›

Khóa luận Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

pdf 40 trang thiennha21 26/04/2022 4491
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_giai_phong_thuoc_cua_vat_lieu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LI ỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật Hà Nội, 5/2019
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật Người hướng dẫn ThS. Phạm Thị Kim Dung Hà Nội, 5/2019
  3. LỜI CẢM ƠN Thành công là sự nỗ lực hết sức của bản thân và sự ủng hộ, giúp đỡ của mọi người cho dù đó là trực tiếp hay gián tiếp, là ít hay nhiều. Viện Nghiên Cứu Khoa học và Ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 là nơi em chọn để hoàn thành chương trình học, thực hiện nghiên cứu, hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ glconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”. Em xin gửi lời cảm ơn Th.S Phạm Thị Kim Dung, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh-KTNN cùng các thầy cô ở Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè thân yêu đã chăm sóc và khích lệ em trong thời gian nghiên cứu. Bài khóa luận tốt nghiệp của em còn rất nhiều thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp, nhận xét, góp ý của quý thầy, cô và các bạn để bài khóa luận của em hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Hường
  4. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo” đều là sự thật, là kết quả nghiên cứu của cá nhân em, không sao chép, không trùng lặp với bất kì đề tài nào. Trong quá trình viết luận văn tốt nghiệp em có tham khảo, trích dẫn một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự hướng dẫn của Th.S. Phạm Thị Kim Dung. Nếu đề tài có vấn đề gì em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, Ngày 20 Tháng 05 Năm 2019 Sinh viên Trần Thị Hường
  5. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 G.xylium Gluconacetobacter xylinus 2 OD Mật độ quang phổ 3 TDKD Tác dụng kéo dài 4 VLC Vật liệu cellulose 5 VNCKH&UD Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng
  6. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 5. Tính mới của đề tài 3 PHẦN NỘI DUNG 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4 1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus 4 1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri 5 1.1.2.1. Công thức hoá học 5 1.1.2.2. Tính chất hóa lý 5 1.1.2.3. Độ ổn định 5 1.1.2.4. Hấp thụ 6 1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định 6 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 6 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7 2.1. Đối tượng 7 2.1.1. Đối tượng 7 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 7 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 8
  7. 2.1.3.1. Thiết bị 8 2.2. Phạm vi nghiên cứu 9 2.3. Phương pháp nghiên cứu 9 2.3.1. Bố trí thí nghiệm 9 2.3.2. Chuẩn bị màng BC 9 2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC 11 2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn 11 2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri 14 2.3.6. Pha dung dịch đệm 14 2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 15 2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu 16 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17 3.2. Màng tinh chế 18 3.3. Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri 18 3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac natri được giải phóng ra khỏi màng 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 7 Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 8 Bảng 2.3. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 8 Bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo 10 Bảng 2.5. Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm 13 Bảng 3.1. Kết quả thu VLC 17 Bảng 3.2. Giá tri OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC chưa ép nước 20 Bảng 3.3. Giá trị OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC ép 50% nước 21 Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) . 24 Bảng 3.5: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) . 25
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri 5 Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô 10 Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC 11 Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm 13 Hình 2.4. Pha dung dịch đệm 15 Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm 16 Hình 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17 Hình 3.2. Rung siêu âm 18 Hình 3.3. Máy xác định lượng thuốc giải phóng 19 Hình 3.4. Mẫu rút ra để đo quang phổ 19 Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 22 Hình 3.6. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 22 Hình 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo chưa ép nước( % ) (n=3) 26 Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo ép 50% nước( % ) (n=3) 27 Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau thời điểm 24 giờ đối với màng chưa ép và màng ép 50% nước (% ) (n=3) 28
  10. MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Vật liệu cellulose (VLC) có giá thành thấp được tạo nên từ các nguyên liệu dễ kiếm, rẻ và có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. VLC có cấu trúc hóa học rất giống cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lí đặc biệt như: độ tinh sạch lớn, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, khả năng đàn hồi tốt, có thể phân hủy sinh học, tái chế, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt đặc biệt là khả năng cản khuẩn. Do tính chất tương đối đặc biệt như vậy mà màng cellulose vi khuẩn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực các như: thực phẩm, công nghiệp, mĩ phẩm và đặc biệt là y học [3, 4, 8]. Việc nghiên cứu và ứng dụng VLC trong nước đang được quan tâm và đã có được một số thành tựu nhất định. VLC có tẩm dầu mù u được thử nghiệm trên thỏ gây bỏng làm màng trị bỏng giúp vết thương mau lành và ngăn sự nhiễm trùng đó là kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Ngoài ra, VLC còn được ứng dụng trong: phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9]. Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid. Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình viêm. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh [5]. Diclofenac Natri được đánh giá là có tác động giảm đau mạnh trong những cơn đau từ trung bình cho đến trầm trọng, khi viêm do chấn thương, do can thiệp phẫu thuật, thuốc nhanh chóng làm giảm chứng đau tự nhiên, đau do vận động, và giảm phù nề do viêm và phù nề ở vết thương [5]. Tuy nhiên, khi dùng Diclofenac Natri cũng gây các tác dụng không mong muốn như đau đầu, đau vùng thượng vị, chán ăn, khó tiêu, trướng bụng, bồn chồn, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, gan tăng các transaminase, ù tai; thỉnh thoảng có gặp trường hợp phù, dị ừng, đau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, 1
  11. làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu; [1,2]. Do đó, với mục tiêu tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng G. xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, kháng lại tác động của acid và khả dụng sinh học của vật liệu cellulose trong việc điều trị bệnh. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 3. Nội dung nghiên cứu Tạo và thu VLC tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường môi trường nước vo gạo. Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong sự giải phóng thuốc. Nghiên cứu tiềm năng của môi trường nuôi cấy trong nước vo gạo. Nghiên cứu ứng dụng của VLC nhằm khắc phục hạn chế của thuốc Diclofenac Natri để mang lại lợi ích cho việc điều trị. Đánh giá những ưu nhược điểm khả năng giải phóng thuốc của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác. 2
  12. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo ra hệ thống giải phóng Diclofenac Natri kéo dài từ màng cellulose vi khuẩn. 5. Tính mới của đề tài Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclfenac Natric từ vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu cellulose nạp thuốc. 3
  13. PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1. Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus Vật liệu cellulose là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, chủng Gluconacetobacter xylinus. Vật liệu cellulose cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose mạch thẳng. Theo AJ. Brown (1886), vật liệu cellulose gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [12]. Vật liệu cellulose được tạo từ Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, môi trường, dầu mỏ, mỹ phẩm, da nhân tạo, y học, Vật liệu cellulose được sử dụng như hệ thống để phân phối thuốc [3, 4, 8]. Ngoài ra, Vật liệu cellulose còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9]. Amin và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng vật liệu cellulose làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy vật liệu cellulose giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [11]. Ở Brazil, Vật liệu cellulose ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thương [9]. Vật liệu cellulose được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với nhiều ứng dụng và đang được nghiên cứu, sản xuất hàng loạt. 4
  14. 1.1.2. Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri Diclofenac là một dẫn chất của acid 2-amino benzen acetic, có sinh khả dụng thấp do kém nước (độ tan trong nước ở 25oc khoảng 0.06 mM) [17]. Vì vậy dạng được dùng thường là muối của nó (có độ tan lớn hơn, ổn định hơn), đặc biệt muối được sử dụng nhiều là muối Natri Diclofenac [5]. 1.1.2.1. Công thức hoá học Tên khoa học: [2- (2,6- dicloro anilino) phenyl] acetat natri. Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2. Khối lượng phân tử: 318,13 [5]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri 1.1.2.2. Tính chất hóa lý Diclofenac là một axit yếu, dạng tồn tại bột kết tinh hoặc tinh thể màu trắng đến trắng hơi vàng. Độ tan: dễ tan trong ethanol 96%, methanol, hơi tan trong axit acetic, thực tế không tan trong ether, hơi tan trong nước độ tan phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và các chất có mặt trong môi trường hoà tan [5]. 1.1.2.3. Độ ổn định Trong cấu trúc phân tử, Natri Diclofenac có nhóm chức amin bậc hai dễ bị oxy hoá, nhóm phenyl acetat dễ bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương đối bền. 5
  15. 1.1.2.4. Hấp thụ Diclofenac Natri được hấp thụ nhanh. Diclofenac Natri hấp thụ qua đường tiêu hoá gần như là hoàn toàn, hấp thụ trong huyết tương đạt nồng độ tối đa khoảng 1 đến 4 giờ sau khi uống. Diclofenac natri cũng được hấp thu qua da và niêm mạc[5]. 1.1.2.5. Tác dụng và chỉ định Natri Diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do có khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane là các chất trung gian gây đau, viêm, sốt. Diclofenac Natri có hoạt tính chống viêm mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương với indomethacin [5]. Diclofenac Natri chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp: viêm khớp dạng thấp, viêm gân, viêm bao hoạt dịch, với liều duy trì hàng ngày khoảng 75 đến 100mg, chia 3 đến 4 lần. Với thuốc TDKD, chỉ cần uống 1 viên 75 mg, hoặc 100 mg trong một ngày, uống khi no [5]. 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam đã và đang quan tâm đến việc nghiên cứu tạo VLC. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu VLC mới dừng lại ở bước đầu thí nghiệm. Nghiên cứu VLC làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn còn là một hướng nghiên cứu mới. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng màng cellulose vi khuẩn trong hệ thống phân phối thuốc (năm 2014) [11] Nghiên cứu của Wei B. Và CS (2011) màng cellulose vi khuẩn thu được sau khi ngâm trong benzalkkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis [19]. 6
  16. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng 2.1.1. Đối tượng Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc 1 Diclofenac Natri dạng tinh khiết Trung Quốc 2 Metanol Trung Quốc 3 D-Glucose Trung Quốc 4 Pepton European Union 5 Amoni sunfat ((NH4)2SO4 ) Trung Quốc 6 Diamoni photphat (KH2PO4 ) Trung Quốc 7 Axit axetic Việt Nam 8 Nước vo gạo VNCKH&UD 9 vi khuẩn G. xylinum Nhật Bản 10 NaOH Việt Nam 11 HCL Việt Nam 12 KCL Việt Nam 13 H3PO4 Việt Nam 7
  17. 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 2.1.3.1. Thiết bị Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Thiết bị 1 Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) 2 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) 3 Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA 4 Buồng cấy vô trùng (Haraeus) 5 Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) 6 Bể ổn nhiệt 1013, bể rửa siêu âm TCP 280 7 Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức) 8 Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh) 9 Máy đo pH 10 Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, và nhiều thiết bị khác 2.1.3.2. Dụng cụ Bảng 2.3. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu STT Dụng cụ 1 Bình thủy tinh, bình tam giác 2 Bình định mức 100ml, 500ml, 1000ml, bình hút ẩm 3 Hộp nhựa, cốc thủy tinh, thước 4 Ống nghiệm 5 pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml 6 Gạc vô trùng, vải xô, giấy nhớ, và nhiều dụng cụ khác. 8
  18. 2.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu khoa học và Ứng dụng-Trường ĐHSP Hà Nội 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC. Thí nghiệm 3: Tìm quang phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc Diclofenac Natri. Thí nghiệm 4: Xây Dựng đường chuẩn Diclofenac Natri. Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac Natri trong 2 giờ. Thí nghiệm 6: Tính tỉ lệ thuốc giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở các môi trường pH khác nhau. Thí nghiệm 7: Tính tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở độ dày khác nhau. 2.3.2. Chuẩn bị màng BC Pha môi trường nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn được thể hiện ở bảng 2.1 [13] 9
  19. Bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo STT Thành phần Khối lượng 1 Glucose 30g 2 Pepton 10g 3 Amoni sunfat ((NH4)2SO4 ) 0,5g 4 Diamoni photphat (KH2PO4 ) 0,3g 5 Axit axetic 2% 6 Nước vo gạo 1000ml 7 Dịch giống 10% Qua bảng 2.4. Tạo VLC trong môi trường nuôi cấynước vo gạo ta có quá trình tạo VLC được thể hiện ở hình 2.1: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy o Hấp khử trùng môi trường trong 113 C, 15 phút Khử trùng môi trường bằng tia UV (15 phút) Bổ Sung 10% Dịch Giống, 2% Acid Acetic Ủ tĩnh trong buồng nuôi cấy tế bào khoảng 5 đến 14 ngày ở 28oC Vật liệu cellulose thô Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô 10
  20. 2.3.3. Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC Vật liệu cellulose thô Rửa dưới vòi nước, ngâm trong NaOH 3% trong 24 giờ đến 48giờ làm vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng độc tố ra ngoài Vật liệu cellulose có màu vàng nâu Trung hòa bằng HCL 3% trong 24 giờ đến 48giờ Vật liệu cellulose có màu trắng ngà, không mùi Ngâm nước trong 24 giờ đến 48 giờ trung hòa hết acid Vật liệu cellulose thô màu trắng, trong Hình 2.2. Sơ đồ chu trình tinh chế VLC Kiểm tra đường glucose có trong màng (Đường D_glucose tác dụng với thuốc Fehling tạo ra kết tủa nâu đổ). Vì vậy để kiểm tra sự có mặt của đường D- glcoso ta dung thuốc thử Fehling, xử lí hóa học. Lấy dịch thử mỗi loại của màng và mẫu đối chứng_nước cất và dung dịch D-glucose. Cho mỗi loại dịch thử vào mỗi ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 đến 15phút. Quan sát hiện tượng (kết tủa) xuất hiện trong mỗi ống nghiệm. 2.3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử. Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru-Nhật Bản), đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. 11
  21. Sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [3]. Pha dãy dung dịch Diclofenac Natri trong Metanol ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của dung dịch Diclofenac Natri có nồng độ 50% ở bước sóng 278nm (bước sóng tại đó dung dịch Diclofenac Natri đạt cực đại (λmax) hấp thụ). Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bước sóng đã lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch Metanol 900ml và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ thuốc Diclofenac Natri. Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac Natri để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R2 là hệ số tương quan Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax x: nồng độ của dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau. Làm tương tự trên khảo sát phổ diclofenac natri và xây dựng khoảng tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Diclofenac Natri trong môi trường pH = 2; 4,5; 6,8 và 7,4. Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc Diclofenac Natri thể hiện ở bảng sau: 12
  22. Bảng 2.5. Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm Nồng độ (mg/ml) 10 20 40 60 80 100 Giá trị Lần 1 0,116 0,21 0,49 0,66 0,95 1,169 OD Lần 2 0,116 0,25 0,46 0,76 0,94 1,173 278nm (n=3) Lần 3 0,119 0,23 0,46 0,68 0,96 1,171 Giá trị trung bình 0,117 0,23 0,47 0,7 0,94 1,171 ± 0,013 ± 0,013 ± 0,013 ± 0,04 ± 0,006 ± 0,001 Dựa vào bảng 2.2 dựng đồ thị biểu diễn, lập đường chuẩn Diclofenac Natri bằng phần mềm Excel 2010, ta được hình 2.1, hình 2.2, hình 2.3 1,20 1,00 y = -0.1583+0.218x R² = 0,9917 0,80 Giá OD trị nm 0,60 0,40 OD 278nm 0,20 0,00 10 20 30 40 50 60 STT Nồng độ dung dịch Diclofenac mg/ml Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm Ta có phương trình đường chuẩn ở bước sóng 278nm sóng: Y = 0,218x – 0,1583 (R2= 9917) (2) Trong đó: x - nồng độ Diclofenac Natri (mg/ml). y - giá trị OD tương ứng. R2 là hệ số tương quan. 13
  23. 2.3.5. Tạo VLC nạp Diclofenac Natri B1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. B2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC. B3: Tiến hành nạp thuốc Diclofenac Natri trên 2 mẫu: Mẫu 1: VLC có độ dày 0,5cm. Mẫu 2:VLC có độ dày 1cm. B4: VLC sau khi tinh chế cho vào sấy khô 50%, sau đó để vào bình tam giác có chứa 100ml dung dịch Diclofenac 20%. B5: Rút dịch ở các mẫu trong khoảng thời gian 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ và 2 giờ ta dùng máy quang phổ UV-Vis để đo giá trị OD của từng mẫu [9] [17]. B6: Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi tính giá trị OD trung bình cho vào phương trình đường chuẩn để tính nồng độ của Diclofenac Natri hấp thụ qua VLC được xác định theo công thức: mBC = mBC(2) – mBC(1) (1) Trong đó: mBC là khối lượng thuốc được hấp thụ qua VLC, mBC(1) là khối lượng của VLC lúc ban đầu, mBC(2) là khối lượng của VLC sau khi hấp thụ thuốc. 2.3.6. Pha dung dịch đệm Nghiên cứu sự giải phóng thuốc Diclofenac Natri từ chế phẩm trong 4 môi trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng là 2,0; 4,5; 6,8;7.4 [1]: Pha dung dịch đệm có pH theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ theo Dược điển Việt Nam [3]. Dung dịch đệm pH = 2,0: Hòa tan 6,57g aliclorid trong nước, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH). Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphate trong 1.000ml nước; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH). 14
  24. Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1.000 ml; đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). Hình 2.4. Pha dung dịch đệm 2.3.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][17] Lấy màng cellulose vi khuẩn đã được nạp thuốc Diclofenac Natri với độ dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5), mỗi loại lấy 4 mẫu cho vào các bình chứa 900ml môi trường pH như trên. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ± 0,50C.Sau các khoảng thời gian 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 24 giờ, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó. Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung lại 5ml dung dịch đệm tương ứng. 15
  25. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung bình. Tỉ lệ giải phóng thuốc được tính theo công thức[17]: R% = x100% Trong đó: R: Tỉ lệ giải phóng thuốc; Ct: Nồng độ của dung dịch Diclofenac Natri tại thời điểm t; V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau; V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào; n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng; m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các màng VLC. Hình 2.5. Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm 2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2007 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Các thông số động học giải phóng thuốc được tính toán, xử lý bằng công cụ DDSolver trong Excel [17]. 16
  26. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo Trong các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, ta thu được màng ở những độ dày khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1 [15]: Bảng 3.1. Kết quả thu VLC Lô Kí hiệu Thời gian nuôi cấy (ngày) 1 Màng 0,5 cm 7 2 Màng 1cm 14 Hình 3.1. Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17
  27. 3.2. Màng tinh chế VLC nuôi cấy từ môi trường nước vo gạo sau khi tinh chế đáp ứng yêu cầu thể chất mềm mại, linh hoạt, dễ gấp mà không cần thêm một vật liệu dẻo nào, độ bền kéo và độ đàn hồi tốt, không bị khô khi để ngoài không khí. 3.3. Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri VLC sau khi tinh chế sấy ở nhiệt độ 90°C trong 4 giờ để loại nước sau đó cho màng vào bình chứa 100 ml dung dịch Diclofenac 5%, đặt bình vào bể rung siêu âm, nhiệt độ 37°C. Sau khi ngâm VLC trong Diclofenac 0,5 giờ, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ lấy dung dịch ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào. Hình 3.2. Rung siêu âm 3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac natri được giải phóng ra khỏi màng Sau khi hấp thụ thuốc tối đa, cho 4 màng cellulose vi khuẩn vào các bình dung dịch đệm có pH tương ứng là: 2,0; 4,5; 6,8, 7,4 với mỗi bình dung tích khoảng 900ml. Xác định lượng thuốc Diclofenac Natri giải phóng ra, ta dùng máy khuấy từ gia nhiệt với tốc độ huấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37°C. Với mỗi mốc thời gian 0,5 giờ; 1 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 12 giờ; 24 giờ rút 5ml mẫu ra đo quang phổ cùng lúc ta bổ sung 5ml dung dịch đệm tương tự. 18
  28. Hình 3.3. Máy xác định lượng thuốc giải phóng Hình 3.4. Mẫu rút ra để đo quang phổ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần được giá trị OD(y) trung bình như bảng 3.2, bảng 3.3 19
  29. Bảng 3.2. Giá tri OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC chưa ép nước Thời pH2 pH4.5 pH6.8 pH7.4 gian Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng (giờ) 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,02 0,09 0,08 0,17 0,21 0,37 0,2 0,23 0,5 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0082 0,0077 0,0076 0,008 0,0082 0,0089 0,009 0,0083 0,25 0,12 0,19 0,19 0,37 0,48 0,33 0,3 1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0084 0,0078 0,008 0,0081 0,009 0,0095 0,0095 0,0086 0,4 0,16 0,25 0,28 0,4 0,57 0,37 0,42 2 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0091 0,008 0,008 0,0085 0,009 0,001 0,0099 0,0092 0,41 0,28 0,37 0,42 0,63 0,59 0,39 0,48 4 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0091 0,0085 0,009 0,0092 0,001 0,007 0,001 0,0095 0,51 0,35 0,42 0,45 0,7 0,67 0,64 0,57 6 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0096 0,0089 0,0091 0,0093 0,01 0,001 0,01 0,0099 0,63 0,52 0,56 0,5 0,84 0,72 0,69 0,68 8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,01 0,0096 0,0098 0,0096 0,015 0,011 0,011 0,01 0,75 0,65 0,6 0,63 0,88 0,77 0,72 0,75 10 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,01 0,012 0,01 0,01 0,011 0,011 0,011 0,011 0,89 0,7 0,78 0,69 0,9 0,85 0,77 0,86 12 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,011 0,014 0,012 0,014 0,011 0,012 0,0089 0,011 0,93 0,87 0,9 0,82 0,94 1,00 0,87 0,92 24 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,013 0,011 0,013 0,011 0,012 0,015 0,012 0,012 20
  30. Bảng 3.3. Giá trị OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC ép 50% nước Thời pH2 pH4.5 pH6.8 pH7.4 gian Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng (giờ) 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,32 0,12 0,14 0,19 0,28 0,37 0,3 0,29 0,5 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0087 0,0078 0,0079 0,0081 0,0085 0,0089 0,0086 0,0085 0,37 0,15 0,19 0,24 0,4 0,52 0,35 0,35 1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0089 0,0079 0,0081 0,0084 0,0091 0,0097 0,0089 0,0089 0,43 0,21 0,27 0,34 0,53 0,6 0,42 0,45 2 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0092 0,0082 0,0085 0,0088 0,0097 0,01 0,0092 0,0093 0,48 0,32 0,42 0,42 0,65 0,67 0,46 0,64 4 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0095 0,0087 0,0092 0,0092 0,01 0,01 0,0094 0,01 0,54 0,43 0,53 0,63 0,77 0,8 0,71 0,74 6 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0097 0,0092 0,0097 0,01 0,011 0,011 0,011 0,01 0,65 0,67 0,65 0,67 0,88 0,89 0,78 0,8 8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,01 0,01 0,01 0,01 0,013 0,013 0,011 0,011 0,89 0,79 0,72 0,78 0,93 0,9 0,84 0,87 10 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,011 0,011 0,011 0,011 0,012 0,014 0,01 0,012 0,92 0,81 0,84 0,92 0,96 0,93 0,89 0,93 12 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,012 0,011 0,011 0,012 0,012 0,015 0,0095 0,012 0,96 0,97 0,91 0,98 1,00 1,15 0,97 1,00 24 ± ± ± 0,012 ± ± ± ± ± 0,013 0,012 0,013 0,013 0,013 0,0089 0,0099 Dựng đồ thị biểu diễn bằng phần mềm Excel 2010, t có hình 3.5, hình 3.6: 21
  31. 1,2 1 0,8 Giá trị OD Giátrị 0,6 0,4 0,2 0 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH2 Màng 0.5cm pH2 Màng 1cm Thời gian pH4.5 Màng 0.5cm pH4.5 Màng 1cm pH6.8 Màng 0.5cm pH6.8 Màng 1cm pH7.4 Màng 0.5cm pH7.4 Màng 1cm Hình 3.5. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 1,2 1 Giá trị OD trị Giá 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH2 Màng 0.5cm pH2 Màng 1cm Thời gian pH4.5 Màng 0.5cm pH4.5 Màng 1cm pH6.8 Màng 0.5cm pH6.8 Màng 1cm pH7.4 Màng 0.5cm pH7.4 Màng 1cm Hình 3.6. Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 22
  32. Số liệu trong bảng 3.2; 3.3, hình 3.5; 3.6 cho thấy: Cả 4 môi trường đệm pH, giá trị OD (y) trung bình của thuốc Diclofenac Natri giải phóng từ VLC ở cả 2 độ dày màng đều tăng dần tới 1 thời điểm nhất định, giải phóng cao nhất tại thời điểm 24 giờ. Trong môi trường nước vo gạo, giá trị OD (y) trung bình của thuốc Diclofenac Natri giải phóng cao nhất tại môi trường pH = 6,8. Từ bảng 3.2 và 3.3 (các giá trị OD (y) trung bình) của thuốc Diclofenac Natri khi tiến hành giải phóng VLC, thay vào phương trình (1) (2) (3) ta tính được nồng độ Diclofenac Natri tương ứng với từng khoảng thời gian. Thay giá trị nồng độ Diclofenac Natri vừa tính được vào công thức (6) ta xác định được tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của VLC trong các độ dày, môi trường pH, thời gian khác nhau thể hiện qua bảng 3.4 và 3.5. 23
  33. Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) Thời pH2 pH4,5 pH6,8 pH7,4 gian Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng (giờ) 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 12,29 12,91 11,47 13,527 12,368 15,07 12,29 13,99 0,5 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0074 0,0079 0,0078 0,0082 0,0085 0,0087 0,0077 0,0081 12,712 13,213 12,294 13,757 13,540 16,003 13,264 14,608 1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0078 0,008 0,0084 0,0084 0,0086 0,0087 0,0083 0,0085 13,817 13,595 12,776 14,527 13,822 16,786 13,613 15,615 2 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,008 0,0081 0,0085 0,0079 0,0087 0,009 0,0078 0,0079 13,962 14,596 13,674 15,688 15,48 17,033 13,826 16,164 4 ± ± ± ± 5± ± ± ± 0,0082 0,0084 0,0083 0,0081 0,0082 0,0091 0,008 0,0082 14,728 15,216 14,093 16,005 16,052 17,743 15,626 16,947 6 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0084 0,0087 0,0087 0,0092 0,0083 0,0086 0,0085 0,0083 15,636 16,610 15,136 16,478 17,106 18,226 16,056 17,888 8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0079 0,0091 0,009 0,0089 0,009 0,09 0,0088 0,0076 16,549 17,704 15,494 17,570 17,474 18,710 16,350 18,525 10 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0091 0,0093 0,0089 0,0092 0,0092 0,0094 0,009 0,0087 17,604 18,185 16,819 18,128 17,707 19,429 16,784 19,474 12 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,009 0,0097 0,01 0,0099 0,01 0,012 0,097 0,093 17,975 19,595 17,738 19,229 18,078 20,690 17,564 20,042 24 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0096 0,01 0,0098 0,011 0,011 0,014 0,099 0,097 24
  34. Bảng 3.5: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) Thời pH2 pH4,5 pH6,8 pH7,4 gian Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng Màng (giờ) 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 0,5 cm 1 cm 11,958 12,189 10,827 12,690 11,707 13,979 11,832 13,406 0,5 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0074 0,0075 0,0077 0,0078 0,0079 0.0078 0,0075 0,0076 12,339 12,472 11,201 13,119 12,526 15,130 12,212 13,910 1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0075 0,0077 0,0078 0,008 0,008 0,0081 0,0077 0,0074 12,784 12,970 11,766 13,907 13,412 15,786 12,720 14,703 2 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0077 0,0079 0,0079 0,0082 0,0083 0,0084 0,0081 0,0077 13,168 13,829 12,773 14,556 14,240 16,374 13,041 16,143 4 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,008 0,0076 0,008 0,0079 0,0081 0,0086 0,008 0,0079 13,617 14,692 13,534 16,139 15,072 17,394 14,683 16,947 6 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0079 0,0081 0,0082 0,0084 0,0084 0,0087 0,0078 0,008 14,383 16,489 14,362 16,513 15,845 18,133 15,203 17,469 8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0083 0,0083 0,0085 0,0086 0,0087 0,009 0,088 0,0076 15,969 17,438 14,880 17,390 16,245 18,303 15,663 18,065 10 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0086 0,0087 0,0088 0,0087 0,009 0,0092 0,01 0,0094 16,244 17,675 15,714 18,486 16,521 18,616 16,061 18,592 12 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,0089 0,0092 0,09 0,0089 0,0093 0,0098 0,099 0,009 16,582 19,131 16,239 19,158 16,862 20,291 16,650 19,193 24 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,094 0,0094 0,0096 0,0092 0,0098 0,01 0,097 0,0093 25
  35. Qua bảng 3.4, bảng 3.5, dựng đồ thị biểu diễn bằng phần mềm Excel 2010, ta được hình 3.7, hình 3.8 22 20 18 16 14 12 10 Tỉ lệ giải phóng thuốc % thuốc phónggiải lệ Tỉ 0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH2 Màng 0.5cm pH2 Màng 1cm Thời gian pH4.5 Màng 0.5cm pH4.5 Màng 1cm pH6.8 Màng 0.5cm pH6.8 Màng 1cm pH7.4 Màng 0.5cm pH7.4 Màng 1cm Hình 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo chưa ép nước( % ) (n=3) 22 20 18 16 14 Tỉ lệ giải phóng % phónggiải lệ Tỉ 12 10 0,5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH2 Màng 0,5cm pH2 Màng 1cm Thời gian pH4,5 Màng 0,5cm pH4,5 Màng 1cm pH6,8 Màng 0,5cm pH6,8 Màng 1cm pH7,4 Màng 0,5cm pH7,4 Màng 1cm 26
  36. Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo ép 50% nước( % ) (n=3) Số liệu trong bảng 3.4; 3.5, hình 3.7; 3.8 cho thấy: Tỷ lệ giải phóng thuốc của VLC ở pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4 tăng dần cao nhất ở 24 giờ: Ở pH = 2: tỷ lệ giải phóng của màng dày 0,5cm (đối với màng không ép đạt 17,975% cao hơn màng ép 50% nước đạt 16,582%) thấp hơn tỷ lệ giải phóng của màng dày 1cm (đối với màng không ép đạt 19,595% cao hơn màng ép 50% nước đạt 19,131%). Ở pH = 4,5: tỷ lệ giải phóng của màng dày 0,5cm (đối với màng không ép đạt 17,738% cao hơn màng ép 50% nước đạt 16,239%) thấp hơn tỷ lệ giải phóng của màng dày 1cm (đối với màng không ép đạt 19,229% cao hơn màng ép 50% nước đạt 19,158%). Ở pH = 6,8: tỷ lệ giải phóng của màng dày 0,5cm (đối với màng không ép đạt 18,078% cao hơn màng ép 50% nước đạt 16,862%) thấp hơn tỷ lệ giải phóng của màng dày 1cm (đối với màng không ép đạt 20,690% cao hơn màng ép 50% nước đạt 20,291%). Ở pH = 7,4: tỷ lệ giải phóng của màng dày 0,5cm (đối với màng không ép đạt 17,564% cao hơn màng ép 50% nước đạt 16,650%) thấp hơn tỷ lệ giải phóng của màng dày 1cm (đối với màng không ép đạt 20,042% cao hơn màng ép 50% nước đạt 19,193%). Vậy Khả năng giải phóng thuốc của màng 1cm cao hơn màng 0,5cm; màng chưa ép có tỉ lệ giải phóng cao hơn màng ép 50% nước. Dung dịch đệm pH = 6,8 màng có khả năng giải phóng thuốc cao nhất sau đó tới pH=7,4; pH = 2 và pH = 4,5, thể hiện qua hình 3.9: 27
  37. 22 20 18 16 không ép Tỉ lệ giải phóng % thuốc giải phóng lệ Tỉ Ép nước 14 12 10 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm pH2 pH4.5 pH6.8 pH7.4 Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau thời điểm 24 giờ đối với màng chưa ép và màng ép 50% nước (% ) (n=3) So sánh các giá trị tỉ lệ trung bình bằng công cụ Data analysis với mức ý nghĩa α = 0,05, ta có kết quả P < 0,05 (sự sai khác về tỉ lệ giải phóng thuốc sau 24 giờ của 2 loại màng có ý nghĩa thống kê). 28
  38. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình thực nghiệm, nghiên cứu đề tài khóa luận, tôi thu hoạch được một số kết quả như sau: Màng cellulose vi khuẩn tạo ra ở môi trường nước vo gạo có độ dày 0,5cm sau 7 ngày thì thu được và 1cm sau 14 ngày thu được. Thời gian giải phóng thuốc Diclofenac Natri tăng dần theo từng mốc thời gian, cao nhất ở 24 giờ; tỷ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC ở môi trường có pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4 tăng dần , giải phóng cao nhất ở môi trường có pH=6,8. Tỷ lệ thuốc giải phóng ở các màng cellulose vi khuẩn có độ dày 1cm cao hơn so với các màng có độ dày 0,5 cm. 2, Kiến nghị Tạo điều kiện và cơ hội để có thể tiếp tục nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của VLC nạp Diclofenac Natri từ các loại môi trường đệm khác nhau. Tiếp tục nghiên cứu khả giải phóng của VLC nạp các loại thuốc khác nhau để so sánh ưu điểm, hạn chế của các loại thuốc đó. 29
  39. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia, 2859-2867. [2]. Bộ Y tế (2013), Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ VI, 18. [3]. Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Hà Nội 2009. [4]. Dương Minh Lam, Nguyễn Thị Thùy Vân, Đinh Thị Kim Nhung (2013), Phân Lập, tuyển chọn và định loại chủng vi khuẩn BHN2 sinh màng cellulose vi khuẩn, Tạp chí Sinh học, 2013, 35(1): 74-79. [5]. Đàm Thị Thủy (2013), “Nghiên cứu bào chế viên nén Diclofenac natri giải phóng nhanh theo cơ chế nhũ hóa”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. [6]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter Xylinum tạo màng Bacterial Cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50 (4), 2012, 453 - 462 [7]. Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng cho Acetobacter xylinum bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36(1), 10 – 12. [8] Nguyễn Xuân Thành (2018), “Đánh giá sự hấp thụ famotidine của cellulose được tạo ra từ Acetobacter xylinum trong một số môi trường nuôi cấy”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (Chuyên san Khoa học Nông nghiệp – Lâm nghiệp – Y dư [9]. Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum”, đề tài KH&CN cấp Bộ Y tế. [10]. Phan Thị Thu Hồng và cộng sự (2015),“Sử dụng cellulose tổng hợp vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4): 114-124. 30
  40. Tài liệu Tiếng anh [11]. Amin M.C.I.M. et al. (2012), "Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties", Journal of Sain Malaysiana, 41, 561-568. [12]. Brown. E. (2007), “Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites”, Master of sience in chemical engineerin, Washington state university. [13]. Choi Y. et al. (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J, Chem, Technol, Biotechnol, 79, 79-84. [14]. Hestrin S., Schramm M. (1954), “Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum, 2. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose”, Biochem J. 58(2): 345-352. [15]. Huang L. et al. (2013), "Nano-cellulose 3D-networks as controlled- release drug carriers", Journal of Materials Chemistry B (Materials for biology and medicine), 1, 2976-2984. [16]. Kyle A.et al. (2008), “Examination of metformin hydroclorid in a continuous dissolution/ HDM system”, Int.J.Pharmaceutics, 351, 127 – 132. [17]. Pinto R.J. et al. (2009), “Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279– 2289. [18]. Thanh Xuan Nguyen. et al. (2014), “Chitosan – coated nano – liposomes for the oral delivery of berberin hydrochloride”, J.Mater.Chem.B, 2, 7149 – 7159. [19]. Wei B. et al. (2011), “Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym, pp. 84, 533 - 538. 31