›

Khóa luận Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein/creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại Bệnh viện Nhi Trung Ương

pdf 65 trang thiennha21 18/04/2022 5420
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein/creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại Bệnh viện Nhi Trung Ương", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xac_dinh_moi_lien_quan_giua_da_hinh_don_rs3738423.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein/creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại Bệnh viện Nhi Trung Ương

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐÀM VĂN QUÝ XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 CỦA GEN NPHS2 VỚI CHỈ SỐ PROTEIN/CREATININ NIỆU Ở BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐÀM VĂN QUÝ XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 CỦA GEN NPHS2 VỚI CHỈ SỐ PROTEIN/CREATININ NIỆU Ở BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa: QH 2013.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Vũ Thị Thơm 2. ThS. BS. Vũ Vân Nga HÀ NỘI - 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS.Bs. Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Đàm Văn Quý
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) DNA Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine EDTA tetraacetic) Focal segmental glomerulosclerosis (Xơ hóa cầu thận khu trú FSGS từng phần) HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát MCD Minimal Change Disease (Tổn thương tối thiểu) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) NC Nhạy cảm KTM Kháng thuốc muộn KTS Kháng thuốc sớm Kb Kilobase (= 1000 bp) OD Optical Density (Mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) VPF Vascular permeability factor (Yếu tố thấm mạch máu)
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen 19 NPHS2 Bảng 3.1 Giới tính ở các nhóm bệnh nhân 23 Bảng 3.2 Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại 23 Bảng 3.3 Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân 24 Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs3738423 (C>T) của exon 2 ở ba 31 nhóm bệnh nhân Bảng 3.5 Phân bố giới theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 32 Bảng 3.6 Tuổi khởi phát theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 32 Bảng 3.7 Protein máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 33 Bảng 3.8 Albumin máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 34 Bảng 3.9 Protein niệu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 35 Bảng 3.10 Protein/creatinin niệu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 36 Bảng 3.11 Chỉ số protein máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen 38 đột biến rs3738423 của exon 2 Bảng 3.12 Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen 39 đột biến rs3738423 của exon 2 Bảng 3.13 Chỉ số protein niệu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen 40 đột biến rs3738423 của exon 2 Bảng 3.14 Chỉ số protein/creatinin niệu theo mức độ đáp ứng corticosteroid 41 và alen đột biến rs3738423 của exon 2
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Tế bào podocyte bình thường và bệnh lý 5 Hình 1.2 Gen NPHS2 trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 25.2 11 Hình 1.3 Cấu trúc màng lọc cầu thận 12 Hình 1.4 Một số đột biến trên gen NPHS2 13 Hình 3.1 Kết quả giải trình tự đa hình thái đơn rs3738423 (C>T) 30
  7. DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân mắc HCTH theo giới 22 Biểu đồ 3.2 Giá trị trung bình protein máu của các nhóm bệnh nhân tại các 25 thời điểm Biểu đồ 3.3 Giá trị trung bình albumin máu của các nhóm bệnh nhân tại các 26 thời điểm Biểu đồ 3.4 Giá trị trung bình protein niệu của các nhóm bệnh nhân tại các 27 thời điểm Biểu đồ 3.5 Giá trị trung bình protein/creatinin niệu của các nhóm bệnh 28 nhân tại các thời điểm
  8. Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Hội chứng thận hư tiên phát 3 1.1.1 Khái niệm 3 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ 3 1.1.3 Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP 4 1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTHTP và HCTHTP kháng corticosteroid 7 1.1.5 Điều trị HCTHTP 8 1.1.6 Vai trò của chỉ số Protein/Creatinin niệu trong chẩn đoán và theo dõi điều trị HCTHTP 10 1.2 Đa hình di truyền NPHS2 11 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò gen NPHS2 11 1.2.2 Đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4 Xử lý số liệu 21 2.5 Đạo đức nghiên cứu 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Đặc điểm chung 22 3.1.1 Giới 22 3.1.2 Tuổi 23 3.2 Kết quả cận lâm sàng 25 3.2.1 Chỉ số protein máu 25 3.2.2 Chỉ số albumin máu 26 3.2.3 Chỉ số protein niệu 27 3.2.4 Chỉ số protein/creatinin niệu 28
  9. 3.3 Kết quả tần số phân bố alen và tỷ lệ kiểu gen 29 3.3.1 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen 29 3.3.2 Liên quan đến giới tính 32 3.3.3 Liên quan đến tuổi khởi phát 32 3.3.4 Liên quan đến protein máu 33 3.3.5 Liên quan đến albumin máu 34 3.3.6 Liên quan đến protein niệu 35 3.3.7 Liên quan đến protein/cretinin niệu 36 3.4 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa 37 3.4.1 Chỉ số protein máu 38 3.4.2 Chỉ số albumin máu 39 3.4.3 Chỉ số protein niệu 40 3.4.4 Chỉ số protein/cretinin niệu 41 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là hội chứng về cầu thận mạn tính thường gặp ở trẻ em, đặc trưng bởi sự thoát protein ra nước tiểu do tổn thương tại cầu thận. Bệnh kéo dài nhiều tháng với những đợt triệu chứng bột phát và thuyên giảm xen kẽ. Tỷ lệ mắc HCTHTP có sự khác nhau tùy chủng tộc, vùng địa lý trên thế giới nhưng tỷ lệ trung bình là từ 2 đến 16,9/100.000 trẻ em [16]. Khó khăn lớn nhất trong điều trị hội chứng thận hư (HCTH) là tình trạng kháng thuốc corticosteroid, mặc dù chiếm tỷ lệ 10-15% hay 20% nhưng gần một nửa số bệnh nhân kháng thuốc có thể tiến triển tới suy thận giai đoạn cuối trong vòng 10 năm, ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và cuộc sống [40, 5]. Trong chẩn đoán và theo dõi hội chứng thận hư thì các xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu đóng vai trò vô cùng quan trọng. Bên cạnh biểu hiện lâm sàng như phù, đái máu thì những nhà lâm sàng luôn quan tâm đến các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu 24 giờ Và đặc biệt là chỉ số protein/creatinin niệu với sự chính xác, thuận tiện và tin cậy trong việc đánh giá protein niệu 24 giờ, giúp cho việc chẩn đoán sớm hội chứng thận hư và theo dõi điều trị bệnh khi việc thu thập nước tiểu 24 giờ gặp khó khăn [10, 2]. Sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử hiện đại đã mở ra bước ngoặt mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh tật nói chung và các bệnh về cầu thận nói riêng. Các nhà khoa học đã phát hiện ra podocin, một protein đảm nhiệm vai trò chính trong chức năng lọc của cầu thận. Podocin được mã hóa bởi gen NPHS2 gồm 8 exon nằm trên nhiễm sắc thể số 1 ở người (1q25-31) [20]. Đột biến gen NPHS2 có thể dẫn đến sai lệch cấu trúc podocin, ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu thận, là một trong những yếu tố dẫn đến HCTH. Và đặc biệt đa hình rs3738423 (tên khác là S96S hay 288C>T) là 1 SNP (single nucleotide polymorphism) ở vị trí nucleotide 16170 của exon 2 gen NPHS2, có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP kháng corticosteroid [20]. Qua nghiên cứu trên 97 bệnh nhi mắc HCTHTP, Junli và cộng sự đã thấy rằng rs3738423 dường như có tác dụng bảo vệ 1
  11. những bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng tác dụng này không thấy ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia [32]. Với mong muốn góp phần cho việc khám và theo dõi điều trị bệnh nhân hiệu quả hơn, đặc biệt là những bệnh nhân trong nhóm kháng thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein/creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại Bệnh viện Nhi Trung Ương” Mục tiêu: - Xác định được tỉ lệ đa hình thái đơn rs3738423 của gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP - Xác định được mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với chỉ số protein/creatinine niệu ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP 2
  12. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng thận hư tiên phát 1.1.1 Khái niệm Hội chứng thận hư là một hội chứng xuất hiện khi có tổn thương cấu trúc hoặc chức năng của cầu thận, đặc trưng bởi các triệu chứng phù, protein niệu tăng cao, protein máu giảm và lipid máu cao. Hội chứng này có nhiều nguyên nhân, có thể do các bệnh lý ngoài thận (như tiểu đường, lupus ) ảnh hưởng đến cầu thận và các cơ quan khác trong cơ thể được gọi là HCTH thứ phát; nhưng thường gặp là do tổn thương khu trú tại thận gọi là HTTHTP [26]. Hội chứng thận hư nguyên phát là bệnh về cầu thận mạn tính thường gặp nhất ở trẻ em, nguyên nhân bắt đầu từ thận và thường được chẩn đoán loại trừ khi không tìm thấy nguyên nhân nào ngoài thận. Bệnh kéo dài nhiều tháng, nhiều năm với những đợt triệu chứng bột phát xen lẫn thời kì thuyên giảm. Hội chứng thận hư kháng corticosteroid được định nghĩa là không có sự thuyên giảm về kết quả điều trị sau khi áp dụng phác đồ chuẩn sử dụng corticosteroid. Mặc dù chỉ chiếm tỷ lệ khoảng 20% số bệnh nhân mắc HCTHTP, nhưng HCTH kháng corticosteroid lại rất khó điều trị và có tới 36-50% số bệnh nhân này sẽ tiến tới suy thận trong vòng 10 năm [40]. 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ Hội chứng thận hư tiên phát ở bệnh nhân nhi có tỷ lệ mắc khác nhau tùy thuộc vào giới, tuổi, chủng tộc, cơ địa của từng trẻ. Tại Việt Nam, HCTHTP hay gặp ở lứa tuổi 8,7 ± 3,5 tuổi, và tỉ lệ bé trai bị bệnh nhiều hơn bé gái là 2/1 [3]. Năm 2016, theo nghiên cứu tại Canada trong vòng 20 năm từ năm 1993 đến năm 2014 cho thấy tỉ lệ mắc giữa bé trai và bé gái là xấp xỉ 2:1, tỉ lệ mắc mới hàng năm của người gốc châu Âu là 2,4, của người gốc Nam Á là 15,83, của người gốc Đông/Đông Nam Á là 1,81 (tính trên 100.000 trẻ em độ tuổi từ 1 đến 18 tuổi) [16]. 3
  13. Hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid luôn được các nhà làm lâm sàng quan tâm bởi vì việc điều trị thường kéo dài, khó khăn và để lại nhiều biến chứng nguy hiểm. Tỷ lệ kháng corticosteroid cũng khác nhau theo các vùng địa lý, thời gian. Tỷ lệ kháng corticosteroid ở một số nước châu Á như Ấn Độ và Pakistan là khoảng 30% [17, 41]. Năm 2012, nghiên cứu tại Ba Lan chỉ ra tỉ lệ kháng corticosteroid trên 178 bệnh nhi mắc HCTH tăng từ 15,8% lên tới 31,4% trong hai giai đoạn 1986-1995 và 1996-2005 [15]. Một nghiên cứu khác ở Nam Phi đưa ra tỷ lệ kháng thuốc là 27,3% [17]. Tại Việt Nam, tỷ lệ kháng thuốc ở trẻ mắc hội chứng thận hư cũng khác nhau trong từng thời gian, từng nghiên cứu. Theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng, tỷ lệ HCTH kháng thuốc là 12,4% [8], nghiên cứu của Dương Thị Thúy Nga là 20% [5], trong khi đó nghiên cứu của Phạm Văn Đếm và các cộng sự thống kê có 258 trẻ kháng thuốc trong tổng số 458 trẻ mắc HCTH điều trị nội trú tại khoa Thận- Lọc máu bệnh viện Nhi Trung Ương chiếm tới 56,3 % [1]. 1.1.3 Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát xuất hiện khi có sự tăng tính thấm của màng lọc cầu thận đối với các protein, nhất là các phân tử albumin. Khi điện di protein niệu ở bệnh nhân có hội chứng thận hư, các nhà khoa học thấy có gần 70% là albumin, do đó người ta gọi là protein niệu chọn lọc [11]. Albumin trong huyết thanh mang điện tích âm, bình thường rất khó lọt qua được màng lọc cầu thận, vì bị lớp điện tích âm của bề mặt màng lọc cầu thận ngăn cản. Màng lọc cầu thận là một hàng rào có cấu trúc hình tổ ong và có cấu tạo gồm ba lớp. Lớp thứ nhất là lớp nội mô mao mạch cầu thận, ở đây có những lỗ lọc đường kính 500-1000 Å. Lớp thứ hai là màng đáy gồm 3 lớp dày khoảng 3200 Å và tích điện âm. Lớp thứ ba là hàng tế bào podocyte (lớp tế bào biểu mô của bao Bowman) [21]. Bình thường, hàng rào này lọc các chất từ huyết tương, tạo ra “nước tiểu đầu” có thành phần giống huyết thanh, chỉ thiếu protein. Màng lọc cầu thận là màng có tính thấm chọn lọc cao, dựa vào kích thước, điện tích và hình dạng của phân tử đó. Các phân tử không mang điện và bán kính nhỏ hơn 70 Å sẽ dễ 4
  14. dàng đi qua màng lọc. Những phân tử có bán kính lớn hơn 4,0nm và tích điện âm sẽ khó qua được hàng rào này để vào nước tiểu đầu [43]. Chính vì vậy, khi màng lọc cầu thận bị thương tổn làm mở rộng lỗ lọc hoặc màng lọc cầu thận mất điện tích âm ở màng đáy thì những cấu trúc protein nhỏ và mang điện tích âm có thể dễ dàng đi qua. Cho đến nay đã có nhiều giả thuyết được đưa ra về vấn đề này và còn nhiều tranh cãi. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã phát hiện ra mối liên quan giữa tế bào podocyte và hội chứng thận hư. Podocyte là tế bào gồm thân và nhiều chân bao quanh các mao mạch cầu thận, các chân xen kẽ với nhau tạo ra các kẽ lọc với đường kính khoảng 70-75 Å hay còn gọi là cấu trúc khe lọc “slit diaphragm”. Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra một số protein liên kết với nhau tạo thành các phức hợp, cấu thành và gắn kết khe lọc slit diaphragm với các sợi actin nội bào. Các protein đó là nephrin, podocin, FAT1, FAT2, CD2AP Chúng có liên quan trực tiếp đến chức năng lọc cầu thận, khi các gen mã hóa các protein đó bị đột biến hoặc mất chức năng thì có thể dẫn tới protein niệu [12]. Do khả năng phân chia và tái tạo có hạn, nên những tổn thương ở tế bào podocyte rất khó hồi phục. Khi số lượng tế bào podocyte bị tổn thương trên 20% thì cầu thận dễ tiến triển tới xơ hóa và mất chức năng thận [55]. Hình 1.1. Tế bào podocyte bình thường và bệnh lý A: Podocyte bình thường với nhiều chân giả; B: Podocyte bệnh lý ở bệnh nhân HCTH dẹt và ít chân giả [51]. 5
  15. Cũng có quan điểm cho rằng hội chứng thận hư là bệnh rối loạn miễn dịch tế bào, do lắng đọng các phức hợp miễn dịch ở cầu thận gây hủy hoại lớp điện tích âm của màng lọc cầu thận, làm cầu thận để lọt dễ dàng các phân tử mang điện tích âm như albumin. Quan điểm này được đưa ra khi một số tác giả thấy rằng HCTH xuất hiện sau khi bệnh nhân tiếp xúc với các chất gây dị ứng [54]. Điều này càng được củng cố khi mà corticosteroid là thuốc chính trong điều trị HCTHTP. Hơn nữa, có bằng chứng cho thấy u lympho Hodgkin và u lympho tế bào T khác có thể gây nên hội chứng thận hư và sau khi dùng hóa trị liệu thì bệnh đã thuyên giảm [13]. Gần đây, protein CD80 (B70-1), một chất cần cho sự kích hoạt tế bào T đã được tìm thấy ở các tế bào podocyte bất thường lại càng củng cố cho quan điểm này. Và đây cũng là một mục tiêu để nghiên cứu thuốc đích cho các bệnh nhân mắc HCTH [45]. Bên cạnh đó, các yếu tố tăng tính thấm trong huyết tương cũng có thể là nguyên nhân gây ra HCTH, điều này đã được chứng minh khi có sự tái phát protein niệu ở những bệnh nhân xơ hóa cầu thận cục bộ từng phần (FSGS) sau khi được ghép thận [52]. Một nghiên cứu khác cho thấy huyết thanh ở bệnh nhân có xơ hóa cầu thận cục bộ từng phần cũng gây protein niệu ở chuột và có sự tăng tính thấm đối với albumin ở màng lọc cầu thận [48]. Nhiều yếu tố gây tăng tính thấm trong huyết tương đã được tìm ra, trong đó đáng chú ý là yếu tố thấm mạch máu (VPF) và haemopxin [14]. Haemopexin được cho là làm thay đổi tế bào chất tế bào podocyte, do đó làm tăng sự khuếch tán albumin trên màng lọc cầu thận [36]. Các nhà nghiên cứu đã tìm ra chất này ở trẻ em mắc HCTHTP và biến mất khi các triệu chứng đã thuyên giảm [14]. Phần lớn các trường hợp bệnh nhân HCTHTP kháng corticosteroid đều không tìm thấy nguyên nhân. Tuy vậy, các nhà khoa học đã tìm được bằng chứng cho rằng 1/4 đến 1/3 các trường hợp bệnh nhân kháng corticosteroid hoặc HCTH bẩm sinh là do các gen mã hóa cho các protein làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào podocyte [33]. Trên thế giới cũng ghi nhận các trường hợp bệnh nhân mắc HCTHTP ban đầu thì đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó thì 6
  16. không, vấn đề này đang được nhiều nhà nghiên cứu tìm câu trả lời. Và nghiên cứu này của chúng tôi cũng được thực hiện với mục đích đó. 1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTHTP và HCTHTP kháng corticosteroid KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) đã đưa ra một số phân loại và định nghĩa về HCTHTP ở trẻ em để áp dụng trong lâm sàng năm 2012 [27, 28]: Tiêu chuẩn chẩn đoán HCTH: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol; Albumin máu ≤ 25 gam/lít; Protein máu ≤ 56 gam/lít. • HCTHTP đạt thuyên giảm khi có Protein niệu/ Creatinine niệu 200 mg/mmol. • Chẩn đoán HCTHTP kháng corticosteroid theo một trong ba tiêu chuẩn sau: - Không thuyên giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục. - Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằngprednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều 1,5mg/kg/ 48 giờ. 7
  17. - Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 3 liều truyền Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73 m2 cơ thể/48 giờ. • Tiêu chuẩn kháng thuốc sớm : Kháng thuốc corticosteroid ngay trong liệu trình đầu tiên • Tiêu chuẩn kháng thuốc muộn : Có đáp ứng corticosteroid trong đợt đầu tiên hoặc nhiều đợt sau đó, nhưng kháng thuốc steroid trong các đợt tái phát. • HCTH phụ thuộc steroid: Bệnh nhân nhạy cảm steroid trong đợt điều trị tấn công nhưng có ≥ 2 lần tái phát trong đợt giảm liều steroid. • HCTH tái phát: Bệnh nhân đã đạt được thuyên giảm hoàn toàn nhưng sau đó protein/creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol hoặc ≥ 3+ protein que thử x 3 ngày. • HCTH tái phát thưa (tái phát không thường xuyên): Tái phát 1 lần trong vòng 6 tháng sau đáp ứng lần đầu hoặc 1 đến 3 lần tái phát trong bất kỳ chu kỳ 12 tháng nào. • HCTH tái phát dày (tái phát thường xuyên): Tái phát 2 lần trong 6 tháng sau đáp ứng lần đầu hoặc 4 lần tái phát trong bất kỳ chu kỳ 12 tháng nào. • HCTHTP đơn thuần: Bệnh nhân chỉ có HCTH không đái máu, không suy thận, không tăng huyết áp. • HCTHTP không đơn thuần: Bệnh nhân có HCTH kết hợp hoặc đái máu hoặc suy thận hoặc tăng huyết áp. 1.1.5 Điều trị HCTHTP Các bằng chứng về rối loạn miễn dịch tế bào trong việc tham gia vào cơ chế bệnh sinh của HCTHTP chính là cơ sở để các tổ chức y tế đưa ra khuyến cáo việc sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác để điều trị bệnh này [37]. Thể nhạy cảm corticosteroid: Bắt đầu điều trị bằng liều tấn công với Prednisolon 2 mg/kg/24 giờ nhưng không quá 60 mg/24 giờ uống 1 lần vào 8 giờ 8
  18. sáng, sau ăn, trong 4 tuần. Sau liều tấn công, bệnh thuyên giảm thì dùng liều duy trì 1,5 mg/kg/24 giờ trong 8 tuần, uống vào buổi sáng. Giảm liều: cứ 2 tuần giảm liều 1 lần, mỗi lần giảm 0,5 mg/kg. Sau đó dùng liều củng cố: 0,5 mg/kg/ cách ngày. Tổng thời gian điều trị là 4,5 tháng. Thể kháng corticosteroid: Dùng Prednisone liều 1 mg/kg/ cách ngày và thêm các thuốc ức chế miễn dịch khác. Cyclosporin là thuốc được ưu tiên nhất, liều 5 mg/kg/ngày. Luôn giữ nồng độ thuốc từ 100-150 ng/l, kiểm tra chức năng thận đều đặn, có thể dùng lâu dài từ 1-2 năm. Sau 3 tháng không thuyên giảm, chuyển thuốc ức chế miễn dịch khác như Mycophenolate mofetil. Nếu 3 tháng điều trị bằng Mycophenolate mofetil vẫn không thuyên giảm thì dùng phối hợp Mycophenolate mofetil và Cyclosporin. Nếu vẫn không đáp ứng thì dừng tất cả các thuốc và điều trị triệu chứng, bảo vệ thận. Khoảng 80-90% trẻ mắc HCTHTP đáp ứng điều trị với corticosteroid [5], điều này giúp giảm tỷ lệ tử vong ở trẻ mắc HCTHTP xuống còn 3% [35]. Tuy nhiên việc sử dụng corticosteroid kéo dài để điều trị bệnh cũng gây ra rất nhiều biến chứng nghiêm trọng như: béo phì, chậm phát triển chiều cao, đái tháo đường, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, kích thích dạ dày, rối loạn hành vi hay cáu giận [30]. Đối với các trường hợp mắc HCTH kháng thuốc thì việc sử dụng corticosteroid kéo dài không những không có kết quả mà còn khiến bệnh nhân chịu nhiều tác dụng phụ của thuốc. Gần đây, với sự phát triển vượt bậc trong lĩnh vực sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng có mối liên quan giữa đa hình di truyền với HCTH kháng thuốc. Sự liên quan này biểu hiện rất đa dạng ở các chủng tộc người, ở các vùng địa lý khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này, tiếp cận HCTHTP theo hướng di truyền sinh học phân tử nhằm tối ưu hóa điều trị, giảm thiểu tối đa các tác dụng phụ và chi phí mà các bệnh nhi phải gánh chịu. 9
  19. 1.1.6 Vai trò của chỉ số Protein/Creatinin niệu trong chẩn đoán và theo dõi điều trị HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát là một rối loạn do tổn thương tại cầu thận, làm một lượng lớn protein trong máu thoát ra nước tiểu ( protein niệu >50mg/kg/24h). Chính vì vậy việc định lượng protein niệu 24h là một trong những xét nghiệm bắt buộc để chẩn đoán xác định và cũng là xét nghiệm thường xuyên để theo dõi tiến triển, kết quả điều trị của các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư [27]. Thu thập nước tiểu 24 giờ [4]: Khi trẻ ngủ dậy khoảng 8h sáng, cho trẻ đi tiểu (bỏ bãi nước tiểu này, không hứng vào bô). Sau đó trong ngày, khi nào trẻ đi tiểu thì hứng vào bô, cho đến bãi nước tiểu cuối cùng vào 8h sáng ngày hôm sau. Đánh giá: thiểu niệu khi số lượng nước tiểu 0,5-1 ml/ kg/ giờ; Vô niệu khi số lượng nước tiểu 4ml/ kg/ giờ. Tuy nhiên việc lấy mẫu nước tiểu 24h ở trẻ nhỏ, nhất là ở trẻ gái hay với những gia đình kém hợp tác gặp khá nhiều khó khăn. Xuất phát từ vấn đề này, định lượng chỉ số protein/creatinin niệu trong mẫu nước tiểu bất kì được đưa ra như là một phương pháp thay thế hợp lý. Thay vì phải tốn công sức, thời gian lấy mẫu nước tiểu 24h, bệnh nhân chỉ cần lấy một mẫu nước tiểu ngẫu nhiên bất kì thời điểm nào. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như Việt Nam đã cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa protein niệu 24h và tỷ số protein/creatinin niệu ở tất cả các mức độ [10, 18, 2]. Và KDIGO đã công nhận chỉ số protein/creatinin niệu là một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để chẩn đoán hội chứng thận hư [27]. Như vậy, chỉ số protein/creatinin niệu có thể dùng để chẩn đoán sớm hội chứng thận hư ở trẻ nhỏ khi trẻ mới nhập viện chưa có kết quả xét nghiệm nước tiểu 24h, cũng như để tiện theo dõi tiến triển của bệnh thay thế cho việc lấy mẫu nước tiểu 24h gặp nhiều khó khăn. Nhận thấy những ưu điểm đó, nghiên cứu này của chúng tôi tập trung vào phân tích mối liên quan xung quanh chỉ số protein/creatinin niệu, nhằm tối ưu hóa công việc chẩn đoán và theo dõi điều trị của bệnh nhân. 10
  20. 1.2 Đa hình di truyền NPHS2 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trò gen NPHS2 Năm 2000, Boute và cộng sự đã xác định được vị trí gen NPHS2 ở người (MIM # 604766, GenBank NM 014625.2). Gen dài khoảng 25 Kb, có 8 exon, nằm trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31). [20]. ( Hình 1.2) Hình 1.2. Gen NPHS2 trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 ở vị trí 25.2 . ( Nguồn: Genome Decoration Page/ NCBI) Gen NPHS2 mã hóa cho podocin, một protein được tạo thành từ 383 acid amin với trọng lượng phân tử là 42 kD. Podocin là protein gắn màng, cấu trúc hình kẹp tóc, có cả hai đầu N- và C- đều nằm trong tế bào chất [49]. Podocin được tìm thấy chủ yếu ở thận, là cơ quan có nhiệm vụ lọc các chất thải từ máu và loại bỏ chúng qua nước tiểu. Cụ thể, podocin được tìm thấy trong các tế bào gọi là podocyte, tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở khu vực slit diagram để có thể dễ dàng tương tác với các protein khác như CD2AP hay nephrin [25]. Podocyte là các tế bào biểu mô có chân hình các tua nhỏ, tạo thành các khe lọc nhỏ (slit diagram) có đường kính khoảng 70- 75 A0. Đây là hàng rào cuối cùng, là 1 trong 3 lớp cấu thành nên màng lọc cầu thận cùng với lớp tế bào nội mô mao mạch và màng đáy [29]. Trong những năm gần đây, các đột biến di truyền gây bệnh ở tế bào podocyte ngày càng được quan tâm và chứng minh là nguyên nhân hàng đầu, liên quan chặt chẽ đến hội chứng thận hư kháng corticosteroid. 11
  21. Hình 1.3. Cấu trúc màng lọc cầu thận [24] Ở lớp tế podocyte, các protein podocin, CD2AP và nephrin tập trung ở khu vực slit diagram và tương tác với nhau để điều hòa chức năng lọc tại đây. Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện 24 đột biến đơn gen có liên quan đến HCTH kháng corticosteroid, có thể kể đến như NPHS1, NPHS2, PLCe1 [38]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, đột biến gen NPHS2 là đột biến hay gặp nhất ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư kháng corticosteroid, với tỷ lệ từ 10- 30% [22]. Trong nghiên cứu của Sadowski và cộng sự, ông nhận thấy rằng có tới 29,5% các gia đình có hội chứng thận hư kháng corticosteroid có mang đột biến đơn gen và 1/3 trong số đó nằm trên gen NPHS2 [47]. Năm 2017, trong nghiên cứu của Joshi trên các bệnh nhi Ấn Độ mắc HCTHTP kháng corticosteroid , tỷ lệ đột biến gen NPHS2 lên đến 35,3 % [31]. Các nhà khoa học đã xác định được 126 đột biến trên gen NPHS2, trong đó có 53 đột biến sai nghĩa, 17 đột biến vô nghĩa, 11 đột biến thêm đoạn, 26 đột biến mất đoạn, 16 đột biến ở vị trí cắt nối, 2 đột biến mất và 1 đột biến ở mã kết thúc [19]. Phần lớn các đột biến nằm tập trung từ exon 1 đến exon 6, được chứng minh là có liên quan chặt chẽ đến HCTHTP, các đột biến khác trên exon 7 và 8 chưa thấy mối liên quan thật sự rõ ràng [50]. 12
  22. Hình 1.4. Một số đột biến trên gen NPHS2 [53]. Cấu trúc hai chiều của protein podocin. Vùng tương đồng với stomatin được mô tả bằng màu đen. Các đột biến chưa xác định được in nghiêng, các đột biến vô nghĩa được gạch chân. 1.2.2 Đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 Đa hình đơn rs3738423 (tên khác là S96S hay 288C>T) là sự thay thế nucleotide C thành nucleotide T tại vị trí 16170 trên exon 2 của gen NPHS2. Chính sự thay thế này đã tạo nên đa hình rs3738423 có 3 kiểu gen: kiểu gen đồng hợp kiểu dại (CC), kiểu gen dị hợp tử (CT) và kiểu gen đồng hợp tử đột biến (TT). Đa hình này lần đầu được phát hiện bởi Mei- Chen Wu và cộng sự vào năm 2001. Nghiên cứu của ông cho thấy tần số alen C và T của đa hình này trên quần thể người Đài Loan khỏe mạnh là 0,94 và 0,06. Tần số kiểu gen CC: CT: TT lần lượt là 0,88: 0,12: 0,0. Sự phân số này tuân theo định luật Hardy Weinberg [57]. Đa hình rs3738423 cũng có tần số tương tự ở những bệnh nhi ở châu Âu [34]. Trong một nghiên cứu khác trên 44 bệnh nhân mắc HCTH đã được chẩn đoán mô bệnh học thể FSGS của Caridi năm 2001 tại Italia thì tần số alen đột biến T là 0,06 ở vị trí SNP 288C>T [22]. 13
  23. Năm 2005, Zihua Yu đã nghiên cứu trên 23 trẻ HCTH kháng thuốc và phát hiện 1 trẻ kiểu gen đồng hợp TT và 1 trẻ kiểu gen dị hợp CT ở SNP rs3738423. Ông không thấy có sự khác biệt về kiểu gen và tần số alen giữa 23 trẻ này và 53 trẻ đối chứng khác [58]. Năm 2009, nghiên cứu của Spyridon Megremis trên 22 trẻ mắc HCTH kháng thuốc ở Hy Lạp thấy rằng tỷ lệ alen đột biến T của SNP rs3738423 là 2,2%. Trong khi đó, tỷ lệ này ở nhóm chứng 100 bệnh nhân là 1% [39]. Cũng cùng năm 2009, Li Zhu nghiên cứu trên 214 trẻ mắc HCTH vùng phía Bắc Trung Quốc có chẩn đoán đoán mô bệnh học là MCD thấy rằng có 35 trường hợp dị hợp tử CT và 5 trường hợp đồng hợp tử TT ở SNP rs3738423. Ông chỉ ra rằng rs3738423 không ảnh hưởng đến mô bệnh học MCD và không liên quan đến protein niệu quả bệnh nhân [59]. Năm 2012, trên 97 bệnh nhi HCTH, Jun Li thấy có 7 trường hợp dị hợp tử CT và 1 trường hợp dị hợp tử TT ở SNP rs3738423. Jun Li và các cộng sự thấy rằng rs3738423 dường như có tác dụng bảo vệ những bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng tác dụng này không thấy có ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia [32]. Năm 2015, nghiên cứu của Dedi Rachmadi trên 59 bệnh nhi HCTH ở Indonesia thì có 4 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử CT ở SNP rs3738423. Đa hình này không liên quan đến lâm sàng hay tình trạng kháng thuốc của bệnh nhân HCTH [44]. 14
  24. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu gồm 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương tự nguyện tham gia nghiên cứu. ✓ Tiêu chuẩn lựa chọn - Các bệnh nhân điều trị ở khoa Thận - Tiết Niệu bệnh viện Nhi Trung Ương từ tháng 09/2015 đến tháng 06/2016 được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 gam/lít, Protid máu ≤ 56 gam/lít [27, 28]. - Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác. - Tự nguyện tham gia nghiên cứu. ✓ Tiêu chuẩn loại trừ - HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc ). - Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu. ✓ Chia nhóm bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, chọn ra 03 nhóm gồm: - Nhóm nhạy cảm (n= 58): Gồm 58 bệnh nhi mắc HCTHTP nhạy cảm với corticosteroid. - Nhóm kháng thuốc sớm (n= 56): Gồm 56 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng sớm với thuốc corticosteroid. - Nhóm kháng thuốc muộn (n= 35): Gồm 35 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng muộn với thuốc corticosteroid. 15
  25. 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ tháng 9/2015 đến 3/2017. Đề tài được tiến hành tại khoa Thận - Lọc máu, phòng xét nghiệm sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương là nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân. Địa điểm tiến hành phân tích gen: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc. Các chỉ tiêu nghiên cứu - Dữ liệu lâm sàng: tuổi, giới, lý do vào viện, bệnh sử, tiền sử, cân nặng, chiều cao, huyết áp, tình trạng sốt, phù; các thông tin khi khám về tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu. - Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu - Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423 Hóa chất Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek). Hóa chất dùng cho điện di: Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X; Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code: SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck). Hóa chất dùng cho PCR: Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek). 16
  26. Thiết bị Các pipet Eppendorf dải 0,5 µl - 10 µl, 10 µl - 100 µl, 100 µl - 1000 µl, hãng: Thermo; Đầu típ 10 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -300C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức). Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ 24h). Bô đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc. Tối hôm trước tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng bệnh nhân đái bỏ đi, và bắt đầu ghi thời gian. Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô. Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5ml để làm xét nghiệm. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5ml). Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu: lấy máu buổi sáng, chưa ăn. Lấy 1,5 - 2ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin. Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để phân tích. Mẫu cho phân tích gen: lấy 2ml máu toàn phần đựng trong ống nghiệm chống đông bằng EDTA, bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng. Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách DNA tổng số. Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu Bệnh phẩm được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh Viện Nhi Trung Ương. Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện, 17
  27. sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng. Các chỉ số sinh hóa cơ bản được phân tích bao gồm: nồng độ protein niệu, protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu, creatinin máu sử dụng hệ thống phân tích sinh hóa tự động AU2700 (Beckman Coulter). Phân tích đa hình gen NPHS2 Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng. Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1. Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết: Sự có mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X. 5 µl DNA được trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml). Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280). ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được trình bày ở Phụ lục 2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR: Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế mồi nhân dòng exon 2, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ). Exon Trình tự mồi (5’ – 3’) CTCTGACTACTCTGATTTGACTT 2 CTCAAATGTGAACAGGAAGCC Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng PCR: Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA cần phân tích từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1 %. 18
  28. Bảng 2.1. Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2. Thể tích Thành phần Điều kiện (chu trình nhiệt) (µL) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 oC trong 3’ Buffer 10X 2,5 * Lặp lại 35 chu kì: MgSO 4 (25mM) 2 - Biến tính: 95 oC – 30” Pfu DNA polymerase 0,5 - Gắn mồi: 56 oC – 30” (2.5 U/µL) - Kéo dài chuỗi: 72 oC – 1’ DNA 2,5 o Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,75 * Tổng hợp cuối: 72 C – 5’ Mồi ngược (10 pmol/µl) 0,75 * Giữ sản phẩm ở -4 oC Nước khử ion 13,5 Tổng thể tích 25 Xác định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 bằng giải trình tự: 20 µl sản phẩm được gửi giải trình tự tại hãng IDT (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân. Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotide được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotid, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp. 19
  29. Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N=149) Điều trị tấn công 4 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h Có Có thuyên giảm không ? Không Điều trị duy trì 4-8 tuần Điều trị tiếp 2 tuần Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h Liều prednisolon 2mg/kg/24h - Thuyên giảm hoàn toàn - Thuyên giảm không Không thuyên giảm - Không tái phát hoàn toàn (Protein/creatinin - Hoặc có tái phát nhưng - Tái phát và kháng thuốc >200mg/mmol) vẫn đáp ứng thuốc trong những đợt điều trị sau Nhạy cảm thuốc Kháng thuốc muộn Kháng thuốc sớm n=58 n=35 n=56 Đặc điểm chung Chỉ số sinh hóa Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423 Phân tích mối liên quan Sơ đồ 2.1: sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20
  30. 2.4 Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0 Phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố và hai nhân tố; Kiểm định Chi- Square (χ2) được áp dụng cho các trường hợp tương ứng. p<0,05 được xem là sai khác có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α=0,05. Sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, T- test, χ2, ANOVA test 2.5 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân theo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế. Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào. Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Nghiên cứu này được Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Nhi Trung Ương phê duyệt với số ID 796/BVNTW- VNCSKTE và đã được sự đồng ý của tất cả bệnh nhân và cha mẹ họ. 21
  31. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm chung Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trên 149 bệnh nhi mắc HCTHTP, sau đây là một số đặc điểm chung về giới và tuổi. 3.1.1 Giới 27.5% 72.5% Nam Nữ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân mắc HCTH theo giới Trong nghiên cứu này, số lượng bệnh nhân nam cao hơn bệnh nhân nữ (72,5% so với 27,5%), với tỉ lệ nam/nữ xấp xỉ 2,6/1. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên ba nhóm bệnh nhân: nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS), nhóm kháng thuốc muộn (KTM). Giới tính ở các nhóm bệnh nhân được thể hiện ở bảng 3.1 22
  32. Bảng 3.1. Giới tính ở các nhóm bệnh nhân Phân nhóm Tổng, p NC KTS KTM n (%) n (%) n (%) n (%) Giới Nam 44 (75,9%) 39 (69,6%) 25 (71,4%) 108 (72,5%) Nữ 14 (24,1%) 17 (30,4 %) 10 (28,6 %) 41 (27,5 %) 58 56 35 149 (χ2 = 0,578; Tổng p = 0,749) Ở ba nhóm bệnh nhân đều số số lượng bệnh nhân nam nhiều hơn bệnh nhân nữ với tỷ lệ phần trăm giới tính nam ở ba nhóm NC, KTS và KTM lần lượt là 75,9%, 69,6% và 71,4%. Không có sự khác biệt về phân bố giới tính giữa ba nhóm với chỉ số χ2 = 0,578 và giá trị p > 0,05. 3.1.2 Tuổi Tuổi khởi phát bệnh trung bình và tuổi trung bình của bệnh nhi tại thời điểm nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2 Bảng 3.2. Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại Tuổi khởi phát Tuổi trung bình ( ± SD) ( ± SD) 4,2 ± 2,8 5,8 ± 3,6 23
  33. Tuổi trung bình của bệnh nhân tại thời điểm nghiên cứu là 5,8 ± 3,7 tuổi, nhỏ nhất 2 tháng, lớn nhất 16 tuổi. Tuổi khởi phát bệnh là 4,2 ± 2,8 tuổi (từ 2 tháng đến 14 tuổi). Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất thuộc nhóm kháng thuốc sớm. Tuổi khởi phát ở các nhóm bệnh nhân, được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân Tuổi khởi phát Bệnh nhân Số lượng (n) ( ± SD) NC 58 4,4 ± 2,5 KTS 56 3,8 ± 3,1 KTM 35 4,4 ± 2,8 p 0,48 Tuổi khởi phát trung bình ở nhóm bệnh nhân NC là 4,4 ± 2,5; ở nhóm bệnh nhân KTS là 3,8 ± 3,1; ở nhóm bệnh nhân KTM là 4,4 ± 2,8. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tuổi khởi phát giữa 3 nhóm bệnh nhân với chỉ số p> 0,05. Bàn luận về đặc điểm chung Trong nghiên cứu này, hội chứng thận hư hay gặp ở nam giới hơn nữ giới. Điều này được thể hiện rõ rệt qua những nghiên cứu trong và ngoài nước như tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng là 2,7/1, Trần Hữu Minh Quân là 2/1, Chang là 2,8/1 và Wong là 2,5/1 [7, 56, 23, 6]. Tuổi khởi phát bệnh trung bình trong nghiên cứu của chúng tôi là 4,2 ± 2,8 tuổi. Khi so sánh độ tuổi khởi phát trung bình với các nghiên cứu khác thì không có sự khác biệt. Độ tuổi khởi phát của bệnh nhi mắc HCTHTP trong nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm là từ 1-8 tuổi, Patrick Niaudet là 2-7 tuổi [42, 9]. Như vậy, độ tuổi khởi phát và độ tuổi trung bình của bệnh nhân mắc HCTHTP là độ tuổi tiền học đường và học đường. 24
  34. 3.2 Kết quả cận lâm sàng Trong hội chứng thận hư, ngoài những biểu hiện lâm sàng như cao huyết áp, phù, những chỉ số cận lâm sàng trong máu và nước tiểu như protein máu, albumin máu, protein niệu, protein/creatinine niệu đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán, theo dõi và điều trị. Bệnh nhân được chia thành ba nhóm dựa trên mức độ đáp ứng với corticosteroid là nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS), nhóm kháng thuốc muộn (KTM), theo dõi dọc tại nhiều thời điểm, từ lúc vào viện, ra viện, sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng. Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu được trình bày bằng các biểu đồ dưới đây. 3.2.1 Chỉ số protein máu PROTEIN MÁU (G/L) Nhạy cảm Kháng thuốc sớm Kháng thuốc muộn 70 60 50 40 + ## + ++ # 30 20 10 0 V ÀO V IỆ N R A V IỆ N SAU 1 THÁNG SAU 6 THÁNG Biểu đồ 3.2. Giá trị trung bình của protein máu của các nhóm bệnh nhân NC (hình trám), KTS (hình vuông) và KTM (hình tam giác) tại các thời điểm. Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * p<0,05; p<0,01; + là giữa nhóm NC và KTM: + p<0,05; ++ p<0,01; # là giữa nhóm KTS và KTM: # p<0,05; ## p<0,01. 25
  35. Protein máu của các nhóm bệnh nhân có xu hướng tăng dần theo thời gian điều trị, từ khi vào viện đến sau ra viện 6 tháng. Tại thời điểm vào viện, chỉ số protein máu không có sự khác nhau giữa ba nhóm bệnh nhân. Tuy nhiên, tại các thời điểm sau đó là ra viện, sau ra viện 1 tháng, sau ra viện 6 tháng, chỉ số protein máu của nhóm NC cao hơn nhóm KTS với giá trị p < 0,01. Cũng tại các thời điểm đó, chỉ số protein máu của nhóm NC cũng cao hơn của nhóm KTM với giá trị p<0,05. Chỉ số protein của nhóm KTM cũng cao hơn có ý nghĩa so với nhóm KTS tại các thời điểm sau ra viện 1 tháng (p<0,05) và sau ra viện 6 tháng (p<0,01). 3.2.2 Chỉ số albumin máu ALBUMIN MÁU (G/L) Nhạy cảm Kháng thuốc sớm Kháng thuốc muộn 40 35 30 25 20 ## 15 ## * 10 5 0 V ÀO V IỆ N R A V IỆ N SAU 1 THÁNG SAU 6 THÁNG Biểu đồ 3.3. Giá trị trung bình của albumin máu của các nhóm bệnh tại các thời điểm. Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * p<0,05; p<0,01; + là giữa nhóm NC và KTM: + p<0,05; ++ p<0,01; # là giữa nhóm KTS và KTM: # p<0,05; ## p<0,01. 26
  36. Cũng như chỉ số protein, chỉ số albumin cũng có xu hướng tăng dần theo diễn tiến thời gian. Tại thời điểm vào viện, chỉ số albumin không có sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân. Tuy nhiên chỉ số albumin của nhóm NC luôn cao hơn có ý nghĩa so với nhóm KTS tại thời điểm ra viện (p<0,05), sau ra viện 1 tháng (p<0,01), sau ra viện 6 tháng (p<0,01). Bên cạnh đó, chỉ số albumin máu của nhóm KTM cũng cao hơn nhóm KTS tại thời điểm sau ra viện 1 tháng và 6 tháng với giá trị p < 0,01. 3.2.3 Chỉ số protein niệu PROTEIN NIỆU (MG/KG/24H) Nhạy cảm Kháng thuốc sớm Kháng thuốc muộn 25 20 15 10 5 0 V ÀO V IỆ N R A V IỆ N SAU 1 THÁNG SAU 6 THÁNG Biểu đồ 3.4. Giá trị trung bình của protein niệu của các nhóm bệnh tại các thời điểm. Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * p<0,05; p<0,00; + là giữa nhóm NC và KTM: + p<0,05; ++ p<0,001; # là giữa nhóm KTS và KTM: # p<0,05; ## p<0,001. Trái ngược với protein máu, chỉ số protein niệu có xu hướng giảm dần theo thời gian điều trị. Tại các thởi điểm vào viện, sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 27
  37. tháng, chỉ số protein niệu của nhóm NC luôn thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm KTS với giá trị p < 0,01. 3.2.4 Chỉ số protein/creatinin niệu PROTEIN/CREATININ NIỆU (MG/MMOL) Nhạy cảm Kháng thuốc sớm Kháng thuốc muộn 3500 3000 2500 # * # 2000 + 1500 1000 500 0 V ÀO V IỆ N R A V IỆ N SAU 1 THÁNG SAU 6 THÁNG Biểu đồ 3.5. Giá trị trung bình của protein/creatinin niệu của các nhóm bệnh nhân tại các thời điểm. Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * p<0,05; p<0,00; + là giữa nhóm NC và KTM: + p<0,05; ++ p<0,001; # là giữa nhóm KTS và KTM: # p<0,05; ## p<0,001. Tương tự như protein niệu, chỉ số protein/creatinin niệu có xu hướng giảm dần theo thời gian điều trị. Tại tất cả các thời điểm, chỉ số protein/creatinin niệu của nhóm NC luôn thấp hơn nhóm KTS với giá trị p < 0,05. Bên cạnh đó, tại thời điểm sau ra viện 1 tháng, chỉ số protein/creatinin niệu của nhóm NC cũng thấp hơn nhóm KTM với giá trị p < 0,05. Chỉ số protein/creatinin niệu của nhóm KTM thấp hơn nhóm KTS tại thời điểm ra viện (p<0,05). 28
  38. Bàn luận về kết quả cận lâm sàng Như vậy, sau điều trị, cả protein máu và albumin máu đều tăng rõ rệt ở cả ba nhóm bệnh nhân. Trước điều trị, chỉ số protein máu và albumin máu không có sự khác biệt giữa ba nhóm bệnh nhân. Tuy nhiên, sau điều trị, protein và albumin máu của nhóm kháng thuốc thuốc thấp hơn hẳn so với nhóm nhạy cảm thuốc có ý nghĩa thống kê. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm [9], Dương Thị Thúy Nga [5], Roy và các cộng sự [46] trong các nghiên cứu trước đó. Trái ngược với các chỉ số sinh hóa máu, các chỉ số sinh hóa nước tiểu lại có xu hướng giảm dần sau điều trị. Trước điều trị, cả chỉ số protein và protein/creatinin niệu của ba nhóm bệnh nhân đều rất cao. Sau điều trị, cả hai chỉ số này đều giảm rõ rệt. Tuy nhiên, ở cả thời điều trước và sau điều trị, protein niệu và protein/creatinin niệu ở các nhóm kháng thuốc đều cao hơn nhóm nhạy cảm thuốc có ý nghĩa thống kê. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng [7], Dương Thị Thúy Nga [5], Đoàn Thị Thắm [9] và Joshi [31]. 3.3 Kết quả tần số phân bố alen và tỷ lệ kiểu gen 3.3.1 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen Gen NPHS2 mã hóa cho podocin, một protein có vai trò quan trọng trong chức năng lọc của cầu thận, ảnh hưởng đến các dấu hiệu lâm sàng và kết quả cận lâm sàng của bệnh nhân. Vì vậy, ngoài việc theo dõi các chỉ số hóa sinh, các bệnh nhân còn được xác định kiểu gen của SNP rs3738423 (C>T) ở exon 2 của gen NPHS2 để tìm hiểu mối liên quan giữa SNP này và các chỉ số hóa sinh. Sau khi thực hiện quá trình giải trình tự SNP rs3738423 của exon 2 gen NPHS2, chúng tôi thực hiện đọc kết quả bằng phần mềm Bioedit cho các hình ảnh như sau: 29
  39. A B C Hình 3.1. Kết quả giải trình tự đa hình thái đơn rs3738423 ( C>T) A. Kiểu gen TT ( bệnh nhân 34). B. Kiểu gen CT ( bệnh nhân 46). C. Kiểu gen CC ( bệnh nhân 111) (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ) Sản phẩm giải trình tự rõ nét. Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng và không có tín hiệu nhiễu. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs 3738423 (C>T) của exon 2 ở ba nhóm bệnh nhân được trình bày ở bảng 3.4. 30
  40. Bảng 3.4. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs3738423 (C>T) của exon 2 ở ba nhóm bệnh nhân. Phân nhóm NC KTS KTM rs3738423 (C>T) n (%) n (%) n (%) CC 47 (81,03%) 43 (76,79%) 28 (80%) Kiểu gen CT 10 (17,24%) 13 (23,21%) 6 (17,14%) TT 1 (1,73%) 0 (0%) 1 (2,86%) Xác suất χ2 = 2,131; p = 0,712 C 0,9 0,88 0,89 Tần số T 0,1 0,12 0,11 alen Xác suất χ2 = 0,2; p = 0,903 Trong 149 bệnh nhân thể hiện ở bảng 3.4, ở vị trí rs3738423 (C>T) của exon 2 chủ yếu tồn tại kiểu gen CC và TC. Kiểu gen TT chiếm tỉ lệ rất nhỏ, chỉ gặp ở hai bệnh nhân ở nhóm NC và KTM. Tỉ lệ kiểu gen ở cả ba nhóm này không có sự khác biệt với χ2 = 2,131và giá trị p=0,712. Tần số alen của rs3738423 (C>T) phân bố tuân theo định luật Hardy- Weinberg với tỷ lệ alen C ở nhóm NC:KTS:KTM tương ứng là 0,90: 0,88: 0,89. Không có sự khác biệt giữa tần số alen được quan sát thấy ở ba nhóm này với χ2 = 0,2 và giá trị p= 0,903. 31
  41. 3.3.2 Liên quan đến giới tính Bảng 3.5. Phân bố giới theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2 Giới Có alen đột Tổng Không có alen đột biến biến (alen T) (n) n (%) n (%) Trẻ trai 85 (72%) 23 (74,2%) 108 Trẻ gái 33 (28%) 8 (25,8%) 41 Tổng 118 (100%) 31 (100%) 149 Xác suất χ2 = 0,57; p = 0,811 Số lượng trẻ trai trong nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến và nhóm bệnh nhân mang alen đột biến luôn cao hơn số lượng trẻ gái. Tỷ lệ phần trăm trẻ trai trong hai nhóm này lần lượt là 72% và 74,2%. Tuy vậy, không có sự khác nhau về sự phân bố giới tính giữa nhóm bệnh nhân mang alen đột biến và nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến với χ2 = 0,57 và giá trị p = 0,811 3.3.3 Liên quan đến tuổi khởi phát Bảng 3.6. Tuổi khởi phát trung bình theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Số lượng Tuổi khởi phát rs3738423 (C>T) của exon 2 (n) ( ± SE) Không mang alen đột biến 118 4,1 ± 0,3 Mang alen đột biến 31 4,3 ± 0,5 p 0,779 32
  42. Tuổi khởi phát trung bình ở nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến là 4,1 ± 0,3, ở nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến là 4,3 ± 0,5. Không có sự khác biệt về tuổi khởi phát giữa hai nhóm bệnh nhân với giá trị p> 0,05. 3.3.4 Liên quan đến protein máu Bảng 3.7. Protein máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2 Không có alen Có alen đột biến p Protein máu (g/l) đột biến (alen T) ( ± SE) Vào viện 42,8 ± 0,8 43,8 ± 3,3 0,682 Ra viện 46,9 ± 0,5 44,5 ± 1,0 0,028 Sau ra viện 1 tháng 53,3 ± 0,6 51,5 ± 1,3 0,188 Sau ra viện 6 tháng 58,9 ± 0,9 55,8 ± 1,7 0,117 Tại thời điểm ra viện, protein máu của nhóm bệnh nhân mang alen đột biến thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến với giá trị p=0,028. Tại các thời điểm khác thì không có sự khác biệt về chỉ số protein máu giữa hai nhóm. 33
  43. 3.3.5 Liên quan đến albumin máu Bảng 3.8. Albumin máu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2 Không có alen Có alen đột Albumin máu (g/l) đột biến biến (alen T) p ( ± SE) Vào viện 16,5 ± 1,0 17,8 ± 2,2 0,571 Ra viện 19,7 ± 0,4 18,0 ± 0,7 0,031 Sau ra viện 1 tháng 25,3 ± 0,5 22,6 ± 1,2 0,017 Sau ra viện 6 tháng 30,7 ± 0,8 27,9 ± 1,3 0,096 Tại thời điểm ra viện và sau ra viện 1 tháng, albumin máu của nhóm bệnh nhân mang alen đột biến thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến với giá trị p lần lượt là 0,031 và 0,017. Tại các thời điểm vào viện và sau ra viện 6 tháng thì không có sự khác biệt về chỉ số albumin máu giữa hai nhóm. 34
  44. 3.3.6 Liên quan đến protein niệu Bảng 3.9. Protein niệu theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2 Không có alen Có alen đột Protein niệu đột biến biến (alen T) p (mg/kg/24h) ( ± SE) Vào viện 19,4 ± 1,4 18,7 ± 3,3 0,809 Ra viện 9,7 ± 1,1 8,6 ± 2,0 0,630 Sau ra viện 1 tháng 5,0 ± 1,5 4,9 ± 1,3 0,966 Sau ra viện 6 tháng 5,1 ± 1,6 4,0 ± 1,8 0,734 Protein niệu của nhóm bệnh nhân không mang alen đột biến và nhóm bệnh nhân mang alen đột biến đều có xu hướng giảm dần theo thời gian điều trị. Tuy nhiên, không có sự khác biệt về protein niệu giữa hai nhóm bệnh nhân tại các thời điểm xét nghiệm. 35
  45. 3.3.7 Liên quan đến protein/creatinin niệu Bảng 3.10. Protein/creatinin theo alen đột biến rs3738423 của exon 2 Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2 Không có alen Có alen đột Protein/creatinin đột biến biến (alen T) p niệu (mg/mmol) ( ± SE) Vào viện 2282,0 ± 135,1 2506,8 ± 419,3 0,509 Ra viện 1050,9 ± 64,9 1533,2 ± 390,2 0,232 Sau ra viện 1 tháng 506,6 ± 70,3 990,6 ± 391,7 0,233 Sau ra viện 6 tháng 653,4 ± 126,9 382,1 ± 116,1 0,118 Chỉ số protein/creatinin niệu của nhóm bệnh nhân mang alen đột biến và nhóm bệnh nhân không man alen đột biến có xu hướng giảm dần theo thời gian điều trị, từ lúc vào viện đến sau khi ra viện 6 tháng. Không có sự khác biệt về protein/creatinin niệu giữa hai nhóm bệnh nhân này tại các thời điểm xét nghiệm. Bàn luận về kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được 20/91 trường hợp mang alen đột biến rs3738423 của exon 2 gen NPHS2 ở trẻ mắc HCTHTP kháng thuốc. Tỷ lệ này khá cao so với các nghiên cứu ở quần thể khác trên thế giới. Trong nghiên cứu củ Juli năm 2012 trên 97 bệnh nhi HCTHTP kháng thuốc tại 36
  46. Singapore, ông đã phát hiện được 8 trường hợp mang đột biến rs3738423 ( 7 dị hợp và 1 đồng hợp) [32]. Megremis cũng phân tích 14 trường hợp HCTHTP kháng corticosteroid và phát được được 1 trường hợp mang đột biến rs3738423 dạng dị hợp tử [39]. Một nghiên cứu khác của Yu trên 23 bệnh nhân HCTHTP kháng corticosteroid, ông phát hiện được một trường hợp mang đột biến rs3738423 mang kiểu gen dị hợp tử, một trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử. Bên cạnh đó, Yu cũng nhận thấy không có sự khác biệt đáng kể về kiểu gen rs3738423 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, điều này tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi [58]. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng nhận thấy rằng, alen đột biến rs3738423 có ảnh hưởng đến chỉ số protein máu ra viện và albumin máu ra viện, sau ra viện 1 tháng. Cụ thể, nhóm bệnh nhân mang alen đột biến có các chỉ số này thấp hơn nhóm không mang alen đột biến. Nhưng alen đột biến rs3738423 lại không ảnh hưởng đến chỉ số protein niệu và protein/creatinin niệu. Điều này khá tương đồng với nghiên cứu của Li Zhu trên 214 bệnh nhân mắc HCTH, ông cũng chỉ ra rằng đa hình thái đơn rs3738423 không ảnh hưởng đến chỉ số protein niệu giữa các nhóm bệnh nhân [59]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng, alen đột biến rs3738423 không phụ thuộc vào giới tính cũng như không ảnh hưởng đến tuổi khởi phát bệnh của các bệnh nhân. 3.4 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa Sự thay đổi của các chỉ số sinh hóa máu, nước tiểu ở bệnh nhân thận hư không chỉ ảnh hưởng bởi sự đáp ứng thuốc corticoid mà còn chịu tác động tương tác giữa yếu tố này và kiểu gen thể hiện ở các bảng dưới đây. 37
  47. 3.4.1 Chỉ số protein máu Bảng 3.11. Chỉ số protein máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2. Protein máu rs3738423 (C>T) của exon 2 Phân Xác suất (g/l) Không có alen đột nhóm Có alen đột biến p ( ± SE) biến NC 43,4 ± 0,7 43,5 ± 1,2 Vào viện KTS 43,2 ± 2,1 46,9 ± 8,5 0,700 KTM 41,3 ± 0,8 40,3 ± 1,7 NC 48,8 ± 0,8 48,3 ± 1,4 Ra viện KTS 45,4 ± 0,9 41,5 ± 1,4 0,408 KTM 46,1 ± 1,0 43,8 ± 1,8 NC 57,4 ± 0,7 57,0 ± 1,1 Sau ra viện 1 KTS 49,7 ± 0,9 45,3 ± 1,7 0,131 tháng KTM 52,0 ± 1,4 53,4 ± 2,5 NC 63,8 ± 0,7 63,9 ± 1,3 Sau ra viện 6 KTS 52,9 ± 1,4 47,1 ± 1,84 0,213 tháng KTM 58,6 ± 2,0 57,8 ±2,4 Sự ảnh hưởng tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không làm thay đổi chỉ số protein máu tại các thời điểm xét nghiệm với các chỉ số p > 0,05. 38
  48. 3.4.2 Chỉ số albumin máu Bảng 3.12. Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2. Albumin máu rs3738423 (C>T) của exon 2 Phân Xác suất (g/l) Không có alen đột nhóm Có alen đột biến p ( ± SE) biến NC 15,6 ± 1,1 14,3 ± 0,5 Vào viện KTS 17,5 ± 2,5 22,7 ± 5,5 0,454 KTM 16,6 ± 2,0 15,7 ± 1,0 NC 20,3 ± 0,5 19,4 ± 0,93 Ra viện KTS 18,9 ± 0,7 16,4 ± 0,9 0,501 KTM 19,8 ± 0,8 19,6 ± 1,8 NC 27,8 ± 0,4 26,4 ± 1,1 Sau ra viện 1 KTS 22,4 ± 0,8 18,6 ± 1,5 0,432 tháng KTM 25,6 ± 1,1 24,8 ± 3,4 NC 34,5 ± 0,8 32,7 ± 0,9 Sau ra viện 6 KTS 25,7 ± 1,2 22,0 ± 1,8 0,765 tháng KTM 31,3 ± 2,0 30,2 ± 3,0 Sự ảnh hưởng tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không làm thay đổi albumin máu tại các thời điểm xét nghiệm với các chỉ số p > 0,05. 39
  49. 3.4.3 Chỉ số protein niệu Bảng 3.13. Chỉ số protein niệu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2. Protein niệu rs3738423 (C>T) của exon 2 Phân Xác suất (mg/kg/24h) Không có alen đột nhóm Có alen đột biến p ( ± SE) biến NC 15,4 ± 1,2 8,2 ± 1,3 Vào viện KTS 21,6 ± 2,7 28,0 ± 4,7 0,141 KTM 22,0 ± 3,2 19,1 ± 10,7 NC 9,2 ± 2,3 3,2 ± 1,1 Ra viện KTS 9,2 ± 0,9 12,1 ± 2,2 0,145 KTM 11,7 ± 2,1 4,5 ± 2,2 NC 1,0 ± 0,3 0,8 ± 0,6 Sau ra viện 1 KTS 5,7 ± 1,1 7,8 ± 2,1 0,461 tháng KTM 10,5 ± 6,1 2,9 ± 1,6 NC 0,6 ± 0,5 0,1 ± 0,1 Sau ra viện 6 KTS 6,8 ± 1,5 7,9 ± 2,1 0,614 tháng KTM 10,1 ± 5,9 3,5 ± 2,5 Sự ảnh hưởng tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không làm thay đổi protein niệu tại các thời điểm xét nghiệm với các chỉ số p > 0,05. 40
  50. 3.4.4 Chỉ số protein/creatinin niệu Bảng 3.14. Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2 Protein/creatinin rs3738423 (C>T) của exon 2 Phân Xác suất niệu (mg/mmol) Không có alen đột nhóm Có alen đột biến p ( ± SE) biến NC 1827,7 ± 132,6 1491,2 ± 126,0 0,002 Vào viện KTS 2737,8 ± 279,2 4336,8 ± 816,9 KTM 2295,5 ± 289,0 1212,1 ± 288,3 NC 798,0 ± 78,5 634,4 ± 128,4 0,000 Ra viện KTS 1300,2 ± 127,6 2872,4 ± 874,8 KTM 1119,9 ± 127,6 561,9 ± 181,4 NC 1281 ± 30,2 67,5 ± 42,4 0,053 Sau ra viện 1 KTS 862,5 ± 132,1 1965,3 ± 927,3 tháng KTM 556,2 ± 178,2 550,0 ± 327,7 NC 116,4 ± 98,5 16,5 ± 12,0 0,779 Sau ra viện 6 KTS 1250,3 ± 249,7 833,1 ± 235,0 tháng KTM 680,5 ± 289,2 183,4 ± 74,8 Sự ảnh hưởng tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid đã làm thay đổi tỷ lệ protein/creatinin niệu tại thời vào viện và ra viện với các giá trị p tương ứng là 0,002 và 0,000. Các bệnh nhân mang alen đột biến ở nhóm KTS có chỉ số protein/creatinin niệu cao gần gấp đôi các bệnh nhân không mang alen đột biến trong cùng nhóm. Trong khi đó, các bệnh nhân mang alen đột biến ở nhóm NC và KTM lại có chỉ số protein/creatinin niệu thấp hơn các bệnh nhân không mang alen đột biến trong cùng nhóm. 41
  51. Bàn luận về đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa Như vậy, sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không có ảnh hưởng lên các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu nhưng lại có ảnh hưởng lên chỉ số protein/creatinin niệu thời điểm vào viện và ra viện . Chúng tôi nhận thấy rằng đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng bảo vệ bệnh nhân ở nhóm NC và KTM khi mà làm giảm protein/creatinin niệu ở các bệnh nhân thuộc hai nhóm này. Tuy vậy, đa hình thái đơn rs3738423 lại làm tăng protein/creatinin niệu ở nhóm bệnh nhân KTS. Chính điều này làm chúng tôi nghĩ đến giả thuyết rằng đột biến ở vị trí rs3738423 có tác dụng bảo vệ những bệnh nhân có đáp ứng thuốc ban đầu, nhưng lại làm tình trạng của các bệnh nhân không đáp ứng trở nên xấu đi. Tác dụng của đa hình đơn rs3738423 cũng gặp trong nghiên cứu của Junli khi ông thấy đa hình này bảo vệ các bệnh gốc Trung Quốc, nhưng tác dụng này lại không gặp ở nhóm bệnh nhân từ phía Bắc và phía Đông Trung Quốc. Sự khác biệt này có thể do sự khác biệt về tần số alen hoặc biến thể di truyền giữa miền Bắc và miền Nam Trung Quốc [32]. 42
  52. KẾT LUẬN Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trên 149 bệnh nhân HCTHTP trong đó có 58 trường hợp nhạy cảm corticoid, 56 trường hợp kháng thuốc sớm, 35 trường hợp kháng thuốc muộn được điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương từ 09/2015 đến 03/2017, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1. Đa hình đơn chủ yếu ở ba nhóm nhạy cảm, kháng thuốc sớm, kháng thuốc muộn là CC với tỷ lệ lần lượt là 81,03%, 76,79% và 80%. Đa hình TT chỉ gặp 2 trường hợp, nằm ở nhóm nhạy cảm và kháng thuốc muộn. Chính vì vậy alen C chiếm tỷ lệ cao ở các nhóm với tỷ lệ alen C/T là 0,9/0,1 ở nhóm nhạy cảm, ở nhóm kháng thuốc sớm là 0,88/0,12 và nhóm kháng thuốc muộn là 0,89/0,11. 2. Đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng làm giảm chỉ số protein/creatinin niệu ở nhóm bệnh nhạy cảm và kháng thuốc muộn, nhưng lại làm tăng chỉ số này ở nhóm bệnh nhân kháng thuốc sớm. 43
  53. KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ đề tài với cỡ mẫu còn hạn chế vì thế chưa thấy rõ ảnh hưởng của mối tương quan đa hình di truyền kiểu gen rs3738423 của gen NPHS2 lên các chỉ số sinh hóa ở các bệnh nhân. Có thể tiến hành với cỡ mẫu lớn hơn để khẳng định mối liên quan này ở quần thể bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát. Ngoài ra có thể tiến hành phân tích sự tương tác giữa các SNP khác của gen NPHS2 với tình trạng kháng corticosteroid. Phân tích sự tương tác giữa HCTH kháng corticosteroid với các gen khác như NPHS1, WT1, CD2AP, ACTN4 để xây dựng một panel xét nghiệm di truyền hỗ trợ công tác điều trị HCTHTP bằng corticosteroid. 44
  54. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Phạm Văn Đếm, Nguyễn Thị Quỳnh Hương và Nguyễn Thu Hương (2015), "Một số yếu tố dịch tễ lâm sàng Hội chứng thận hư tại Khoa Thận và Lọc máu, Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2015", Tạp chí Y học Thực hành, 624(45-53. 2. Phạm Thu Hiền, Trịnh Thị Phương Dung, Trần Thị Chi Mai (2012), "Tiện ích của chỉ số protein/cretinin nước tiểu trong đánh giá protein niệu ở hội chứng thận hư trẻ em", Tạp chí nghiên cứu y học, 80(3), 35-39. 3. Phạm Trung Kiên (2016), Giáo trình Nhi khoa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 4. Trần Đình Long (2012), Bệnh học thận tiết niệu sinh dục và lọc máu trẻ em, Nhà xuất bản Y học. 5. Dương Thị Thúy Nga (2011), Nhận xét kết quả điều trị hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid tại khoa Thận - Tiết niệu bệnh viện Nhi Trung Ương, Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội. 6. Trần Hữu Minh Quân, Loan Huỳnh Thoại và Quang Nguyễn Ðức (2014), "Đặc điểm hội chứng thận hư kháng steroid tại bệnh viện Nhi Đồng I", Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(4), 80-86. 7. Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét về đặc điểm lâm sàng và sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc ở trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Đại học Y Hà Nội. 8. Nguyễn Ngọc Sáng (1999), Đánh giá hiệu quả điều trị bằng Methylprednisolon và những thay đổi miễn dịch trước và sau điều trị hội chứng thận hư tiên phát ở trẻ em, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội. 9. Đoàn Thị Thắm (2012), Nhận xét kết quả điều trị hội chứng thận hư tiên phát, Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội. Tiếng Anh 10. Abitbol Carolyn, Zilleruelo Gaston, Frendlich Michael, et al (1990), "Quantitation of proteinuria with urinary protein/creatinine ratios and random testing with dipsticks in nephrotic children", The Journal of pediatrics, 116(2), 243-247. 11. Adamson O, Trachtman H and Tejani A (1986), "Urinary protein electrophoresis patterns in childhood idiopathic nephrotic syndrome", The International journal of pediatric nephrology, 7(4), 181-186.
  55. 12. Akchurin Oleh and Reidy Kimberly J (2015), "Genetic causes of proteinuria and nephrotic syndrome: impact on podocyte pathobiology", Pediatric Nephrology, 30(2), 221-233. 13. Audard Vincent, Larousserie F, Grimbert P, et al (2006), "Minimal change nephrotic syndrome and classical Hodgkin's lymphoma: report of 21 cases and review of the literature", Kidney international, 69(12), 2251-2260. 14. Bakker Winston W, Van Dael Catharina Ml, Pierik Leonie Jwm, et al (2005), "Altered activity of plasma hemopexin in patients with minimal change disease in relapse", Pediatric Nephrology, 20(10), 1410-1415. 15. Banaszak Beata and Banaszak Paweł (2012), "The increasing incidence of initial steroid resistance in childhood nephrotic syndrome", Pediatric Nephrology, 27(6), 927-932. 16. Banh Tonny Hm, Hussain-Shamsy Neesha, Patel Viral, et al (2016), "Ethnic differences in incidence and outcomes of childhood nephrotic syndrome", Clinical Journal of the American Society of Nephrology, 11(10), 1760-1768. 17. Bhimma Rajendra, Adhikari Miriam and Asharam Kareshma (2006), "Steroid-resistant nephrotic syndrome: the influence of race on cyclophosphamide sensitivity", Pediatric Nephrology, 21(12), 1847-1853. 18. Biswas Arnab, Kumar R, Chaterjee A, et al (2009), "Quantitation of proteinuria in nephrotic syndrome by spot urine protein creatinine ratio estimation in children", Mymensingh medical journal: MMJ, 18(1), 67-71. 19. Bouchireb Karim, Boyer Olivia, Gribouval Olivier, et al (2014), "NPHS 2 Mutations in Steroid‐Resistant Nephrotic Syndrome: A Mutation Update and the Associated Phenotypic Spectrum", Human mutation, 35(2), 178-186. 20. Boute Nicolas, Gribouval Olivier, Roselli Séverine, et al (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome", Nature genetics, 24(4), 349. 21. Brenner Barry M, Hostetter Thomas H and Humes H David (1978), "Molecular basis of proteinuria of glomerular origin", New England Journal of Medicine, 298(15), 826-833. 22. Caridi Gianluca, Bertelli Roberta, Carrea Alba, et al (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroid- resistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", Journal of the American Society of Nephrology, 12(12), 2742-2746. 23. Chang Jei-Wen, Tsai Hsin-Lin, Wang Hsin-Hui, et al (2009), "Clinicopathological features and prognosis of Chinese children with idiopathic nephrotic syndrome between different age groups", European journal of pediatrics, 168(10), 1189-1194.
  56. 24. Day Clara J, Cockwell Paul, Lipkin Graham W, et al (2002), "Mycophenolate mofetil in the treatment of resistant idiopathic nephrotic syndrome", Nephrology Dialysis Transplantation, 17(11), 2011-2013. 25. Ding Wen Y and Saleem Moin A (2012), "Current concepts of the podocyte in nephrotic syndrome", Kidney research and clinical practice, 31(2), 87-93. 26. Gbadegesin Rasheed and Smoyer William E (2008), Nephrotic syndrome, Elsevier Inc. 27. Glomerulonephritis Kdigo Clinical Practice Guideline For (2012), "Steroid- sensitive nephrotic syndrome in children", Kidney International Supplements 2, chapter 3, 163-171. 28. Glomerulonephritis Kdigo Clinical Practice Guideline For (2012), "Steroid- sensitive nephrotic syndrome in children", Kidney International Supplements 2, chapter 4, 162-176. 29. Ha Tae-Sun (2013), "Roles of adaptor proteins in podocyte biology", World journal of nephrology, 2(1), 1. 30. Hahn Deirdre, Hodson Elisabeth M, Willis Narelle S, et al (2015), "Corticosteroid therapy for nephrotic syndrome in children", Cochrane Database of Systematic Reviews, 3). 31. Joshi Bhoomi B, Mistry Kinnari N, Gang Sishir, et al (2017), "Characterization of NPHS2 gene polymorphisms associated to steroid resistance nephrotic syndrome in Indian children", Gene, 628(134-140. 32. Junli Huang (2012), Genetics of nephrotic syndrome in singapore pediatrics patients, Doctoral dissertation, National University Singapore. 33. Kang Hee Gyung and Cheong Hae Il (2015), "Nephrotic syndrome: what's new, what's hot?", Korean journal of pediatrics, 58(8), 275-282. 34. Karle Stephanie M, Uetz Barbara, Ronner Vera, et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", Journal of the American Society of Nephrology, 13(2), 388- 393. 35. Koskimies O, Vilska J, Rapola J, et al (1982), "Long-term outcome of primary nephrotic syndrome", Archives of disease in childhood, 57(7), 544-548. 36. Lennon Rachel, Singh Anurag, Welsh Gavin I, et al (2008), "Hemopexin induces nephrin-dependent reorganization of the actin cytoskeleton in podocytes", Journal of the American Society of Nephrology, 19(11), 2140-2149. 37. Lombel Rebecca M, Gipson Debbie S and Hodson Elisabeth M (2013), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelines from KDIGO", Pediatric Nephrology, 28(3), 409–414. 38. Mccarthy Hugh J, Bierzynska Agnieszka, Wherlock Matt, et al (2013), "Simultaneous sequencing of 24 genes associated with steroid-resistant nephrotic
  57. syndrome", Clinical Journal of the American Society of Nephrology, 8(4), 637- 648. 39. Megremis Spyridon, Mitsioni Andromachi, Mitsioni Artemis G, et al (2009), "Nucleotide variations in the NPHS2 gene in Greek children with steroid- resistant nephrotic syndrome", Genetic testing and molecular biomarkers, 13(2), 249-256. 40. Mekahli Djalila, Liutkus Aurelia, Ranchin Bruno, et al (2009), "Long-term outcome of idiopathic steroid-resistant nephrotic syndrome: a multicenter study", Pediatric Nephrology, 24(8), 1525-1532. 41. Mubarak Muhammed, Lanewala Ali, Kazi Javed Iqbal, et al (2009), "Histopathological spectrum of childhood nephrotic syndrome in Pakistan", Clinical and experimental nephrology, 13(6), 589-593. 42. Niaudet Patrick (2004), "Podocin and nephrotic syndrome: implications for the clinician", 15(3), 832-834. 43. Pavenstadt Hermann, Kriz Wilhelm and Kretzler Matthias (2003), "Cell biology of the glomerular podocyte", Physiological reviews, 83(1), 253-307. 44. Rachmadi Dedi, Melani Ani and Monnens Leo (2015), "NPHS2 gene mutation and polymorphisms in indonesian children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5(01), 27. 45. Reiser Jochen, Von Gersdorff Gero, Loos Martin, et al (2004), "Induction of B7-1 in podocytes is associated with nephrotic syndrome", The Journal of clinical investigation, 113(10), 1390-1397. 46. Roy Ranjit Ranjan, Islam Md Rafiqul, Jesmin Tahmina, et al (2013), "Prognostic Value of Biochemical and Hematological Parameters in Children with Nephrotic Syndrome", Journal of Shaheed Suhrawardy Medical College, 5(2), 95- 98. 47. Sadowski Carolin E, Lovric Svjetlana, Ashraf Shazia, et al (2015), "A single-gene cause in 29.5% of cases of steroid-resistant nephrotic syndrome", Journal of the American Society of Nephrology, 26(6), 1279-1289. 48. Savin Virginia J, Sharma Ram, Sharma Mukut, et al (1996), "Circulating factor associated with increased glomerular permeability to albumin in recurrent focal segmental glomerulosclerosis", New England Journal of Medicine, 334(14), 878-883. 49. Schwarz Karin, Simons Matias, Reiser Jochen, et al (2001), "Podocin, a raft-associated component of the glomerular slit diaphragm, interacts with CD2AP and nephrin", The Journal of clinical investigation, 108(11), 1621-1629. 50. Tory Kálmán, Menyhárd Dóra K, Woerner Stéphanie, et al (2014), "Mutation-dependent recessive inheritance of NPHS2-associated steroid-resistant nephrotic syndrome", Nature genetics, 46(3), 299.
  58. 51. Tryggvason Karl, Patrakka Jaakko and Wartiovaara Jorma (2006), "Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria", New England Journal of Medicine, 354(13), 1387-1401. 52. Wada Takehiko and Nangaku Masaomi (2015), "A circulating permeability factor in focal segmental glomerulosclerosis: the hunt continues", Clinical kidney journal, 8(6), 708-715. 53. Weber Stefanie, Gribouval Olivier, Esquivel Ernie L, et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneityof steroid-resistant nephrotic syndrome and lowpost-transplant recurrence", Kidney international, 66(2), 571- 579. 54. Weening Jan J (2004), "Role of the immune system in the pathogenesis of idiopathic nephrotic syndrome", Clinical Science, 107(2), 125-136. 55. Wharram Bryan L, Goyal Meera, Wiggins Jocelyn E, et al (2005), "Podocyte depletion causes glomerulosclerosis: Diphtheria toxin–induced podocyte depletion in rats expressing human diphtheria toxin receptor transgene", Journal of the American Society of Nephrology, 16(10), 2941-2952. 56. Wong William (2007), "Idiopathic nephrotic syndrome in New Zealand children, demographic, clinical features, initial management and outcome after twelve‐month follow‐up: Results of a three‐year national surveillance study", Journal of paediatrics and child health, 43(5), 337-341. 57. Wu Mei‐Chen, Wu Jer‐Yuarn, Lee Cheng‐Chun, et al (2001), "A novel polymorphism (c288C> T) of the NPHS2 gene identified in a Taiwan Chinese family", Human mutation, 17(1), 81-82. 58. Yu Zihua, Ding Jie, Huang Jianping, et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrology Dialysis Transplantation, 20(5), 902-908. 59. Zhu Li, Yu Lei, Wang Chen‐Dan, et al (2009), "Genetic effect of the NPHS2 gene variants on proteinuria in minimal change disease and immunoglobulin A nephropathy", Nephrology, 14(8), 728-734.
  59. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Quy trình tách chiết ADN tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit 1. Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất ở nhiệt độ phòng. 2. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống ly tâm vô trùng. 3. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex trong 10 giây. 4. Ủ 65oC trong 10 phút. Chú ý: Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây. 5. Thêm 260 µl Ethanol 100%, vortex trong 20 giây. 6. Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống. 7. Chèn HiBind ADN Mini Column vào Collection Tube 2ml. 8. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl). 9. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 10. Bỏ dịch lọc và Collection Tube. 11. Lắp HiBind ADN Mini Column vào Collletion Tube 2ml mới. 12. Thêm 500 µl HBC Buffer. 13. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 14. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube 15. Thêm 700 µl ADN Wash Buffer. 16. Ly tâm trong 1 phút ở 10.000g 17. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube. 18. Lặp lại các bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ 2 với ADN Wash Buffer. 19. Ly tâm HiBind ADN Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô cột. 20. Chuyển HiBind ADN Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới. 21. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 65oC). Ủ 65oC trong 5 phút. 22. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 23. Thêm 50 µl Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
  60. 24. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 25. Thu vào bảo quản ADN ở -20oC.
  61. Phụ lục 2. Quy trình kiểm tra chất lượng ADN thông qua điện di Bước 1: Chuẩn bị gel agarose Pha Agarose trong bột đệm TAE 1X để đạt được nồng độ dung dịch gel agarose 1,5%. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo các giếng nhỏ. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra đặt bản gel vào bể điện di ở tư thế nằm ngang. Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1- 2 mm. Bước 2: Tra mẫu ADN Mẫu ADN được trộn với ADN dye 6X (chất này chứa hai chất nhuộm màu khác nhau: bromophenol xanh và xylene cyanol FF để theo dõi trực quan sự di chuyển trên bản gel trong điện trường, 5µl ADN mẫu và 5µl ADN thang chuẩn Lambda/Hind III Marker được tra vào các giếng. Bước 3: Chạy điện di Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 70V trong 60 phút. ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào dừng điện di. Bản gel được lấy nhẹ khỏi khuôn soi và ghi hình dưới ánh sáng tử ngoại.
  62. Phụ lục 3. Danh sách bệnh nhân nghiên cứu Mã số Tuổi theo STT Họ và tên Mã Bệnh án Giới nghiên cứu tháng 1 Nguyễn Tường Duy A 1 6036891 156 Nam 2 Hoàng Bá T 2 1442007 72 Nam 3 Hoàng Trường G 3 14057109 30 Nam 4 Nguyễn Thị Thu T 4 13895851 156 Nữ 5 Trần Kỳ A 5 14324321 84 Nữ 6 Đào Đức N 6 1412076 13 Nam 7 Trần Duy Q 7 12010952 84 Nam 8 Trần Minh K 8 13272173 22 Nam 9 Ngô Mai T 9 1365113 48 Nữ 10 Tống Văn Bảo N 10 13014385 84 Nam 11 Lưu Hương G 11 1272332 36 Nữ 12 Kiều Thị Hải M 12 10311182 108 Nữ 13 Trần Ngọc H 13 1441181 19 Nữ 14 Nguyễn Quốc C 14 12373036 60 Nam 15 Nguyễn Vũ Ngọc K 15 15655257 120 Nam 16 Lê Bá Đ 16 15048355 48 Nam 17 Thái Hữu L 17 12140932 120 Nam 18 Vũ Gia L 18 1155156 60 Nữ 19 Đỗ Thị H 19 10188213 180 Nữ 20 Linh Minh H 20 1159764 48 Nam 21 Phạm Phát L 21 1522067 2 Nam 22 Vũ Đức S 22 1540593 24 Nam 23 Bàn Phúc T 23 15013604 60 Nam 24 Tô Đức T 24 1548717 36 Nam 25 Phạm Thị T 25 13226994 108 Nữ 26 Nguyễn Quang K 26 14263657 22 Nam 27 Trần Thị T 27 110445724 96 Nữ 28 Lê Tuyền C 28 9178578 96 Nữ 29 Vũ Thị T 29 14549602 156 Nữ 30 Bùi Quý T 30 14099239 60 Nam 31 Vũ Văn T 31 1254905 84 Nam 32 Vi Thị L 32 1456893 120 Nữ 33 Trần Như Q 33 12134331 48 Nam 34 Ngô Minh H 34 14913054 36 Nam 35 Trần Thị T 35 15047747 156 Nữ
  63. 36 Nguyễn Đình Q 36 15021680 40 Nam 37 Trần Bích L 37 14201553 24 Nữ 38 Phạm Vũ Hoàng A 38 8028096 72 Nam 39 Vương Ngọc Anh Đ 39 13247781 72 Nam 40 Nguyễn Thị Thanh N 40 8178553 96 Nữ 41 Nguyễn Ngọc M 41 15075971 36 Nữ 42 Vũ Tiến Đ 42 15091226 48 Nam 43 Nguyễn Phương D 43 12420282 60 Nữ 44 Lê Chung H 44 12012758 60 Nam 45 Nguyễn Thị Bích D 45 11273228 72 Nữ 46 Nguyễn Thị Phương A 46 6149804 96 Nữ 47 Đồng Sĩ N 47 1131667 84 Nam 48 Phạm Hoàng A 48 15092824 84 Nam 49 Bùi Thị Mai Ph 49 14098246 24 Nữ 50 Nguyễn An K 50 15091226 84 Nam 51 Hoàng Phúc H 51 12282569 84 Nam 52 Nguyễn Vũ Tùng A 52 13017764 48 Nam 53 Đặng Sĩ H 53 14249115 27 Nam 54 Trần Hữu Trung H 54 1562488 36 Nam 55 Phạm Anh V 55 15959621 84 Nam 56 Trần Xuân Q 56 1244943 36 Nam 57 Lù Văn T 57 14154999 192 Nam 58 Ngô Lệ Q 58 12288479 36 Nữ 59 Nguyễn Văn Q 59 13091482 156 Nam 60 Nguyễn Thị M 60 14787434 108 Nữ 61 Trương Ngọc H 61 15098519 168 Nữ 62 Nguyễn Đức A 62 9867548 108 Nam 63 Nguyễn Xuân P 63 13754482 60 Nam 64 Chu Anh Đ 64 11156232 84 Nam 65 Lê Ngọc T 65 15173540 96 Nữ 66 Nguyễn Quốc V 66 15216008 144 Nam 67 Bùi Trung H 67 13345118 21 Nam 68 Nguyễn Tuấn D 68 15698321 36 Nam 69 Bùi Trần Trung K 70 15201208 36 Nam 70 Nguyễn Tiến D 71 14578711 72 Nam 71 Phan Hoàng B 72 15282015 19 Nữ 72 Nguyễn Trà M 73 14020982 23 Nữ 73 Hoàng Ngọc H 75 15268347 60 Nam 74 Lê Hữu T 76 16216630 36 Nam
  64. 75 Vũ Đặng Lam A 78 15418678 11 Nữ 76 Nguyễn Hoàng H 79 12346758 36 Nam 77 Nguyễn Văn T 80 15031374 60 Nam 78 Đinh Ngọc K 81 9654541 168 Nam 79 Nguyễn Tứ M 82 9090541 84 Nam 80 Hà Hải N 83 15401660 60 Nam 81 Nguyễn Thùy L 84 15283636 84 Nữ 82 Nguyễn Thị H 85 15419293 144 Nữ 83 Nguyễn Đình Khánh N 86 15411255 24 Nam 84 Đỗ Quang T 87 15127786 36 Nam 85 Đỗ Quang M 88 15127786 36 Nam 86 Nguyễn Hoàng L 89 14408549 72 Nam 87 Hoàng Lê Anh T 90 13148391 84 Nam 88 Trịnh Duy T 91 10021888 84 Nam 89 Nguyễn Anh K 92 14376414 84 Nam 90 Lê Ngọc Minh T 93 15429714 48 Nam 91 Đỗ Quang T 94 15423610 24 Nam 92 Đinh Gia L 95 7567891 180 Nam 93 Ma Văn T 96 12091887 84 Nam 94 Nguyễn Hồng T 97 14318341 15 Nữ 95 Nguyễn Thị Vân A 98 11564534 156 Nữ 96 Nguyễn Hoàng L 99 15893412 24 Nam 97 Lê Đình H 100 8030107 84 Nam 98 Nguyễn Thu H 101 11274618 108 Nữ 99 Nguyễn Văn T 102 15443427 24 Nam 100 Lê Thanh N 103 15191961 120 Nam 101 Phạm Khánh D 104 15449964 72 Nam 102 Hoàng Xuân T 105 15448091 108 Nam 103 Hà Thùy L 106 15031163 20 Nữ 104 Nguyễn Hoàng H 107 12346758 36 Nam 105 Nguyễn Nam K 108 98756321 120 Nam 106 Nguyễn Đức T 109 150832325 21 Nam 107 Nguyễn Thu H 110 15471902 72 Nữ 108 Lý Tiến V 111 15466754 72 Nam 109 Kiều Quang H 112 9204549 72 Nam 110 Trần Tiến H 113 15471981 36 Nam 111 Hoàng Minh Đ 114 5093951 168 Nam 112 Trần Xuân Q 115 12144943 36 Nam 113 Ngô Tuấn H 116 12276423 96 Nam
  65. 114 Đỗ Văn H 117 150468754 72 Nam 115 Phạm Thị Bảo C 118 15471998 25 Nữ 116 Vũ Văn D 119 15477328 48 Nam 117 Lê Ngọc Minh T 120 159632689 48 Nam 118 Lê Phương N 121 15693567 19 Nữ 119 Thạch Phúc T 122 13002230 60 Nam 120 Hứa Xuân T 123 15048796 72 Nam 121 Nguyễn Văn T 124 15482293 144 Nam 122 Tạ Bảo L 125 15484670 30 Nam 123 Phạm Huy Nhật M 126 15472951 10 Nam 124 Trần Khánh G 127 15478474 96 Nữ 125 Đặng Duy A 128 150507512 16 Nam 126 Hoàng Hải N 129 15339756 96 Nam 127 Nguyễn Thiên  130 1620798 65 Nam 128 Đào Yến N 131 161579878 42 Nữ 129 Tào Minh Đ 132 160064623 108 Nam 130 Lê Quỳnh A 133 130018648 68 Nữ 131 Nguyễn Đức D 134 15974873 60 Nam 132 Trương Quang B 135 160003947 96 Nam 133 Đặng Hải N 136 150397659 60 Nam 134 Nguyễn Nhật T 137 130030728 36 Nam 135 Nguyễn Huy H 138 160088801 48 Nam 136 Hoàng Minh Đ 139 160081160 96 Nam 137 Nguyễn Trường T 140 13252878 96 Nam 138 Nguyễn Gia H 141 160082327 60 Nam 139 Trần Đức T 143 1173669 84 Nam 140 Lê Xuân K 144 15175177 23 Nam 141 Hoàng Thị H 145 15842395 144 Nữ 142 Nguyễn Huy H 146 160056100 48 Nam 143 Nguyễn Nhật T 147 1330728 23 Nam 144 Vũ Đức M 148 16121216 41 Nam 145 Ngô Văn D 149 130303164 40 Nam 146 Tran Le Bao H 151 150176067 42 Nữ 147 Lê Đình H 152 150398425 72 Nam 148 Trần Lê Trí D 153 16113523 36 Nam 149 Vũ Đăng K 154 16113262 60 Nam