Khóa luận Khảo sát và so sánh đặc điểm vi học, sơ bộ hoá thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn - Kháng nấm giữa loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) và Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.)

78 trang thiennha21 18/04/2022 5031

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát và so sánh đặc điểm vi học, sơ bộ hoá thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn - Kháng nấm giữa loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) và Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_khao_sat_va_so_sanh_dac_diem_vi_hoc_so_bo_hoa_than.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát và so sánh đặc điểm vi học, sơ bộ hoá thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn - Kháng nấm giữa loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) và Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH HỒNG GIA ÂN KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM VI HỌC, SƠ BỘ HÓA THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN - KHÁNG NẤM GIỮA SÀI ĐẤT 3 THÙY (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) VÀ SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) Chuyên ngành : Sản xuất và phát triển thuốc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: DS. Nguyễn Thị Thu Hiền Tp HCM – 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chữ ký SV SV. HỒNG GIA ÂN
LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành cuốn luận văn này, trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình đến Cô DS. Nguyễn Thị Thu Hiền đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Những nhận xét và đánh giá của Cô, đặc biệt là những gợi ý về hƣớng giải quyết vấn đề trong suốt quá trình nghiên cứu, thực sự là những bài học vô cùng quý giá đối với tôi trong quá trình viết luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến thầy DS. Phan Cảnh Trình – giảng viên bộ môn vi sinh - ký sinh trùng, trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh ngƣời đã chỉ dạy tận tình, truyền đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành bổ ích, những kỹ năng thực hành thí nghiệm cho bản thân tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô Khoa dƣợc, bộ môn Dƣợc liệu, trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành đã giúp đỡ, góp ý và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình nghiên cứu và viết luận án của mình. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Với khả năng nghiên cứu của bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi xin kính mong đƣợc sự chỉ dẫn và đóng góp của các chuyên gia, các Thầy Cô để đề tài này đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cám ơn
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu 2 1.1. Tổng quan về thực vật học 2 1.1.1. Bộ Cúc (Asterales) 2 1.1.2. Họ Cúc (Asteraceae) 2 1.1.3. Chi Wedelia 4 1.1.4. Loài Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) 5 1.1.5. Loài Sài đất Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. 8 1.2. Tổng quan thành phần hóa học 12 1.3. Tác dụng dƣợc lý 17 1.3.1. Tác dụng dược lý của loài Sài đất ba thùy 17 1.3.2. Tác dụng dược lý của loài Sài đất: 20 1.4. Chế phẩm 24 1.4.1. Chế phẩm của Sài đất ba thùy 24 1.4.2. Chế phẩm của Sài đất 24 1.5. Tổng quan các loài vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 25 1.5.1. Staphylococus aureus 25 1.5.2. Pseudomonas aeruginosa 25 1.5.3. Escherichia coli 26 1.5.4. Klebsiella pneumoniae 27 1.5.5. Candida tropicalis 28 Chƣơng 2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 29 i
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1. Khảo sát vi học 31 2.2.2. Sơ bộ hóa thực vật 32 2.2.3. Kiểm nghiệm vi sinh 37 Chƣơng 3. Kết quả và bàn luận 39 3.1. Mô tả dƣợc liệu 39 3.2. Kiểm nghiệm vi học 42 3.2.1. Vi phẫu lá Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) 42 3.2.2. Vi phẫu lá Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) 45 3.2.3. Vi phẫu thân Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) 48 3.2.4. Vi phẫu thân Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) 51 3.3. Soi bột dƣợc liệu 54 3.3.1. Mô tả bột lá Sài đất ba thùy( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) 54 3.3.2. Mô tả bột thân cây Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) 55 3.3.3. Mô tả bột toàn cây Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) 55 3.4. Kết quả sơ bộ hóa thành phần hóa thực vật: 56 3.5. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 58 Chƣơng 4. Kết luận và đề nghị 62 4.1. Kết luận 62 4.2. Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 ii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CHCl3 Chloroform DMSO Dimethyl sulfoxide EAC Ehrlich ascites carcinoma MHA Muller - hinton agar KQ Kết quả MeOH Methanol MRSA Methicillin-resistant S.aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar SDB Sabouraud Dextrose Broth TBARS Thiobarbituric acid reactive substances TLTK Tài liệu tham khảo TSA Tryptic soy agar TSB Tryptic Soy Broth WC Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. WT Wedelia trilobata (L.) Hitchc. iii
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Thành phần chính tìm thấy trong tinh dầu hoa Sài đất ba thuỳ 12 Bảng 2.1. Bảng đánh giá mức độ kháng vi sinh vật 38 Bảng 3.1.Mô tả đặc điểm lá hai loài Sài đất 39 Bảng 3.2. Mô tả đặc điểm thân cây hai loài Sài đất 40 Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm hoa hai loài Sài đất 41 Bảng 3.4. Bảng so sánh vi phẫu lá cây giữa 2 loài 47 Bảng 3.5. Bảng so sánh vi phẫu thân cây giữa 2 loài 53 Bảng 3.6. Kết quả sơ bộ hóa thành phần hóa học từ lá Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 57 Bảng 3.7. Bảng so sánh sơ bộ thành phần hóa học giữa 2 loài 58 Bảng 3.8. Kết quả định tính hoạt tính kháng khuẩn - kháng nấm của 2 loại dịch chiết và so sánh với loài Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) tham khảo từ các tài liệu nghiên cứu. 59 iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình thái loài Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 6 Hình 1.2. Một số bộ phận của loài Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 7 Hình 1.3. Hình thái loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. 9 Hình 1.4. Một số bộ phận loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. 11 Hình 1.5. Một số chế phẩm từ Sài đất đã có mặt trên thị trƣờng Việt Nam 24 Hình 1.6. Hình dạng loài Staphylococus aureus 25 Hình 1.7. Hình dạng loài Pseudomonas aeruginosa 26 Hình 1.8. Hình dạng loài Escherichia coli 27 Hình 1.9. Hình dạng loài Klebsiella pneumoniae 27 Hình 1.10. Hình dạng loài Candida tropicalis 28 Hình 2.1. Sơ đồ và quy trình sơ bộ hóa thành phần hóa học lá Sài đất ba thùy 33 Hình 2.2. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết ether 34 Hình 2.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết cồn 35 Hình 2.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nƣớc 36 Hình 3.1. Đặc điểm lá giữa hai loài 39 Hình 3.2. Đặc điểm thân giữa hai loài 40 Hình 3.3. Đặc điểm hoa giữa hai loài 41 Hình 3.4. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Sài đất ba thùy 42 Hình 3.5. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất ba thùy 44 Hình 3.6. Biểu bì lá tƣơi Sài đất ba thuỳ 44 Hình 3.7. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Sài đất 45 Hình 3.8. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất 46 Hình 3.9. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết thân Sài đất ba thùy 48 Hình 3.10. Các thành phần trong vi phẫu thân Sài đất ba thùy 50 Hình 3.11. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết thân cây Sài đất 51 Hình 3.12. Các thành phần trong vi phẫu thân Sài đất 52 Hình 3.13. Các thành phần trong bột lá Sài đất ba thùy 54 Hình 3.14. Các thành phần trong bột thân Sài đất ba thùy 55 Hình 3.15. Các thành phần trong bột thân Sài đất 56 v
Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học - Năm học 2013 – 2018 KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM VI HỌC, SƠ BỘ HÓA THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN - KHÁNG NẤM GIỮA SÀI ĐẤT BA THÙY (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) VÀ SÀI ĐẤT (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) Hồng Gia Ân Hƣớng dẫn khoa học: DS. Nguyễn Thị Thu Hiền Mở đầu: Loài Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) từ xƣa đƣợc sử dụng nhƣ một loại kháng sinh thực vật nhƣng ngày nay số lƣợng loài này không còn nhiều. Trong khi đó, Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) mới du nhập vào nƣớc ta, chủ yếu đƣợc sử dụng rộng rãi làm cây kiểng do mọc rất thích nghi nên hay bị sử dụng nhầm lẫn với loài Sài đất mà vẫn chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng sinh. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu: 1. Đặc điểm vi học: Cắt nhuộm, mô tả và lập bảng so sánh vi phẫu thân và lá giữa hai loài. 2. Sơ bộ thành phần hóa thực vật: Định tính nhanh các nhóm hợp chất trong lá Sài đất ba thùy. Lập bảng so sánh các thành phần hoá học giữa hai loài. 3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn - kháng nấm: Mẫu lá Sài đất ba thuỳ chia 2 phần chiết để thu đƣợc cao methanol và chloroform. Thử kháng khuẩn – kháng nấm bằng phƣơng pháp khuếch tán qua giếng thạch với các loài vi sinh vật. Lập bảng so sánh với loài Sài đất. Kết quả: So sánh đƣợc sự khác biệt về hình thái và vi phẫu giữa hai loài, sơ bộ định tính đƣợc các hoạt chất có trong lá Sài đất ba thuỳ. Dịch chiết chloroform và dịch chiết methanol từ lá Sài đất ba thuỳ cho kết quả kháng Tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA). Kết luận: Đã mô tả đƣợc hình thái và đặc điểm vi phẫu thân, lá và bột của loài nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hóa loài này. Đã sơ bộ định tính và xác định đƣợc một số nhóm chất có trong lá Sài đất ba thùy là: flavonoid, tanin, carotenoid, chất béo, tinh dầu, đƣờng khử, triterpenoid tự do, acid hữu cơ và hợp chất polyuronic và so với loài Sài đất thì không có coumarin và saponin. Đã xác định đƣợc hoạt tính kháng khuẩn với Tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) ở nồng độ 2500µg với vòng tròn vô khuẩn là 8mm. Từ khoá: Sài đất, Sài đất ba thuỳ, vi phẫu, kháng khuẩn – kháng nấm, khuếch tán qua giếng thạch.
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013-2018 SURVEY AND COMPARISON ANATOMICAL ANALYSIS, PRELIMINARY CHEMICAL COMPOSITION, ANTIBACTERIAL – ANTIFUNGAL ACTIVITY OF Wedelia trilobata (L.) Hitchc. AND Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. Hong Gia An Pharmacist. Nguyen Thi Thu Hien Introduction: Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. was originally used as a plant-based antibiotic, but today there are not many species. At the same time, Wedelia trilobata (L.) Hitchc. was introduced into our country, mainly used as ornamental plants because of its well-adapted and misused use of Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. but there are not many studies on antibiotic activity. Materials and methods: 1. Microscopic: Cut, describe and compare the micro-stem and leaf between two species. 2. Preliminary composition of plant composition: Rapid identification of compounds in the leaves of Wedelia trilobata. Make a comparative table between the two species. 3. Antibacterial-antifungal activity: dried powder leaves of Wedelia trilobata divided by 2 extracts to obtain high methanol and chloroform. Antimicrobial test by well diffusion agar method with microorganisms. Make comparative table between the two species. Results: Comparison of the morphological and microscopic differences between two species, preliminary composition in the leaves of Wedelia trilobata. Chloroform extraction and methanol extraction for antibacterial results with MRSA. Conclusion: Describing the morphology and characteristics of microscopic trunks, leaves and starches of the species contributes to the standardization of this species. Preliminary identification of several groups of substances in the leaves: flavonoid, tannin, carotenoids, fats, essential oils, reducing sugar, free triterpenoid, organic acids and polyuronic compounds and compare with Wedelia chinensis, there is no coumarin and saponin. Antimicrobial activity with MRSA at 2500μg with sterile circle of 8mm was determined. Keywords: Wedelia chinensis, Wedelia trilobata, microscopic, antimicrobial, well diffusion agar.
ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Wedelia thuộc họ Asteraceae bao gồm khoảng 104 loài, thƣờng phân bố nhiều ở những vùng nhiệt đới và nhiệt đới ẩm. Trong đó có khá nhiều loài phổ biến ở nƣớc ta trong đó có Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) trong dân gian thƣờng đƣợc dùng nhƣ một loại kháng sinh thực vật để chữa các bệnh ngoài da: mụn nhọt, lở loét, rôm sảy, sƣng khớp, viêm nhiễm Sự thật ngày nay loài này ngày càng khan hiếm một phần do thuốc tân dƣợc ngày càng phát triển, một phần do tốc độ đô thị hóa nhanh. Gần đây có một loài Sài đất mới du nhập vào nƣớc ta có tên gọi Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.). Loài này lần đầu đƣợc ghi nhận ở Bangladesh vào năm 2003 và đƣợc tìm thấy nhiều ở các quốc gia Châu Mỹ. Sau đó, nó dần phát triển mạnh mẽ ở các nƣớc nhiệt đới, thậm chí ở một số quốc gia nó còn đƣợc xem là một loài thực vật xâm lấn [9]. Ở Việt Nam, Sài đất ba thùy rất thích nghi nên đƣợc trồng nhiều ở các vệ cỏ, công viên và cả mọc hoang. Tuy nhiên, Sài đất ba thùy chỉ đƣợc biết đến chủ yếu nhƣ một loại cây cảnh cộng thêm việc mới du nhập vào nƣớc ta nên vẫn chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng – công dụng. Đề tài: “ Khảo sát và so sánh đặc điểm vi học, sơ bộ hoá thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn - kháng nấm giữa loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) và Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) ” đƣợc tiến hành với mục đích tìm kiếm thêm một loài dƣợc liệu mới có hoạt tính kháng sinh và góp phần bổ sung những tiêu chuẩn kiểm nghiệm loài Sài đất ba thùy vào Dƣợc điển Việt Nam V nhằm nâng cao công tác kiểm nghiệm và chất lƣợng dƣợc liệu. Nghiên cứu bao gồm các giai đoạn: - Khảo sát đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dƣợc liệu từ lá và thân Sài đất ba thùy và Sài đất. - Sơ bộ hóa thành phần hóa thực vật từ lá Sài đất ba thùy. - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm từ lá Sài đất ba thùy trên một số chủng vi khuẩn, nấm men. 1
Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Tổng quan về thực vật học 1.1.1. Bộ Cúc (Asterales) Bộ này phân bổ rộng khắp thế giới và chủ yếu là các loài cây thân thảo, mặc dù có một lƣợng nhỏ là cây thân gỗ (chi Lobelia) và cây bụi 22. Bộ Asterales có thể đƣợc đặc trƣng ở mức độ phân tử và hình thái học. Các đặc điểm chung bao gồm nhóm các oligosacarid nguồn gốc tự nhiên (các phân tử đƣờng sacaroza liên kết với nhau) nhƣ là nơi lƣu trữ chất dinh dƣỡng và các nhị hoa thông thƣờng đƣợc tập hợp lại dày đặc xung quanh vòi nhụy hoặc thậm chí đƣợc hợp nhất lại thành ống xung quanh nó. Thuộc tính thứ hai có lẽ gắn liền với sự thụ phấn đầu cơ (hay thứ cấp) và điều này rất phổ biến trong các họ của bộ này 22. Bộ Asterales bao gồm khoảng 11 họ, trong đó các họ lớn nhất là họ Cúc (Asteraceae) với khoảng 25.000 loài và họ Hoa chuông (Campanulaceae) với khoảng 2.000 loài. Các họ còn lại có tổng cộng không quá 500 loài. Hai họ lớn nhất là phân bổ rộng khắp thế giới với trung tâm nằm ở Bắc bán cầu, còn những họ nhỏ hơn thông thƣờng phân bổ ở Australia và các vùng xung quanh, hoặc đôi khi ở Nam Mỹ 22. 1.1.2. Họ Cúc (Asteraceae) Thân: cỏ, sống 1 hay nhiều năm. Thân gỗ, cây bụi hay dây leo hiếm gặp 3. Rễ: có thể phù lên thành củ, nhƣng chất dự trữ ở cây không phải là tinh bột mà là inulin (Thƣợc dƣợc) 3. Lá: Hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thƣờng mọc đối hay tụ thành hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai. Thông thƣờng phiến lá nguyên, xẻ sâu; lá kép hình lông chim hay hình chân vịt hiếm gặp 3. Cụm hoa: đầu, có thể mang rất nhiều hoa hay ít hoa. Đầu có thể đứng riêng lẻ hay tụ thành chùm, gié, xim, nhƣng thông thƣờng nhất là tụ thành ngù. Có thể xem hoa 2
tự đầu nhƣ một gié thu ngắn, trong đó các hoa đính theo một đƣờng xoắn ốc liên tục, hoa già ở bìa, hoa non ở giữa. Dạng thông thƣờng của hoa tự đầu là hình nón, nhƣng cũng có thể phẳng hoặc có khi lõm hình chén. Đầu mang hai loại lá bắc: Lá bắc ngoài bất thụ, tạo thành một tổng bao. Các lá bắc này có thể đính trên một hàng (Senecio, Tagetes) hoặc đính trên nhiều hàng kết hợp. Hình dạng và kích thƣớc của lá bắc ngoài rất biến thiên.Lá bắc ngoài có thể nguyên hay có răng, có gai; có những loại có màu nhƣ cánh. Lá bắc thật có mang hoa ở nách. Chúng là những phiến mỏng dẹt, đôi khi có lông. Lá bắc thật có thể phẳng hay cong xung quanh hoa; chúng có thể không có 3. Hoa: lƣỡng tính, mẫu 5, bầu dƣới, không có lá bắc con. Hoa thức theo kiểu: Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, có thể cùng cách cấu tạo, cùng chức năng. Kiểu đầu này gọi là đồng giao với toàn những hoa hình ống hoặc toàn hoa hình lƣỡi nhỏ có 5 răng hoặc đôi khi toàn hoa hình môi. Hoa tự đầu có thể gồm 2 loại hoa: Hoa đều hình ống ở giữa có nhiệm vụ sinh sản và hoa không đều hình lƣỡi nhỏ có 3 răng ở bìa, đóng vai trò của tràng để thu hút côn trùng. Kiểu đầu này gọi là dị giao 3. Bao hoa: Lá đài thƣờng giảm vì nhiệm vụ bảo vệ đã đƣợc đảm nhiệm bởi các lá bắc của tổng bao. Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn 1 gờ nhỏ, nguyên hay có thùy, gờ có thể mang những vẩy hoặc một vòng lông tơ. Sau khi thụ tinh, đài có thể phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán của quả. Tràng do cánh hoa dính, có thể đều hình ống (trƣờng hợp hoa giữa hoa giữa của các đầu dị giao) hoặc không đều có dạng lƣỡi nhỏ có 3 răng hay 5 răng hoặc hình môi 2/3 hoặc hình ống dài hơi cong 3. Bộ nhị: 5 nhị bằng nhau, đính trên tràng ống và xen kẽ với cánh hoa. Chỉ nhị rời nhau trừ tông Cynareae. Bao phấn mở dọc, hƣớng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi. Chung đới thƣờng kéo dài trên bao phấn thành phụ bộ. Ngoài ra, bao 3
phấn còn mang ở gốc những phụ bộ choãi ra tạo thành những tai thỏ, che chở cho mật hoa ở gốc vòi khỏi bị nƣớc mƣa 3. Bộ nhụy: 2 lá noãn ở vị trí trƣớc sau, tạo thành bầu dƣới 1 ô, đựng 1 noãn, đính đáy. Đĩa mật ở trên bầu. Ở hoa lƣỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật và chia thành 2 nhánh đầu nhụy (vòi không chia nhánh ở hoa bất thụ). Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dƣới những lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn. Sự thụ phấn nhờ côn trùng 3. Quả: bế, thƣờng mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông đƣợc mang bởi một cuống dài hay ngắn. Đôi khi, quả trần có móc hay có gai. Hạt không có nội nhũ; lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu (hạt Hƣớng dƣơng) 3. Cơ cấu học: Lông che chở kiểu biến thiên. Lông tiết có chân ngắn, đầu đa bào, đặt trong chỗ lõm của biểu bì. Phân họ hoa hình ống và hoa tỏa tròn có ống tiết rất nhỏ. Phân họ hoa hình ống còn có tế bào tiết tinh dầu riêng lẻ. Phân họ hoa hình lƣỡi nhỏ có ống nhựa mủ có đốt và hình mạng 3. 1.1.3. Chi Wedelia Các cây họ Cúc (Asteraceae) gồm 104 loài cây thuộc chi Wedelia. Chi đƣợc đặt theo tên của nhà thực vật học và bác sĩ ngƣời Đức tên Georg Wolfgang Wedel (1645-1721) 37. Thân: cỏ sống lâu năm. Thân thẳng đứng hoặc bò lan trên mặt đất, phân cành nhánh 37. Lá: mọc đối, hiếm khi so le, viền nguyên hoặc răng cƣa 37. Cụm hoa: đầu, ở tận cùng hoặc nách lá, có đƣờng kính lớn hơn 1cm, đơn độc hay 2-4 cụm hợp lại, mỗi cụm hoa có cuống riêng. Cụm hoa đầu, dạng tỏa tròn, trong có 2 loại hoa; ở viền 1 hàng hoa cái; ở giữa là hoa lƣỡng tính, hiếm gặp hoa đực riêng 37. Lá bắc: ở tổng bao 2-3 hàng, xếp lợp thành hình bán cầu hoặc hình chuông 37. 4
Đế hoa: lồi, có vảy 37. Tràng hoa: ở viền dạng lƣỡi nhỏ, ống tràng rất ngắn, phiến lƣỡi phía đầu có 2-3 răng, màu vàng tƣơi; hoa ở giữa có tràng hình ống, đầu loe dạng chuông có 5 thùy màu vàng sẫm 37. Bao phấn: thƣờng màu nâu, đỉnh nhọn, gốc tù 37. Quả: đóng hình trứng, ít nhiều bị ép, quả đóng của hoa ở viền có 3 góc; còn của hoa ở giữa có 4 góc; đỉnh quả có vảy hoặc 1-2 lông cứng, không mào lông 37. 1.1.4. Loài Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) Tên Việt nam: Sài đất ba thùy. Tên thƣờng gọi: Sài đất kiểng, Sơn cúc ba thùy, Cúc xuyến chi. Tên khoa học: Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 36], [38], [39. Tên đồng danh: Sphagneticola trilobata (L.) Pruski., Wedelia carnosa Wedelia paludosa DC. 41. 1.1.4.1. Vị trí của cây Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) trong hệ thống phân loại thực vật Ngành Thực vật có hạt ( Spermatophyta) Phân ngành Hạt kín ( Angiospermae) Lớp Hai lá mầm ( Dicotyledonae) Bộ Cúc ( Asterales) Họ Cúc ( Asteraceae) Chi Wedelia Loài Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 40], [41. (Xem hình 1.1) 5
1.1.4.2. Mô tả thực vật Hình 1.1. Hình thái loài Wedelia trilobata (L.) Hitchc. A. Phác thảo hình thái; B. Cụm hoa dạng đầu; C. Tổng bao lá bắc; D. a. Hoa cái, b. Hoa lƣỡng tính; E. a. Lá bắc nhỏ mọc ở vòng ngoài, b. Lá bắc nhỏ mọc ở vòng trong Thân: Cây thảo sống lâu năm, dài khoảng 10 – 30cm, có thể mọc thẳng đứng cao đến 45 - 60cm, bò lan đến 1,8m. Cây thƣờng mọc thành từng mảng, dày đặc che kín mặt đất. Thân bò, màu hơi đỏ hoặc xanh, tròn, rễ mọc tại các đốt, dài 10-30cm. Phần mọc hƣớng lên có lông thô, cứng, rậm rạp, đôi khi nhẵn, không lông 41. Lá: đơn, mọc đối, dày, dài khoảng 4-9cm, rộng 2-5cm, có răng cƣa ở 2 bên thùy lá, có lông cứng và thô ở cả hai mặt lá. Hình thuôn bầu dục, nhọn đầu. Hệ gân lá cong hình cung và lông chim 41. Cụm hoa: hình đầu, mọc từ nách lá, mang hoa không đều ở vòng ngoài 41. Hoa: đơn, mọc ở nách lá, màu vàng tƣơi, nhiều cánh thành tầng, cuống hoa dài 3- 10cm, tổng bao có dạng chuông hoặc bán cầu, đầu hoa thƣờng có khoảng 8 - 13 hoa tia, cánh dài 6 -15mm, đĩa tràng hoa dài 4 - 5mm. Ra hoa quanh năm 41. 6
Quả: Quả bế có nốt sần 41. Bộ nhị: Chỉ nhị dài 1mm 41. Bộ nhụy: Bầu nhụy dài 2mm, Đầu nhụy dài 5mm, noãn đơn 41. Bao phấn: dính với nhau dài khoảng 2mm, hạt phấn màu vàng cam 41. (Xem hình 1.2) Hình 1.2. Một số bộ phận của loài Wedelia trilobata (L.) Hitchc. 1. Thân bò lan trên mặt đất; 2. Thân có nhiều lông che chở; 3. Rễ; 4. Cụm hoa; 5. a. Cụm hoa đầu, b. Cánh hoa, c. Lá bắc nhỏ, d. Hoa lƣỡng tính, e . Tổng bao lá bắc; 6. Quả. 7
1.1.4.3. Sinh thái phân bố Wedelia trilobata (L.) Hitchc. có nguồn gốc Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và Tây Ấn, đƣợc tìm thấy rộng rãi ở Bangladesh, Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Campuchia, Miến Điện, phát triển mạnh mẽ trong các thung lũng, mƣơng, đƣờng bộ ẩm ƣớt, các vùng trồng trọt, rừng tự nhiên, rừng trồng, đồng cỏ, vùng ven biển và các khu vực thành thị 41. 1.1.4.4. Bộ phận dùng Thƣờng là hoa và lá. Ở Việt Nam chủ yếu đƣợc trồng và canh tác nhƣ một cây phủ đất và cây cảnh trong các thành phố, công viên và nhà ở 40. 1.1.5. Loài Sài đất Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. Tên Việt Nam: Sài đất. Tên thƣờng gọi: Húng trám, cúc nháp, ngổ đất. Tên khoa học: Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. Tên đồng danh: Solidago chinensis Osbeck, Verbesina calendulacea L. 1.1.5.1. Vị trí loài Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr) trong hệ thống phân loại thực vật Ngành Thực vật bậc cao (Tracheophyta) Lớp Hai lá mầm ( Magnoliopsida) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae) Chi Wedelia Loài Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) 25. (Xem hình 1.3) 8
1.1.5.2. Mô tả thực vật Hình 1.3. Hình thái loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. A. Cành con; B. Hoa con tỏa tia; C. Hoa con mọc trên đĩa; D. Nhụy hoa; E. Bầu nhụy Thân: thảo sống lâu năm, thân bò, gần nhƣ thẳng đứng, có lông thƣa 2], [6. Lá: mọc đối, có cuống ngắn 1-3mm. Phiến hình mác rộng, dài 3-7cm, rộng 1-2cm. Đỉnh nhọn hoặc tù, mép nguyên hoặc có 1-3 đôi răng cƣa. Hai mặt đều có lông mịn 9
ngắn. Mặt trên gân chính rõ. Mặt dƣới hơi lồi. Gân bên 1-2 đôi, đƣờng kính 15- 20mm, cao 10mm 2], [6. Cụm hoa: Đế cụm hoa hơi lồi 2], [6. Cụm cuống hoa: Dài 3-10cm, có lông thô ngắn, mọc đơn độc ở đỉnh thân hoặc ở nách lá 2], [6. Hoa: Đế cụm hoa hơi lồi mang hai loại hoa, màu vàng tƣơi, đƣợc bao bọc bởi vòng tổng bao lá bắc gồm 2 hàng xếp xen kẽ. Mỗi hoa có 1 lá bắc nhỏ đi kèm. Bầu dƣới 5 lá đài 2], [6. Hoa cái: tràng hoa hình lƣỡi nhỏ gồm 2 phần: Phần ống dài 1-1,5mm và phần lƣỡi nhỏ dài 8-9mm, rộng 4mm, đỉnh tù, có 2-3 răng, khía sâu 1mm. Có từ 12-18 hoa cái trên đầu 2], [6. Hoa lƣỡng tính: tràng hoa hình ống loa dần lên phía trên, dài 5mm, phần rộng nhất 1,2mm. Phần trên cùng chia 5 thùy có đỉnh tù hoặc gần tròn. Phần dƣới ống tràng nối với bầu thu nhỏ lại dài khoảng 1mm 2], [6. Quả: Quả bế, có răng dạng mào lông ở đỉnh 2], [6. Bộ nhị: 5 nhị, chỉ nhị đính vào ống tràng, rời nhau 2], [6. Bộ nhụy: 2 noãn, bầu dƣới 1 ô, đính noãn gốc, một vòi nhụy, núm nhụy chia thành 2 nhánh 2], [6. Bao phấn: Dính vào nhau thành 1 ống bao quanh thành 1 ống bao quanh bộ nhụy. Bao phấn đính gốc, dài 2mm, đỉnh tròn. Trung đới kéo dài trên bao phấn thành một phần phụ 2], [6. (Xem hình 1.4) 10
Hình 1.4. Một số bộ phận loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr. a. Thân; b. Cụm hoa; c. Hoa đơn tính; d. Hoa lƣỡng tính; e. Quả 1.1.5.3. Sinh thái và phân bố Mọc ở các trảng cỏ, nƣơng rẫy bỏ hoang, đất trồng nơi ẩm ƣớt, từ vùng thấp lên đến độ cao 1000m. Thƣờng đƣợc trồng làm thuốc. Trồng nơi đất tốt hơi ẩm, chọn những đoạn thân có rễ vùi xuống đất 2-3cm, sau nửa tháng lại thu hoạch đợt nữa. Ra hoa quả từ tháng 3 đến đầu tháng 10 2. 1.1.5.4. Bộ phận dùng Toàn cây. Thu hái cây gần nhƣ quanh năm, chủ yếu vào mùa hè thu, lúc cây đang ra hoa, mang về rửa sạch, dùng tƣơi hay phơi khô 2. 11
1.2. Tổng quan thành phần hóa học 1.2.1. Tổng quan thành phần hóa học Sài đất ba thùy Năm 1981, tác giả Bohlman và cộng sự 15 đã ly trích từ cây Sài đất ba thùy đƣợc 6 hợp chất eudesmanolid mới: (Xem hình 1, 4, 5, 8, 9, 10) và một vài dẫn xuất acid ent-kaurenic: - acid 3α-tigloyloxykaur-16-en-19-oic, - acid 3α-angeloyloxykaur-16-en-19-oic, - acid 3α-cinamoyloxykaur-16-en-19-oic, - acid 3α- angeloyloxykaur-9β-hydroxy-16-en-19-oic, - acid 3α-cinamoyloxykaur-16-en-19-oic. Năm 2000, tác giả Koheil M. A. và cộng sự [24] đã khảo sát thành phần tinh dầu của hoa Wedelia trilobata bằng GC-MS. Kết quả cho thấy thành phần của tinh dầu gồm 48 chất trong đó thành phần chính là: Bảng 1.1. Thành phần chính tìm thấy trong tinh dầu hoa Sài đất ba thuỳ Thành phần % hàm lƣợng β-phellandren 25,65% limonen 8,93% γ-terpinen 5,90% trans-β-caryophyllen 4,83% α-pinen 4,72% Năm 2004, tác giả Zhang Yuhu [34] phân lập đƣợc 6 sesquiterpen từ cây Wedelia trilobata: (Xem hình 1, 3); hỗn hợp gồm hai hợp chất là 1β,9α-diacetyloxy-4α- hydroxy-6β-isobutyryloxyprostatolid hay wedeliatrilolacton B (Xem hình 2, 4, 6, 7). 12
Năm 2005, tác giả Nirmal và cộng sự [29] đã khảo sát thành phần hóa học tinh dầu của lá Wedelia trilobata bằng GC-MS. Kết quả cho thấy tinh dầu chứa 14 hợp chất, trong đó α-pinen; germacren D và d-limonen chiếm đến 85,52%. Năm 2006, tác giả Nguyễn Thanh Hoàng và cộng sự [21] đã cô lập từ lá của Wedelia trilobata đƣợc 3 hợp chất: friedelan-3β-ol (Xem hình 15); β-amyrin acetat (Xem hình 16) và acid 3α-tigloyloxykaur-16-en-19-oic (Xem hình 13). Năm 2007, tác giả Phan Toan Duc và cộng sự [31] đã phân lập từ lá Wedelia trilobata đƣợc 2 sesquiterpen lacton mới: wedelolid A (Xem hình 11) và wedelolid B (Xem hình 12). Hai hợp chất trên là minh họa đầu tiên cho một cấu trúc chƣa từng đƣợc biết đến, sesquiterpen δ-lacton mới, (9R)-eudesman-9-12-olid. 1.2.2. Tổng quan thành phần hóa học Sài đất Năm 1986, tác giả Yang Ling Ling 33 đã cô lập từ Wedelia chinensis đƣợc acid kaur-16-en-19-oic (Xem hình 14) và stigmasterol glucosid (Xem hình 17). Năm 2002, tác giả Apers Sandra và cộng sự 11 đã cô lập từ cây thuốc Wedelia chinensis ở Trung Quốc đƣợc - acid 3,5-dicaffeoylquinic (Xem hình 21). - acid 3,4-dicaffeoylquinic (Xem hình 22). - 2,3,4-trihydroxyphenyletyl-O-[β-apiofuranosyl-(1→4)-α-rhamnopyranosyl- (1→3)]-(4-O-caffeoyl)-β-glucopyranosid hay wedelosin (Xem hình 23). Cùng lúc phân lập đƣợc ba flavonoid glycosid là: - 3-O-β-glucopyranosylkaempferol hay astragalin (Xem hình 18). - 3-O-β-apiofuranosyl-(1-2)-β-glucopyranosylkaempferol (Xem hình 19). - 3-O-β-glucopyranosylquercetin (Xem hình 20). Cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc từ các loài Wedelia trilobata (L.) Hitch và Wedelia chinensis (Obs.) Merr đƣợc trình bày nhƣ sau : 13
SESQUITERPEN 14
DITERPEN TRITERPEN STEROL 15
FLAVON DẪN XUẤT CỦA ACID CAFFEIC 16
1.3. Tác dụng dƣợc lý 1.3.1. Tác dụng dƣợc lý của loài Sài đất ba thùy Chống oxi – hóa Đƣợc đánh giá trên dịch chiết methanol ở hoa của W.trilobata. Các tính chất chống oxy hóa đƣợc đánh giá bởi 1,1 diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) và axit 2,2'- azino-bis 3-thylbenzthiazolin-6-sulphonic (ABTS). Chiết xuất methanol so với acid ascorbic chuẩn cho thấy hoạt tính chống oxy hoá với giá trị IC50 là 90 μg / ml và 60 μg / ml 17. Chống đái tháo đƣờng Dịch chiết nƣớc của W.trilobata làm giảm sự kích thích streptozotocin có tác dụng làm tăng đƣờng huyết khi thử nghiệm trên chuột. Những con chuột bạch đực đƣợc gây kích thích tăng đƣờng huyết bằng streptozotocin với liều (45mg/kg, IV), sau đó đƣợc điều trị bằng cách cho uống với W.trilobata liều (50mg/kg). Thử nghiệm cho thấy, chuột đã giảm nồng độ glucose trong máu và cân nặng đƣợc cải thiện. Ngƣợc lại, W. trilobata cũng làm giảm mức độ cao các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi hóa lipid phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS test) quan sát thấy ở gan, thận, tinh hoàn cũng nhƣ triglyceride huyết thanh cao, ALT và AST ở các con chuột bị bệnh tiểu đƣờng. Rungprom et al. 2010 đã chứng minh rằng chiết xuất methanol của W.trilobata đƣợc tìm thấy là chất ức chế alpha-glucosidase mạnh so với thuốc đích thực Acarbose® 23. Tác động ức chế hệ thần kinh trung ƣơng (CNS) Hoạt động ức chế thần kinh trung ƣơng đƣợc nghiên cứu ở lá W.trilobata. Dịch chiết ete dầu mỏ, chloroform, ethyl acetate và chiết xuất methanol của lá của W. trilobata (30mg / kg) kết hợp với sử dụng pentobarbitone đánh giá trên thời gian ngủ và hoạt động di chuyển ở chuột. Chiết xuất ete dầu mỏ làm tăng nồng độ Natri pentobarbitone ở chuột so với các chiết xuất khác. Các động vật đƣợc dùng chiết xuất ete dầu mỏ cho thấy giảm hoạt động vận động cao hơn đáng kể so với các thuốc diazepam điển hình và các loại chiết xuất khác 32. 17
Chống ký sinh trùng Ở Venezuela, hiệu quả của acid kaurenic chiết xuất từ W.trilobata (Asteracea) chống lại Leishmania (Viannia) braziliensis (ký sinh trùng gây bệnh ở da và niêm mạc mà trung gian truyền bệnh là Phlebotomus - một loại muỗi cát rất nhỏ). Kaurenic acid (ent-kaur-16-in-19-oic) đƣợc phân lập từ cây W. trilobata đã đƣợc đánh giá trên ký sinh trùng Leishmania (V) braziliensis cả trong cơ thể và in vitro. Hợp chất có một tác dụng gây chết đối với dạng amastigote (Dạng amastigotes: là những tế bào nhỏ hình cầu, không roi, đƣờng kính từ 2 - 4 μm, gặp trong tế bào của hệ võng mô, các đơn bào, tổ chức ở da, niêm mạc hoặc ở các cơ quan nội tạng (gan, lách, tủy xƣơng) của ký chủ có xƣơng sống (bao gồm con ngƣời) và trong nuôi cấy tế bào.) và dạng promastigotes (Dạng promastigotes: là những tế bào thon dài, mỏng, có roi, kích thƣớc từ 5 - 14μm x 1,5 - 3,5μm, là dạng gây nhiễm, gặp ở trung gian truyền bệnh và trong môi trƣờng nuôi cấy) với LD50 là 0,25 và 0,78g / ml trong 24 giờ 16. Kháng khuẩn – kháng nấm W.trilobata đƣợc sử dụng trong y học dân gian. Cây cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và các thành phần hóa học kháng ung thƣ. Hoa, lá và thân W.trilobata đã đƣợc chiết 10 lần với cồn ethyl. Dịch chiết sau đó đƣợc lắc phân bố với n-Hexane, ethyl acetate, n-butyl rƣợu và nƣớc để đánh giá các hoạt động chống vi khuẩn. Kết quả cho thấy hầu hết các chiết xuất đều có các hoạt động kháng khuẩn ngoại trừ các dịch chiết nƣớc từ hoa. Chiết xuất ethyl acetat là hiệu quả nhất trong số tất cả các chiết xuất 35. Làm lành vết thƣơng Hoạt động làm lành vết thƣơng đƣợc khảo sát trên 2 hợp chất ent-kaura-9 (11), axit 16-dien-19-oic đƣợc phân lập từ lá W.trilobata. Dịch chiết ethanol của lá W. trilobata đã đƣợc phân lập trên sắc ký cột thu đƣợc các phân đoạn Hexane, ethyl acetate (WEA) và chloroform: methanol (50:50) (WCM) . Các phân đoạn đƣợc thử nghiệm bằng cách sử dụng phƣơng pháp in-vitro có liên quan chữa lành vết thƣơng. 18
WEA (3g / mL) tăng cƣờng khả năng sống sót của nguyên bào sợi L929 lên đến trên 90% trƣớc và trên 85% sau khi dùng hydrogen peroxit gây mất cân bằng oxy hóa. Các acid ent-kaura-9 (11), 16-dien-19-oic cô lập từ lá W.trilobata có tác dụng chữa lành vết thƣơng do là hợp chất kháng khuẩn, kích thích tăng trƣởng nguyên bào sợi và bảo vệ các tế bào thƣơng tích gây ra bởi peroxit. Các ent-kaura-9 (11),16-dien-19-oic acid (2,5-0,08g / ml) đã làm tăng sự sống sót của tế bào nguyên bào sợi chuột L929 từ 97-117% và bảo vệ tế bào nguyên bào sợi L929 chống lại sự mất cân bằng oxy hóa gây ra bởi hydrogen peroxide (94-80%) 12. Kháng viêm Axit kaurenoic từ W.trilobata có tác dụng kháng viêm: ảnh hƣởng đến việc sản sinh cytokine và kích hoạt enzyme NO- cGMP kinase G-ATP nhạy cảm kênh K+ truyền tín hiệu. Axit kaurenoic [ent-kaur-16-en-19-oic acid] (1) là một diterpen có trong một số cây bao gồm W.trilobata. Các tài liệu nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng viêm mà hiệu quả của nó là ức chế phản ứng quằn quại gây ra bởi acid acetic ở chuột. Điều trị bằng đƣờng uống với (1) cũng ức chế rõ ràng cảm giác đau thụ thể. Hợp chất (1) cũng ức chế cấp tính carrageenin (chất xơ hoà tan trong nƣớc, đƣợc tìm thấy trong nhiều loại rong biển) và PGE (2) - khởi phát và mãn tính CFA gây tăng đau cơ quá mẫn. Về mặt cơ học, (1) ức chế sự sản sinh các cytokine tăng đau (TNF-α và IL-1β) 28. Tác động giảm đau Nghiên cứu so sánh về hoạt tính giảm đau từ chiết xuất ethanol của: W.trilobata (EEWT), Wedelia biflora (Melanthera biflora) (EEWB) và Eclipta alba (EEEA) đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp dùng acid acetic gây đau ở chuột. Ngƣời ta phát hiện ra rằng các chiết xuất ức chế về phản ứng đau gây ra bởi acid acetic phụ thuộc liều. Liều 500mg / kg EEWT, EEWB, EEEA và Aspirin có thể ngăn chặn đáp ứng nghiến răng. Kết quả phản ánh hiệu quả giảm đau và hiệu quả điều trị của chiết xuất trên mô hình động vật tƣơng đƣơng với các thuốc chuẩn nhƣ aspirin và morphine 26. 19
1.3.2. Tác dụng dƣợc lý của loài Sài đất: Bảo vệ tế bào gan Linn SC và cộng sự (1994) nghiên cứu ảnh hƣởng của chiết xuất W.chinensis lên gan bằng cách gây độc cho gan sử dụng ba độc tố gan: CCl4 và acetaminophen và dextro-galactosamine ở chuột. Kết luận cho thấy W.chinensis có tác dụng bảo vệ gan, chống lại các tổn thƣơng gan 25. Murugain P và cộng sự (2008) đã nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan từ chiết xuất ethanol chống lại CCl4 gây nhiễm độc gan ở chuột. Việc điều trị bằng chiết xuất ethanol cho thấy giảm liều phụ thuộc các hoạt động của enzyme mà CCl4 gây ra nồng độ cao trong huyết thanh song song với sự gia tăng tổng số protein và bilirubin cho thấy chiết xuất bảo tồn trạng thái chức năng bình thƣờng của gan 25. Mishra G và cộng sự (2009) đã nghiên cứu hoạt tính bảo vệ tế bào gan từ chiết xuất cồn và nƣớc của W.chinensis. Quan sát thấy rằng các chiết xuất cồn ở mức liều 500µg /kg cho thấy có tác dụng nhiều và mạnh hơn so với chiết xuất nƣớc 25. Wagner H và cộng sự (1986) nghiên cứu dịch chiết ethyl acetat của W.chinensis có biểu hiện kháng độc trong thử nghiệm sử dụng CCl4, Gain, và Phaloidin gây độc tính trên tế bào gan ở chuột. Ngoài ra còn cho tác dụng kích thích tái tạo tế bào gan 25. Jalal A và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của W.chinensis khi dùng CCl4 gây tổn thƣơng gan ở chuột. Cho thấy các hợp chất nhƣ flavonoid, terppenoids và tanin có thể chịu trách nhiệm về bảo vệ gan 25. Chữa lành vết thƣơng Verma N và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của chiết xuất ethanol trong lá của cây W.chinensis trong vết cắt, vết mổ. Chiết xuất ethanol đã đƣợc tìm thấy có hoạt động chữa lành vết thƣơng đáng kể đƣợc chứng minh bằng sự tăng thời kỳ lên da non làm lành vết thƣơng, tăng tỷ lệ co rút vết thƣơng, độ bền da 25. 20
Chống ung thƣ Gupta M và cộng sự (2007) đã đánh giá chiết xuất methanol của W.chinensis trên hoạt động chống ung thƣ biểu mô ở chuột bạch tạng. Chiết xuất cho thấy khả năng làm tăng tuổi thọ và phục hồi các thông số huyết học của chuột mang EAC (ung thƣ biểu mô Ehrlich) đƣợc điều trị so với chuột mang EAC không đƣợc điều trị 25. SaiT CH và cộng sự (2009) nghiên cứu các tác động sinh học của chiết xuất W.chinensis trên ung thƣ tuyến tiền liệt. Kết luận rằng cơ chế chống ung thƣ của chiết xuất W.chinensis là do ba hợp chất có hoạt tính ức chế đƣờng dẫn tín hiệu thụ thể androgen 25. Kích thích miễn dịch Koul S và cộng sự (2013) nghiên cứu cơ chế điều hòa miễn dịch của chiết xuất ethanol toàn cây của W.chinensis (EEWC) và đã quan sát thấy rằng EEWC đƣờng uống ở mức liều 200 và 400 mg / kg trọng lƣợng cơ thể ức chế đáng kể phản ứng quá mẫn gây ra trong tế bào máu cừu và tăng đáng kể chỉ số thực bào 25. Tác động ức chế hệ thần kinh trung ƣơng (CNS) Suresh V và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hƣởng chiết xuất ethanol của cây W.chinensis. Thử nghiệm cho thấy chiết xuất ethanol ở liều 200 và 300 mg /kg trọng lƣợng cơ thể gây giảm đáng kể trong các hoạt động tự phát, hoạt động giãn cơ và tăng cƣờng đáng kể tác dụng phenobarbital sodium lên thời gian ngủ 25. Chống oxi hóa Manjamali và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu từ W.chinensis trên in vitro. Nó cho thấy tinh dầu có thể đƣợc đề nghị điều trị các bệnh liên quan đến các gốc tự do và để ngăn ngừa điều trị ung thƣ 25. 21
Chống stress Verma N và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của chiết xuất ethanol của lá W.chinensis lên sự căng thẳng gây ra thay đổi chất dẫn truyền thần kinh não và tỉ lệ các enzyme mono amin oxidase ở chuột albino 25. An thần Prakash T và cộng sự (2008) đã nghiên cứu các hoạt động hƣớng thần của dịch chiết methanol và nƣớc từ thân cây W.chinensis trên chuột. Chiết xuất nƣớc và methanol kéo dài thời gian gây ngủ của pentobarbital và làm giảm hoạt động thần kinh vận động tự phát (SMA). Nó cũng cho thấy sự kéo dài của giai đoạn khởi phát co giật. Kết luận còn cho thấy chiết xuất có chứa một tác nhân tự nhiên có thể có tác dụng an thần 25. Chống loãng xƣơng Shirwaikar A và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về tác dụng chống loãng xƣơng của chiết xuất ethanol W.chinensis trong mô hình chuột bị loãng xƣơng. Kết luận rằng chiết xuất methanol có tác dụng bảo vệ nhất định 25. Ức chế sản xuất androgen Lin FM và cộng sự (2007) đã phát hiện rằng các hợp chất từ W.chinensis có tác dụng ức chế hoạt động androgen – yếu tố tăng trƣởng trong các tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt. Nó cho thấy rằng tác dụng hiệp đồng của các hợp chất hoạt động trong W.chinensis chứng minh tiềm năng trong việc phòng ngừa và điều trị ung thƣ tuyến tiền liệt 25. Chống co giật Mishra G và cộng sự (2011) đã tìm thấy chiết xuất ethanol và nƣớc của toàn cây của W.chinensis tại liều lƣợng 250, 500, 750 mg/kg trọng lƣợng cơ thể chuột đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp MES và PTZ. Kết luận rằng chiết xuất W.chinensis có thể có hoạt tính chống co giật 25. 22
Chống loét và bảo vệ niêm mạc Hedge DA và cộng sự (1994) nghiên cứu tác nhân bảo vệ chống loét và bảo vệ niêm mạc. Tác động chống loét dạ dày và hiệu quả chữa bệnh loét từ dịch chiết ethanol và nƣớc từ lá khô W.chinensis đã đƣợc tìm thấy là có ý nghĩa. Tác dụng của dịch chiết nƣớc rõ rệt hơn dịch chiết ethanol 25. Kháng khuẩn – kháng nấm Manjamalai A và cộng sự (2011) đánh giá tác dụng kháng nấm và chống viêm trên chiết xuất methanol của lá W.chinensis 25. Rehana Banu và Nagrajan N (2010) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của lá W. chinensis chống lại 15 (Vi khuẩn Gram+ và Gram-) và 5 loại nấm bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa. Tính nhạy cảm của vi khuẩn thử nghiệm phụ thuộc vào dung môi đƣợc sử dụng để chiết xuất. Quan sát thấy rằng chiết xuất methanol cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Hầu hết các vi khuẩn Gram dƣơng nhạy cảm là các loài Streptococcus, hoạt tính kháng nấm đã đƣợc thử nghiệm với Candida albicans trong chiết xuất methanol 25. Manjamalai A và cộng sự (2010) đã nghiên cứu các thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của một số cây dƣợc liệu trong đó có dịch chiết ethanol của W.chinensis. Hoạt tính kháng khuẩn đã đƣợc đánh giá chống lại các chủng vi khuẩn khác nhau bằng cách đo nồng độ ức chế tối thiểu và vùng ức chế 25. Giảm đau, kháng viêm Wagner H và cộng sự (1984) đã nghiên cứu rằng Wedelolactone tìm thấy có 5 cơ chế ức chế lipoxygenase và caspase. Nghiên cứu khẳng định rằng W.chinensis có tác dụng giảm đau mạnh, kháng viêm và hiệu quả điều trị của chiết xuất W.chinensis trên các mô hình động vật có thể so sánh với các thuốc chuẩn nhƣ Morphine, Aspirin và Indomethacine 25. 23
1.4. Chế phẩm 1.4.1. Chế phẩm của Sài đất ba thùy Vẫn chƣa tìm thấy chế phẩm trên thị trƣờng. 1.4.2. Chế phẩm của Sài đất Nhờ tác dụng chữa mụn nhọt, rôm sảy, thanh nhiệt, giải độc mà Sài đất đƣợc dùng bào chế một số dạng dƣợc phẩm nhƣ: bột tắm, sữa tắm thảo dƣợc cho trẻ em, thuốc thanh nhiệt, giải độc gan . Một số chế phẩm tìm thấy ở Việt Nam đƣợc trình bày ở hình 1.5 Hình 1.5. Một số chế phẩm từ Sài đất đã có mặt trên thị trƣờng Việt Nam 24
1.5. Tổng quan các loài vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 1.5.1. Staphylococus aureus Staphylococus aureus thuộc nhóm vi khuẩn tụ cầu, Gram dƣơng thƣờng sống ký sinh trên da, lỗ mũi và đƣờng hô hấp trên của ngƣời. Staphylococus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng có đƣờng kính từ 0,8 – 1,0 μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram+, không có lông và nha bào, thƣờng không có vỏ [8]. (Xem hình 1.6) Hình 1.6. Hình dạng loài Staphylococus aureus Tụ cầu vàng gây bệnh cho ngƣời suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau nhƣ: Nhiễm khuẩn ngoài da do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dƣới da, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu [8]. 1.5.2. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa còn gọi là trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Gram âm, thẳng hoặc hơi cong nhƣng không xoắn, hai đầu tròn. Kích thƣớc từ 0,5 – 1,0 μm x 1,5 – 5,0 μm. Có một lông duy nhất ở một cực. Các pili của trực khuẩn mủ xanh dài khoảng 6 nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp cho vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ. Trực khuẩn mủ xanh không sinh nha bào. Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 44oC), nhƣng tối ƣu ở 35oC. Trong môi trƣờng đặc có thể gặp hai loại khuẩn 25
lạc một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên và một loại khác thì xù xì [8]. (Xem hình 1.7) Hình 1.7. Hình dạng loài Pseudomonas aeruginosa Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện. Khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị mắc các bệnh ác tính hoặc mạn tính, dùng lâu dài corticoid, thì dễ mắc bệnh nhiễm trùng nội sinh hoặc ngoại sinh do trực khuẩn mủ xanh. Trực khuẩn mủ xanh có ở khắp nơi trong bệnh viện: Ống thông khí, máy hô hấp nhân tạo, máy hút ẩm, Trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng là hai vi khuẩn thƣờng gặp nhất trong nhiễm trùng bệnh viện. Trực khuẩn mủ xanh từ môi trƣờng bên ngoài xâm nhập vào cơ thể qua các vết thƣơng hở (nhất là vết bỏng). Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ, nếu cơ thể suy giảm sức đề kháng, chúng có thể xâm nhập vào và gây viêm các phủ tạng hoặc gây bệnh toàn thân [8]. 1.5.3. Escherichia coli E.coli thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterobacteriaceae) là trực khuẩn Gram âm, hiếu kỵ khí tùy tiện. Kích thƣớc trung bình từ 2 – 3 μm x 0,5 μm, trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ nhƣ trong môi trƣờng có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài nhƣ sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhƣng hầu hết có lông và có khả năng di động. E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ từ 5 – 40oC. Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút [8]. (Xem hình 1.8) 26
Hình 1.8. Hình dạng loài Escherichia coli Trong đƣờng tiêu hóa E. coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí. Nhƣng E.coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng mật, đứng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thƣơng [8]. 1.5.4. Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn này có nhiều hình thể, có khi nhƣ cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào [8]. (Xem hình 1.9) Hình 1.9. Hình dạng loài Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae là loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Những “nhiễm trùng cơ hội” xảy ra chủ yếu ở môi trƣờng bệnh viện và trên những bệnh nhân bị suy kiệt, 27
suy giảm miễn dịch. Các thủ thuật nhƣ nội soi, thông tim đƣợc phát triển và áp dụng ngày càng nhiều trong các bệnh viện. Klebsiella pneumoniae có thể gây ra: Nhiễm trùng đƣờng hô hấp dƣới nhƣ viêm phổi, viêm phế quản phổi thứ phát sau cúm, sau sởi, sau ho gà hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp (đang dùng máy hô hấp nhân tạo). Nhiễm trùng máu: Thƣờng gặp ở những bệnh nhân bị suy kiệt nhƣ xơ gan, ung thƣ máu, suy tủy Ngoài ra còn có thể gây nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, đƣờng mật hoặc đƣờng sinh dục, viêm màng não, viêm tai, viêm xoang và viêm nội tâm mạc [8]. 1.5.5. Candida tropicalis Nấm men Candida spp. có hình tròn hay hình bầu dục, sinh sản bằng cách nảy chồi hay cho sợi tơ nấm giả và bào tử bao dầy. Candida tropicalis là thành viên của hệ vi sinh vật ở da và niêm mạc, thƣờng sống vô hại ở màng nhầy (miệng, ruột, âm đạo) của ngƣời và động vật máu nóng và không thƣờng xuyên ở trên da ở dạng đơn bào [7]. (Xem hình 1.10) Hình 1.10. Hình dạng loài Candida tropicalis Ở những điều kiện nhất định, nấm men phân hóa thành dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, tăng trƣởng không kiểm soát và gây những bệnh “nhiễm nấm men” khá nghiêm trọng. Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan sâu gây nhiễm trùng huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm. Khả năng tồn tại ở hai dạng hình thái là tế bào và sợi giúp loài này nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và khó bị tiêu diệt [7]. 28
Chƣơng 2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu - Sài đất đƣợc thu hái tại ĐH Y Dƣợc TP.HCM. - Sài đất ba thùy đƣợc thu hái trên đƣờng Nguyễn Hữu Thọ, Quận 7, TP.HCM. 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị, dung môi Các dụng cụ thí nghiệm thƣờng quy (bình nón, bình lắng gạn, cốc có mỏ, pipet, chén sứ ) Dung môi methanol (MeOH) của hãng Merck, dung môi chloroform của VN- chemsol và một số dung môi hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích. Trang thiết bị: - Tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cô quay IKA RV10 - Kính hiển vi OPTIKA (Ý) - Đèn UV Spectroline Model CM – 10A (Mỹ) - Bếp cách thủy Memmert (Đức) - Lò hấp vô trùng Hiyayma HV-110 - Tủ cấy vô trùng ESCO AVC-4D1 - Máy lắc ổn nhiệt IKA KS 4000i control - Máy siêu âm Elmasonic S120 - Tủ ấm Memmert INB-5000 - Tủ âm SANYO SR-U19JN - Tủ lạnh SANYO SR- U19JN - Cân kỹ thuật Sartorius TE412 - Máy vortex Labnet SO200-23V-EU - Máy đo quang Gene Quant 1300. 29
2.1.3. Vi sinh vật thử nghiệm Vi sinh vật thử nghiệm đƣợc cung cấp bởi bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh. 1. Escherichia coli ATCC 25922 2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 3. Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 4. Klebsiella pneumoniae NBRC 14940 5. Candida tropicalis PK12C 2.1.4. Môi trƣờng Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Sabouraud Dextrose Broth (SDB) Peptone casein 10 g Polypeptone 10 g Glucose 20 g Dextrone 40 g Agar 15 g Nƣớc cất 1 lít Nƣớc cất 1 lít Tryptic Soy Agar (TSA) Tryptic Soy Broth (TSB) Pepton 15 g Trypticase peptone 17 g Pepton đậu nành 5 g Phytone peptone 3 g NaCl 5 g NaCl 5 g Agar 15 g K2HPO4 2,5g. Nƣớc cất 1 lít Glucose 2,5g Mueller hinton agar (MHA) Nƣớc cất 1 lít Beet extract 2 g Acid Digest của Casein 17.5 g Tinh bột 1.5 g Agar Bios Special 17 g Nƣớc cất 1 lít 30
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát vi học 2.2.1.1. Kỹ thuật thường quy với kính hiển vi a) Chọn mẫu: lá tƣơi, không quá già hoặc quá non. b) Cắt vi phẫu: cắt bằng lƣỡi lam theo phẫu thức ngang (lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt). Mẫu là lá nên lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và có một phần phiến lá ở hai bên. c) Nhuộm vi phẫu - Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-30 phút (đến khi lát cắt trở nên trắng), rửa bằng nƣớc cất nhiều lần. - Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1%-3% trong 2 phút để trung hòa Javel, rửa bằng nƣớc cất. - Ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm kép 15 phút, rửa sạch bằng nƣớc cất. - Ngâm lát cắt đã nhuộm trong nƣớc. d) Lên lame và quan sát Vi phẫu lá: quan sát hình dạng tổng quát của vi phẫu, độ lồi, lõm của gân lá, cấu tạo biểu bì, lông che chở, lông tiết, cấu tạo bó libe-gỗ của gân chính và gân phụ Xem tầng cutin dày hay mỏng, mô mềm giậu có một tầng hay nhiều tầng, phiến lá có cấu tạo đồng thể hay dị thể [5]. 2.2.1.2. Kỹ thuật sử dụng trong khảo sát bột dược liệu a) Chuẩn bị bột để soi: bột lá cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ 60oC, xay mịn (qua rây số 32). b) Cách lên tiêu bản: cho 1 giọt nƣớc cất vào giữa phiến kính, dùng que sạch trộn đều bột, lấy 1 ít bột cho vào giữa giọt nƣớc, dùng 1 góc của lá kính khuấy nhẹ và 31
đậy lá kính lại, dùng ngón trỏ di nhẹ lá kính, thấm sạch phần nƣớc thừa và mặt lá kính trƣớc khi soi kính hiển vi [5]. 2.2.1.3. Kỹ thuật tách biểu bì Dùng lá tƣơi, xé và lấy phần biểu bì trên và dƣới (mỏng, trong suốt bên ngoài), lên tiêu bản và soi kính hiển vi [5]. 2.2.2. Sơ bộ hóa thực vật 2.2.2.1. Chuẩn bị dịch chiết - Chiết dịch chiết ether: Chiết 10 – 25g bột thô lá Sài đất ba thùy bằng diethyl ether (lƣợng ether cho ngập mặt dƣợc liệu khoảng 1cm) trong một bình nón, lắc trong 10 – 20 phút ( hoặc chiết bằng sohxlet). Chiết cho tới khi dịch chiết ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ. Gộp, lọc dịch chiết và cô lại trên bếp cách thủy trong tủ hốt đến khi còn khoàng 50ml dịch chiết ether [5]. - Chiết dịch chiết cồn Bã dƣợc liệu đƣợc chiết tiếp bằng cồn cao độ trong bình nón (lƣợng cồn cho ngập mặt dƣợc liệu khoảng 1cm), đun với sinh hàn hồi lƣu 20 -30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 2 -3 lần. Gộp, lọc dịch chiết và cô cách thủy đến còn khoảng 50ml [5]. - Chiết dịch chiết nƣớc Bã dƣợc liệu sau khi đƣợc chiết bằng cồn, đƣợc chiết nóng với nƣớc (lƣợng nƣớc cho ngập mặt dƣợc liệu khoảng 1cm) trong bình nón, trên bếp cách thủy sôi trong 10 phút, thực hiện 2-3 lần. Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc (cô lại nếu cần) để thu đƣợc 50ml dịch chiết [5]. 32
3.2.2.2. Sơ đồ chiết xuất Quy trình chiết xuất bên dƣới đƣợc tham khảo từ tài liệu [5]. Bột lá 10-25g Chiết với Diethyl ether Lắc liên tục trong bình nón 15’ Phân tích thành phần Bã dƣợc liệu Dịch chiết ether hóa học Chiết với Ethanol 96o Đun hồi lƣu 30’, lắc đều, làm 2 lần Phân tích thành phần Bã dƣợc liệu Dịch chiết cồn hóa học Chiết Nƣớc Cách thủy 30’, làm 2 lần Phân tích thành phần Dịch chiết nƣớc Bã dƣợc liệu hóa học Hình 2.1. Sơ đồ và quy trình sơ bộ hóa thành phần hóa học lá Sài đất ba thùy 33
Quy trình dƣới tham khảo tài liệu [5] Dịch chiết ether Nhỏ Bốc hơi Bốc hơi Bốc hơi chén sứ Bốc hơi đến Bốc hơi đến Phản ứng Bốc hơi lên đến cắn. chén sứ đến đến cắn. Làm phản cắn, hòa tan cắn, cho tác Borntrager đến cắn. giấy Có mùi cắn ứng Liebermann- trong nƣớc dụng với Hòa tan lọc. thơm, Burchard acid, cho kiềm, soi trong Đợi thêm vài phản ứng với trong UV365 cồn. Làm bay giọt cồn, thuốc thử phản ứng hơi bốc hơi chung cyanidin ether hết cồn alkaloid Có Cắn Thuốc thử Acid Lớp phân Có tủa Tăng Dung dịch Có vết có Carr- sulfuric cách có cƣờng độ kiềm có màu đỏ mờ mùi Price: cắn đặc: cắn màu đỏ nâu phát quang màu đỏ thơm màu xanh màu lục và vòng khi soi UV chuyển chuyển màu lục/tím sang đỏ xanh dƣơng khuếch tán đậm lên u ầ tbéo ấ Alkaloid Ch Tinh d Tinh Flavonoid Coumarin Carotenoid Triterpenoid Anthraquinon Hình 2.2. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết ether 34
Quy trình dƣới tham khảo tài liệu [5]. Dịch chiết cồn Bốc hơi Bốc hơi Làm Đun Thêm vài Phản ứng Bốc hơi Phản Thêm đến cắn, đến cắn. phản cách giọt HCl với dung tới cắn. ứng với một ít hòa trong Cho tác ứng thủy 10 10% và dịch FeCl3 Hòa thuốc tinh thể nƣớc dụng cyanidin phút với KOH và dung trong thử Na2CO3 acid. Phản với HCl 10% dịch gelatin nƣớc, Fehling ứng với kiềm, 10% muối lắc thuốc thử soi mạnh chung UV365 alkaloid Có tủa Tăng cƣờng Có Có Đỏ với Xanh rêu – Có bọt Có tủa đỏ Có bọt độ phát màu màu dung dịch xanh đen bền trên gạch khí quang đỏ đỏ acid. Xanh với FeCl3, 15 phút bay với dung tủa bông lên dịch kiềm với gelatin muối ử pyron - u cơ u tkh  ữ ấ - p ch p Tannin Saponin Anthocyanidin Alkaloid ợ Coumarin Acid h Acid - H Proanthocyanidin - Flavonoid Flavonoid Flav. Fla Hình 2.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết cồn 35
Quy trình dƣới tham khảo tài liệu [5]. Dịch chiết nƣớc Bốc hơi Bốc hơi Pha loãng Đun Thêm Phản ứng Bốc hơi Phản Thêm đến cắn, đến cắn. trong 5 cách vài giọt với dung tới cắn. ứng một ít hòa trong Hòa lại thể tích thủy 10 HCl dịch FeCl3 Hòa trong với tinh thể nƣớc acid. trong cồn cồn 95% phút với 10% và và dung nƣớc, lắc thuốc Na2CO3 Phản ứng 25%. Làm hay HCl KOH dịch mạnh thử với thuốc phản ứng aceton 10% 10% gelatin Fehling thử chung cyanidin muối alkaloid Có tủa Có màu Có tủa Có Đỏ với Xanh rêu – Có bọt Có tủa Có bọt đỏ bông màu dung dịch xanh đen bền đỏ gạch khí bay trắng đỏ acid. Xanh với FeCl3, trên 15 lên với dung tủa bông phút dịch kiềm với gelatin muối ử pyron - u cơ u  tkh ữ ấ - Tannin p ch p Saponin Anthocyanidin Alkaloid ợ Polyuronid - Acid h Acid H Proanthocyanidin - Flavonoid Flavonoid Flav. Fla Hình 2.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nƣớc 36
2.2.3. Kiểm nghiệm vi sinh 2.2.3.1. Chuẩn bị cao chiết Mẫu lá Sài đất ba thùy không sâu bệnh đƣợc thu hái trên đƣờng Nguyễn Hữu Thọ, Quận 7, TP.HCM. Mẫu cây đƣợc rửa sạch, nhặt hết lá cho vào trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 70oC trong 6 giờ. Sau khi lá khô, xay lá thành bột thô. Cân 100g mẫu, chia thành 2 phần bằng nhau. Phần 1 chiết với 500ml methanol bằng cách đun sinh hàn hồi lƣu ở nhiệt độ 60 - 70oC trong vòng 1 giờ. Dịch chiết đƣợc đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC để thu đƣợc cao methanol. Phần 2 chiết tƣơng tự với 500ml dung môi chloroform, đem cô quay ở nhiệt độ 37oC. Cao toàn phần sau khi cô đƣợc tính hiệu suất theo công thức sau: Trong đó: H: hiệu suất chiết xuất (%) mcao: khối lượng cao sau cô quay (g) mmẫu tươi: khối lượng mẫu tươi (g) 2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm của cao methanol Sài đất ba thùy bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch a. Pha mẫu: Cân chính xác 50mg cao chiết methanol cho vào eppendoff, hòa tan trong 1ml dung môi DMSO 10%. Thực hiện tƣơng tự với cao chloroform [27]. b. Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trƣờng MHA đƣợc nấu chảy và đổ hộp sao cho có đƣợc lớp thạch dày khoảng 3 - 4 mm [27]. c. Chuẩn bị vi sinh vật: Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trƣờng thạch TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trƣờng TSB. Ủ từ 2 – 6h ở 37oC để hoạt hóa vi khuẩn. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex. Điều chỉnh dịch 37
treo bằng máy đo OD ở bƣớc sóng 600 nm về giá trị OD 0,1 (0,08 – 0,12) thì trải đều lên môi trƣờng MHA đã chuẩn bị trƣớc. Dịch nấm thực hiện tƣơng tự nhƣng với một số thay đổi nhƣ sau: môi trƣờng tăng sinh: SDA, SDB và môi trƣờng thử nghiệm: SDA. Huyền dịch vi nấm đƣợc điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 530 nm [27]. d. Tiến hành: Đĩa thạch đƣợc để khô 3 – 5 phút trƣớc khi đục các lỗ giếng đƣờng kính 6 mm với khoảng cách thích hợp trên đĩa thạch đã trải vi khuẩn. Hút chính xác 50µl dung môi methanol làm chứng âm vào giếng (1). Giếng (2): 50µl dung môi chloroform làm chứng âm cho dịch chiết chloroform. Giếng (3): 50µl DMSO 10%. Giếng (4) là chứng dƣơng với chất thử là ciprofloxacin (cip) 10 µg/giếng cho vi khuẩn và fluconazole (flu) 10 µg/giếng cho vi nấm. Giếng (5): 50µl dịch chiết methanol (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Giếng (6): 50µl dịch chiết chloroform (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Sau đó để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35 – 37oC trong 16 - 18 h đối với vi khuẩn và trong 48 giờ đối với Candida spp. Nếu vi khuẩn là MRSA thì ủ trong 24 giờ [27]. Đọc kết quả khi: - Đĩa chứng âm không ức chế sự phát triển của vi khuẩn. - Đĩa chứng dƣơng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. - Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quang lỗ có vòng kháng khuẩn [27]. Bảng 2.1. Bảng đánh giá mức độ kháng vi sinh vật Đƣờng kính vòng kháng vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật ≥ 15 Mạnh 10 – 14 Vừa < 9 Yếu 0 Không kháng 38
Chƣơng 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Mô tả dƣợc liệu Lá tƣơi Sài đất và Sài đất ba thuỳ dùng để mô tả không già quá cũng không non quá, đƣợc rửa sạch, quan sát và lập bảng so sánh giữa 2 loài. (Xem bảng 3.1) Bảng 3.1. Mô tả đặc điểm lá hai loài Sài đất Sài đất ba thùy Sài đất Lá xẻ thùy chân vịt, phiến lá xẻ 3 thùy, khía Lá mọc đối không cuống, hình sâu ½ phiến lá, dài từ 5-9cm, rộng từ 2-5cm, bầu dục, thon, dài 1,5-5 cm, rộng phiến lá không dày, có tính dai kém, đầu lá 0,8-2 cm. Mép lá thƣờng có 1- 3 nhọn, mép lá có răng cƣa đều hai bên thùy. răng to và nông. Hai mặt lá có Lá Phía cuống ngắn, dƣờng nhƣ không có. Từ lông cứng, mặt trên màu xám tƣơi cuống lá tỏa ra 3 gân chính rõ rệt. Mặt trên lục, có chấm trắng, mặt dƣới phiến lá màu xanh lục đậm, nhám, lông mọc màu nhạt hơn, có gân hơi nổi thƣa thớt, mặt dƣới xanh lục nhạt, ba gân nổi lên. rõ, lông mịn, dài mọc thƣa thớt. Bột Bột lá mịn, màu xanh xám, mùi thơm nhẹ, vị Màu lục xám, vị hơi mặn, hơi lá đắng nhẹ. đắng. A. Lá Sài đất ba thùy tƣơi B. Hình dạng lá giữa 2 loài C. Bột lá Sài đất ba thùy Hình 3.1. Đặc điểm lá giữa hai loài 39
Thân Sài đất và Sài đất ba thuỳ dùng để mô tả gồm cả thân non và thân già đƣợc rửa sạch, quan sát và lập bảng so sánh giữa 2 loài. (Xem bảng 3.2) Bảng 3.2. Mô tả đặc điểm thân cây hai loài Sài đất Sài đất ba thùy Sài đất Thân bò, dài 10 – 30cm, màu hơi đỏ hoặc xanh, Thân màu xanh, mọc bò, lan tròn, rễ mọc tại các đốt. Thân non giòn, nhiều tới đâu mọc rễ tới đó, mang Thân lông che chở mảnh mịn, thân xanh hơn. Thân lông trắng cứng nhỏ. tƣơi già dai, láng, ít hoặc không còn lông che chở, màu sẫm, các đốt mọc nhiều rễ. Bột Bột màu vàng nhạt, thô ráp, không có vị gì đặc Bột màu xanh lục, vị hơi mặn, thân biệt. có mùi thơm, dễ chịu. A. Thân non Sài đất ba thùy B. Bột thân Sài đất ba thùy C. Thân già Sài đất ba thùy D. So sánh hình dạng thân giữa 2 loài Hình 3.2. Đặc điểm thân giữa hai loài 40
Do Sài đất thu hái không có hoa nên mô tả hình thái đƣợc tham khảo từ khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ của Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền [4. (Xem bảng 3.3) Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm hoa hai loài Sài đất Sài đất ba thuỳ Sài đất Cụm hoa: dạng đầu, đƣờng kính 3-4cm, Cụm hoa: dạng đầu đƣờng kính 20-25mm, cuống cụm hoa dài 7-15cm, có lông thô, cuống cụm hoa dài 2-6cm, có lông thô, ngắn. ngắn. Tổng bao lá bắc xếp 2 tầng. Các Tổng bao lá bắc xếp 2 tầng. Các phiến tầng phiến tầng ngoài và trong tƣơng tự nhau: ngoài chất lá, màu xanh, đỉnh tù, dài khoảng chất lá màu xanh, đỉnh nhọn, dài khoảng 9mm, rộng 3,5-4mm. Các phiến tầng trong 10-12mm, rộng 3-4mm. ngắn hơn, dài khoảng 6mm, rộng 2-3mm [4. Hoa cái: dạng lƣỡi nhỏ dài 8,5-10mm, Hoa cái: dạng lƣỡi nhỏ, dài 8,5-10mm, rộng rộng 3,5-4mm, màu vàng đậm, đỉnh chia 3,5-4mm, màu vàng tƣơi, đỉnh có 2-3 răng, 3 thuỳ răng, bầu hoa cái ngắn, nhỏ. Có từ khía sâu 1mm. Có từ 12-16 hoa cái trên đầu 12-14 hoa ở viền. [4. Hoa lưỡng tính: tràng dạng ống dài 4- Hoa lưỡng tính: tràng dạng ống loa dần lên 4,5mm, đầu ống loe 5 thuỳ ngắn, có phía trên chia 5 thùy ngắn, dài 3mm. Phần trên nhiều gai nhỏ màu vàng. Có từ 40-43 cùng. Nhị 5. Có từ 30-40 hoa lƣỡng tính [4. hoa lƣỡng tính. A. Cụm hoa B. Hoa cái C. Hoa lƣỡng tính Hình 3.3. Đặc điểm hoa giữa hai loài 41
Nhận xét: Qua mô tả nhận thấy đặc trƣng quan trọng để phân biệt Sài đất và Sài đất ba thuỳ là đặc điểm về lá, trong khoá phân loại Thực vật chí của Trung Quốc và Đài Loan cũng nêu rõ sự khác biệt về lá giữa hai loài [4]. 3.2. Kiểm nghiệm vi học 3.2.1. Vi phẫu lá Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) Lá tƣơi lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và có một phần phiến lá ở hai bên. Sau khi cắt và nhuộm đƣợc kết quả vi phẫu (Xem hình 3.4) Hình 3.4. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Sài đất ba thùy 42
Mô tả Gân giữa: mặt dƣới lồi hơn mặt trên. Từ trên xuống gồm: - Biểu bì trên và biểu bì dƣới là một lớp tế bào sống, hình bầu dục hoặc gần tròn, kích thƣớc không đều. Trên biểu bì đôi khi có lông tiết, lông che chở. Lông tiết là những tế bào biểu bì mọc dài ra, mỗi lông tiết gồm 1 chân và 1 đầu kiểu đơn bào. Lông che chở dạng đa bào đầu nhọn. - Dƣới biểu bì là mô dày góc, đám mô dày góc ở biểu bì trên và dƣới đều mỏng (1- 2 lớp tế bào) là những tế bào sống, hình đa giác không đều, dày lên ở góc, sắp xếp lộn xộn. - Mô mềm khuyết có kích thƣớc không đều, hình tròn hoặc đa giác, sắp xếp để hở những khoảng lớn. Sau đó là mô mềm đạo gồm các tế bào gần tròn hoặc đa giác, sắp xếp không khít nhau mà để hở những khoảng trống nhỏ. Rải rác trong vùng này có 7-9 ống tiết ly bào tập trung đều ở mặt trên và mặt dƣới lá. - Có 5 bó libe – gỗ rời nhau xếp thành hình cung cân đối: bó ở giữa to nhất, hai bó cạnh bên nhỏ hơn, một cung libe – gỗ gồm: Gỗ 1 ở trên là những mạch gỗ hình đa giác, vách hóa gỗ, xếp thành từng dãy, mạch nhỏ ở trên, mạch lớn ở dƣới. Libe 1 gồm những tế bào nhỏ hình đa giác, sắp xếp lộn xộn, bao lấy Gỗ 1. Phiến lá: có cấu tạo dị thể. - Tế bào biểu bì trên to, hình chữ nhật và rải rác vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình đa giác và dẹt. - Mô mềm giậu: một lớp tế bào hình bầu dục hoặc hơi đa giác, ngắn, xếp khít nhau và vuông góc với biểu bì. - Mô mềm đặc (3-4 lớp): tế bào hình đa giác, vách uốn lƣợn, xếp khít nhau. (Xem chi tiết các thành phần vi phẫu hình 3.5) 43
A. Biểu bì trên, mô dày góc B. Lông che chở đa C. Lông tiết đơn bào và mô mềm khuyết bào đầu nhọn D. Mô mềm đạo và ống E. Bó libe – gỗ cấu tạo F. Mô mềm khuyết và tiết ly bào cấp 1 mô mềm đặc Hình 3.5. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất ba thùy Bóc tách biểu bì lá - Biểu bì trên: tế bào đa giác vách uốn lƣợn, không thấy lỗ khí, đôi khi gặp lông tiết hay lông che chở (Xem hình 3.6). - Biểu bì dƣới: tế bào vách uốn lƣợn, nhiều lỗ khí kiểu hỗn bào gồm 3-4 tế bào bạn không đều bao quanh lỗ khí (Xem hình 3.6). Hình 3.6. Biểu bì lá tƣơi Sài đất ba thuỳ 44
3.2.2. Vi phẫu lá Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) Lá tƣơi lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và có một phần phiến lá ở hai bên. Sau khi cắt và nhuộm đƣợc kết quả vi phẫu (Xem hình 3.7) Hình 3.7. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Sài đất 45
Mô tả Phần gân lá: - Biểu bì trên và dƣới gồm một lớp tế bào nhỏ tƣơng đối tròn, xếp đều đặn, trên biểu bì thƣờng có lông tiết chân đa bào, đầu đơn bào. - Dƣới biểu bì là mô dày góc gồm 2-3 lớp, đám mô dày ở biểu bì dƣới dày và rộng hơn đám mô dày ở biểu bì trên. - Mô mềm đặc: là những tế bào hình đa giác thành mỏng không đều nhau. - Ở giữa gân lá có một bó libe - gỗ to, có lớp libe hình cung bao dƣới bó gỗ. Trong gân lá có thể có khoảng 3 bó libe – gỗ xếp theo hình cung. Phần phiến lá: có cấu tạo dị thể - Biểu bì trên gồm 1 lớp tế bào to, hình chữ nhật và rải rác vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình đa giác và dẹt. - Mô giậu: 1 lớp tế bào hình chữ nhật to đều, xếp khít nhau. - Dƣới mô giậu là mô mềm đặc. (Xem chi tiết các thành phần vi phẫu hình 3.8) A. Lông tiết đa bào, biểu B. Mô mềm giậu C. Bó libe – gỗ bì và mô dày góc Hình 3.8. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất Sau khi đã quan sát và mô tả vi phẫu giữa hai loài. Lập bảng so sánh các thành phần có ở biểu bì, gân lá và phiến lá giữa hai loài. (Xem bảng 3.4) 46
Bảng 3.4. Bảng so sánh vi phẫu lá cây giữa 2 loài Sài đất ba thùy Sài đất Biểu bì trên và biểu bì dƣới gồm 1 lớp tế bào Biểu bì trên và dƣới gồm 1 lớp hình bầu dục hoặc gần tròn, kích thƣớc không tế bào nhỏ tƣơng đối tròn, trên đều, bên ngoài phủ lớp cutin mỏng. Trên biểu biểu bì thƣờng có lông tiết chân bì đôi khi có lông tiết, lông che chở. đa bào, đầu đơn bào. Mô dày góc ở biểu bì trên và dƣới đều mỏng Mô dày góc: gồm 2-3 lớp, đám (1-2 lớp tế bào) mô dày dƣới biểu bì dƣới dày và rộng hơn đám mô dày dƣới biểu bì trên. Phần Mô mềm khuyết có kích thƣớc không đều, Mô mềm đặc: tế bào hình đa gân hình tròn hoặc đa giác. giác thành mỏng không đều lá nhau. Mô mềm đạo gồm các tế bào gần tròn hoặc đa giác, kích thƣớc không đều. Rải rác trong vùng này có 7-9 ống tiết ly bào tập trung đều ở mặt trên và mặt dƣới lá. Có 5 bó libe – gỗ (3 bó libe – gỗ to ở gân Một bó libe - gỗ to, có lớp libe chính và 2 bó libe – gỗ nhỏ ở 2 bên gân phụ) hình cung bao dƣới bó gỗ. Trong rời nhau xếp thành hình cung cân đối: bó ở gân lá có thể có khoảng 3 bó giữa to nhất, hai bó cạnh bên nhỏ hơn. libe-gỗ xếp theo hình cung. Tế bào biểu bì trên to, hình chữ nhật và rải rác Tế bào biểu bì trên lớn hơn tế vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình bào biểu bì dƣới, trên biểu bì có đa giác và dẹt. lông tiết đầu đơn bào, lông che chở đa bào. Phần phiến Mô mềm giậu: một lớp tế bào hình bầu dục Mô giậu, gồm 1-2 lớp tế bào lá hoặc hơi đa giác, ngắn, xếp khít nhau và hình chữ nhật to đều đặn, xếp vuông góc với biểu bì. khít nhau. Mô mềm đặc: 3-4 lớp Mô mềm đặc: 5-6 lớp Nhận xét: Sau quá trình soi kính hiển vi và mô tả vi phẫu lá nhận thấy sự khác biệt đặc trƣng giữa hai loài nằm ở lông tiết và có một ít khác biệt ở lông che chở, mô mềm, số lƣợng bó libe – gỗ ở phần gân lá. Phần phiến lá không có nhiều khác biệt. 47
3.2.3. Vi phẫu thân Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.) Mẫu thân cây chọn đoạn không quá già cũng không quá non, cắt theo phẫu thức ngang và nhuộm. Kết quả đƣợc vi phẫu thân Sài đất ba thuỳ. (Xem hình 3.9) Hình 3.9. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết thân Sài đất ba thùy 48
Mô tả: vùng vỏ chiếm 1/3 và vùng trung trụ chiếm 2/3 bán kính vi phẫu. Vùng vỏ gồm: - Biểu bì là 1 lớp tế bào đa giác, kích thƣớc không đều, bên ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, vách tẩm cellulose. Trên biểu bì có thể có lỗ khí, lông tiết hoặc lông che chở. Lông che chở đa bào đầu nhọn gồm 3-4 tế bào. - Dƣới biểu bì là mô dày góc có vách tẩm cellulose dày lên ở các góc, tập trung đều thành vòng tròn dƣới biểu bì (khoảng 2-3 lớp). Các tế bào mô dày ở dạng hình đa giác không đều, kích thƣớc không đều và sắp xếp lộn xộn. - Dƣới mô dày là mô mềm khuyết (7-8 lớp tế bào) có vách bằng cellulose, kích thƣớc không đều, hình tròn hoặc đa giác, sắp xếp để hở những khoảng lớn. Rải rác vùng này có nhiều ống tiết ly bào và tế bào tiết to, màu vàng, không đều, nằm gọn trong các tế bào. - Nội bì: là một lớp tế bào sống trong cùng của mô mềm vỏ, gồm những tế bào hình chữ nhật, dẹt, xếp khít nhau. Vùng trung trụ gồm: - Trụ bì: hoá mô cứng thành từng cụm trên đầu bó libe gỗ, tế bào hình đa giác, vách dày, xếp khít nhau. - Vòng mô dẫn liên tục. Libe ở trên, Gỗ ở dƣới phân hóa ly tâm. - Libe 1: ở trên, là lớp tế bào mỏng dẹt, móp méo, sắp xếp lộn xộn, vách tẩm cellulose, tập trung thành cụm do Libe 2 chèn ép. - Libe 2: ở dƣới, gồm nhiều dãy tế bào hơi dẹp, xếp thành dãy xuyên tâm. - Gỗ 2: những mạch gỗ 2 có kích thƣớc lớn, hình tròn không đều, xếp không thứ tự, nằm rải rác ở mô mềm gỗ 2. Mô mềm gỗ cấp 2 tế bào hình chữ nhật hay đa giác, xếp thẳng hàng xuyên tâm, vách hóa gỗ dày hay mỏng, xếp khít nhau. - Gỗ 1: gỗ cấp 1 gồm các mạch gỗ rời nhau, không đều, phân hóa ly tâm, mô mềm gỗ tế bào hình đa giác, vách cellulose, kích thƣớc nhỏ, xếp khít nhau. - Mô mềm tủy: gồm nhiều tế bào hình tròn, sắp xếp dạng mô mềm đạo. - Tia tủy: hẹp, 1-3 dãy tế bào. 49
(Xem chi tiết các thành phần vi phẫu hình 3.10) A. Bần ở thân già B. Biểu bì và mô dày C. Mô mềm khuyết và góc trụ bì hoá mô cứng D. Ống tiết ly bào vùng vỏ E. Tế bào tiết F. Nội bì và trụ bì G. Libe – gỗ cấp 2 H. Mô mềm đạo vùng I. Tế bào chứa cặn tủy bã Hình 3.10. Các thành phần trong vi phẫu thân Sài đất ba thùy 50
3.2.4. Vi phẫu thân Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) Mẫu thân cây chọn đoạn không quá già cũng không quá non, cắt theo phẫu thức ngang và nhuộm. Kết quả đƣợc vi phẫu thân Sài đất. (Xem hình 3.11) Hình 3.11. Vi phẫu và sơ đồ cấu tạo chi tiết thân cây Sài đất Mô tả - Biểu bì: 1 lớp tế bào hình gần tròn, đều nhau, trên biểu bì có lông che chở đa bào: 3-4 tế bào, đầu nhọn, gốc hơi phình to và lông tiết chân đa bào đầu đơn bào. 51
- Mô dày góc cấu tạo bởi 3-4 lớp tế bào, tế bào vách tẩm cellulose dày lên ở các góc, tập trung đều thành vòng tròn dƣới biểu bì. Các tế bào mô dày ở dạng hình đa giác không đều, kích thƣớc không đều và sắp xếp lộn xộn. - Dƣới mô dày là mô mềm khuyết là các tế bào hình dạng không đều, vách tẩm cellulose, sắp xếp để hở những vòng tròn khuyết lớn. - Trong mô mềm vỏ thấy có các ống tiết ly bào. - Nội bì: là một lớp tế bào sống trong cùng của mô mềm vỏ, gồm những tế bào hình chữ nhật, dẹt, xếp khít nhau. - Trụ bì: mằm dƣới nội bì, gồm các tế bào nhỏ, hình đa giác, xếp xen kẽ nội bì. - Có khoảng 12 bó libe-gỗ hình trứng cũng xếp thành vòng. Trong mỗi bó libe-gỗ gồm libe ở trên và các mạch gỗ xếp thành hàng tập trung thành đám ở dƣới. Libe 1 gồm những tế bào nhỏ hình đa giác, sắp xếp lộn xộn. Gỗ 1 ở dƣới là những mạch gỗ hình đa giác, vách hóa gỗ, xếp thành từng dãy, mạch lớn ở trên, mạch nhỏ ở dƣới. - Tầng phát sinh libc-gỗ gồm 1-2 lớp tế bào tạo thành vòng liên tục. - Trong cùng là mô mềm tủy gồm các tế bào hình đa giác hay hình tròn, càng vào sâu càng to, xếp hở những lỗ nhỏ (mô mềm đạo). (Xem chi tiết các thành phần vi phẫu hình 3.12) A. Lông che chở đa B. Lông tiết đa bào, biểu C. Bó libe – gỗ và bào bì, mô dày và mô mềm ống tiết ly bào khuyết Hình 3.12. Các thành phần trong vi phẫu thân Sài đất 52
Sau khi đã quan sát và mô tả vi phẫu giữa hai loài. Lập bảng so sánh các thành phần có ở biểu bì, gân lá và phiến lá giữa hai loài. (Xem bảng 3.5) Bảng 3.5. Bảng so sánh vi phẫu thân cây giữa 2 loài Sài đất ba thùy Sài đất Biểu bì là 1 lớp tế bào, bên ngoài phủ 1 Biểu bì gồm 1 lớp tế bào hình gần lớp cutin mỏng. Trên biểu bì có thể có tròn nhỏ, đều nhau, trên biểu bì có lỗ khí, lông tiết hoặc lông che chở. lông che chở đa bào gồm 3-4 tế bào, đầu nhọn, gốc hơi phình to. Mô dày góc: 2-3 lớp. Mô dày góc: 3-4 lớp tế bào. Vùng vỏ Mô mềm khuyết: 7-8 lớp. Rải rác vùng Mô mềm khuyết để hở những này có nhiều ống tiết ly bào và các tế khuyết lớn. Trong mô mềm vỏ thấy bào tiết to, màu vàng, không đều, nằm có các ống tiết ly bào. gọn trong các tế bào. Nội bì: 1 lớp. Nội bì: 1 lớp. Trụ bì: hoá mô cứng thành từng đám. Trụ bì: 1 lớp. Vòng mô dẫn liên tục. Bó libe gỗ gồm: Có khoảng 12 bó libe-gỗ hình Libe ở trên, Gỗ ở dƣới phân hóa ly tâm trứng cũng xếp thành vòng. Tầng (Đặc trƣng cho cấu tạo thân cây 2 lá phát sinh libc-gỗ gồm 1-2 lớp tế mầm) bào tạo thành vòng liên tục Vùng trung trụ Mô mềm tủy: gồm nhiều tế bào hình Mô mềm tủy gồm các tế bào hình tròn sắp xếp kiểu mô mềm đạo đa giác hay hình tròn, màng mỏng, càng vào sâu càng to, sắp xếp kiểu mô mềm đạo. Tia tủy: hẹp, 1-3 dãy tế bào. Nhận xét: Qua quá trình soi và mô tả vi phẫu thân nhận thấy có sự khác biệt đặc trƣng giữa hai loài nằm ở lông tiết, trụ bì hoá mô cứng và vòng mô dẫn, có ít khác biệt ở lông che chở. Ngoài ra, không còn nhiều sự khác biệt lớn giữa hai loài. 53
3.3. Soi bột dƣợc liệu 3.3.1. Mô tả bột lá Sài đất ba thùy( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.): Bột lá sau khi xay mịn, soi kính và ghi nhận các cấu tử đặc biệt. (Xem hình 3.13) A. Mảnh biểu bì trên B. Mảnh biểu bì dƣới C. Mảnh mô mềm mang lỗ khí D. Mảnh mạch mạng E. Lông che chở đa bào F. Hạt phấn đầu nhọn Hình 3.13. Các thành phần trong bột lá Sài đất ba thùy Nhận xét: Bột lá Sài đất ba thuỳ có lẫn hạt phấn hình cầu gai và lông che chở có hình dạng đặc biệt. 54
3.3.2. Mô tả bột thân cây Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.): Bột lá sau khi xay mịn, soi kính và ghi nhận các cấu tử đặc biệt. (Xem hình 3.14) A. Lông che chở B. Mảnh mạch mạng C. Mảnh mạch vòng D. Tinh thể canxi oxalat Hình 3.14. Các thành phần trong bột thân Sài đất ba thùy Nhận xét: Bột thân Sài đất ba thuỳ có lông che chở có hình dạng đặc biệt là phình to ở góc và rất nhiều các tế bào canxi oxalat hình khối. 3.3.3. Mô tả bột toàn cây Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.): Do không thể thu hái đủ số lƣợng để phơi khô và sấy nên các cấu tử trong bột toàn cây Sài đất đƣợc tham khảo trong Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học của tác giả Nguyễn Chiến Binh [1]. 55
Thành phần: Mảnh phiến lá (1) đôi khi mang lông che chở hoăc lỗ khí (6). Lông che chở đa bào (2) chứa nang thạch, thƣờng có 3 - 4 tế bào, đầu nhọn, gốc hơi phình to, bề mặt lông thấy những gai nhỏ, xù xì đăc biệt. Riêng tế bào đầu lông nhọn, không có gai. Rải rác có những mạch mạng, mạch chấm, mạch xoắn (5). Sợi màng dày, khoang rộng, đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành bó (4). Hạt phấn hoa hình cầu gai, màu vàng nhạt, mặt ngoài xù xì (7) [1]. (Xem hình 3.15) Hình 3.15. Các thành phần trong bột thân Sài đất Nhận xét: So với các cấu tử bột toàn cây Sài đất tham khảo từ khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ đại học của tác giả Nguyễn Chiến Binh cho thấy, các thành phần cấu tử trong bột thân và lá Sài đất ba thuỳ chỉ khác về hình dạng lông che chở và giống nhau về một số thành phần nhƣ: hạt phấn hoa, mạch xoắn, mạch mạng, biểu bì chứa lỗ khí. 3.4. Kết quả sơ bộ hóa thành phần hóa thực vật: Lá khô Sài đất ba thuỳ xay thô đƣợc chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần (ethyl acetat, cồn 96o, nƣớc). Sau đó, định tính nhanh các hợp chất bằng các phản ứng hoá học đặc trƣng. Kết quả xem bảng 3.6 56
Bảng 3.6. Kết quả sơ bộ hóa thành phần hóa học từ lá Wedelia trilobata (L.) Hitchc. Kết quả định tính trên các dịch chiết Kết Thuốc thử/ Dịch chiết cồn Dịch chiết nƣớc quả Dịch Nhóm hợp chất Cách thực Phản ứng dƣơng tính Không Không định chiết Thủy Thủy hiện thủy thủy tính ether phân phân phân phân chung Nhỏ dd lên Chất béo Vết trong mờ + + giấy Carotenoid H2SO4 Xanh dƣơng hay xanh + + lục ngả sang xanh dƣơng Tinh dầu Bốc hơi tới Có mùi thơm + + cắn Triterpenoid tự Liebermann Đỏ nâu – tím, lớp trên + + do – Burchard có màu xanh lục Alkaloid Thuốc thử Kết tủa – – – – chung alkaloid Coumarin Phát quang Phát quang mạnh hơn – – – trong kiềm Antraglycosid KOH 10% Dung dịch kiềm có – – màu từ hồng tới đỏ Flavonoid Mg/HCl đđ Dung dịch có màu + + + + hồng tới đỏ Anthocyanosid HCl Đỏ – – – KOH Xanh – – – Proanthocyanidin HCl/t˚ Đỏ – – – Tanin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh + + + đen ( Polyphenol) Dung dịch Tủa bông trắng + + + gelatin muối ( Tannin) Saponin Lắc mạnh – – – dung dịch nƣớc Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt + + + Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch + + + Hợp chất Pha loãng Tủa bông trắng – + + polyuronic với cồn 90% vàng nâu Có thể có phản ứng nhƣng không thực hiện (+) Có (–) Không có Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết (±) Nghi ngờ 57
Nhận xét: Sơ bộ hoá thấy trong lá Sài đất ba thuỳ có chứa chất béo, caroten, tinh dầu, triterpen tự do, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, chất khử, hợp chất polyuronic. Và lập bảng so sánh với tài liệu tham khảo của loài Sài đất 4, 25 đƣợc bảng 3.7 Bảng 3.7. Bảng so sánh sơ bộ thành phần hóa học giữa 2 loài WC Nhóm hợp chất WT TLTK 4, 25 Chất béo + + Carotenoid + + Tinh dầu + + Triterpenoid tự do + + Alkaloid _ _ Coumarin _ + Antraglycosid _ _ Flavonoid + + Anthocyanosid _ _ Proanthocyanidin _ _ Tanin + + Saponin _ + Acid hữu cơ + + Chất khử + + Hợp chất polyuronic + + Nhận xét: So với các thành phần hoá học tham khảo đƣợc về Sài đất, Sài đất ba thuỳ không có coumarin và saponin cũng có thể do hàm lƣợng quá ít nên không thể phát hiện đƣợc. 3.5. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Kết quả thu đƣợc 4,6820g cao methanol và 2,7313g cao chloroform. Do đó hiệu suất chiết tƣơng ứng là 9,36% và 5,46%. Sau đó đem khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch thu đƣợc kết quả ở bảng 3.8 58
Bảng 3.8. Kết quả định tính hoạt tính kháng khuẩn - kháng nấm của 2 loại dịch chiết và so sánh với loài Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) tham khảo từ các tài liệu nghiên cứu. Cao Cao KQ kháng khuẩn – MeOH CHCl nấm của WC / Hình ảnh 3 KQ (+/-) KQ (+/-) tham khảo từ các nghiên cứu (+) Staphylococcus Thử nghiệm aureus đề (+) (+) trên dịch kháng (8mm) (8mm) chiết MeOH methycillin (MRSA) và CHCl3 từ lá / [30. (+) Thử nghiệm Pseudomonas trên dịch ( - ) ( - ) aeruginosa chiết MeOH và CHCl3 từ lá / [30. (+) Thử nghiệm trên dịch Escherichia coli ( - ) ( - ) chiết MeOH và CHCl3 từ lá / [30. 59
(+) Thử nghiệm Klebsiella trên dịch ( - ) ( - ) pneumoniae chiết MeOH và CHCl3 từ lá / [30. (+) Candida Thử nghiệm tropicalis ( - ) ( - ) trên Tinh dầu chiết từ lá / 10. Chú thích: (+): dƣơng tính, (-): âm tính Giếng (1): dung môi methanol làm chứng âm cho dịch chiết MeOH. Giếng (2): dung môi chloroform làm chứng âm cho dịch chiết chloroform. Giếng (3): DMSO 10%. Giếng (4): 10 µg ciprofloxacin / vi khuẩn hoặc 10 µg fluconazole/ vi nấm. Giếng (5): 50µl dịch chiết methanol (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Giếng (6): 50µl dịch chiết chloroform (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Nhận xét: Hai loại dịch chiết đều cho kết quả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methycillin (MRSA). Đƣờng kính vòng tròn vô khuẩn là 8mm so với bảng 2.1 cho 60
thấy hoạt tính kháng khuẩn yếu. So với nghiên cứu của tác giả Rehana banu H và cộng sự (2012) trên lá Sài đất đều kháng với 4 loài vi khuẩn trên ở nồng độ 100mg / đĩa giấy. Trong đó, kháng loài Staphylococcus aureus cho vòng tròn vô khuẩn tƣơng ứng (cao chloroform: 13.33 + 0.33mm và cao methanol: 23.67 + 0.68mm). Mặc dù vậy, cho thấy lá Sài đất ba thuỳ dù ở dạng cao và nồng độ khá thấp (tƣơng đƣơng 2500µg/giếng) nhƣng vẫn cho kết quả kháng khuẩn, nếu ta tiến hành tăng nồng độ thử nghiệm kết quả kháng có thể sẽ cao và tốt hơn. 61
Chƣơng 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt đƣợc mục tiêu đề ra và thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: - Đã mô tả đƣợc đặc điểm hình thái thực vật giữa hai loài và nhận thấy đặc điểm lá là đặc trƣng quan trọng để phân biệt hai loài Sài đất. Đã mô tả đƣợc đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột của loài Sài đất ba thuỳ góp phần tiêu chuẩn hóa loài này. - Đã sơ bộ định tính đƣợc một số nhóm chất có trong mẫu lá Sài đất ba thùy là: flavonoid, tanin, carotenoid, chất béo, tinh dầu, đƣờng khử, triterpenoid tự do, acid hữu cơ và hợp chất polyuronic. So với Sài đất, thì không có coumarin và saponin, cũng có thể có nhƣng do hàm lƣợng quá thấp nên không thể phát hiện đƣợc. - Đã xác định sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của 2 loại dịch chiết chloroform và methanol từ lá Sài đất ba thùy với Tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) ở nồng độ 2500µg và vòng tròn vô khuẩn là 8mm. So với Sài đất đều kháng cả 4 loài vi khuẩn ở nồng độ 100mg / đĩa giấy cho thấy nếu tiếp tục tăng nồng độ thử nghiệm sẽ cho kết quả kháng cao và tốt hơn. 4.2. Đề nghị - Cần tiến hành thêm các nghiên cứu tiếp, mới có thể khẳng định Sài đất ba thuỳ có thể thay thế Sài đất trong việc dùng làm dƣợc liệu hay không. - Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Sài đất ba thùy. - Thử đánh giá tác dụng sinh học của các nhóm chất và các chất phân lập đƣợc, cũng nhƣ của dịch chiết loài Sài đất ba thùy này. 62
Tài liệu tham khảo Tiếng việt 1. Nguyễn Chiến Binh (2001), Nghiên cứu đặc điểm của một số cây thuốc họ Cúc (Asteraceae) bằng phương pháp hiển vi, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ đại học khóa 51, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội. 2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr. 643 – 645. 3. Trƣơng Thị Đẹp (2007), Thực vật dược, NXB. Y học, TP. Hồ Chí Minh, tr. 217 – 219. 4. Nguyễn Thị Thu Hiền (2011), Phân loại các cây mang tên Sài đất thuộc chi Wedelia ở miền Bắc Việt Nam, Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội. 5. Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình và cộng sự (2015), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh, tr. 2-126. 6. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB. Y học, TP. Hồ Chí Minh, tr. 86. 7. Nguyễn Đinh Nga (2009), Ký sinh trùng, NXB. Giáo dục Việt Nam, tr. 210 – 222. 8. Lê Văn Phủng (2009), Vi khuẩn Y học, NXB. Giáo dục Việt Nam, tr. 45 – 52, 212 – 219, 248 – 252, 291 – 300. Tiếng anh 9. A. E. & Hasan, M. A., Hosain (2005), “Wedelia trilobata(L.) A.S.Hitchs. (Asteraceae) - A new record for Bangladesh”, Bangladesh Journal of Plant Taxonomy, 12(1), pp. 63 - 65. 10. A. Manjamalai, et.al (2012), “ Study on the effect of essential oil of Wedelia chinensis (Osbeck) against microbes and inflammation”, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 5(2), pp. 155 - 163. 63
11. Apers S, et.al (2002),“Characterisation of new oligoglycosidic compounds in two Chinese medicinal herbs”, Phytochem Anal, 13, pp. 202 - 206 12. Balekar N., et.al(2012), “Evaluation of the wound healing potential of Wedelia trilobata (L.) leaves”, Journal of Ethnopharmacology, 141, pp. 817–824. 13. Balekar, N., et.al (2013 b), "In vitro stimulatory effect of grandiflorenic acid isolated from Wedelia trilobata (L.) Leaves on L929 fibroblast cells."Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, 37(3), pp. 117 - 124. 14. Balekar, N., Nakpheng, T. & Srichana, T. (2013 a), “Wound-healing potential of grandiflorenic acid isolated from Wedelia trilobata (L.) Leaves”. Journal of Science and Technology, 35 (5), pp. 537 - 546. 15. Bohlmann F, Ziesche J, et.al (1982), “Naturally occurring terpen derivatives: Eudesmanolides and diterpenes from Wedelia trilobata and an ent-kaurenic acid derivative from Aspilia parvifolia”, Phytochem, 20, pp.751 - 765. 16. Brito, S., Crescente, et.al (2006), “Efficacy of a kaurenic acid extracted from the Venezuelan plant Wedelia trilobata (Asteracea) against Leishmania (Viannia) braziliensis.”, Biomedica, 26, pp. 180 - 187. 17. Chethan, J., Kumara, S. K. K., et.al (2012), “Evaluation of antioxidant and antibacterial activities of methanolic flower extract of Wedelia trilobata (L.) Hitch.”, African Journal of Biotechnology, 11, pp. 9829 - 9834. 18. Felix G.Coe, Gregory J.Anderson (1996), “ Screening of medicinal plants used by the Garifuna of Eastern Nicaragua for bioactive compounds”, Journal of Ethnopharmacology, 53(1), pp. 29 - 50. 19. Ghosh, A. (2014), "Survey of Ethno-medicinal Climbing plants in Andaman and Nicobar Islands, India.", International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 5(7), pp. 3671 - 3677. 20. Govindachari, T.R., et al (1985), “ The benzofuran norwedelic acid from W. calendulaceae”, Phytochemistry, 24(12), pp.3068 – 3069. 64
21. Hoang, Thanh, N.Vinh, et.al (2006), "Contribution to the Study on Chemical Constituents of the Leaves of Wedelia Trilobata (L.) Hitch (Asteraceae).", Journal of Chemistry, 44(1), pp. 91 - 95. 22. J.W.Kadereit, et.al (2007), “Asterales: Introduction and Conspectus”, Flowering Plants, XI, pp. 636. 23. Kade, et.al (2010), “Aqueous extracts of Sphagneticola trilobata attenuates streptozotocininduced hyperglycaemia in rat models by modulating oxidative stress parameters”, Biology and Medicine, 2(3), pp.1 – 13. 24. Koheil MA (2000), “Study of the essential oil of the flower-heads of Wedelia trilobata (L.) Hitch.”, J Pharm Sci 2000, 26, pp. 288 - 93. 25. Koul S., et.al (2012), “Wedelia chinenis (Asteraceae) - An overview”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, pp. S1169-S1175. 26. Kumar ,S. S., Bhama S., et.al (2007), “Analgesic activities of the medicinal plants of Wedelia trilobata, Wedelia biflora and Eclipta alba in standard experimental animal models.”, Bioscience, Biotechnology, 4, pp. 201 - 206. 27. Mounyr Balouiri, et.al (2016), “Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review”, Journal of Pharmaceutical Analysis, pp. 71 – 76. 28. Mizokami, S. S., Arakwa , et.al (2012), “ Kaurenoic acid from inhibits inflammatory pain: Effect on cytokine production and activation of the NO- Cyclic GMP protein kinase G-ATP-sensitive potassium channel signaling pathway”, Journal of Natural Product, 5, pp. 896 - 904. 29. Nirmal SA, et.al (2005), “Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of Wedelia trilobata leaves”, Indian J Nat Prod, 21(3), pp.33 - 35. 30. Rehana banu H, N. Nagarajan (2012), “Antimicrobial activity of Wedelia chinensis leaves”, Journal of Pharmacy Research, 5(1), pp. 407 - 412. 31. Toan Phan Duc, Akino Jossang, et.al (2007), “New wedelolides, (9R)- eudesman-9,12-olide -lactones, from Wedelia trilobata”, Phytochemistry Letters, 17, pp. 304 - 309. 65
32. Toppo, et.al (2013), “Antimicrobial activity of Sphagneticola trilobata (l.) pruski, against some human pathogenic bacteria and fungi”, The bioscan, 8(2), pp. 695 - 700. 33. Yang Ling Ling, Konno C, Oshima Y, et.al (1986), “Antihepatotoxic principles of Wedelia chinensis herbs”, Planta Med, 52, pp. 499 - 500. 34. Zhang Y H, Liu M F, et.al (2004), “New eudesmanolide of yaredai zhiwu xuebao Redai”, Yaredai Zhiwu Xuabao, 12, pp. 533 - 537. Trang web 35. Asia university institutional repository, Studies on the antibacterial activity, antioxidation, anti-inflammation and anticancer activity of Wedelia trilobata (L.) Hitchc., truy cập ngày 28/10/2018, 36. Cabi.org, Sphagneticola trilobata (wedelia), truy cập ngày 13/06/ 2018, 37. Digital Flora of Karnataka (Indian Institute of Science), Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., truy cập ngày 09/07/2018 38. Floridata, Wedelia trilobata, truy cập ngày 09/07/ 2018, 39. Invasive Species Compendium, Sphagneticola trilobata (wedelia), truy cập ngày 14/07/2018, 40. Phillipine Medicinal Plant, Wedelia trilobata, truy cập ngày 12/08/2018, 41. Weeds of Australia, Singapore daisy Sphagneticola trilobata, truy cập ngày 11/08/2018, ata.htm 66
CÂU HỎI SINH VIÊN PHẢI TRẢ LỜI TRƢỚC HỘI ĐỒNG Phản biện 1: - Tại sao không so sánh đặc điểm hình thái về hoa ? Trả lời: do khi thu hái ở vƣờn Dƣợc liệu thuộc ĐH. Y dƣợc TP.HCM, cây chƣa ra hoa nên không thể mô tả và so sánh đặc điểm hình thái về hoa giữa hai loài. - Tại sao chỉ làm trên một chủng nấm men ? Trả lời: do điều kiện phòng thí nghiệm Vi sinh - Ký sinh trùng, Khoa Dƣợc, trƣờng ĐH. Y dƣợc TP.HCM không cho phép nên không thể tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sâu rộng hơn. Phản biện 2: - Chiết xuất với dung môi Ethyl acetat là hiệu quả nhất nhƣng tại sao lại khảo sát trên dung môi methanol và chloroform ? Trả lời: theo nhƣ tài liệu tham khảo thì hoa, lá và thân Sài đất ba thuỳ đƣợc chiết với cồn ethyl. Dịch chiết sau đó đƣợc lắc phân bố với n-Hexane, ethyl acetate, n- butyl rƣợu và nƣớc để đánh giá các hoạt động chống vi khuẩn. Chiết xuất ethyl acetat là hiệu quả nhất trong số tất cả các chiết xuất, nhƣng trong nghiên cứu này lại không sử dụng ethyl acetat vì: mục đích của đề tài là sơ bộ khảo sát khả năng kháng khuẩn - kháng nấm của Sài đất ba thuỳ thông qua 2 loại dung môi phân cực và kém phân cực, sau khi đƣợc kết quả nghiên cứu sẽ tiếp tục khảo sát và phân lập kỹ hơn các hoạt chất bằng phƣơng pháp lắc phân bố sau. - Tại sao không so sánh đặc điểm hình thái về hoa ? Trả lời: do khi thu hái ở vƣờn Dƣợc liệu thuộc ĐH. Y dƣợc TP.HCM, cây chƣa ra hoa nên không thể mô tả và so sánh đặc điểm hình thái về hoa giữa hai loài.
PHIẾU XÁC NHẬN SỬA CHỮA Nội dung khóa luận đã đƣợc chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng : Tác giả đã chỉnh sửa các nội dung nhƣ sau : - Bổ sung so sánh đặc điểm về hoa. - Làm rõ tính cấp thiết của đề tài. - Lỗi chính tả các trang: 12, 14, 43, 67. - Chỉnh sửa kích thƣớc trình bày của các công thức hóa học. - Bổ sung thêm tài liệu tham khảo ở phần thử nghiệm kháng khuẩn – kháng nấm. - Chỉnh sửa hình thức toàn bài. GVHD Sinh viên (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên) Chủ tịch Hội đồng GV phản biện (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)