›

Khóa luận Nghiên cứu xây dựng công thức điều chế thuốc nhỏ mắt gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin

pdf 57 trang thiennha21 18/04/2022 2540
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu xây dựng công thức điều chế thuốc nhỏ mắt gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_xay_dung_cong_thuc_dieu_che_thuoc_nho_m.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu xây dựng công thức điều chế thuốc nhỏ mắt gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƢỢC – ĐIỀU DƢỠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƢỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ MẮT GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN Cán bộ hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. ĐẶNG VĂN NHƢ TÂM PHAN PHƢƠNG THY MSSV: 12D720401168 Lớp: ĐẠI HỌC DƢỢC 7B Cần Thơ, 2017
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƢỢC – ĐIỀU DƢỠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƢỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ MẮT GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN Cán bộ hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. ĐẶNG VĂN NHƢ TÂM PHAN PHƢƠNG THY MSSV: 12D720401168 Lớp: ĐẠI HỌC DƢỢC 7B Cần Thơ, 2017
  3. LỜI CẢM TẠ Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ đại học “Nghiên cứu xây dựng công thức điều chế thuốc nhỏ mắt gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin” đƣợc thực hiện từ 03/2017 đến 06/2017 tại Bộ môn Bào chế, Khoa Dƣợc – Điều dƣỡng trƣờng Đại học Tây Đô, dƣới sự hƣớng dẫn của thầy ThS. Đặng Văn Nhƣ Tâm. Em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất đến thầy ThS. Đặng Văn Nhƣ Tâm đã luôn quan tâm, hƣớng dẫn và truyền đạt kiến thức cũng nhƣ những kinh nghiệm quý báu để giúp em thực hiện và hoàn thành khoá luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS. Nguyễn Thị Thuý Lan đã dành thời gian quý báu để góp ý giúp cho khoá luận đƣợc hoàn thiện hơn. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Dƣợc – Điều dƣỡng trƣờng Đại học Tây Đô đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong thời gian em học tập tại trƣờng. Con xin cảm ơn ba mẹ và gia đình đã quan tâm, động viên và là chỗ dựa vững chắc cho con trong học tập và cuộc sống. Cảm ơn các bạn sinh viên khoá 2012 – 2017, đặc biệt là các bạn sinh viên thực hiện khoá luận học lớp đại học Dƣợc 7B đã động viên, chia sẻ, góp ý và giúp đỡ mình trong quá trình thực hiện khoá luận cũng nhƣ học tập, rèn luyện tại trƣờng. Phan Phƣơng Thy i
  4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chính xác. Phan Phƣơng Thy ii
  5. Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ đại học – Năm học: 2016 – 2017 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ THUỐC NHỎ MẮT GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN Phan Phƣơng Thy Thầy hƣớng dẫn: ThS. Đặng Văn Nhƣ Tâm TÓM TẮT Mở đầu và đặt vấn đề Do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nƣớc mắt, bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc làm cho sinh khả dụng của các thuốc nhãn khoa quy ƣớc (nhƣ thuốc nhỏ mắt) thƣờng rất thấp. Chỉ có khoảng 1 – 3 % lƣợng dƣợc chất có trong liều thuốc đã đƣa vào mắt là thấm qua đƣợc giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng. Vì vậy, việc nghiên cứu để cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa là rất cần thiết. Một trong những biện pháp đƣợc nghiên cứu là tối ƣu hóa công thức bào chế để có thể kéo dài thời gian lƣu của thuốc ở vùng trƣớc giác mạc bằng cách bào chế thuốc nhỏ mắt dƣới dạng in situ gel. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Dung môi tăng độ tan của ofloxacin đƣợc lựa chọn. Thăm dò phối hợp các tá dƣợc với hoạt chất để có đƣợc công thức gel in situ chứa ofloxacin 0,3 % (pH 6,0). Các công thức đƣợc điều chế, sử dụng carbopol phối hợp với các tá dƣợc khác. Các công thức này đƣợc đánh giá về các chỉ tiêu pH, khả năng tạo gel, khả năng chảy lỏng, thử kết dính sinh học. Các công thức tối ƣu đƣợc lựa chọn đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro, đánh giá tính kháng khuẩn. Kết quả và bàn luận Dung dịch đệm citro – phosphat pH 6,0 đƣợc lựa chọn làm dung môi hòa tan ofloxacin. Các công thức gel in situ chứa ofloxacin 0,3 % đƣợc điều chế và đánh giá. Một công thức đã đƣợc lựa chọn. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cho thấy sự kết hợp của carbopol và HPMC khi giọt thuốc tạo thành gel trong mắt có vai trò trong việc cung cấp liều thuốc giải phóng ra một cách hằng định trong quá trình điều trị. Kết luận Công thức gel in situ chứa ofloxacin đã đƣợc điều chế, sử dụng carbopol và các tá dƣợc khác. Các gel in situ này cho thấy quá trình chuyển đổi solgel tốt, không mất đi khả năng kháng khuẩn, khả năng chảy lỏng, độ nhớt, lực bám dính thích hợp và lợi thế trong việc cho tác dụng điều trị hiệu quả. iii
  6. MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. THUỐC NHỎ MẮT 3 2.1.1. Định nghĩa 3 2.1.2. Yêu cầu chung 3 2.1.3. Yêu cầu chất lƣợng 4 2.1.4. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt 5 2.1.5. Thuốc nhỏ mắt chứa ofloxacin 6 2.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ GEL IN SITU 8 2.2.1. Khái niệm 8 2.2.2. Ƣu nhƣợc điểm của gel 9 2.2.3. Phƣơng pháp điều chế 9 2.2.4. Gel in situ 10 2.3. OFLOXACIN 16 2.3.1. Cấu trúc hóa học 16 2.3.2. Tính chất lý hóa 16 2.3.3. Phổ tác động 17 2.3.4. Cơ chế tác động 17 2.3.5. Chỉ định, chống chỉ định, tác dụng không mong muốn 17 2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ GEL IN SITU SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ CÁC BỆNH VỀ MẮT 18 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20 3.1.1. Các vật liệu, hoá chất dung trong bào chế và kiểm nghiệm 20 3.1.2. Thiết bị 20 3.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 21 3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 iv
  7. 3.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.2.1. Xây dựng công thức cơ bản gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin 21 3.2.2. Xây dựng công thức hoàn chỉnh và quy trình điều chế 21 3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá các chỉ tiêu của gel nghiên cứu 22 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. XÂY DỰNG CÔNG THỨC CƠ BẢN GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN 29 4.1.1. Khảo sát nồng độ của carbopol 29 4.1.2. Khảo sát sự phối hợp giữa carbopol và các tá dƣợc hỗ trợ 29 4.2. XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN 37 4.3. ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU CỦA CÁC CÔNG THỨC GEL NGHIÊN CỨU. 40 4.3.1. Cảm quan 40 4.3.2. pH 40 4.3.3. Độ trong 40 4.3.4. Giới hạn kích thƣớc tiểu phân 40 4.3.5. Độ nhớt 40 4.3.6. Thử kết dính sinh học 40 4.3.7. Đánh giá tính kháng khuẩn 41 4.3.8. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro 42 4.3.9. Độ ổn định 43 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1. KẾT LUẬN 44 5.2. ĐỀ NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 v
  8. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADR Adverse Drug Reaction (phản ứng có hại của thuốc) DIG Dung dịch in situ gel HPLC High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPMC Hydroxypropylmethyl cellulose kt/tt Khối lƣợng/ thể tích (nồng độ phần trăm khối lƣợng theo thể tích) NXB Nhà xuất bản PAA Polyacrilamid SD Standard Deviation (độ lệch chuẩn) TT Thuốc thử vđ Vừa đủ VN Việt Nam ̅ Giá trị trung bình ZOI (vùng ức chế vi khuẩn) vi
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Chủng vi khuẩn nhạy cảm với ofloxacin 7 Bảng 2.2. Phân loại chất tạo gel 8 Bảng 2.3. Phân loại tác nhân tạo gel in situ 10 Bảng 3.1. Các nguyên liệu hoá chất dùng trong bào chế và kiểm nghiệm 20 Bảng 3.2. Thiết bị nghiên cứu đƣợc sử dụng trong đề tài 20 Bảng 3.3. Thành phần của giọt nƣớc mắt nhân tạo 23 Bảng 4.1. Công thức thuốc với nồng độ carbopol đƣợc trung hoà bởi triethanolamin . 30 Bảng 4.2. Kết quả khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức A1 – A6 31 Bảng 4.3. Công thức thuốc phối hợp nồng độ carbopol với HPMC 33 Bảng 4.4. Kết quả khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức B1 – B9 34 Bảng 4.5. Kết quả đo độ nhớt tại pH 6,0 35 Bảng 4.6. Kết quả đo độ nhớt tại pH 7,4 36 Bảng 4.7. Thành phần (%) hoạt chất và tá dƣợc trong các công thức hoàn chỉnh 37 Bảng 4.8. Giá trị pH của chế phẩm ở 25 40 Bảng 4.9. Kết quả khả năng kết dính sinh học 40 Bảng 4.10. Kết quả đánh giá tính kháng khuẩn 41 vii
  10. DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Chế phẩm Timoptol XE 2 Hình 1.2. Chế phẩm Systane 2 Hình 2.1. Thuốc nhỏ mắt ofloxacin 6 Hình 2.2. Cơ chế tạo gel hệ nhảy cảm với nhiệt (Rajoria G. and Gupta A., 2012) 11 Hình 2.3. Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm pH (Rajoria G. and Gupta A., 2012) 12 Hình 2.4. Cấu tạo của carbopol 940 12 Hình 2.5. Cơ chế tạo gel do ion hoá (Rajoria G. and Gupta A., 2012) 13 Hình 2.6. Mô hình thử kết dính sinh học gel in situ 15 Hình 2.7. Cấu trúc hoá học của ofloxacin 16 Hình 3.1. Trắc vi thị kính 23 Hình 3.2. Mô hình thử kết dính sinh học gel in situ tự chế 25 Hình 4.1. Các công thức đƣợc trung hoà bằng triethanolamin đã chuẩn bị 30 Hình 4.2. Quan sát trực quan sự hình thành gel trong các công thức A1 – A6 31 Hình 4.3. Các công thức phối hợp với HPMC đã chuẩn bị 32 Hình 4.4. Quan sát trực quan sự hình thành gel trong các công thức B1 – B9 33 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn độ nhớt tại pH 6,0 35 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn độ nhớt tại pH 7,4 36 Hình 4.7. Dung dịch gel in situ ofloxacin thành phẩm 38 Hình 4.8. Lƣu đồ điều chế gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin 39 Hình 4.9. Mô hình đánh giá tính kháng khuẩn 41 Hình 4.10. Mô hình đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro 42 Hình 4.11. Mẫu tại những thời điểm xác định 42 viii
  11. CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU Mắt ngƣời là một phần của não hình thành từ tuần thứ 3 của phôi kỳ dƣới dạng hai túi thị nguyên thủy, phát triển và lồi dần ra phía trƣớc tạo thành võng mạc, thủy tinh thể và các thành phần hoàn chỉnh khác. Mắt là một trong năm giác quan quan trọng, giúp con ngƣời quan sát và kiểm soát môi trƣờng chung quanh. Con ngƣời có khả năng dùng mắt để liên hệ, trao đổi thông tin với nhau thay lời nói. Giác mạc là một mảnh mô mỏng, trong suốt nằm phía trƣớc con ngƣơi mắt, có nhiệm vụ bảo vệ mắt và góp phần vào hoạt động khúc xạ của mắt. Vì là một lớp rất mỏng, lại là bộ phận đầu tiên của mắt tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng bên ngoài nên giác mạc rất dễ bị tổn thƣơng, tạo điều kiện cho vi khuẩn, virus hoặc nấm xâm nhập. Khi giác mạc bị viêm loét sẽ dẫn đến các di chứng và biến chứng nhƣ sẹo giác mạc, teo nhãn, lồi mắt cua và làm giảm thị lực (www.kienthucnhankhoa.com; www.wit-ecogreen.com.vn). Trên thị trƣờng hiện nay đã có nhiều chế phẩm sử dụng cho việc chữa bệnh viêm giác mạc nói riêng và các bệnh về mắt nói chung. Do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nƣớc mắt, bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc làm cho sinh khả dụng của các thuốc nhãn khoa quy ƣớc (nhƣ thuốc nhỏ mắt) thƣờng rất thấp. Chỉ có khoảng 1 – 3 % lƣợng dƣợc chất có trong liều thuốc đã đƣa vào mắt là thấm qua đƣợc giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng (Sinh dƣợc học bào chế, 2009). Vì vậy, việc nghiên cứu để cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa là rất cần thiết. Một trong những biện pháp đƣợc nghiên cứu là tối ƣu hóa công thức bào chế để có thể kéo dài thời gian lƣu của thuốc ở vùng trƣớc giác mạc bằng cách bào chế thuốc nhỏ mắt dƣới dạng gel in situ. Gel in situ với đặc tính tồn tại ở dạng dung dịch và tạo gel khi vào vị trí tác động giúp cho việc phân phối thuốc vào những vị trí sâu một cách dễ dàng. Với mục tiêu điều trị tại chỗ, gel in situ tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây bệnh và đƣa dƣợc chất đến đích tác động gần nhƣ hoàn toàn và duy trì hiệu quả nồng độ cao của thuốc tại vị trí tác động trong thời gian dài (Clyder M. O. et al., 2007). Do đó, hiệu quả trị liệu cao và hầu nhƣ không có hay ít có tác dụng phụ toàn thân. Ofloxacin là một kháng sinh thế hệ 2 nhóm quinolon có tác dụng kháng khuẩn với phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt có hiệu quả cao chống vi khuẩn Gram (-) hiếu khí. Ofloxacin sử dụng điều trị nhiễm trùng mắt do các chủng nhạy cảm của vi khuẩn (Hoá dƣợc tập 1, 2010). Hiện nay trên thị trƣờng đã có các chế phẩm thuốc nhỏ mắt dạng gel in situ nhƣ thuốc nhỏ mắt chứa timolol Timoptol® XE, gel nhỏ mắt dƣỡng ẩm Systane® Đã có các đề tài nghiên cứu về thuốc nhỏ mắt gel in situ nhằm tận dụng các ƣu điểm của hệ tạo gel thuận nghịch, đặc biệt là hệ tạo gel do thay đổi pH. 1
  12. Hình 1.1. Chế phẩm Timoptol XE Hình 1.2. Chế phẩm Systane Xuất phát từ nhu cầu thực tế và góp phần khắc phục những hạn chế của các dạng thuốc nhỏ mắt thông thƣờng chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng công thức điều chế thuốc nhỏ mắt gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin” đƣợc thực hiện với những mục tiêu cụ thể sau: 1. Xây dựng công thức cơ bản gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin. 2. Xây dựng công thức và quy trình điều chế gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin. 3. Đánh giá các chỉ tiêu chất lƣợng của dung dịch gel trong chế phẩm. 2
  13. CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. THUỐC NHỎ MẮT 2.1.1. Định nghĩa Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nƣớc, dung dịch dầu hoặc hỗn dịch vô khuẩn của một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt. Chế phẩm cũng có thể đƣợc bào chế dƣới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, đƣợc hòa tan hoặc phân tán vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng (Dƣợc điển VN IV; Kiểm nghiệm thuốc, 2011). 2.1.2. Yêu cầu chung Thuốc nhỏ mắt phải đạt độ tinh khiết và vô khuẩn cao, đẳng trƣơng với dung dịch nƣớc mắt, có pH gần với pH nƣớc mắt (pH 7,4). Thuốc nhỏ mắt phải đƣợc pha chế – sản xuất trong điều kiện vô khuẩn. Các dụng cụ, thiết bị và đồ đựng dùng trong pha chế sản xuất phải sạch và vô khuẩn. Dung môi để pha chế thuốc nhỏ mắt thƣờng là nƣớc tinh khiết hoặc các dung dịch nƣớc thích hợp hoặc là dầu thực vật trung tính đạt tiêu chuẩn để pha thuốc tiêm. Trong thành phần của thuốc nhỏ mắt có thể có thêm các tá dƣợc, để điều chỉnh độ đẳng trƣơng, độ nhớt, điều chỉnh hay ổn định pH của chế phẩm, tăng độ tan và độ ổn định của hoạt chất, nhƣng không đƣợc ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của thuốc và không gây kích ứng đối với mắt ở nồng độ sử dụng trong chế phẩm. Những chế phẩm thuốc nhỏ mắt nƣớc đóng nhiều liều trong một đơn vị đóng gói phải cho thêm chất sát khuẩn với nồng độ thích hợp, trừ khi tự chế phẩm có đủ tính chất sát khuẩn. Chất sát khuẩn phải không tƣơng kỵ với các thành phần khác có trong chế phẩm và phải duy trì đƣợc hiệu quả sát khuẩn trong thời gian sử dụng chế phẩm kể từ lần mở nắp đầu tiên. Không đƣợc thêm chất sát khuẩn hoặc chất chống oxy hóa vào các thuốc nhỏ mắt dùng cho phẫu thuật ở mắt. Các thuốc nhỏ mắt này phải pha chế – sản xuất trong điều kiện vô khuẩn và đóng gói một liều. Không đƣợc cho thêm chất màu vào thuốc nhỏ mắt chỉ với mục đích nhuộm màu chế phẩm. Đồ đựng thuốc nhỏ mắt phải có đủ độ trong cần thiết để kiểm tra đƣợc bằng mắt độ trong của dung dịch hay độ đồng nhất của hỗn dịch nhỏ mắt chứa trong đó. Đồ đựng thuốc nhỏ mắt phải vô khuẩn và không có tƣơng tác về mặt vật lý hay hóa học 3
  14. với thuốc. Đồ đựng thuốc nhỏ mắt chứa nhiều liều phải có bộ phận nhỏ giọt thích hợp, thể tích mỗi đơn vị đóng gói không nên vƣợt quá 10 mL (Dƣợc điển VN IV). 2.1.3. Yêu cầu chất lƣợng Độ trong (thử theo phụ lục 11.8. phần B, Dƣợc điển VN IV) Dung dịch thuốc nhỏ mắt phải trong suốt, không có các tiểu phân quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Hỗn dịch nhỏ mắt có thể lắng đọng khi để yên nhƣng phải dễ dàng phân tán đồng nhất khi lắc và phải duy trì đƣợc sự phân tán đồng nhất đó trong khi nhỏ thuốc để sử dụng đúng liều. Kích thước tiểu phân (thử theo phụ lục 11.8. phần A, Dƣợc điển VN IV) Nếu không có chỉ dẫn khác, thuốc nhỏ mắt dạng hỗn dịch phải đạt yêu cầu của phép thử sau: Lắc mạnh và chuyển một lƣợng chế phẩm tƣơng đƣơng với khoảng 10 µg pha rắn vào buồng đếm hoặc lên một phiến kính thích hợp và quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại thích hợp. Trong mẫu đo: Không đƣợc có quá 20 tiểu phân có kích thƣớc lớn hơn 25 µm. Không có quá 2 tiểu phân có kích thƣớc lớn hơn 50 µm. Không có tiểu phân nào có kích thƣớc lớn hơn 90 µm. pH pH của dung dịch đem thử phải nằm trong giới hạn quy định (phụ lục 6.2, Dƣợc điển VN IV). Thử vô khuẩn Chế phẩm phải hoàn toàn vô khuẩn nhƣ quy định thuốc tiêm. Tiến hành nhƣ mô tả ở chuyên luận “Thử vô khuẩn” (phụ lục 13.7, Dƣợc điển VN IV). Với chế phẩm có ống nhỏ giọt đi kèm cũng phải kiểm tra độ vô trùng của ống nhỏ giọt. Lấy ống nhỏ giọt ra khỏi đồ bao gói một cách vô trùng rồi chuyển ngay vào ống nghiệm có môi trƣờng nuôi cấy thích hợp. Phải để ống ngập chìm trong môi trƣờng. Để trong tủ nuôi cấy và đánh giá kết quả theo phụ lục 13.7, Dƣợc điển VN IV. Giới hạn cho phép về thể tích Phép thử giới hạn cho phép về thể tích và đánh giá kết quả của thuốc nhỏ mắt đƣợc thực hiện theo phụ lục 11.1, Dƣợc điển VN IV. Giới hạn cho phép của mọi thể tích là + 10 % so với thể tích ghi trên nhãn (phụ lục 11.1, Dƣợc điển VN IV). 4
  15. Thuốc rửa mắt nhiều liều phải đóng gói không quá 200 mL cho 1 đơn vị đóng gói nhỏ nhất (Kiểm nghiệm thuốc, 2011). Các yêu cầu kỹ thuật khác Thử theo quy định trong chuyên luận riêng. 2.1.4. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thƣờng rất thấp (chỉ từ 1 – 3 %). Nguyên nhân do bên cạnh các yếu tố thông thƣờng ảnh hƣởng đến sinh khả dụng nhƣ: đặc tính lý hóa của dƣợc chất, pH của chế phẩm, mức độ đẳng trƣơng với dịch nƣớc mắt, thì cấu tạo sinh lý đặc biệt gồm các lớp thân dầu và thân nƣớc đan xen và cơ chế bảo vệ của hệ thống nƣớc mắt là yếu tố quan trọng làm giảm sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt (Sinh dƣợc học bào chế, 2009). Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ƣớc (Sinh dƣợc học bào chế, 2009; Kỹ thuật bào chế và sinh dƣợc học các dạng thuốc tập 1, 2013): Kéo dài thời gian lƣu thuốc ở vùng trƣớc giác mạc: thêm chất kết dính sinh học, chất làm tăng độ nhớt, bào chế thuốc dƣới dạng hỗn dịch, dạng gel, thuốc mỡ, Tăng tính thấm của giác mạc với dƣợc chất: chất diện hoạt (tween 80, cremophor), tạo ra các tiền thuốc, tạo phức chelat với ion calci (natri edetat). Hiện nay dạng dung dịch nhỏ mắt in situ gel với đặc điểm là tồn tại ở dạng dung dịch ở điều kiện bảo quản và chuyển sang dạng gel trong điều kiện sinh lý ở mắt, đang đƣợc nghiên cứu nhiều với kỳ vọng tăng sinh khả dụng của dung dịch thuốc nhỏ mắt quy ƣớc và khắc phục đƣợc một số nhƣợc điểm của những dạng bào chế khác dành cho nhãn khoa (Agrawal A. K. et al., 2012). DIG tạo gel nhớt trƣớc giác mạc, hạn chế rửa trôi dƣợc chất, kéo dài thời gian lƣu thuốc ở mắt, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, đồng thời giảm số lần sử dụng cho ngƣời bệnh so với dung dịch nhỏ mắt quy ƣớc. DIG là dung dịch dƣợc chất, đảm bảo đồng đều phân liều hơn và hạn chế nhƣợc điểm kém ổn định vật lý của hỗn dịch. DIG không làm mờ, giảm tầm nhìn và khó chịu nhƣ thuốc mỡ. DIG sử dụng nhỏ giọt nhƣ thuốc nhỏ mắt thông thƣờng không gây khó khăn khi dùng nhƣ màng đặt nhãn khoa, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm giải phóng dƣợc chất không hằng định của hệ màng đặt theo cơ chế mài mòn. DIG có phƣơng pháp bào chế đơn giản, ổn định hơn các dạng bào chế mới nhƣ nhũ tƣơng nano, hỗn dịch nano, liposom, 5
  16. 2.1.5. Thuốc nhỏ mắt chứa ofloxacin Hình 2.1. Thuốc nhỏ mắt ofloxacin Dƣợc chất: ofloxacin 0,3 % (0,3 mg/mL). Chất bảo quản: benzalkonium clorid 0,005 %. Chất không hoạt động: NaCl, nƣớc cất và có thể chứa thêm HCl hay NaOH để điều chỉnh pH (www.drugs.com). 2.1.5.1. Chỉ định Đƣợc chỉ định để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi các chủng nhạy cảm của các vi khuẩn liệt kê ở phổ kháng khuẩn (www.drugs.com). 2.1.5.2. Dược lực học Ofloxacin đƣợc cho là có tác dụng diệt khuẩn trên các tế bào vi khuẩn nhạy cảm bằng cách ức chế DNA gyrase, một enzyme vi khuẩn thiết yếu là một chất xúc tác quan trọng trong việc sao chép, sao chép và sửa chữa DNA của vi khuẩn (www.drugs.com). 2.1.5.3. Dược động học Nồng độ huyết thanh, nƣớc tiểu và nƣớc mắt của ofloxacin đƣợc đo ở 30 phụ nữ khỏe mạnh ở các thời điểm khác nhau trong suốt 10 ngày điều trị bằng thuốc nhỏ mắt ofloxacin. Nồng độ trung bình ofloxacin huyết thanh dao động từ 0,4 ng/ml đến 1,9 ng/mL. Nồng độ ofloxacin tối đa tăng từ 1,1 ng/mL vào ngày đầu tiên đến 1,9 ng/ml vào ngày thứ 10 sau khi dùng thuốc. Nồng độ ofloxacin huyết thanh tối đa sau 10 ngày dùng liều nhãn khoa ít hơn gấp 1000 lần so với báo cáo sau khi dùng ofloxacin. 6
  17. Nồng độ mô giác mạc 4,4 mcg/mL đƣợc quan sát thấy trong 4 giờ sau khi bắt đầu dùng hai giọt thuốc ofloxacin mỗi lần 30 phút. Ofloxacin đã đƣợc bài tiết trong nƣớc tiểu chủ yếu không thay đổi (www.drugs.com). 2.1.5.4. Phổ kháng khuẩn Ofloxacin có hoạt tính in vitro chống lại một loạt các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí Gram âm và Gram dƣơng. Ofloxacin có hoạt tính diệt khuẩn ở nồng độ tƣơng đƣơng hoặc cao hơn một chút so với nồng độ ức chế. Ofloxacin đã đƣợc chứng minh là hoạt động chống lại hầu hết các chủng của các sinh vật sau đây trong viêm màng kết mạc và/hoặc viêm giác mạc (www.drugs.com). Bảng 2.1. Chủng vi khuẩn nhạy cảm với ofloxacin Viêm màng kết mạc Vi khuẩn Gram dƣơng: Vi khuẩn Gram âm: Staphylococcus aureus Enterobacter cloacae Staphylococcus epidermidis Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Viêm giác mạc Vi khuẩn Gram dƣơng: Vi khuẩn Gram âm: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Các loài kỵ khí: Propionibacterium acnes 2.1.5.5. Liều dùng Ngƣời lớn và trẻ em (trên 1 tuổi): Viêm màng kết mạc: Ngày 1 và 2: từ 1 đến 2 giọt mỗi 2 đến 4 giờ. Ngày 3 đến 7: từ 1 đến 2 giọt cho 4 lần một ngày. Viêm giác mạc: 7
  18. Ngày 1 và 2: từ 1 đến 2 giọt mỗi 30 phút trong khi tỉnh táo và khoảng 4 và 6 giờ khi nghỉ ngơi. Ngày 3 đến 7: từ 1 đến 2 giọt mỗi giờ khi thức. Ngày 7 đến 9 thông qua điều trị: từ 1 – 2 giọt 4 lần một ngày (www.drugs.com). 2.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ GEL IN SITU 2.2.1. Khái niệm Gel đƣợc định nghĩa là một hệ bán rắn trong đó sự chuyển động của môi trƣờng phân tán bị giới hạn bởi mạng không gian ba chiều với nhiều liên kết vật lý hay hoá học hoặc cả hai liên kết này của các tác nhân tạo gel đƣợc solvate hoá (Clyder M. O. et al., 2007). Gel bôi da và niêm mạc là những chế phẩm thể chất mềm, sử dụng tá dƣợc tạo gel thích hợp. Tác nhân tạo gel bao gồm các nhóm nhƣ protein, polysaccharid, polymer bán tổng hợp, polymer tổng hợp, các chất vô cơ và một số chất diện hoạt (Kiểm nghiệm thuốc, 2011; Bào chế và sinh dƣợc học tập 2, 2010). Bảng 2.2. Phân loại chất tạo gel Phân loại chất tạo gel Ví dụ Protein Collagen, gelatin Polysaccharid Agar, K – Carrageenan, gôm tragacan, tinh bột, acid hyaluronic, pectin, gôm guar Polymer bán tổng hợp Carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, methylcellulose Polymer tổng hợp Carbomer, poloxamer, polyacrylamid, polyvinyl alcol Chất vô cơ Nhôm hydroxyd, bentonit, laponit Dựa theo cấu trúc, gel đƣợc phân loại thành gel một pha và gel hai pha (Clyder M. O. et al., 2007). Gel một pha: là một thể thống nhất, không có giới hạn rõ ràng giữa môi trƣờng và đại phân tử phân tán. Ví dụ: gel carbomer, gel alginat. Gel hai pha: là một hệ có chứa các tiểu phân tạo gel phân tán. Ví dụ nhƣ gel nhôm hydroxyl. 8
  19. Dựa theo môi trƣờng, gel đƣợc phân loại thành gel thân dầu và gel thân nƣớc (Dƣợc điển VN IV; Kiểm nghiệm thuốc, 2011). Gel thân dầu (oleogel): trong thành phần sử dụng tá dƣợc tạo gel, bao gồm dầu parafin phối hợp với tá dƣợc thân dầu khác, có thêm keo silic, xà phòng nhôm hoặc xà phòng kẽm. Gel thân nƣớc (hydrogel): thành phần bao gồm nƣớc, glycerin, propylen glycol, có thêm các tá dƣợc tạo gel nhƣ polysacarid (tinh bột, tinh bột biến tính, acid alginic và natri alginat), dẫn chất cellulose, polymer của acid acrylic (carbomer, carbomer copolymer, carbomer interpolymer, methyl acrylat) và các chất vô cơ (magnesi – nhôm silicat). 2.2.2. Ƣu nhƣợc điểm của gel Với mục tiêu điều trị tại chỗ, gel tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây bệnh và đƣa dƣợc chất đến đích tác động trên da gần nhƣ hoàn toàn. Do đó, hiệu quả trị liệu cao và hầu nhƣ không có hay ít có tác dụng phụ toàn thân. Hơn nữa, quy trình điều chế gel đơn giản, chế phẩm ổn định, cảm quan tốt. Tuy nhiên, sự hấp thu hoạt chất từ gel còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố và thay đổi nhiều giữa các cá thể hay trong cùng một cá thể. Sự hấp thu thuốc qua da rất kém, chỉ có các dƣợc chất có hoạt lực mạnh với liều điều trị không quá 2 mg/ngày, không gây kích ứng với da, có đặc tính phù hợp cho sự hấp thu qua da mới có thể bào chế ở dạng gel. Ngoài ra, do hiệu suất hấp thu không cao, sau khi sử dụng vẫn còn một lƣợng lớn dƣợc chất trong dạng thuốc, gây phí phạm dƣợc chất, có thể có vấn đề về sự an toàn và ô nhiễm môi trƣờng (Sinh dƣợc học và các hệ thống trị liệu mới, 2007). 2.2.3. Phƣơng pháp điều chế Tùy theo hoạt chất và tá dƣợc mà có phƣơng pháp điều chế gel sau đây: Phƣơng pháp hòa tan: khi dƣợc chất dễ tan trong tá dƣợc, hỗn hợp tá dƣợc hoặc trong một dung môi trơ đồng tan với tá dƣợc. Ta có gel kiểu dung dịch. Nếu tá dƣợc thân dầu, ta có thể đun chảy (nếu tá dƣợc dạng rắn) rồi phối hợp thành hỗn hợp đồng nhất bằng cách khuấy trộn. Sau đó thêm hoạt chất vào. Nếu tá dƣợc thân nƣớc ta thƣờng ngâm cho trƣơng nở rồi cho hoạt chất vào. Phƣơng pháp trộn đều đơn giản: áp dụng khi dƣợc chất rắn không hòa tan trong tá dƣợc hoặc trong trƣờng hợp dƣợc chất cần gây tác dụng tại chỗ hay cần hạn chế sự hấp thu hay khi các thành phần dƣợc chất rắn có tƣơng kỵ khi hòa tan. Đây là gel dạng hỗn dịch. 9
  20. Phƣơng pháp trộn đều nhũ hóa: áp dụng khi dƣợc chất lỏng không đồng tan với tá dƣợc, hoặc dƣợc chất rắn mềm không đồng tan với tá dƣợc nhƣng lại dễ tan trong dung môi trơ phân cực, hoặc trƣờng hợp dƣợc chất rắn chỉ phát huy tác dụng dƣới dạng dung dịch nƣớc. Đây là dạng gel nhũ tƣơng (Sinh dƣợc học và các hệ thống trị liệu mới, 2007). 2.2.4. Gel in situ Trong vài năm qua, một lƣợng lớn các nghiên cứu và báo cáo về các hệ thống tạo gel in situ (in situ – forming gel) đã đƣợc công bố. Sự hình thành của gel in situ có thể đƣợc định nghĩa là sự chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn hay bán rắn dƣới ảnh hƣởng của các tác nhân nhƣ nhiệt độ, pH hoặc ion. Dung dịch poly (N – isopropyl acrylamid) và poloxamer có sự chuyển pha sol – gel khi thay đổi nhiệt độ. Trong khi poly (methacrylic acid) và chitosan tạo gel dựa trên sự thay đổi pH (Clyder M. O. et al., 2007; Nirmal H. B. et al., 2010). Hai điều kiện tiên quyết trong một hệ in situ gel đó là độ nhớt và khả năng tạo gel. Độ nhớt nên là tối ƣu sao cho dễ dàng nhỏ thuốc vào mắt ở dạng lỏng và gel hóa nhanh chóng (kích hoạt nhờ việc tăng pH từ 6,0 lên 7,4). Ngoài ra, gel hình thành tại chỗ nên đƣợc bảo toàn tính nguyên vẹn của nó mà không bị hòa tan hay bị xói mòn trong một khoảng thời gian dài thích hợp. Phân loại Cơ chế tạo gel của dung dịch in situ gel đƣợc quyết định bởi loại polymer đƣợc sử dụng, mỗi loại polymer tạo gel dƣới tác động của các yếu tố nhất định, đƣợc chia thành 3 nhóm nhƣ trong bảng 2.2 (Nirmal H. B. et al., 2010; Rajoria G. and Gupta A., 2012). Bảng 2.3. Phân loại tác nhân tạo gel in situ Tác nhân kích thích Polymer tạo gel Pluronics, tetronics, xyloglucans, Nhiệt độ hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) Chitosan, cellulose acetate phtalat (CAP), pH Carbopol, polymethacrylic acid (PMMA), polyethylen glycol (PEG) Tƣơng tác ion Gelrite, gellan, acid hyaluronic, alginat. 10
  21. 2.2.4.1. Hệ gel in situ nhạy cảm với nhiệt Cơ chế Sự chuyển thể sol – gel xảy ra chủ yếu do khả năng hoà tan khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau của các polymer tạo gel. Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bắt đầu xảy ra sự chuyển thể sol – gel, liên kết hydro giữa các nhóm ƣa nƣớc ở trên bề mặt polymer và phân tử nƣớc làm tăng sự hoà tan của các chuỗi polymer và hệ tồn tại ở dạng dung dịch. Khi nhiệt độ cao hơn, các liên kết hydro bị phá vỡ, tƣơng tác polymer – polymer và nƣớc – nƣớc chiếm ƣu thế hơn, do các đại phân tử hoà tan bị khử nƣớc đột ngột và chuyển sang cấu trúc kỵ nƣớc hơn, dung dịch chuyển thành dạng gel (Rajoria G. and Gupta A., 2012). Nhiệt độ tăng Dung dịch copolomer Micellization Sự hình thành gel Hình 2.2. Cơ chế tạo gel hệ nhảy cảm với nhiệt (Rajoria G. and Gupta A., 2012) Một số polymer thƣờng dùng: poloxamer, xyloglucan 2.2.4.2. Hệ tạo gel in situ do thay đổi pH Cơ chế Các polymer nhạy cảm với pH chuyển từ dạng dung dịch sang dạng gel do pH làm thay đổi mức độ ion hóa và độ tan trong nƣớc của chúng. Tất cả các polymer nhạy cảm với pH đều có các nhóm ion (acid hay base) có thể cho hoặc nhận điện tử khi pH môi trƣờng thay đổi. Khi pH môi trƣờng tăng, sự trƣơng nở của các polymer tăng lên nếu trong phân tử polymer có các nhóm có tính acid yếu, và giảm đi khi có các nhóm có tính base yếu (Rajoria G. and Gupta A., 2012). 11
  22. Hình 2.3. Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm pH (Rajoria G. and Gupta A., 2012) Một số polymer thƣờng dung: chitosan, carbopol Carbopol 940 (acid acrylic – PAA) Hình 2.4. Cấu tạo của carbopol 940 Carbopol là những sản phẩm trùng hiệp cao phân tử của acid acrylic, dạng bột trắng, không tan hoặc rất ít tan trong nƣớc nhƣng trƣơng nở trong nƣớc tạo những thể gel có pH acid (dịch treo 1 % của các chất này có pH khoảng 3) và không sánh. Là chất tạo gel, có vai trò chuyển dung dịch thuốc ban đầu thành gel khi pH tăng lên. Nồng độ carbopol với vai trò tác nhân tạo gel thƣờng đƣợc sử dụng từ 0,5 – 2 %. Khi carbopol trƣơng nở hoàn toàn là lúc gel đạt đến độ nhớt cao nhất (Bào chế và sinh dƣợc học tập 2, 2010; Kỹ thuật bào chế và sinh dƣợc học các dạng thuốc tập 2, 2014). Carbopol cũng có thể tạo gel với các dung môi ethanol, glycerin, propylen glycol. Carbopol tƣơng kỵ với phenol, polymer dạng cation, acid mạnh và chất điện giải mạnh. Mỗi carbopol khác nhau về cấu trúc hóa học, mức độ liên kết, loại và lƣợng dung môi còn tồn dƣ ảnh hƣởng đến mức độ và tốc độ phân tán, khả năng trƣơng nở, thể chất và cấu trúc gel điển hình là độ nhớt. Ngoài ra, tùy theo dạng thuốc, tùy theo đƣờng dùng mà lựa chọn loại carbopol thích hợp (Nirmal H. B. et al., 2010). 12
  23. Ngoài vai trò tạo gel, carbopol còn đƣợc sử dụng nhƣ một tá dƣợc hỗ trợ, cải thiện các tính chất của gel (Kỹ thuật bào chế và sinh dƣợc học các dạng thuốc tập 2, 2014). 2.2.4.3. Hệ tạo gel in situ do ion hoá Cơ chế Hệ tạo gel do ion hóa bị kích hoạt bởi sự có mặt của các ion có trong dịch nƣớc mắt nhƣ Na+, Ca2+, Mg2+. Các polymer đƣợc sử dụng là các polymer anion, nhƣ: natri alginat, gelrite, tamarind, gellan. Sự tạo gel xảy ra do tƣơng tác ion giữa các ion của polymer và các ion hóa trị 2 của nƣớc mắt. Khi các polymer anion tiếp xúc với các cation, chúng chuyển sang dạng gel có độ nhớt cao (Rajoria G. and Gupta A., 2012). Hình 2.5. Cơ chế tạo gel do ion hoá (Rajoria G. and Gupta A., 2012) Một số polymer thƣờng dung: alginat, gellan, 2.2.4.4. Các tá dược hỗ trợ Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) HPMC là một dẫn xuất của cellulose, có màu trắng hoặc trắng kem, dễ tan trong nƣớc lạnh tạo thành một dung dịch keo nhớt, thực tế không tan trong nƣớc nóng. Khi tăng nhiệt độ, dung dịch HPMC chuyển thành dạng gel ở nồng độ thấp (1 – 10 %). Nhiệt độ chuyển tiếp sol – gel 75 – 90 . Nhiệt độ này có thể hạ xuống bằng hóa chất hay thay đổi vật lý. Bằng cách giảm số nhóm hydroxypropyl thay thế trên phân tử HPMC, nhiệt độ chuyển tiếp có thể giảm xuống 40 . HPMC đƣợc sử dụng rộng rãi trong các công thức gel nhƣ là tác nhân làm tăng độ nhớt, cải thiện độ bám dính, điều chỉnh sự phóng thích hoạt chất (Kulkarni A. P. et al., 2012; Raymond C. R. et al., 2009). 13
  24. 2.2.4.5. Các chỉ tiêu đánh giá gel in situ tạo bởi thay đổi pH Gel in situ theo pH đặc trƣng bởi tính chất tạo gel thuận nghịch theo pH. Bên cạnh pH tạo gel, gel in situ còn đƣợc đánh giá qua các chỉ tiêu khác nhƣ: độ trong, độ nhớt, khả năng chảy lỏng, lực bám dính, khả năng phóng thích hoạt chất, độ ổn định của gel (Nirmal H. B. et al., 2010). Dƣới đây trình bày một số phƣơng pháp của một số tác giả đánh giá các tính chất của gel in situ: Khả năng tạo gel Trong nghiên cứu của Nagaich U. và ctv (2015), khả năng tạo gel đƣợc xác định bằng cách nhỏ 1 giọt của DIG vào 1 ống nghiệm có chứa 2 mL nƣớc mắt nhân tạo vừa đƣợc chuẩn bị ở nhiệt độ 37 °C. Trực quan đánh giá sự hình thành gel. Khả năng chảy lỏng Preetha J. P. và ctv (2010) đã xác định khả năng chảy lỏng theo phƣơng pháp sau: hút 2 mL DIG cho vào một ống nghiệm, úp ngƣợc ống nghiệm. Ghi nhận thời gian DIG chảy đến miệng ống. Độ nhớt Reddy J. và Ahmed M. năm 2013, đã xác định độ nhớt bằng cách sử dụng nhớt kế Brookfield. Cho chế phẩm đƣợc đổ vào một adaptor nhỏ của máy và vận tốc góc tăng dần từ 0,5 đến 50 rpm. Độ ổn định Kulkarni A. P. và ctv (2012), đã nghiên cứu độ ổn định của DIG bằng cách cho DIG đƣợc đựng trong lọ kín, bảo quản ở 5 1 . Theo dõi độ ổn định của gel trong 15, 30, 45 ngày. 14
  25. Lực bám dính niêm mạc Hình 2.6. Mô hình thử kết dính sinh học gel in situ A: trục cân bằng B: nơi để cốc thuỷ tinh hứng nƣớc từ buret hoặc quả cân C: vật cố định niêm mạc D: mẫu E: niêm mạc ruột heo đƣợc gắn vào C Ramadan E. (2010) và ctv đã tiến hành xác định lực bám dính niêm mạc nhƣ sau: dùng niêm mạc ruột heo rửa sạch, ngâm trong nƣớc bọt nhân tạo ở 37 . Cố định 2 miếng niêm mạc vào bề mặt C. Cho vào giữa 2C 0,2 mL gel. Nâng nhẹ B để 2C tiếp xúc vào nhau, tác động lên gel một lực dàn mỏng trong 30 giây, lần lƣợt cho các quả cân có khối lƣợng 50 g, 55 g, 60 g, 65 g Ghi nhận khối lƣợng đầu tiên làm 2 miếng niêm mạc tách ra. Lực bám dính niêm mạc đƣợc tính bằng công thức: BS = m/S. Trong đó: BS: lực bám dính niêm mạc (g/cm2) m: khối lƣợng thêm vào làm mất bám dính S: diện tích tiếp xúc (S = 3,14 cm2) Khả năng phóng thích hoạt chất Khả năng phóng thích hoạt chất in vitro đƣợc xác định bằng phƣơng pháp khuếch tán qua gel hay qua màng. Trong phƣơng pháp khuếch tán qua gel, khả năng phóng 15
  26. thích hoạt chất của gel đƣợc đánh giá bằng đƣờng kính khuếch tán của hoạt chất đƣợc giải phóng ra trên lớp keo, thạch. Đối với phƣơng pháp khuếch tán qua màng, dụng cụ thƣờng đƣợc sử dụng là tế bào Franz với màng khuếch tán là màng nhân tạo hay màng tự nhiên (Sinh dƣợc học và các hệ thống trị liệu mới, 2007). 2.3. OFLOXACIN 2.3.1. Cấu trúc hóa học Hình 2.7. Cấu trúc hoá học của ofloxacin Tên khoa học: acid (RS)-9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo- 2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-carboxylic. Công thức phân tử: C18H20FN3O4 Phân tử lượng: 361,368 g/mol (Dƣợc điển VN IV). 2.3.2. Tính chất lý hóa Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng sáng, ít tan trong nƣớc và methanol, tan trong acid acetic băng, ít tan đến tan trong dicloromethan (Dƣợc điển VN IV; Hoá dƣợc tập 1, 2010). Độ tan của ofloxacin đã đƣợc thử nghiệm trong dung dịch acetat đệm (pH 4,6; 4,8; 5,0; 5,5 và 6,0), đệm citro – phosphat (pH 6,0 và 6,2) và đệm phosphat (pH 6,0; 6,5 và 7,2). Hoà tan ofloxacin vào các dung dịch đệm (0,3 %, kl/tt) và kiểm tra nồng độ hoà tan bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC). Đƣợc kết quả, thuốc tan trong dung dịch đệm acetate có pH 4,6; 4,8; 5,0 và trong dung dịch đệm citro – phosphate pH 6,0 ở mức độ mong muốn (0,3 %, kl/tt) (Srividya B. et al., 2001). Vậy nghiên cứu này sử dụng hệ đệm citro – phosphat pH 6,0 là dung dịch đệm cho DIG và là dung môi hoà tan ofloxacin. 16
  27. 2.3.3. Phổ tác động Ofloxacin có phổ kháng khuẩn rộng bao gồm Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria spp., Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae và một vài vi khuẩn Gram (+) khác (Hoá dƣợc tập 1, 2010). 2.3.4. Cơ chế tác động Ofloxacin có tác dụng diệt khuẩn. Cơ chế tác dụng chƣa đƣợc biết đầy đủ. Giống nhƣ các thuốc quinolon kháng khuẩn khác, ofloxacin ức chế DNA – gyrase là enzym cần thiết trong quá trình nhân đôi, phiên mã và tu sửa DNA của vi khuẩn (Dƣợc thƣ quốc gia). 2.3.5. Chỉ định, chống chỉ định, tác dụng không mong muốn Chỉ định Ofloxacin đƣợc dùng trong các bệnh: Viêm phế quản nặng do vi khuẩn, viêm phổi Nhiễm khuẩn Chlamydia tại cổ tử cung hoặc niệu đạo có hoặc không kèm lậu, lậu không biến chứng, viêm tuyến tiền liệt, viêm đƣờng tiết niệu. Nhiễm khuẩn da và mô mềm. Viêm đại tràng do nhiễm khuẩn (Dƣợc thƣ quốc gia). Dạng thuốc nhỏ mắt: các nhiễm trùng ở phần ngoài mắt (viêm kết mạc, viêm giác mạc) hoặc những bộ phận phụ (viêm mi mắt, viêm túi lệ) do những chủng vi khuẩn nhạy cảm với ofloxacin (Dƣợc điển VN IV). Chống chỉ định: Chống chỉ định với ngƣời có tiền sử quá mẫn với ofloxacin, các quinolon khác và/hoặc các thành phần khác có trong chế phẩm. Các thuốc diệt khuẩn fluoroquinolon nhƣ ciprofloxacin, ofloxacin có thể gây thoái hóa sụn khớp ở các khớp chịu lực trên súc vật thực nghiệm. Vì vậy không nên dùng cho trẻ dƣới 15 tuổi, ngƣời mang thai và cho con bú. Thời kỳ mang thai: ofloxacin qua nhau thai. Cũng phát hiện thấy ofloxacin trong nƣớc ối của hơn một nửa số ngƣời mẹ mang thai có dùng thuốc. Chƣa có những công trình đƣợc theo dõi tốt và đầy đủ trên ngƣời. Tuy vậy, vì ofloxacin và các fluoroquinolon khác gây bệnh về khớp ở súc vật non, không nên dùng ofloxacin trong thời kỳ mang thai. 17
  28. Thời kỳ cho con bú: ofloxacin có bài tiết vào sữa mẹ với nồng độ tƣơng tự nhƣ trong huyết tƣơng. Các fluoroquinolon đã đƣợc biết là gây tổn thƣơng vĩnh viễn ở sụn của những khớp chịu lực và cả nhiều dấu hiệu bệnh lý khác về khớp ở súc vật non. Vì vậy nếu không thay thế đƣợc kháng sinh khác và vẫn phải dùng ofloxacin, thì không nên cho con bú (Dƣợc thƣ quốc gia). Tác dụng không mong muốn Thƣờng ofloxacin đƣợc dung nạp tốt. Tỷ lệ tác dụng không mong muốn của ofloxacin, ciprofloxacin và các thuốc kháng khuẩn fluoroquinolon khác tƣơng tự tỷ lệ gặp khi dùng các quinolon thế hệ trƣớc nhƣ acid nalidixic. Thường gặp, ADR > 1/100 Tiêu hóa: buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng và rối loạn tiêu hóa. Thần kinh: đau đầu, chóng mặt, mệt mỏi, run, mất ngủ, ác mộng, rối loạn thị giác. Da: phát ban, ngứa, phản ứng da kiểu quá mẫn. Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100 Ðau và kích ứng chỗ tiêm, đôi khi kèm theo viêm tĩnh mạch và viêm tĩnh mạch huyết khối. Hiếm gặp, ADR < 1/1000 Thần kinh: ảo giác, phản ứng loạn thần, trầm cảm, co giật. Da: viêm mạch, hội chứng Stevens – Johnson và hoại tử nhiễm độc của da (Dƣợc thƣ quốc gia). 2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ GEL IN SITU SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ CÁC BỆNH VỀ MẮT Preetha J. P. và ctv (2010) đã nghiên cứu xây dựng và đánh giá một hệ thống phân phối mắt của thuốc chống viêm diclofenac sodium, dựa trên khái niệm pH tạo ra sự gel hóa tại chỗ bằng cách sử dụng alginate natri. Từ nghiên cứu này, kết luận sau đây đƣợc rút ra bằng cách thay đổi nồng độ các polymer với tỉ lệ khác nhau để đạt đƣợc thời gian gia tăng và sự phóng thích thuốc kéo dài. Năm 2011, Rathore K. S. đã tiến hành một nghiên cứu đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và in vivo của gel in situ timolol maleate. Kết quả cho thấy các công thức cho tác dụng điều trị hiệu quả, không gây kích ứng, ổn định và cung cấp duy trì sự phóng thích của thuốc trong một thời gian dài và thời hạn sử dụng xác định bởi phƣơng trình Arrhenius là 1,6 năm. 18
  29. Alpana Pradeep Kulkarni và ctv (2012) đã nghiên cứu sự phóng thích hoạt chất của gel in situ chứa articain với tá dƣợc tạo gel là poloxamer 407 phối hợp với hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) và carbopol 934P. Các thử nghiệm cho thấy thuốc có khả năng phóng thích kéo dài đến 7 giờ. Năm 2013, Reddy J. và Ahmed M. đã tiến hành nghiên cứu điều chế gel in situ sử dụng tá dƣợc: carbopol và HPMC chứa hoạt chất sparfloxacin. Nhóm đã nghiên cứu điều chế gel in situ và đánh giá các thông số liên quan: pH tạo gel, độ nhớt, năng giải phóng hoạt chất, độ ổn định Gần đây, một nghiên cứu của Nagaich U. và ctv (2015) về gel oflxacin bởi hệ tạo gel nhạy cảm nhiệt có thành phần pluronic F127 kết hợp với HPMC. Kết quả cho thấy thấy một sự thay thế khả thi đối với thuốc nhỏ mắt thông thƣờng nhờ khả năng tăng cƣờng hiệu quả kháng khuẩn thông qua thời gian trú lâu hơn và khả năng duy trì sự phóng thích của thuốc. Tính dễ sử dụng cùng với khả năng cung cấp sự duy trì kéo dài trong 24 giờ có thể dẫn đến tần suất dùng thuốc ít hơn, có thể góp phần nâng cao sự tuân thủ của bệnh nhân. Nhìn chung, hiện nay các đề tài nghiên cứu về gel in situ trong điều trị các bệnh về mắt tƣơng đối đa dạng. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về dung dịch in situ gel nhƣng trong nƣớc các nghiên cứu vẫn rất hạn chế. Vì vậy, từ nhu cầu điều trị đề tài đƣợc thực hiện nhằm xây dựng và đánh giá công thức DIG ofloxacin, trong đó sử dụng carbopol là tác nhân tạo gel do thay đổi pH và HPMC là polymer kết hợp giúp tăng độ nhớt. 19
  30. CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1. Các vật liệu, hoá chất dung trong bào chế và kiểm nghiệm Các nguyên liệu và hóa chất dùng trong bào chế và kiểm nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Các nguyên liệu hoá chất dùng trong bào chế và kiểm nghiệm STT Nguyên liệu – hoá chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc 1 Ofloxacin TCCS Trung Quốc 2 Carbopol 940 TCCS Italy 3 HPMC TCCS Trung Quốc 4 Acid citric TCCS Trung Quốc 5 Disodium hydrophosphat TCCS Trung Quốc 6 Triethanolamin TCCS Trung Quốc 7 Benzalkonium chlorid TCCS Trung Quốc 8 Tween 20 TCCS Trung Quốc 9 Nƣớc cất TCCS Phòng thí nghiệm 3.1.2. Thiết bị Thiết bị nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Thiết bị nghiên cứu đƣợc sử dụng trong đề tài STT Tên thiết bị Mã hiệu Nguồn gốc 1 Cân điện tử PA4102 Mỹ 2 Cân phân tích PA214 Mỹ 3 Bể siêu âm ELMA S 100 H Đức 4 Máy đo pH HI 2211 Ý 20
  31. 5 Máy khuấy từ CB161 Anh 6 Máy khuấy OS20-PRO Đức 7 Nhớt kế Brookfield DV- I + VISCOMETER Mỹ 8 Tủ lạnh AQR125ANSS Trung Quốc 9 Tủ sấy 3.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Dựa trên khái niệm pH tạo ra sự gel hóa tại chỗ, bằng cách sử dụng carbopol kết hợp HPMC tiến hành nghiên cứu. 3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Phòng thí nghiệm bộ môn Bào chế trƣờng đại học Tây Đô. 3.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Từ 03/2017 đến tháng 05/2017. 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Xây dựng công thức cơ bản gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin 3.2.1.1. Khảo sát nồng độ của carbopol Điều chế công thức gel 0,3 % ofloxacin chứa carbopol với nồng độ 0,5 – 2 %. Xác định gel bằng phƣơng pháp cảm quan, khả năng tạo gel ở 37 1 . Từ đó chọn nồng độ carbopol để tiếp tục khảo sát phối hợp với các tá dƣợc khác. 3.2.1.3. Khảo sát công thức phối hợp giữa carbopol và các tá dược hỗ trợ khác Điều chế công thức dung dịch thuốc nhỏ mắt ofloxacin chứa carbopol nồng độ đã chọn phối hợp với các tá dƣợc hỗ trợ. Xác định gel theo phƣơng pháp cảm quan khả năng tạo gel ở 37 1 và khả năng chảy lỏng. Yêu cầu: công thức nghiên cứu trong suốt, không bị tủa hoạt chất, tạo gel đƣợc ở 37 1 , chảy lỏng tốt ở dạng dung dịch và không chảy lỏng ở dạng gel. 3.2.2. Xây dựng công thức hoàn chỉnh và quy trình điều chế Từ kết quả khảo sát ở mục 3.2.1., công thức thuốc nhỏ mắt gel in situ hoàn chỉnh chứa 0,3 % ofloxacin đƣợc đề nghị bao gồm: ofloxacin, carbopol 940, HPMC, đệm citro – phosphat pH 6,0, triethanolamin, tween 20, benzalkonium chlorid. 21
  32. Tiến hành điều chế dung dịch thuốc (100 mL) và đánh giá các chỉ tiêu theo mục 3.2.3. Các chế phẩm sau khi điều chế đƣợc bảo quản ở 4 – 8 nhằm đánh giá nhanh sự ổn định của chế phẩm. 3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá các chỉ tiêu của gel nghiên cứu 3.2.3.1. Cảm quan: DIG thu đƣợc trong ở nhiệt độ thƣờng, không có tiểu phân lạ. 3.2.3.2. pH Các DIG đƣợc xác định pH bằng máy đo pH ở 25 , đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới dạng giá trị trung bình độ lệch chuẩn. Yêu cầu: các dung dịch gel phải có khoảng pH 6,0 (từ 5,9 – 6,1). 3.2.3.3. Độ trong: độ trong của DIG đƣợc đánh giá bằng cách quan sát bằng mắt thƣờng trên phông nền đen và trắng trong tủ có ánh sánh tốt. 3.2.3.4. Giới hạn kích thước tiểu phân Phương pháp: dùng kính hiển vi thích hợp (Dƣợc điển VN IV). Kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần 10 lần, đƣợc trang bị một trắc vi thị kính hiệu chỉnh bằng một trắc vi vật kính, một bàn soi có khả năng cố định và xoay quanh toàn bộ diện tích lọc của màng lọc, hai nguồn chiếu thích hợp cấp ánh sáng phản xạ bổ sung cho ánh sáng chếch. Trắc vi thị kính bao gồm một vòng tròn lớn có hình chữ thập chia tƣ, các vòng đối chiếu trong suốt hay màu đen đƣờng kính 10 m và 25 m ở độ phóng đại 100 lần, một thƣớc chia vạch 10 m đã đƣợc kiểm định theo chuẩn quốc gia hoặc quốc tế với sai số tƣơng đối cho phép 2 %. Vòng tròn lớn đƣợc gọi là thị trƣờng phân vạch. 22
  33. Hình 3.1. Trắc vi thị kính Trải một lƣợng nhỏ chế phẩm thành một lớp mỏng trên bản soi của kính hiển vi, phủ phiến kính lên trên và soi (Kiểm nghiệm thuốc, 2010). Yêu cầu: không đƣợc có phần tử nào của thuốc có kích thƣớc lớn hơn 75 m (chuyên luận “Thuốc mỡ tra mắt”, Dƣợc điển VN IV). 3.2.3.5. Khả năng tạo gel Khả năng tạo gel đƣợc xác định bằng cách nhỏ 1 giọt của DIG vào 1 ống nghiệm có chứa 2 mL nƣớc mắt nhân tạo vừa đƣợc chuẩn bị ở nhiệt độ 37 °C. Trực quan đánh giá sự hình thành gel, ghi thời gian đông tạo gel và thời gian để gel tạo thành hòa tan ra (Nagaich U. et al., 2015). Bảng 3.3. Thành phần của giọt nƣớc mắt nhân tạo Thành phần Hàm lƣợng (g/100 mL) NaCl 0,670 NaHCO3 0,200 CaCl2.2H2O 0,008 23
  34. Khả năng tạo gel đƣợc đánh giá theo 4 mức: Không tạo gel + Tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút ++ Tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10 – 20 phút +++ Tạo gel ngay lập tức và duy trì đƣợc > 20 phút 3.2.3.6. Khả năng chảy lỏng Khả năng chảy lỏng đƣợc đánh giá bằng cách úp ngƣợc ống nghiệm chứa 2 ml DIG và quan sát bằng mắt thƣờng. Tính thời gian t từ khi bắt đầu úp ống nghiệm đến khi DIG trong ống chảy đến miệng ống. Khả năng chảy lỏng đƣợc đánh giá theo 4 mức (Preetha J. P. et al., 2010): Không chảy + Kém: t > 6 giây ++ Trung bình: 3 < t < 6 giây +++ Tốt: t < 3 giây Với pH 6,0 tiến hành ở các nhiệt độ: 4 1 ºC (nhiệt độ bảo quản), 25 1 (nhiệt độ phòng) Với pH 7,4 tiến hành ở nhiệt độ: 37 1 (nhiệt độ trƣớc giác mạc). 3.2.3.7. Độ nhớt Sử dụng nhớt kế Brookfield. DIG ở pH 6,0 đƣợc cho vào 1 cốc 100 mL tiến hành đo với tốc độ quay tăng từ 5 rpm đến 25 rpm và công thức sau đó đƣợc điều chỉnh pH tăng lên 7,4 bằng cách thêm triethanolamin (Reddy J. and Ahmed M., 2013). 3.2.3.8. Thử kết dính sinh học Dựa trên các tài liệu tham khảo (Ramadan E. et al., 2010), mô hình đánh giá lực kết dính sinh học đƣợc thiết kế nhƣ hình 3.2. 24
  35. Hình 3.2. Mô hình thử kết dính sinh học gel in situ tự chế Cách xử lý giác mạc mắt heo: giác mạc mắt heo sau khi bóc tách đƣợc rửa sạch và bảo quản bằng dung dịch nƣớc mắt nhân tạo, sử dụng trong vòng 3 giờ sau khi bóc tách. Tiến hành đo lực kết dính sinh học đƣợc tiến hành nhƣ sau: lắp đặt các bộ phận nhƣ hình mô tả. Dùng giác mạc mắt heo đã đƣợc xử lý. Cố định giác mạc vào mặt dƣới quả cân (đƣờng kính 2 cm). Chỉnh nhiệt độ máy khuấy từ ở 37 1 . Cốc nhựa chứa một lƣợng nƣớc xác định để đảm bảo hệ thống cân bằng. Cho vào giữa quả cân và đĩa sắt 0,2 mL DIG. Nâng nhẹ cốc nhựa để giác mạc gắn với quả cân nhanh chóng đƣợc tiếp xúc với DIG trƣớc khi nó bị gel hóa khoảng 1 phút. Vặn buret với tốc độ tối đa để nƣớc chảy vào cốc cho đến khi miếng giác mạc tách ra thì khoá buret. Khối lƣợng làm mất bám dính đƣợc xác định bằng hiệu số giữa khối lƣợng nƣớc trong cốc sau và khối lƣợng nƣớc trong cốc ban đầu. Lực bám dính niêm mạc đƣợc tính bằng công thức: BS = m/S (Ramadan E. et al., 2010). Trong đó: BS: lực bám dính niêm mạc (g/cm2) m: khối lƣợng thêm vào làm mất bám dính S: diện tích tiếp xúc (S = 3,14 cm2) 25
  36. 3.2.3.9. Đánh giá tính kháng khuẩn Tác dụng kháng khuẩn đƣợc xác định bằng kỹ thuật khuếch tán từ các “giếng” đƣợc tạo ra trên môi trƣờng thạch rắn. Hai dung dịch vô khuẩn bao gồm: (1) ofloxacin trong hệ đệm citro – phosphate pH 6,0 (dung dịch chuẩn) và (2) chế phẩm đƣợc pha loãng thích hợp với hệ đệm citro – phosphate pH 6,0 (dung dịch thử) đƣợc đổ vào các “giếng” đã đƣợc đục sẵn trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng vô khuẩn trƣớc khi nhân giống với các chủng thử nghiệm là Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. Sau khi dung dịch khuếch tán vào 2 đĩa thạch, đem ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Mỗi dung dịch đƣợc tiến hành 3 lần. Vùng ức chế (ZOI) đƣợc xác định quanh các giếng (Bangun D. H. et al., 2014). 3.2.3.10. Định lượng hoạt chất Tiến hành định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC (Dƣợc điển VN IV). Điều kiện sắc ký: Pha động: hỗn hợp dung dịch natri lauryl sulfat 0,24 % - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20). Pha tĩnh: cột thép không gỉ (25 cm × 4,6 mm) đƣợc nhồi pha tĩnh C18 (5 m). Nhiệt độ cột: duy trì ở 35 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bƣớc sóng 294 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 20 l. Mẫu chuẩn: Hòa tan 0,06 g ofloxacin chuẩn trong 100 mL dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT), sau đó lấy ra 1 mL dung dịch trên pha với 10 mL dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) để thu đƣợc dung dịch có nồng độ khoảng 0,06 mg/mL. Mẫu thử: Hòa tan một lƣợng DIG trong dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) để thu đƣợc dung dịch có nồng độ ofloxacin khoảng 0,06 mg/mL. Công thức tính: Nồng độ dược chất trong mẫu thử được tính theo công thức sau (Hoá phân tích tập 2, 2013): 26
  37. Trong đó: Ct : nồng độ dƣợc chất trong mẫu DIG (mg/mL). mc: khối lƣợng dƣợc chất cân ban đầu để pha mẫu chuẩn (mg). St: diện tích pic chính của mẫu DIG (mAU.giây). Sc: diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây). Phần trăm dược chất chứa trong mẫu DIG được tính theo công thức: Trong đó: H: phần trăm dƣợc chất trong mẫu DIG (%). Ct: nồng độ dƣợc chất trong mẫu DIG (mg/mL). Co: nồng độ lý thuyết của dƣợc chất trong DIG bào chế (mg/mL), Co= 0,06 mg/mL. Yêu cầu: hàm lƣợng ofloxacin trong chế phẩm phải nằm trong giới hạn từ 90 % - 110 % so với hàm lƣợng ghi trên nhãn (chuyên luận “Ofloxacin”, Dƣợc điển VN IV). 3.2.3.11. Đánh giá khả năng phóng thích hoạt chất in vitro Môi trƣờng hòa tan là nƣớc mắt nhân tạo. Màng cellophane đƣợc ngâm qua đêm trong nƣớc mắt nhân tạo (pH = 7,4), sau đó đƣợc gắn vào 1 đầu của 1 xi lanh. Hút chính xác 1 mL chế phẩm vào xi lanh. Xi lanh đƣợc gắn liền với ổ trục bằng kim loại và đƣợc treo vào trong cốc có chứa 50ml môi trƣờng hòa tan (duy trì ở nhiệt độ 37 1°C). Trục quay với tốc độ 50 vòng/phút (50 rpm). Mỗi giờ lấy ra 1 mL môi trƣờng hòa tan và bổ sung vào cốc một lƣợng tƣơng ứng môi trƣờng đã lấy ra (Sinh dƣợc học và các hệ thống trị liệu mới, 2007; Rathore K. S., 2011). Lƣợng dƣợc chất giải phóng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng nhƣ mục 3.2.3.10. Cách tính tỷ lệ dƣợc chất giải phóng tại các thời điểm. Nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (Hoá phân tích tập 2, 2013): Trong đó: Ct: nồng độ dƣợc chất trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL). 27
  38. Cc: nồng độ mẫu chuẩn (µg/mL). St: diện tích pic của mẫu giải phóng (mAU.giây). Sc: diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây). Tổng lượng dược chất đã giải phóng từ DIG tại thời điểm t (lần lấy mẫu thứ n): ∑ Trong đó: Qt: tổng lƣợng dƣợc chất đã giải phóng tại thời điểm t (µg). V: thể tích môi trƣờng khuếch tán (mL). v: thể tích mỗi lần lấy mẫu giải phóng (mL). Ct: nồng độ dƣợc chất trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL). Ci: nồng độ dƣợc chất trong môi trƣờng khuếch tán tại thời điểm i (µg/mL). Phần trăm dược chất đã giải phóng từ DIG tại thời điểm t: Trong đó: Xt: phần trăm dƣợc chất giải phóng tại thời điểm t (%). Qt: lƣợng dƣợc chất đã giải phóng tại thời điểm t (mg). M: khối lƣợng dƣợc chất có trong mẫu DIG (mg). 3.2.3.12. Độ ổn định Gel đƣợc đựng trong lọ kín, bảo quản ở 5 1 . Theo dõi độ ổn định của gel trong 15, 30, 45 ngày. 28
  39. CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÂY DỰNG CÔNG THỨC CƠ BẢN GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN 4.1.1. Khảo sát nồng độ của carbopol Theo kết quả khảo sát, ta thấy nồng độ carbopol để tạo đƣợc gel lại làm cho dung dịch thuốc có tính acid cao làm tủa hoạt chất và không dễ dàng trung hòa bởi tác dụng đệm của nƣớc mắt. Chính vì vậy, việc giảm nồng độ carbopol mà không làm ảnh hƣởng đến khả năng tạo gel và tính chất lƣu biến của hệ thuốc rất quan trọng. Có hai cơ chế giúp cho chuỗi polymer đƣợc duỗi thẳng hoàn toàn (Raymond C. R. et al., 2009): Trung hòa với chất có tính kiềm (amino acid, kali hydroxid, natri hydroxid, natri bicarbonat, amin hữu cơ nhƣ mono, di hay triethanolamin, diisopropanolamin). Quá trình trung hòa tạo ra lực đẩy giữa các nhóm COO- giúp duỗi thẳng chuỗi polymer trong gel. Quá trình này diễn ra rất nhanh. Gel chỉ đƣợc tăng độ nhớt khi nằm trong khoảng pH 6 – 11, độ nhớt sẽ giảm đáng kể khi pH 12. Thêm các chất có nhiều nhóm hydroxy nhƣ các polyol (glycerin, HPMC, propylenglycol, polyethylen glycol) giúp hình thành các liên kết hydro và duỗi thẳng chuỗi polymer. Quá trình này cần thời gian để gel đạt đến độ nhớt tối đa. 4.1.2. Khảo sát sự phối hợp giữa carbopol và các tá dƣợc hỗ trợ  Trung hoà với triethanolamin Khảo sát 0,15 % (kl/tt) dƣợc chất, hệ đệm citro – phosphat pH 6,0 và carbopol với việc điều chỉnh pH bằng triethanolmin. Mỗi công thức bào chế với lƣợng 50 mL. Các công thức đƣợc chuẩn bị thể hiện trong hình 4.1. 29
  40. Hình 4.1. Các công thức đƣợc trung hoà bằng triethanolamin đã chuẩn bị Các công thức khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Công thức thuốc với nồng độ carbopol đƣợc trung hoà bởi triethanolamin Công thức Ofloxacin Carbopol Triethanolamin (%, kl/tt) (%, kl/tt) (%, kl/tt) A1 0,15 0,25 0,18 A2 0,15 0,3 0,2 A3 0,15 0,35 0,23 A4 0,15 0,4 0,25 A5 0,15 0,45 0,29 A6 0,15 0,5 0,32 Các công thức xác định khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của theo phƣơng pháp trình bày mục 3.2.3.5. và mục 3.2.3.6. Khả năng tạo gel đƣợc đánh giá dựa trên hình thái và khoảng thời gian mà các gel hình thành, màu sắc đã đƣợc thêm vào để dễ quan sát hơn, thể hiện trong hình 4.2. 30
  41. Hình 4.2. Quan sát trực quan sự hình thành gel trong các công thức A1 – A6 Kết quả đƣợc trình bảy ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Kết quả khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức A1 – A6 Khả năng chảy lỏng Khả năng tạo gel ở Công thức pH 6,0 pH 7,4 37 1 4 25 37 A1 +++ +++ +++ - A2 +++ +++ ++ ++ A3 +++ +++ + +++ A4 ++ ++ + +++ A5 + + - +++ A6 - - - +++ Chú thích: Khả năng chảy lỏng (thời gian chảy t): “-” không chảy; “+” kém (t > 6 giây); “++” trung bình (3 < t < 6 giây); “+++” tốt (t < 3 giây). 31
  42. Khả năng tạo gel: “-” không tạo gel; “ +” tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút; “++” tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10 – 20 phút; “+++” tạo gel ngay lập tức và duy trì được > 20 phút. Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy A3 – A6 cho kết quả tạo gel ở 37 tốt hơn A1 – A2. Tuy nhiên, A5 – A4 cho kết quả chảy lỏng không tốt, A6 lại tạo gel bền vững ở pH 6,0 nhƣ vậy rất khó cho việc đƣa thuốc vào mắt để điều trị. Trong khi A3 lại tạo gel tốt và khả năng chảy lỏng ở pH 6,0 tốt phù hợp dùng nhỏ giọt ở điều kiện phòng và tạo đƣợc gel trƣớc giác mạc nên ta chọn A3 tiếp tục nghiên cứu.  Phối hợp với HPMC Khảo sát 0,15 % (kl/tt) dƣợc chất, hệ đệm citro – phosphat pH 6,0 và carbopol với chất tạo độ nhớt HPMC. Mỗi công thức bào chế với lƣợng 50 mL. Các công thức đƣợc chuẩn bị thể hiện trong hình 4.3. Hình 4.3. Các công thức phối hợp với HPMC đã chuẩn bị Các công thức khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 4.3. 32
  43. Bảng 4.3. Công thức thuốc phối hợp nồng độ carbopol với HPMC Công Ofloxacin Carbopol HPMC thức (%, kl/tt) (%, kl/tt) (%, kl/tt) B1 0,15 0,25 0,5 B2 0,15 0,25 0,75 B3 0,15 0,25 1 B4 0,15 0,3 0,5 B5 0,15 0,3 0,75 B6 0,15 0,3 1 B7 0,15 0,35 0,5 B8 0,15 0,35 0,75 B9 0,15 0,35 1 Các công thức xác định khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của theo phƣơng pháp trình bày mục 3.2.3.5. và mục 3.2.3.6. Khả năng tạo gel đƣợc đánh giá dựa trên hình thái và khoảng thời gian mà các gel hình thành, màu sắc đã đƣợc thêm vào để dễ quan sát hơn, thể hiện trong hình Hình 4.4. Quan sát trực quan sự hình thành gel trong các công thức B1 – B9 33
  44. Kết quả đƣợc trình bảy ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức B1 – B9 Khả năng chảy lỏng Khả năng tạo gel ở Công thức pH 6,0 pH 7,4 37 1 4 25 37 B1 +++ +++ +++ - B2 +++ +++ +++ + B3 +++ +++ +++ + B4 +++ +++ +++ ++ B5 +++ +++ ++ ++ B6 ++ +++ + +++ B7 ++ +++ - +++ B8 + ++ - +++ B9 + + - +++ Chú thích: Khả năng chảy lỏng (thời gian chảy t): “-” không chảy; “+” kém (t > 6 giây); “++” trung bình (3 20 phút. Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy B1 – B5 đạt yêu cầu về khả năng chảy lỏng nhƣng khả năng tạo gel kém. B8, B9 cho khả năng tạo gel ngay lập tức nhƣng lại kém linh động ở 25 . B6, B7 với nồng độ phối hợp carbopol : HPMC tƣơng ứng (0,3:1; 0,35:0,5) vừa chảy lỏng tốt ở pH 6,0 nhiệt độ 25 vừa tạo gel bền vững ở pH 7,4 nhiệt độ 37 phù hợp dùng nhỏ giọt ở điều kiện phòng và tạo đƣợc gel trƣớc giác mạc, nên ta chọn B6, B7 tiếp tục nghiên cứu. 34
  45. Xác định độ nhớt của các công thức A3, B6, B7 theo phƣơng pháp ở mục 3.2.3.7. và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5 và bảng 4.6. Độ nhớt của DIG ở các pH là một trong những yếu tố phản ánh trạng thái của DIG ở các pH đó. DIG có độ nhớt thấp có thể dễ dàng nhỏ giọt, khi DIG chuyển thành dạng gel, độ nhớt của nó tăng lên. Bảng 4.5. Kết quả đo độ nhớt tại pH 6,0 Công Độ nhớt thức 5 rpm 10 rpm 15 rpm 20 rpm 25 rpm A3 1240 810 476 365 203 B6 1832 1043 720 557 412 B7 1934 1123 880 698 468 2500 2000 1500 A3 Độ nhớt Độ 1000 B6 B7 500 0 5 10 15 20 25 Tốc độ quay (rpm) Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn độ nhớt tại pH 6,0 35
  46. Bảng 4.6. Kết quả đo độ nhớt tại pH 7,4 Công Độ nhớt thức 5 rpm 10 rpm 15 rpm 20 rpm 25 rpm A3 18577 12500 9134 7184 5903 B6 25580 16944 12852 10590 9109 B7 27924 19327 14767 12138 10257 30000 25000 20000 15000 A3 Độ nhớt Độ B6 10000 B7 5000 0 5 10 15 20 25 Tốc độ quay (rpm) Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn độ nhớt tại pH 7,4 Nhận xét: Tại pH 6,0, chế phẩm thuốc ở dạng lỏng và có độ nhớt thấp và tại pH 7,4, dung dịch chuyển sang dạng gel có độ nhớt cao. B6 có độ nhớt cao hơn A3 cho thấy việc giúp carbopol cho độ nhớt tối đa bằng cách thêm một polymer có tác dụng tăng cƣờng độ nhớt nhƣ HPMC có hiệu quả hơn việc trung hoà với chất có tính kiềm nhƣ triethanolamin. Độ nhớt của B7 lớn hơn B6 chỉ ra rằng việc tăng độ nhớt gây ra bởi việc tăng nồng độ carbopol. Nên công thức B7 đƣợc khảo sát để xây dựng công thức và quy trình điều chế hoàn chỉnh, tiếp tục khảo sát các chỉ tiêu đánh giá khác. 36
  47. Các đồ thị cho thấy độ nhớt của các công thức giảm khi tốc độ quay tăng, cho thấy đặc tính của chất lỏng pseudoplastic. 4.2. XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ GEL IN SITU CHỨA 0,3 % OFLOXACIN Từ kết quả thu đƣợc ở mục 4.1.2., tiến hành điều chế 100 mL các công thức sau theo quy trình đƣợc mô tả dƣới đây. Nồng độ 1 % HPMC và 0,7 % carbopol 940 thỏa mãn độ nhớt và khả năng tạo gel cần thiết tuy nhiên 2 chất trên nếu phối hợp với dƣợc chất lại làm cho dƣợc chất kết tủa do carbopol làm giảm pH của dung dịch thuốc. Vì vậy, triethanolamin đƣợc sử dụng với một lƣợng phù hợp và thuốc sẽ đƣợc phối hợp với nó trƣớc, sau đó mới đƣợc cho vào dung dịch carbopol – HPMC. Tween 20 (nồng độ 1 % kl/tt) đƣợc sử dụng với mục đích làm tăng độ tan của ofloxacin do trong quá trình nghiên cứu công thức, quan sát thấy sau 1 thời gian, ofloxacin có dấu hiệu bị kết tủa. Bảng 4.7. Thành phần (%) hoạt chất và tá dƣợc trong các công thức hoàn chỉnh Thành phần C1 Ofloxacin 0,3 Carbopol 940 0,7 HPMC 1,0 Triethanolamin 0,46 Benzalkonium clorid 0,01 Tween 20 1,0 Đệm citro – phosphat pH 6,0 vđ Nƣớc cất vđ Quy trình điều chế Pha 100 mL dung dịch đệm citro – phosphat pH 6,0 theo DĐVN IV, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 . 37
  48. Cho HPMC vào 75 mL dung dịch đệm citro – phosphat pH 6,0 để ngâm trƣơng nở, carbopol đƣợc rắc lên dung dịch này và để trƣơng nở qua đêm. Sau đó dung dịch đƣợc khuấy trộn bằng máy khuấy tốc độ 300 vòng/phút trong 1 giờ và tween 20 đƣợc thêm vào trong khi khuấy. Mang hỗn hợp đi hấp ở 121 trong 30 phút. Ofloxacin đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm citro – phosphat và đƣợc điều chỉnh pH bằng dung dịch triethanolamin. Sau đó thêm benzalkonium chloride vào và dung dịch đƣợc lọc qua màng lọc cellulose acetate kích thƣớc 0,2 m. Dung dịch dƣợc chất đƣợc thêm từ từ vào dung dịch carbopol - HPMC đồng thời khuấy trộn liên tục cho đến khi thu đƣợc dung dịch đồng nhất. Sau đó thêm đủ nƣớc cho đến 100 mL, khuấy đều (tất cả thao tác công đoạn này đều tiến hành trong buồng vô khuẩn). Thuốc đƣợc đóng trong lọ dung tích 10 mL Hình 4.7. Dung dịch gel in situ ofloxacin thành phẩm 38
  49. Lƣu đồ điều chế gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin đƣợc trình bày ở hình 4.1. 75 mL đệm citro- Đệm citro-phosphat phosphat pH 6,0 pH 6,0 lọc qua màng hoà tan cellulose acetat Ofloxacin 0,45 휇 HPMC Dung dịch C Carbopol Triethanolamin ngâm 24h hoà tan Hỗn hợp A Benzalkonium clorid khuấy 300 lọc qua màng Tween 20 vòng/phút cellulose acetat trong 1 giờ 0,2 휇 Hỗn hợp B hấp ở 121 trong 30 phút cho từ từ trong buồng Dung dịch D vô khuẩn khuấy đều DIG Hình 4.8. Lƣu đồ điều chế gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin 39
  50. 4.3. ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU CỦA CÁC CÔNG THỨC GEL NGHIÊN CỨU 4.3.1. Cảm quan Chế phẩm dạng lỏng ở nhiệt độ thƣờng. 4.3.2. pH Thực hiện đo pH của dung dịch thuốc bằng máy đo pH thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Giá trị pH của chế phẩm ở 25 pH Công thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 ̅ C7 6,05 6,02 6,02 6,03 3.10-4 Nhƣ vậy, công thức đạt pH nhƣ yêu cầu (khoảng pH 6,0). 4.3.3. Độ trong Dung dịch trong, không có các tiểu phân quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. 4.3.4. Giới hạn kích thƣớc tiểu phân DIG đạt giới hạn kích thƣớc tiểu phân nhƣ yêu cầu không đƣợc có phần tử nào có kích thƣớc lớn hơn 75 m. 4.3.5. Độ nhớt Tại pH = 6,0, chế phẩm thuốc ở dạng lỏng và có độ nhớt thấp. Tại pH = 7,4, dung dịch chuyển sang dạng gel có độ nhớt cao. Nhƣ kết quả đã khảo sát ở bảng 4.5. 4.3.6. Thử kết dính sinh học Khả năng kết dính sinh học của DIG đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp ở mục 3.2.3.7. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Kết quả khả năng kết dính sinh học Khối lƣợng làm mất bám dính (g) Công thức Lực bám dính (g/cm2) Lần 1 Lần 2 Lần 3 ̅ C7 62,43 64,12 63,76 63,44 0,82 20,04 0,26 40
  51. Nhƣ vậy, carbopol kết hợp với HPMC làm tăng độ nhớt của DIG, làm tăng khả năng bám dính của gel với niêm mạc. 4.3.7. Đánh giá tính kháng khuẩn Tiến hành đánh giá nhƣ mô tả ở mục 3.2.3.9. Hình 4.9. Mô hình đánh giá tính kháng khuẩn Kết quả của các kiểm tra tác dụng kháng khuẩn đƣợc biểu diễn trong bảng 4.10. Bảng 4.10. Kết quả đánh giá tính kháng khuẩn ZOI của dung dịch ZOI của dung Tỷ lệ % giữa d và Nồng độ (µg/ml) 1 chuẩn d1 (cm) dịch thử d2 (cm) d2 (%) S. aureus 1 1,5 1,4 93 10 2,8 2,4 85 100 3,6 3,6 100 500 5,6 4,7 84 P. aeruginosa 1 0,5 0,5 100 10 1,2 1,2 100 100 3,5 3,0 85 500 4,2 4,0 95 Kết quả cho thấy rằng ofloxacin giữ đƣợc tác dụng kháng khuẩn khi đƣợc bào chế dƣới dạng gel in situ. 41
  52. 4.3.8. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro Tiến hành đánh giá nhƣ mô tả ở mục 3.2.3.11. Hình 4.10. Mô hình đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro Lấy mẫu ở những thời điểm xác định 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ. Hình 4.11. Mẫu tại những thời điểm xác định 42
  53. 4.3.9. Độ ổn định Trong 1 tháng, chế phẩm thuốc không có sự thay đổi các chỉ tiêu pH (khoảng 6,0), độ nhớt, giải phóng thuốc in vitro, khả năng tạo gel và tính bám dính niêm mạc. 43
  54. CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài đã đạt đƣợc các mục tiêu đề ra với những kết quả sau: 1. Lựa chọn đƣợc tá dƣợc để tăng độ tan của ofloxacin là dung dịch đệm citro – phosphat pH 6,0. 2. Xây dựng công thức cơ bản gel in situ chứa 0,3 % ofloxacin. 3. Xây dựng công thức và quy trình điều chế gel in situ 0,3 % ofloxacin. Thành phần công thức 100 mL DIG Ofloxacin 0,3 g Carbopol 940 0,7 g HPMC 1,0 g Triethanolamin 0,43 g Tween 20 1,0 g Benzylkonium clorid 0,01 g Đệm citro – phosphat pH 6,0 vđ Nƣớc cất vđ 4. Đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của các yếu tố trong công thức bào chế tới các chỉ tiêu chất lƣợng của dung dịch in situ gel: khả năng tạo gel, khả năng chảy lỏng, độ nhớt, khả năng kết dính, tính kháng khuẩn và độ ổn định. 5.2. ĐỀ NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng ofloxacin trong chế phẩm bằng phƣơng pháp HPLC 2. Tiếp tục hoàn thiện công thức bào chế DIG ofloxacin, nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ của DIG 3. Lựa chọn phƣơng pháp bào chế trong môi trƣờng vô khuẩn hay lựa chọn phƣơng pháp tiệt khuẩn thích hợp cho DIG ofloxacin. 4. Thử hoạt tính in vivo. 44
  55. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Agrawal A. K., Das M. and Jain S. (2012). In situ gel systems as 'smart' carriers for sustained ocular drug delivery. Expert Opinion Drug Delivery. pp. 383 – 402. 2. Bangun D. H., Ariyana, Sinurat D., Ervina I. (2014). Formulation and in vitro Evaluation of Alginate Based Metronidazole Periodontal Gel. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. pp 223 – 227. 3. Bộ Y tế . Dƣợc điển Việt Nam IV. NXB Y học. 4. Bộ Y tế . Dƣợc thƣ quốc gia. NXB Y học. 5. Clyder M. O. III and Klech-Gelotte C. M. (2007). Gels and Jellies. In: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology 3 rd edition. Informa healthcare USA. New York. pp. 1875 – 1889. 6. Huỳnh Văn Hoá (2010). Bào chế và sinh dƣợc học tập 2. NXB Giáo dục Việt Nam. Hà Nội. tr 73 – 124. 7. Kulkarni A. P., Khan S. K. A., Dehghan M. H. (2012). Evaluation of poloxamer based in situ gelling system of articaine as a drug delivery system for anesthetizing periodontal pockets: An in vitro study. Indian Journal of Dentistry. pp 201 – 208. 8. Lê Quan Nghiệm (2007). Sinh dƣợc học và các hệ thống trị liệu mới. NXB Y Học. Thành phố Hồ Chí Minh. tr 87, 148 – 209. 9. Nagaich U., Jain N., Kumar D., Gulati N. (2015). Controlled Ocular Drug delivery of ofloxacin using temperature modulated in situ gelling system. Journal of the Scientific Society. pp 90 – 94. 10. Nguyễn Đăng Hoà (2009). Sinh dƣợc học bào chế. NXB Y học. Hà Nội. tr 52 – 66. 11. Nguyễn Đăng Hoà (2013). Kỹ thuật bào chế và sinh dƣợc học các dạng thuốc tập 1. NXB Y học. Hà Nội. tr 180 – 200. 12. Nguyễn Thanh Hà (2014). Nghiên cứu xây dựng công thức in situ gel diclofenac nhỏ mắt. Luận văn tốt nghiệp Dƣợc sĩ. Đại học Dƣợc Hà Nội. Hà Nội. 13. Nguyễn Thị Hồng Hƣơng (2011). Kiểm nghiệm thuốc. NXB Giáo dục Việt Nam. Hà Nội. tr 285 – 296, tr 313 – 329. 14. Nguyễn Văn Long (2014). Kỹ thuật bào chế và sinh dƣợc học các dạng thuốc tập 2. NXB Y học. Hà Nội. tr 43 – 90. 45
  56. 15. Nirmal H. B., Bakliwal S.R., Pawar S.P. (2010). In situ gel: New trends in Controlled and Sustained Drug Delivery System. International Journal of PharmTech Research. pp 1398 – 1408. 16. Phan Thanh Dũng (2013). Hoá phân tích tập 2. NXB Y học. Hà Nội. tr 238 – 262. 17. Preetha J. P., Karthika K., Rekha. NR and Elshafie K. (2010). Formulation and evaluation of in situ ophthalmic gels of diclofenac sodium. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. pp 528 – 535. 18. Rajoria G. and Gupta A. (2012). In situ Gelling System: A Novel Approach for Ocular Drug Delivery. American Journal of Pharmtech Research. pp 24 – 53. 19. Ramadan E., Borg Th., Hawary Y.M. El and Saleh N. M. (2010). Formulation and evaluation of metronidazole bioadhesive matrices for treatment of periodontitis. Bulletin of Pharmaceutical Science. pp 79 – 94. 20. Rathore K. S. (2011). Development and in vivo in vitro Characterizations of timolol maleate in situ gels. International Journal of Pharma and Bio Sciences. pp 248 – 263. 21. Raymond C. R., Sheskey P. J., Quinn M. E. (2009). Handbook of Pharmaceutical Exipients 6th Edition. Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. The United States of America. pp 110 – 114, pp 326 – 329. 22. Reddy J. and Ahmed M. (2013). Sustained ocular delivery of sparfloxacin from pH riggered in situ gelling System. Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences. pp 16 – 25. 23. Srividya B., Cardoza R. M., Amin P.D. (2001). Sustained ophthalmic delivery of ofloxacin from a pH triggered in situ gelling system. Journal of Controlled Release. pp 205 – 211. 24. Trƣơng Phƣơng (2010). Hóa dƣợc tập 1. NXB Giáo dục Việt Nam. Hà Nội. tr 146 – 160. Website 25. Viêm giác mạc. Truy cập ngày 30 tháng 3 năm 2017. 26. Mắt ngƣời. Truy cập ngày 30 tháng 3 năm 2017. 46
  57. 27. Thuốc nhỏ mắt ofloxacin. solution.html. Truy cập ngày 05 tháng 4 năm 2017. 47