›

Khóa luận Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic

pdf 70 trang thiennha21 15/04/2022 3360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_tong_hop_mot_so_dan_xuat_cua_axit_gambogic.pdf

Nội dung text: Khóa luận Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC ĐỖ THỊ HỘI TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THU THỦY HÀ NỘI, 2017
  2. LỜI CẢM ƠN Khóa luận với đề tài: “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic” đƣợc thực hiện tại phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Em xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em đƣợc học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong khóa luận của mình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Thu Thủy, cùng các anh - chị phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tập tại trƣờng. Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù đã hết sức cố gắng nhƣng chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận đƣợc sự đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Đỗ Thị Hội
  3. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3 1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia 3 1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi 4 1.1.3. Axit gambogic (GA). 8 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 1.2.1. ớp m ng 12 1 2 2 ột 14 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 15 1 3 1 Phổ hối ượng M 15 1.3.2. Phổ cộng từ hạt nhân ( NMR) 16 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 18 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 18 2.1.1. Nguyên liệu 18 2.1.2. Thiết bị 18 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất 18 2.2. CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 19 2.2.1.Phân lập axit gambogic 19 2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic 20 2.2.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC 25 3 1 1 Định hướng nghiên cứu 25 3.1.2. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất 26
  4. 3.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA AXIT GAMBOGIC VÀ CÁC DẪN XUẤT 34 KẾT LUẬN 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 43
  5. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng 4 Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng 5 Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng dạng bột và dạng thỏi 6 Hình 1.4. Một số hợp chất trong nhựa cây Đằng hoàng 7 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 9 Hình 1.6: Bình giải ly bản mỏng 13 Hình 1.7: Sắc ký cột 14 Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 19 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic 25 Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic. 27 Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) 28 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của axit gambogic 28 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2) 29 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của axit gambogic 29 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (2) 30 Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) 31 Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất (3) 31 Hình 3.10: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (3) 32 Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất (4) 33 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (4) 33 Hình 3.13: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (4) 34
  6. DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hiệu suất phản ứng chuyển hóa của axit gambogic 34 Bảng 3.2: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của axit gambogic và các dẫn xuất. 35 Bảng 3.3: Giá trị IC50 của axit gambogic và các dẫn xuất 35
  7. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13) 1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) COSY : 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ tƣơng tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity (Phổ tƣơng tác đa liên kết hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tƣơng tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) MS : Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) HR-MS : Hight resolution Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phân giải cao) s: singlet q: quartet d: doublet dd: doublet doublet t: triplet dt: doublet triplet m: multiplet δH, δC : Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon ppm : parts per million (phần triệu) CC : Column Chromatography (Sắc ký cột) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Me : Nhóm metyl DCM : Diclomethane EtOAc : Etyl axetat
  8. EtOH : Etylic MeOH : Methanol EDC : 1-Ethyl-3-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide DNAP : Dimetylaminopiridin GA : axit gambogic EGA1 : ethyl gambogate (2) DIALY.GA : N –diallyl-gambogamide (3) 3FGA : 1(4-trifuoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide (4)
  9. MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên đƣợc thừa hƣởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loại dƣợc liệu quý. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài trong đó có khoảng 3.200 loài cây đƣợc sử dụng trong Y học dân tộc [1]. Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hƣớng để con ngƣời có thể chiết, tách, tổng hợp tìm ra các loại thuốc mới chống lại bệnh tật, chất bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm cũng nhƣ các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi có hoạt tính sinh học cao mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng sinh thái. Cùng với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, hóa học các hợp chất thiên nhiên đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu. Tìm kiếm và phát hiện các chất có hoạt tính sinh học trong thảm thực vật Việt Nam, qua đó đƣa ra các giải pháp bảo tồn sự đa dạng sinh học của môi trƣờng xung quanh là một nhiệm vụ luôn đòi hỏi sự cố gắng của tất cả mọi ngƣời trong xã hội đặc biệt là các nhà khoa học. Tuy nhiên, phần lớn các cây cỏ đƣợc sử dụng làm thuốc chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ và có hệ thống về mặt hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học mà chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian.Vì vậy chƣa phát huy hết hiệu quả của nguồn tài nguyên quý giá này. Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ Guttiferae có giá trị sử dụng cao đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Đặc biệt, trong số đó phải kể đến cây Đằng hoàng. Axit gambogic (GA) là thành phần chính mang lại hoạt tính đáng chú ý của nhựa cây Đằng hoàng. Mặc dù đƣợc phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc [2,3] nhƣng mãi đến năm 2004 hoạt tính ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thƣ của axit gambogic 1
  10. mới đƣợc giới khoa học chú ý nhƣ ung thƣ phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày, ung thƣ vú, ung thƣ ruột kết, ung thƣ não, ung thƣ gan Từ đó đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập đƣợc axit gambogic có độ tinh từ 95-99 và có gần 200 bài báo khoa học đƣợc công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các kết quả thử lâm sàng của axit gambogic. Hiện nay, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào về vấn đề này đƣợc công bố. Trong khi đó, nƣớc ta lại là một trong những vùng đặc hữu mà nguồn nguyên liệu này sinh trƣởng tốt. Bởi vậy việc khai thác hoạt tính chống ung thƣ từ nhựa cây Đằng hoàng, nhất là axit gambogic là việc làm cần thiết từ các nhà khoa học để không phí hoài nguồn tài nguyên dƣợc liệu s n có. Các nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic là rất cần thiết và tiềm năng trong việc phát hiện các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn chất đầu và ít độc tính hơn. Việc thực hiện nhiệm vụ góp phần vào việc nâng cao trình độ nghiên cứu của các cán bộ thực hiện trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và hóa hợp chất thiên nhiên Xuất phát từ những cơ sở trên tôi đã chọn đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic”. 2
  11. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia Garcinia là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bứa (hay Măng cụt) với khoảng 400 loài trên thế giới. Tên gọi Garcinia lấy theo tên của nhà thực vật học Laurence Garcinia, ngƣời đã sƣu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18. Họ Bứa ở Việt Nam có tất cả 62 loài, phân bố trên khắp đất nƣớc từ vùng rừng núi phía Bắc đến ven sông rạch của các tỉnh phía Nam 1]. Các loài trong họ Bứa chủ yếu là cây gỗ hoặc cây bụi, đặc trƣng bởi có nhựa mủ vàng, cành thƣờng nằm ngang, hoa thƣờng đơn tính, nhị thƣờng nhiều, rời hay hợp thành bó. Ở Việt Nam, chi này có khoảng 29 loài và là chi lớn nhất trong họ Măng cụt [4]. Các loài trong chi này thuộc loại thân thẳng có chiều cao trung bình 8- 30m. Lá của chúng có màu xanh đậm, có các đƣờng gân r ràng. Hoa màu vàng nhạt hoặc trắng hơi xanh có từ 4-5 cánh, bao phấn không cuống, buồng phấn hẹp. Nhiều loài cây trong chi Garcinia có quả ăn đƣợc nhƣ quả măng cụt, quả dọc Quả thƣờng hình tròn, có từ 4-10 múi, có nhiều nƣớc, hạt có lớp vỏ mỏng bao bọc. Vỏ cây, vỏ quả và gỗ của các cây thuộc chi này thƣờng tiết ra nhựa màu vàng hoặc trắng. Thành phần hóa học của chi Garcinia khá đa dạng, chủ yếu là các xanthon, benzophenon, biflavonoid [5] và triterpenoid [6]. Trong đó, xanthon là nhóm hợp chất đặc trƣng của chi Garcinia. Nhiều loài thuộc chi Garcinia có quả ăn đƣợc và rất ngon nhƣ quả măng cụt (G. mangostana , bứa lửa (G. fusca , bứa mọi (G. harmandii , bứa núi (G. oliveri . Hạt của trái G. indica có chƣa một loại chất b o ăn đƣợc giống nhƣ bơ. Trái của loài G. livingstonei dùng để lên men thức uống. Trƣớc đây khi 3
  12. chƣa có acid citric tổng hợp ngƣời ta xem tai chua (G.pendunculata là nguồn cung cấp acid citrcic đáng quý. Trong công nghiệp, nhựa và vỏ trái nhiều loài đƣợc dùng làm phẩm nhuộm vàng nhƣ vỏ trái sơn v (G. merguensis , nhựa cây đằng hoàng (G. hanburyi . Dầu lọc (G. multiflora đƣợc dùng làm xà phòng, dầu nhờn Từ lâu trong dân gian ngƣời ta đã biết sử dụng nhiều loài thuộc chi Garcinia để làm thuốc chữa các bệnh đơn giản. Vỏ cây bứa lá tròn, dài (G. oblongifolia thƣờng dùng trị lo t dạ dày, lo t tá tràng, viêm dạ dày, ho ra máu, mụn nhọt, nhựa dùng trị bỏng. Vỏ trái bứa mọi (G. harmandii đƣợc dùng ăn với trầu, phối hợp với nhiều vị thuốc khác để trị tiêu chảy. Dầu dọc đƣợc dùng để đắp mụn nhọt khi chƣa vỡ mủ. Ngoài ra, khi phối hợp với các thuốc khác nhƣ Calomel và Lô hội, nhựa của chúng còn đƣợc dùng để trị giun và cả sán sơ mít 1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi 1.1.2.1. Đặ điểm hình thái và phân bố Cây Garcinia hanburyi có tên thông thƣờng là Đằng hoàng, thuộc họ Măng cụt Clusiaceae (Guttiferae) phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á bao gồm Việt Nam, Hải Nam (Trung Quốc), Campuchia, Thái Lan, và mới đây đƣợc trồng thành công ở Singapo [7]. Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng 4
  13. Cây cao, to 10 - 20cm, thân nh n, thẳng đứng. Lá mọc đối, cuống ngắn, hình bầu dục hay hình mác, hai đầu hơi tù, phiến lá dai, nguyên nh n, rộng 3 - 10cm. Quả mọng hơi hình cầu, đƣờng kính 2 - 5cm, phía cuống có đài tồn tại, 4 ngăn, mỗi ngăn có một hạt hơi cong hình cung. Mùa hoa tháng 12 - 1, mùa quả tháng 2 - 3. Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng Tất cả các bộ phận của cây đều có những ống bài tiết nằm trong mô vỏ, trong libe, tủy và cả trong mô gỗ. Thƣờng sau mùa mƣa (ở miền Nam, vào các tháng 1 - 5 ngƣời ta dùng rìu khía thành vòng xoắn ốc trên thân, những khía sâu vài mm từ dƣới đất lên đến cành thứ nhất. Một chất dịch mủ màu vàng chảy ra đƣợc hứng vào các ống tre, sau một thời gian nhựa mủ đặc lại. Hơ nóng đều ống tre cho nƣớc bốc hết đi. Chẻ lấy vị Đằng hoàng. Mỗi cây mỗi năm có thể cho ba thỏi đằng hoàng dài 0,50cm, đƣờng kính 4cm. Loại Đằng hoàng thỏi này đƣợc chuộng nhất trên thị trƣờng tiêu thụ. Nhƣng có khi vị Đằng hoàng còn đang mềm, ngƣời ta nặn thành bánh hay thành miếng to nhỏ không đều. Có nơi ngƣời ta uốn cong cả cành Đằng hoàng cắt đầu cho nhựa mủ chảy ra, hứng vào ống tre hay vại rồi chế thành đằng hoàng thỏi hay miếng. Vị Đằng hoàng thỏi thƣờng là những thỏi dài 15-20 cm, đƣờng kính 3- 6 cm, trên mặt thƣờng có những khía dọc dấu vết của ống tre, trên mặt có bụi màu vàng nhạt. Đằng hoàng dễ vỡ, vết vỡ bóng hay mờ, màu vàng, sẫm hay 5
  14. vàng cam nâu nhạt. Khi miết ngón tay ƣớt lên vị đằng hoàng ta sẽ thấy tay có màu vàng tƣơi. Đằng hoàng tan trong cồn (cho màu đỏ), trong ete (cho màu vàng . Đun nóng mềm ra nhƣng không chảy lỏng và cháy không cho mùi gì đặc biệt. Vị hắc, mùi không rõ. Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng d ng ột và d ng th i 1.1.2.2. hành ph n h h ủ nh ây Garcinia hanburyi Trong nhựa cây Đằng hoàng có 70-80% chất nhựa, 18 đến 24% chất gôm, ngoài ra còn có tinh dầu, một ête phenolic. Thành phần chính của chất nhựa này là axit gambogic (G , axit neogambogic và axit allogambogic [8,9]. Ngoài ra còn có một số xanthone, các triterpene khác và có hoạt tính gây độc tế bào nhƣng ở hàm lƣợng rất nhỏ [10,11]. 6
  15. H nh 1.4. Một số hợp chất t ong nhựa cây Đằng hoàng 7
  16. 1.1.2.3. Công dụng - Là thuốc tẩy rất mạnh: với liều 0,1 đến 0,2g đã cho phân lỏng, với liều 0,25 đến 0,4g phân rất nhiều, đau bụng và có khi nôn, với liều cao nữa thì độc (nôn, viêm dạ dày và ruột) có khi đến chết sau khi đau bụng nặng, phân có máu Đằng hoàng chỉ có tác dụng ở khu vực ruột khi tiếp xúc với chất béo và với mật nhung không có tác dụng thông mật. - Nhựa Đằng hoàng là một vị thuốc cổ truyền đƣợc dùng để điều trị một số bệnh nhƣ cầm máu, tẩy giun sán, viêm hô hấp, viêm phế quản, sổ mũi, nhuận tràng, trị các vết thƣơng nhiễm trùng ngoài da. - Trong công nghiệp dùng trong sơn, vẽ màu, phẩm nhuộm và chế vecni phủ lên kim loại. 1.1.3. Axit gambogic (GA). 1.1.3.1. Giới thiệu về axit gambogic Axit gambogic (GA- còn gọi là -guttiferin, axit guttatic) là thành phần chính mang hoạt tính của nhựa cây Đằng hoàng. - CTPT là C38H44O8 - Khối lƣợng phân tử: 628 (g/mol) - Trạng thái: dạng bột - Màu: vàng nghệ - Độ tan: DMSO 10 mg/mL - Tỉ trọng: 1,29 (g/cm3) - Tan trong các dung môi: Diclometan, methanol, axeton, cồn, n-hexan, etyl axetat 8
  17. Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của G đƣợc thực hiện chủ yếu tại các nƣớc châu Á nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc. Mặc dù đƣợc phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc [12,13] nhƣng mãi đến năm 2004 hoạt tính chống ung thƣ của axit gambogic mới đƣợc chú ý. Từ đó đến nay, đã có gần 200 bài báo khoa học trên thế giới công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các kết quả thử lâm sàng của AG. xit gambogic đã đƣợc chứng minh in vitro và in vivo là có hoạt tính ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thƣ 14,15], ví dụ nhƣ: ung thƣ phổi (IC50 tại 24h, 48h, 72 h : 1,74 ; 1,01; 0,81g/mL thấp hơn 4 lần so với thuốc chống ung thƣ hydroxycamthothecin , ung thƣ bạch cầu (ED50 0,35 g/mL , ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày (MGC-803: IC50 0,96 g/mL , ung thƣ vú (ED50 1,64 g/mL , ung thƣ ruột kết (ED50 0,45 g/mL , ung thƣ não, ung thƣ gan Ngoài ra, axit gambogic còn đƣợc phát hiện có hoạt tính ức chế kênh ion chỉnh lƣu Kir2.1 (EC< 100 nm 16]. Cơ chế chống ung thƣ của G có liên quan đến việc thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis) của tế bào bằng cách hoạt hóa enzyme caspase 3 (EC50 0,78 M), ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptid BH3 (IC50 = 1,47; 1,21; 2,02; 0,66; 1,06; 0,79 M lần lƣợt đối với Bcl-XL, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-B, Bfl-1, 9
  18. Mcl-1) [12, 13, 14]. AG gắn với thụ thể transferring (IC50 = 4,1 M) gây ra sự chết lập trình của nhiều dòng tế bào ung thƣ 17,18]. Một số nghiên cứu khác chỉ ra AG ức chế hoạt động của chymptrypsin trên 20S proteasome [19], gây độc trên dòng tế bào ung thƣ não thông qua cơ chế AMPK ảnh hƣởng trên EGFR và tín hiệu Akt/mTORC1 [20]. G ngăn chặn sự tạo mạch máu, ức chế quá trình tăng sinh tế bào và di căn 21]. xit gambogic có độc tính thấp, hoạt tính chọn lọc và khả năng là một tác nhân hóa trị tiềm năng. Nghiên cứu độc tính cấp và trƣờng diễn trên chuột và chó đã chỉ ra liều không gây độc theo đƣờng uống là 60 mg/kg trọng lƣợng trong 13 tuần, gấp 18 lần so với liều thử lâm sàng trên ngƣời (20 mg/60 kg, hàng ngày) [22,23]. Hiện tại, axit gambogic đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc điều chế thuốc từ trạng thái tinh khiết 92-95 và đã thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn I và II trên bệnh nhân ung thƣ phổi, ruột và thận [24]. Kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II đã bƣớc đầu chứng minh tác dụng hiệu quả của AG trên các bệnh nhân ung thƣ và cho thấy AG dạng bào chế an toàn hơn so với nhựa Đằng hoàng tự nhiên, đồng thời có thể tiếp tục đƣa vào thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn sau. Nhiều công trình khoa học gần đây nhất cũng cho thấy AG còn thể hiện khả năng tăng cƣờng hiệu lực điều trị (synergistic) khi kết hợp với một số loại thuốc điều trị ung thƣ khác nhƣ docetaxel, vincristine, verapamil, adreamycin, cisplatin, 5-fluorouracil hay sunitinib trên các dòng tế bào ung thƣ ác tính khác nhau [25,26,27,28]. Cấu trúc hóa học của axit gambogic đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ NMR [29], và gần đây đƣợc khẳng định thêm nhờ phân tích nhiễu xạ tia X tinh thể [30]. Nó bao gồm một hệ vòng 4-oxatricyclo[4.3.1.0]decan- 10
  19. 2-one, một dạng cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên phân lập đƣợc từ các loài Garcinia (chi Bứa) [31]. Vào năm 2004, công trình đầu tiên về việc chuyển hóa AG nhằm nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (S R đƣợc công bố bởi các nhà khoa học của hãng Dƣợc Maxim (San Diego, Mỹ) [32]. Từ đó đến nay, đã có hơn 10 công bố về việc tổng hợp các dẫn xuất (derivative) và các chất tƣơng tự (analogue). Một số chất tổng hợp đƣợc từ AG có hoạt tính mạnh hơn nhiều lần so với chất đầu, ví dụ nhƣ methyl ester của AG có hoạt tính trên dòng tế bào ung thƣ phổi A549 mạnh hơn 2-3 lần, dẫn xuất epoxy có hoạt tính mạnh hơn 3-6 lần GA trên dòng tế bào ung thƣ gan 33], 3 dẫn xuất este khác có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ gan mạnh hơn G và hơn 27,8-14,5 lần so với taxol [34] Các hợp chất analogue tổng hợp đƣợc tuy không có hoạt tính kháng ung thƣ mạnh nhƣ G nhƣng việc nghiên cứu chúng đã làm sáng tỏ phần cấu trúc có hoạt tính của axit gambogic [35-38]. 1.1.3.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam xit gambogic cũng nhƣ dƣợc liệu Đằng hoàng chƣa có trên thị trƣờng Việt Nam nên tiêu chuẩn cơ sở là chƣa có. Việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cơ sở và phƣơng pháp phân tích định tính, định lƣợng axit gambogic là rất quan trọng. Nhờ thế, sản phẩm axit gambogic mới trở thành thƣơng phẩm có giá trị. Tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, từ năm 2013, chỉ có nhóm TS. Trần Thị Thu Thủy đang tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập axit gambogic tinh khiết ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện đang triển khai ở quy mô lớn hơn. Cấu trúc của axit gambogic phân lập đƣợc đã đƣợc khẳng định bằng phổ NMR và MS, kết hợp với so sánh dữ liệu đã công bố. Các nghiên cứu sơ bộ về hoạt tính sinh học tại Viện đã chứng minh hoạt tính gây độc tế 11
  20. bào trên 3 dòng tế bào ung thƣ phổi, gan và màng tim. Hoạt tính và cơ chế tác dụng của axit gambogic trên dòng tế bào ung thƣ não T98 đã đƣợc thực hiện và công trình đã đƣợc đăng trên tạp chí Bioorg. Med. Chem. Lett. vào năm 2015. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.1. ớ ) Sắc ký lớp mỏng (TLC đƣợc sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định hƣớng và kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập bằng sắc ký. Phân tích sắc ký lớp mỏng thƣờng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel, chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Nếu các chất không phát hiện đƣợc bằng đèn UV 256/354 nm thì dùng các thuốc thử hiện màu là dung dịch Vanilin/H2SO4 đặc1%, Ce(SO4)2/H2SO4đặc 15%, p-Anisaldehyde/H2SO4, Ce(SO4)2 / molybdate / H2SO4, I2, KMnO4, N-inhydrin Các dung môi thƣờng dùng cho TLC đƣợc xếp theo thứ tự độ phân cực tăng dần là: ete dầu hỏa < hexane < cyclo hexane < toluen < diethyl ete < dichloromethan < chloroform < etyl axetat < axeton < ethanol < axit axetic. Giải ly bản m ng Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt s n một tấm giấy thấm (giấy lọc , nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ƣớt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình đƣợc bão hòa). Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không đƣợc ngập vào dung môi. 12
  21. Hình 1.6: Bình giải ly bản m ng Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngƣng quá trình giải ly, lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi và tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trƣng. Hiện hình các vết sau khi giải ly. Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ đƣợc nhìn bằng mắt thƣờng, nhƣng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý. Phương pháp vật lý. Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu, nếu cần quan tâm thì dùng vết chì khoanh lại. Phương pháp hóa h c. Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trƣng nhƣ I2, KMnO4,dung dịch vanillin, dung dịch FeCl3, dung dịch H2SO4, dung dịch Ce(SO4)2. Thƣờng sử dụng thuốc thử vanillin. 13
  22. ) Trong phƣơng pháp sắc ký cột, pha tĩnh thƣờng là silica gel đƣợc nhồi vào cột sau đó hỗn hợp chất hoà tan trong dung môi hữu cơ đƣợc đƣa lên cột sắc ký. Tiếp đó sắc phổ đƣợc triển khai, nghĩa là các vùng của từng chất lúc đầu chƣa tách ra khỏi nhau, thì nay do rửa giải tiếp bằng dung môi (tức là cho dung môi tinh khiết liên tục chảy qua cột) mà tách hẳn ra khỏi nhau. Đây là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng phổ biến nhất để phân tách các chất trong một hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về độ phân cực của chúng. Khi dung môi kém phân cực đi qua cột sắc ký, những phần kém phân cực sẽ bị rửa giải đi ra cùng dung môi, những phần phân cực hơn chỉ đi qua khi dung môi đƣợc đƣa vào có độ phân cực cao hơn. Hình 1.7: Sắc ký cột Trong sắc ký cột dung môi dùng để rửa giải thƣờng là n-hexan, axeton, etyaxetat, điclometan, methanol. Để hứng dung môi trong quá trình rửa giải hấp phụ ta thƣờng dùng ống nghiệm 20mL hoặc lọ thủy tinh, ống nghiệm hoặc bình nón, tuỳ vào kích thƣớc cột mà ta sử dụng lọ hứng chất cho phù hợp. 14
  23. Các ống nghiệm đều đƣợc đánh số thứ tự và sắp xếp lần lƣợt. Sau khi kiểm tra bằng TLC để gom các phân đoạn có đặc điểm giống nhau. Các phân đoạn sau đó đƣợc chuyển vào các lọ chứa để làm các phân tích tiếp theo. Nhồi cột có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ƣớt. Nhồi khô: Cột sau khi đƣợc dựng cẩn thận, ta đƣa silicagel vào cột theo một tỷ lệ nhất định. Dùng dung môi thích hợp cho vào cột sắc ký, sau đó từ từ cho dung môi ngấm dần và chảy xuống cuối cột. Chú ý không để các bọt khí còn trong cột sẽ làm ảnh hƣởng tới quá trình tách chất. Để ổn định cột trƣớc khi chuyển mẫu phân tích lên. Nhồi ƣớt: Cột đƣợc chuẩn bị và lắp cố định vào giá, cân một lƣợng silicagel thích hợp khuấy trộn đều với dung môi thành một hỗn hợp lỏng sệt. Mở và rót vào cột cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đáy cột. Tránh xuất hiện các bọt khí. Cho dung môi chảy liên tục một thời gian đến khi cột đã hoàn toàn ổn định. Đƣa chất phân tích vào cột: Có 2 cách đƣa chất vào cột: tẩm mẫu bằng silica gel hoặc đƣa trực tiếp lên cột. 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, ngƣời ta phải sử dụng các phƣơng pháp bổ sung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, các phƣơng pháp sắc ký so sánh, 1.3.1 Phổ hối ượ M ) Máy phối khổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng nhỏ chất thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng. Các mảnh ion này nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng 15
  24. ứng với khối lƣợng của mỗi ion, đó là khối phổ. Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị phá rất nhanh từ 10-10 đến 10-3 giây để hình thành các mảnh ion mang điện dƣơng, những ion này lại tiếp tục bị phá thành những ion nhỏ hơn. Chỉ có một số ít ion phân tử chƣa kịp bị bắn phá di chuyển đến bộ phận tập hợp và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic này sẽ cho ta biết khối lƣợng phân tử của chất thử. Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ cho chúng ta khối lƣợng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng. 1.3.2. Phổ c ng từ hạt nhân ( NMR) Phổ cộng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C dƣới tác dụng của tử trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, δ . Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân tử với nhau (spin coupling). 1.3.2.1. Phổ 1H-NMR 1 Trong phổ H -NMR, độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chyển hóa học và tƣơng tác spin mà ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. 16
  25. 1.3.2.2. Phổ 13C-NMR Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một môi trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dài thang đo rộng là 0 - 230 ppm. 1.3.2.3. Phổ DEPT Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 Hz. Trên phổ DEPT 90 Hz chỉ xuất hiện tín hiệu phổ CH. 1.3.2.4. Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho ph p xác định tƣơng tác của các hạt nhân tử của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ sau. - Phổ HSQC: Các tƣơng tác trực tiếp H - C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là phổ 13C -NMR. Các tƣơng tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. - Phổ 1H- 1H COSY : Phổ này biễu diễn tƣơng tác của H - H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc nối ghép lại với nhau. - Phổ HMBC : Đây là phổ biểu diễn tƣơng tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. 17
  26. CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu nhựa Đằng hoàng đƣợc mua ở Đồng Nai và Phú Quốc - Kiên Giang. Là những thỏi nhựa Đằng hoàng đặc cứng và khô; hình trụ với màu vàng sậm óng. Nguyên liệu mua về đƣợc bọc kín và để ở nơi thoáng mát, không có ánh sáng trực tiếp chiếu vào. Khi sử dụng thì đập vỡ các thỏi nhựa Đằng hoàng thành các mẩu nhỏ rồi nghiền mịn. Đem sấy khô để loại bỏ hoàn toàn nƣớc còn lại có trong nguyên liệu. 2.1.2. Thiết bị - Phổ cộng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR đƣợc đo trên máy Bruker V 500 FT-NMR Spectrometer trong các dùng môi CDCl3 và CD3OD sử dụng TMS làm chất chuẩn nội - Phổ khối phân giải cao (HR-MS đƣợc đo trên máy micro-TOF-QII 1002.7 tại Gif-sur-Yvette (Pháp) - Máy siêu âm - Máy cô quay chân không - Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất - Máy sấy - Bếp điện - Cột sắc ký pha thƣờng đƣờng kính khác nhau. - Cốc thủy tinh. - Bình tam giác. - Phều chiết. 18
  27. - Máy sấy. - Silicagel pha thƣờng (0,04 - 0,063 mm và 0,063 - 0,2 mm) Merck. - Bản mỏng tráng s n pha thƣờng DC -Alufolien 60 F254 (Merck). - Các loại dung môi hữu cơ nhƣ metanol, cloroform, axeton, etyl axetat, n-hexan, butanol đƣợc tinh chế bằng chƣng cất trƣớc khi sử dụng - Các loại thuốc thử khác nhau: vanilin, KMnO4 , H2SO4 , FeCl3 2.2. CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 2.2.1.Phân lập axit gambogic Cặn chiết etyl axetat từ nhựa cây đằng hoàng đƣợc tách trên cột silica gel với hệ rửa giải gradient hexane/EtO c. Phân đoạn chính đƣợc tiếp tục tinh chế trên cột Sephadex LH-20 sử dụng MeOH là dung môi rửa giải. Axit gambogic (1) thu đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu vàng (hàm lƣợng 10% từ nhựa). Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 1 H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,77 (OH-6); 7,55 (1H, d, J 7.0 Hz, H-10); 6,60 (1H, d, J 10.0 Hz, H-4); 6,09 (1H, t, J 7.5 Hz, H-27); 5,38 (1H, d, J 10.0 Hz, H-3); 5,04 (2H, m, H-22, H-32); 3,47 (1H, m, H-11); 3,29 (1H, dd, J 8.0 & 15.0 Hz, H-31); 3,14 (1H, dd, J 5.0 & 15.0 Hz, H-31); 2,95 (2H, d, J 7.0 Hz, H-26); 2,51 (1H, d, J 9.5 Hz, H-36); 2,31 (1H, dd, J 5.0 & 13.0 Hz, H-37); 2,01 (m, 1H, H-21); 1,76 (m, 2H, H-20); 1,74 (s, 3H, H-29); 1,72 (s, 3H, H-34); 1,69 (s, 3H, H-39); 1,64 (s, 3H, H-24); 1,62 (s, 3H, H-35); 1,59 (m, 1H, H-21); 1,55 (s, 3H, H-25); 1,38 (s, 3H, H-19); 1,36-1,34 (overlap, 1H, H-37); 1,29 (s, 3H, H-40). 19
  28. 13 C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,3 (C-12); 178,9 (C-8); 160,2 (C-30); 161,5 (C-6); 157,6 & 157,4 (C-16, C-18); 137,8 (C-27); 135,3 (C-10); 133,4 (C-9); 131,8 (C-23); 131,5 (C-33); 127,8 (C-28); 124,5 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-32); 115,9 (C-4); 107,6 (C-17); 102,8 (C-5); 100,5 (C- 7); 90,9 (C-14); 83,95 (C-13); 83,8 (C-38); 81,3 (C-2); 49,0 (C-36); 46,8 (C- 11); 42,0 (C-20); 29,9 (C-39); 29,3 (C-26); 28,8 (C-40); 27,7 (C-19); 25,6 (C-24, C-35); 25,2 (C-37); 22,7 (C-21); 21,6 (C-31); 20,7 (C-29); 18,1 (C- 34); 17,6 (C-25). 2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic 2.2.2.1. Qui trình este hóa Hỗn hợp của axit gambogic (200 mg; 0,32 mmol), DMAP (78 mg; 0,64 mmol), EDC (123 mg; 0,64 mmol) và MeOH hoặc EtOH (3,2 mmol) trong THF (5 mL đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 h. Dung dịch phản ứng đƣợc đổ vào nƣớc (10 mL), chiết bằng EtOAc (3 x 10 mL). Pha hữu cơ đƣợc gộp lại, làm khan và cô đặc cho sản phẩm thô. Tinh chế trên cột silica gel (hexane-EtOAc 5:1) cho sản phẩm ester. Ethyl gambogate (2): Chất dầu màu vàng (hiệu suât 75%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,84 (s, 1H, OH-6); 7,53 (d, J 7.0 Hz, H-10); 6,66 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-4); 5,99 (t, 1H, J 8.0 Hz, H-27); 5,42 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-3); 5,05 (m, 2H, H-22, 32); 3,89 (q, 2H, J 5.5 Hz, OCH2); 3,46 (m, 1H, H-11); 3,30 (dd, 1H, J 8.0 & 15.0 Hz, H-31); 3,15 (dd, 1H, J 5.0 & 14.5 Hz, H-31); 3,02 (dd, 1H, J 6.5 & 16.5 Hz, H-26); 2,92 (dd, 1H, J 7.0 & 16.5, H-26); 2,50 (d, 1H, J 9.5 Hz, H-36); 2,31 (dd, 1H, J 4.5 & 13.5 Hz, H-37); 2,03 (m, 2H, H-21); 1,77 (m, 1H, H-20); 1,73 (s, 3H); 1,69 (s, 3H); 1,68 (s, 3H); 1,65 (s, 3H); 1,63 (s, 3H); 1,60 (m, 1H, H-20); 1,57 (s, 3H); 1,55 (s, 3H); 1,43 (s, 3H); 1,37 (m, 1H, H-37); 1,28 (s, 3H); 1,09 (t, 3H, J 7.0 Hz, CH3-CH2-O). 20
  29. 13 C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,6 (C-8); 179,0 (C-12); 167,0 (C-30); 161,3 (C-6); 157,6 (C-16); 157,5 (C-18); 136,0 (C-10); 135,1 (C-28); 133,6 (C-9); 131,8 (C-33); 131,5 (C-23); 127,9-124,4 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-27,32); 115,9 (C-4); 107,6 (C-17); 102,5 (C-5); 100,5 (C-7); 91,0 (C-14); 83,73 (C-2); 83,69 (C-13); 81,3 (C-38); 60,1 (OCH2); 49,1 (C- 36); 46,9 (C-11); 42,1 (C-20); 29,9 (Me); 29,7 (C-26); 29,1 (Me); 28,8 (Me); 27,9 (Me); 25,6 (2Me); 25,1 (C-37); 22,7 (C-21); 21,6(C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me); 14,0 (CH3-CH2-O). + + HR-MS (m/z): 657,3422 [M+H] , tính toán [C40H48O8+H] : 657,3427. 2.2.2.2. Qui trình amide hóa Hỗn hợp của axit gambogic (200 mg; 0,32 mmol), DMAP (78 mg; 0,64 mmol), EDC (123 mg; 0,64 mg) và amine (0,64 mmol) trong THF (3 mL) đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 6 h. Dung dịch phản ứng đƣợc đổ vào nƣớc ( 10 mL) và chiết bằng EtOAc (3 x 10 mL). Pha hữu cơ đƣợc gộp lại, làm khan và cô đặc, tinh chế trên cột silica gel (EtOAc-DCM). N-diallyl-gambogamide (3): Chất dầu màu vàng (hiệu suất 70%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,89 (s, 1H, OH-6); 7,53 (d, J 7.0 Hz, H-10); 6,67 (d, 1H, J 10.5 Hz, H-4); 5,61 (m, 2H, 2CH= allyl); 5,44 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-3); 5,43 (overlap, 1H , H-27); 5,09-5,02 (m, 4H, 2CH2= allyl); 5,04-5,07 (m, 2H, H-22, 32); 3,88 (m, 2H, CH2 allyl); 3,71 & 3,61 (2dd, 2H, J 4.5 & 16.0, 5.5 &16.0 Hz, CH2 allyl); 3,43 (t, 1H, J 5.5 Hz, H-11); 3,29 (m, 2H, H-31); 2,49 (d, 1H, J 9.0 Hz, H-36); 2,42 (dd, 1H, J 6.5 & 16,5 Hz, H-26); 2,29 (dd, 1H, J 4.5 & 13.5, H-37); 2,22 (dd, 1H, J 7.5 & 15.5 Hz, H-26); 2,05 (m, 2H, H-21); 1,79 (overlap, 1H, H-20); 1,77 (s, 3H); 1,75 (s, 3H); 1,6; (s, 3H); 1,65 (s, 6H); 1,62 (overlap, 1H, H-20); 1,56 (s, 3H); 1,43 (s, 3H); 1,36 (dd, 1H, J 8.0 & 13.5 Hz, H-37); 1,27 (s, 3H). 21
  30. 13 C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,3 (C-8); 179,0 (C-12); 171,0 (C-30); 161,6 (C-6); 157,7 (C-16); 157,6 (C-18); 135,6 (C-10); 133,8 (C-28); 133,6 (CH=allyl); 133,0 (C-9); 132,8 (CH=allyl); 131,8 (C-33); 131,5 (C-23); 124,6 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-27, C-32); 117,6 (2CH2= allyl); 115,9 (C- 4); 107,7 (C-17); 102,7 (C-5); 100,5 (C-7); 91,1 (C-14); 83,6(C-2); 82,9(C- 13); 81,3(C-38); 49,5 (CH2 allyl); 49,0 (C-36); 47,0 (C-11); 45,5 (CH2 allyl); 42,1 (C-20); 30,1 (Me); 29,5 (C-26); 28,7 (Me); 27,8 (Me); 25,7 (Me); 25,6 (Me); 25,4 (C-37); 22,7 (C-21); 21,7 (C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me). + + HR-MS (m/z): 708,3895 [M+H] , tính toán [C44H53NO7+H] : 708,3900. 1(4-trifluoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide (4): Chất dầu màu vàng (hiệu suất 51%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,86 (s, 1H, OH-6); 7,52 (d, J 7.0 Hz, H-10); 7,49 (d, 2H, J 9.0 Hz, 2CH aromatic); 6,89 (d, 2H, J 9.0 Hz, 2CH aromatic); 6,66 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-4); 5,49 (m, 1H, H-27); 5,44 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-3); 5,08 (m, 2H, H-22, 32); 3,74 & 3,59 (m, 2x1H, CH2 piperazine); 3,42 (dd, 1H, J 4.5 & 6.5 Hz, H-11); 3,29 (dd, 2H, J 8.0 & 7.0 Hz, C-31); 3,35-3,05 (m, 6H, 3CH2 piperazine); 2,50 (d, 1H, J 9.0 Hz, H-36); 2,39 (dd, 1H, J 7.0 & 16.0 Hz, H-26); 2,30 (m, 2H, H-37, H-26); 2,03 (m, 2H, H-21); 1,79 (m, 1H, H-20); 1,76 (s, 3H, Me); 1,74 (s, 3H, Me); 1,68 (s, 3H, Me); 1,65 (s, 6H, 2Me); 1,60 (m, 1H, H-20); 1,55 (s, 3H, Me); 1,40 (s, 3H, Me); 1,35 (m, 1H , H-37); 1,25 (s, 3H, Me). 13 C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,4 (C-8); 179,0 (C-12); 169,7 (C-30); 161,7 (C-6); 157,7 (C-16); 157,5 (C-18); 152,9 (C-N); 135,6 (C-10); 133,13 (C-28); 133,11 (C-9); 131,9 (C-33); 131,7 (C-23); 126,52 & 126,49 (2C, 2CH thuộc C6H4-CF3); 124,7 (C-3); 123,7 (C-22); 122,8 (C-27); 122,2 (C-32); 115,8 (C-4); 115,2 (2C, 2CH thuộc C6H4-CF3); 107,7 (C-17); 102,8 (C-5); 100,5 (C-7); 91,1 (C-14); 83,6 (C-2); 82,9 (C-13); 81,4 (C-38); 49,0 22
  31. (C-36, 2CH2 piperazine); 48,04 (CH2 piperazine); 47,0 (C-11); 45,4 (C-31); 42,0 (C-20); 40,6 (CH2 piperazine); 30,1 (Me); 29,4 (C-26); 28,7 (Me); 27,8 (Me); 25,7 (Me); 25,6 (Me); 25,4 (C-37); 22,7 (C-21); 21,7 (C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me). + + HR-MS (m/z): 841,4016 [M+H] , tính toán [C49H55O7N2F3+H] : 841,4040. 2.2.3. Thử hoạ í h ây đ c tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất Đƣợc thực hiện theo theo phƣơng pháp của Skehan & CS (1990 và Likhiwitayawuid & CS(1993) tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dòng tế bào: Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thƣ gan Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thƣ biểu mô phổi Dòng RD (Human rhabdomyosarcoma – Ung thƣ màng tim) - Môi trường nuôi ấy tế bào DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt Có bổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum) Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic. - á dụng ụ dùng 1 n: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet 23
  32. - hất huẩn hứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine, pha trong DMSO Đọc trên máy ELIS ở bƣớc sóng 495-515nm - ính ết quả: Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0 , DMSO 10 và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS ( theo công thức: ( ) ( ) ( ) ( ) Giá trị CS sau khi tính theo công thức trên, đựơc đƣa vào tính toán Excel để tìm ra trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của ph p thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn  ( ̅) √ Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50 sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC5 Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang gía trị logarit của đƣờng cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y=a+blnX Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS ( . 24
  33. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC 3 Đị h hướng nghiên cứu Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic Các nghiên cứu về hoạt tính - cấu trúc (SAR) của axit gambogic [32, 36] đã chỉ ra tầm quan trọng của nối đôi trên vòng D (liên hợp với nhóm C=O của vòng C đối với hoạt tính. Nhóm axit COOH có thể chuyển hóa về các dạng nhóm chức khác nhƣ ester, amide hay nhóm mang tính base khác mà không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính apoptosis. Một số dẫn xuất amide có chứa nhóm base làm tăng độ tan của chất trong môi trƣờng axit. Điều thú vị là sự thay đổi nhiều ở nhóm carboxylic không làm mất hoạt tính, chỉ ra khả năng vùng cấu trúc này của axit gambogic không ảnh hƣởng đến sự gắn kết của axit gambogic với đích sinh học. Dựa trên cấu trúc tinh thể của axit gambogic, cấu trúc hệ vòng xanthone nằm trên một mặt phẳng và có hai mặt trên và dƣới khác nhau. Hai nhóm prenyl và vòng polycyclic nằm ở phía trên, tạo nên phía kỵ nƣớc (hydrophobic face), còn nhóm axit carboxylic và nhóm carbonyl của hệ vòng polycyclic nằm phía dƣới tạo nên phía ƣa nƣớc (hydrophilic face). Các kết quả về việc chuyển hóa nhóm carboxylic đã gợi ý rằng phía mặt phẳng hydrophilic không đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết với đích sinh học của nó. 25
  34. Các dẫn xuất tạo ra từ sự chuyển hóa nhóm 6-OH (vòng B nhƣ methyl hay acyl hóa [32] có hoạt tính tƣơng tự nhƣ chất đầu. Vì thế nhóm 6-OH này cũng không đóng vai trò quyết định đối với hoạt tính. Ngoài ra còn quan sát thấy liên kết hydro nội phân tử rất mạnh giữa nhóm 6-OH và nhóm carbonyl (vòng C) bởi độ dịch chuyển hóa học về phía trƣờng rất thấp của hydrogen thuộc nhóm OH (12,66 ppm). Trong khi đó, các dẫn xuất với liên kết đôi (vòng D ở dạng bão hòa thì có hoạt tính giảm hơn 10 lần so với axit gambogic trên dòng tế bào T47D, chứng tỏ liên kết đôi liên hợp keton này có vai trò quan trọng đối với hoạt tính, có thể là đích tấn công của các nucleophil có mặt trên đích sinh học (phản ứng cộng Michael) tạo ra liên kết đồng hóa trị của axit gambogic với đích, và hoạt hóa tín hiệu apoptosis, dẫn đến hoạt hóa chuỗi caspase và sự chết tế bào. Từ các kết quả hoạt tính – cấu trúc nói trên, trong khuôn khổ đề tài, một số dẫn xuất bằng cách chuyển hóa nhóm axit carboxylic về dạng ester và amide của axit gambogic đƣợc tổng hợp và nghiên cứu sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào. 3.1.2. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất xit gambogic đƣợc phân lập từ nhựa cây đằng hoàng với hiệu suất là 10 theo phƣơng pháp sắc kí cột silicagel kết hợp với cột Sephadex [12]. Cấu trúc của axit gambogic đƣợc xác định bằng phổ NMR 1H và 13C kết hợp với so sánh dữ liệu nêu ra trong tài liệu tham khảo. Việc chuyển hoá nhóm COOH của axit gambogic đƣợc thực hiện theo sơ đồ 1, bằng cách sử dụng hệ xúc tác EDC/DM P để hoạt hóa nhóm axit. 26
  35. R: Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic. Phản ứng este hóa của axit gambogic với EtOH, sử dụng hệ xúc tác EDC/DM P thu đƣợc sản phẩm (2) với hiệu suât 75%. Cấu trúc của dẫn xuất (2) đƣợc xác định bằng phổ NMR và HR-MS. Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2) cho thấy ngoài các tín hiệu proton của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu quartet tại δH 3,89 ppm của nhóm -OCH2 và tín hiệu triptet tại δH 1,09 ppm của nhóm CH3-CH2-O-. Tƣơng tự vậy, phổ 13C-NMR của dẫn xuất (2) cũng cho thấy ngoài các tín hiệu cacbon của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δC(ppm): 60,1 (OCH2) và 14,0 (CH3-CH2-O). Phổ HR-MS của dẫn xuất (2) cho giá trị [M+H]+: 657,3427 ứng với hợp chất có công thức C40H48O8 (tính toán theo lý thuyết cho [M+H]+:657,3422. 27
  36. OEt Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của axit gambogic 28
  37. Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2) Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của axit gambogic 29
  38. Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (2) Phản ứng amide hóa của axit gambogic với diallylamine, sử dụng hệ xúc tác EDC/DM P thu đƣợc sản phẩm (3) với hiệu xuất 70%. Cấu trúc của dẫn xuất (3) đƣợc xác định bằng phổ NMR và HR-MS. Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (3) cho thấy ngoài các tín hiệu proton của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δH(ppm): 5,61 (m, 2H, 2CH= allyl); 5,09-5,02 (m, 4H, 2CH2= allyl); 3,88 (m, 2H, CH2 allyl); 3,71 & 3,61 (2dd, 2H, J 4.5 & 16,0; 5,5 13 &16,0 Hz, CH2 allyl . Tƣơng tự vậy, phổ C-NMR của dẫn xuất (3) cũng cho thấy ngoài các tín hiệu cacbon của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δC(ppm): 133,6 (CH=allyl); 132,8 (CH=allyl); 117,6 (2CH2= allyl); 49,5 (CH2 allyl); 45,5 (CH2 allyl). Phổ HR-MS của dẫn xuất (3) cho giá trị + [M+H] : 708,3900 ứng với hợp chất có công thức C44H53NO7 (tính toán theo lý thuyết cho [M+H]+ là 708,3895) 30
  39. Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất (3) 31
  40. Hình 3.10: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (3) Phản ứng amide hóa của axit gambogic với 1-(4-trifluoromethyl- phenyl)-piparazine, sử dụng hệ xúc tác EDC/DM P thu đƣợc sản phẩm (4) với hiệu xuât 51%. Cấu trúc của dẫn xuất (4) đƣợc xác định bằng phổ NMR và HR-MS. Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (4) cho thấy ngoài các tín hiệu proton của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δC(ppm): 7,49 (d, 2H, J 9.0 Hz, 2CH aromatic); 6,89 (d, 2H, J 9.0 Hz, 2CH aromatic); 3,74 & 3,59 (m, 2x1H, CH2 piperazine); 3,35-3,05 (m, 6H, 3CH2 piperazine). Tƣơng tự vậy, phổ 13C-NMR của dẫn xuất (3) cũng cho thấy ngoài các tín hiệu cacbon của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δC(ppm): 126,52 & 126,49 (2C, 2CH thuộc C6H4 –CF3); 115,2 (2C, 2CH thuộc C6H4 –CF3); 49,0 (C-36, 2CH2 piperazine); 48,04 (CH2 piperazine); 40,6 (CH2 piperazine). Phổ HR-MS của dẫn xuất (4) cho giá trị [M+H]+ : 841,4040 ứng với hợp chất có công thức + C49H55O7N2F3 (tính toán theo lý thuyết cho [M+H] là 841,4016) 32
  41. Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất (4) Hình 3.12: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (4) 33
  42. Hình 3.13: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (4) Hiệu suất phản ứng đƣợc đƣa trong Bảng 3.1 Bảng 3.1: Hiệu suất phản ứng chuyển hóa của axit gambogic TT R Hiệu suất (%) Trạng thái VL Khối lƣợng (mg) 2 Ethyl 75 Dầu, màu vàng 175 3 250 70 Dầu, màu vàng 4 140 51 Dầu, màu vàng 3.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA AXIT GAMBOGIC VÀ CÁC DẪN XUẤT Axit gambogic và tất cả các dẫn xuất tổng hợp đƣợc đƣợc thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời là gan (HepG2), phổi 34
  43. (Lu-1) và màng tim (RD). Các tế bào ung thƣ đƣợc xử lý với dung dịch 5g/mL mỗi chất trong DMSO. Chứng dƣơng đƣợc sử dụng là ellipticine. Kết quả % tế bào sống sót (CS đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2: Bảng 3.2: Ho t tính gây độc tế bào in vitro của axit gambogic và các dẫn xuất. Nồng Dòng tế ào TT KH mẫu độ đầu Giá t ị CS (%) Nhận xét (g/ml) Hep-G2 LU-1 RD 0 DMSO - 100 100 100 Chứng (+ 5 2,55 1,5 3,12 0,5 3,03 0,1 1 GA 5 0 0 0 Dƣơng tính 3 dòng TB 2 Ethyl.GA 5 0 0,2 0,1 0 Dƣơng tính 3 dòng TB 3 DIALY.GA 5 0,8 0,3 0 0 Dƣơng tính 3 dòng TB 4 3F.GA 5 0 11,22 0,9 0 Dƣơng tính 3 dòng TB Các mẫu dƣơng tính (CS<50 đƣợc đem thử nghiệm tiếp để tìm ra giá trị IC50. Kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3: Bảng 3.3: Giá trị IC50 của axit gambogic và các dẫn xuất Giá t ị IC50 (g/ml) Ký hiệu mẫu Dòng tế bào Hep-G2 LU-1 RD 1 GA 0,434 0,841 0,340 2 Ethyl.GA 0,391 0,816 0,327 3 DIALY.GA 0,394 0,780 0,298 4 3F.GA 3,433 4,064 1,825 35
  44. Kết quả cho thấy các dẫn xuất 2-3 có hoạt tính mạnh hơn so với axit gambogic trên các dòng tế bào ung thƣ gan (HepG2 , phổi (LU1) và màng tim (RD). Riêng dẫn xuất 4 có chứa vòng piperazine gắn với nhân benzen flo hóa lại có hoạt tính yếu hơn 7,8-8,7 lần (HepG2), 4,8 lần (Lu1, 6) và 5,4-8,2 lần (RD) so với axit gambogic. Các hợp chất có hoạt tính đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thƣ khác, và hoạt tính apoptosis (hoạt hóa caspase, ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptide BH3 và hoạt tính trên kênh ion Kir2.1. Một số dẫn xuất amide khác đang đƣợc tiếp tục điều chế nhằm mục tiêu tìm ra mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc. 36
  45. KẾT LUẬN Khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic” đã thu đƣợc những kết quả sau: Tổng hợp đƣợc axit gambogic và 3 dẫn xuất của axit gambogic là ethyl gambogate (2); N-diallyl-gambogamide (3) và 1(4- trifluoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide (4) bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại. Đã thử hoạt tính gây độc tế bào 3 dẫn xuất tổng hợp đƣợc của axit gambogic với giá trị IC50 (μg/ml) của ethyl gambogate (2) là 0,391 (Hep-G2) 0,816 (LU-1) 0,327 (RD); N-diallyl-gambogamide (3) là 0,394 (Hep-G2) 0,780 (LU-1) 0,298 (RD) và 1(4-trifluoromethylbenzene-piperazinyl)- gambogamide (4) là 3,433 (Hep-G2) 4,064 (LU-1) 1,825 (RD). Trong các dẫn xuất tổng hợp đƣợc các dẫn xuất 2-3 có hoạt tính mạnh hơn so với axit gambogic trên các dòng tế bào ung thƣ gan (HepG2 , phổi (LU1) và màng tim (RD). 37
  46. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. V Văn Chi (1999 . Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, TP. HCM. [2]. Gustafsson M. H. G., Bittrich V., Stevens P. F. (2002). Phylogeny of Clusiaceae based on rbcL sequences. Int. J. Plant Sci 163(6), pp. 1045- 1054. [3]. Kubitzki K. Bayer C. Stevens P. F. (2007). The families and genera of vascular plants. Vol. IX. Springer.Hamburg, pp. 48-66, 194-201. [4]. Lien Hoa D. Nguyen, Leslie J. Harrison, January 2000. Xanthones and triterpenoids from the bark of Garcinia vilersiana. Phytochemistry, Volume 53, Issue 1, Pages 111-114. [5]. Sen A. K., Sarkar K. K., Majumder P. C., Banerij N., Usvuori R., Hase T. A. (1981). The structures of garcinones A, B and C.Three new xanthones from Garcinia mangostana. Phytochemistry 21, pp. 1947-1950. [6]. Gey C., Kyrylenko S., Hennig L., Nguyen D. L. H., Buttner A., Pham H. D., Giannis A (2007). Phloroglucinol derivatives guttiferone G. aristoforin and hyperforin: inhibitors of human sirtuins SIRT 1 and SIRT 2. Angew. Chem. Int. Ed. 46, pp. 5219-5222. [7]. Angiosperm Phylogeny Group (1998). An ordinal classification for the families of flowering plants. Bot. J. Linn. Soc. 141, pp. 399-436. [8]. Lu GB, Yang XX, Huang QS Isolation of gambogic acid from gamboge and its structure. Acta Pharm Sin (Chin) (1984); 19,636-639. [9]. Lin, L. J., Lin, L. Z., Pezzuto, J. M. and Cordell, G. A. (1993) Magnetic Resonance Chem. 31, 340. [10]. Asano J., Chiba K., Tada M., Yoshii T. (1996). Cytotoxic xanthones from Garcinia hanburyi, Phytochemistry. 41(3), 815-20. 38
  47. [11]. Deng, Y-X., Pan, S-L., Zhao, S-Y., Wu, M-Q., Sun, Z-Q., Chen, X-H., Shao, Z-Y., Cytotoxic alkoxylated xanthones from the resin of Garcinia hanburyi, Fitoterapia, (2012), 83 (8), 1548-1552. [12]. D. Ollis, M.V.J. Ramsay, I.O. Sutherland, The constitution of gambogic acid, Tetrahedron, 1965, 21 (6), 1453-1470. [13]. C.G. Karanjgaonkar, P.Madhavan Nair, K. Venkataraman; Morellic, isomorellic and gambogic acids, Tetrahedron Let. , (1966), 7 (7), 687- 691. [14] Wu, Z. Q., Q. L. Guo, Q. D. You, L. Zhao & H. Y. Gu: Gambogic acid inhibits proliferation of human lung carcinoma SPC-A1 cells in vivo and in vitro and represses telomerase activity and telomerase reverse transcriptase mRNA expression in the cells. Biol.Pharm. Bull. (2004), 27, 1769–1774. [15] a) Zhao, L., Q. L. Guo, Q. D. You, Z. Q. Wu & H. Y. Gu: Gambogic acid induces apoptosis and regulates expressions of Bax and Bcl-2 protein in human gastric carcinoma MGC-803 cells. Biol.Pharm. Bull. (2004), 27, 998–1003. b) Guo, Q. L., S. S. Lin, Q. D. You, H. Y. Gu, J. Yu, L. Zhao, Q. Qi, F. Liang, Z. Tan & X. Wang: Inhibition of human telomerase reverse transcriptase gene expression by gambogic acid in human hepatoma SMMC-7721 cells. Life Sci. (2006), 78, 1238–1245. [16] Zaks-Makhina E, Li H, Grishin A, Salvador-Recatala V, Levitan ES.J. Biol. Chem. (2009), 284 (23), 15432-15438. [17] Kasibhatla, S., Jessen, K.A., Maliartchouk, S., et al. A role for transferrin receptor in triggering apoptosis when targeted with gambogic acid. Proc Natl Acad Sci USA 102(34) 12095-12100 (2005). 39
  48. [18] Pandey MK, Sung B, Ahn KS, Kunnumakkara AB, Chaturvedi MM, Aggarwal BB (2007) Gambogic acid, a novel ligand for transferrin receptor, potentiates TNF-induced apoptosis through modulation of the nuclear factor-kappaB signaling pathway. Blood110(10): 3517–3525 [19] elth, J., Lesiak-Mieczkowska, K., D'Arcy, P., et al. Gambogic acid is cytotoxic to cancer cells through inhibition of the ubiquitin-proteasome system. Invest New Drugs 31(3) 587-598 (2013). [20] He, X., Liu, X., Chen, X., et al. Gambogic acid induces EGFR degradation and Akt/mTORC1 inhibition through AMPK dependent- LRIG1 upregulation in cultured U87 glioma cells. Biochem Biophys Res Commun 435(3) 397-402 (2013). [21] Wang X, Chen W, Gambogic acid is a novel anti-cancer agent that inhibits cell proliferation, angiogenesis and metastasis, Anticancer Agents Med Chem. 2012 Oct 1;12(8):994-1000. [22] Qinglong Guo, Qi Qi, Qidong You, Hongyan Gu, Li Zhao and Zhaoqiu Wu, Toxicological Studies of Gambogic Acid and its Potential Targets in Experimental Animals, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology (2006), 99, 178–184. [23] Qi Q, You Q, Gu H, Zhao L, Liu W, Lu N, Guo Q, Studies on the toxicity of gambogic acid in rats, J Ethnopharmacol. 2008 May 22; 117(3): 433-8. [24] CHI Yihebali, ZHAN Xiao-kai, YU Hao, XIE Guang-ru, WANG Zhen- zhong, XIAO Wei, WANG Yong-gang, XIONG Fu-xing, HU Jun-feng, YANG Lin, CUI Cheng-xu and WANG Jin-wan, An open-labeled, randomized, multicenter phase IIa study of gambogic acid injection for advanced malignant tumors, Chin Med J, (2013); 126 (9): 1642-1646. 40
  49. [25] L-H Wang, Y Li, S-N Yang, F-Y Wang, Y Hou, W Cui, K Chen, Q Cao, S Wang, T-Y Zhang, Z-Z Wang, W Xiao, J-Y Yang and C-F Wu, Gambogic acid synergistically potentiates cisplatin-induced apoptosis in non-small-cell lung cancer through suppressing NF-κB and MAPK/HO- 1 signalling, British Journal of Cancer (2014) 110, 34 - 352. [26] Zou Z, Xie L, Wei J, Yu L, Qian X, Chen J, Wang T, Liu B, Synergistic anti-proliferative effects of gambogic acid with docetaxel in gastrointestinal cancer cell lines, BMC Complement Altern Med. 2012 Apr 30; 12: 58. [27] Zou ZY, Wei J, Li XL, Yu LX, Wang TT, Qian XP, Liu BR, Enhancement of anticancer efficacy of chemotherapeutics by gambogic acid against gastric cancer cells, Cancer Biother Radiopharm. 2012 Jun; 27(5): 299-306. [28] Wang J, Liu W, Zhao Q, Qi Q, Lu N, Yang Y, Nei FF, Rong JJ, You QD, Guo QL, Synergistic effect of 5-fluorouracil with gambogic acid on BGC-823 human gastric carcinoma, Toxicology. 2009 Feb 4; 256 (1-2): 135-40. [29] Ollis, W. D., Ramsay, M. V., Sutherland, I. O., Mongkolsuk, S. Tetrahedron. (1965), 21, 1453. [30] Weakley, T. J. R., Cai, S. X., Zhang, H.-Z., Keana, J. F. W. J. Chem. Crystallogr. (2001), 31, 501. [31] a) Xu, Y. J., Yip, S. C., Kosela, S., Fitri, E., Hana, M., Goh, S. H., Sim, K. Y. Org. Lett. (2000), 2, 3945. b) Thoison, O., Fahy, J., Dumontet, V., Chiaroni, A., Riche, C., Tri, M. V., Sevenet, T. J. Nat. Prod. (2000), 63, 441. [32] Zhang, H. –Z., Kasibhatla, S., Wang, Y., Herich, J., Guastella, J., Tseng, B., Drewe, J., Cai, S. X. Bioorg. Med. Chem. (2004), 12, 309-317. 41
  50. [33] Wang, J., Zhao, L., Hu, Y., Guo, Q., Zhang, L., Wang, X., Li, N., You, Q. Eur. J. Med. Chem. (2009), 44, 2611-2620. [34] He, L., Ling, Y., Yin, D., Wang, X., Zhang, Y. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2012), 22, 289-292. [35] Li, N., You, Q., Huang, X., Wang, J., Guo, Q., Chen, X., Li, Y., Li, H. Chin. J. Nat. Med. (2008), 6, 37-42. [36] Kuemmerle, J., Jiang, S., Tseng, B., Kasibhatla, S., Drewe J., Cai, S. X. Bioorg. Med. Chem. (2008), 16, 4233-4241. [37] Wang, X., Lu, N., Yang, Q., Gong, D., Lin, C., Zhang, s., Xi, M., Gao. Y., Wei, L., Guo., Q., You. Q. Eur. J. Med. Chem. (2011), 46, 1280- 1290. [38] Sun, H., Chen, F., Wang, X., Liu, Z., Yang, Q., Zhang, X., Zhu, J., Qiang, L., Guo, Q., You, Q. Eur. J. Med. Chem. (2012), 51, 110-123. 42
  51. PHỤ LỤC GA2 : phổ của axit gambogic EGA1 : phổ của hợp chất ethyl gambogate (2) DIALY.GA : phổ của hợp chất N –diallyl-gambogamide (3) 3FGA : phổ của hợp chất 1(4-trifuoromethylbenzene-piperazinyl)- gambogamide (4) 43