 48
  56. through Inhibition of NF-κB and p38 MAPK Pathways in BV2 Microglia”, Molecule 2016, 21, 1240. 9. Dae Hoon Kim, Sooung Lee, Youn Wook Chung, Byeong Mo Kim, Hanseul Kim, Kunhong Kim, and Kyung Mi Yang(2016), “Antiobesity and Antidiabetes Effects of a Cudrania tricuspidata Hydrophilic Extract Presenting PTP1B Inhibitory Potentia”, BioMed Research International , Volume 2016 , Article ID 8432759, 11 pages. 10. Dong-Cheol Kim, Chi-Su Yoon, Tran Hong Quang, Wonmin Ko, Jong-Su Kim, Hyuncheol Oh and Youn-Chul Kim (2016), “Prenylated Flavonoids from Cudrania tricuspidata Suppress Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammatory Activities in BV2 Microglial Cells”, International Journal of Molecular Sciences , Vol.17, 255. 11. Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Yean- Yves Lallemand and Marcel Fetizon (1990), “Ellagic acid compounds from Diplopanax stachyanthus”, Phytochemistry, Vol.29(1), 251-256. 12. Jaeyoung Kwon, Nguyen Tuan Hiep, Dong-Woo Kim, Sungeun Hong, Yuanqiang Guo, Bang Yeon Hwang, Hak Ju Lee, Woongchon Mar and Dongho Lee (2016). “Chemical Constituents Isolated from the Root Bark of Cudrania tricuspidata and Their Potential Neuroprotective Effects”, Journal of Natural Products, Vol.79(8), 1938–1951. 13. Jules Lobe Songue, Kouam, Etienne Dongo, Theophile Ngando Mpondo and Robert L. White (2012), “Article Chemical Constituents from Stem Bark and Roots of Clausena anisata, Molecules”, Vol.17, 13673-13686. 14. K. R. Markham, B. Ternai, R. Stanley, H. Geiger and T. J. Mabry (1978), “Tetrahedron”, 34, 1389-1392. 15. Lobe Songue, Kouam, Etienne Dongo, Theophile Ngando Mpondo and Robert L. White (2012), Article Chemical Constituents from Stem Bark and Roots of Clausena anisata Jules. 49
  57. 16. Peter J. Houghton and Lu Ming Lian (1986), “Triterpenes from Desfonatainia spinosa”, Phytochemistry, Vol. 15(8), 1939-1944. 17. S. B. Mahato and A. P. Kundu (1994), “13C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-A compilantion and some salient features”, Phytochemistry, Vol.37, 1517-1575. 18. Soo-Myeong Jeon, Dong-Sung Lee, Gil-Saeong Jeong (2016), “Cudraticusxanthone A isolated from the roots of Cudrania tricuspidata inhibits metastasis and induces apoptosis in breast cancer cells”, Journal of Environmental Psychology , Vol.194, 57–62. 19. Yang Hee Jo, Seon Beom Kim, Qing Liu, Bang Yeon Hwang, and Mi Kyeong Lee (2016), “Prenylated Xanthones from the Roots of Cudrania tricuspidata as Inhibitors of Lipopolysaccharide - Stimulated Nitric Oxide Production”, Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2016, 349, 1–7. 20. Yang Hee Jo, Seon Beom Kim, Qing Liu, Seon-Gil Do, Bang Yeon Hwang, Mi Kyeong Lee (2016), Comparison of pancreatic lipase inhibitory isoflavonoids from unripe and ripe fruits of Cudrania tricuspidata. 21. Phytochemistry, Vol. 20, No. 9, 2217-2220 (1981). Tài liệu web 22. nha 23. qua-3410.html 24. qua.html 25. p2/moqua 26. 50