›

Khóa luận Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử

pdf 45 trang thiennha21 15/04/2022 5360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_phan_loai_chi_coc_spondias_l_o_viet_nam.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ĐẶNG THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CĨC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Thực vật học Hà Nội, tháng 05 năm 2019
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ĐẶNG THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CĨC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Thực vật học Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lê Chí Tồn Hà Nội, tháng 05 năm 2019
  3. LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực của khĩa luận, tơi xin cam đoan: Khĩa luận ―Nghiên cứu phân loại chi Cĩc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖ là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tơi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Chí Tồn. Các kết quả trình bày trong khĩa luận là trung thực và chưa được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào trước đây. Xuân Hịa, ngày 21 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Ánh i
  4. LỜI CẢM ƠN Trong suốt khoảng thời gian hồn thành đề tài khĩa luận này, tơi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ của thầy cơ, người thân và bạn bè xung quanh. Tơi rất cảm kích về điều đĩ. Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý thầy cơ, cán bộ của khoa Sinh–KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, bằng cả tấm lịng, sự nhiệt huyết, và những tri thức uyên bác của mình đã truyền đạt cho tơi những kiến thức quý báu, những bài học kinh nghiệm mà phải mất khoảng thời gian dài mới cĩ thể đúc kết ra được. Đặc biệt, với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Lê Chí Tồn – người thầy, người hướng dẫn trực tiếp đề tài khĩa luận này của tơi. Thầy đã đồng hành, trợ giúp tơi trong các bước đọc tài liệu, chắt lọc, thu thập thơng tin, làm thí nghiệm; cho tơi những kinh nghiệm hữu ích trong quá trình nghiên cứu. Với kiến thức cịn non nớt, và những kinh nghiệm cịn hạn chế thì việc thất bại trong quá trình nghiên cứu là lẽ tất yếu, những lời khuyên của thầy đã giúp tơi nhận biết và khắc phục những sai sĩt gặp phải, vượt qua giới hạn của bản thân để hồn thành tốt đề tài khĩa luận này. Một lần nữa, tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, chúc thầy cĩ thật nhiều sức khỏe để cĩ thêm nhiều đĩng gĩp hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học, và chúc những dự án mà thầy đang ấp ủ thực hiện sẽ gặt hái được nhiều thành cơng. Ngồi ra chúng tơi xin trân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này thơng qua đề tài mã số C.2019.01. Thời gian tơi được làm quen, tiếp xúc với nghiên cứu khoa học chưa nhiều, kiến thức và kinh nghiệm cịn hạn hẹp nên khơng tránh được những thiếu sĩt, tơi rất mong nhận được những lời gĩp ý của các quý thầy cơ để bản khĩa luận được hồn thiện hơn. Tơi xin trân trọng cảm ơn! Xuân Hịa, ngày 21 tháng 4 năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Ánh ii
  5. MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2 3. Nội dung chính của đề tài 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 PHẦN NỘI DUNG 4 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước 7 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cĩc của Việt Nam 9 CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu 11 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 11 2.3. Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1. Cách tiếp cận 13 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 13 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa 20 3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử 20 3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi 22 3.4 Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho spondias l. Ở việt nam 28 CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1. Kết luận 32 4.2. Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iii
  6. PHỤ LỤC BẢNG Bảng 2.1. Thơng tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA được giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải trong nghiên cứu này. 12 Bảng 2.2. Dụng cụ, máy mĩc sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 2.3. Hĩa chất cần thiết được sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di 17 Bảng 2.4. Thơng tin các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 18 iv
  7. PHỤ LỤC HÌNH Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cĩc 20 Hình 3.2. Kết quả alignment. 21 Hình 3.3. Cây phát sinh lồi của chi Cĩc (Spondias) theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.22 Hình 3.4. Cây phát sinh lồi của chi Cĩc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.23 Hình 3.5. Cây phát sinh lồi của chi Cĩc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%. 23 Hình 3.6. Hình thái lá, số lượng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B) 24 Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis 25 Hình 3.8. Lơng ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis 25 Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B) . 26 v
  8. PHỤ LỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ L. Linnaeus PCR Polymerase Chain Reaction PTN SHTT Phịng thí nghiệm Sinh học trung tâm sp. Species var. Varietas Viện NCKH & ƯD Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng vi
  9. PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chi Cĩc (Spondias L.) là một chi nhỏ thuộc họ Ðào lộn hột hay cịn gọi là họ Xồi (Anacardiaceae R. Br.) với khoảng 18 lồi trên thế giới, chi Spondias tập trung phân bố ở Nam Mỹ, châu Á và Madagascar [24]. Spondias là chi mẫu chuẩn của phân họ Spondioideae Takht. emend. Pell & J. D. Mitch. và được ủng hộ bằng dữ liệu phân tử qua nghiên cứu của Pell (2004), Mitchell và cộng sự (2006), Pell và cộng sự (2011). Spondias là chi thực vật cĩ giá trị kinh tế khá cao. Quả, rễ của các lồi Spondias cĩ giá trị thương mại và y dược. Lịch sử phân loại của chi Spondias khá phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mơ tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ Xồi thành các nhĩm và chia họ Xồi thành hai tơng Anacardieae và Spondieae. Sau đĩ, Marchand (1869) đã cơng bố tơng Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mơ hình khái niệm của Spondias [16]. Hai quan điểm phân loại của Spondioideae của Châu Á cịn nhiều đối lập trong sự phân chia các lồi. Trong phiên bản sửa đổi chi Spondias nhiệt đới của Châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn với lá kép lơng chim, nỗn đơn với nỗn đa, lá chét cĩ hoặc khơng cĩ một đường gân ở mép lá [6]. Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đĩ chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng khơng thuộc về chi Spondias. Ngồi ra các lồi Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata cịn là những vấn đề chưa rõ ràng và cĩ lẽ cũng khơng thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngồi ra, 1
  10. Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khĩ khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]. Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay cịn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hĩa thực vật. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Tuy nhiên việc áp dụng cơng nghệ này vào các nghiên cứu trong nước cịn ở mức hạn chế cả về chất lượng và số lượng nghiên cứu. Đối với Spondias, kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đĩ Spondias Nam Mỹ là chi của Spondias châu Á [27]. Chi Cĩc (Spondias L.) ở Việt Nam được ghi nhận bao gồm 3 lồi là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hịa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi cĩ giá trị kinh tế và một số lồi của chi này được trồng rộng rãi. Tuy vậy việc nghiên cứu phân loại và mối quan hệ phát sinh của các lồi trong chi Spondias ở Việt Nam chưa được thực hiện. Do đĩ, một nghiên cứu phân loại cho chi Spondias ở Việt Nam là cần thiết. Xuất phát từ lí do trên, chúng tơi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cĩc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu Tiến hành điều tra và khẳng định số lượng lồi thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khơ của một số lồi thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Xây dựng khĩa định loại và cây phát sinh lồi bằng dữ liệu phân tử cho chi Spondias ở Việt Nam. 2
  11. 3. Nội dung chính của đề tài Nghiên cứu tài liệu, tiêu bản của các lồi thuộc chi Spondias ở Việt Nam tại các phịng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khơ của một số lồi thuộc chi Spondias ở Việt Nam. Tiến hành các thí nghiệm như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự một số gen (03 gen lục lạp: rbcL, matK, trnLF) cho các mẫu của chi Spondias ở Việt Nam. Phân tích kết quả xử lí trình tự được nghiên cứu bằng chương trình và thuật tốn: Geneious, jModelTest, Maximum Likelihood, Bayesian Inference. Xây dựng khĩa định loại và cây phát sinh lồi bằng dữ liệu phân tử cho chi Spondias ở Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Đề tài gĩp phần tìm hiểu thực trạng số lượng các lồi của chi Spondias ở Việt Nam, từ đĩ đánh giá được mức độ đa dạng và đưa ra được các đề xuất nhằm bảo tồn chi Spondias ở Việt Nam. Hơn nữa, đề tài sẽ đĩng gĩp các thơng tin, dữ liệu cần thiết (cả hình thái, phân tử và sự phân bố) của chi Spondias ở Việt Nam cho cơng tác xây dựng hệ thống Thực vật chí của Việt Nam. Ngồi ra, đề tài sẽ giúp sinh viên được tìm hiểu và làm việc trực tiếp với các thí nghiệm và phân tích phân tử hiện đại. 3
  12. PHẦN NỘI DUNG CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu Theo hệ thống phân loại APG III (2009), họ Xồi/Đào lộn hột (Anacardiaceae) chứa khoảng 70 chi với khoảng 600 lồi trên thế giới. Họ Xồi được chia thành hai phân họ là phân họ Xồi với khoảng 10 chi và 115 lồi và phân họ Đào lộn hột với khoảng 60 chi và 485 lồi [8, 28]. Họ Xồi là họ thực vật cĩ nhiều sản phẩm nơng nghiệp nổi tiếng và cĩ giá trị kinh tế cao như là hạt điều, xồi, hạt tiêu hồng, và quả hồ trăn. Nhiều lồi trong các chi của họ Xồi được trồng và dùng làm thực phẩm như: Antrocaryon (lấy quả và hạt), Bouea (quả), Buchanania (quả và hạt), Choerospondias (quả), Rhus (quả), Cyrtocarpa (quả), Lannea (quả), Ozoroa (gỗ, quả), Fegimanra (hạt), Haematostaphis (quả, hạt), Harpephyllum (quả), Pleiogynium (quả), Pseudospondias (quả và hạt), Schinus L. (quả), Sclerocarya (quả), Searsia (quả), Sorindeia (quả), Spondias (quả), và Trichoscypha (quả và hạt) [20]. Tuy khơng cĩ thành viên của Anacardiaceae nào được xếp hạng là cây gỗ lớn, nhưng giữ vai trị quan trọng trong thị trường gỗ nhỏ và được đánh giá cao về chất lượng và khả năng chống mối mọt. Gỗ của Schinopsis ở Nam Mỹ cĩ khả năng chống mối mọt tốt và được sử dụng rộng rãi ở Argentina cho ngành đường sắt. Các loại gỗ khác bao gồm: Abrahamia, Anacardium, Astronium, Campnosperma, Ozoroa, Dracontomelon dao, Loxopterygium, Myracrodruon, Protorhus, Schinopsis, Sclerocarya, Trichoscypha được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong sản xuất: làm diêm, tủ, cung, than, nhà ở, tay cầm rìu, củi, bát, ván, và cột [20]. Nhiều lồi của Anacardiaceae cĩ giá trị việc trong trang trí sân vườn. Các lồi của Cotinus, Rhus, Schinus, Searsia, P. chinensis, P. mexicana, Harpephyllum caffrum, Lannea coromandelica, Rhodosphaera, Smodingium, và Toxicodendron được trồng thành cụm, cĩ hoa đẹp để trang trí cho nhà cửa, tạo 4
  13. hàng cây thường xanh hoặc rụng lá. Tuy nhiên, một vài lồi sau khi được trồng trong nơng, lâm nghiệp hay trang trí đã phát triển vượt ra sự kiểm sốt và trở thành lồi xâm lấn cĩ thể kể tới như: Toxicodendron succedaneum ban đầu được trồng ở Brazil, nhưng đã phát triển rất mạnh sau khi được giới thiệu trồng tại Nhật Bản, hiện nay đang nằm trong danh sách lồi xâm lấn ở Nhật Bản. Gần đây Pistacia chinensishas được nhập trồng và bắt đầu xâm lấn ở Texas (Hoa Kỳ). Ngồi ra, nhiều lồi khác cĩ giá trị cao trong y dược phẩm như: Spondias (quả: lợi tiểu; rễ: làm kem dưỡng da; vỏ cây dùng sản xuất: thuốc tẩy, thuốc xổ, chữa bệnh phong, chữa ho, trị các vết thương; lá: chữa bệnh phong, tẩy giun, trị đau dạ dày) [20]. Chi Cĩc thuộc phân họ Spondoideae. Chi này gồm 18 lồi đã được mơ tả, trong số đĩ cĩ 7 lồi tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Á và 10 lồi tìm thấy ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, và 01 lồi ở Madagascar. Trong số 18 lồi Cĩc được tìm thấy, cĩ 10 lồi cĩ lá và quả ăn được, các lồi này được thuần hĩa để trồng ở vùng nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ [28], trong đĩ, S. dulcis được trồng phổ biến trên thế giới. S. dulcis ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ được dùng làm nước ép, làm kem; ở vùng biển Caribbean nĩ được sử dụng như hương liệu tạo vị cho sữa chua chứa nhiều vitamin C [20]. Trên thế giới, các nghiên cứu phân loại và phát sinh lồi của thực vật hạt kín được tiến hành từ rất sớm và đã cĩ rất nhiều cơng bố khoa học được đăng trên các tạp chí và sách chuyên ngành. Tuy nhiên việc sử dụng dữ liệu phân tử vào các hướng nghiên cứu này ở Việt Nam cịn rất hạn chế và tồn tại nhiều khĩ khăn. Ngồi ra, số lượng và chất lượng các nghiên cứu phát sinh lồi và tiến hĩa ở Việt Nam trong những năm gần đây là chưa cao. Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay cịn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hĩa thực vật và di truyền. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Trong ba hệ gen gồm: gen nhân, gen ty thể và gen lục lạp; các trình tự của 5
  14. gen lục lạp được sử dụng nhiều và phổ biến đối với các nghiên cứu thực vật. Trình tự của ba gen rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), matK (Maturase K), trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence (trình tự từng phần); trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; và tRNA–Phe (trnF)) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hệ thống và phát sinh của thực vật hạt kín nĩi chung và Spondias nĩi riêng [29]. rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), là gen được tìm thấy trong lục lạp, quy định enzyme RuBisCO trong quá trình quang hợp. rbcL cĩ giá trị lớn và được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đánh giá mối quan hệ phát sinh lồi [29]. Tuy nhiên trình tự gen rbcL thường cĩ tính bảo thủ lồi và chi khá cao, cĩ nghĩa là trình tự rbcL của các lồi trong cùng một chi cĩ độ tương đồng cao. Mặc dù vậy, rbcL là gen dễ khuếch đại và tạo thuận lợi cho nhiều nghiên cứu. matK (Maturase K) là một gen lục lạp, protein của nĩ mã hĩa một maturase intron [29]. Trình tự gen matK thường cĩ tính bảo thủ lồi thấp do đĩ rất hữu ích cho nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên, matK lại là một trong những trình tự gen lục lạp khĩ khuếch đại nhất. Mặc dù vậy, matK vẫn là một gen được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu hiện nay. Để khắc phục khĩ khăn trong quá trình khuếch đại (PCR) các nhà khoa học cĩ thể tác động đến chương trình chạy PCR hoặc thay đổi trình tự mồi. Yu và cộng sự (2011) đề xuất việc sử dụng matK và thúc đẩy việc áp dụng matK như một mã vạch DNA bằng việc sử dụng các loại mồi mới. Nghiên cứu sử dụng 58 lồi từ 47 họ thực vật hạt kín, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng các đoạn mồi mới cĩ khả năng khuếch đại mạnh mã gen matK (93,1%) và tỷ lệ trình tự cĩ thể sử dụng được là rất cao (92,6%) [14, 23]. trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence; trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; and tRNA–Phe (trnF) gene) cũng là một gen lục lạp, tuy nhiên trnLF là một gen khảm, phân mảnh, nĩ bao gồm ba đoạn là trnL, trnL–trnF intergenic spacer và trnF. Trình tự của gen trnLF cĩ tính bảo thủ thấp, 6
  15. do đĩ cung cấp nhiều thơng tin cho việc xác định rõ ràng mối quan hệ của các lồi nên cĩ giá trị sử dụng cao trong nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên đây cũng là một gen khĩ khuếch đại và đặc biệt là rất khĩ giĩng hàng và căn trình tự [29]. Hệ thực vật của Việt Nam rất đa dạng và chưa được nghiên cứu kĩ, đặc biệt là các nghiên cứu phát sinh lồi sử dụng dữ liệu phân tử. Do đĩ, đây là một hướng nghiên cứu cĩ thể đĩng gĩp nhiều thơng tin và dữ liệu quý giá cho khoa học thế giới và Việt Nam. 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu chi Cĩc trên thế giới Lịch sử phân loại của chi Cĩc Spondias khá là phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mơ tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ này thành các nhĩm và chia họ này thành hai tơng Anacardieae và Spondieae [9]. Sau đĩ, Marchand (1869) đã cơng bố tơng Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mơ hình khái niệm của Spondias [16]. Hai quan điểm phân loại của Spondioideae châu Á cịn nhiều đối lập trong sự phân chia các lồi. Trong phiên bản sửa đổi của Spondias nhiệt đới của châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn vs. lá kép lơng chim, nỗn đơn vs. nỗn đa, lá chét cĩ hoặc khơng cĩ một đường gân ở mép lá [6]. Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đĩ chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng khơng thuộc về chi Spondias [19]. Ngồi ra các lồi Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata cịn là những vấn đề chưa rõ ràng và cĩ lẽ cũng khơng thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngồi ra, 7
  16. Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khĩ khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]. Kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đĩ Spondias Nam Mỹ nằm ở một nhánh phát sinh riêng biết và cĩ quan hệ chị em gần gũi với Spondias châu Á, điều này cũng gợi ý cho nghiên cứu lịch sử tiến hĩa và phát sinh của chi Spondias trên tồn thế giới. Chayamarit (1997) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột ở Thái Lan dựa trên dữ liệu phân tử (bao gồm chi Spondias), tuy nhiên do sự hạn chế về việc lấy mẫu và các trình tự gen (chỉ bao gồm duy nhất một gen rbcL) nên kết quả của nghiên cứu này là rất hạn chế đối với chi Spondias. Kết quả chỉ ra rằng, Spondias cĩ quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh phát sinh với Dracontomelon [10]. Pell (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột dựa trên dữ liệu sinh học phân tử và hình thái (bao gồm chi Spondias). Nghiên cứu được tiến hành trên 9 chi của họ Ðào lộn hột bao gồm cả Spondias, sử dụng trình tự của 5 gen: ETS, ITS, trnLF, rps16, matK. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, khi kết hợp 2 gen ETS và ITS cho chỉ số ủng hộ bootstrap cao hơn khi kết hợp 3 gen ETS, ITS và trnLF [20]. Trong thực vật chí Trung Quốc, Min and Barfod (2008) ghi nhận hai lồi của chi Spondias ở Trung Quốc là S. pinnata và S. lakonensis. Lồi S. lakonensis bao gồm hai thứ là S. lakonensis var. lakonensis và S. lakonensis var. hirsuta [18]. Silva và cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu phát sinh các lồi của chi Spondias ở Nam Mỹ dựa trên dữ liệu phân tử. Nghiên cứu được tiến hành trên 6 lồi của chi Spondias ở Nam Mỹ sử dụng trình tự của 3 gen là rbcL, matK và trnH–psbA spacer [24]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trình tự gen rbcL và matK của các lồi thuộc Spondias ở Nam Mỹ là tương đối bảo thủ, trong khi đĩ, 8
  17. trnH–psbA spacer khá là khác biệt giữa các lồi và cĩ thể cho phép phân biệt được các lồi. Al–Saghir (2017) tiến hành nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể của 5 lồi thuộc chi Spondias sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [7]. Kết quả của nghiên cứu thể hiện rằng, tất cả 5 lồi được nghiên cứu đều cĩ chung bộ nhiễm sắc thể là 2n = 32. Hơn nữa, tất cả các lồi Spondias cĩ quan hệ di truyền gần gũi. 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cĩc của Việt Nam Chi Cĩc (Spondias) ở Việt Nam đến nay được ghi nhận bao gồm 3 lồi là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata và tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hịa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi cĩ giá trị kinh tế và một số lồi của chi này được trồng rộng rãi. Tuy nhiên, theo Phạm Hồng Hộ (2003) chi Cĩc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm 3 lồi là S. cythera, S. pinnata và S. mombin. Tuy vậy, tác giả cũng nhấn mạnh rằng ơng chỉ quan sát thấy S. cythera, S. pinnata (dọc ven biển từ Vinh tới Đà Lạt, Đồng Nai), trong khi S. mombin cĩ lẽ là khơng chắc chắn [2]. Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) tiến hành nghiên cứu chiết xuất pectin từ vỏ Cĩc (S. cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sĩng [3]. Nghiên cứu đưa ra một quy trình tối ưu cho việc chiết xuất pectin từ vỏ cĩc sử dụng các tác nhân hĩa học (HCl và cồn 96o) kết hợp với vi sĩng (MAE – microwave assisted extraction method) ở 400 W trong 10 phút. Quy trình này được cho là giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất pectin so với phương pháp chiết xuất truyền thống. Nguyễn Xuân Quyền và cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu giá trị sử dụng của các lồi trong họ Xồi ở Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra các giá trị sử dụng khác nhau của các lồi trong họ Xồi, trong đĩ cĩ giá trị của các lồi Cĩc (Spondias L.) là: cây ăn quả, làm thuốc, lấy gỗ, làm cảnh [4]. 9
  18. Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân loại và hệ thống phát sinh của Spondias chưa được quan tâm chú trọng vì vậy mối quan hệ phát sinh của các lồi thuộc chi Spondias ở Việt Nam là chưa rõ ràng. Do đĩ, một nghiên cứu phân loại và phát sinh cho Spondias ở Việt Nam là cần thiết. Sử dụng phương pháp phân loại dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cĩc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖. 10
  19. CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng lồi thuộc chi Cĩc như đã được ghi nhận trong ―Danh lục các lồi thực vật Việt Nam‖ và một số tài liệu cĩ liên quan. Ngồi ra, nghiên cứu này cũng tiến hành thu thập và phân tích thơng tin, dữ liệu phân tử một số lồi Cĩc trên thế giới dựa trên dữ liệu từ Ngân hàng Gen (Genbank–NCBI). Chúng tơi tiến hành nghiên cứu trên 14 lồi (16 cá thể) của hai chi Spondias và Allospondias (Bảng 2.1). Trong đĩ bao gồm: 04 mẫu được thu ở Việt Nam, 12 mẫu được thu thập trên ngân hành Gen thế giới (Genbank – NCBI). Nghiên cứu sử dụng 03 lồi thuộc chi Buchanania (B. siamensis, B. reticulata và B. glabra) làm đối chứng cho phân tích phát sinh lồi. Nghiên cứu sử dụng 03 gen lục lạp bao gồm rbcL, matK và trnLF cho các phân tích phát sinh lồi. Phương pháp tách chiết, PCR, giải trình tự và phân tích được trình bày chi tiết ở mục 3. 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 2.2.1. Phạm vi nghiên cứu Phân tích hình thái và phân tử sử dụng các mẫu tươi, các tiêu bản khơ, các trình tự DNA của các lồi thuộc chi Cĩc ở Việt Nam. 2.2.2. Địa điểm Một số địa điểm được ghi nhận phân bố của các lồi thuộc chi Spondias tại Việt Nam. Địa điểm kiểm tra tiêu bản khơ: Phịng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật; Viện Dược liệu; Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam; Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 11
  20. Bảng 2.1. Thơng tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA đƣợc giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới đƣợc giải trong nghiên cứu này. Lồi Địa điểm Ngƣời thu mẫu matK rbcL trnLF Spondias tuberosa Arruda Brazil W. Thomas s.n. (NY) KP774614 KP774626 KP055577 Spondias mombin L. USA; Costa Rica Mitchell s.n. (NY); Roberto E. 528 KP774609 JQ590140 KP055575 Spondias venulosa (Engl.) Engl. Brazil KP774610 KP774632 KR081921 Spondias purpurea L. Mexico F. Arreola & F. Mora s.n. KP774612 KP774619 KR081868 Spondias sp. Brazil KP774613 KP774630 – R. Perez s.n.; E. Mart nez S., C. H. Brazil Ramos, R. Lombera & G. Dom nguez Spondias radlkoferi Donn.Sm. 25557 – GQ981883 KR081870 Spondias testudinis J.D. Mitch. & D.C. Brazil M. C. Machado & N. G. Antas 1563 Daly – – KR081875 Spondias malayana Kosterm. USA Pell 775 (BKL) – – KP055574 Spondias globosa J.D. Mitch. & D.C. Daly Brazil C. van den Berg 2171 – – KR081819 Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den E. Melo, M. C. Machado & B. M. Silva Brazil Berg & M.Machado 11933 – – KR081811 Spondias acida Blume Australia D.A. Powell & H'ng Kim Chey 579 – – KR081767 M. C. Machado, A. R. Barbosa & M. R. Brazil Spondias dulcis Parkinson Santos 1302; Weiblen, G. D. WS5B0380 KP774606 JF739148 KR081815 Spondias pinnata (Koenig ex L.f.) Kurz Lai Chau, Vietnam C.T. Le Le10 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Lang Son, Vietnam C.T. Le Le04 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Vinh Phuc, Vietnam C.T. Le Le18 XXX XXX XXX Allospondias laxiflora Lace Vietnam C.T. Le Le17 – – XXX Buchanania glabra Wall. ex Engl. Vietnam Pell 1062 (NY) – – KP055491 Pell 1054 (NY); Toyama et al. 554 Buchanania siamensis Miq. Vietnam (KYUM) AB925072 AB925701 KP055493 Pell 1057 (NY); Toyama et al. 167 Buchanania reticulata Hance Vietnam; Cambodia (KYUM) AB924829 AB925441 KP055492 12
  21. Địa điểm thu mẫu: một số tỉnh của Việt Nam như Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hịa Bình, Tp. Hồ Chí Minh. Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Thực vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học sư phạm Hà Nội 2. 2.2.3. Thời gian: 10/2018–05/2019. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Cách tiếp cận Nghiên cứu tiêu bản của các lồi Spondias tại phịng tiêu bản Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tiến hành nghiên cứu thực địa và thu mẫu trong điều kiện cho phép. Tiến hành thí nghiệm tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.2.1. Phương pháp thu thập tài liệu và nghiên cứu tiêu bản Thu thập, tổng hợp các tài liệu liên quan đến chi Spondias và các chi cĩ quan hệ gần gũi với Spondias. Nghiên cứu tiêu bản của các lồi Spondias: kiểm tra đặc điểm hình thái, thu thập các thơng tin cần thiết trên tiêu bản (tên khoa học, tên địa phương, địa điểm thu mẫu, người thu và các ghi chú trên tiêu bản). 2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu thực địa và thu mẫu Tiến hành thực địa từ một đến hai lần tại những địa điểm được ghi nhận cĩ sự phân bố của chi Spondias, nhằm thu mẫu tiêu bản (một hoặc hai tiêu bản với mỗi mẫu thu được) và mẫu để tách chiết DNA. 13
  22. Mẫu tiêu bản sau khi được xử lý cắt tỉa sẽ được ép phẳng và sấy khơ để bảo quản cho nghiên cứu lâu dài. Trong khi đĩ, đối với mẫu DNA, các mẫu lá sẽ được lấy và chứa trong các túi kẹp cĩ chứa hạt hút ẩm để làm khơ mẫu và tránh phá hủy cấu trúc DNA, các mẫu DNA này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm phân tử. 2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái Nghiên cứu sử dụng phương pháp hình thái so sánh dựa trên các đặc điểm cấu tạo bên ngồi của các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của thực vật, trong đĩ đặc biệt là cơ quan sinh sản [5]. Nhiều tiêu bản chi Cĩc được nghiên cứu (nghiên cứu online thơng qua các hình ảnh của tiêu bản được cơng bố) ở nhiều phịng tiêu bản và bảo tàng trên thế giới như: HN, HNU, PE, HAL, TCD, L, C, A và KUN. Các kí hiệu tên của phịng tiêu bản theo the Index Herbariorum ( Ngồi ra, chúng tơi cũng nghiên cứu tiêu bản ở phịng tiêu bản bộ mơn Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 (*) và phịng tiêu bản của Viện Dược liệu ( ). Khĩa định loại được xây dựng theo kiểu khĩa lưỡng phân. 2.3.2.4. Phương pháp tách chiết DNA, PCR, giải trình tự gen Các mẫu DNA được đánh kí hiệu tương đồng với mẫu tiêu bản và tiến hành tách DNA theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) [12]. Các dụng cụ, máy mĩc, và hĩa chất cần thiết cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di được trình bày trong Bảng 2.2 và 2.3. Chuẩn bị dụng cụ, hĩa chất Để tiến hành các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR và điện di cần chuẩn bị: Các loại đầu tip, bi sắt nghiền mẫu, ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) cần được hấp vơ trùng và để khơ. 14
  23. Bảng 2.2. Dụng cụ, máy mĩc sử dụng trong nghiên cứu Số TT Tên dụng cụ máy mĩc Đơn vị quản lý 1. Ống eppendorf Nhĩm nghiên cứu 2. Đầu típ các loại Nhĩm nghiên cứu 3. Bi nghiền mẫu Nhĩm nghiên cứu 4. Kẹp, giấy lau, giấy parafilm, gang Nhĩm nghiên cứu tay, khẩu trang 5. Đèn cồn PTN Thực vật 6. Máy sấy mẫu PTN Thực vật 7. Tủ lạnh PTN Thực vật 8. Tủ lạnh âm sâu PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD 9. Bộ micropipet đơn kênh PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD 10. Máy nghiền mẫu Tissuelyser II Viện NCKH & ƯD 11. Cân phân tích Viện NCKH & ƯD 12. Máy li tâm Viện NCKH & ƯD 13. Nồi hấp (bể ổn nhiệt) Viện NCKH & ƯD 14. Máy PCR Viện NCKH & ƯD 15. Bộ điện di Viện NCKH & ƯD 16. Hệ thống chụp ảnh gel điện di Viện NCKH & ƯD 17. Lị vi sĩng Viện NCKH & ƯD Các ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) được dùng trong thí nghiệm cần được đánh số mã hĩa và ghi thơng tin đầy đủ như: thời gian, tên mẫu 15
  24. Các mồi cần được pha lỗng bằng ddH2O (nước cất 2 lần và khử ion) trước khi sử dụng. Phƣơng pháp tách chiết DNA Bước 1. Lấy mẫu. Dùng gang tay, kẹp để lấy 2 gram mẫu khơ vào ống eppendorf 2.0 đã được hấp vơ trùng, đánh số mã hĩa và chuẩn bị bi sắt. Bước 2. Nghiền mẫu. Sử dụng máy Tissuelyser II, thời gian nghiền là 80 giây chia 4 lần. Bước 3. Cho 800µl đệm CTAB (CTAB buffer) vào mỗi ống, lắc ống từ 5- 10 phút để mẫu trộn đều trong hĩa chất. Bước 4. Đem mẫu hấp ở nhiệt độ 65oC trong vịng 1 giờ 30 phút trong bể ổn nhiệt. Bước 5. Cho 700µl CI (24:1) vào từng mẫu ống, lắc đều 10 phút. Bước 6. Ly tâm mẫu ở tốc độ 13000 vịng/15 phút, sử dụng máy ly tâm Mikro 200R. Bước 7. Hút và chuyển lớp dung dịch ở phía trên cùng thu được sau ly tâm sang ống eppendorf 1,5 mới đã chuẩn bị sẵn (đã được đánh số mã hĩa). Bước 8. Cho 800µl isopropanol vào ống eppendorf 1,5 mới chuyển dung dịch sang, lắc đều trong vịng 5-10 phút, sẽ thu được kết tủa DNA. Bước 9. Đem ủ các ống mẫu sau lắc ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút. Bước 10. Lấy mẫu sau ủ và tiến hành ly tâm 13000 vịng/15 phút, lọc dịch, thu kết tủa DNA. Bước 11. Rửa kết tủa DNA bằng cồn 70%, tiến hành 2-3 lần. Sau đĩ để khơ 30 phút trong tủ hút. Bước 12. Thêm 100µl dịch đệm TE (TE buffer) vào mỗi ống mẫu chứa DNA lắc đều và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-20 đến -50 oC). 16
  25. Bảng 2.3. Hĩa chất cần thiết đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di Số TT Tên hĩa chất Thí nghiệm sử dụng 1. CTAB buffer Tách chiết DNA 2. CI (chloroform–isoamyl alcohol, 24:1) Tách chiết DNA 3. Isopropanol Tách chiết DNA 4. Cồn 70o Tách chiết DNA 5. TE buffer Tách chiết DNA 6. MasterMix PCR 7. ddH2O PCR 8. Primers (mồi các loại, gồm xuơi và ngược) PCR 9. Marker (HighRanger 1Kb DNA ladder) Điện di 10. Agarose G10 Điện di 11. TAE 50X Điện di 12. Thuốc nhuộm DNA Điện di Phƣơng pháp tiến hành phản ứng PCR: Tiến hành chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) sau khi tách các mẫu DNA. Phản ứng PCR sử dụng 2×Taq PCR MasterMix (Biomed, China) bao gồm 0,05 u/μL of Taq DNA Polymerase, 4 mM MgCl2, 0,4 mM of dNTPs và buffer của phản ứng. Hỗn hợp phản ứng PCR chứa 25 µl cho mỗi phản ứng (mỗi ống mẫu) bao gồm: 12,5 µl MasterMix. 17
  26. 2 µl mỗi mồi (bao gồm mồi xuơi và mồi ngược) (Bảng 4). 2 µl DNA. 6,5 µl ddH2O. Chương trình chạy cho phản ứng PCR bao gồm: 5’ ở 95°C, 37 chu kỳ với 30’’ ở 95°C, 50’’ ở 52°C, và 1’ 30’’ ở 72°C, và giai đoạn cuối cùng 10’ ở 72°C. Bảng 2.4. Thơng tin các mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Gen Tên mồi Trình tự 5’–3’ Tài liệu tham khảo matK 78F CAGGAGTATATTTATGCACT Vidal–Russell và Nickrent (2008a) 1420R TCGAAGTATATACTTTATTCG 163F AGGTTACTAATTGTGAAACG Vidal–Russell và Nickrent (2008b) 1564R ATGATTRACTAGATCGTTGA AF CTATATCCACTTATCTTTCAGGGT Ooi và CS (1995) 8R AAAGTTCTAGCACAAGAAAGTCGA rbcL 1F ATGTCACCACAAACAGARAC Vidal–Russell và Nickrent (2008a) 889R CTATCAATAACTGCATGCAT trnL–F C CGAAATCGGTAGACGCTACG Taberlet và CS (1991) F ATTTGAACTGGTGACACGAG Phƣơng pháp tiến hành điện di và giải trình tự Các sản phẩm PCR được kiểm tra và tinh sạch bằng 1,0% agarose gels và sau đĩ sẽ được tiến hành giải trình tự sử dụng chính các đoạn mồi đã dùng để khuếch đại. 2.3.2.5. Phương pháp tập hợp, kiểm tra các trình tự gen và dựng cây phát sinh. 18
  27. Các trình tự thu được được kiểm tra và kết hợp với nhau (kết hợp mạch xuơi và mạch ngược) sử dụng phần mềm Geneious v.8.0.5 [15]. Sau đĩ các trình tự được tiến hành chạy BLAST trên ngân hàng Gen (NCBI, để kiểm tra tính chính xác của trình tự. Tất cả các trình tự chính xác được sắp xếp bằng cách sử dụng MUSCLE v.3.8.31 trong Geneious v.8.0.5. Dữ liệu cuối cùng thu được được sử dụng để tạo cây phát sinh. Nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp dựng cây phát sinh là Maximum Likelihood (ML) và Bayesian Inference (BI), sau đĩ được tiến hành chạy trên CIPRES Science Gateway Portal [17]. Đối với cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp ML được chạy trên phần mềm RAxML v.8.2.8 [25, 26] với mơ hình tốt nhất cho khối dữ liệu GTR + I + G được xác định từ phần mềm jModelTest v.2.1.6 [11]. Chỉ số ủng hộ của cây ML được chạy lặp lại 1000 lần. Cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp BI được chạy trên phần mềm MrBayes v.3.1.2 [22] với cùng mơ hình tốt nhất sử dụng cho cây ML. Thơng số Markov chain Monte Carlo (MCMC) trong phương pháp BI được cài đặt chạy 10,000,000 thế hệ và mỗi cây phát sinh lồi được tập hợp từ 1000 thế hệ. Phần mềm Tracer v.1.6 [13], được sử dụng để kiểm tra chất lượng của cây phát sinh cuối cùng. 25% thế hệ cây ban đầu được loại bỏ, cây phát sinh lồi cuối cùng và chỉ số ủng hộ Posterior Probabilities (PP) được thu từ các cây cịn lại. 19
  28. CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa Trong quá trình nghiên cứu thực địa tại một số địa điểm nghiên cứu như đã lên kế hoạch và được trình bày ở Chương 2, chúng tơi thu được một số lồi của hai chi Spondias và Allspondias (Hình S1, S2 ở phần phụ lục) và lựa chọn những lồi mà dữ liệu phân tử chưa được cơng bố để tiến hành các thí nghiệm và thu dữ liệu phân tử. Qua điều tra thực địa, nhĩm nghiên cứu của chúng tơi nhận thấy rằng đa số các thơng tin trong các tài liệu nghiên cứu thực vật của Việt Nam trước đây về chi Cĩc vẫn cịn tương đối chính xác, tuy nhiên cũng cĩ một số thơng tin đã khơng cịn chính xác cĩ thể do các địa danh đã bị thay đổi hoặc do mơi trường sinh thái đã thay đổi. Vì vậy cần cĩ sự chỉnh sửa và bổ sung các thơng tin chính xác cho các lồi của chi Cĩc ở Việt Nam. 3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử Chúng tơi đã tách chiết DNA tổng số và thực hiện thành cơng phản ứng PCR cho 4 mẫu nghiên cứu, mỗi mẫu với 3 gen theo phương pháp đã trình bày ở Chương 2. DNA tổng số khơng cĩ màu và hịa tan hồn tồn trong dung dịch TE. Sản phẩm PCR cĩ hàm lượng cao và cho 1 băng sắc nét (Hình 3.1). Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cĩc 20
  29. Trình tự DNA của gen rbcL, matK, và trnLF của 4 mẫu nghiên cứu đã được giải trình tự thành cơng với kích thước thu được lần lượt là 850, 1000, 400 bp. Sơ đồ điện di giải trình tự cho các đỉnh huỳnh quang rõ ràng. Chúng tơi giải trình tự hai chiều (hai mạch xuơi và ngược) để thu được đầy đủ thơng tin và độ dài của các đoạn mạch sản phẩm. Trình tự các gen được BLAST trên ngân hàng Genbank ( và kết quả BLAST thể hiện trình tự từng gen của 4 mẫu cĩ mức độ tương đồng rất cao (99%) so với các dữ liệu hay các trình tự đã cĩ của mỗi gen trên ngân hàng gen. Thơng tin từ kết quả tìm kiếm BLAST cho thấy, các đoạn trình tự gen mà chúng tơi giải được là chính xác. Chúng tơi giải thành cơng 10 trình tự mới và tiến hành giĩng hàng, sắp xếp alignment cho từng khối dữ liệu đơn rbcL, matK, và trnLF. Chúng tơi thu được ma trận dữ liệu của 3 gen rbcL, matK, và trnLF lần lượt là 890, 1200, 1000 pb. Khối dữ liệu kết hợp cả 3 gen cĩ kích thước là 3090 bp (Hình 3.2). Trong đĩ khối dữ liệu trnLF và matK là khĩ tiến hành giĩng hàng, sắp xếp nhất do cĩ nhiều đoạn gen tiến hĩa nhanh và nhiều khoảng nối giữa các đoạn gen. Hình 3.2. Kết quả alignment. (A)–Kết hợp (B)–gen matK (C)–gen trnLF 21
  30. 3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi Phân tích mối quan hệ phát sinh lồi bằng dữ liệu phân tử từ các khối dữ liệu đơn như rbcL, matK và trnLF là khơng rõ ràng và mức ủng hộ thấp hơn so với kết quả từ khơi dữ liệu kết hợp (xem Hình 3.4, 3.5). Do đĩ chúng tơi sử dụng cây phát sinh lồi từ khối dữ liệu kết hợp để trình bày mối quan hệ phát sinh lồi của chi Cĩc (Spondias) và được thể hiện ở Hình 3.3. Hình 3.3. Cây phát sinh lồi của chi Cĩc (Spondias) theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI đƣợc trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%. 22
  31. Kết quả phân tích phân tử thể hiện rằng Allospondias (chi Dâu gia xoan) cĩ quan hệ rất gần gũi với Spondias về mặt di truyền (Hình 3.3). Allospondias được ghi nhận gồm cĩ 02 lồi trên thế giới là Allospondias laxiflora và A. lakonensis. Tuy nhiên, theo Thực vật chí Trung Quốc, Min và Barfod (2008) ghi nhận Allospondias như tên đồng nghĩa của Spondias với lồi Spondias lakonensis [18]. Kết quả từ dữ liệu phân tử ủng hộ mạnh mẽ Allospondias là một chi riêng biệt so với Spondias (Hình 3.3). Hình 3.4. Cây phát sinh lồi của chi Hình 3.5. Cây phát sinh lồi của chi Cĩc Spondias theo phân tích Cĩc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen Maximum Likelihood từ dữ liệu matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP phân tích BI đƣợc trình bày trên các của phân tích BI đƣợc trình bày nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số thấp hơn 50%. ủng hộ thấp hơn 50%. Pell và cộng sự (2011) cũng đã cơng nhận Allospondias như một thành viên của họ Xồi Anacardiaceae [21]. Hơn nữa, Allospondias cĩ thể dễ dàng phân biệt với Spondias theo các đặc điểm hình thái như: 11–23 cặp lá chét, thường cĩ lớp lơng trên mặt lá và khơng cĩ gân lá ngoại vi (so với 4–11 cặp lá chét, cả hai mặt của lá nhẵn, khơng cĩ lơng, cĩ gân lá ngoại vi ở Spondias) xem Hình 3.6, 3.7, 3.8); lá đài cĩ nhiều lơng tơ (so với, lá đài nhẵn ở Spondias); quả 23
  32. hạch hình trứng đến trịn đều (so với, quả hạch hình elip ở Spondias). Vì vậy từ các bằng chứng trên, một cập nhật và sắp xếp mới cho Allospondias với Allospondias lakonensis trong thực vật chi Trung Quốc là cần thiết. Hình 3.6. Hình thái lá, số lƣợng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B) 24
  33. Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis Hình 3.8. Lơng ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis 25
  34. Trong ―Danh lục các lồi Thực vật Việt Nam‖, Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2003) đã ghi nhận 03 lồi của chi Cĩc Spondias ở Việt Nam bao gồm S. Petteloti - lồi đặc hữu ở Đồng Mơ, tỉnh Lạng Sơn [1]. Tuy nhiên, qua điều tra thực địa tại thị trấn Đồng Mơ, cũng như kết quả phân tích dữ liệu phân tử của mẫu Spondias petteloti được thu tại Đồng Mơ, Lạng Sơn (kí hiệu Le04) cho thấy rằng, Spondias petteloti cĩ quan hệ gần gũi về mặt di truyền và nằm cùng nhánh với Allospondias và kết quả này được ủng hộ mạnh mẽ bởi dữ liệu phân tử. Phân tích hình thái của chúng tơi cũng thể hiện rằng đặc điểm hình thái của Spondias petteloti là rất tương đồng với Allospondias lakonensis như: gồm 11–23 cặp lá chét, khơng cĩ gân ở mép lá, hoa được bao bởi bẹ hoa cĩ kích thước 0.5–1 mm, bầu 4 hoặc 5, ống nhụy 1, quả cĩ kích thước 8–10×6–7 mm (Hình 3.6, 3.9). Do đĩ, từ những bằng chứng trên, một ghi nhận và sắp xếp cho Spondias petteloti như tên đồng nghĩa của Allospondias lakonensis là rất cần thiết, nghiên cứu này đề xuất rằng Spondias petteloti là một tên đồng nghĩa của Allospondias lakonensis dựa trên cả dữ liệu hình thái và phân tử. Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B) 26
  35. Ngồi ra, Pell và cộng sự (2011) đã gợi ý rằng Allospondias laxiflora cĩ thể được ghi nhận như một chi độc lập riêng rẽ dựa trên sự khác biệt như: đầu nhụy chia thành nhánh riêng biệt, hình dạng của đầu nhụy (hình trịn), quả khơng cĩ ngăn và khơng cĩ thịt quả ở các khoang hạt [21]. Tuy nhiên, chúng tơi đề xuất các nghiên cứu sử dụng dữ liệu phân tử của Allospondias laxiflora trong tương lại cần được tiến hành để khẳng định ý kiến của Pell và cộng sự (2011). Spondias được ủng hộ là nhĩm đơn phát sinh (monophyletic group), hai nhánh chính được ghi nhận trong Spondias. Nhánh đầu tiên bao gồm các thành viên Cĩc Nam Mỹ được ủng hộ (Hình 3.3). Nhánh thứ hai gồm cĩ S. radlkoferi, S. mombin từ Nam Mỹ cộng với các thành viên Cĩc châu Á. Các lồi Cĩc cĩ ở Việt Nam như S. pinnata và S. dulcis khơng nằm liền nhau trên cây phát sinh lồi, nhưng chúng được đặt nằm trong nhánh Cĩc châu Á. Ngồi ra, hiện nay một số tài liệu thực vật của Việt Nam vẫn đang sử dụng tên S. cytherea Sonn. cơng bố năm 1782 như là tên chính thức hay tên hợp pháp, tuy nhiên điều này là khơng chính xác. Nghiên cứu này mạnh mẽ đề nghị rằng S. dulcis Parkinson cơng bố năm 1773 là tên hợp pháp cho lồi Cĩc mà đang được nhắc đến, và ngược lại, S. cytherea Sonn. là một tên đồng nghĩa của S. dulcis Parkinson. Phạm HH (2003) đã ghi nhận chi Cĩc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm S. mombin [2]. Tuy nhiên, ơng cũng chú ý rằng, ơng chưa từng quan sát thấy S. mombin tại Việt Nam. Michell và Daly (2015) đã gợi ý rằng S. mombin là một lồi tự nhiên và cĩ nguồn gốc ở Mexico đến nam và đơng nam Brazil. Mặc dù hiện nay S. mombin được con người trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới nhưng dựa trên các phân tích phân tử của chúng tơi, S. mombin là một thành viên của Cĩc Nam Mỹ và khơng thuộc vào nhánh Cĩc châu Á. Do đĩ, sự ghi nhận S. mombin tự nhiên ở Việt Nam là khơng hợp lý và khơng chính xác. Nghiên cứu này ghi nhận hai lồi S. dulcis và S. pinnata cho chi Cĩc Việt Nam. 27
  36. 3.4. Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho Spondias L. ở Việt Nam Spondias Linnaeus, Sp. Pl. 1: 371. 1753. Mẫu chuẩn.— Spondias mombin L. Mơ tả.— Cây nhỏ hoặc to, rụng lá hồn tồn hoặc một phần. Lá mọc xen kẽ, sắp xếp theo kiểu xoắn ốc, cĩ cuống, khơng cân đối; mép lá cĩ răng cưa một phần hoặc tồn bộ. Cụm hoa hình chùy, ở đầu cành hoặc nách lá. Hoa mẫu 4 hoặc 5, lưỡng tính hay đơn tính về mặt chức năng. Nhị hoa 8–10; chỉ nhị nhỏ, cĩ độ dài bằng nhau. Bầu cĩ 4 hoặc 5 ơ, với 1 nỗn trên mỗi ơ; ống nhụy 4 hoặc 5, tự do, hoặc ống nhụy 1. Quả cĩ hột cứng; thịt quả ngọt; hạt hĩa gỗ, được bao phủ bởi một hệ thống xơ; phơi kéo dài, dạng thẳng đến hơi cong. Phân bố.— Trong tổng số 18 lồi Spondias trên thế giới, 10 lồi tự nhiên ở Nam Mỹ, được phân bố từ Mexico đến phía nam Brazil; một lồi tự nhiên ở Madagascar; và 7 lồi là tự nhiên ở châu Á và nam Thái Bình Dương. Khĩa định loại cho Spondias ở Việt Nam Cuống hoa rõ ràng; vỏ hạt chứa nhiều sợi xơ thẳng hoặc cong tỏa ra ngẫu nhiên, các sợi xơ khơng được sắp xếp theo chiều dọc, khơng cĩ lớp màng ngoại vi; nhu mơ (thịt quả) phát triển; được trồng; khơng được biết đến ở trạng thái hoang rã Spondias dulcis Gần như khơng cĩ cuống hoa; vỏ hạt khơng cĩ các sợi xơ tỏa ra ngẫu nhiên, các sợi xơ được sắp theo chiều dọc, và hình thành lớp màng ngoại vi nhẵn; nhu mơ (thịt quả) khơng phát triển; hoang rã Spondias pinnata Spondias dulcis Parkinson, J. voy. South Seas 39. 1773. Poupartia dulcis (Parkinson) Blume, Bijdr. fl. Ned. Ind. 1161. 1826–27. Evia dulcis (Parkinson) Blume, Mus. Bot. 1(15): 233. 1850. Type:— based on Spondias dulcis Parkinson. Spondias cytherea Sonn., Voy. Indes orient. 3: 242, t. 123. 1782. 28
  37. Type:— Mauritius (cultivated), Commerson s.n. (P!). Spondias dulcis Parkinson var. commersonii Engl. in A. DC & C. DC., Monogr. phan. 4: 247. 1883. Type:— Several syntypes cited. Spondias dulcis Parkinson var. mucroserrata Engl. in A. DC. & C. DC., Monogr. phan. 4: 247. 1883. Type:— Mexico, w/o date, Pavĩn 744 (G n.v.; GH–photo!, NY–photo!). Spondias dulcis Parkinson var. integra Engl. in A. DC. & C. DC., Monogr. phan. 4: 248. 1883. Type:— Indonesia. Amboin, w/o date, Reinwardt s.n. (W!). Mẫu chuẩn:— TAHITI. (without date), Capt. Cook [Banks & Solander] s.n. (lectotype, BM–793299 n.v., designated by A. C. Smith 1985: 453). Mơ tả:— Cây gỗ, lưỡng tính, cao từ 10–25 m. Đường kính thân cây 20–40 cm; vỏ ngồi cĩ màu xám nhạt hoặc nâu nhạt, nhẵn đến nhám, lá bắc muộn, dạng đĩa mỏng, thân cây hồn tồn nhẵn trừ một số tuyến cĩ lơng. Lá thường rụng hoặc rụng một phần, 4–11 cặp lá chét, dài 11–60 cm, cuống lá dài 9–15 cm, cuống lá chét dài 2–8 mm, đỉnh dài 10–30 mm, kích thước cơ bản của một lá 4.3–7.5 × 1.3–3.5 cm, đơi khi cĩ thể lớn tới 5–15 × 1.7–5 cm, tất cả lá chét thuơn dài hoặc cĩ hình mũi mác đến hình ovan, lá chét đầu cĩ kích thước 5–9 × 1.9–3.5 cm, cĩ dạng elip với nhọn cơ bản, lá chét ở đỉnh thuơn nhọn đơi khi nhọn sắc, mũi nhọn dài 4–13 mm, lá chét bán đối xứng với nhau, mép lá cĩ viền vịng quanh và thường cĩ răng cưa lồi lõm. Cụm hoa thường phát triển với lá mới, ở đầu cành hoặc nách lá, tập trung nhiều ở các đầu cành, dài 9–32.5 cm, đường kính 3–7 mm, trục thứ cấp dài tới 11.5 cm, lá bắc dài 0.4–5 mm, lá bắc con 0.3–0.9 mm, hình trứng, cuống dài 1–3 mm, đơi khi các lá bắc và cuống nhỏ cĩ lơng. Đài hoa dài 0.7–1.2 mm, sẻ đến gần đáy, thùy dài 0.5–1 mm, cánh hoa cĩ kích thước 2–3 29
  38. × 0.5–1.1 (1.3) mm, thuơn dài đến ovan, đỉnh nhọn đến hơi nhọn, màu kem hoặc trắng hoặc xanh trắng, bĩng, nhị hoa lan rộng, bao phấn dài 0.7–0.8 mm, mặt trước và sau hình elip đến ovan, mặt bên thuơn dài, đĩa hoa cao 0.3–0.5(0.7) mm, dày 0.2–0.4 mm, màu vàng, chụy hoa dài 1.3 mm, giẹp–hình trứng đến hình trụ, dài 0.8 mm, nhụy dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuối lá), hơi mở rộng. Quả cĩ kích thước 4–7 × 2–4 cm, hình elip, hơi trịn hoặc thuơn dài, khi chín cĩ màu vàng hoặc cam; xơ được tỏa ra từ vỏ hạt ngẫu nhiên. Phân bố:— Vùng nhiệt đới của Nam Mỹ, châu Á, và châu Úc. Phân bố ở Việt Nam:— Được trồng rộng rãi ở Việt Nam. Thời gian sinh sản:— Ra hoa từ tháng 3–5; quả từ tháng 6–12. Mẫu vật nghiên cứu:— Việt Nam. Phú Thọ: 21/8/2018, C.T Le LCT01 (*); Vĩnh Phúc: 23/8/2018, C.T Le LCT02 (*); Phú Thọ: 26/8/2018, V.H. Nguyen & C.T Le LCT03 (*); Ha Noi: 02/11/1981, K.L. Phan P1831 (HNU); Lạng Sơn: 28/4/ 1938, A. Petelok 6384 (HNU); 28/4/1938, A. Petelok 6384 (A). Peru. 1777, L.H. Ruiz s.n. (HAL); Thailand. Bangkok: 4/1927, Kerr & G. Arthur Francis 12795A (TCD). Spondias pinnata (Linnaeus f.) Kurz, Prelim. Rep. Forest Pegu, App. A, 44; App. B, 42. 1875. Type:— INDIA, (without date), Kưnig, J.G., s.n. Mơ tả:— Cây rụng lá, cao từ 10–15 m, cành màu nâu vàng, nhẵn. Cuống lá dài 10–15 cm, cuống và cuống lá chét nhẵn, lá chét 5–11 cặp đối diện, cuống lá cĩ kích thước 3–5 mm, phiến lá cĩ hình dạng ovan thuơn dài đến kiểu thuơn hình elip, kích thước 7–12 × 4–5 cm, mỏng, hai mặt nhẵn, đáy hình nêm đến vịng trịn, thường khơng đối xứng, mép lá cĩ răng cưa hoặc khơng, đỉnh nhọn, gân bên cĩ 12–25 cặp, các gân ngoại vi ở mép lá tập hợp lại. Cụm hoa hình chùy, dài 25–35cm, nhẵn. Hoa khơng cĩ cuống hoặc rất ngắn, màu trắng, nhẵn. Đài hoa cĩ thùy hình tam giác, khoảng 0.5 mm, cánh hoa hình ovan đến thuơn dài, kích 30
  39. thước 2.5 × 1.5 mm, đỉnh nhọn. Nhị hoa dài 1.5 mm. Bầu nhụy hình cầu 1 mm; ống nhụy 4 hoặc 5, tự do, 0.5 mm. Quả hạch hình elip đến hình trứng, khi chín cĩ màu cam vàng, 3.5–5 × 2.5–3.5 cm, phần bên trong hĩa gỗ và cĩ rãnh, các sợi xơ được sắp xếp theo chiều dọc và hình thành một lớp màng mịn ở phía ngồi; quả chín thường cĩ 2 hoặc 3 hạt. Phân bố:— Trung Quốc, Bhutan, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Singapore, Thái Lan, và Việt Nam. Phân bố ở Việt Nam:— Lai Châu, Sơn La, Hịa Bình, Nghệ An, Quảng Nam, Gia Lai, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Đồng Nai. Thời gian sinh sản:— Ra hoa tháng 4–6; ra quả tháng 7–9. Mẫu vật nghiên cứu:— Việt Nam. Lai Châu: 13/10/2018, C.T. Le et al. LCT010 (*); 27/9/ 2000, D.K. Harder et al. DKH 5685 (HN); Tuyên Quang: 1/11/2003, N.Q. Binh & D.D. Cuong VN 1203 (HN); Gia Lai: 4/11/2002, T. Tuan 153 ( ); Trung Quốc. Vân Nam: 18/11/2000, Y.M. Shiu & W.H. Chun 13125 (KUN); 10/1936, C.W. Wang 79418 (KUN); 8/1936, C.W. Wang 77690 (KUN); 8/1936, C.W. Wang 77620 (PE); Hải Nam: 20/8/ 1929, F.A. McClure 704 (PE); 26/6/ 1936, S.K. Lau 27277 (KUN); 16/6/ 1932, S.K. Lau 98 (PE); Ấn Độ: J.G. Kưnig s.n. (C); INDONESIA. Java: C.L. Blume s.n. (L). 31
  40. CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Nghiên cứu được tiến hành dựa trên cả dữ liệu hình thái và phân tử, trong nghiên cứu này của chúng tơi đã giải thành cơng các trình tự gen cĩ tính tương đồng cao so với các mạch gen trên Genbank. Qua nghiên cứu này, chúng tơi nhận thấy hai đoạn gen matK và trnLF cĩ tính bảo thủ khơng cao và khĩ giĩng hàng, sắp xếp (alignment) hơn so với rbcL. Nhưng cũng chính vì thế mà hai gen này cung cấp nhiều thơng tin cho xây dựng cây phát sinh và giúp xác định được mối quan hệ của các lồi trong nghiên cứu. Kết quả phân tích của nghiên cứu khẳng định rằng, chi Dâu gia xoan (Allospondias) cĩ mối quan hệ gần gũi với chi Cĩc (Spondias) về mặt di truyền. Một đề xuất ghi nhận chi Dâu gia xoan cho hệ thực vật Trung Quốc. Dựa trên các bằng chứng từ dữ liệu sinh thái và dữ liệu phân tử, chúng tơi khẳng định chi Cĩc ở Việt Nam cĩ 2 lồi là Spondias dulcis và Spondias pinnata, hai lồi Cĩc ở Việt Nam tuy khơng cĩ quan hệ di truyền quá gần gũi nhưng chúng đề nằm trên nhánh phát sinh của Cĩc châu Á. Một lưu ý cho việc sử dụng tên hợp pháp cho lồi Spondias dulcis. Nghiên cứu này khẳng đinh Spondias petteloti là một tên đồng nghĩa của Allospondias lakonensis dựa trên bằng chứng hình thái và phân tử. 4.2. Kiến nghị Với kết quả cĩ độ tin cậy cao khi kết hợp phân tích dữ liệu phân tử và hình thái, cho thấy được nhiều tiềm năng của hướng nghiên cứu này. Hơn nữa, nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích dữ liệu hiện đại được cơng nhận (được cơng bố trên các tạp chí ISI uy tín của thế giới) và đang sử dụng trong các nghiên cứu cùng hướng trên thế giới. Chúng tơi đề nghị thực hiện nhiều nghiên cứu cùng hướng trên các đối tượng thuộc tơng Cĩc, họ Xồi và nhiều họ thực vật của Việt Nam. 32
  41. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Nguyễn Tiến Bân (2003) Danh lục các lồi thực vật Việt Nam. Tập 2, 132. Nxb Nơng Nghiệp. 2. Phạm Hồng Hộ (2003) Cây cỏ Việt Nam. Tập II, 372–373. Nxb Trẻ. 3. Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) ―Chiết xuất pectin từ vỏ cĩc (Spondias cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sĩng‖, Tạp chí Hĩa học, 51. 4. Nguyễn Xuân Quyền (2015) Giá trị sử dụng của các lồi trong họ xồi (Anacardiaceae r. Br.) Ở Việt Nam. Hội nghị khoa học tồn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6. 5. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật, tr. 5–7, Nxb. Đại học quốc gia Hà Nội. Tài liệu nước ngồi 6. Airy–Shaw HK, Forman LL (1967) ―The genus Spondias L. (Anacardiaceae) in tropical Asia‖, Kew Bulletin, 21, 1–19. 7. Al–Saghir MG (2017) ―Karyotyping of Spondias L. (Anacardiaceae) using fluorescent microscope‖, Advances in plants and Agriculture research, 7, 00280. 8. APG III (2009) An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Botanical Journal of the Linnean Society 161: 105–121. 9. Bentham G, Hooker JD (1862) Anacardiaceae. In: Genera Plantarum. Reeve & Co., London 1, 415–428. 10. Chayamarit K (1997) ―Molecular phylogeny analysis of Anacardiaceae in Thailand‖, Thai Forest Bulletin (BOT), 25, 1–13. 11. Darriba D. và cộng sự (2012) JModelTest 2: More models, new heuristics and parallel computing. Nature Methods, 9: 772. 33
  42. 12. Doyle JJ, Doyle JL (1987) ―A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue‖, Phytochem. Bull, 19, 11–15. 13. Drummond AJ, Rambaut A. ( 2007) BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evolution Biology, 7: 214. 14. Jing YU và cộng sự (2011) ―New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms‖, Journal of Systematics and Evolution, 49 (3), 176–181. 15. Kearse M. và cộng sự (2012). Geneious basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data, Bioinformatics 28, 1647–1649. 16. Marchand NL (1869) Révision du Groupe des Anacardiacées. Baillière JB et Fils, Paris. 17. Miller MA, Pfeiffer W, Schwartz T (2010) ―Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees, in: Proceedings of the gateway computing environments workshop (GCE)‖, Institute of Electrical and Electronics Engineers (IEEE), New Orleans, USA, pp. 1–8. 18. Min T, Barfod A (2008) Anacardiaceae In: Wu A, Raven PH, Hong D (Eds) Flora of China. Science Press, Beijing and Missouri Botanical Garden Press, St Louis, 11, 335–357. 19. Mitchell JD, Daly DC (2015) ―A revision of Spondias L. (Anacardiaceae) in the Neotropics‖, Phytokeys, 55, 1–92. 20. Pell (2004) ―Molecular systematics of the cashew family (Anacardiaceae)‖ LSU Digital Commons, 4–9. 21. Pell S. K. và cộng sự (2011), Anacardiaceae, in: Kubitzki K. (Ed.), The families and genera of vascular plants, Flowering plants: Eudicots; Sapindales, Cucurbitales, Myrtaceae, vol. 10. Springer, Hamburg, Germany 7–51. 22. Ronquist F, Huelsenbeck JP. (2003) MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 19: 1572–1574. 34
  43. 23. Seung–Chul Kim và cộng sự (2007) ―Phylogenetic analysis of chloroplast DNA matK gene and ITS of nrDNA sequences reveals polyphyly of the genus Sonchus and new relationships among the subtribe Sonchinae‖, Molecular Phylogenetics and Evolution, 44, 578–597. 24. Silva JN, Costa AB, Silva JV (2015) ―DNA barcoding and phylogeny in Neotropical species of the genus Spondias‖, Biochemical Systematics and Ecology, 61, 240–243. 25. Stamatakis và cộng sự (2008) A rapid bootstrap algorithm for the RaxML web servers. Systematic Biologists, 575: 758–771. 26. Stamatakis (2006) RAxML–VI–HPC, Maximum Likelihood–based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics, 2221: 2688–2690. 27. Weeks A và cộng sự (2014) ―To move or to evolve: Contrasting patterns of intercontinental connectivity and climatic niche evolution in ―Terebinthaceae‖ (Anacardiaceae and Burseraceae)‖, Frontiers in Genetics, 409, 1–20. Tài liệu trực tuyến 28. ĩc_(cây). 29. rbcL, trnLF. 35
  44. Hình S1. Hình thái phát hoa, quả của (A) Spondias dulcis và (B) Spondias pinata. 36
  45. Hình S2. Một số tiêu bản đƣợc sử dụng trong nghiên cứu (A) Buchanania Blume, (B) Spondias pinata. 37