Khóa luận Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)

152 trang thiennha21 18/04/2022 5711

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_xay_dung_va_tham_dinh_quy_trinh_dinh_luong_dong_th.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ LÊ VÂN NGUYỄN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN LÊ VÂN HÀ QUẢN LÝ VÀ C QUẢN LÝ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG UNG ỨNG THUỐC UNG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) KHÓA 2013 KHÓA 2013 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC TPHCM – 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN LÊ VÂN HÀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung TPHCM – Năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chữ ký SV SV. Nguyễn Lê Vân Hà
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS. Dương Đình Chung, người thầy đã tận tình hướng dẫn cũng như truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp tôi bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và hoàn thành tốt khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị trong bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm cũng như các thầy cô trong khoa Dược – trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình truyền dạy cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ trường Đại học Nguyễn Tất Thành, những người đã trang bị cho tôi rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để tôi có được thành quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn!
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs 2 1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton 2 1.1.2. Công thức hóa học và tính chất 3 1.1.3. Cơ chế tác dụng 4 1.1.4. Dược động học 4 1.1.5. Dược lực học 4 1.1.6. Tác dụng không mong muốn 4 1.1.7. Chỉ định 4 1.1.8. Chống chỉ định 5 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC 5 1.2.1. Trên thế giới 5 1.2.2. Trong nước 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 8 1.3.1. Cơ sở lý thuyết 8 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 8 1.3.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 9 1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11 1.3.5. Một số phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng HPLC 13 1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 14 1.4.1. Khái niệm 14 1.4.2. Các chỉ tiêu thẩm định 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2. Hóa chất, dung môi 18 i
2.1.3. Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu 18 2.1.4. Dụng cụ, máy móc, thiết bị 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Các dung dịch thử nghiệm 19 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 28 3.1.2. Kết quả khảo sát pha động 29 3.1.3. Lựa chọn nội chuẩn 34 3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 36 3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN 39 3.3.1. Tính tương thích hệ thống 39 3.3.2. Thẩm định tính đặc hiệu 42 3.3.3. Thẩm định độ tuyến tính 45 3.3.4. Giới hạn định lượng dưới 48 3.3.5. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại 49 3.3.6. Hiệu suất chiết 54 3.3.7. Độ ổn định 54 3.4. BÀN LUẬN 62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1. KẾT LUẬN 67 4.2. KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril AUC Area Under Curve Diện tích dưới đường cong Cmax Nồng độ đỉnh CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên DĐVN Dược điển Việt Nam EMA European Medicine Agency Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu Cơ quan quản lý thực phẩm và FDA Food and Drug Administration thuốc Hoa Kỳ HQC High Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ cao High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HT Huyết tương IDM Indomethacin Indomethacin IS Internal Standand Chất nội chuẩn KLPT Khối lượng phân tử LLOQ Lower Limit Of Quantification Giới hạn định lượng dưới LPZ Lansoprazole Lansoprazol LQC Lower Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeOH Methanol Methanol MP Mobile phase Pha động MQC Middle Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình OPZ Omeprazole Omeprazol PDA/ Photodiod array Dãy diod quang DAD iii
PPIs Proton Pump Inhibitors Ức chế bơm proton PPZ Pantoprazole Pantoprazol RPZ Rabeprazole Rabeprazol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối S Standard Chất chuẩn SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ S/N Signal/Noise SW Standard Working Dung dịch chuẩn làm việc TB Trung bình TĐSH Tương đương sinh học TEA Triethylamine Triethylamin The United States USP Dược điển Mỹ Pharmacopoeia UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiến iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20 Hình 3.1. Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ 29 Hình 3.2. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 30 Hình 3.3. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) 30 Hình 3.4. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 31 Hình 3.5. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25 : 75) 31 Hình 3.6. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (25 : 75) 32 Hình 3.7. SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45) 33 Hình 3.8. SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, 33 Hình 3.9 SKĐ: a. chất nội chuẩn domperidone và PPIs; b. chất nội chuẩn metronidazole và PPIs và c. chất nội chuẩn indomethacin và PPIs 35 Hình 3.10. SKĐ: a. huyết tương trắng; b. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH; c. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH thêm dung dịch kiềm hóa KOH, d. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và e. Mẫu chuẩn, nội chuẩn pha trong pha động (hệ pha động số 7). 38 Hình 3.11. SKĐ: a. mẫu huyết tương trắng; b. mẫu thử giả lập; c. mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn; d. mẫu pha động 43 Hình 3.12. Phổ hấp thu UV: a. IS; b. PPZ; c. OPZ; d. RPZ ; e. LPZ; Độ tinh khiết pic: f. IS; g. PPZ; h. OPZ; i. RPZ ; j. LPZ 44 Hình 3.13. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của PPZ 45 Hình 3.14. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của OPZ 46 Hình 3.15. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của RPZ 47 Hình 3.16. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của LPZ 48 v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Công thức hóa học và tính chất của các PPIs 3 Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới 5 Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 18 Bảng 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu 18 Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu 23 Bảng 3.1. Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu 39 Bảng 3.2. Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống 41 Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ 45 Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ 46 Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ 47 Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ 48 Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày) 49 Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày 50 Bảng 3.9. Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng) 51 Bảng 3.10. Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ 52 Bảng 3.11. Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ 53 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS 55 Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của PPZ trong huyết tương 57 Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của OPZ trong huyết tương 58 Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của RPZ trong huyết tương 59 Bảng 3.16. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của LPZ trong huyết tương 60 Bảng 3.17. Kết quả phân tích thống kê nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương 61 vi
TÓM TẮT Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) Nguyễn Lê Vân Hà Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung Mở đầu Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) bao gồm Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ), được dùng để điều trị bệnh trào ngược dạ dày - thực quản, loét dạ dày tá tràng, Tuy nhiên việc định lượng riêng lẻ từng hoạt chất trong nhóm thuốc này phải qua nhiều quy trình khác nhau gây phức tạp và tốn kém. Do đó, mục tiêu của đề tài là xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC theo hướng dẫn của FDA. Đồng thời ứng dụng quy trình này để phát triển vào nghiên cứu dược động học lâm sàng đối với nhóm thuốc PPIs. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các thuốc OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương. Phương pháp nghiên cứu: xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD). Kết quả Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời bốn PPIs trong huyết tương bằng phương pháp HPLC là: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), đầu dò DAD với bước sóng phát hiện 285 nm, pha động là hỗn hợp nước 0,3 % TEA (pH = 7,2 được điều chỉnh bằng acid acetic) – ACN – MeOH (53 : 15 : 32, tt/tt/tt), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, nhiệt độ cột là 45ºC. Quy trình đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA. Kết luận Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang. Quy trình đã được thẩm định, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA. Từ khóa: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, định lượng, thẩm định.
ABSTRACT Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 -2018 DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD (HPLC – DAD) FOR THE SIMULTANEOUS DETERMINATION OF OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE AND LANSOPRAZOLE IN HUMAN PLASMA Nguyen Le Van Ha Supervisor: B.S. Duong Dinh Chung Introduction Proton pump inhibitors (PPIs), viz. Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) and Rabeprazole (RPZ), are used for treating gastro-oesophagal reflux disease, duodenal gastric ulcers, However, the quantitation of these compounds is often complex and difficult as each component requires each analytical procedure. Therefore, the aim of this study is to develop and validate a simple and rapid reverse-phase HPLC method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines. The developed method is applied to a pharmacokinetic study for PPIs. Materials and methods Materials: OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma. Methods: Developing and validating the method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC - DAD). Results The separation of the four components was performed on XDB Zobrax C18 column (150 x 4.6 mm, 5 µm), using the mixture of 0.3% triethylamine (pH 7.2 adjusted with acetic acid) – acetonitrile – methanol (53 : 15 : 32, v/v/v) as a mobile phase. An isocratic elution was made at 45ºC, flow rate of 1.0 ml/min with 20 μL injection volume. The UV detection was performed at 285 nm. Validation results showed that the method is suitable for the HPLC system and the procedure obtained the specificity, accuracy, precision, lower limit of quantitation, linearity, and stability according to the FDA guidelines. Conclusion A reverse-phase HPLC method was developed and validated for the simultaneous determination of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines. Keywords: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, Quantitation, Validation.
ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dạ dày - tá tràng là bệnh đứng đầu về mức độ phổ biến trong số các bệnh lý đường tiêu hóa. Ước tính khoảng 10 % dân số thế giới mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính và mỗi năm tăng thêm khoảng 0,2 % dân số mắc bệnh. Trước thực trạng đó, nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm kháng acid, kháng histamin H2 hay ức chế bơm proton được sử dụng trong điều trị. Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) thường được kê đơn nhiều vì ưu điểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả làm lành vết loét có thể đạt đến 95% sau tám tuần điều trị; thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội tại và sự co bóp dạ dày [5]. Omeprazole (OPZ), Lansoprazole (LPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ) là các đại diện quan trọng và được kê đơn phổ biến nhất của nhóm ức chế bơm proton. Để có được sự điều chỉnh liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ các hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết, từ đó, làm định hướng giúp bác sĩ thực hiện kê đơn thuốc an toàn và hiệu quả. Tuy nhiên, cho đến nay, nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng đồng thời các hoạt chất này trong huyết tương. Do đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung, nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên trong huyết tương nhằm phục vụ công tác điều trị cũng như đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)”. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương. 2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu. 3. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương theo hướng dẫn FDA. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs 1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton Thuốc PPI đầu tiên ra đời vào năm 1989 là OPZ, tiếp theo đó là sự ra đời của các thuốc LPZ, PPZ và RPZ, esomeprazole và mới đây nhất là dexlansoprazole. Các thuốc ức chế bơm proton gồm OPZ, esomeprazole, LPZ, PPZ và RPZ. Chúng ức chế bài tiết acid dịch vị do ức chế hệ thống enzym H+/K+ – ATPase (“bơm proton”) của tế bào thành dạ dày. Các thuốc ức chế bơm proton điều trị có hiệu quả trong loét dạ dày và tá tràng, phối hợp với kháng sinh để tiệt trừ Helicobacter pylori. Trong bệnh trào ngược dạ dày – thực quản, chỉ dùng thuốc nhóm này khi có triệu chứng nặng (lúc đầu ngắn ngày) và khi có các biến chứng như hẹp, loét, chảy máu đã được xác định bằng nội soi (phải điều trị duy trì đủ liều bằng một thuốc của nhóm này). Các thuốc ức chế bơm proton cũng được dùng để phòng ngừa và điều trị các trường hợp loét do dùng NSAID. ở những người phải tiếp tục dùng NSAID sau khi vết loét đã liền, thông thường không nên giảm liều thuốc ức chế bơm proton vì tình trạng loét không triệu chứng có thể xảy ra. Thuốc ức chế bơm proton có hiệu quả trong điều trị hội chứng Zollinger – Ellison (kể cả các trường hợp kháng với các điều trị khác) [6]. 2
1.1.2. Công thức hóa học và tính chất Bảng 1.1. Công thức hóa học và tính chất của các PPIs OPZ LPZ PPZ RPZ CTPT C17H19N3O3S C16H14F3N3O2S C16H15F2N3O4S C18H21N3O3S KLPT 345,4 369,36 383,4 358,4 5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5- 2-[[3-methyl-4-(2,2,2- 6-(Difluoromethoxy)-2-[[(3,4- 2-[[4-(3-methoxypropoxy)-3- Danh dimethylpyridin-2-yl)- trifluoroethoxy)pyridin-2-yl]- imethoxypyridin-2-yl) methylpyridin-2-yl]methyl- pháp methylsulfinyl]-1H- methylsulfinyl]-1H-benzimidazole methylsulfinyl]-1H- sulfinyl]-1H-benzimidazole benzimidazole benzimidazole CTCT Bột trắng hoặc gần như trắng. Bột kết tinh màu trắng hay nâu nhạt, Bột kết tinh màu trắng hay gần Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi Tan trong dicloromethan và nhiệt độ nóng chảy khoảng 166°C. như trắng. Khó tan trong nước và vàng trắng. Khó tan trong nước và dung dịch kiềm loãng, hơi tan Rất dễ tan trong dimethylformamid, ethanol (96%), thực tế không tan ethanol, thực tế không tan trong Tính trong ethanol 96% và tan trong methanol, hơi tan trong trong hexan. Rất dễ bị phân hủy hexan. Rất dễ bị phân hủy trong chất methanol, rất khó tan trong ethanol, khó tan trong ethyl acetat, trong môi trường acid, thường môi trường acid, thường thấy ở nước [1], [21]. dicloromethan, rất khó tan trong thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 dạng muối natri [21]. acetonitril, thực tế không tan trong phân tử nước [4], [11], [14], [21]. hexan và nước [1], [21], [22]. 3
1.1.3. Cơ chế tác dụng Các thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton là dẫn xuất benzimidazole, chúng có cùng cơ chế là ức chế bơm H+/ K+ ATPase (còn gọi là bơm proton). Sau khi vào trong cơ thể, ở pH ≤ 5, thuốc được proton hóa thành 2 dạng: acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfhydryl của bơm H+/ K+ ATPase ở tế bào thành dạ dày nên ức chế bài tiết acid do bất kỳ nguyên nhân nào [3], [6]. 1.1.4. Dược động học Khi dùng đường uống, các PPIs hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa nhưng thay đổi tùy thuộc theo liều dùng và pH dạ dày. Sinh khả dụng theo đường uống có thể đạt đến 70 % nếu dùng lặp lại. Các thuốc gắn mạnh vào protein huyết tương (> 95 %). Nhóm thuốc PPIs chuyển hóa chủ yếu qua gan, chất chuyển hóa được đào thải chủ yếu qua nước tiểu (80 %), phần còn lại qua mật vào phân. Thời gian bán thải khoảng 30 – 90 phút [3], [6]. 1.1.5. Dược lực học Thuốc ức chế đặc hiệu và không hồi phục bơm proton do tác dụng chọn lọc trên tế bào thành dạ dày nên thuốc tác dụng nhanh và hiệu quả hơn các thuốc khác. Tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt 95 % sau 8 tuần điều trị. Rất ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày [2], [6]. 1.1.6. Tác dụng không mong muốn Thuốc có thể gây các rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, táo bón hay tiêu chảy, các rối loạn thần kinh trung ương như chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà (ít gặp). Ngoài ra, do thuốc gây ức chế tiết acid sẽ khiến pH dạ dày tăng lên, làm cho một số vi khuẩn phát triển gây ung thư (hiếm). PPIs ức chế cytochrome P450 nên có thể ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc khác khi dùng đồng thời [2], [6]. 1.1.7. Chỉ định Trào ngược dạ dày - thực quản. Loét dạ dày, tá tràng. Dự phòng loét dạ dày, tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do stress. Hội chứng Zollinger – Ellison [6]. 4
1.1.8. Chống chỉ định Quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc [6]. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC 1.2.1. Trên thế giới Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới Bước sóng Tốc độ Thể tích Đối tượng Chuẩn nội Pha động Cột sắc ký phát hiện dòng bơm định lượng (nm) (ml/phút) mẫu (µl) H.A. Dugger và ACN – đệm kali các cộng sự Megesterol C18, 250 mm x LPZ dihydrophosphat pH 4,5 (46 : 285 1,5 10 (2001) acetat 4,6 mm; 5µm 54) [12] Na2HPO4 0,05 M – acetonitril K.H. Yuen và các (ACN) (65 : 35), đã điều chỉnh C18, 150 mm x cộng sự (2001) OPZ Chloramphenicol 302 1,0 20 pH đến 6,5 bằng acid acetic 4,6 mm; 5 µm [24] băng Ramakrishna và Đệm phosphate 10 mM (pH C18, 250 mm x cộng sự (2005) PPZ Zonisamide 290 1,0 100 6,0) – ACN (6 1: 39) 4,6 mm; 5 µm [19] 5
Đệm amoni acetate 5 mM (đã Ramakrishna và PPZ điều chỉnh pH đến 7,4 bằng C18, 250 mm x các cộng sự RPZ 284 1,0 100 dung dịch natri hydroxit) – 4,6 mm; 5µm (2005) [20] ACN – MeOH (45 : 20 : 35) Đệm amoni bihydro phosphate 285 nm Zeng Xiaohui và 0,01 M – ACN C18, 150 mm x với LPZ các cộng sự LPZ OPZ 1,0 20 (66 : 34), được thêm 1 ‰ 4,6 mm; 5 µm và 305nm (2006) [23] Octylamine với OPZ Triethylamin (TEA) 0,1 % (pH D.V. Bharathi và OPZ, = 6,0 được điều chỉnh bằng C18, 75 mm x cộng sự (2009) LPZ, PPZ Zonisamide 270 1,0 20 acid ortho phosphoric) – ACN 4,6 mm; 3,5 µm [10] và RPZ (72 : 28) Định lượng OPZ và LPZ thì PPZ 290 nm Maryam OPZ, được sử dụng Đệm phosphate 10 mM – đối với Noubarani và các C18, 150 mm x LPZ, PPZ làm chất chuẩn ACN (53 : 47), đã điều chỉnh PPZ và 1,0 50 cộng sự (2010) 4,6 mm; 5 µm và RPZ nội. Định lượng pH đến 7,3 bằng TEA 285 nm [18] PPZ và RPZ thì với LPZ LPZ được dùng 6
làm chất chuẩn nội R.F. Hussein và Đệm Na2HPO4 0,05 M –ACN Cột C18, 4,5 x cộng sự (2016) OPZ LPZ (60 : 40), đã điều chỉnh pH đến 302 1,0 100 150 mm; 5 µm [16] 7,0 bằng acid phosphoric Các PPIs cũng có thể được định lượng trong huyết tương bằng một số phương pháp khác như: phương pháp LC/MS, LC/MS/MS [15], [25], [27], [28], [31] hay phương pháp điện di mao quản [30]. 1.2.2. Trong nước Năm 2010, Đào Văn Đôn và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng PPZ trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC, sử dụng chất nội chuẩn là LPZ. Với điều kiện sắc ký là cột Gemini C18, 250 mm x 4 mm; 5 µm. Pha động ACN – đệm K2HPO4 0,01 M, điều chỉnh pH đến 6,0 (39 : 61); tốc độ dòng là 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 100 µl. Đầu dò UV ở bước sóng 296 nm. Kết quả cho thấy khảo sát độ tuyến tính trong khoảng nồng độ 20 – 5000 ng/ml. Phương pháp HPLC có độ chính xác trong ngày và khác ngày lần lượt là 1,4 – 5,2 % và 1,5 – 4 %. Độ đúng trong ngày và khác ngày tương ứng là 99,3 – 102,2 % và 100,7 – 103,5 % [7]. 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion hay tương tác hóa học trên bề mặt [8], [5]. 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 1.3.2.1. Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường là từ 0 - 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký [8], [5]. 1.3.2.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) [8], [5]. 1.3.2.3. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ thống tiêm mẫu tự động [8], [5]. 1.3.2.4. Cột sắc ký Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar. Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính 2 – 5 mm [8], [5]. 8
1.3.2.5. Bộ phận phát hiện Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng đầu dò thích hợp, hiện nay có các loại đầu dò sau: Đầu dò hấp thụ UV – Vis, đầu dò phổ phát xạ nguyên tử, đầu dò huỳnh quang [8], [5]. 1.3.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 1.3.3.1. Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR Thời gian lưu (tR): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất nhất định tR là một hằng số khi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực (tR’), được tính bằng công thức sau: 푡R’ = 푡R − 푡M Với tM là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh. Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị giãn, thời gian phân tích kéo dài. Thể tích lưu (VR): Là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ. VR = tR × Fc Với Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian. Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi tín hiệu sắc ký đầu tiên ra khỏi hệ thống [8], [5]. 1.3.3.2. Hệ số phân bố K Hệ số phân bố K là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng, xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột. C K = S CM Trong đó: Cs và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động. 9
Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh và nhiệt độ cột. Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [8], [5]. 1.3.3.3. Hệ số dung lượng k’ Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột: 푣 푄 푡′ 푡 − 푡 ′ = × 푆 = 푠 = 푅 = 푅 0 푣푅 푄 푡′0 푡0 Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho 1 ≤ k’ ≤ 8 [8], [5]. 1.3.3.4. Hệ số chọn lọc α Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất A và B, người ta dùng hệ số chọn lọc α: 퐾 ′ 푡(R)A − 푡M α = = = 퐾 ′ 푡(R)B − 푡M Quy ước: Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1. Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [8], [5]. 1.3.3.5. Hệ số đối xứng của pic F 푊 퐹 = 2 Trong đó: W: Chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic; a: Khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [8], [5]. 1.3.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột: 2 푡 2 푡 = 16 ( 푅 ) hay N = 5,54 ( 푅 ) 푊 푊1 ⁄2 Trong đó: W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic; W: Chiều rộng của pic đo ở đáy pic [8], [5]. 10
1.3.3.7. Độ phân giải Rs của cột Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) 2. [푡(R)A − 푡(R)B] 1,18. [푡(R)A − 푡(R)B] Rs = hoặc 푊 + 푊 푊1 + 푊1 ⁄2 ⁄2 Trong đó: t(R)A, t(R)B: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B). WA, WB: Độ rộng pic đo ở các đáy pic. W1/2: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Yêu cầu: Rs > 1, giá trị tối ưu để định lượng Rs > 1,5 [8], [5]. 1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.3.4.1. Lựa chọn pha tĩnh Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động, sắc ký được chia thành 2 loại: Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực. Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực. Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt nên được sử dụng nhiều nhất. Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan: R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm –OH hoặc các alkylamin –CH2- NH2, alkyl nitril –CH2–CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [29]. R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm –OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm –OH thân nước được thay thế bằng các gốc –R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica 11
đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [8]. Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm –OH tự do chưa được thay thế trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích. Trong môi trường acid mạnh, pH 7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay hiện tượng kéo đuôi làm cho việc phân tích diện tích hay chiều cao pic có độ chính xác không cao. Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh [8], [29]. 1.3.4.2. Lựa chọn pha động Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: Nước, MeOH, ACN, hoặc hỗn hợp của chúng. Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như: Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp rất quan trọng. Yêu cầu của một pha động [29]: Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian. Hòa tan được chất cần phân tích. Có độ tinh khiết cao. Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký. Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường. Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả [29]: 12
Bản chất của dung môi để pha pha động. Thành phần các chất trong pha động. pH của pha động. Tốc độ dòng của pha động. 1.3.4.3. Lựa chọn bộ phận phát hiện Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ phận phát hiện, sau đó chuyển thành tín hiệu và được ghi trên SKĐ. Đầu dò phổ biến nhất là UV – Vis. Tùy theo chất phân tích mà người ta lựa chọn các bước sóng phát hiện khác nhau [29]. 1.3.5. Một số phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng HPLC Tất cả các phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của nó. Có 4 phương pháp tính toán kết quả định lượng thường được sử dụng trong sắc ký: chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn và chuẩn hóa diện tích. Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong dịch sinh học. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những quy trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp [8], [5]. Phương pháp chuẩn nội: Nguyên tắc: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội - IS) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Yêu cầu với chất chuẩn nội: Trong cùng điều kiện sắc ký, IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử. Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử. Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử. Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm. 13
1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 1.4.1. Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát. Phân tích dược chất trong dịch sinh học là cơ sở để đánh giá SKD và TĐSH trực tiếp và chính xác nhất. Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp là các chất nội sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [9], [13], [17], [26]. 1.4.2. Các chỉ tiêu thẩm định Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của FDA và EMA [13], [26]. 1.4.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận diện “chất cần phân tích” và không bị “nhầm lẫn” bởi các chất khác. Do vậy, kết quả phải được thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng, chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các pic tạp. Tính chọn lọc – đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau [13], [26]: Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi (AS) ≤ 2,0; độ phân giải (RS) giữa pic của chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5. 14
Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng. Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng. 1.4.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất). Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích. Không nên xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính. Đường chuẩn sẽ không bao giờ có điểm “0” [13], [26]. Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số r2 ≥ 0,99 và phải đáp ứng các điều kiện sau [13], [26]: Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85 – 115 %, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80 – 120 %. Có ít nhất 75 % số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn. Có hệ số tương quan r ≥ 0,99. 1.4.2.3. Giới hạn định lượng dưới Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ đúng và độ chính xác của phương pháp. LLOQ được chấp nhận với điều kiện đáp ứng của chất phân tích tại nồng độ này so với đáp ứng 15
của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N ≥ 5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng ± 20 % và độ đúng từ 80 – 120 % [13], [26]. 1.4.2.4. Độ đúng và độ chính xác Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, 1 nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng, 1 nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu độc lập. Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác có thể được biểu thị bằng hệ số biến thiên (CV) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày và giữa các ngày. Nói chung, CV ≤ 15 %, riêng nồng độ gần với LLOQ thì CV ≤ 20 %. Độ đúng của phương pháp phân tích được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học. Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85 – 115 %, nhưng có thể chấp nhận 80 - 120 % đối với điểm gần LLOQ [13], [26]. 1.4.2.5. Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách được pha trong dung môi phù hợp (thường sử dụng dung môi pha động). Tỷ lệ thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích trong một giới hạn nhất định. Để khảo sát tỷ lệ thu hồi của phương pháp nên tiến hành tại 3 nồng độ thấp, trung bình và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần. Tỷ lệ thu hồi không nên vượt quá 110 % và không nên quá thấp; giá trị CV < 15 % đối vớ mỗi nồng độ và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15 % [13], [26]. 1.4.2.6. Độ ổn định Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc xử lý, phân tích và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử. Để khảo sát độ ổn định của phương pháp 16
nên tiến hành tại 2 nồng độ thấp và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần. Do đó, trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định. Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm [13], [26]: a. Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông. b. Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách). c. Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định. d. Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong hệ thống bơm mẫu tự động). e. Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện lạnh (thường ở -2 °C đến -8 °C). 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các hoạt chất OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương 2.1.2. Hóa chất, dung môi Dung môi: acetonitril, methanol, nước (Merck, Đức) đạt chuẩn cho sắc ký lỏng. Hóa chất: kali dihydrophosphat, kali hydroxyd, triethylamin, natri acetat, acid acetic (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. 2.1.3. Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh, huyết tương người cung cấp bởi Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (số kiểm soát: 1620 16L19) được trình bày ở Bảng 2.1. Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu Hợp chất Số lô Hàm lượng Nơi cung cấp OPZ QT134 130915 99,72 % LPZ QT161 050413 98,53 % Viện Kiểm Chuẩn PPZ Natri QT219 030715 94,21 % nghiệm thuốc RPZ Natri QT226 010813 96,29 % TPHCM Indomethacin 98,51 % Chuẩn nội QT077 030710 (IDM) 2.1.4. Dụng cụ, máy móc, thiết bị Dụng cụ: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, các loại dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm, ống ly tâm, ống đựng huyết tương. Thiết bị nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.2, tất cả các thiết bị được hiệu chuẩn định kỳ theo quy định. Các loại dụng cụ thủy tinh chính xác sử dụng hãng Vitlab – Đức đạt chuẩn chính xác cấp A. Bảng 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Tên thiết bị Hãng sản xuất, xuất xứ Hệ thống HPLC 1260 Infinity Agilent, Mỹ 18
Đầu dò dãy diod quang (1260 diod) Agilent, Mỹ Cột sắc ký XDB Zobrax Agilent, Mỹ (C18, 150 x 4,6 mm, 5 µm) Máy đo pH S220K Mettler Toledo, Thụy Sĩ Cân phân tích 0,01 mg, max 120 g Mettler Toledo, Thụy Sĩ Bể siêu âm gia nhiệt Power Sonic, Taiwan Máy quang phổ UV 1800 Shimadzu, Nhật Máy ly tâm Hermle Z306K Hermle Z336K, Đức Máy lắc vortex S200 Labnet, Mỹ Hệ thống lọc dung môi Rooker 400, Taiwan Màng lọc PTFE 0,22 µm; 0,45 µm Sartorius, Đức 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các dung dịch thử nghiệm 2.2.1.1. Dung dịch chuẩn gốc Dung dịch nội chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn nội Indomethacin (IDM) cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml methanol (MeOH), siêu âm 5 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được có nồng độ IDM khoảng 500 µg/ml. Từ dung dịch này pha loãng đến nồng độ phù hợp khi thực hiện khảo sát. Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn PPIs cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml MeOH, siêu âm 5 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều (bình 1). Dung dịch thu được có nồng độ hỗn hợp OPZ, LPZ, PPZ và RPZ khoảng 1000 µg/ml. 2.2.1.2. Dung dịch chuẩn làm việc Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH để được 2 dung dịch chuẩn làm việc (SW) có nồng độ hỗn hợp các PPIs trong SW1 là 144 g/ml và SW2 là 18 g/ml. 19
2.2.1.3. Mẫu đối chiếu Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 trong 400 l huyết tương để thu được các mẫu đối chiếu có nồng độ hỗn hợp các PPIs là 2000 ng/ml và IS là 8000 ng/ml sau khi xử lý mẫu. 2.2.1.4. Mẫu kiểm tra Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác (chuẩn gốc thứ 2), pha loãng đến nồng độ phù hợp. Thêm lượng nhất định dung dịch này vào 400 l huyết tương để thu được các mẫu nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) có nồng độ sau khi xử lý mẫu tương ứng là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml. 2.2.1.5. Mẫu thử giả lập Lấy 400 µl huyết tương trắng cho vào ống ly tâm. Thêm 50 µl dung dịch SW hỗn hợp PPIs (hoặc QC), vortex trong 30 giây. Thêm 50 µl dung dịch chất nội chuẩn, vortex trong 1 phút thu được mẫu giả lập. 2.2.2. Nội dung nghiên cứu Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1. Xây dựng điều kiện sắc ký Phương pháp xử lý mẫu Thẩm định quy trình phân tích đã chọn Xử lý kết quả và viết báo cáo Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.2.2.1. Xây dựng điều kiện sắc ký Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent 1260 (Mỹ), đầu dò dãy diod (DAD) với mẫu MQC. Dựa vào tính chất hóa lý của 20
các chất nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo, đề tài thực hiện khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột sắc ký C18 150 x 4,6 mm; 5 µm với cột bảo vệ cùng loại: Bước sóng phát hiện: Áp dụng bước sóng được khảo sát từ các dung dịch chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH được các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có nồng độ khoảng 5 µg/ml. Tiến hành quét phổ hấp thu UV trên máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) của 4 dung dịch, chọn bước sóng phát hiện phù hợp. Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH, ACN, phối hợp với dung dịch có pH thay đổi (dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm) ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của pic đạt yêu cầu. Tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu: được khảo sát đồng thời. Chọn điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs và IDM tách hoàn toàn nhau và tách khỏi các pic tạp và đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký đạt yêu cầu. Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho [26]: Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5. Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000. Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5. Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút. RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %. 2.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây: Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN, vortex trong 5 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch nổi, lọc qua màng PTFE 0,22 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký. Tiến hành song song với mẫu được chiết không kiềm hóa. 21
Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99 : 1), vortex trong 5 phút. Đem ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 3 ml dịch nổi, bốc hơi ở 40 C bằng máy ủ nhiệt khô, cắn thu được đem hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE 0,45 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký. 2.2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích đã chọn Quy trình phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của FDA [26] về các chỉ tiêu tính đặc hiệu (chọn lọc), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu. a. Kiểm tra tính tương thích hệ thống Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện. Yêu cầu: RSD % của: (i) thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển ≤ 2 %, (ii) tỷ số diện tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng ≤ 2 %. Hệ số T từ 0,8 ≤ T ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5 [26]. b. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu pha động, mẫu đối chiếu trong pha động, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử và mẫu huyết tương chứa thử thêm chất đối chiếu được xử lý theo quy trình tối ưu được chọn từ kết quả khảo sát các phương pháp xử lý mẫu. Ghi lại các sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang. Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]: Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu pha động không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu. Độ tinh khiết pic của các pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt theo cách xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống. 22
Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic (S/IS) của chất cần định lượng. Hoặc sự tăng chiều cao pic sau khi thêm chất đối chiếu. c. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính Đường chuẩn bao gồm 1 mẫu huyết tương trắng và 5 mẫu huyết tương có pha SW và IS. Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 thêm 400 l huyết tương để thu được các mẫu của đường chuẩn có nồng độ từ 500 – 1000 – 2000 – 4000 – 8000 ng/ml sau khi sử lý mẫu. Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.3. Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu Mẫu chuẩn Mẫu trắng S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Thể tích huyết tương (µl) 400 400 400 400 400 400 Thể tích chất nội chuẩn (µl) 50 50 50 50 50 50 Thể tích dung dịch SW1 (µl) - - - 25 50 100 Thể tích dung dịch SW2 (µl) - 50 100 - - - Thể tích MeOH (µl) 100 50 - 75 50 - Định lượng 2 lần cho mỗi mẫu, tính giá trị trung bình, dựa vào đường chuẩn tính lại độ đúng tại mỗi điểm nồng độ. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy. Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau: Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995; ít nhất 75 % số điểm của đường chuẩn bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20% [9], [13], [26]. 23
d. Giới hạn định lượng dưới Nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (LLOQ) có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó, giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy của phương pháp. Trong nghiên cứu, giá trị LLOQ được xác định dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ đốc đường tuyến tính. 10.SD Công thức tính toán như sau: L L O Q a Trong đó: SD là độ lệch chuẩn đường tuyến tính a là hệ số gốc đường tuyến tính (y = a.x + b) LLOQ được chấp nhận nếu thỏa mãn điều kiện sau: Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80 – 120 % so với nồng độ thực. Độ chính xác RSD ≤ 20 % [9], [13], [26]. e. Độ đúng và độ lặp lại Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml. Xác định hàm lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày). Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85 – 115 %, có thể chấp nhận 80 – 120 % đối với những điểm gần giới hạn định lượng dưới. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD %, giá trị này không được vượt quá 15 %, riêng nồng độ gần với giới hạn định lượng dưới thì không được vượt quá 20 %. [9], [13], [26]. f. Hiệu suất chiết Hiệu suất chiết hay còn gọi là tỷ lệ thu hồi được thẩm định bằng cách tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong dịch sinh học, mỗi lô mẫu gồm 6 mẫu độc lập. Xử lý mẫu theo quy trình nghiên 24
cứu, phân tích, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Song song tiến hành với các lô mẫu QC trong pha động có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của các PPIs và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách). Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau: Hiệu suất chiết các nồng độ khác nhau không được quá ± 15 %. Giá trị RSD % các đáp ứng của PPIs và IS trong các mẫu huyết tương ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [9], [13], [26]. g. Độ ổn định Độ ổn định của thuốc trong huyết tương/ dịch sinh học nói chung phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và định lượng, tính chất hóa học của thuốc, nền mẫu và đồ chứa. Trong nghiên cứu, thực hiện khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, độ ổn định ngắn hạn, độ ổn định dài hạn và độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – ra đông. Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc: Phân tích và so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 °C trong 3 ngày với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. Dung dịch chuẩn gốc được coi là ổn định nếu độ lệch giữa nồng độ trung bình của dung dịch sau bảo quản so với nồng độ trung bình của dung dịch mới pha ≤ 2 %. Giá trị RSD giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤ 2 % [26]. Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết tương ở 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC được pha chế và lưu trữ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi chuẩn bị. Nồng độ các PPIs trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15 % và giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]. Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài: Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35 ± 5 C, phân tích mẫu tại thời điểm 25
ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản sau 15 ngày và sau 30 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ các PPIs trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông: Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông thực hiện trên 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35 ± 5 °C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24 giờ. Lặp lại chu kì đông - rã đông 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông – rã đông, tiến hành xử lý mẫu, phân tích xác định nồng độ các PPIs có trong mẫu. So sánh với nồng độ các PPIs có trong các lô mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ các PPIs trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]. 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel 16. Một số công thức tính toán sử dụng trong xử lý thống kê kết quả Giá trị trung bình: + + + ⋯ + ̅ = 1 2 3 푛 푛 Độ lệch chuẩn: ∑푛 ( 푖 − ̅)2 푆 = √ 푖=1 푛 − 1 tương ứng với hàm STDEV.S trong Microsoft Excel. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %): 푆 푅푆 (%) = × 100 ̅ 26
Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích: y = ax + b. Thực hiện phân tích trắc nghiệm Fischer để kiểm chứng độ tương thích của phương trình hồi quy và thực hiện phân tích trắc nghiệm Student để đánh giá các hệ số a, b có ý nghĩa về mặt thống kê. Các kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Dựa vào tính chất hóa lý của các PPIs, qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn kỹ thuật sắc ký pha đảo, đầu dò dãy diod quang để thực hiện khảo sát với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), Agilent (Mỹ); Cột bảo vệ tương ứng C18 (4 x 4,6 mm, 5 µm); Agilent (Mỹ); Thể tích tiêm mẫu 20 µl; Tốc độ dòng 1,0 ml/phút và bước sóng ghi nhận tín hiệu từ 190 – 400 nm. Tiến hành thăm dò các hỗn hợp ACN/ MeOH, nước ở các pH và tỷ lệ khác nhau làm dung môi. Chọn điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs tách khỏi nhau và tách khỏi các pic tạp chất. Tín hiệu pic sắc ký cân đối, đạt độ tinh khiết và đồng thời có thời gian phù hợp cho một trình phân tích. 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện Tiến hành quét phổ hấp thu trên máy UV 1800 (Shimadzu) trong khoảng bước sóng từ 190 - 400 nm của các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH ở nồng độ mỗi chất khoảng 5 µg/ml thu được trên phổ đồ Hình 3.1, OPZ có cực đại ở bước sóng 301 nm, LPZ có cực đại ở 283,5 nm, PPZ có cực đại ở 289 nm và RPZ có cực đại ở 283,5 nm. Bước sóng 285 nm được lựa chọn để ghi nhận tín hiệu với cả bốn PPIs cho các nghiên cứu tiếp theo. Spectrum_Omeprazol_20180513_110258 - Raw Data Spectrum_Lansoprazol_20180513_104314 - Raw Data 0.7953 1.2899 4 4 1.0000 0.6000 0.4000 Abs. Abs. 0.5000 2 0.2000 2 3 3 1 1 8 6 5 7 6 0.0000 0.0000 5 -0.1344 -0.2290 190.0000 300.0000 400.0000 500.0000 190.0000 300.0000 400.0000 500.0000 nm. nm. 28
Spectrum_Rabeprazol_20180513_105240 - Raw Data Spectrum_Pantoprazol_20180513_103351 - Raw Data 0.5398 3.4642 3 3 3.0000 0.4000 2.0000 Abs. Abs. 0.2000 1.0000 2 2 5 1 1 4 6 0.0000 0.0000 5 4 -0.0882 -0.6303 190.0000 300.0000 400.0000 500.0000 190.0000 300.0000 400.0000 500.0000 nm. nm. Hình 3.1. Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ 3.1.2. Kết quả khảo sát pha động Trên cơ sở tham khảo tài liệu [10], [12], [18], [19], [24] đề tài lựa chọn tốc độ dòng cố định là 1,0 ml/phút, bước sóng 285 nm, thể tích tiêm 10 l tiến hành trên mẫu chuẩn pha trong MeOH, thực hiện khảo sát thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH, ACN, nước điều chỉnh với các điều kiện tỷ lệ khác nhau: ACN/MeOH và dung dịch đệm phosphat 5 mM pH 8 (KH2PO4 được điều chỉnh bằng dung dịch KOH). ACN/MeOH và dung dịch đệm nati acetat 5 mM pH 7,6 (được điều chỉnh bằng dung dịch TEA 1%). ACN/MeOH và nước 0,3% TEA, pH 7,2 (được điều chỉnh bằng dung dịch acid acetic). 3.1.2.1. Khảo sát hệ pha động 1 Với pha động là hỗn hợp MeOH và KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1 M) với tỷ lệ 40 : 60 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.2. Kết quả các pic PPIs có tách nhưng còn xen phủ nhau nhiều và pic bị giãn, không tinh khiết. 29
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO_SAT000020.D) mAU 7.093 7.533 8.029 4 10.490 3 2 1 0 -1 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 min Hình 3.2. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.2. Khảo sát hệ pha động 2 Trên cơ sở của khảo sát hệ pha động 1, tiến hành thay đổi các tỷ lệ pha động là hỗn hợp của MeOH và KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M) với tỷ lệ 75 : 25 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.3. DAD1 A, Sig=280,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\SAMPLE_1000109.D) mAU 6 8.336 3.656 5 4 7.400 7.107 3 2 1 1.513 0 2 4 6 8 10 12 min Hình 3.3. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) Nhận xét: SKĐ Hình 3.3 cho thấy, các tín hiệu PPIs đã tách nhau gần hoàn toàn, nhưng đánh giá thông số độ phân giải Rs < 1,5 chưa đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng. 3.1.2.3. Khảo sát hệ pha động 3 Với pha động là hỗn hợp của ACN và điệm KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M) với tỷ lệ 40 : 60 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.4. Nhận 30
thấy, trên sắc ký đồ Hình 3.4 đường nền ổn định, nhưng các pic PPIs không tách nhau. DAD1 A, Sig=280,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI000016.D) mAU 30 16.374 25 20 17.300 16.885 15 10 16.739 5 3.109 0 17.608 5 10 15 20 25 min Hình 3.4. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.4. Khảo sát hệ pha động 4 Trên cơ sở của khảo sát hệ pha động 3, tiến hành thay đổi tỷ lệ thành phần dung môi ACN là 25 % và đệm phosphat KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M) là 75 %, phân tích sắc ký đồ thu được như Hình 3.5. DAD1 A, Sig=280,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\SAMPLE_1000303.D) mAU 6.657 20 17.5 15 12.5 13.370 10 9.547 7.5 8.571 5 2.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Hình 3.5. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25 : 75) Nhận xét: SKĐ Hình 3.5 cho thấy khi thay đổi thành phần MeOH bằng ACN trong hệ pha động 2 thì khả năng tách của hệ này tốt hơn, các thông số sắc ký đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng, pic cân đối (T ≈ 1), độ phân giải Rs > 2, số đĩa lý thuyết N > 3000 cho mỗi chất. Thời gian cho 1 trình phân tích cho 4 chất 31
tương đối phù hợp ( 2, số đĩa lý thuyết N > 3000, hệ số phân bố k’ (< 5) đều đạt yêu cầu cho một phép định lượng. 3.1.2.6. Khảo sát pha động 6 Hỗn hợp pha động ACN và nước kiềm 0,3 % TEA (được điều chỉnh pH 7,2 bằng acid acetic), với tỷ lệ 55 : 45 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.7. Trên SKĐ Hình 3.7 các pic tách nhau chưa hoàn toàn. 32
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PANTOPRAZOLE002.D) mAU 4.825 25 20 4.626 6.581 15 5.769 10 5 2.054 2.892 3.299 0 2 4 6 8 10 12 min Hình 3.7. SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45) 3.1.2.7. Khảo sát pha động 7 Hỗn hợp pha động gồm MeOH – ACN – nước kiềm 0,3% TEA (đã được điều chỉnh pH đến 7,2 bằng acid acetic), với tỷ lệ 32 : 15 : 53 (tt/tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.8. DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\SAMPLE_1000326.D) mAU 7 6.824 6 5 13.041 4 3 9.430 8.296 2 1.604 1 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 min Hình 3.8. SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (32 : 15 : 53) Nhận xét: Trên sắc ký đồ Hình 3.8, pic của các PPIs tách hoàn toàn, tín hiệu sắc nét, cân đối. Các thông số sắc ký: hệ số T (0,8 – 1,5), số đĩa lý thuyết N > 3000, độ phân giải Rs > 2, hệ số phân bố k’< 5 và thời gian phân tích cho một quy trình không quá dài (khoảng 15 phút). Ngoài ra, ưu điểm của việc chọn pha động không 33
chứa dung dịch đệm trong quy trình phân tích có thể tránh gây ăn mòn hệ thống sắc ký, giảm thời gian rửa cột và hệ thống sắc ký đáng kể so với sử dụng đệm. Từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo: Pha động (hệ pha động số 7): MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA (điều chỉnh pH 7,2 bằng acid acetic) với tỷ lệ 32 : 15 : 53 (tt/tt/tt). Cột XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) với cột bảo vệ cùng loại. Nhiệt độ buồng cột đặt ở 45 °C. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Bước sóng phát hiện 285 nm. 3.1.3. Lựa chọn nội chuẩn Chất được lựa chọn làm nội chuẩn cần có cấu trúc và tính chất hóa lý gần giống với chất phân tích. Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của chất phân tích và các chất chuẩn sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát indomethacin, domperidone và metronidazole để làm chất nội chuẩn. Kết quả trình bài trong Hình 3.9. DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO-SAT-16.D) mAU 9 8 OMEPRAZOLE (a) - 7 PANTOPRAZOLE 77 - 2 DOMPERIDON 8. RABEPRAZOLE 44 - - 9 6 . 6 54 67 9 LANSOPRAZOLE . 3 - 9.4 5 0 192 13. 4 3 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min (a) 34
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO-SAT-023.D) mAU 9 8 TRONIDAZOLE ME - (b) 7 OMEPRAZOLE 2.654 2.654 - PANTOPRAZOLE - 269 8. 121 6 RABEPRAZOLE - 7.0 LANSOPRAZOLE 99 - 9.4 5 13.270 13.270 4 3 2 1 0 2 4 6 8 10 1 14 16 18 min (b) DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) mAU 6 (C) 5.923 - INDOMETHACIN 5 4 8.433 - OMEPRAZOLE 3 7.095 - PANTOPRAZOLE 9.518 - RABEPRAZOLE 2 13.377 - LANSOPRAZOLE 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min (c) Hình 3.9 SKĐ: a. chất nội chuẩn domperidone và PPIs; b. chất nội chuẩn metronidazole và PPIs và c. chất nội chuẩn indomethacin và PPIs Nhận xét: Kết quả SKĐ trong Hình 3.9a, 3.9b của chất nội chuẩn domperidone và metronidazole, ta thấy sắc ký đồ có thời gian lưu của IS sớm (tR 99%. Do đó, chúng tôi lựa chọn 35
indomethacin làm chất nội chuẩn cho nghiên cứu định lượng đồng thời PPIs trong huyết tương. 3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương khác nhau, đánh giá và lựa chọn phương pháp phù hợp để thực hiện xử lý mẫu. Xử lý mẫu huyết tương bằng cách gây tủa protein: Tiến hành thêm vào 400 µl huyết tương trắng, 50 µl dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp các PPIs có nồng độ khoảng 18 µg/ml và 50 µl dung dịch chuẩn làm việc IS, lắc xoáy trong 30 giây. Tiếp tục thêm 1,2 ml MeOH, lắc xoáy trong 2 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy dịch nổi lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,22 µl, tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký, thu được SKĐ Hình 3.10b. Thực hiện như quy trình xử lý trên nhưng có thêm 100 µl dung dịch KOH 0,25M, thu được SKĐ Hình 3.10c. Xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng: Tiến hành thêm vào 400 µl huyết tương trắng, 50 µl dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp các PPIs có nồng độ khoảng 18 µg/ml và 50 µl dung dịch chuẩn làm việc IS, lắc xoáy trong 30 giây. Tiếp tục thêm 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99 : 1), lắc xoáy 5 phút. Đem ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 3 ml dịch nổi, bốc hơi ở 40 C bằng máy ủ nhiệt khô, cắn thu được đem hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE có kích thước lỗ 0,45 µm. Dịch lọc thu được tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký, thu được SKĐ Hình 3.10d. Song song tiến hành mẫu có chứa hỗn hợp các chất chuẩn PPIs và IS có nồng độ tương ứng pha trong pha động. Lọc qua màng lọc PTFE có kích thước lỗ 0,45 µm, làm dịch tiêm sắc ký. 36
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D) mAU 120 100 (A) 80 60 40 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min (a) DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO_SAT000089.D) mAU 8 (B) 7 7.000 - PANTOPRAZOLE 6 5 13.463 - LANSOPRAZOLE 9.578 - RABEPRAZOLE 8.370 - OMEPRAZOLE 4 3 5.388 - INDOMETHACIN 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 min (b) DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D) mAU 9 8 (C) 8.378 - OMEPRAZOLE 7 5.737 - INDOMETHACIN 7.035 - PANTOPRAZOLE 6 9.459 - RABEPRAZOLE 5 13.270 - LANSOPRAZOLE 4 3 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min (c) 37
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) mAU 6 5.923 - INDOMETHACIN 5 (D) 4 8.433 - OMEPRAZOLE 3 7.095 - PANTOPRAZOLE 9.518 - RABEPRAZOLE 2 13.377 - LANSOPRAZOLE 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min (d) DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-12 14-39-56\SAMPLE000001.D) mAU 1.5 1.25 (E) 7.998 - OMEPRAZOLE 8.963 - RABEPRAZOLE 5.705 - INDOMETHACIN 1 6.902 - PANTOPRAZOLE 12.513 - LANSOPRAZOLE 0.75 0.5 0.25 0 -0.25 -0.5 -0.75 2 4 6 8 10 12 14 16 min (e) Hình 3.10. SKĐ: a. huyết tương trắng; b. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH; c. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH thêm dung dịch kiềm hóa KOH, d. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và e. Mẫu chuẩn, nội chuẩn pha trong pha động (hệ pha động số 7). Nhận xét: Hình 3.10a, mẫu huyết tương trắng hoàn toàn không xuất hiện pic. Sắc ký đồ trong các Hình 3.10b cho thấy các pic chưa tách khỏi nhau và chưa tách khỏi nền mẫu, pic bị giãn và xen phủ lẫn nhau. Do đó, điều kiện này chưa phù hợp để xử lý mẫu. Trong khi đó, SKĐ trong Hình 3.10c, hình 3.10d các pic IS và PPIs 38
tách khỏi nhau rõ ràng, pic cân đối tương tự như SKĐ mẫu chuẩn trong pha động Hình 3.10e. Vì vậy, phương pháp gây tủa protein có kiềm hóa và phương pháp chiết tách phân bố lỏng – lỏng có thể lựa chọn để xử lý mẫu. Kết quả phân tích ANOVA trong Bảng 3.1 của 2 phương pháp chiết đã được lựa chọn cho thấy tỷ lệ phục hồi cao > 80%, RSD 0,05 chứng tỏ 2 phương pháp xử lý mẫu khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Mặt khác, phương pháp gây tủa protein có kiềm hóa khi xử lý mẫu có ưu điểm là nhanh chóng, dễ thực hiện, kết quả đạt yêu cầu cho phân tích mẫu trong dịch sinh học. Vì vậy, phương pháp này được lựa chọn để xử lý mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1. Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu PPZ OPZ % P - % sai Mẫu MQC TB ± SD sai TB ± SD P -Value Value khac khac Phương pháp 1 93,87 ± 2,01 - - 94,97 ± 4,16 - - Phương pháp 2 92,40 ± 3,66 1,46 0,5874 91,56 3,00 3,41 0,80639 RPZ LPZ % P - % sai Mẫu MQC TB ± SD sai TB ± SD P -Value Value khac khac Phương pháp 1 93,88 ± 4,79 - - 93,34 ± 2,71 - - Phương pháp 2 101,30 ± 8,14 7,42 0,2669 94,72 ± 2,36 1,38 0,5416 Ghi chú: MQC 3000 ng/ml. Phương pháp 1: gây tủa protein có kiềm hóa mẫu. Phương pháp 2: chiết tách phân bố lỏng – lỏng 3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN 3.3.1. Tính tương thích hệ thống Thẩm định tính tương thích của hệ thống là cần thiết khi tiến hành các phương pháp phân tích bằng sắc ký, nhằm mục đích xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích sắc ký thích hợp với phương pháp phân tích đang thực hiện. Với điều kiện sắc ký trên, khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch mẫu huyết tương giả lập có nồng độ các PPIs khoảng 1000 ng/ml và IS có nồng độ khoảng 8000 ng/ml, được kết quả trình bày trong Bảng 3.2. 39
Nhận xét: Kết quả phân tích từ Bảng 3.2 cho thấy các thông số sắc ký: thời gian lưu (tR), hệ số phân bố (k’), tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn/chất nội chuẩn (RS/IS ) có RSD 3000), hệ số bất đối (T) đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5. Như vậy, phương pháp đã xây dựng đạt tính tương thích hệ thống. 40
Bảng 3.2. Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống PPZ OPZ RPZ LPZ STT tR k' RS/IS T N Rs tR k' RS/IS T N Rs tR k' RS/IS T N Rs tR k' RS/IS T N Rs 1 6,963 1,793 0,18162 1,077 9486 4,511 8,348 2,349 0,12619 1,094 9697 4,423 9,406 2,773 0,11920 1,064 9926 2,947 13,178 4,286 0,19533 1,080 11184 8,597 2 7,015 1,814 0,18104 1,108 9103 4,493 8,360 2,354 0,12590 1,112 9663 4,234 9,418 2,778 0,11758 1,081 9079 2,873 13,208 4,298 0,19888 1,056 10985 8,413 3 6,973 1,797 0,18509 1,117 9191 4,505 8,346 2,348 0,12768 1,069 9539 4,335 9,403 2,772 0,11691 1,052 9349 2,888 13,181 4,288 0,19467 1,073 10698 8,393 4 7,003 1,809 0,17989 1,109 9152 4,481 8,357 2,352 0,12802 1,093 9577 4,260 9,413 2,776 0,11921 1,018 9197 2,873 13,193 4,293 0,19548 1,097 10951 8,416 5 6,938 1,783 0,18868 1,061 9058 4,517 8,327 2,340 0,12631 1,076 9611 4,392 9,373 2,760 0,11559 1,023 9476 2,881 13,151 4,276 0,19656 1,103 10881 8,483 6 6,983 1,801 0,18114 1,117 9198 4,570 8,337 2,344 0,12544 1,104 9650 4,288 9,391 2,767 0,11967 1,074 9693 2,920 13,166 4,281 0,19533 1,073 10915 8,511 TB 6,979 1,800 0,183 1,098 9198 4,513 8,346 2,348 0,127 1,091 9623 4,322 9,401 2,771 0,118 1,052 9453 2,897 13,180 4,287 0,196 1,080 10936 8,469 SD 0,028 0,011 0,003 0,023 150,820 0,031 0,012 0,005 0,001 0,016 58,516 0,075 0,016 0,007 0,002 0,026 315,622 0,030 0,020 0,008 0,002 0,017 157,632 0,078 RSD% 0,40 0,62 1,82 2,14 1,64 0,68 0,148 0,220 0,811 1,495 0,608 1,732 0,17 0,24 1,36 2,50 3,34 1,04 0,15 0,19 0,77 1,60 1,44 0,92 Ghi chú: tR (thời gian lưu); k’(hệ số phân bố); RS/IS (tỷ lệ diện tích chất chuẩn/chất nội chuẩn); T (USB Tailling); N (Số đĩa lý thuyết); Rs (Độ phân giải) 41
3.3.2. Thẩm định tính đặc hiệu Phân tích các mẫu pha động, mẫu chuẩn và nội chuẩn trong pha động, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa mẫu thử, mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn (giả lập) với nồng độ 2000 ng/ml có chất nội chuẩn indomethacin theo phương pháp đã xây dựng. Kết quả sắc ký đồ của các mẫu được thể hiện trên các Hình 3.11. DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D) mAU 120 100 (A) 80 60 40 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) mAU 6 (B) 5.923 - INDOMETHACIN 5 4 8.433 - OMEPRAZOLE 3 7.095 - PATOPRAZOLE 9.518 - RABEPRAZOLE 2 13.377 - LANSOPRAZOLE 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min 42
DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D) mAU 9 8 (C) 8.378 - OMEPRAZOLE 7 5.737 - INDOMETHACIN 7.035 - PANTOPRAZOLE 6 9.459 - RABEPRAZOLE 5 13.270 - LANSOPRAZOLE 4 3 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\khao sat\Mau pha dong.D) mAU 1.5 1.25 (D) 1 0.75 0.5 0.25 0 -0.25 -0.5 -0.75 2 4 6 8 10 12 14 16 min Hình 3.11. SKĐ: a. mẫu huyết tương trắng; b. mẫu thử giả lập; c. mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn; d. mẫu pha động Nhận xét: Trên sắc ký đồ các pic tách rời nhau, tại thời gian lưu 5,7; 7,0; 8,4; 9,5 và 13,3 phút lần lượt tương ứng với tín hiệu của IDM, PPZ, OMZ, RPZ và LPZ (Hình 3.11b, c). Trong khi đó, trên sắc ký đồ của mẫu pha động và mẫu huyết tương trắng, không thấy xuất hiện pic của các chất này tại thời gian lưu tương ứng (Hình 3.11a, d). Phổ hấp thu UV ghi nhận cho mỗi tín hiệu (Hình 3.12a, b, c, d, e) và độ tinh khiết pic của mẫu thử được đánh giá bằng phần mềm Chemstation - Agilent với đầu dò DAD cho kết quả đáp ứng trên 99,99% cho mỗi chất (Hình 3.12f, g, h, i, j). Phương pháp phân tích đã đảm bảo nhận diện, phân biệt được các PPIs và IS, không bị ảnh hưởng bởi các tạp có trong huyết tương. Do vậy, phương pháp sử dụng có tính chọn lọc và độ đặc hiệu cao. 43
*DAD1, 5.830 (5.9 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) *DAD1, 5.877 (15.2 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.988 (999.941-999.998) of DAD1, 5.830 (5.9 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *DAD1, 5.923 (20.5 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *Threshold curve, mean level 999.957 (999.857-999.984) of DAD1, 5.830 (5.9 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *DAD1, 5.983 (13.7 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.988 (999.941-999.998) of DAD1, 5.830 (5.9 Fl, - ) Ref= 5.623 & 6.750 of 002-0201.D | | | ' ' ' ' | Calculated ++++++++++++++++++++++++++++++++ 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm 5 .7 5 6 6 .2 5 6 .5 6 .7 5 m in (a) (f) *DAD1, 7.030 (5.2 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D *DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) *DAD1, 7.037 (5.6 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.968 (999.937-999.990) of DAD1, 7.030 (5.2 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D *DAD1, 7.097 (7.5 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D *Threshold curve, mean level 999.836 (999.771-999.866) of DAD1, 7.030 (5.2 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.968 (999.937-999.990) of DAD1, 7.030 (5.2 Fl, - ) Ref= 6.770 & 7.443 of 002-0201.D | | | ' ' ' | Calculated +++++++++++++++++++++ 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm 6 .8 7 7 .2 7 .4 m in (b) (g) *DAD1, 8.317 (5.1 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) *DAD1, 8.363 (9.3 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.970 (999.867-999.991) of DAD1, 8.317 (5.1 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *DAD1, 8.430 (13.0 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *Threshold curve, mean level 999.912 (999.783-999.953) of DAD1, 8.317 (5.1 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *DAD1, 8.510 (9.0 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.970 (999.867-999.991) of DAD1, 8.317 (5.1 Fl, - ) Ref= 8.070 & 9.077 of 002-0201.D | | | ' ' ' ' | Calculated +++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm 8 8 .2 5 8 .5 8 .7 5 9 m in (c) (h) *DAD1, 9.470 (5.1 Fl, - ) Ref= 9.130 & 10.117 of 002-0201.D *DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\002-0201.D) *DAD1, 9.517 (5.9 Fl, - ) Ref= 9.130 & 10.117 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.943 (999.790-999.986) of DAD1, 9.470 (5.1 Fl, - ) Ref= 9.130 & 10.117 of 002-0201.D *Threshold curve, mean level 999.777 (999.745-999.793) of DAD1, 9.470 (5.1 Fl, - ) Ref= 9.130 & 10.117 of 002-0201.D *Similarity curve, mean level 999.943 (999.790-999.986) of DAD1, 9.470 (5.1 Fl, - ) Ref= 9.130 & 10.117 of 002-0201.D | | | ' ' | Calculated +++++++++++++++++ 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm 9 9 .2 5 9 .5 9 .7 5 10 m in (d) (i) *DAD1,13.214 (5.2 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *DAD1 A, Sig=285,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\003-0301.D) *DAD1,13.254 (7.2 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *Similarity curve, mean level 999.973 (999.904-999.985) of DAD1,13.214 (5.2 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *DAD1,13.361 (10.1 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *Threshold curve, mean level 999.920 (999.843-999.947) of DAD1,13.214 (5.2 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *DAD1,13.474 (6.9 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D *Similarity curve, mean level 999.973 (999.904-999.985) of DAD1,13.214 (5.2 Fl, - ) Ref=12.754 & 13.894 of 003-0301.D | | | ' ' ' ' | Calculated ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm 13 1 3 .5 m in (e) (j) Hình 3.12. Phổ hấp thu UV: a. IS; b. PPZ; c. OPZ; d. RPZ ; e. LPZ; Độ tinh khiết pic: f. IS; g. PPZ; h. OPZ; i. RPZ ; j. LPZ 44
3.3.3. Thẩm định độ tuyến tính Tiến hành chuẩn bị các mẫu trong huyết tương như trong mục 2.2.1, tiến hành xử lý các mẫu theo quy trình đã chọn tại mục 3.2. Phân tích sắc ký, khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ nồng độ và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn/ chất nội chuẩn trong mẫu huyết tương: Đối với PPZ Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Diện tích pic PPZ (mAU.s) 24,668 30,765 67 120,85 254,07 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46 Tỷ lệ diện tích pic 0,07937 0,09753 0,21719 0,39024 0,81053 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 0,7957.x ; r2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS PANTOPRAZOLE, DAD1 A Area Ratio = 0.79574264*Am tRatio +0.0088532 A r e a R a t io R el. R es% (1): 35.479 0 . 8 5 0 . 7 0 . 6 0 . 5 4 0 . 4 0 . 3 3 0 . 2 1 2 0 . 1 0 C orrelation: 0.99886 0 0 . 5 Amount Ratio Hình 3.13. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của PPZ Nhận xét: Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích với hệ số F = 1198,07 > F0,05 = 7,77; qua trắc nghiệm Student, hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê (t = 34,61 > t0,05 = 2,77, p 0,05). 45
Đối với OPZ Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Diện tích pic OPZ (mAU.s) 23,765 42,695 94,813 164,26 353,66 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46 Tỷ lệ diện tích pic 0,07647 0,13535 0,30736 0,53042 1,12825 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 1,1166.x ; r2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS OMEPRAZOLE, DAD1 A Area Ratio = 1.11657533*Am tRatio +0.0024096 A r e a R a t io R el. R es% (1): 5.917 5 1 0 . 8 0 . 6 4 0 . 4 3 0 . 2 2 1 0 C orrelation: 0.99902 0 0 . 5 Amount Ratio Hình 3.14. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của OPZ Nhận xét: Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích với hệ số F = 1254,56 > F0,05 = 7,77; qua trắc nghiệm Student, hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê (t = 35,41978 > t0,05 = 2,77, p 0,05). 46
Đối với RPZ Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Diện tích pic RPZ (mAU.s) 21,98 34,79 75,67 133,27 274,27 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46 Tỷ lệ diện tích pic 0,07073 0,11029 0,24529 0,43035 0,87498 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 0,8643.x ; r2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS RAPEPRAZOLE, DAD1 A Area Ratio = 0.86428638*Am tRatio +0.0095137 A r e a R a t io R el. R es% (1): 11.331 0 . 8 5 0 . 6 4 0 . 4 3 0 . 2 2 1 0 C orrelation: 0.99933 0 0 . 5 Amount Ratio Hình 3.15. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của RPZ Nhận xét: Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích với hệ số F = 2210,779 > F0,05 = 7,77; qua trắc nghiệm Student, hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê (t = 47,0189 > t0,05 = 2,77, p 0,05). 47
Đối với LPZ Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Diện tích pic LPZ (mAU.s) 21,15 36,09 80,61 159,91 310,46 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46 Tỷ lệ diện tích pic 0,06805 0,11441 0,26132 0,51637 0,99043 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 0,9947.x ; r2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS LANSOPRAZOLE, DAD1 A Area Ratio = 0.99468758*Am tRatio +0.0038951 A r e a R a t io R el. R es% (1): 3.007 1 5 0 . 8 0 . 6 4 0 . 4 3 0 . 2 2 1 0 C orrelation: 0.99958 0 0 . 5 Amount Ratio Hình 3.16. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của LPZ Nhận xét: Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích với hệ số F = 3063,9404 > F0,05 = 7,77; qua trắc nghiệm Student, hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê (t = 55,3528 > t0,05 = 2,77, p 0,05). 3.3.4. Giới hạn định lượng dưới Dựa vào kết quả thẩm định tính tuyến tính, tiến hành xác định giá trị nồng độ thấp nhất (độ nhạy) mà tại đó phương pháp vẫn đảm bảo tính đúng và tính chính xác dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ đốc đường tuyến tính. Kết quả 48
LLOQ của PPZ, OPZ, RPZ và LPZ được xác định lần lượt là 480,0698 ng/ml; 507,2739 ng/ml; 484,8794 ng/ml và 505,3141 ng/ml. 3.3.5. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại Tiến hành thẩm định độ đúng, độ lặp lại trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml, xử lý tiếp theo bằng quy trình đã xây dựng. Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp của phương pháp được trình bày ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8. Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày) LQC (1000 ng/ml) MQC (3000 ng/ml) HQC (5000 ng/ml) Mẫu Nồng độ Nồng độ Nồng độ Độ đúng (%) Độ đúng (%) Độ đúng (%) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) TB ± SD 922,29 ± 73,75 92,23 ± 7,38 2599,33 ± 166,01 86,64 ± 5,53 4871,42 ± 252,25 97,43 ± 5,04 (n=18) PPZ RSD (%) 8,00 6,39 5,18 TB ± SD 903,69 ± 76,94 90,37 ± 7,69 2843,39 ± 172,30 94,78 ± 5,74 4870,58 ± 289,53 97,41 ± 5,79 (n=18) OPZ RSD (%) 8,51 6,06 5,94 TB ± SD 877,20 ± 95,36 87,72 ± 9,54 2649,36 ± 211,71 88,31 ± 7,06 4647,51 ± 269,47 92,95 ± 5,39 (n=18) RPZ RSD (%) 10,87 7,99 5,80 TB ± SD 882,41 ± 79,74 88,24 ± 7,97 2819,95 ± 177,42 94,00 ± 5,91 4795,16 ± 221,47 95,90 ± 4,43 (n=18) LPZ RSD (%) 9,04 6,29 4,62 Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.7, Bảng 3.8 và kết quả phân tích thống kê Bảng 3.9 cho thấy tất cả các lô mẫu phân tích ở 3 nồng độ thấp, trung bình và cao có độ đúng trong ngày và giữa các ngày nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115 %). Độ lặp lại (độ chính xác) trong ngày và giữa các ngày đều đạt yêu cầu RSD < 15 % với giá trị cao nhất là 10,87 %. Do đó, phương pháp có độ đúng, độ chính xác cao, đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. 49
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày PPZ OPZ RPZ LPZ Nồng Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ Nồng độ độ tìm tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy tìm thấy Mẫu thấy (LQC (MQC (HQC (LQC (MQC (HQC (LQC (MQC (HQC (LQC (MQC (HQC 1000 3000 5000 1000 3000 5000 1000 3000 5000 1000 3000 5000 ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) ng/ml) 1 879,73 2672,60 4812,35 919,20 2964,34 4866,56 810,15 2615,38 4216,16 814,39 2862,67 4766,19 2 838,96 2568,57 4740,01 1052,77 2717,54 4713,52 748,44 3036,06 4743,84 857,72 2749,49 4583,75 3 948,84 2463,83 4956,53 989,32 2577,52 4664,32 802,75 2474,35 4941,70 736,10 2493,48 4645,84 Ngày 1 4 849,12 2756,79 4904,14 1014,42 2986,42 5097,01 900,21 2892,18 4863,53 876,79 3009,65 5065,89 5 995,88 2721,15 4576,52 938,68 2884,24 4730,81 1018,49 2810,36 4770,78 986,71 2763,77 4709,91 6 732,14 2437,34 4829,44 819,52 2866,19 5042,62 874,30 2383,66 5124,10 755,27 2718,35 4834,73 7 912,42 2536,32 4929,16 904,44 2894,21 4823,65 861,41 2754,76 4950,46 879,03 2798,39 5078,00 8 1005,60 2357,89 4663,94 929,21 2715,42 4475,36 980,48 2386,59 4378,17 905,83 2632,54 4671,94 9 874,91 2559,78 4460,67 829,14 2956,44 4366,45 932,82 2819,44 4258,13 769,62 2871,80 4560,03 Ngày 2 10 925,99 2538,93 4987,97 850,00 2914,06 4887,64 914,76 2624,50 4705,70 834,65 2820,80 5117,17 11 960,07 2425,29 4881,89 959,06 2829,33 4734,04 847,82 2651,10 4464,94 927,66 2724,93 4916,31 12 1030,09 2709,09 5045,91 980,86 3111,39 5150,39 651,71 2893,12 4672,16 944,05 2991,44 5099,77 13 954,35 2627,72 4796,89 840,72 2782,10 4812,20 871,90 2433,98 4471,29 928,48 2863,91 4597,61 14 920,73 2669,75 5010,38 818,97 2825,56 5043,75 856,33 2624,60 4761,68 907,99 2904,92 4915,29 15 863,91 2275,98 4471,68 765,55 2360,83 4544,53 805,64 2263,46 4215,45 831,80 2455,49 4331,74 Ngày 3 16 997,85 2852,32 4938,37 888,26 2954,88 4936,61 966,29 2859,83 4567,35 984,13 3094,97 4700,40 17 928,62 2746,94 5143,95 862,59 2846,37 5213,14 908,02 2523,84 4917,47 945,11 2922,98 4994,91 18 981,93 2867,72 5535,69 903,67 2994,23 5567,89 1038,07 2641,31 4632,36 998,00 3079,44 4723,46 TB 922,29 2599,33 4871,42 903,69 2843,39 4870,58 877,20 2649,36 4647,51 882,41 2819,95 4795,16 RSD % 8,00 6,39 5,18 8,51 6,06 5,94 10,87 7,99 5,80 9,04 6,29 4,62 50
Bảng 3.9. Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng) PPZ OPZ RPZ LPZ Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu LQC MQC HQC LQC MQC HQC LQC MQC HQC LQC MQC HQC 1000 3000 5000 1000 3000 5000 1000 3000 5000 1000 3000 5000 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml Mean 92,23 86,64 97,43 90,37 94,78 97,41 87,72 88,31 92,95 88,24 94,00 95,90 Standard Error 1,7384 1,3043 1,1891 1,8134 1,3537 1,3648 2,2477 1,6634 1,2703 1,8796 1,3939 1,0440 Median 92,73 86,60 97,86 90,41 95,84 96,90 87,31 87,77 93,78 89,24 94,72 94,90 Mode #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 7,3754 5,5337 5,0450 7,6938 5,7434 5,7906 9,5362 7,0570 5,3894 7,9744 5,9140 4,4294 Sample Variance 54,3967 30,6215 25,4516 59,1944 32,9861 33,5306 90,9394 49,8018 29,0459 63,5903 34,9755 19,6194 Kurtosis 1,10536 -0,62160 1,88544 -0,57795 2,70443 0,73201 0,64044 -0,76552 -0,82529 -0,79734 0,02974 -0,59023 Skewness -0,86578 -0,20133 0,63237 0,18300 -1,35487 0,49241 -0,43191 -0,03878 -0,18885 -0,35983 -0,47486 -0,12846 Range 29,80 19,72 21,50 28,72 25,02 24,03 38,64 25,75 18,17 26,19 21,32 15,71 Minimum 73,21 75,87 89,21 76,56 78,69 87,33 65,17 75,45 84,31 73,61 81,85 86,63 Maximum 103,01 95,59 110,71 105,28 103,71 111,36 103,81 101,20 102,48 99,80 103,17 102,34 Sum 1660,11 1559,60 1753,71 1626,64 1706,04 1753,41 1578,96 1589,62 1673,11 1588,33 1691,97 1726,26 Count 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 51
Bảng 3.10. Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ PPZ OPZ Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu STT % LQC/HT LQC/MP % tìm HQC/HT HQC/MP LQC/HT LQC/MP % tìm HQC/HT HQC/MP % tìm tìm lại lại lại lại R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP 1 0,08936 82,08 0,492 95,20 0,13719 96,48 0,65857 98,53 2 0,08640 79,36 0,489 94,71 0,12785 89,92 0,64523 96,54 3 0,09457 86,86 0,481 93,04 0,12712 89,40 0,64668 96,75 0,10888 0,51666 0,14219 0,66838 4 0,08539 78,43 0,447 86,43 0,09792 68,86 0,59757 89,41 5 0,11114 102,08 0,468 90,54 0,11424 80,34 0,62765 93,91 6 0,07609 69,89 0,394 76,31 0,13115 92,24 0,52750 78,92 TB 83,11 89,36 86,21 92,34 SD 10,83 7,160 10,01 7,30 RSD % 13,02 8,01 11,61 7,91 Ghi chú: R(S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 52
Bảng 3.11. Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ RPZ LPZ Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu STT LQC/HT LQC/MP % HQC/HT HQC/MP % LQC/HT LQC/MP % HQC/HT HQC/MP % tìm lại tìm lại tìm lại tìm lại R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP R(S/IS)/HT R(S/IS)/MP 1 0,11841 100,48 0,59444 101,89 0,12249 107,28 0,59444 101,89 2 0,12146 103,07 0,57885 99,22 0,10667 93,43 0,57885 99,22 3 0,08566 72,69 0,57952 99,34 0,09621 84,27 0,57952 99,34 0,11784 0,58339 0,11417 0,58339 4 0,10080 85,54 0,56739 97,26 0,09750 85,40 0,56739 97,26 5 0,09877 83,81 0,56445 96,75 0,09766 85,54 0,56445 96,75 6 0,10754 91,26 0,51604 88,46 0,10615 92,97 0,51604 88,46 TB 89,48 97,15 91,48 97,15 SD 11,30 4,63 8,72 4,63 RSD % 12,63 4,77 9,53 4,77 Ghi chú: R(S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 53
3.3.6. Hiệu suất chiết Tiến hành phân tích các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong huyết tương, xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng. Sau đó, thực hiện song song với mẫu có nồng độ tương ứng trong pha động. Thực hiện so sánh tỷ lệ S/IS của các mẫu. Kết quả trình bày trong Bảng 3.10 và Bảng 3.11. Từ bảng kết quả cho thấy, ở các nồng độ khảo sát, hiệu suất chiết trung bình cho các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml lần lượt là 83,11 %, 89,36 % tương ứng cho PPZ; 86,21 %, 92,34 % tương ứng với OPZ; 89,48 %, 97,15 % tương ứng cho RPZ và 91,48 %, 97,15 % cho LPZ. RSD cho tất cả các lô mẫu không quá 15 %, thay đổi từ 4,77 – 13,02 %. Vậy quy trình xử lý mẫu đạt yêu cầu theo quy định của phương pháp phân mẫu trong dịch sinh học. 3.3.7. Độ ổn định 3.3.7.1. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc Tiến hành phân tích và so sánh tỷ lệ S/IS của dung dịch chuẩn gốc trong MeOH sau quá trình bảo quản 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày ở 2 – 8 oC với dung dịch gốc vừa pha (được tính là thời điểm ban đầu), kết quả trình bày trong Bảng 3.12. Từ bảng kết quả cho thấy, sau thời gian bảo quản 5 ngày, dung dịch sai khác so với ban đầu không quá 2 % (lớn nhất là 1,67 %), độ lệch chuẩn tương đối của các lô mẫu phân tích đều < 2 %. Vậy dung dịch gốc ổn định trong thời gian 5 ngày ở điều kiện 2 – 8 oC. 54
Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS PPZ OPZ RPZ LPZ Mẫu Ban Sau 1 Sau 3 Sau 5 Ban Sau 1 Sau 3 Sau 5 Ban Sau 1 Sau 3 Sau 5 Ban Sau 1 Sau 3 Sau 5 đầu ngày ngày ngày đầu ngày ngày ngày đầu ngày ngày ngày đầu ngày ngày ngày 1 99,73 97,97 98,57 98,60 99,09 97,91 98,35 97,62 96,63 97,20 95,92 96,08 98,34 98,81 98,19 96,56 2 99,96 98,90 98,93 98,57 98,62 98,38 96,01 97,80 97,80 98,77 97,28 96,28 98,54 96,58 96,42 97,52 3 98,84 99,88 98,61 98,83 98,13 99,87 97,53 99,13 98,81 98,73 96,93 94,07 97,52 94,92 94,88 95,32 TB 99,51 98,92 98,70 98,67 98,61 98,72 97,30 98,19 97,75 98,23 96,71 95,47 98,13 96,77 96,50 96,47 % sai khác - -0,59 -0,81 -0,85 - 0,11 -1,31 -0,43 - 0,49 -1,53 -1,23 - -1,36 -1,64 -1,67 SD 0,59 0,96 0,20 0,15 0,48 1,02 1,19 0,82 1,09 0,89 0,70 1,22 0,54 1,95 1,65 1,10 RSD % 0,59 0,97 0,20 0,15 0,49 1,04 1,22 0,84 1,11 0,91 0,73 1,28 0,55 2,02 1,71 1,14 55
3.3.7.2. Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương Tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các PPIs trong huyết tương trên các lô mẫu có nồng độ LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml. Đánh giá độ ổn định của các PPIs trong huyết tương bằng cách so sánh nồng độ các PPIs có trong: - Mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn PPIs được phân tích ngay sau khi pha. - Mẫu được bảo quản ở những điều kiện nhất định: (i) tại nhiệt độ phòng trong 5 giờ, (ii) sau 3 chu kỳ đông – rã đông và (iii) lưu mẫu -40 oC trong 15 ngày và 30 ngày. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của các PPIs trong huyết tương được trình bày trong Bảng 3.13, 3.14, 3.15 và 3.16. Nhận xét: Từ những kết quả thẩm định độ ổn định từ Bảng 3.13, 3.14, 3.15 và 3.16 và kết quả thống kê (Bảng 3.17) sự sai khác trung bình cho cả 2 lô LQC và HQC không quá 11 % sau thời gian bảo quản, % sai khác với PPZ từ 7,1 – 15,9 %; OPZ từ 8,7 – 13,5 %; RPZ từ 7,9 – 13,0 % và LPZ từ 8,0 – 13,05 %. Phân tích ANOVA cho thấy các nồng độ tìm lại sau khi lưu mẫu bảo quản sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Vì vậy, kết luận mẫu huyết tương có độ ổn định trong 5 giờ, tại nhiệt độ phòng thí nghiệm; ổn định sau thời gian bảo quản 30 ngày ở -40 oC và ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông. Kết luận chung: Từ các kết quả thực nghiệm thu được ở trên đã chứng minh đề tài xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Pantoprazole, Rabeprazole và Lansoprazole trong huyết tương người. Phương pháp đã được thẩm định đạt các yêu cầu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết và độ ổn định theo hướng dẫn thực hiện của FDA. 56
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của PPZ trong huyết tương PPZ % sai Độ ổn định Nồng độ ban đầu (n=6) Nồng độ sau bảo quản(n=6) % tìm lại P-Value khác TB ± SD TB ± SD Thời gian ngắn LQC 922,8203 ± 83,3376 809,6243 ± 86,0497 87,73 12,27 0,0432 (5h, tại nhiệt độ phòng) HQC 4752,2543 ± 146,7306 4346,1900 ± 410,5253 91,46 8,54 0,0457 Độ ổn định LQC 922,8203 ± 83,3376 800,9749 ± 103,2130 86,80 13,20 0,0482 (3 chu kỳ đông - rã đông) HQC 4752,2543 ± 146,7306 4341,2687 ± 403,2315 91,35 8,65 0,0409 Độ ổn định sau LQC 922,8203 ± 83,3376 793,0376 ± 106,8558 85,94 14,06 0,0409 o (15 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4752,2543 ± 146,7306 4380,4515 ± 358,2127 92,18 7,82 0,0405 Độ ổn định sau LQC 922,8203 ± 83,3376 775,3355 ± 134,4002 84,02 15,98 0,0454 o (30 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4752,2543 ± 146,7306 4414,5707 ± 297,7279 92,89 7,11 0,0319 Ghi chú: Mẫu LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 57
Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của OPZ trong huyết tương OPZ % sai Độ ổn định Nồng độ ban đầu (n=6) Nồng độ sau bảo quản (n=6) % tìm lại P-Value khác TB ± SD TB ± SD Thời gian ngắn LQC 847,0337 ± 81,0532 752,0398 ± 62,6491 88,79 11,21 0,0465 (5h, tại nhiệt độ phòng) HQC 4462,4752 ± 126,9184 4939,7609 ± 475,8306 110,70 10,70 0,0390 Độ ổn định LQC 847,0337 ± 81,0532 731,9013 ± 98,3816 86,41 13,59 0,0514 (3 chu kỳ đông - rã đông) HQC 4462,4752 ± 126,9184 4010,1210 ± 472,5606 89,86 10,14 0,0470 Độ ổn định sau LQC 847,0337 ± 81,0532 740,1858 ± 84,3654 87,39 12,61 0,0492 o (15 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4462,4752 ± 126,9184 4074,0392 ± 409,7729 91,30 8,70 0,0509 Độ ổn định sau LQC 847,0337 ± 81,0532 738,4196 ± 81,2848 87,18 12,82 0,0429 o (30 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4462,4752 ± 126,9184 4007,4590 ± 474,2749 89,80 10,20 0,0466 Ghi chú: Mẫu LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 58
Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của RPZ trong huyết tương RPZ % Nồng độ ban đầu Nồng độ sau bảo quản % sai Độ ổn định tìm P-Value (n=6) (n=6) khác lại TB ± SD TB ± SD Thời gian ngắn LQC 783,0157 ± 66,0908 681,2278 ± 56,6437 87,00 13,00 0,0168 (5h, tại nhiệt độ phòng) HQC 4707,9447 ± 128,8170 4305,7066 ± 405,8484 91,46 8,54 0,0000 Độ ổn định LQC 783,0157 ± 66,0908 686,3336 ± 83,7697 87,65 12,35 0,0507 (3 chu kỳ đông - rã đông) HQC 4707,9447 ± 128,8170 4214,8209 ± 536,0687 89,53 10,47 0,0533 Độ ổn định sau LQC 783,0157 ± 66,0908 690,1920 ± 75,2191 88,15 11,85 0,0509 (15 ngày lưu trữ -40 oC) HQC 4707,9447 ± 128,8170 4335,3152 ± 75,7978 92,09 7,91 0,0498 Độ ổn định sau LQC 783,0157 ± 66,0908 698,5862 ± 63,9697 89,22 10,78 0,0483 (30 ngày lưu trữ -40 oC) HQC 4707,9447 ± 128,8170 4216,3313 ± 519,6188 89,56 10,44 0,0482 Ghi chú: Mẫu LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 59
Bảng 3.16. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của LPZ trong huyết tương LPZ % Nồng độ ban đầu % sai Độ ổn định Nồng độ sau bảo quản (n=6) tìm P-Value (n=6) khác lại TB ± SD TB ± SD Thời gian ngắn LQC 793,8910 ± 67,0087 711,0316 ± 59,1219 89,56 10,44 0,0465 (5h, tại nhiệt độ phòng) HQC 4875,3383 ± 133,3971 4471,5164 ± 421,4773 91,72 8,28 0,0492 Độ ổn định LQC 793,8910 ± 67,0087 690,3239 ± 84,2567 86,95 13,05 0,0402 (3 chu kỳ đông - rã đông) HQC 4875,3383 ± 133,3971 4357,6962 ± 554,2405 89,38 10,62 0,0503 Độ ổn định sau LQC 793,8910 ± 67,0087 695,5012 ± 75,7978 87,61 12,39 0,0385 o (15 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4875,3383 ± 133,3971 4485,4250 ± 401,8505 92,00 8,00 0,0477 Độ ổn định sau LQC 793,8910 ± 67,0087 708,5482 ± 64,8819 89,25 10,75 0,0489 o (30 ngày lưu trữ -40 C) HQC 4875,3383 ± 133,3971 4369,3565 ± 538,4775 89,62 10,38 0,0495 Ghi chú: Mẫu LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml) 60
Bảng 3.17. Kết quả phân tích thống kê nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương PPZ OPZ RPZ LPZ Mean 10,954741 11,24724007 10,66992 10,48781 Standard Error 1,176121 0,581861285 0,624751 0,617241 Median 10,457269 10,95521303 10,62845 10,52734 Mode #N/A #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 3,326572 1,645752242 1,767062 1,74582 Sample Variance 11,066083 2,708500441 3,122509 3,047887 Kurtosis -1,712991 -0,948890157 -0,77218 -0,54238 Skewness 0,293624 0,009730133 -0,39748 -0,08913 Range 8,876207 4,887924674 5,084561 5,047837 Minimum 7,105758 8,704496437 7,914909 7,997666 Maximum 15,981964 13,59242111 12,99947 13,0455 Sum 87,637926 89,97792056 85,35935 83,90249 Count 8 8 8 8 61
3.4. BÀN LUẬN Phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học có vai trò quan trọng trong việc có thể đánh giá đúng các số liệu về dược động học, đánh giá và phân tích các số liệu trong nghiên cứu SKD và TĐSH. Các phương pháp này cần phảo được đánh giá và thẩm định để đảm bảo kết quả thu được khi phân tích bằng phương pháp đó là chính xác, ổn định và đáng tin cậy. Trong thuốc các PPIs có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như quang phổ hấp thu phân tử (UV - VIS), phương pháp cực phổ, các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nhưng với nền mẫu phức tạp như dịch sinh học, nồng độ trong mẫu rất nhỏ thì việc xác định riêng/hay đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ thì phương pháp sắc ký lỏng được xem là tiêu chuẩn vàng để áp dụng. Mẫu sau khi qua hệ thống sắc ký có thể dùng đầu dò khối phổ và quang phổ tử ngoại, hay đầu dò dãy diod quang. Trong đó, đầu dò khối phổ độ nhạy rất cao, tuy nhiên hiện chưa được dùng rộng rãi trong nước vì đầu tư lớn và cần nhiều điều kiện đảm bảo đi kèm (hệ thống nguồn cấp điện, nguồn cấp chân không, ). Trong nghiên cứu này, đề tài đã sử dụng đầu dò DAD được cho hệ thống HPLC, một hệ thống (HPLC/UV/DAD) là rất phổ biến hiện nay cho hầu hết các phòng thí nghiệm. Phương pháp đã xây dựng và được thẩm định thành công các tiêu chí tính đặc hiệu; khoảng tuyến tính; độ đúng và độ lặp lại; giới hạn định lượng; tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết); độ ổn định của mẫu thử theo yêu cầu của FDA: Lựa chọn chuẩn nội: Đối với phương pháp phân tích trong dịch sinh học, chuẩn nội đóng vai trò là yếu tố quan trọng. Chuẩn nội có tính chất lý hóa gần giống với chất phân tích, được cho vào cùng với chất phân tích để hạn chế sai số trong quá trình tiến hành phân tích. Các PPIs và IDM có tính chất lý hóa gần giống nhau. Do vậy có thể sử dụng IDM để định lượng các PPIs. Phương pháp trên dùng IDM là một chất chuẩn dễ kiếm, có cực đại hấp thụ gần với cực đại hấp thụ của các PPIs làm chuẩn nội. So sánh với nghiên cứu của Noubarani và các cộng sự đã sử dụng một trong các chất PPIs để định lượng các chất còn lại [18], thì khi sử dụng một chất không phải là PPIs để làm chuẩn nội, chúng tôi có thể định 62
lượng được cả bốn PPIs trên cùng một sắc ký đồ và trên cùng một lần phân tích. Từ đó, có thể tiết kiệm thời gian, hóa chất và chi phí cho quá trình thực nghiệm. Chính vì vậy, IDM đáp ứng được các yêu cầu của một chuẩn nội đồng thời thông dụng, dễ kiếm. Điều kiện sắc ký và tính đặc hiệu: Các pha động với các tỷ lệ khác nhau được khảo sát để tìm ra điều kiện sắc ký phù hợp dựa trên các thông số của pic sắc ký và độ ổn định của chất phân tích trong pha động. Các PPIs là chất kém bền, đặc biệt là trong môi trường có pH thấp do vậy pha động cần phải có pH phù hợp để các PPIs ít bị phân hủy nhưng vẫn đảm bảo tốt các thông số của pic sắc ký. Ở các nghiên cứu trước, một số tác giả sử dụng pH của đệm là 4,5 là chưa hợp lý [12], nhưng chủ yếu các tác giả sử dụng pH của đệm là khoảng 7,0 [10], [16], [18], [20]. Nghiên cứu ban đầu, chúng tôi có tiến hành khảo sát một số hệ dung môi có sử dụng đệm như đệm phosphat, đệm acetat đều điều chỉnh pH đến 8,0. Các hệ đệm này đều phân tách tốt các PPIs, các pic trên SKĐ tách rõ ràng, đẹp. Tuy nhiên, nhược điểm khi sử dụng dung dịch đệm làm pha động là thời gian rửa cột cho một quy trình phân tích quá dài (khoảng 2 - 3 giờ), chưa đáp ứng được sự nhanh chóng để phân tích cho nhiều quy trình và khi sử dụng lâu dài có thể gây ăn mòn hệ thống sắc ký. Do đó, chúng tôi tiếp tục khảo sát các hệ pha động sử dụng dung dịch nước kiềm, được điều chỉnh pH đến 7,2. Qua quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng pha động là nước kiềm, đây là dung dịch đơn giản, dễ pha, pH của dung dịch là 7,2 là hợp lý (nằm trong khoảng pH 7,0 - 8,0), ở pH này đảm bảo cho chất phân tích là các PPIs ổn định trong quá trình phân tích và các thông số của pic sắc ký thu được: Số đĩa lý thuyết, hệ số phân giải, hệ số bất đối xứng đảm bảo tốt theo yêu cầu. Bên cạnh đó, khi sử dụng pha động là nước kiềm, thời gian rửa cột cho một quy trình phân tích được rút ngắn (khoảng 1 giờ), đáp ứng được yêu cầu xây dựng quy trình phân tích nhanh chóng, đơn giản, tiện lợi. Với điều kiện sắc ký lựa chọn, phương pháp đảm bảo sự tách, các tín hiệu sắc ký ghi nhận sắc nét, rõ ràng. Độ đặc hiệu được chứng ming có khả năng phát hiện 63