Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (Persea americana Mill.)

55 trang thiennha21 18/04/2022 3321

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (Persea americana Mill.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_danh_gia_tac_dung_uc_che_enzym_acetylcholinesteras.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (Persea americana Mill.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC HOÀNG THỊ THÚY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ (Persea americana Mill.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƯỢC HOÀNG THỊ THÚY ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ (Persea americana Mill.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn 1: ThS. ĐẶNG KIM THU Người hướng dẫn 2: PGS.TS BÙI THANH TÙNG HÀ N Ộ@I – School 2019 of Medicine and Pharmacy, VNU
LỜI CẢM ƠN Với mỗi sinh viên khóa luận là món quà cuối cùng để lại dưới mái trường thân yêu trước khi rời xa. Và tôi cũng thế, với tôi khóa luận không chỉ là món quà mà còn là hành trang tiếp bước cho tôi trên con đường sắp tới. Mỗi ngày thực nghiệm, mỗi ngày hoàn thành khóa luận tôi đã gặp muôn vàn khó khăn nhưng thật may mắn khi tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và những người thân yêu để tôi hoàn thành món quà này một cách tốt nhất. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là ThS. Đặng Kim Thu và PGS.TS Bùi Thanh Tùng – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cô luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo những kĩ năng, kiến thức không chỉ trong khóa luận này mà còn định hướng cho tôi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con đường phía trước. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi đầy đủ cơ sở vật chất và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời trong quá trình thực hiện tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo phụ trách các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được sử dụng các dụng cụ, phòng thí nghiệm và cho tôi nhiều bài học quý giá trong nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất tới bố mẹ, người thân và bạn bè của tôi – những người luôn bên tôi, giúp đỡ, chia sẻ và đồng hành cùng tôi để vượt qua mọi khó khăn không chỉ trong khóa luận này mà trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và cuộc sống của tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Thúy @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholin iodid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EtOAc Ethylacetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (Interational Unit) n-BuOH n-buthanol Ph Chỉ số hoạt động của ion hidro (Hydrogen power) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) 퐗⃐ Giá trị trung bình @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin 5 Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE 5 Hình 1.3. Quả Bơ (Persea americana Mill) 13 Hình 1.4. Công thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ 17 Hình 2.1. Nguyên liệu chiết xuất 20 Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 24 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn hạt quả Bơ 28 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của lá và các phần trong quả Bơ 29 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic 29 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của lá và các phần trong quả Bơ 31 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của Donezepil 31 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn hạt quả Bơ 33 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết hạt quả Bơ 34 Hình 3.8. Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ 35 Hình 3.9. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ để xác định hằng số ức chế Ki 36 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh 8 Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 9 Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ 14 Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ 15 Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA) 16 Bảng 2.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng 24 Bảng 3.1. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH 30 Bảng 3.2. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE 32 Bảng 3.3. Giá trị IC50 các phân đoạn từ hạt quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH 33 Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 3 1.1.1. Bệnh Alzheimer 3 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE 4 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa 6 1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. 9 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 9 1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 11 1.3. Tổng quan về Bơ 13 1.3.1. Nguồn gốc, phân boại 13 1.3.2. Đặc điểm thực vật 15 1.3.3. Thành phần hóa học 15 1.3.4. Tác dụng và công dụng 18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 20 2.1.3. Hóa chất, dung môi 20 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ 21 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2. Nội dung nghiên cứu 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1. Phương pháp chiết xuất 22 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 22 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 23 2.3.4. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE 26 2.4. Phương pháp xử lí số liệu 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 28 3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết 28 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết lá và các phần trong quả Bơ 29 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 29 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE 30 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt quả Bơ 32 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 32 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE 34 3.3.3. Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE 35 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 37 4.1. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của dịch chiết lá và quả Bơ 37 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất 38 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, làm suy yếu khả năng nhớ và nhận thức [34]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2017, 44 triệu người trên thế giới bị mất trí nhớ và trong đó chiếm tới 60-70% là bệnh nhân Alzheimer [23]. Bệnh lý học của Alzheimer hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ và hiện nay các nhà khoa học cho rằng ở các bệnh nhân Alzheimer có sự kết hợp của các yếu tố di truyền và môi trường gây ra. Vì thế việc hiểu biết về cơ chế bệnh vẫn cần được làm sáng rõ và sẽ là chìa khóa để phát triển thuốc điều trị bệnh. Các nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt trong các chất dẫn truyền thần kinh gây ra suy giảm nhận thức và mất trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer [55]. Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine. Một số phương pháp điều trị khác nhau có mục tiêu tăng cường dẫn truyền cholinergic bằng cách tăng lượng tiền chất ACh, ngăn chặn quá trình thủy phân bởi chất ức chế AChE, kích thích các thụ thể nicotinic và muscarinic hoặc sử dụng các chất có tác dụng tương tự cholinergic [61]. Bởi vậy, các chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh Alzheimer. Mặt khác, sự gia tăng quá mức của các gốc tự do trong cơ thể gây ra hiện tượng “stress oxy hóa” được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh mạn tính và thoái hóa như bệnh Alzheimer và Parkinson. Tuy nhiên các chất ức chế enzym AChE như physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil, metrifonate, lại không mang lại hiệu quả cao và gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như: buồn nôn, nôn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban [44]. Physostigmin là chất ức chế AChE đầu tiên được dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer, nhưng đã bị thu hồi khỏi thị trường do một số tác dụng không mong muốn. Tacrine cũng gây độc đối với gan trong các thử nghiệm lâm sàng [62]. Ngoài ra, các thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa như vitamin E, Ginkgo biloba được sử dụng để điều trị những tổn thương liên quan đến nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer có nguồn gốc từ tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả năng ức chế enzym AChE để phòng và điều trị bệnh Alzeimer là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới. Bơ có tên khoa học là Persea americana Mill (Lauraceae), là một loại cây cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Nghiên cứu cho thấy trong Bơ có chứa các hợp chất peptone, b-galactoside, @ School acid glycosylated of Medicine abscisic, alkaloids, and Pharmacy, VNU 1
cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450, [48, 64]. Bơ cũng đã được sử dụng cho điều trị một số bệnh như lở loét, tăng huyết áp, đau bụng, viêm phế quản [15], tiêu chảy và tiểu đường [22]. Ngoài ra, Bơ có hàm lượng kali cao và ít natri, giúp điều chỉnh cân bằng điện giải và áp lực máu trong cơ thể, giúp ổn định huyết áp [32]. Các hợp chất béo omega-3, carotenoid và vitamin làm cho quả Bơ có tác dụng chống viêm [15]. Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết và hạ cholesterol toàn phần và LDL, có tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch [28]. Hơn nữa, lá Bơ còn có tác dụng trên hệ thần kinh như chống co giật [53], ức chế enzym AChE và butyrylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa [51]. Tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh của dược liệu ngày càng thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu để tìm ra sản phẩm tự nhiên tiềm năng dùng làm thuốc để chống lại bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa DPPH của lá và quả Bơ trồng tại Việt Nam để có thể định hướng phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Vì vậy, chúng tôi đề xuất tiến hành đề tài: “Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.)” với mục tiêu: Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.). Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.1.1. Bệnh Alzheimer Alzheimer là bệnh thần kinh thoái hóa tiến triển, làm mất trí nhớ và giảm khả năng nhận thức, là một vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt ở những người cao tuổi. Bệnh đã được mô tả đặc điểm lâm sàng lần đầu tiên tại Đức vào ngày 03 tháng 11 năm 1906 bởi ông Alois Alzheimer. Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên bệnh – bệnh Alzeimer trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie) của mình [60]. Bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ ở hầu hết các quốc gia. Tỷ lệ mắc bệnh Alzeimer tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở lên. Chi phí cho việc chăm sóc và điều trị ở nước Mỹ ước tính 200 tỷ USD mỗi năm cho căn bệnh này [26]. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ với dạng bệnh điển hình là Alzeimer [6]. Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh bao gồm cả yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền. Yếu tố di truyền được thấy ở 5% các bệnh nhân mắc bệnh được nghiên cứu là những đột biến liên quan đến thay thế một nucleotide trong chuỗi ADN (đa hình nucleotide đơn) (tại nhiễm sắc thể 1, 14 hoặc 21) và các biến thể ε4 (alen) của gen mã hóa apolipoprotein E (APOE), nằm trên nhiễm sắc thể 19 [43]. Các yếu tố nguy cơ không di truyền được đưa ra là: tuổi, giới tính. Tuổi là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đối với bệnh Alzeimer khi các nghiên cứu chỉ ra rằng người trên 60 tuổi sẽ có tỷ lệ mắc bệnh tăng gấp đôi cứ sau 5-6 năm: ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%; ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40%. Các nghiên cứu cũng cho thấy giới tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng khi tỷ lệ mắc bệnh của phụ nữ cao hơn khoảng 1,5 – 2 lần so với nam giới [25]. Bệnh Alzheimer có đặc điểm là tiến triển chậm và bắt đầu rất từ từ nên bệnh nhân thường khó phát hiện bệnh ở giai đoạn khởi phát. Bệnh cảnh lâm sàng là hội chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển theo 3 giai đoạn chính: • Giai đoạn 1: Thường kéo dài 2 – 3 năm, được đặc trưng bởi các triệu chứng: suy giảm trí nhớ, giảm hiệu suất trong giải quyết các công việc thường ngày, rối loạn định hướng không gian. • Giai đoạn 2: Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt. Nhân cách của người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi. Thường gặp các triệu chứng: rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri @giác, School rối loạn hành of vi, Medicine thay đổi tính cách. and Pharmacy, VNU 3
• Giai đoạn 3: Giai đoạn cuối cùng. Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác ) thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng. Bệnh nhân không thể giao tiếp và nhận diện khuôn mặt, không thể tự chăm sóc bản thân. Cho tới thời điểm hiện tại, vẫn chưa có loại thuốc nào có thể chữa khỏi bệnh Alzheimer mà chỉ có thể giúp làm chậm tiến triển của bệnh và làm giảm một số triệu chứng. Tất cả các bệnh nhân mắc Alzheimer cần được ổn định cân bằng chuyển hóa và cân bằng thể dịch, đồng thời duy trì trọng lượng cơ thể ở mức bình thường, điều chỉnh huyết áp, mỡ máu cũng như các vấn đề khác gây khó chịu cho người bệnh. Ngoài ra cần áp dụng các biện pháp chăm sóc y tế cơ bản tùy theo mức độ nặng nề, suy giảm trí nhớ của người bệnh và các triệu chứng xuất hiện về sau. Dược liệu có khả năng phòng ngừa và điều trị một số bệnh, trong đó có bệnh Alzheimer [40]. Có rất nhiều nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của dịch chiết toàn phần với tác dụng chống lại Alzheimer và tiến hành phân lập các hợp chất có tác dụng bảo vệ hiệu quả [21]. Các nghiên cứu hóa thực vật chỉ ra nhiều hợp chất có giá trị bao gồm lignans, flavonoid, tannin, polyphenol, triterpenes, sterol và ankaloid với một phổ rộng các tác dụng dược lý như kháng viêm, chống amyloidogenic, kháng cholinesterase, hạ lipid, chống oxy hóa, chống chết rụng tế bào [40]. 1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. ACh tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh. Trong các nghiên cứu cho thấy ACh có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc Alzheimer [56]. Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào t@ế bào School thần kinh of để tMedicineổng hợp ACh. Doand đó, Pharmacy, VNU 4
những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8, 20]. Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protein có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính (hình 1.2) là vị trí este hóa, vị trí oxy- anion, vị trí anion và túi acyl [39]. Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [36]. Theo giả thuyết cholinergic, các chất đối kháng cholinergic gây ra suy giảm trí nhớ và khả năng nhận thức của con người còn các chất đối kháng muscarinic thì có tác dụng ngược lại [65]. Do vậy, việc ức chế AChE sẽ duy trì nồng độ và thời gian hoạt động của ACh tại các khe synap, từ đó có tác dụng duy trì khả năng ghi nhớ và khả năng học tập của con người [58]. Sự giảm sút nồng độ ACh thường gặp ở các bệnh nhân Alzheimer, theo nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. và cộng sự, trong não của bệnh nhân Alzheimer có sự thiếu hụt đến gần 90% lượng chất dẫn truyền thần kinh này [33]. Trong khi nguyên nhân gây bệnh còn chưa được các nhà khoa học làm rõ thì các chất ức chế AChE là lựa chọn hàng đầu cho các bệnh nhân Alzheimer, thông qua việc duy trì nồng độ ACh trong não, các chất này có tác dụng làm giảm các triệu chứng và ngăn chặn sự tiến triển của bệnh [49]. AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [31, 56]. 1.1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa Quá trình oxy hóa trong cơ thể Oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học, trong đó các electron được chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do trong cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào. Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với electron chưa ghép cặp rất không ổn định và phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do ROS, RNS, RSS [1, 9, 29]. Bản chất của các gốc tự do là có khả năng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [13, 29]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể: • Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể. • Từ quá trình peroxyd hóa lipid. • Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. Đích phân tử chính của các gốc tự do là các protein, ADN (acid deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch, béo phì, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày, [29, 37]. Các cơ chế chống oxy hóa [42]: 1) Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS. 2) Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống oxy hóa của tế bào. 3) Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa dẫn đến sự gián đoạn tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho các phân tử sinh học [79]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh Alzheimer [69]. Một số chất chống oxy hóa như N-acetylcystein, curcumin, resveratrol, vitamin E, acid ferulic, selen, coenzym Q (CoQ) và melatonin đã được thử nghiệm về khả năng cải thiện hiệu suất nhận thức ở những người mắc bệnh Alzheimer [70]. Vì vậy những chất có khả năng cân bằng chất oxy hóa và chất chống oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong quá trình chẩn đoán và điều trị bệnh Alzheimer. Các chất chống oxy hóa ❖ Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa trong cơ thể người được chia thành 2 loại, các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa không phải enzym. Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase, superoxid dismutase, Glucose-6 phosphat dehydrogenase. Các chất chống oxy hóa không phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu từ thức ăn bổ sung [29]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh Các enzym Các chất không phải enzym Glutathion peroxidase Co – Enzym: Q10 Catalase Vitamin A Superoxide dismutase Hợp chất chứa nito (non –protein): uric Glucose – 6 phosphat dehydrogenase Hợp chất chứa S: Glutathion Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do và có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do. Nhờ các chất chống oxy hóa này mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được cân bằng trao đổi chất. Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa trong cơ thể. ❖ Chất chống oxy hóa trong hóa dược Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc này được xếp thành 3 nhóm: ● ● • Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O2 , OH, H2O2 như aspirin, indomethacin, ibubrofen ● ● • Nhóm 2: Những chất làm giảm OH nhưng làm giảm mạnh O2 , H2O2 như hydrocortisol, 2 -3 hydroxybenzoic • Nhóm 3: Thuốc làm giảm ●OH ở nồng độ rất thấp như phenylbutanol. Các chất chống oxy hóa tổng hợp BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert – butylhydroquinon) ❖ Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol: - Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào và các phần tử chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức nhờ đó có tác dụng chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ. - Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ở pha nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E dạng oxy hóa về dạng khử [30]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
- Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa và tạo phức chelat rất đáng chú ý. Chúng tập trung nhiều nhất trong trái cây, rau quả, rượu, trà và cacao. Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng glycoside và polymer, được thoái hóa ở nhiều mức độ trong đường tiêu hóa. Xu hướng ức chế quá trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí các nhóm thế). Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG từ chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [38]. - Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, có mặt trong một số thực vật nhiệt đới. Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin, 1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. 1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp được chia thành 2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [18]: Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Các phương pháp in vitro Các phương pháp in vivo 1. Dọn gốc tự do DPPH 1. Khả năng làm giảm sắt trong 2. Dọn gốc tự do HO huyết tương. 3. Dọn gốc tự do nitric oxid 2. Khả năng làm giảm glutathion 4. Dọn gốc tự do peroxynitrite 3. Glutathion peroxidase 5. Phương pháp định lượng ABTS 4. Glutathion – S – Tranferase 6. Phương pháp TRAP 5. Superoxid dismutase 7. Phương pháp FRAP 6. Catalase 8. Dọn gốc tự do superoxid (SOD) 7. γ– glutanyl transpeptidase 9. Dọn gốc tự do hydroxyl 8. Glutathion reductase 10. Phương pháp HORAC 9. Peroxid hóa lipid 11. Phương pháp ORAC 10. Thử nghiệm LDL 12. Phương pháp RP 13. Phương pháp DMPD 14. Enzym xanthin oxidase 15. Phương pháp CUPRAC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử. Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu [13, 17, 29, 47]. ● Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2 ● Nguyên tắc: Gốc tự do O2 được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin ● thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2 tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại 560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng ● O2 tham gia phản ứng [13, 18, 29, 50] Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu được tương đối ổn định và chính xác. Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ●OH Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 – deoxyribose của gốc ●OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử. Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc ●OH có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các thử nghiệm trên [13, 18, 29, 47]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải trải qua rất nhiều giai đoạn và một trong những giai đoạn đầu của quá trình là nghiên cứu sàng lọc. Có nhiều phương pháp được sử dụng trong giai đoạn này và phương pháp thử in vitro được áp dụng khi nó đáp ứng được một số tiêu chí như: có thể tiến hành trên nhiều mẫu, lượng mẫu thử ít, kết quả nhanh, chi phí thấp. Các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của enzym AChE, bao gồm: phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp huỳnh quang với cơ chất phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác định hoạt độ điện hóa của enzym AChE. Đối với nghiên cứu tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B. 1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất trong số những phương pháp được sử dụng đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng, trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học. Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’ - dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB). ❖ Phương pháp đo quang Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym AChE dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [45]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio- 2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm. Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng [57, 59]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [16]. Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế enzym AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzym AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch enzym AChE được phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [14]. 1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double). ❖ Phương pháp đo quang Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [63]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α- naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [33, 46]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch cơ chất. ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [33]. Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả. Bên cạnh đó, để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z. M. và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di mao quản [41]. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp, thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp, hạn chế về số lượng mẫu thử nên hiện nay mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố và ít được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc. 1.3. Tổng quan về Bơ 1.3.1. Nguồn gốc, phân boại Tên khoa học: Persea americana mill hay Persea gratissima gaern. Tên tiếng Anh: Avocado Giới: Plantae Bộ: Laurales Họ: Lauraceae Chi: Persea Loài: P.american @Hình School 1.3. Quả Bơof ( PerseaMedicine americana and Mill )Pharmacy, VNU 13
Đa số các giống Bơ hiện nay đều có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới Trung Mỹ như Mexico, Guatemala và quần đảo Antilles vì các khảo cứu phát hiện rằng những cây Bơ mọc hoang dại tại những xứ này [68]. Hóa thạch hạt Bơ có niên đại 7000 năm Trước công nguyên đã được tìm thấy tại một khu khảo cổ ở Mexico. Tên “Avocado” bắt nguồn từ tiếng Aztee là ahuacucuahitl, trong tiếng Tây Ban Nha rút ngắn đi gọi là Aguacate và trong tiếng Anh gọi là Avocado hay còn gọi là trái trạng sư [12]. Cây Bơ được xếp vào loại thực vật có hoa, hai lá mầm và gồm rất nhiều giống thuộc họ Long não (Lauraceae) [2, 3]. Phần lớn các giống trồng thương mại đều thuộc vào giống Mexico, giống Guatemala và giống Antilles (Tây Ấn). Giống Guatemala và Antilles (Tây Ấn) được xếp vào loài P.americana Mill, giống Mexico được xếp vào loài P.drymyfolia với các đặc tính quan trọng như sau [12]: Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ Dầu Khoảng rỗng Giống Mùi lá Vỏ trái trong Hạt Ưu điểm hạt cơm Hôi mùi Mỏng Cao To Lỏng, không Chịu rét tốt, Mexico anique khoảng sát thịt trái chất lượng tốt 0,8 mm Không Dày từ Trung Nhỏ Dính chặt vào Chịu rét khá Guatemala hôi 1,5 – 1,8 bình cơm tốt mm Không Trung Thấp To Lỏng, khi Chịu nóng, Antilles hôi bình chín lắc kêu chịu mặn tốt Ở Việt Nam, cây Bơ được trồng lần đầu tiên ở tỉnh Lâm Đồng do người Pháp đưa vào từ những năm 1940 [12]. Những vùng trồng Bơ chủ yếu ở nước ta là những vùng cao thuộc các tỉnh như Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu, Lâm Đồng, Đắk Nông và Đắk Lắk với tổng diện tích 40.000 ha đang thu hoạch [5]. Người kinh doanh thường phân chia trái Bơ thành 3 loại dựa theo hàm lượng và màu sắc của thịt quả [12]: • Bơ sáp: Thịt quả màu vàng sẫm và có hàm lượng dầu cao nhất. • Bơ mỡ: Thịt quả màu vàng @ và cóSchool hàm lượng of dầ uMedicine trung bình. and Pharmacy, VNU 14
• Bơ nước: Thịt quả màu hơi vàng và có hàm lượng dầu thấp nhất. 1.3.2. Đặc điểm thực vật Cây Bơ cao khoảng 20 mét. Lá lúc còn non thường có lông mịn, màu hơi đỏ hoặc màu đồng nhưng đến khi trưởng thành, lá có màu xanh láng và dài [12]. Hình dạng lá rất thay đổi từ hình thuỗn đến hình dao, mỗi lá dài 12 – 25 cm [5]. Chóp lá thường bén nhọn nhưng có vài giống chóp lá hơi tròn. Hoa có màu xanh nhạt hoặc xanh vàng, thường mọc thành chùm trên đoạn cuối cành tạo quả. Mỗi hoa lớn độ 5 - 10 mm, khi hoa nở hoa có đường kính 12 - 14 mm. Quả Bơ có trọng lượng và hình dáng khác nhau tùy giống: tròn, trứng, quả lê, thuỗn, Quả có ba phần rõ rệt: vỏ, thịt và hạt. Bề dày và cấu tạo vỏ thay đổi tùy giống. Quả của những giống thuộc chủng Mexico thường có vỏ mỏng và láng, chủng Guatemala và Antilles thường có vỏ dày hơn [12]. Màu sắc của vỏ quả thay đổi từ màu xanh sáng, màu xanh nhạt, xanh vàng hoặc tím đến tím sẫm khi chín. Thịt quả thường có màu vàng kem hoặc màu vàng sáng, có giống cho thịt màu vàng xanh ở sát phần vỏ quả. Thịt quả có hàm lượng dầu béo rất cao so vớ các loại quả khác. Hạt trái Bơ hình tựa quả trứng, dài 5 – 6 cm, nằm trong trung tâm, màu nâu đậm và rất cứng. Hạt được 2 lớp vỏ lụa bao bọc, gồm có hai tử diệp (nội nhũ) hình bán cầu. Giữa hai tử diệp có phôi hạt nằm về phía cuống trái và khi hạt nảy mầm, cây mầm sẽ mọc thẳng từ dưới lên trên theo trục thẳng đứng của hạt [5]. Mặt ngoài tử diệp trơn láng hoặc sần sùi tùy theo giống và hình dạng cũng thay đổi khá nhiều. 1.3.3. Thành phần hóa học Khối lượng của quả Bơ cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần. Khi quả càng to, phần thịt càng nhiều, các phần hạt và vỏ càng ít. Thành phần thường có tỷ lệ như sau [12]: Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ Bộ phận Tỷ lệ Thịt Bơ 34,7 ± 38 % Vỏ Bơ 23,6 ± 27 % Hạt Bơ 37,5 ± 40,6 % @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
Phần thịt Bơ thường chiếm 1/3 trọng lượng quả Bơ và đây cũng là phần có nhiều thành phần dinh dưỡng nhất được tìm thấy. Thịt Bơ chứa hàm lượng protein, carbohydrat và lipid tương đối cao so với các loại trái cây khác và thay đổi tùy theo vùng sinh thái, giống Bơ, độ chín cũng như thời gian thu hái. Trong thịt Bơ còn chứa khoảng 14 loại vitamin và nhiều khoáng chất cần thiết cho cơ thể [5]. Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA) Thành phần Hàm lượng Đơn vị Calories 171,0 Kcal Thành phần dinh dưỡng chính Protein 2,2 Chất béo 17,0 g Carbohydrat tổng 6,0 Xơ (dietary fiber) 1,5 Chất khoáng Kali 340 – 723 Phospho 20 – 80 Canxi 10 – 15 mg Magie 40 – 60 Sắt 0,5 – 2 Vitamin β-caroten 370 – 750 iu Vitamin B2 95 – 230 µg Vitamin B1 60 – 240 µg Cholin 17 – 22 mg Folacin 30 – 62 µg Vitamin C 1,6 – 30 iu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
Vitamin E 1,6 – 2,4 iu Phytochemical β-sitosterol 75 mg Lutein 293 mcg Một số hợp chất phenol và alkanoid cũng được tìm ra trong thịt Bơ [5] như: Hình 1.4. Công thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy trong Bơ có chứa các hợp chất peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids, cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450 và các tinh dầu [48, 64]. Hạt Bơ chưa được nghiên cứu đầy đủ các chất nhưng cũng phát hiện ra các chất chính có trong một số dịch chiết hạt Bơ [7] bao gồm: 1,3-Dicyclopentyl-2-n- dodecylcyclopentane và Squalene (trong dịch chiết methanol); E-11-Methyl-12- tetradecen-1-ol acetat và Z,Z 4,15-Octadecandien-1-ol acetat (dịch chiết etyl acetate); E-11-Methyl-12-tetradecen-1-ol- acetat và Stigmast-5-en-3-ol (dịch chiết hexan). Trong đó Squalene và Stigmast-5-en-3-ol là hai chất có nhiều ứng dụng trong y học và thực phẩm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
1.3.4. Tác dụng và công dụng Thịt quả Bơ chứa nhiều chất dinh dưỡng, dùng bồi bổ trong những trường hợp: mới ốm dậy, làm việc quá sức, điều trị trạng thái thần kinh dễ kích thích, thừa acid niệu [3]. Quả Bơ cung cấp từ 150 đến 300 calo trên 100g – một nguồn thức ăn dinh dưỡng quan trọng và đã được ghi tên trong sách kỷ lục Guinness là trái cây giàu dinh dưỡng nhất thế giới [4]. Với hàm lượng giàu các vitamin và dưỡng chất cần thiết, trái Bơ trở thành món ăn được khuyến khích dùng cho trẻ ăn dặm và thực phẩm được khuyên dùng. Quả Bơ không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn được sử dụng trong làm đẹp với các cách sử dụng khác nhau như: mặt nạ, đồ uống, thực phẩm giảm cân, Một số cách sử dụng trái Bơ như trộn thịt Bơ với lòng trắng trứng và quyện vào tóc trong 30 phút sau đó gội đầu như bình thường giúp tóc mềm mượt và chắc khỏe hơn; hay mặt nạ dưỡng da gồm một nửa quả Bơ với sữa chua không đường đắp lên mặt 30 phút sau đó rửa sạch giúp da dưỡng ẩm, trắng sáng hơn. Quả Bơ được sử dụng trong làm đẹp do có chứa hơn 14 loại vitamin và nhiều loại khoáng chất bao gồm canxi, sắt, đồng, magiê, kali, natri, là những chất giúp chống oxy hóa, chống lão hóa trong cơ thể. Ngoài ra trái Bơ được sử dụng trong dân gian để chữa một số bệnh như điều trị táo bón với hàm lượng chất xơ cao, điều trị tiểu đường lâu năm do lượng đường thấp và calo cao, cải thiện thị giác, phòng tránh các bệnh về mắt do các chất chống oxy hóa chứa trong quả Bơ giúp trung hòa các gốc tự do và lượng vitamin A cao, Trái Bơ ngày càng được quan tâm trên thị trường thế giới vì không chỉ là món ăn chơi mà còn là nguồn thực phẩm bổ dưỡng được dùng chế biến trong bữa ăn hàng ngày và sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm. Từ đó thúc đẩy các nhà nghiên cứu có những đề tài nghiên cứu sâu hơn về Bơ để khẳng định vai trò của Bơ và ứng dụng Bơ rộng rãi hơn. Chiết xuất hạt quả Bơ có thể giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị loét dạ dày đó là kết luận của Brena Ramos Athaydes và cộng sự khi nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ của phân đoạn ethyl acetate trong chiết xuất hạt Bơ chống lại loét dạ dày do indomethacin gây ra ở chuột [24]. Hạt quả Bơ còn có tác dụng kháng chuẩn khi nghiên cứu cho thấy dịch chiết phân đoạn từ hạt Bơ có hoạt tính kháng các chủng Lactobacillus fermentum [7]. Maha I. Alkhalf và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư của chiết xuất @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
hạt Bơ và quả Bơ để từ đó cho thấy cả hai đều cho tác dụng tốt và hạt Bơ cho tác dụng mạnh hơn thịt quả Bơ [19]. Lá Bơ cũng được nghiên cứu và chỉ ra nhiều tác dụng như làm giảm glucose huyết và hạ cholesterol toàn phần giúp phòng ngừa xơ vữa động mạch [27]; tác dụng trên hệ thần kinh giúp chống co giật [52]; ức chế enzym AChE, butyrylcholinesterase và chống oxy hóa [53], Chiết xuất quả Bơ cũng được nghiên cứu có tác dụng bảo vệ tim chuột dưới tác động của lượng muối tăng cao [54], từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về Bơ trong tương lai. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Hình 2.1. Nguyên liệu chiết xuất Quả và lá Bơ được thu mua vào tháng 10 năm 2018 ở Đắk Lắk. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Quả Bơ thu mua về được rửa sạch, tách riêng các phần vỏ, thịt, hạt và đem thái nhỏ, sấy khô ở 500C. Lá Bơ đươc rửa sạch, sấy khô ở 500C. Phương pháp chiết xuất mẫu: Lấy các mẫu khô: Vỏ (65g), Thịt (100g), Hạt (100g), Lá (50g) chiết xuất bằng ethanol 500 (500ml x 3 lần) bằng phương pháp siêu âm. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao ethanol. Tiến hành đánh giá, phân tích với các mẫu cao tổng để chọn ra mẫu có giá trị và ý nghĩa nhất. Tiếp tục tiến hành chiết phân đoạn mẫu đó với n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 100 mL). 2.1.3. Hóa chất, dung môi - Enzym acetylcholinesterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore) - Acetylthiocholine iodide (ATCI) (Sigma, Singapore) - 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic @acid) School (DTNB) (Sigma, of Medicine Singapore) and Pharmacy, VNU 20
- Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ) - 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, Singapore) - Acid ascorbic 99% (Sigma, Singapore) - Một số hóa chất phòng thí nghiệm: HCl, NaOH - Dung môi: n-hexan, ethylacetat (EtOAc), n-buthanol (n-BuOH), ethanol (Trung Quốc), methanol (MeOH) (Merck), nước cất. 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ - Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản) - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ - Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức) - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ) - Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc, đầu côn các loại - Cuvet (1 ml, 3 ml), Eppendorf 1,5 ml (50 chiếc/túi) - Các dụng cụ thủy tinh: Pipet, bình định mức, bình chiết, các loại cốc có mỏ dung tích 25 – 500 ml, bình cầu và các dụng cụ cần thiết khác. 2.2. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện các mục tiêu để ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau: Nội dung 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của dịch chiết cây Bơ (Persea americana Mill.). • Khảo sát, thu mẫu, giám định tên khoa học; tạo và lưu giữ tiêu bản. • Sơ chế mẫu nghiên cứu, tạo cao chiết tổng lá Bơ và các phần trong quả Bơ. • Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của cao chiết lá Bơ và các phần trong quả Bơ (vỏ, thịt và hạt quả) để chọn phần có tác dụng mạnh nhất. Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất. • Tạo cao chiết phân đoạn của bộ phận có tác dụng mạnh nhất được sàng lọc ở mục tiêu 1 với các dung môi lần lượt là n-hexan, EtOAc, EtOH. • Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết các phân đoạn thu được theo phương pháp DPPH. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
• Đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của cao chiết các phân đoạn thu được theo phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman. • Đánh giá đặc điểm dược động học ức chế enzym AChE của phân đoạn có tác dụng ức chế tốt nhất. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chiết xuất Để đạt được các mục tiêu, đầu tiên cần tiến hành chiết xuất các phần trong quả Bơ và lá Bơ khô bằng ethanol (EtOH) 500 được dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn tạo thành cao tổng để tiến hành thử hoạt tính. Phân tích, đánh giá kết quả thu được của cao tổng các loại: lá, vỏ quả, thịt quả và hạt quả Bơ để đưa ra phần có hoạt tính cao nhất, tiến hành chiết phân đoạn. Cao tổng của phần có hoạt tính cao nhất được tiến hành chiết phân đoạn như sau: Hòa tan cao trong EtOH 500 được dịch chiết, sau đó chiết lần lượt bằng các dung môi n-hexan, EtOAc và n-BuOH thu được các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dịch chiết các phân đoạn để tiến hành thử hoạt tính. 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa Có nhiều phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro được tiến hành. Một trong số đó là phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1- diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) được áp dụng khá phổ biến và có giá trị khoa học cao [7, 18, 29]. Nguyên tắc Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa, dung dịch có màu tím đỏ phản ứng với các chất chống oxy hóa để tạo ra phức hợp màu vàng không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Khi cho chất vào dung dịch này nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Tiến hành đo hấp thụ tại bước sóng này sẽ cho biết lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Khả năng chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng. Cách tiến hành Mẫu thử được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Hỗn hợp phản ứng gồm: 1100 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,08 mg/ml) trong methanol, 100 µl dịch thử các mẫu và @1800 School µl methanol of đư Medicineợc ủ ở 250C trong and 15 Pharmacy, VNU 22
phút. Song song với mỗi mẫu thử, tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 1900 µl methanol và 1100 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,08 mg/ml trong methanol). Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cách đánh giá kết quả Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế I (%) và được tính theo công thức: − 푡 % = 100 (CT1) − 표 Trong đó: I %: Hoạt tính chống oxy hóa Ac: Độ hấp thu của mẫu chứng At: Độ hấp thu của mẫu thử A0: Độ hấp thu của mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết được so sánh với chất chuẩn dương là acid ascorbic. Giá trị chống oxy hóa IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%). 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu lần đầu tiên bởi tác giả Ellman vào năm 1961 [35] và được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu hiện nay. Nguyên tắc phương pháp Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’-dithiobis-2- nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ (cường độ màu) của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman Cách tiến hành Bảng 2.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng STT Thành phần Thể tích (µL) 1 Đệm sodium phosphat 0,1M (pH 8,0) 700 2 Mẫu thử các nồng độ 100 3 AChE 0,5 IU/ml 100 4 DTNB 2,5 mM 50 5 ATCI 2,5 mM 50 Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 1000 ❖ Cách chuẩn bị hóa chất • Pha đệm sodium phosphat 0,1M (pH 8,0) - Dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: 1,807g NaH2PO4 .2H2O trong 50ml nước cất (dung dịch A). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
- Dung dịch dinatri hydrophosphat 0,2M: 35,85g Na2HPO4 .12H2O trong 500 ml nước cất (dung dịch B). - Lấy 26,5 ml dung dịch A, 473,5 ml dung dịch B và 500 ml nước cất định mức trong bình định mức 1000 ml. - Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M. • Pha enzym AChE, cơ chất, thuốc thử Enzym: Từ dung dịch enzym AChE 137 IU/ml có sẵn tại phòng thí nghiệm khoa Y Dược, tiến hành pha loãng tạo dung dịch enzym nồng độ 0,5 IU/ml cần dùng. Cơ chất: Cân chính xác 0,1446g Acetylthiocholin iodid (ATCI) pha trong 25 ml nước cất tạo thành dung dịch có nồng độ 20mM, từ dung dịch đó pha loãng 8 lần thu được dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM. Thuốc thử: Cân chính xác 0,1982g thuốc thử 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pha trong 25ml dung dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM. • Pha các dải nồng độ dung dịch mẫu thử và mẫu đối chứng Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác 10 mg cao tổng của mỗi loại Vỏ, Thịt, Hạt, Lá của Bơ hòa tan trong 10 ml MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch có nồng độ 1mg/ml pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml ; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml. Cân chính xác 10 mg cắn của 4 phân đoạn dịch chiết EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH của phần có hoạt tính tốt nhất ở cao tổng, hòa tan hoàn toàn trong 10 ml MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch có nồng độ 1 mg/ml pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 100 µg/ml; 50 µg/ml; 25 µg/ml ; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml. Dung dịch đối chứng: Cân chính xác 1 mg donepezil hòa tan trong 2 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 500 µg/ml; từ dung dịch này pha loãng thành các nồng độ 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; 1,25 µg/ml; 0,625 µg/ml; 0,3125 µg/ml và 0,15625 µg/ml. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
❖ Cách tiến hành đo kết quả ➢ Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm sodium phosphat pH = 8, dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và dung dịch enzym 0,5 IU/ml vào cuvet 1 ml. Trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. ➢ Sau đó, thêm tiếp dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI vào. Trộn đều và ủ ở 250C trong 10 phút. ➢ Đo độ hấp thụ ở bước song 412 nm. Mỗi thử nghiệm được lặp đi lặp lại 3 lần. Cách đánh giá kết quả Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức: A − A %I = c t x100 (CT2) Ac − Ao Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 100 µl dung dịch thử) At: độ hấp thu của mẫu thử Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1 ml dung dịch đệm sodium phosphat) 2.3.4. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE Dựa trên kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất tiếp tục tiến hành đánh giá động học ức chế AChE ở các nồng độ gần sát giá trị nồng độ IC50 để nghiên cứu động học ức chế. Phương pháp xác định động học ức chế enzym dựa trên sự thay đổi nồng độ cơ chất ATCI và nồng độ dung dịch mẫu thử. Cách tiến hành Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dich chiết có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây. Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm sodium phosphat 0,1M (pH 8.0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ mẫu thử và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 50 µl dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 µl với các nồng độ khác nhau của cơ chất ATCI (1,25; 2,5; 5 mM) và trộn đều. Tiến hành đo độ hấp thụ quang c ủ@a dung School dịch thu ofđượ cMedicine ở bước sóng 412and nm Pharmacy, VNU 26
trong vòng 5 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng các đồ thị 1/[ATCI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Từ đồ thị Dixon plot, hằng số ức chế Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] và 1/V (1/tốc độ phản ứng). Cách đánh giá kết quả Tác dụng ức chế AChE của mẫu thử được xác định bằng giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế (I%) và được tính theo công thức (CT2). Giá trị ức chế enzym AChE IC50 của các mẫu thử được tính dựa vào đồ thị nồng độ mẫu thử và % ức chế xây dựng trên phần mềm Excel. Sử dụng các đồ thị 1/[ATCI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao của các đường nồng độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ nhất với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon – Dixon plot) trên trục Ox. 2.4. Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính dưới sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2013, Sigma Plot 12. Các thuật toán sử dụng: + Giá trị trung bình (X⃐ ) được tính bằng trung bình cộng 3 lần đo. + Độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức: ∑( − ̅)2 SD = √ 푖 푛−1 + Tính tỷ lệ %. + Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn, ký hiệu: X⃐ ± SD. 2 + Giá trị IC50 được tính theo hàm số y = ax + bx + c biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ mẫu thử và phần trăm tác dụng, trong đó x = 50 (%) và y = IC50. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết Lá và quả Bơ sau khi thu mua được sơ chế và bóc tách và sấy tại 500C tạo các mẫu thử khô (hình 3.1). Tiến hành chiết xuất các phần trong quả Bơ (vỏ 65g, hạt 100g, thịt 100g) và lá Bơ (65g) khô bằng ethanol (EtOH) 500 được dịch chiết, lặp lại 3 lần và gộp dịch chiết sau đó lọc. Cô quay thu hồi cắn tạo thành cao tổng để tiến hành thử hoạt tính. Hiệu suất chiết từng phần thu được như sau: Lá 9,03 %; Vỏ 17,51%; Hạt 25,8 %; Thịt 43,65 %. Phân tích, đánh giá kết quả thu được của cao tổng các loại: lá, vỏ, thịt , hạt của quả Bơ để đưa ra phần có hoạt tính cao nhất, tiến hành chiết phân đoạn. Kết quả thu được hạt quả Bơ có tác dụng tốt nhất nên ta tiến hành chiết phân đoạn như sau: Hòa tan cao trong EtOH 50o được dịch chiết, sau đó chiết lần lượt bằng các dung môi n-hexan, Ethyl acetat và n-Butanol thu được các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dịch chiết các phân đoạn để tiến hành thử hoạt tính. Hình 3.1. Sơ đồ chi @ết xu Schoolất phân đo ạofn h ạMedicinet quả Bơ and Pharmacy, VNU 28
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết lá và các phần trong quả Bơ 3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của dịch chiết lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic được trình bày trong hình 3.2 và hình 3.3. Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của lá và các phần trong quả Bơ Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
Từ đồ thị giữa nồng độ và khả năng chống oxy hóa (%) trên ta tính được giá trị IC50 của các mẫu thử được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH Acid Mẫu thử Lá Bơ Vỏ quả Bơ Thịt quả Bơ Hạt quả Bơ ascorbic IC50 142,09 ± 1 161,43 ± 0,88 409,20 ± 0,53 68,70 ± 0,35 4,84 ± 0,35 (µg/ml) Kết quả hình 3.2 cho thấy khả năng quét gốc tự do DPPH của các bộ phận khác nhau và tác dụng chống oxy hóa của các mẫu đều tăng dần theo nồng độ. Từ bảng 3.1 ta có cao chiết hạt quả Bơ có tác dụng quét gốc tự do DPPH tốt nhất với IC50 là 68,70 ± 0,35 µg/ml, sau đó là lá Bơ và vỏ quả Bơ với IC50 lần lượt là 142,09 ± 1,00 µg/ml và 161,43 ± 0,88 µg/ml. Thịt quả Bơ gần như không thể hiện tác dụng chống oxy hóa với giá trị IC50 thu được là 409,20 ± 0,53 µg/ml, gấp gần 100 lần mẫu chứng. Song song với mẫu thử tiến hành tương tự với mẫu chứng là Acid ascorbic thu được giá trị IC50 là 4,84 ± 0,35 µg/ml. 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của dịch chiết lá Bơ, các phần trong Bơ và chất đối chứng Donepezil được trình bày trong hình 3.4, hình 3.5 và bảng 3.2. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của lá và các phần trong quả Bơ Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của Donezepil @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
Bảng 3.2. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE Mẫu thử Lá Bơ Vỏ quả Bơ Thịt quả Bơ Hạt quả Bơ Donepezil IC50 93,72 ± 1,86 376,29 ± 0,68 182,62 ± 2,50 47,43 ± 0,50 0,41 ± 0,12 (µg/ml) Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết hạt quả Bơ cho tác dụng ức chế tốt nhất với IC50 là 47,43 ± 0,5 µg/ml, tiếp theo là cao chiết lá Bơ với IC50 là 93,72 ± 1,86 µg/ml. Và cao chiết thịt quả Bơ và vỏ quả Bơ gần như không cho tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 lần lượt là 182,62 ± 2,5 µg/ml và 376,29 ± 0,68 µg/ml. Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng là donepezil thu được giá trị IC50 là 0,41 ± 0,12 µg/ml. Với tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE tốt nhất, cao chiết hạt quả Bơ được lựa chọn tiến hành chiết phân đoạn để đánh giá hoạt tính. 3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt quả Bơ 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH Tác dụng chống oxy hóa in vitro trên mô hình quét gốc tự do DPPH của các mẫu thử phân đoạn dịch chiết ở các nồng độ khác nhau của hạt Bơ được trình bày ở hình 3.6 và bảng 3.3. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn hạt quả Bơ Giá trị IC50 của các phân đoạn hạt quả Bơ và acid ascorbic được tính dựa vào phương trình đồ thị giữa nồng độ mẫu thử và phần trăm ức chế được biểu diễn ở hình 3.4 và hình 3.6. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Giá trị IC50 các phân đoạn từ hạt quả Bơ và acid ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH Acid Mẫu thử n-hexan EtOAc n-BuOH EtOH ascorbic IC50 78,47 ± 1,05 59,51 ± 1,61 15,73 ± 0,42 87,63 ± 0,26 4,84 ± 0,35 (µg/ml) Từ bảng 3.3 cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao nhất với IC50 là 15,73 ± 0,42 µg/ml. Tiếp theo là các phân đoạn khác có tác dụng thấp hơn là phân đoạn EtOAc và n-hexan với giá trị IC50 lần lượt là 59,51 ± 1,61 µg/ml và 78,47 ± 1,05 µg/ml, phân đoạn EtOH có tác dụng chống oxy hóa thấp nhất trong các phân đoạn với IC50 là 87,63 ± 0,26 µg/ml. Song song với các @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng là acid ascorbic ta thu được giá trị IC50 là 4,84 ± 0,35 µg/ml. 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE Khả năng ức chế enzym AChE của các mẫu thử phân đoạn dịch chiết ở các nồng độ khác nhau của hạt Bơ được trình bày ở hình 3.7 và bảng 3.4. Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết hạt quả Bơ Giá trị IC50 của các phân đoạn hạt quả Bơ được tính dựa vào phương trình đồ thị giữa nồng độ mẫu thử và phần trăm ức chế được biểu diễn ở hình 3.7. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE Mẫu thử n-hexan EtOAc n-BuOH EtOH Donepezil IC50 52,19 ± 1,10 99,94 ± 3,23 15,24 ± 0,52 92,24 ± 0,88 0,41 ± 0,12 (µg/ml) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
Từ bảng 3.4 cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất với IC50 là 15,24 ± 0,52 µg/ml, so với các phân đoạn khác có tác dụng ức chế enzym AChE thấp hơn là phân đoạn n-hexan với giá trị IC50 là 52,19 ± 1,10 µg/ml, phân đoạn EtOH với giá trị IC50 là 92,24 ± 0,88 µg/ml và phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp nhất trong các phân đoạn với IC50 là 99,94 ± 3,23 µg/ml. 3.3.3. Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE Phân đoạn n-BuOH có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất nên phân đoạn này được lựa chọn sử dụng để xác định động học ức chế enzym AChE. Phương pháp xác định động học ức chế enzym dựa trên sự thay đổi nồng độ cơ chất ATCI và nồng độ dung dịch thử n-BuOH. Do giá trị IC50 của phân đoạn dịch chiết n- BuOH là 15,24 ± 0,52 µg/ml nên ta tiến hành đo tại các nồng độ gần sát giá trị IC50 là 0; 7,5; 15 và 30 µg/ml. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE Động học ức chế enzym AChE được mô tả bằng đồ thị Lineweaver-Burk, được xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của cơ chất ATCI ở các nồng độ khác nhau. Tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết n-BuOH của hạt quả Bơ thể hiện trong hình 3.8 (Đồ thị Lineweaver-Burk plot). Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định được kiểu ức chế enzym AchE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH là ức chế hỗn hợp [11, 74]. Hình 3.8. Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt qu @ả Bơ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
Đồ thị động học Dixon của phân đoạn dịch chiết n-BuOH được xây dựng dựa trên đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng của phân đoạn dịch chiết n-BuOH ở các nồng độ 0; 7,5; 15; 30 µg/mL trong hình 3.9. Hình 3.9. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ để xác định hằng số ức chế Ki Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của các đường. Từ hình 3.9 ta thấy giá trị Ki được xác định theo đồ thị là 9,07 ± 0,21 µg/ml. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của dịch chiết lá và quả Bơ Theo các nghiên cứu về bệnh học Alzheimer thì quá trình oxy hóa kéo dài là một đặc điểm điển hình của bệnh với đặc điểm là lượng peroxid hóa lipid, oxy hóa protein và oxy hóa ADN đều tăng cao trong não [6]. Các nghiên cứu đã chỉ ra nguyên nhân của quá trình oxy hóa này chủ yếu là do protein beta – amyloid gây ra trên tế bào thần kinh nên phương hướng tiếp cận điều trị sẽ là sử dụng các liệu pháp chống oxy hóa. Phương pháp DPPH là một trong các phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới [1]. Vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử. Chất đối chứng chúng tôi sử dụng là acid ascorbic thu được giá trị IC50 của acid ascobic là 4,84 ± 0,35 µg/ml tương đồng với các nghiên cứu trước đây [67, 77] cho thấy phương pháp thử nghiệm phù hợp và kết quả thu được có ý nghĩa. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cao chiết từ lá và các phần trong quả Bơ đều có tác dụng quét các gốc tự do DPPH và khi các nồng độ biến thiên thì khả năng quét các gốc tự do cùng biến thiên theo. Trong đó, cao chiết từ hạt quả Bơ cho tác dụng tốt nhất so với các bộ phận còn lại với IC50 là 68,70 ± 0,35 µg/ml. Điều này chứng tỏ, trong cao chiết hạt quả Bơ chứa nhiều chất có khả năng quét các gốc tự do DPPH hơn các phần khác như phenol, sterol, flavonoid. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi tác giả Maha I Alkhalf đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa chỉ ra hạt quả Bơ có tác dụng chống oxy hóa tốt hơn thịt quả Bơ [19]. Hạt quả Bơ cũng được tác giả Gómez nghiên cứu để sử dụng làm chất chống oxy hóa trong thực phẩm [73]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt quả Bơ [66, 72]. Bên cạnh liệu pháp chống oxy hóa thì một hướng điều trị nữa được tiến hành nghiên cứu trong điều trị bệnh Alzheimer là nghiên cứu các chất ức chế enzym AChE – xúc tác quá trình thủy phân chất dẫn truyền ACh mà theo nghiên cứu nồng độ chất dẫn truyền ACh giảm trầm trọng ở bệnh nhân Alzheimer gây suy giảm khả năng nhận thức của người bệnh [6, 10]. Với nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác, phương pháp đo quang Ellman được chúng tôi sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các mẫu thử v ớ@i m ộSchoolt số thay đổ ofi cho Medicine phù hợp với đi ềandu kiệ nPharmacy, VNU 37
nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng chất đối chứng là Donepezil vì đây là một trong những thuốc được FDA chấp thuận sử dụng cho bệnh nhân bị Alzheimer thông qua cơ chế ức chế AChE [75]. Bên cạnh đó nó cũng được sử dụng phổ biến làm chất đối chứng trong các thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE [71, 76]. Kết quả thu được Donezepil thể hiện khả năng ức chế AChE rõ rệt với giá trị IC50 là 0,41 ± 0,12 µg/ml tương đồng với các nghiên cứu trước đây như của Fernandes và cộng sự hay Ahmad Mohammadi-Farani và cộng sự [71, 76]. Vì vậy phương pháp và chất đối chứng lựa chọn là phù hợp với thí nghiệm này. Bằng phương pháp Ellman chúng tôi nghiên cứu thấy lá và các phần trong quả Bơ đều có tác dụng ức chế enzym AChE theo cách thức phụ thuộc vào nồng độ chất thử, nghĩa là tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ thử. Cao chiết hạt quả Bơ cho thấy khả năng ức chế cao nhất với IC50 là 47,43 ± 0,5 µg/ml do trong hạt quả Bơ chứa hàm lượng cao các chất có khả năng ức chế enzym AChE như phenolic, saponin, alkanoid, terpenoid Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu trước đây của Oboh và cộng sự đã kết luận dịch chiết hạt quả Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE và chống oxy hóa [78]. Như vậy, với việc kết quả thu được từ việc đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE ta đã sàng lọc được trong các mẫu thử từ lá Bơ và các phần của quả Bơ thì cao chiết hạt quả Bơ cho tác dụng tốt nhất. Tuy nhiên, không nên tự ý sử dụng hạt quả Bơ bởi trong hạt quả Bơ còn chứa nhiều thành phần gây độc và tác dụng không mong muốn như các hợp chất tanin, alkanoid, flavonoid Do đó, cần nghiên cứu tách chiết các chất có tác dụng dược lý để an toàn và hiệu quả trong sử dụng. 4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn trong dịch chiết hạt quả Bơ bao gồm các phân đoạn: n-hexan, EtOAc, n-BuOH và EtOH. Chúng tôi vẫn tiếp tục sử dụng phương pháp DPPH, phương pháp thuốc thử Ellman và các chất đối chứng đã chọn để đánh giá tác dụng của các phân đoạn thu được. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa cho thấy phân đoạn n-BuOH của cao chiết hạt quả Bơ có tác dụng tối nhất với IC50 là 15,73 ± 0,42 µg/ml chỉ gấp gần bốn lần so với chất đối chứng acid ascorbic có giá trị IC50 là 4,84 ± 0,35 µg/ml. Như @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
vậy các chất có hoạt tính chống oxy hóa chủ yếu nằm trong phân đoạn n-BuOH và có hoạt tính khá mạnh. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn hạt quả Bơ cũng cho thấy phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt nhất với IC50 = 15,24 ± 0,52 µg/ml. Tiếp theo là các phân đoạn n-hexan với IC50 = 52,19 ± 1,10 µg/ml, phân đoạn EtOH với IC50 = 92,24 ± 0,88 µg/ml và kém nhất là vỏ quả Bơ tại IC50 = 99,94 ± 3,23 µg/ml. Từ đó cho thấy, các chất có tác dụng ức chế enzym AChE tập trung nhiều trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ. Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết hạt quả Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE và chống oxy hóa cao nhất trong các phân đoạn có thể giải thích là do BuOH là dung môi phân cực nên các hợp chất như phenol, flavonois tan chủ yếu trong dung môi này. Kết quả tác dụng ức chế enzym AChE và chống oxy hóa là do tác dụng hiệp đồng của các hợp chất trong phân đoạn dịch chiết này. Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào phân lập, xác định hợp chất và làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của các hợp chất. Với kết quả thu được, phân đoạn n-BuOH của hạt quả Bơ luôn được đánh giá tốt hơn so với các dịch chiết còn lại, đồng thời dộng học ức chế enzym AChE của dịch chiết hạt quả Bơ chưa từng được công bố trước đây nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu để đánh giá động học ức chế enzym của phân đoạn này. Đồ thị động học Lineweaver–Burk có tính chất trung gian giữa 2 kiểu ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế của phân đoạn dịch chiết n-BuOH là kiểu ức chế hỗn hợp (trong đồ thị Lineweaver–Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km). Đồ thị động học Dixon có tính chất đặc trưng của chất ức chế cạnh tranh. Hằng số ức chế Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao của 3 đường trên trục Ox trên đồ thị Dixon, được vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Giá trị Ki được xác định theo đồ thị Dixon là 9,07 ± 0,21 µg/ml. Ki là hằng số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu của chất ức chế, còn gọi là hằng số phân ly của phức hợp enzym – chất ức chế. Nếu hằng số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động sẽ nhỏ, do vậy tác dụng ức chế mạnh. Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết hạt quả Bơ có giá trị hằng số Ki nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh. Kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu, nguyên nhân là do trong thành phần dịch chiết có chứa một loạt các hợp chất có nhiều cơ chế tác dụng khác nhau. Cơ chế ức chế cho thấy các hợp chất có hoạt tính trong @ phân School đoạn dịch of chi ếMedicinet n-BuOH có th andể cạnh Pharmacy, VNU 39
tranh với ATCI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với cơ chất của enzym AChE hoặc kết hợp với enzym AChE hoặc kết hợp với phức hợp AChE- ATCI. Như vậy, từ nghiên cứu cho thấy lá Bơ, vỏ, thịt và hạt quả Bơ đều có tác dụng chống oxy hóa và ức chế ẠChE ở mức độ khác nhau. Trong đó hạt quả Bơ được đánh giá có tác dụng tốt nhất. Những kết quả đầy hứa hẹn này càng góp phần chỉ ra giá trị của các bộ phận thải cũng có giá trị đáng quan tâm. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi không khuyến khích nên sử dụng hạt Bơ trong thực phẩm chăm sóc sức khỏe bởi chưa có nghiên cứu cụ thể về lượng dùng và tác dụng phụ của hạt Bơ có thể gây ra. Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để phân lập, xác định hợp chất có hoạt tính cụ thể và làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của các hợp chất. Mặc dù kết quả nghiên cứu chưa chỉ ra hoạt chất cụ thể và cơ chế tác dụng của hợp chất nhưng cũng góp phần bổ sung cho cơ sở dữ liệu về những chất có tác dụng chống oxy hóa và ức chế AChE nói chung đồng thời là căn cứ cho những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất trong quả Bơ và lá Bơ có tác dụng trong hỗ trợ phòng và điều trị bệnh Alzheimer. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN 1. Về sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.) ✓ Đã sàng lọc được tác dụng chống oxy hóa của các bộ phận cây Bơ bằng phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH, thu được hạt quả Bơ có tác dụng tốt nhất (IC50 = 68,70 ± 0,35 µg/ml), sau đó lần lượt đến lá, vỏ và thịt quả. ✓ Đã sàng lọc được khả năng ức chế enzym AChE của các bộ phận cây Bơ bằng phương pháp đo quang Ellman, thu được hạt quả Bơ có tác dụng tốt nhất ( với IC50 = 47,43 ± 0,50 µg/ml), sau đó lần lượt đến lá, thịt và vỏ quả. 2. Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất ✓ Đã đánh giá được tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ thu được phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt nhất (IC50 = 15,73 ± 0,42 µg/ml), sau đó đến các phân đoạn EtOAc, n-hexan và EtOH. ✓ Đánh giá được khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ thu được phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt nhất (IC50 = 15,24 ± 0,52 µg/ml), sau đó đến các phân đoạn n-hexan, EtOH và EtOAc. ✓ Đã đánh giá được đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH của hạt quả Bơ là kiểu ức chế hỗn hợp với hằng số Ki tìm được là 9,07 ± 0,21 µg/ml. ĐỀ XUẤT 1. Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của hạt quả Bơ. 2. Tiến hành nghiên cứu sâu hơn để tinh chế các hợp chất tinh khiết trong các phân đoạn dịch chiết hạt quả Bơ có tiềm năng trong phòng, điều trị các bệnh liên quan đến Alzheimer và rối loạn thần kinh để phục vụ cho nghiên cứu khoa học và ứng dụng trên lâm sàng. 3. Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE của dịch chiết hạt quả Bơ in vivo và nghiên cứu lâm sàng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đàm Trung Bảo (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược học, 6, 29 - 30. 2. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam. 3. TS. Trương Thị Đẹp (2011), Thực vật Dược, Bộ Y Tế. 4. Nguyễn Văn Đoàn (2016), "Phát triển bền vững cây bơ trên địa bàn huyện Krông Ana tỉnh Đắk Lắk". 5. Võ Tấn Hậu (2008), "Nghiên cứu công nghệ sản xuất dầu béo và bột bơ loại béo từ trái bơ (Avocado)", Viện công nghệ thực phẩm - Bộ công thương. 6. Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bản Y học. 7. Lê Thị Tuyết Ngân (2012), "Nghiên cứu xác định thành phần hóa học có trong một số dịch chiết của hạt quả Bơ ở Đăk Lăk ", Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng. 8. Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, and Nguyễn Trọng Thông (2011),Dược lý học. NXB Giáo dục Việt Nam. 9. Lê Thành Phước (2016), "Chất chống oxy hóa và nguyên tố vi lượng thiết yếu", Tài liệu chuyên đề D5K66. 10. Phan Kế Sơn (2017), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinsterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng Liên Ô rô (Mahonia Nepalensis DC., họ Berberidaceae)", Khóa luận tốt nghiệp Đại học ngành Dược học, Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Nguyễn Xuân Thắng (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Y học. 12. Huỳnh Như Thủy Tiên (2008), "Tìm hiểu về trái bơ và sản xuất thử nghiệm một số sản phẩm từ phần nạc của trái bơ", Đại học Kĩ thuật công nghiệp TP.HCM. 13. Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, Hà Nội, NXB Khoa học và kỹ thuật. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tiếng Anh 14. Adewusi, E.A. and V. Steenkamp (2011), "In vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from southern Africa", Asian Pacific journal of tropical medicine, 4(10), 829-835. 15. Adeyemi, O., S. Okpo, and O. Ogunti, (2002), Analgesic and anti- inflammatory effects of the aqueous extract of leaves of Persea americana Mill (Lauraceae). 375-380. 16. Adsersen, A., et al. (2006), "Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity", Journal of ethnopharmacology, 104(3), 418-422. 17. Alam, M.N., N.J. Bristi, and M. Rafiquzzaman (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharm J, 21(2), 143-52. doi:10.1016/j.jsps.2012.05.002 18. Alam, M.N., N.J. Bristi, and M. Rafiquzzaman (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharmaceutical Journal, 21(2), 143-152. 19. Alkhalf, M.I., et al. (2018), "Anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activities of avocado (Persea americana) fruit and seed extract", Journal of King Saud University-Science. 20. Alzheimer's, A. (2012), "2012 Alzheimer's disease facts and figures", Alzheimers Dement, 8(2), 131-68. doi:10.1016/j.jalz.2012.02.001 21. Ansari, N.a.F.K. (2013),Natural products as promising drug candidates for the treatment of Alzheimer’s disease: molecular mechanism aspect. 414- 429. 22. Antia, B., J. Okokon, and P. Okon (2005), "Hypoglycemic activity of aqueous leaf extract of Persea americana Mill", Indian journal of pharmacology, 37(5), 325. 23. Association, A.s. (2017),Alzheimer's disease facts and figures. 325-373. 24. Athaydes, B.R., et al. (2019), "Avocado seeds (Persea americana Mill.) prevents indomethacin-induced gastric ulcer in mice", Food Research International, 119, 751-760. 25. Barril, X., M. Orozco, and F.J. Luque (2001), "Towards improved acetylcholinesterase inhibitors: a structural and computational approach", Mini Rev Med Chem, 1(3), 255-66. 26. Battle, D.E. (2013), "Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM)", Codas, 25(2), 191-2. 27. Brai, B., A. Odetola, and P. Agomo (2007), "Effects of Persea americana leaf extracts on body weight and liver lipids in rats fed hyperlipidaemic diet", African journal of Biotechnology ,@ 6(8). School of Medicine and Pharmacy, VNU
28. Brai, B.I., A. Odetola, and P. Agomo, (2007), "Hypoglycemic and hypocholesterolemic potential of Persea americana leaf extracts", Journal of medicinal food, 10(2), 356-360. 29. Carocho, M. and I.C. Ferreira (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, 15-25. 30. Carr, A.C. and B. Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", Am J Clin Nutr, 69(6), 1086-107. doi:10.1093/ajcn/69.6.1086 31. Di Giovanni, S., et al. (2008), "In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods", Eur J Pharm Sci, 33(2), 109-19. doi:10.1016/j.ejps.2007.10.004 32. Dzeufiet, P.D.D., et al. (2014), Antihypertensive potential of the aqueous extract which combine leaf of Persea americana Mill.(Lauraceae), stems and leaf of Cymbopogon citratus (DC) Stapf.(Poaceae), fruits of Citrus medical L.(Rutaceae) as well as honey in ethanol and sucrose experimental model. 507. 33. Ellman, G.L., et al. (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical pharmacology, 7(2), 88-95. 34. Essa, M.M., et al. (2012), "Neuroprotective effect of natural products against Alzheimer's disease", Neurochem Res, 37(9), 1829-42. 35. Ezio Giacobini (2000), Cholinesterase and cholinesterase inhibitors, London. 36. Grossberg, G.T. (2003), "Cholinesterase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease:: getting on and staying on", Curr Ther Res Clin Exp, 64(4), 216-35. doi:10.1016/S0011-393X(03)00059-6 37. Halliwell, B. (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", Lancet, 344(8924), 721-4. 38. Heim, K.E., A.R. Tagliaferro, and D.J. Bobilya (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", The Journal of nutritional biochemistry, 13(10), 572-584. 39. Houghton, P.J., Y. Ren, and M.J. Howes (2006), "Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi", Nat Prod Rep, 23(2), 181-99. doi:10.1039/b508966m 40. Howes, M.J.R., N.S. Perry, and P.J (2003), Houghton, Plants with traditional uses and activities, relevant to the management of Alzheimer's disease and other cognitive disorders. 1-18. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
41. Liu, W. (2012), Introduction to modeling biological cellular control systems, (6), Springer Science & Business Media. 42. López-Alarcón, C. and A. Denicola (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular-based assays", Analytica chimica acta, 763, 1-10. 43. Marston, A. (2011), "Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry", J Chromatogr A, 1218(19), 2676-83. doi:10.1016/j.chroma.2010.12.068 44. McGleenon, B., K. Dynan, and A. Passmore (1999), "Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease", British journal of clinical pharmacology, 48, 471-480. 45. Mikiciuk-Olasik, E., P. Szymański, and E. Żurek (2007), "Diagnostics and therapy of Alzheimer’s disease", Indian Journal of Experimental Biology, 45, 325. 46. Min, B.S., et al. (2010), "Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds", Archives of pharmacal research, 33(10), 1665-1670. 47. Molyneux and Philip (2004), "The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity", Songklanakarin J. Sci. Technol, 26(2), 211-219. 48. Moreno, A.O., et al (2003), "Effect of different extraction methods on fatty acids, volatile compounds, and physical and chemical properties of avocado (Persea americana Mill.) oil", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8), 2216-2221. 49. Musicco, M., et al. (2013), "Inverse occurrence of cancer and Alzheimer disease: a population-based incidence study", Neurology, 81(4), 322-8. doi:10.1212/WNL.0b013e31829c5ec1 50. Nguyen, Q.-V. and J.-B. Eun (2011), "Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants", Journal of Medicinal Plants Research, 5(13), 2798-2811. 51. Oboh, G., et al. (2016), "Aqueous extracts of avocado pear (Persea americana Mill.) leaves and seeds exhibit anti-cholinesterases and antioxidant activities in vitro", Journal of basic and clinical physiology and pharmacology, 27(2), 131-140. 52. Ojewole, J.A. and G.J. Amabeoku (2006), "Anticonvulsant effect of Persea americana Mill (Lauraceae) (Avocado) leaf aqueous extract in mice", Phytother Res, 20(8), 696-700. doi:10.1002/ptr.1940 53. Ojewole, J.A.a.G.J.A. (2006), "Anticonvulsant effect of Persea americana Mill (Lauraceae)(Avocado) leaf aqueous extract in mice", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 20(8), 696-700. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
54. Olushola, A.I., et al. (2017), "Biochemical Effects of Aqueous Extract of Persea americana (Mill) on the Myocardium of Left Ventricle of High Salt– Fed Adult Wistar Rats", Journal of Evidence-Based Complementary & Alternative Medicine, 22(4), 765-769. 55. Pappas, B.A., et al (2000), "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain scores of Alzheimer’s patients", Neurobiology of aging, 21(1), 11- 17. 56. Peng, L., et al. (2017), "A novel assay to determine acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease", Biomed Chromatogr, 31(10). doi:10.1002/bmc.3971 57. Pohanka, M. (2011), "Cholinesterases, a target of pharmacology and toxicology", Biomedical Papers of the Medical Faculty of Palacky University in Olomouc, 155(3), 219 -229. 58. Schiff P. L. (1997), "Bisbenzylisoquinoline alkaloids", J. Nat. Prod, 60, 934 – 953. 59. Selkoe, D.J. (2001), "Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy", Physiological reviews, 81(2), 741-766. 60. Tang, Z.M., Z.Y. Wang, and J.W. Kang (2007), "Screening of acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique", Electrophoresis, 28(3), 360-5. doi:10.1002/elps.200600327 61. Upadhyaya, P., V. Seth, and M. Ahmad, (2010), "Therapy of Alzheimer’s disease: An update", Afr. J. Pharm. Pharmacol, 4(6), 408-421. 62. Watkins, P.B., et al., (1994),Hepatotoxic effects of tacrine administration in patients with Alzheimer's disease. . 992-998. 63. Whitehouse, P.J., et al. (1982), "Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain", Science, 215(4537), 1237-1239. 64. Yasir, M., S. Das, and M. Kharya, (2010), "The phytochemical and pharmacological profile of Persea americana Mill", Pharmacognosy reviews, 4(7), 77. 65. Ziegler-Graham, K., Brookmeyer, R., Johnson, E., Arrighi, H.M. (2008), "Worldwide variation in the doubling time of Alzheimer’s disease incidence rates", Alzheimers Dement, 4, 316–323. 66. Alagbaoso, C.A., I.I. Tokunbo, and O.S. Osakwe (2017), "Comparative study of antioxidant activity and mineral composition of methanol extract of seeds of ripe and unripe avocado pear (Persea americana, Mill.)", NISEB Journal, 15(4). 67. Bao, Y., et al. (2018), "In vitro and in vivo antioxidant activities of the flowers and leaves from Paeonia rockii and identification of their antioxidant @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
constituents by UHPLC-ESI-HRMSn via pre-column DPPH reaction", Molecules, 23(2), 392. 68. Cowan, A. and B. Wolstenholme (2016), "Avocado". 69. De Matos, A.M., M.P. de Macedo, and A.P. Rauter (2018), "Bridging type 2 diabetes and Alzheimer's disease: assembling the puzzle pieces in the quest for the molecules with therapeutic and preventive potential", Medicinal research reviews, 38(1), 261-324. 70. Di Domenico, F., et al. (2015), "Strategy to reduce free radical species in Alzheimer’s disease: an update of selected antioxidants", Expert review of neurotherapeutics, 15(1), 19-40. 71. Fernandes, T.B., et al. (2017), "Synthesis, Molecular Modeling, and Evaluation of Novel Sulfonylhydrazones as Acetylcholinesterase Inhibitors for Alzheimer's Disease", Archiv der Pharmazie, 350(11), 1700163. 72. Folasade, O.A., R.A. Olaide, and T.A. Olufemi (2016), "Antioxidant properties of Persea americana M. seed as affected by different extraction solvent", Journal of Advances in Food Science & Technology, 3(2), 101-106. 73. Gómez, F., et al. (2014), "Avocado seeds: extraction optimization and possible use as antioxidant in food", Antioxidants, 3(2), 439-454. 74. Mills, S. and K. Bone (2000), Principles and practice of phytotherapy. Modern herbal medicine, Churchill Livingstone. 75. Mohammad, D., et al. (2017), "Acetylcholinesterase inhibitors for treating dementia symptoms-a safety evaluation", Expert opinion on drug safety, 16(9), 1009-1019. 76. Mohammadi-Farani, A., S.S. Darbandi, and A. Aliabadi (2016), "Synthesis and acetylcholinesterase inhibitory evaluation of 4-(1, 3-dioxoisoindolin-2- yl)-N-phenyl benzamide derivatives as potential anti-alzheimer agents", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 15(3), 313. 77. Mowsumi, F.R., et al. (2015), "In vitro relative free radical scavenging effects of Calocybe indica (milky oyster) and Pleurotus djamor (pink oyster)", World J. Pharm. Pharm. Sci., 4(07), 186-195. 78. Oboh, G., et al. (2016), "Aqueous extracts of avocado pear (Persea americana Mill.) leaves and seeds exhibit anti-cholinesterases and antioxidant activities in vitro", Journal of basic and clinical physiology and pharmacology, 27(2), 131-140. 79. Sies, H. (2015), "Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine", Redox biology, 4, 180-183. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU