›

Khóa luận Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

pdf 58 trang thiennha21 18/04/2022 2390
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_phan_tich_gen_nphs2_tren_mau_mau_benh_nhan_nhi_mac.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Khóa: QH 2012.Y Người hướng dẫn: 1. ThS. Phạm Thị Hồng Nhung 2. ThS. BS. Vũ Vân Nga HÀ NỘI - 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS. Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23. Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018 Nguyễn Thị Thùy Linh @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng cao áp biến tính) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát Kb kilobase (= 1000 bp) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) NPHS2 Gen mã hóa cho protein podocin NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi và máu quốc gia) OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) SSCP Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) STR Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn) TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1 Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 20 Bảng 2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2 30 Bảng 3 Tổng hợp các SNP thuộc gen NPHS2 của 149 bệnh nhân 32 Bảng 4 Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu 33 Bảng 5 Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu 33 Bảng 6 Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước 4 Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH 5 Hình 1.3 Gen NPHS2 và protein podocin 8 Hình 1.4 Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa các protein cấu tạo nên tế bào 9 Hình 1.5 Các đột biến trên protein podocin được mã hóa bởi gen NPHS2 10 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 23 Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,7% 25 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon gen NPHS2 27 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi trên 6 exon gen NPHS2 28 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác nhau trên 6 exon gen NPHS2 29 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 exon gen NPHS2 sau khi tối ưu 29 Hình 3.6 Một số kết quả giải trình tự gen NPHS2 31 Hình 3.7 Số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 31 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 3 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học 3 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học 4 1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP 5 1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 8 1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2 8 1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2 9 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP 11 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2. Hóa chất 18 2.1.3. Thiết bị 19 2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm 20 2.2.2. Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số 20 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.2.3. Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR 21 2.2.4. Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự 23 2.2.5. Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2 23 2.3. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 26 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 26 3.2. NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR 26 3.3. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ 30 3.4. TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU 33 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 34 4.1. VỀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦU CỦA GEN NPHS2 34 4.2. VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN 6 EXON 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1. KẾT LUẬN 40 4.2. KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là bệnh cầu thận mạn tính thường gặp nhất ở trẻ em và là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy giảm chức năng thận [14, 65]. Cho đến nay, các phương pháp điều trị bệnh chủ yếu là liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch và ghép thận. Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH được phân loại dựa vào đáp ứng của bệnh nhân với liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm và kháng corticosteroid [14, 38]. Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường rất cảm thụ với liệu pháp này, tuy nhiên việc điều trị kéo dài bằng corticosteroid gây ra nhiều tác dụng phụ như hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng xương, chậm phát triển thể chất [12]. Bên cạnh đó, một tỉ lệ không nhỏ (10 – 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cơ cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58]. Nhiều trường hợp kháng corticosetorid được chứng minh là do đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức năng và sự biệt hóa của tế bào podocyte (tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận). Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo ra sự lo lắng, chán nản và tiêu tốn nhiều tiền của cho bệnh nhân và gia đình người bệnh [6]. Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiện để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh. Những nghiên cứu áp dụng tiến bộ của di truyền học phân tử trong vài năm qua đã chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng corticosteroid, trong đó các đột biến của gen NPHS2 mã hóa cho protein podocin đóng vai trò quan trọng [49, 60]. Các nhà khoa học đã xác định được tổng cộng 89 đột biến điểm trên 8 exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41]. Vì vậy, việc xác định các đột biến của gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa di truyền với đáp ứng thuốc có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng quyết định phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng do thuốc và giảm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  10. chi phí điều trị [43]. Đây chính là xu hướng tối ưu hóa điều trị theo từng cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học trong phác đồ điều trị bệnh nhân. Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về các đa hình thái của gen NPHS2 cũng như quy trình phân tích gen này. Từ nhu cầu lâm sàng và tính cấp thiết của nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới trong chẩn đoán, điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát”. 1. Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng quy trình phân tích các đa hình di truyền nằm trong exon 1 đến exon 6 thuộc gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. - Xác định tần số các đa hình gen NPHS2 trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. 2. Nội dung nghiên cứu: - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon 1 đến exon 6 thuộc gen NPHS2. - Giải trình tự và xác định các đa hình gen NPHS2. - Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học Hội chứng thận hư là biểu hiện thường gặp của bệnh cầu thận nguyên phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát, xen lẫn những thời kỳ thuyên giảm. Đây là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện ở nhiều bệnh do tổn thương ở cầu thận đặc trưng bởi phù, protein niệu cao, protein máu giảm, rối loạn lipid máu và có thể đái ra mỡ [6]. Hội chứng thận hư tiên phát là HCTH không có nguyên nhân rõ ràng, khởi phát sớm nhất trên 3 tháng tuổi, với 3 hình thái bệnh lí tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ hoặc một phần và tăng sinh gian mạch lan toả. Bệnh hay gặp ở tuổi tiền học đường hoặc học đường (5 – 10 tuổi) [8]. Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome - SRNS) được định nghĩa là một tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư không đạt được sự thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn. Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư ở trẻ em và có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm [44]. Khi đó bệnh nhân cần được điều trị bằng lọc máu và ghép thận với chi phí cao. Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư và cơ địa. Tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em Việt Nam là 8,7 ± 3,5 (tuổi đi học) trong khi đó một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp hơn thường gặp ở trẻ em trước tuổi đi học. Trẻ nam gặp nhiều hơn trẻ nữ (tỷ lệ 2:1). Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều hơn Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng nếu trẻ em da đen mắc HCTHTP thì thường bị kháng corticosteroid [52]. Ở Mỹ, tỉ lệ mắc mới hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ hiện mắc là 16/100.000 người. Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mới mắc của trẻ em gốc Á (Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp 6 lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể hiện tỉ lệ mắc HCTH ở một số nước trên thế giới). Ở nước ta, tại các khoa Nhi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú và chiếm 10 – 30% tổng số bệnh nhi bị các bệnh thận. Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân và chiếm 40% tổng số bệnh nhân của khoa thận [1, 10]. Hình 1.1. Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước trên thế giới [27] 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học Cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự rối loạn chức năng của tế bào lympho T dẫn đến sự rối loạn đáp ứng miễn dịch. Các protein đặc biệt là các Albumin xuất hiện trong nước tiểu là do biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng lỗ lọc và mất điện tích âm màng đáy. Một số bệnh nhân mang điện tích dương trong huyết tương và các phân tử protein này có thể trung hòa điện tích âm trên thành mao mạch cầu thận. Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy có vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTHTP. Gần đây người ta thấy rằng sự thay đổi của các phân tử creatin bộc lộ trên chân lồi của các tế bào biểu mô có chân, đặc biệt là nephrin, podocin và α-actin cũng có vai trò gây xuất hiện protein niệu [4]. Hình 1.2 mô tả cơ chế gây mất albumin từ máu ra nước tiểu trong HCTH. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. Hình 1.2. Cơ chế bệnh học HCTH [53] Hầu hết các bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân. Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em hoặc HCTH bẩm sinh được chứng minh trong các nghiên cứu có nguyên nhân do gen làm ảnh hưởng tới sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte [33]. 1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP. Khi chưa có corticosteroid, một tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết hoặc tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng. Từ năm 1950, corticosteroid đã được sử dụng trong điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH xuống còn khoảng 3%. Corticosteroid có tác dụng giảm viêm ở cầu thận trong điều trị HCTHTP, từ đó các triệu chứng bệnh sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn. Với những trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid [45]. Tuy nhiên, bệnh có khả năng tái phát cao, vì vậy cần theo dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ một cách chính xác. Mặt khác, điều trị bằng corticosteroid trong thời gian dài cũng gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như [12, 45]: - Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm. - Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù. - Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy. - Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em. - Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. - Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu cơ, nhược cơ. - Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao. - Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo. - Nhiễm khuẩn. - Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiên cho thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc là 10 – 20% và có xu hướng ngày càng tăng [11, 31]. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và cộng sự trên 42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid được điều trị bằng methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm một phần là 30,9% và không đáp ứng là 35,7% [8]. Những nghiên cứu mới về phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp các protein tham gia cấu trúc màng lọc cầu thận đã phần nào chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc do gen. Bằng chứng là sự di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với corticosteroid ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư đang ngày càng được công nhận [30]. Vấn đề cơ chế nào dẫn đến việc những bệnh nhân này ban đầu đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó lại kháng với corticosteroid (hiện tượng kháng corticosteroid muộn) cũng được đặt ra. Vì vậy, xét nghiệm gen di truyền đang ngày càng trở thành một công cụ có giá trị trong việc xác định các đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư và sự di truyền tính kháng steroid, từ đó có được hướng điều trị hiệu quả và trong tương lai có thể tránh những trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13]. 1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát Hơn hai thập kỉ qua, cơ sở phân tử của HCTH kháng corticosteroid đã được nghiên cứu trên cả trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính chất gia đình và những trường hợp ngẫu nhiên. Các đột biến trên gen mã hóa cho các protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) được mô tả như là nguyên nhân của HCTH kháng corticosteroid di truyền. Đến nay, các đột biến ở 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E, PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1, SMARCA, MYH9 và NXF5) [23]. Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện trên thế giới chỉ ra các gen sau đây là nguyên nhân phổ biến nhất trong HCTH kháng corticosteroid: - Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36]. - Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin của tế bào podocyte, thường gặp ở lứa tuổi lớn và HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình. Đột biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc ở Châu Âu và Trung Đông, ngược lại tỉ lệ này lại ít ở trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69]. - WT1 mã hóa cho sự di truyền ức chế protein của khối u liên quan đến phát triển thận và hệ sinh dục. Đột biến gen WT1-Wilm’tumor có thể gặp ở tất cả các trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59]. - Gen ít gặp hơn là LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa phospholipase C epsilon và TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid tạo thành một phức hệ với podocin quy định cơ chế cảm nhận của màng lọc cầu thận [36]. - Đột biến gen NPHS3 và đột biến ở gen epsilon phospholipase C (PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh và xơ hóa gian mạch lan tỏa [35]. - Các gen khác gồm ACTN4 mã hóa alpha-actinine 4, TRPC6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid và INF2 mã hóa protein điều hòa actin, các gen này gây HCTH di truyền trội với xơ hóa cầu thận cục bộ thường xuất hiện ở trẻ vị thành niên và người trẻ tuổi [68]. Trên cơ sở các nghiên cứu này, các đột biến của gen NPHS2 được mô tả là một trong các nguyên nhân quan trọng trong cơ chế kháng thuốc ở bệnh nhân mắc HCTHTP và được tìm thấy ở các quần thể khác nhau với tần số và mức độ biểu hiện khác nhau [20, 25]. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn phân tích gen NPHS2 là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về mối liên quan giữa các đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đáp ứng điều trị và tiên lượng ở bệnh nhân người Việt Nam mắc HCTHTP. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. 1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2 Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon [21] (Hình 1.3). Hình 1.3. Gen NPHS2 và protein podocin. A. Vị trí của gen NPHS2 trên nhiễm sắc thể số 1. B. Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2 mã hóa protein Podocin. Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon. UTR là vùng không dịch mã. C. Cấu trúc protein podocin. (Nguồn: Genetics in Medicine) NPHS2 mã hóa cho protein podocin, hầu như chỉ biểu hiện ở tế bào podocyte trên cầu thận. Podocyte là tế bào biểu mô biệt hóa bao quanh mặt ngoài của màng lọc cầu thận (Hình 1.4). Những tế bào này phân ngón thành những chân bám vào mặt ngoài màng đáy, khe giữa các chân giả tạo ra những lỗ lọc đường kính khoảng n Å cho dịch lọc đi qua. Podocin là một protein màng, cấu tạo từ 383 axit amin và trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin có cấu trúc giống như kẹp tóc, cả hai đầu của phân tử protein podocin đều nằm trong tế bào chất. Podocin tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở các khe của màng lọc cầu thận, nơi nó tương tác với các protein khác như CD2AP hay nephrin [20]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. Hình 1.4. Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa các protein cấu tạo nên tế bào (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang) 1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2 Kruglyak và Nickerson (2001) ước tính rằng hai hệ gen người bình thường trung bình giống nhau về trình tự các nucleotit tới 99,9%. Trong phần khác biệt di truyền còn lại thì đến 90% là các đa hình đơn nucleotit (single nucleotit polymorphism, viết tắt là SNP) [46]. SNP là đột biến thay thế một nucleotit trong trình tự ADN với tần số lớn hơn 1% trong quần thể. Nhiều nghiên cứu đến nay cho thấy hầu hết các SNP phổ biến chỉ có hai alen và khoảng 2/3 các SNP trong hệ gen người có nguồn gốc là các đột biến đồng hoán. SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền phổ biến và ổn định, hơn 99,9% trình tự hệ gen là giống nhau và sự biến đổi của phần còn lại được coi là có ảnh hưởng rất lớn đến việc bằng cách nào đó mà con người có sự phản ứng khác nhau với bệnh tật, với các nhân tố môi trường như vi khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất, các thuốc và các liệu pháp điều trị khác @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. nhau. Các SNP nằm trong vùng mã hóa của gen làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein được dịch mã là một trong những mục tiêu thường được phân tích nhằm chẩn đoán bệnh và lý giải cho việc tại sao mỗi người lại đáp ứng khác nhau với một loại thuốc trong cùng một điều kiện môi trường. Các điểm đa hình nucleotit này cho thấy tiềm năng không giới hạn trong việc nghiên cứu tác động của chúng đến con đường sinh bệnh học [61, 64]. Mặc dù tác động của từng SNP riêng rẽ đến sự hình thành bệnh là tương đối yếu nhưng sự tổ hợp của chúng có thể làm tăng đáng kể nguy cơ gây bệnh. Cùng với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng thuốc, khả năng hấp thụ, chuyển hóa thuốc cũng như các phân tử khác [66]. Vì vậy, việc nghiên cứu mối liên hệ giữa các SNP này với sự hình thành bệnh là rất cần thiết nhằm tìm ra các chỉ thị di truyền đặc trưng cho từng quần thể. Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên các kĩ thuật sinh học phân tử có thể phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen của hàng trăm hay hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hay hàng ngàn SNP [47]. Các nhà di truyền học hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể. Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 đã được xác định, trong đó chủ yếu là các SNP (Hình 1.5). Hình 1.5. Các đột biến trên podocin (Nguồn: Weber et al: Podocin gene mutation screening) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Các nhà khoa học đã xác định được 89 đột biến điểm trên 8 exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP; còn 33 đột biến tập trung ở exon 7 và 8 chưa tìm được mối liên quan chặt chẽ nào với HCTHTP [41, 42]. Bên cạnh các nghiên cứu trên các exon, cũng có một số ít nghiên cứu về các đột biến trên intron của NPHS2, tuy nhiên chưa có mối liên hệ rõ ràng nào giữa các đột biến trên intron của gen này với HCTHTP kháng thuốc [34, 41]. Sáu mươi bảy biến thể đa hình của NPHS2 đã được công bố gồm 22 SNP thuộc vùng mã hóa, trong đó có 8 SNP làm thay đổi axit amin và 14 SNP không làm thay đổi axit amin. 45 đột biến còn lại nằm ở vùng không mã hóa gồm 13 thay đổi ở intron, 26 thay đổi ở vùng promoter và 6 thay đổi ở vùng 3 UTR. Đột biến p.R229Q (c.686G>A) thay thế nucleotit G thành A ở vị trí 686 trong exon 5 dẫn đến sự thay đổi axit amin arginine thành glutamine [21]. Vì vậy, các đặc điểm sinh học của chuỗi peptit được mã hóa đã thay đổi. Nghiên cứu invitro cho thấy podocin đã giảm đáng kể liên kết với nephrin [63]. Tỷ lệ xuất hiện alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,03- 0,13 ở châu Âu [25, 42, 63], và 0,005-0,025 ở các cá nhân từ gốc Phi Châu [29, 55, 63]. Các biến thể p.A61V (c.182C> T) và p.A242V (c.725C> T) là những SNP làm thay đổi protein mã hóa chủ yếu ở các cá nhân người Mỹ gốc Phi, với tần suất tương đối lần lượt là 0,015 và 0,076 (NHLBI Exome Sequencing Project). Năm 2011, Ren Q và Yu Sy trong nghiên cứu ở 35 bệnh nhân nhi và 30 người đối chứng khỏe mạnh đã phát hiện 3 SNP: 288C>T thể dị hợp ở exon 2, 945T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 [56]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP Trên thế giới, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân tích đa hình di truyền gen NPHS2 trên những nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác nhau. Năm 2000, Boute và cộng sự lần đầu phân tích đột biến gen NPHS2 đã phát hiện ra đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường ở các bệnh nhân người Mỹ với HCTH kháng thuốc [21]. Các nghiên cứu trước đây về tần số đột biến gen NPHS2 trong các quần thể khác nhau cho thấy chủng tộc đóng một vai trò quan trọng. Các đa hình di truyền gen NPHS2 đã được công bố có ảnh hưởng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. khác nhau đến các đặc điểm lâm sàng như protein niệu xuất hiện sớm, tiến triển nhanh đến bệnh thận giai đoạn cuối và sự khác biệt về thể mô bệnh học [19, 44, 65]. Tuy nhiên, không có sự đồng thuận về exon nào ảnh hưởng đến HCTH hơn hay đột biến trên exon nào có hại nhất [32]. Năm 2007, Berdeli nghiên cứu đột biến gen NPHS2 trên 295 trẻ em ở Thổ Nhĩ Kì mắc HCTHTP kháng thuốc thấy: 41 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 13,8%) có tiền sử gia đình và 254 bệnh nhân (chiếm 86,2%) là trường hợp ngẫu nhiên. Phân tích trên 8 exon của gen NPHS2 bằng phương pháp giải trình tự thấy có 53 đột biến, trong đó 37 đột biến mới. Tỷ lệ phát hiện đột biến là 24,7% trên tất cả các bệnh nhân, 29,2% ở nhóm có tiền sử gia đình và 24% ở nhóm ngẫu nhiên [18]. Trong nghiên cứu của Basiratnia và cộng sự năm 2013 trên 99 trẻ em mắc hội chứng thận hư ở Tây Nam Iran, sau khi phân tích kết quả trên hai nhóm là nhóm kháng corticosteroid (49 bệnh nhân) và nhóm nhạy cảm với corticosteroid (50 bệnh nhân), đã đề xuất phác đồ điều trị mới cho nhóm trẻ em mắc HCTH kháng thuốc dựa trên xác định các đột biến gen NPHS2 [51]. Joshi và cộng sự năm 2013 đã chỉ ra trong nghiên cứu của mình sự biểu hiện đa dạng về đột biến gen NPHS2 ở các chủng người và các quốc gia khác nhau. Từ đó đề xuất sự tiếp cận có hệ thống để kiểm tra di truyền cho từng bệnh nhân mắc HCTH kháng thuốc nhằm hỗ trợ các bác sĩ trong việc lựa chọn điều trị thích hợp [40]. Mặc dù vậy, cũng có một số nghiên cứu phân tích các exon khác nhau của gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTH lại không tìm thấy đột biến gen nào. Nghiên cứu của Dedi Rachmadi và cộng sự năm 2015 trên đối tượng bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng steroid ở Indonesia đã phân tích các đa hình di truyền trên các exon 1, 2 và 8 bằng phương pháp giải trình tự gen và mối liên quan với các biểu hiện lâm sàng. Kết quả cho thấy không có mối tương quan giữa 6 đa hình di truyền gen NPHS2 đã xác định được với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (p>0,05) và không tìm thấy đột biến mới. Tuy nhiên, tác giả cũng đưa ra kết luận trong nghiên cứu này chỉ có 28 trên 59 mẫu giải trình tự thành công do hạn chế về thời gian và tài chính [28]. Vì vậy có thể các exon khác của gen mã hóa cho protein podocin đóng vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư kháng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. corticosteroid chưa được chứng minh trong nghiên cứu này và cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTHTP được tiến hành trước đây tập trung chủ yếu về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đánh giá đáp ứng điều trị. Đến nay chưa có nghiên cứu nào về đa hình di truyền gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân này được công bố. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành với mục đích tìm ra phương pháp phân tích gen NPHS2, phục vụ cho chẩn đoán và điều trị HCTH cho từng cá thể. Đây là xu hướng điều trị hứa hẹn mang lại kết quả tối ưu hơn trong tương lai. 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT Gần 300 gen đã được phân tích chi tiết về SNP theo các phương pháp và trên nhiều nhóm người khác nhau. Năm 1980, SNP được phát hiện do sử dụng enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của vị trí cắt và số điểm cắt bằng cách quan sát sự thay đổi độ dài của các đoạn cắt trên ADN. Đến năm 1990, SNPs đã phần lớn thay thế STR (short tandem repeat) trong việc sử dụng như một dấu chuẩn lựa chọn cho các nghiên cứu liên kết. STR là các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6 bp, có tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể [24]. Phân tích STR lý tưởng với các nghiên cứu liên kết mà quá trình phân tích phả hệ được sử dụng để xác định một gen chịu trách nhiệm cho một rối loạn đơn gen [2]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về sau đã có sự chuyển đổi từ các rối loạn đơn gen sang phân tích các bệnh đa yếu tố như loãng xương, tiểu đường, tim mạch, rối loạn tâm thần và phần lớn ung thư, là các bệnh xảy ra với tần số cao hơn các bệnh đơn gen. Bên cạnh đó, quan điểm điều trị mới quan tâm nhiều hơn ảnh hưởng của di truyền trong đáp ứng thuốc. Các bệnh đa yếu tố di truyền này bao gồm nhiều biến đổi ở gen mà mỗi biến đổi đóng góp một phần tác động nhỏ. Các nghiên cứu với kích thước mẫu lớn so sánh được các trường hợp bệnh với các đối chứng tương ứng từ cùng một quần thể và khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trong gen cao hơn. SNP được lựa chọn như dấu chuẩn do nó phong phú hơn và được cho là ổn định hơn STR. Nhiều SNP là các trình tự chức năng nếu chúng xảy ra trong @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. vùng mang trình tự mã hóa hoặc trình tự quy định trong gen, do đó có thể kiểm tra trực tiếp sự liên kết giữa kiểu hình và sự thay đổi chức năng gen [2, 24]. Nghiên cứu về mối liên quan giữa SNP với bệnh lý có thể thực hiện bằng 2 cách: trực tiếp phân tích một SNP trong một trình tự mang chức năng kết hợp với một đặc trưng của bệnh hoặc sử dụng một SNP như một dấu chuẩn cho mất cân bằng liên kết (linkage disequilibrium -LD). Dựa trên cơ sở lý thuyết, phương pháp sử dụng máy tính để mô phỏng đã dự đoán rằng LD không có khả năng mở rộng ra hơn 3 kb trong quần thể người, tức là chỉ khoảng 500000 SNP được sử dụng cho một lần phân tích. Tuy nhiên, những hiểu biết về mức độ và mô hình biến động của tần số tái tổ hợp của genome đã được công nhận cho phép chúng ta phân loại dấu chuẩn cho một lần phân tích genome, rút ngắn hơn thời gian và kích thước mẫu cần thiết. Một hệ quả của việc sử dụng quá nhiều dấu chuẩn đồng thời (nhiều cuộc kiểm tra độc lập) là lượng mẫu yêu cầu để phát hiện các ảnh hưởng di truyền nhỏ có ý nghĩa thống kê là khá lớn. Do đó, nghiên cứu yêu cầu lượng lớn các bệnh nhân và các nhóm đối chứng. Hiện nay, quy mô thí nghiệm lớn như vậy là không khả thi về mặt kinh tế, vì vậy cách tiếp cận phân tích gen ứng cử viên – gen được lựa chọn trên cơ sở chức năng sinh học và nghiên cứu, kết hợp với các kiểu hình của bệnh đang được áp dụng phổ biến [2]. Việc xác định và mô tả lượng lớn SNP rất cần thiết trước khi chúng ta có thể sử dụng chúng rộng rãi như một công cụ di truyền. Khoảng vài trăm ngàn SNP sẽ được yêu cầu như một nguồn tài nguyên để xây dựng các bộ dấu chuẩn tối ưu cho các nghiên cứu. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp xác định các đa hình di truyền trên ADN như kĩ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, viết tắt là RFLP), kĩ thuật sử dụng đầu dò ADN (ADN- probe), kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (single strand conformational polymorphism, viết tắt là SSCP), giải trình tự, sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC), chip ADN (SNP microarray) [64]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism, viết tắt là RFLP) RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt ADN bằng ezyme cắt giới hạn. Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamide và được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot. Trên màng có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với. Đầu dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác nhau. Mỗi đoạn giới hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di truyền [22]. Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tích, bỏ qua bước lai với mẫu dò ADN đánh dấu phóng xạ như trong phương pháp RFLP thông thường nên giá thành rẻ hơn và ít ảnh hưởng đến sức khỏe hơn cho người nghiên cứu. Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP. Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác. Phương pháp phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation polymorphism, viết tắt là SSCP) Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau. Phương pháp phân tích ADN dị sợi kép (Denaturing high performance liquid chromatography, viết tắt là DHPLC) Đây là phương pháp thay vì sử dụng gel và phân tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. DHPLC là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt. Công nghệ VDA cũng có nhiều ưu điểm và tỷ lệ phát hiện cao, cho phép phát hiện các SNP bằng quá trình lai sản phẩm PCR với mảng array sử dụng đầu dò oligonucleotit trên một chip thuỷ tinh và đo sự khác biệt trong liên kết lai giữa oligonucleotit phù hợp và không phù hợp. Phương pháp giải trình tự Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột biến điểm/SNP. Để khẳng định chính xác đột biến hay biến đổi người ta phải giải trình tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [3]. Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotit ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotit A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotit để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [5]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả trên. Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao [7]. Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Phương pháp này có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm. Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu. Ngoài việc chọn lựa phương pháp cho phát hiện SNP, quần thể sử dụng để phát hiện SNP cũng cần được chọn lựa. Tần số alen SNP khác nhau đáng kể giữa các dân tộc và các quần thể khác nhau. Các công ty phân tích SNP đã lựa chọn sử dụng các nhóm người đa sắc tộc để tối đa hóa cơ hội phát hiện SNP. Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các nhóm người mang bệnh để tìm ra các SNP, theo logic là các biến thể góp phần vào giai đoạn bệnh sẽ xuất hiện ở tần số cao ở nhóm người này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu máu toàn phần chống đông EDTA của 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung Ương. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Các bệnh nhân được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/lít, Protid máu ≤ 56 g/lít [48]. Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác; Tự nguyện tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân: HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc ). Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.1.2. Hóa chất Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek). Hóa chất dùng cho điện di Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X; Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code: SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck). Hóa chất dùng cho PCR Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. 2.1.3. Thiết bị Các pipet Eppendorf dải 0,5 µl - 10 µl, 10 µl - 100 µl, 100 µl - 1000 µl, hãng: Thermo; Đầu típ 10 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -300C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức). 2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ tháng 9/2015 đến 3/2017. Địa điểm tiến hành phân tích gen: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cỡ mẫu nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp thỏa mãn tiêu chuẩn tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đồng ý tham gia nghiên cứu cho đến khi quy trình đạt ổn định. Đề tài áp dụng phương pháp giải trình tự dựa trên nguyên lý của Sanger. Tiến hành tối ưu hóa quy trình PCR với các điều kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn. Mức độ đánh giá tối ưu dựa trên kết quả điện di trên gel agarose. Dựa trên kết quả giải trình tự sẽ tính được tần số kiểu gen và tần số alen của các SNP. Tần số alen thu được trong nghiên cứu được so sánh với tần số lý thuyết khi quần thể cân bằng theo định luật Hardy-Weinberg. Phân tích kết quả và xử lý số liệu với kiểm định Khi bình phương bằng phần mềm Excel. Phép thử Khi bình phương được dùng để đánh giá tần số alen thu được trong nghiên cứu có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tần số alen lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg hay không. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm Mẫu máu toàn phần (2 ml máu/ mẫu) lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân nhi mắc HCTHTP tại Bệnh viện Nhi Trung Ương được đưa vào ống chuyên dụng chứa EDTA, bảo quản lạnh ở -20oC đến khi sử dụng. Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách ADN tổng số. 2.2.2. Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số Tách chiết ADN tổng số Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng. Quy trình tách chiết ADN được trình bày ở Phụ lục 1. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết Sự có mặt của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X. 5 µl ADN được trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml). Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng ADN được phát hiện dưới ánh sáng UV. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280). ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Quy trình kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di được trình bày ở Phụ lục 2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế các mồi nhân dòng exon 2, 3 và 4, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ). Các cặp mồi dùng cho nhân dòng exon 1, 5 và 6 sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013 [17]. Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. Bảng 1. Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 Exon Trình tự mồi (5’ – 3’) Độ dài sản phẩm dự kiến 1 GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT 414 bp TCC ACC TTA TCT GAC GCC CC 2 CTCTGACTACTCTGATTTGACTT 438 bp CTCAAATGTGAACAGGAAGCC 3 CTA GGA TCA TTC TTA TGC CA 238 bp GAGGTCCATATTACA AAT CTG C 4 TCC CTG TTT ATA CCTATT GTC 475 bp C CCC ATT CCC TAG ATT GCC 5 AAA GGA GCC CAA GAA TCA AG 292 bp AAA TAT TTC AGC ATA TTG GCC 6 GTT TAG GCA TGC TCT CCT C 228 bp GATATGGCTATAGTA CTC AGT G 2.2.3. Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN cần phân tích từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn ADN, tổng hợp chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung. - Hai đoạn mồi xác định vị trí bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN cần khuếch đại. - Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Môi trường đệm cung cấp ion Mg2+ giúp enzyme hoạt động tối ưu. - Enzyme tổng hợp chuỗi mới. Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. Trình tự lý thuyết và độ dài của các exon từ 1 đến 6 của gen NPHS2 như sau (trình tự mồi được đánh dấu màu vàng, trình tự tham khảo trên NCBI có mã NG_007535.1): Exon1: 4981 gtcccccggg cacgccacgc ggacccgcag cgactccaca gggactgcgc tcccgtgccc 5041 ctagcgctcc cgcgctgctg ctccagccgc ccggcagctc tgaggatgga gaggagggcg 5101 cggagctcct ccagggagtc ccgcgggcga ggcggcagga ctccgcacaa ggagaacaag 5161 agggcaaagg ccgagaggag cggcggaggc cgcgggcgcc aggaggctgg gcccgagccg 5221 tcgggctccg gacgggcggg gaccccgggg gagccccgag cgcccgccgc cacggtggtg 5281 gacgtggatg aggtccgagg ctccggcgag gagggcaccg aggtggtggc gctgttggag 5341 agcgagcggc ccgaggaagg tacggattca gcaccactat ctgctacttt tccaggtggt 5401 aactaagggg cgtcagataa ggtggaaagg gtcatcccca cgagacccac tgaagccaga Exon 2: 16021 tttgacttat tctaatattt ccagcaaagt ctccaagttg tgccaactcc aataccaaga 16081 attggaccaa cagatgctag tcagtgaata cagtgaagtt tcaatataat tattcttttg 16141 ctttaatttt tttaaggtac caaatcctcc ggcttagggg cctgtgagtg gcttcttgtc 16201 ctcatttccc tgctcttcat catcatgacc ttcccttttt ccatctggtt ctgcgtaaag 16261 gtgagattcc ataaggaccc aataggtaat ttcctgaggc ctctcactgg ccacaccatg 16321 cccattctca cttctgtttt ctggtacatg ttattgctcc atgtggaatg ccctcacccc Exon 3: 19501 tctgatatct aggatcattc ttatgccaag gccttttgaa gactttttct ttctgggagt 19561 gatttgaaag gattaaattt ctctttaggt tgtacaagag tatgaaagag taattatatt 19621 ccgactggga catctgcttc ctggaagagc caaaggccct ggtaaaaaaa cactcttttt 19681 tttctaaaca cctctctcct gacttgccaa tttcttcaac ccatgcagat ttgtaatatg 19741 gacctcagat taaatgaagt aacttgattc atgatatctg aattttccaa tctgttactt Exon 4: 20941 atgactaaaa ggaccacaca gcccagtttg ctgggaataa tccctgttta tacctattgt 21001 cctggattac atattataat atataatagt gctctccttt taccctcagg tggaggtggg 21061 atgggccaat ggtctgtaat tagaggctaa gaaaagtaat gtagtgtgca acctgacccc 21121 agaaaggtga aacccaaaca gccttcatgc tagctattta tctgtcactt cctcctcctc 21181 tcttttaggt cttttctttt ttttgccctg cctggatacc taccacaagg ttgaccttcg 21241 tctccaaact ctggagatac cttttcatga ggtaagccaa atgatggctt ttgctttctc 21301 tatacatttt ccatggtcta cctaccgtgg acaaaatgat tatttatact caaaaatagg 21361 aaagaaaaat aatgatatgg actacatcat aacttaaaac ttttgtgcat caaaggacac 21421 aattaacaga gtgcaaaggc aatctaggga atgggggaaa atatttgcaa atcatatctc Exon 5: 23641 aacacattta gttcctctaa ccccacatag gaaaggagcc caagaatcaa gcctgtcatc 23701 caaacttttt tctgcctaga tcgtgaccaa agacatgttt ataatggaga tagatgccat 23761 ttgctactac cgaatggaaa atgcctctct tctcctaagc agtcttgctc atgtatctaa 23821 agctgtgcaa ttccttgtgc aaaccactat gaagcgtctc ctagcacatc gatccctcac 23881 tgaaattctt ctagagagga agagcatcgc ccaagatgca aaggtactta gataaacata 23941 atggccaata tgctgaaata tttatctttt attcatttgt tcattggaca tttattaaat @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. Exon 6: 26341 acaatggcca ccagggttta ggcatgctct cctcccacct ggaggctccc actgacatct 26401 gaattcttct ttccacaggt tgccttggat tcagtgacct gtatttgggg aatcaaagtg 26461 gagagaatag aaatgtgggt aggaaattaa ctagcaagaa ctgtatgata aaggaaaata 26521 ttctggtttc attttaaatt tttcatttga aaaattattt tcactgagta ctatagccat 26581 atcagcataa atttataaaa aagagaaaca aatcacctaa tatcttacag ccataacaca 2.2.4. Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự 20 µl sản phẩm được gửi giải trình tự tại hãng IDT (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân. Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp. 2.2.5. Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2 Tần số kiểu gen và alen được xác định theo công thức sau (giả sử với kiểu gen X gồm 2 dạng alen là C và T, cho 3 kiểu gen là CC, CT, TT): - Tần số của mỗi kiểu gen: Tần số kiểu gen X = - Tần số của mỗi alen: Tần số alen C: f (C) = f (CC) + f (CT) Tần số alen T: f (T) = f (TT) + f (CT) Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT): tần số các kiểu gen CC, TT, CT Quy trình nghiên cứu được tóm tắt thành sơ đồ Hình 2.1. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. Tách chiết ADN tổng số Thu nhận 149 mẫu Chu ẩn bằng E.Z.N.A blood DNA máu toàn phần bệnh bị m ẫu Mini kit. Kiểm tra độ tinh nhi mắc HCTHTP sạch và nồng độ ADN Exon 2, 3 và 4: tự thiết kế mồi sử dụng Lựa chọn cặp phần mềm PerlPrimer version 1.1. mồi nhân gen Exon 1, 5 và 6: sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013 PCR nhân Tối ưu các thành phần tham gia dòng 6 exon phản ứng và chu trình nhiệt Xác định kiểu Đọc kết quả bằng Giải trình tự gen của SNP phần mềm BioEdit version 7.1.9 Xác định tần số Tính toán tần số và so sánh với các của các SNP nằm nghiên cứu đã công bố trên NCBI trong 6 exon Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 2.3. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tuân theo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế. Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào. Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. đích nghiên cứu. Nghiên cứu này được Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Nhi Trung Ương phê duyệt với số ID 796/BVNTW-VNCSKTE và đã được sự đồng ý của tất cả bệnh nhân và cha mẹ họ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ADN tổng số từ 149 mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Omega-Biotek, sản phẩm ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0,7%. Kết quả điện di cho thấy các sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng ADN rõ nét, tương ứng với băng 23,1 kb của marker (Hình 3.1). Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 2%. Làn M: Lamda DNA/HindIII marker. Làn 01-12: mẫu ADN tổng số thu của bênh nhân có mã số tương ứng. Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (số liệu chi tiết trình bày ở Phụ lục 3) cho thấy nồng độ ADN thu từ 149 mẫu máu dao động từ 31 - 350 ng/µl, chỉ số OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,7 đến 2,1. Axit nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm là do sự có mặt của bazơ purin và bazơ pyrimidin. Vì vậy, nồng độ ADN có thể xác định thông qua giá trị hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260). Một đơn vị OD260 tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi. Ngoài ra, người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280 nm là mức hấp thụ cực đại của protein và sử dụng chỉ số OD260/OD280 để đánh giá độ tinh sạch của ADN [9]. Như vậy, ADN tổng số thu được ít bị đứt gãy với một băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo. 3.2. NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR Tối ưu nhiệt độ gắn mồi Chúng tôi tiến hành tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR trong 10 nhiệt độ lựa chọn dao động quanh nhiệt độ gắn mồi lý thuyết. Kết @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. quả điện di ở hình 3.2 cho thấy băng ADN ở exon 1 hiện lên rõ nét nhất tại dải nhiệt độ gắn mồi từ 54,5oC đến 66,5oC; exon 2 từ 50,8oC đến 58,1oC; exon 3 từ 50,9oC đến 58,1oC; exon 4 từ 51,0oC đến 59,1oC; exon 5 từ 53,4oC đến 57,3oC và exon 6 tại nhiệt độ 56,3oC. Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi là 56oC vì nằm trong khoảng nhiệt độ để ADN hiện lên 1 băng rõ nét ở cả 6 exon. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon gen NPHS2. Làn M: marker, ĐC +: đối chứng dương, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nhiệt độ gắn mồi sử dụng cho các mẫu (0C) Tối ưu nồng độ mồi Quá trình tối ưu hóa nồng độ mồi với sản phẩm PCR chạy ở 3 nồng độ 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/µl trên 3 mẫu 29, 49 và 57. Hình ảnh điện di sản phẩm thể hiện Hình 3.3. Kết quả điện di cho thấy cả 6 exon đều hiện băng rõ nhất ở nồng độ 0,3 pmol/µl. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ mồi chạy PCR là 0,3 pmol/µl. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi trên 6 exon gen NPHS2. Làn M: Marker 100bp. Các mẫu 29, 49, 57 được chạy PCR với nồng độ mồi 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/µl. ĐC-: Đối chứng âm. Tối ưu nồng độ ADN Chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ ADN sử dụng trong phản ứng PCR ở các nồng độ: 5, 10, 50, 100 và 500 ng/µl. Kết quả điện di trên 6 exon ở Hình 3.4 cho thấy băng sáng hiện lên rõ nhất tương ứng với hai cột nồng độ 50, 100 ng/µl; băng mờ hơn ở cột 5, 10 ng/µl và hầu như không thấy băng sáng ở cột 500 ng/µl. Như vậy, PCR ở cả 6 exon thực hiện với nồng độ ADN xác định là 50 - 100 ng/µl. Tại dải nồng độ này, sản phẩm PCR cho băng duy nhất, sáng rõ cho thấy phản ứng nhân dòng đặc hiệu với lượng sản phẩm cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác nhau trên 6 exon gen NPHS2. Làn M: marker, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nồng độ ADN các mẫu (ng/µl.) Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu với thành phần chi tiết ở Bảng 2, chúng tôi đã nhân dòng thành công 6 exon với cùng chu trình nhiệt. Bảng 2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2 Thành phần Thể tích Điều kiện (chu trình nhiệt) (µL) dNTP (2mM) 2.5 * Biến tính đầu: 95oC trong 3 phút Buffer 10X 2.5 * Lặp lại 35 chu kì: - Biến tính: 95 oC – 30 giây MgSO4 (25mM) 2 - Gắn mồi: 56 oC – 30 giây Pfu ADN polymerase (2.5 U/ 0.5 - Kéo dài chuỗi: 72 oC – 1 phút µL) * Tổng hợp cuối: 72 oC – 5 phút * Giữ sản phẩm ở -4 oC AND 2.5 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0.75 Mồi ngược (10 pmol/µl) 0.75 Nước khử ion 13.5 Tổng thể tích 25 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. 3.3. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ Phân tích kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu trên NCBI, chúng tôi xác định được 73 SNP trên exon 1, 44 SNP trên exon 2, 32 SNP trên exon 3, 37 SNP trên exon 4, 50 SNP trên exon 5 và 17 SNP trên exon 6. Chúng tôi cũng phát hiện 2 đa hình mới chưa được công bố: 1 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp AT ở sau 4 Nu của rs772151217 trên exon 2; 1 bệnh nhân có kiểu gen TT ở sau 2 Nu của rs786204708 trên exon 3. Kết quả đọc kiểu gen từ giải trình tự của một số mẫu được thể hiện trong Hình 3.6. Hình 3.6. Một số kết quả giải trình tự gen NPHS2. Hình A: các kiểu gen của đa hình rs3738423. Hình B: đột biến mới trên exon 2, exon 3. Số lượng đa hình trên các exon được biểu thị ở Hình 3.7. Số lượng đa hình ở exon 1 xuất hiện nhiều nhất, tiếp đến là các exon 5, exon 2, exon 4, exon 3 theo thứ tự giảm dần và thấp nhất là ở exon 6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. Số SNP 80 70 60 50 40 73 30 44 50 20 32 37 10 17 0 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Hình 3.7. Số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 Đa số các đa hình phát hiện trong nghiên cứu đều chỉ có 1 kiểu gen đồng hợp kiểu dại, các đa hình xuất hiện nhiều hơn 1 kiểu gen được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. Tổng hợp các SNP xuất hiện alen đột biến của 149 bệnh nhân Exon SNP Số lượng bệnh Kiểu gen nhân 1 rs1079292 2 Dị hợp rs758564490 1 Dị hợp 2 rs3738423 2 Đồng hợp đột biến 30 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs772151217 1 Dị hợp là 04 Nu) 3 rs200437667 1 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs786204708 1 Đồng hợp là 02 nucleotid) đột biến 4 rs12401711 13 Dị hợp rs12401708 13 Dị hợp rs528833893 1 Thêm 1 Nu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. Những công bố trên PubMed trong hơn một thập kỉ qua đã cho thấy sự đa dạng và chức năng của các đa hình gen NPHS2 ở các nhóm nghiên cứu khác nhau. Tham khảo các kết quả nghiên cứu trước trên thế giới, chúng tôi xác định được trên quần thể đối tượng nghiên cứu của mình một số SNP thuộc hai nhóm đột biến thường gặp nhất là đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa. Bảng 4 trình bày các đột biến sai nghĩa đã tìm thấy trong nghiên cứu này tương ứng với vị trí trên mRNA và protein. Bảng 5 trình bày các đột biến vô nghĩa đã tìm thấy trong nghiên cứu này tương ứng với vị trí trên mRNA và protein. Bảng 4. Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu Tên SNP Vị trí trên Exon Vị trí trên mRNA protein rs74315342 c.413G>A 3 p.R138Q rs869025495 c.353C>T 2 p.P118L rs74315346 c.479A>G 4 p.D160G rs200437667 c.502C>A 3 p.R168S rs786204583 c.502C>T 4 p.R168C rs530318579 c.503G>A 4 p.R168H rs775006954 c.779T>A 6 p.V260E rs74315345 c.274G>T 1 p.G92C rs74315347 c.538G>A 5 p.V180M rs748812981 c.714G>T 5 p.R238S rs61747728 c.686G>A 5 p.R229Q rs201050491 c.182C>T 1 p.A61V rs61747727 c.725C>T 5 p.A242V Bảng 5. Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu Tên SNP Vị trí trên Exon Vị trí trên mRNA protein rs147672543 c.809T>A 5 p.L270X rs869312746 c.115C>T 1 p.Q39X rs755972674 c.385C>T 3 p.Q129X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X rs12568913 c.586C>T 5 p.R196X rs778055996 c.643C>T 5 p.Q215X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. 3.4. TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU Trong tổng số 251 SNP chúng tôi xác định được trên 6 exon đầu của gen NPHS2, chỉ có 7 SNP xuất hiện alen đột biến. Tần số kiểu gen và tần số alen được thống kê ở Bảng 6, các SNP còn lại có kiểu gen giống nhau ở tất cả 149 bệnh nhân. Bảng 6. Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến SNP Tần số kiểu gen Tần số alen Giá trị p Đồng Dị hợp Đồng Alen Alen hợp hợp đột kiểu đột kiểu dại biến dại biến rs1079292 0,987 0,013 00 0,993 0,007 0,934 rs758564490 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs3738423 0,785 0,201 0,014 0,886 0,114 0,961 rs200437667 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs12401711 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs12401708 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs528833893 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 Thống kê Khi bình phương cho giá trị p > 0.05 chứng tỏ cấu trúc di truyền của các alen này ở người Việt Nam có thể đã trở nên ổn định (ít nhất quần thể 149 bệnh nhân thuộc nghiên cứu này đã có tính đại diện). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Về tối ưu hóa quy trình phân tích 6 exon đầu của gen NPHS2 Đột biến trên gen NPHS2 có liên quan đến tính kháng corticosteroid ở bệnh nhân mắc HCTHTP khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn, bệnh nhân bị tái phát nhiều lần ngay cả khi đã ghép thận. Vì vậy, trên thế giới, nghiên cứu di truyền ở bệnh nhân mắc HCTHTP được đặc biệt quan tâm và đã có những kết quả nhất định trong việc xác định các đột biến gen liên quan. Quy trình phân tích gen NPHS2 trong nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo các bước sau: tách chiết ADN tổng số, PCR nhân dòng 6 exon, giải trình tự, phân tích kết quả. Trong đó, sau mỗi bước chúng tôi có tiến hành kiểm tra chất lượng các sản phẩm thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose hoặc đo quang. Tách chiết ADN là bước đầu tiên quan trọng của quy trình thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử. ADN tách chiết được phải đảm bảo không bị đứt gãy, không nhiễm tạp chất để đảm bảo độ chính xác cho kết quả PCR và giải trình tự gen. Kết quả chúng tôi thu dược, tất cả mẫu ADN của bệnh nhân sau tách chiết được đo trên máy quang phổ kế Nano-drop ở bước sóng 260/280nm đều có nồng độ cao và độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,7  2,1. Kết quả tách chiết ADN ổn định và có tính lặp lại cao, sản phẩm ADN tổng số đạt yêu cầu về độ tinh sạch. Vì vậy, sản phẩm sau khi tách chiết ADN của chúng tôi rất phù hợp cho các bước tiếp theo trong quy trình nghiên cứu, đảm bảo kết quả chính xác. Phản ứng PCR trong bước tiếp theo là phản ứng quan trọng để khuếch đại đoạn gen cần phân tích. Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN- polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: sợi khuôn ADN, hai đoạn mồi, các loại nucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), môi trường đệm và enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq). Ngoài ra còn các yếu tố khác ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm PCR nhiệt độ nóng chảy của mồi, thời gian và số lượng chu kì phản ứng PCR hay yêu cầu về thiết bị và dụng cụ. Trong nghiên cứu này do điều kiện cho phép, chúng tôi tiến hành tối ưu 3 yếu tố liên quan đến phản ứng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. nhân dòng 6 exon thuộc gen NPHS2 là: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn bởi các lý do sau. Thứ nhất, nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào số lượng mỗi bazơ nitơ A, T, G, C trong mỗi cặp mồi và thường được công ty cung cấp cặp mồi khuyến cáo. Nghiên cứu của Basiratnia (2013) chọn nhiệt độ gắn mồi cho exon 5 là 52oC và cho các exon 1, 2, 6, 7 là 60oC [17]. Vì vậy, khi tiến hành phản ứng PCR cho 6 exon mà mỗi exon chọn nhiệt độ khác nhau sẽ làm cho quy trình trở nên phức tạp. Chúng tôi đã tiến hành tối ưu lựa chọn một nhiệt độ gắn mồi chung cho cả 6 exon mà đảm bảo kết quả phản ứng PCR. Thứ hai, nồng độ mồi nếu thêm quá nhiều sẽ làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau. Ngược lại, nồng độ mồi thấp lại làm giảm hiệu suất PCR. Vì thế, đây là yếu tố quan trọng đảm bảo độ chính xác cho phản ứng nhân dòng. Cuối cùng, kết quả tách chiết ADN đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch cho phản ứng PCR, tuy nhiên lại có sự biến thiên đa dạng về nồng độ giữa các mẫu. Chính vì vậy, trong quá trình thực hiện PCR, tối ưu nồng độ ADN khuôn là điều cần thiết. Quy trình PCR chúng tôi xây dựng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: biến tính ở 95 oC – 3 phút, 35 chu kỳ (biến tính ở 95 oC trong 30s, gắn mồi ở 56 oC trong 30s, và kéo dài chuỗi ở 72 oC trong 1 phút) và tổng hợp cuối ở 72 oC trong 5 phút với nồng độ mồi là 0,3 pmol/µl và nồng độ ADN khuôn là 50 - 100 ng/ µl. Thí nghiệm PCR có sử dụng đối chứng âm đều cho kết quả âm tính chứng tỏ sản phẩm PCR hoàn toàn tinh sạch, không bị nhiễm các ADN ngoại lai. Kích thước các băng cần phải phù hợp với kích thước lý thuyết theo trình tự được niêm yết trên Ngân hàng gen quốc tế. Các băng ADN từ sản phẩm PCR gọn, sáng và đặc hiệu (chỉ xuất hiện một băng duy nhất) là tiêu chuẩn cho sản phẩm PCR có chất lượng tốt và hoàn toàn tinh sạch, có thể sử dụng cho giải trình tự gen. Cho đến nay, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm. Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu. Chúng tôi đã cố gắng đơn giản hóa quy trình nhằm đưa quy trình có thể sử dụng tại các phòng khám và cơ sở nghiên cứu có thiết bị phù hợp. ADN được tách từ mẫu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. máu toàn phần, là dạng mẫu dễ thu thập tại các cơ sở khám chữa bệnh. Việc tối ưu được các điều kiện như vậy có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng thực tế vì tiết kiệm được thời gian và công sức thao tác. Áp dụng phân tích trên 149 bệnh nhân cho thấy quy trình phân tích gen của chúng tôi có tính ổn định, dễ dàng lặp lại với độ chính xác cao. Quy trình được xây dựng trong nghiên cứu này sẽ là công cụ hỗ trợ các nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen NPHS2 và HCTH, một mảng nghiên cứu vẫn cần bổ sung thêm nhiều dẫn liệu và hoàn toàn chưa được đánh giá ở Việt Nam. 4.2. Về phân tích kết quả SNP xác định được trên 6 exon Dựa vào kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu trên NCBI, chúng tôi xác định được 251 SNP trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 và 2 đột biến mới trên exon 2 và exon 3. Trên thế giới, đã có nhiều công bố về giải trình tự toàn bộ exon của gen NPHS2, tuy nhiên, đây là lần đầu tiên chúng tôi công bố về giải trình tự toàn bộ exon trên gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc hội chứng thận hư tiên phát. Nghiên cứu ở trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid không có tiền sử gia đình cho thấy khả năng liên quan giữa một số đột biến gen NPHS2 đến tiên lượng kém thuận lợi của những bệnh nhân này [14]. Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư ở Nam Ấn Độ phát hiện 4 đột biến NPHS2 là rs74315345, rs869025495, rs74315342 và rs74315346, chỉ xuất hiện trong nhóm kháng corticoid mà không xuất hiện trong nhóm nhạy cảm với corticoid [15]. Ở Việt Nam, chúng tôi khuyến nghị mở rộng thực hiện các nghiên cứu tiếp theo kết hợp với các dữ liệu cận lâm sàng và lâm sàng về HCTHTP để đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền NPHS2 đối với đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị HCTH. Chúng tôi cũng xác định được một số SNP thuộc nhóm đột biến sai nghĩa và vô nghĩa. Theo nhiều nghiên cứu trước đây trên thế giới, đột biến sai nghĩa là nhóm đột biến xuất hiện nhiều nhất trong các đột biến của NPHS2. Trong đó, đột biến rs74315342 (tên khác là c.413G>A hay p.R138Q) trên exon 3 là đột biến thường gặp nhất ở Châu Âu [54]. Axit amin arginine ở vị trí 138 đóng vai trò quan trọng trong bảo toàn cấu trúc và chức năng của podocin trên màng đáy cầu thận [21]. Vì vậy, sự thay thế nucleotit G bằng A dẫn đến sự thay thế của glutamine cho arginine đã làm mất khả năng giữ lại @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. nephrin và mất tính toàn vẹn của màng lọc cầu thận [37]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng tìm thấy sự xuất hiện của đột biến này. Các đột biến gen mã hóa protein podocin được giữ lại trong mạng lưới nội chất cũng được chứng minh là các đột biến sai nghĩa khác như: p.P118L (c.353C> T), p.D160G (C.479A> G), p.R168S (c.502C> A), p.R168C (c.502C> T), p.R168H (C.503G> A), và p.V260E (c.779T> A) [62]. Mặt khác, một số đột biến sai nghĩa dẫn đến các đột biến của podocin nhắm mục tiêu đúng vào màng tế bào. Các đột biến gây hại bằng việc ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng của protein làm thay đổi đặc tính báo hiệu và/ hoặc thay đổi tương tác với các protein khác trên màng lọc cầu thận [57]. Các đột biến sai nghĩa không chỉ giới hạn ở một vài exon cụ thể mà phân bố trong suốt chiều dài của gen. Do đó, các miền chức năng khác nhau của podocin đều bị ảnh hưởng [62]. Trong số các đột biến sai nghĩa, 3 đột biến đã được công bố trong cơ sở dữ liệu giải trình tự p.V290M (C.868G> A) và p.V180M (c.538G> A) với tần suất 1/13006 alen (0.008%), và p.R138Q (c.413G> A) với tần số 8/13006 (0.06%), được cho là thường gặp hơn các đột biến sau này ở các bệnh nhân [20]. Nhóm đột biến thứ hai được xác định trên gen NPHS2 là đột biến vô nghĩa. Tổng hợp từ các nghiên cứu trước, mười bảy đột biến vô nghĩa đã được mô tả, trong đó có 4 đột biến mới (p.S46X [c.137C> A], p.Q219X [c.655C> T], p.R229X [C.685C> T], và p.L270X [c.809T> A]). Các đột biến khác đã mô tả trước đây là: p.Q39X (c.115C> T), p.R71X (c.211C> T), P.E87X (c.259G> T), p.W122X (c.366G> A), p.Q129X (c.385C> T) P.R138X (c.412C> T), p.Y162X (c.486C> A), p.R196X (c.586C> T) P.Q215X (c.643C> T), p.E237X (c.709G> T), p.E264X (c.790G> T) P.K289X (c.865A> T), và p.R322X (c.964C> T). Xét nghiệm invitro đã chỉ ra protein đột biến p.R138X (c.412C> T) gây mất khả năng giữ lại nephrin trên màng đáy cầu thận [37]. Mặt khác, phản ứng khuếch đại gen khi sinh thiết thận của bệnh nhân mang đột biến p. R138X (C.412C> T) không thể phát hiện sản phẩm chứng tỏ đột biến làm phân hủy mRNA [20, 21]. Nghiên cứu của Karim Bouchireb và cộng sự (năm 2013) cập nhật các đột biến trên gen NPHS2 liên quan đến HCTH kháng corticosteroid, các đột biến thêm hay mất bớt nucleotit đã xác định được bao gồm 11 đột biến chèn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. thêm và 26 đột biến xóa những đoạn gen ngắn. Trong số đó có 3 đột biến gây lệch khung đọc. Đột biến thêm và mất nucleotit rải rác toàn bộ chiều dài gen mã hóa podocin, tuy nhiên, những đột biến mất nucleotit tập trung ở vùng PHB và đầu C-terminal. Chỉ có 4 đột biến mất nucleotit là: p.Pro89ArgfsX13 (c.264 265del), (p.P45RfsX54 [C.134del], p.E56GfsX43 [c.167del], và p.L84WfsX15 [c.249del]) ở exon đầu tiên có ảnh hưởng đến đầu N của podocin. Nghiên cứu của chúng tôi không thấy sự xuất hiện của những đột biến này, có thể do kích thước quần thể nghiên cứu vì đây là những đột biến có tần số thấp hoặc có thể đây là những đột biến liên quan đến chủng tộc và địa dư mà chưa được chứng minh rõ. Ngoài các đột biến thuộc 6 exon đầu, nhiều nghiên cứu khác về các đột biến thuộc vùng intron và đột biến mã kết thúc đã được xác định. Mười sáu đột biến làm thay đổi vị trí cắt đã được mô tả trong các nghiên cứu bao gồm: 275-1G> C, 275-2A> C, 378> 1G> A, 378> 5G> A, 379-1G> C, 451 + 2T> A, 451 + 3A> T, 452-2A> C, 534 + 1G> T, 535-1G> T, 794 + 5G> T, 873 + 5G> A, 873 + 2T> A, 873> 1G> A, 874-1G> C, và 874-2A> G. Tuy nhiên cả đều được cho là nguyên nhân gây bệnh. Phần lớn các đột biến tại vị trí cắt ảnh hưởng đến intron 3 và 7 (58% tất cả các đột biến tại vị trí cắt). Đột biến mới p.X384QextX7 (c.1150T>C) được tìm thấy gần đây trong nghiên cứu của Bouchireb. Trong đột biến này, sự thay thế 1 base đơn lẻ trong stop codon tạo ra khung đọc mở dài hơn, kết quả là tạo ra protein với hơn 390 axit amin dẫn đến sự biểu hiện quá mức của podocin trong tế bào chân giả. Vì vậy, những nghiên cứu thực nghiệm trong tương lai là cần thiết để đánh giá hậu quả chức năng do đột biến đơn lẻ này. Việc xác định tần số kiểu gen và tần số alen của các đa hình di truyền xuất hiện alen đột biến này sẽ góp phần vào việc xác định SNP tiềm năng cho mối liên quan giữa đa hình di truyền gen NPHS2 với HCTHTP kháng corticoid trên quẩn thể người Việt Nam. Trong 149 bệnh nhân nghiên cứu, ngoài hai đột biến mới nằm trên exon 2 và exon 3, chúng tôi thấy có 7 SNP có tính đa hình trên exon 1 - 4 là rs1079292, rs758564490, rs3738423, rs200437667, rs12401711, rs12401708 và Rs528833893; exon 5, 6 có tính đồng hình. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Hasan Otukesh trên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. 20 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng corticoid tại bệnh viện Ali Asghar (Iran) và nghiên cứu của Maruyama trên cả 8 exon ở 36 trẻ em Nhật Bản mắc HCTH kháng corticosteroid [32, 50]. Trong nghiên cứu của Yu năm 2005 trên 23 bệnh nhân người Trung Quốc, có một trường hợp đột biến mất dị hợp tử ở 7 đa hình: 51G>T, 288C>T, IVS3-46C>T, IVS3-21C>T, IVS7- 74G>C, 954T>C và 1038A>G xảy ra với cả bệnh nhân và nhóm đối chứng [67]. Nghiên cứu về HCTH kháng corticosteroid đối với một số nhóm người châu Âu cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến gen NPHS2 từ 12-19% [26, 58, 65]. Ở một nghiên cứu khác, những đột biến của gen NPHS2 là phổ biến ở trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid không có tiền sử gia đình đưa ra khả năng giải thích cho tiên lượng kém thuận lợi đối với những bệnh nhân này [16]. Nghiên cứu trên 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư ở Nam Ấn Độ phát hiện 4 đột biến trong gen NPHS2 là G92C, P118L, R138Q và D160G trong nhóm kháng corticoid (chiếm 18,5%) còn nhóm nhạy cảm với corticoid thì không thấy đột biến xuất hiện [39]. Azocar M cùng cộng sự đã phân tích gen NPHS2 ở 34 trẻ em Chile mắc hội chứng thận hư kháng corticoid, phát hiện 7 bệnh nhân có đột biến (chiếm 21%) trong đó 6 bệnh nhân là dị hợp tử đột biến R229Q và 1 bệnh nhân đột biến A284V [15]. Nội dung trong khóa luận này là một phần thuộc nghiên cứu lớn của chúng tôi. Đây là bước đầu trong việc xác định các SNP có ý nghĩa trên quần thể người Việt Nam mắc HCTHTP, từ đó tìm hiểu mối liên quan giữa di truyền là đặc điểm lâm sàng cũng như các chỉ số hóa sinh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  48. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Từ những kết quả đạt được, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: - Chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân tích gen cho exon 1 đến 6 thuộc gen NPHS2 sử dụng mẫu máu toàn phần với các điều kiện đã được tối ưu hóa cho phản ứng PCR: nhiệt độ gắn mồi là 56oC, nồng độ mồi là 0,3 pmol/µl và nồng độ ADN khuôn trong khoảng 50 - 100 ng/µl. - Áp dụng thành công quy trình phân tích gen trên 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát. Qua đó xác định được 251 SNP và 2 đột biến mới. Tần số alen các SNP xuất hiện đột biến được thống kê và so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy – Weinberg đều cho giá tri p > 0,05. 4.2. KIẾN NGHỊ - Thực hiện các nghiên cứu tiếp theo đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền gen NPHS2 với đáp ứng thuốc corticosteroid trong điều trị hội chứng thận hư. - Xây dựng quy trình phân tích gen với 2 exon còn lại và vùng không mã hóa protein của gen NPHS2 để xác định thêm các đa hình có khả năng ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc corticosteroid. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  49. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bệnh viện Nhi Trung Ương (2006), "Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trẻ em". 2. BioMedia Việt Nam Đa hình đơn nucleotide – Công cụ sử dụng trong di truyền học ở người, truy cập ngày 01 - 03-2018, tại trang web dung-trong-di-truyen-hoc-o-nguoi.html. 3. Đinh Đoàn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 325-355. 4. Hà Phan Hải An (2015), "Hội chứng thận hư", Bệnh học nội khoa, tập 1, Nhà xuất bản Y học. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học. 6. Hoàng Hà Kiểm (2010), "Thận học lâm sàng", Nhà xuất bản Y học. 7. Khuất Hữu Thanh (1997), "Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen", Nhà xuất bản KHKT HN. 8. Lê Nam Trà (2009), "Hội chứng thận hư tiên phát", Bài giảng Nhi khoa, tập 2, Nhà xuất bản Y học. 9. Lê Thị Nhiên (2016), Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở bệnh nhân đặt Stent động mạch vành qua da, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội. 10. Nguyễn Gia Khánh (2013), "Bài giảng Nhi khoa", tập 2. 11. Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét về đặc điểm lâm sàng và sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc ở trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Trường Đại học Y Hà Nội. 12. Trần Đình Long (1995), "Một số biến chứng của liệu pháp corticoid trong điều trị hội chứng thận hư ở trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, 4 (2&3), tr. 50-51. Tiếng Anh 13. Andolino TP and Reid-Adam J (2015), "Nephrotic syndrome", Pediatrics in Review, 36(3), pp. 117–126. 14. Arbeitsgemeinschaft fur Pädiatrische Nephrologie (1988), "Short versus standard prednisone therapy for initial treatment of idiopathic nephrotic syndrome in children", Lancet, 1, pp. 380 –383. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. 15. Azocar M, Vega A et al (2016), "NPHS2 Mutation analysis study in children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Rev Chil Pediatr, 87(1), pp. 31-6. 16. Bakr A Yehia S, El-Ghannam D and et al (2008), "NPHS2 mutations", Indian J Pediatr, 75, pp. 135-8. 17. Basiratnia. M., Yavarian. M. and Torabinezhad. S. (2013), "NPHS2 Gene in Steroid-resistant Nephrotic Syndrome Prevalence, Clinical Course, and Mutational Spectrum in South-West Iranian Children", Iran J Kidney Dis, 7(5), pp. 357-62. 18. Berdeli A, M.S. et al ( 2007), "NPHS2 (podocin) mutations in Turkish children with idiopathic nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 22, pp. 2031-2040. 19. Bernward Hinkes, C.V. et al (2008), "Specific Podocin mutations correlate with age of onset in Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 19, pp. 365-371. 20. Bouchireb K, Boyer O and Gribouval O (2013), "NPHS2 mutations in steroid-resistant nephrotic syndrome: a mutation update and the associated phenotypic spectrum", Hum Mutat, 35(2), pp. 178-86. 21. Boute N, Gribouval O and Roselli S (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid- resistant nephrotic syndrome", Nat Genet, 24(4), pp. 349-54. 22. Budowle B., Adams D.E. and Allen R.C (1994), "Fragment-length polymorphisms for forensic science applications", Methods in nucleic acids research, pp. 181-202. 23. Buscher AK and Weber S ( 2012), "Educational paper: the podocytopathies", Eu J Pediatr, 171 (8), pp. 1151-60. 24. Butler J.M (2001), "Biology and Technology behind STR marker", Forensic DNA Typing, Academic Press, London. 25. Caridi G, Bertelli R and Carrea A (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroid- resistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephrol, 12 (12), pp. 2742-6. 26. Caridi G, Bertelli R et al (2003), "Broadening the spectrum of diseases related to podocin mutations", J Am Soc Nephrol, 14, pp. 1278‐86. 27. Chanchlani R and Parekh RS (2016), "Ethnic differences in childhood nephrotic syndrome", Front Pediatrics, DOI: 10.3389/fped.2016.00039. 28. Dedi Rachmadi, A.M. and Leo Monners (2015), "Gene Mutation and Polymorphisms in Indonesian Chhildren with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp. 27-33. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 29. Dusel JA, Burdon KP and Hicks PJ (2005), "Identification of podocin (NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic end- stage renal disease", Kidney Int, 68(1), pp. 256-62. 30. Eddy AA and Symons JM (2003), "Nephrotic syndrome in childhood", Lancet, 362(9384), pp. 629–639. 31. HabibR (1993), "Nephrotic syndrome in the 1 st year of life", Inserm U, Hospital Necker – Enfant Malades, Paris, France, 7(4), pp. 347- 353. 32. Hasan Otukesh, B.G. et al (2009), "NPHS2 Mutations in Children with Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", Iranian Journal of Kidney Diseases, 3, pp. 99-102. 33. Hee Gyung Kang and H.I.C (2015), "Nephrotic syndrome: What’s new, what’s hot?", Korean J Pediatr 58, pp. 275-282. 34. Hee Yeon Cho, Joo Hoon Lee and Hyun Jin Choi (2008), "WT1 and NPHS2 mutations in Korean children with steroid resistant nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 23, pp. 63-70. 35. Hinkes B, Wiggins RC et al (2006), "Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible", Nat Genet, 38, pp. 1397–1405. 36. Hinkes BG, Mucha B and ) Vlangos CN (2007), "Nephrotic syndrome in the first year of life: Two thirds of cases are caused by mutations in 4 genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2)", Pediatrics, 119, pp. 907–919. 37. Huber TB, Simons M and Hartleben B (2003), "Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Hum Mol Genet, 15;12(24), pp. 3397-405. 38. International Study of Kidney Disease in Children (1981), Primary nephrotic syndrome in children: Clinical significance of histopathologic variants of minimal change and of diffuse mesangial hypercellularity, A Report of the International Study of Kidney Disease in Children. 39. Jaffer A, Unnisa W et al (2014), "NPHS2 mutation analysis and primary nephrotic syndrome in southern Indians", Nephrology, 19(7), pp. 398-403. 40. Joshi S, A.R. et al (2013), "Genetics of steroid resistant nephritic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing", Acta Paediatr, 102(9). 41. Kalman Tory, Dora K Menyhard et al ( 2013), "Mutation dependent recessive inheritance of NPHS2 associated steroid resistant nephritic syndrome", Nature Genetics, 46(3), pp. 299-304. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. 42. Karle SM, Uetz B and Ronner V (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13(2), pp. 388-93. 43. Karle SM, Uetz B et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13 pp. 388 –393. 44. Kitamura A, Tsukaguchi H et al (2006), "Genetics and Clinical Features of 15 Asian Families with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome.", HealthNephrology Dialysis Transplantation, 21, pp. 3133- 3138. 45. Kosskimies O, V.J et al (1982), "Long-termoutcome of primary nephrotic syndrome", Archives of Diseasein Chilhood 57, pp. 544-548. 46. Kruglyak. L and Nickerson. D.A (2001), "Variation is the spice of life", Nature Genetics, 27, pp. 234–236. 47. Kwok PY and Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol, 5(2), pp. 43-60. 48. Lombel. R. M., Hodson. E. M. and Gipson. D. S. (2012), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", Pediatr Nephrol, 2304(8). 49. Maddalena Gigante, Matteo Piemontese et al (2011), "Molecular and Genetic Basic of Inherited nephrotic syndrome ", International Journal of Nephrology, 2011, pp. 1-15. 50. Maruyama K, Iuima K et al (2003), "NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant nephrotic syndrome in Japanese children", Pediatr Nephrol, 18, pp. 412‐6. 51. Mitra Basiratnia, M.Y. et al (2013), "NPHS2 gene in Steroid resistant nephritic syndrome. Prevelance, clinical course, and mutational spectrum in South West Iranian children", IJKD, 7, pp. 357-362. 52. Nelson (2000), "Nephrosis", Textbook of Pediatrics, 1129-1133. 53. Nephrotic Syndrome: Pathophysiology, Treatment, Complications, Differential Diagnoses (2017), accessed 01 - 03-2018, from web treatment-pathophysiology-complications-differential-diagnosis.html. 54. Patrick Niaudet (2004), "Podocin and Nephrotic Syndrome: Implications for the Clinician", Journal of the American society of Nephrology, 15, pp. 832-834. 55. Pereira AC, Pereira AB and Mota GF (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney Int, 65(3), pp. 1026-30. 56. Ren Q and Y.S (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal 4, pp. 30-33. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. 57. Roselli S, Moutkine I and Gribouval O (2004), "Plasma membrane targeting of podocin through the classical exocytic pathway: effect of NPHS2 mutations", Traffic, 5(1), pp. 37-44. 58. Ruf RG, Lichtenberger A and Karle SM et al (2004), "Patients with mutations in NPHS2 (podocin) do not respond to standard steroid treatment of nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol 15, pp. 722 –732. 59. Schumacher V, Scharer K et al (1998), "Spectrum of early onset nephrotic syndrome associated with WT1 missense mutations", Kidney Int, 53, pp. 1594–1600. 60. Severine Roselli, Imane Moutkine et al (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", TRafic, 5, pp. 37-44. 61. Snustad D. P. and Simmons M. J. (2012), "The human Hapmap project", Principle of genetics, John Wiley & Sons, Inc, 414-415. 62. Stefanie Weber, Oliver Gribouval and Ernie L (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid-resistant nephrotic syndrome and low post-transplant recurrence", Kidney International, 66(2004), pp. 571–579. 63. Tsukaguchi H, Yager H and Dawborn J (2000), "A locus for adolescent and adult onset familial focal segmental glomerulosclerosis on chromosome 1q25-31", J Am Soc Nephrol, 11(9), pp. 1674-80. 64. A. Vignal and et al (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE, 34(3), pp. 275-305. 65. Weber S Gribouval O, Esquivel EL and et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and low post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp. 571-579. 66. What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? , accessed 03 - 01- 2018, from web 67. Yu Sy Ren Q (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4(30-33). 68. Zenker M, Tralau T et al (2004), "Congenital nephrosis, mesangial sclerosis, and distinct eye abnormalities with microcoria: An autosomal recessive syndrome", Am J Med Genet A, 130, pp. 138–145. 69. Zihua Yu, Jianping Huang et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid – resistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrol Dial Transplant, 20, pp. 902-908. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Quy trình tách chiết ADN tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit 1. Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất ở nhiệt độ phòng. 2. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống ly tâm vô trùng. 3. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex trong 10 giây. 4. Ủ 65oC trong 10 phút. Chú ý: Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây. 5. Thêm 260 µl Ethanol 100%, vortex trong 20 giây. 6. Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống. 7. Chèn HiBind ADN Mini Column vào Collection Tube 2ml. 8. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl). 9. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 10. Bỏ dịch lọc và Collection Tube. 11. Lắp HiBind ADN Mini Column vào Collletion Tube 2ml mới. 12. Thêm 500 µl HBC Buffer. 13. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 14. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube 15. Thêm 700 µl ADN Wash Buffer. 16. Ly tâm trong 1 phút ở 10.000g 17. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube. 18. Lặp lại các bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ 2 với ADN Wash Buffer. 19. Ly tâm HiBind ADN Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô cột. 20. Chuyển HiBind ADN Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới. 21. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 65oC). Ủ 65oC trong 5 phút. 22. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 23. Thêm 50 µl Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 24. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút. 25. Thu vào bảo quản ADN ở -20oC. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. Phụ lục 2. Quy trình kiểm tra chất lượng ADN thông qua điện di Bước 1: Chuẩn bị gel agarose Pha Agarose trong bột đệm TAE 1X để đạt được nồng độ dung dịch gel agarose 1,5%. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo các giếng nhỏ. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra đặt bản gel vào bể điện di ở tư thế nằm ngang. Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1- 2 mm. Bước 2: Tra mẫu ADN Mẫu ADN được trộn với ADN dye 6X (chất này chứa hai chất nhuộm màu khác nhau: bromophenol xanh và xylene cyanol FF để theo dõi trực quan sự di chuyển trên bản gel trong điện trường, 5µl ADN mẫu và 5µl ADN thang chuẩn Lambda/Hind III Marker được tra vào các giếng. Bước 3: Chạy điện di Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 70V trong 60 phút. ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào dừng điện di. Bản gel được lấy nhẹ khỏi khuôn soi và ghi hình dưới ánh sáng tử ngoại. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. Phụ lục 3. Kết quả đo OD của các mẫu ADN STT OD A260/A280 STT OD A260/A280 STT OD A260/A280 1 85,6 1,877 51 112,8 1,932 104 76,55 1,803 2 89,95 1,849 52 169,4 1,916 105 179,55 1,872 3 186 1.931 53 105,3 1,975 106 138,1 1,843 4 62,55 1,853 54 90,5 2,025 107 101,0 1,796 5 58,05 1,797 55 87,5 1,91 108 58,05 1,932 6 59 1,832 56 80 1,82 109 108,5 1,869 7 35,4 1,723 57 60 1,862 110 97,1 1,873 8 57,05 1,84 58 106 1,859 111 130,35 1,873 9 88 1,833 59 59,1 2,017 112 61,15 2,347 10 49,4 1,83 60 89,3 1,882 113 95,65 1,838 11 72,1 1,828 61 156,5 1,854 114 77,95 2,23 12 64,1 1,834 62 51,05 1,782 115 231,05 1,876 13 66,8 1,838 63 202 1,852 116 65,85 2,335 14 83,5 1,835 64 65 1,898 117 94,4 1,855 15 34,9 1,776 65 164,8 1,865 118 110,75 1,819 16 75,3 1,848 66 82,85 2 119 101,4 1,829 17 129,7 1,837 67 353,65 1,858 120 143,6 1,859 18 55,7 1,814 68 95,95 2,016 121 53,2 1,921 19 105,9 1,827 70 128,7 2 122 58,65 2,026 20 65 1,86 71 94 1,891 123 71,7 1,846 21 123,9 1,892 72 78,9 1,779 124 133,4 1,849 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  57. 22 119,3 1,856 73 72,25 1,899 125 140,55 1,851 23 125,7 1,852 75 151,55 1,865 126 61,65 1,819 24 65,1 1,852 76 90,6 1,872 127 49,7 1,807 25 31,7 1,761 78 166,4 1,85 128 57,8 1,806 26 160,3 1,829 79 96,65 1,91 129 93,55 1,849 27 61,35 1,771 80 110,85 1,882 130 69,25 1,976 28 68,55 1,876 81 67,85 1,829 131 89,55 1,916 29 87,2 1,91 82 149,75 1,871 132 32,95 2,175 30 125,2 1,886 83 95,7 1,935 133 77,7 1,962 31 115,9 1,905 84 68,7 1,893 134 46,1 1,851 32 120,9 1,914 85 90,95 1,839 135 128,7 1,925 33 77,4 1,972 86 163,4 1,846 136 77,85 1,91 34 34,65 2,126 87 47,3 1,87 137 121,55 1,846 35 74,95 1,949 88 83,95 1,833 138 58,2 1,836 36 105,3 1,903 89 66,6 1,884 139 63,25 2,014 37 282,3 1,866 90 146,5 1,884 141 65,3 2,047 38 92,45 1,938 91 126,25 1,93 143 84,45 1,868 39 157,3 1,862 92 71,4 2,122 144 78,55 1,861 40 184,9 1,883 93 103,8 1,968 145 82,95 1,86 41 91,55 1,942 94 95,1 2,026 146 47,9 1,86 42 189,3 1,908 95 60,15 2,175 147 49,8 1,89 43 126,8 1,836 96 91,55 2,064 148 34,45 1,867 44 128,1 1,911 97 155,35 1,978 149 40,35 1,758 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  58. 45 145,5 1,899 98 104,5 2,057 151 70,5 1,868 46 60,6 2 99 64,4 2,248 152 77,3 1,874 47 95,7 1,957 100 106,1 1,801 153 52,9 1,856 48 63,05 2,002 101 159,1 1,793 154 96,9 1,867 49 112,2 1,902 102 109,9 1,852 155 58,95 1,877 50 146,4 1,901 103 82,8 1,765 156 160,3 1,894 157 200,3 1,880 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU