›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata )

pdf 52 trang thiennha21 15/04/2022 4940
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata )", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_phan_doan_nuoc_cua_loa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata )

  1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ TÂM KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƢỚC CỦA LOÀI ĐU ĐỦ RỪNG (TREVESIA PALMATA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ HÀ NỘI – 2018
  2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ TÂM KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƢỚC CỦA LOÀI ĐU ĐỦ RỪNG (TREVESIA PALMATA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. PHẠM HẢI YẾN HÀ NỘI – 2018
  3. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành dƣới sự giúp đỡ tận tình của thầy (cô) khoa Hóa học trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2 cùng cán bộ Viện Hóa Sinh Biển-Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Hải Yến đã giao cho em đề tài và đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS.Nguyễn Văn Bằng cùng các thầy (cô) khoa Hóa học trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian học tập, tu dƣỡng tại trƣờng. Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc hóa học Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình làm thực nghiệm để hoàn thành khoa luận này. Bản thân em đã cố gắng để hoàn thành kháo luận, nhƣng cũng không tránh khỏi thiếu xót. Vì vậy, em kính mong sự đóng góp ý kiến của thầy (cô) và các bạn đọc để khóa luận của em đƣợc hoàn chỉnh hơn. Hà Nội, tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Tâm SV. Nguyễn Thị Tâm K40C – Hóa học
  4. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về chi Trevesia Vis 2 1.2. Tổng quan về loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata) 3 1.2.1.Mô tả 3 1.2.2. Phân bố và sinh thái 3 1.2.3. Công dụng 4 1.2.4. Thành phần hóa học 4 1.2.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ rừng 5 1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật. 6 1.3.1. Chọn dung môi chiết 6 1.3.2. Qúa trình chiết. 8 1.4. Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 9 1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký. 10 1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. 10 1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. 11 1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 18 1.5.1. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR) 19 1.5.2. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 19 1.5.3. Phương pháp khối phổ (MS) 22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 SV. Nguyễn Thị Tâm K40C – Hóa học
  5. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 2.1. Mẫu thực vật 23 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất. 23 2.2.1. Sắc kí lớp mỏng ( TLC) 23 2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế 23 2.2.3. Sắc kí cột 23 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất. 24 2.4. Dụng cụ 24 2.5. Hóa chất 24 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1. Phân lập các hợp chất 25 3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất . 28 3.2.1.Hợp chất 1: 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid . 28 3.2.2. Hợp chất 2:Hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside . 28 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 29 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 35 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 SV. Nguyễn Thị Tâm K40C – Hóa học
  6. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Lá cây Đu đủ rừng 3 Hình 1.2 Hoa cây Đu đủ rừng 3 Sơ đồ 1 Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của lá 25 Đu đu rừng Sơ đồ 2 Sơ đồ phân lập phân đoạn nƣớc từ lá Đu đủ rừng 27 Hình 4.1.a Phổ proton 1H của hợp chất 1 29 Hình 4.2.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 30 Hình 4.1.c Phổ 13C và DEPT của hợp chất 1 31 Hình 4.1.d Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1 32 Hình 4.1.e Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 1 33 Hình 4.1.g Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính 33 (HC) của hợp chất 1 Hình 4.2.a Phổ proton 1H của hợp chất 2 36 Hình 4.2.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 36 Hình 4.2.c Phổ cacbon 13C và DEPT của hợp chất 2 37 Hình 4.2.d Phổ COSY của hợp chất 2 39 Hình 4.2.e Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 40 Hình 4.2.f Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2 40 Hình 4.2.f Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC (HC) 41 của hợp chất 2 Bảng 4.1.1 Số liệu phổ của hợp chất 1 34 Bảng 4.2.2 Số liệu phổ của hợp chất 2 41 SV. Nguyễn Thị Tâm K40C – Hóa học
  7. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT 13C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13 NuclearMagneticResonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy 2D-NMR Phổcộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc kí cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer EI-MS Phổ khối lƣợng va chạm electronElectron Impact Mas Spectroscopy FAB-MS Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mas Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivit HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy ME Nhóm metyl MS Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography SV. Nguyễn Thị Tâm K40C – Hóa học
  8. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 MỞ ĐẦU Họ Nhân sâm (Araliaceae) trong hệ thực vật Việt Nam khá phong phú và đa dạng về đặc điểm hình thái cũng nhƣ thành phần hóa học. Trên thế giới, đặc biệt là ở các nƣớc Đông Bắc Á đều đã sử dụng các loài trong họ Nhân sâm làm thuốc trong Y học cổ truyền. Trevesia Vis. là một chi thuộc họ Nhân sâm, gồm khoảng hơn 10 loài , là những cây thuốc quý , có giá trị. Các nhà khoa học đã xác định ở Việt Nam chi Trevesia Vis. gồm 6 loài phân bố rộng khắp cả nƣớc, cây thƣờng mọc ở vùng rừng đệm, rừng xanh hay dọc bờ sông suối . Trevesia palmata ( Roxb.&Lindl.) Vis., tên thƣờng gọi là Đu đủ rừng, Thông thảo gai, Thầu dầu núi, là một loài thuộc chi Trevesia Vis., thƣờng mọc ở các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [2]. Đu đủ rừng đã đƣợc sử dụng từ lâu theo kinh nhiệm dân gian và Y học cổ truyền. Theo Đông Y, lõi thân có tác dung lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng đƣợc xem nhƣ một vị thuốc bổ, lá chữa gãy xƣơng. Xuất phát từ ý nghĩa trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nƣớc của loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata )”. Để thực hiện đề tài này, nội dung nghiên cứu bao gồm : - Xử lý mẫu, tạo dịch chiết; - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập đƣợc từ loài Đu đủ rừng. SV. Nguyễn Thị Tâm 1 K40C – Hóa học
  9. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Trevesia Vis Theo hệ thống phân loại của Takhtajan đƣợc ghi trong cuốn Flowering plants [17], cây Đu đu rừng (Trevesia palmata ( Roxb.& Lindl.) Vis.) thuộc chi Trevesia Vis., một chi nằm trong họ Nhân sâm ( Araliaceae). Vị trí phân loại của chi Trevesia Vis. trong hệ thống phân loại thực vật chính thức đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Nghành: Ngọc lan Magnliophyta Lớp: Ngọc lan Magnliopsida Phân lớp: Sổ Dilleniidae Liên bộ: Cornanae Bộ Nhân sâm (Hoa tán) Apiales Họ Nhân sâm khá đa dạng về đặc điểm hình thái. Ở Việt Nam ghi nhận đƣợc 18 chi thuộc họ này, trong đó có chi Trevesia Vis. [4]. Chi Trevesia Vis. là những cây bụi hay cây gỗ nhỏ thƣờng xanh, hiếm khi phân nhánh; thân có gai ( ở cây già những gai này bị tiêu biến). Lá lớn, mọc so le, có thùy chân vịt, có cuống, mép lá khía răng cƣa; số thùy 5-13. Lá kèm dính với cuống lá thành bẹ chìa có 2 thùy. Cụm hoa tán nhiều hoa, hợp lại thành chùy hoặc chùm; tổng số tán 1-25, mỗi tán mang 9-65 hoa. Hoa lƣỡng tính. Đài có mép dạng sóng hay có răng nhỏ. Cánh hoa 6-16, xếp van, thƣờng thì hợp thành thể dạng mũ rụng sớm. Nhị bằng số cánh hoa. Bầu dƣới, 6-16 ô, vòi nhụy hợp thành cột ngắn, mỗi ô có một noãn treo. Quả hạch hình cầu – trứng [1 ], [5], [7]. Trên thế giới, chi Trevesia Vis. có khoảng hơn 10 loài phân bố ở vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Nepal, Bu-tan, Băng La Đét và Tây Nam Trung Quốc [5], [7]. SV. Nguyễn Thị Tâm 2 K40C – Hóa học
  10. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.2. Tổng quan về loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata) 1.2.1.Mô tả Ở Việt Nam gọi là Đu dủ rừng, Nhật phiến, Thôi hoang, Thông thảo gai, Thầu dầu núi [1]. Là cây nhỡ cao 7-8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp. lá đơn, phiến lá phân thùy chân vịt, xẻ sâu nhƣ lá thầu dầu, có 5-9 thùy nhọn có răng, gân nối ở hai mặt, mép lá có răng cƣa thô, cuống lá dài và có gai. Lá non phủ lông mềm, màu nâu nhạt, lá già nhẵn, tụ thành chùy ở nhách. Hoa to khoảng 1 cm, màu trắng. Quả dài 13-18mm, có khía, hạt dẹt. Độ cao phân bố thƣờng từ 400m trở lên. Hoa tháng 5-6. Quả tháng 7-9 [2]. Cây sinh trƣởng gần nhƣ quanh năm và ra quả 1-2 năm/lần. Hình 1.1: Lá cây Đu đủ rừng Hình 1.2: Hoa cây Đu đủ rừng 1.2.2. Phân bố và sinh thái Đu đủ rừng đƣợc phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam Đu đủ rừng là những cây ƣa ẩm. chịu bóng và cũng ƣa sáng vì thế Đu đủ rừng thƣờng mọc ở những chỗ ẩm dọc theo các sông, suối, thung lũng ở SV. Nguyễn Thị Tâm 3 K40C – Hóa học
  11. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 các rừng phục hồi [2], thuộc loại hình rừng kín xanh ảm trên núi đá vôi hoặc trên núi đất có nguồn gốc từ một vài loài đá mẹ khác nhau. Ở Việt Nam, loài này phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Quảng Trị [3], Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Tây, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng [1]. 1.2.3. Công dụng Chi Trevesia Vis. ở nƣớc ta có 5 loài, trong đó loài T. palmata đã đƣợc sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian và Y học cổ truyền. Theo Đông Y, lõi thân có tác dụng lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng đƣợc xem nhƣ một vị thuốc bổ (20 – 30 g lõi thân sắc riêng hoặc phối hợp với cây Mua đỏ); lá đƣợc dùng nấu nƣớc xông chƣa tê liệt bại ngƣời và giã đắp chữa gãy xƣơng [2] 1.2.4. Thành phần hóa học Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Trevesia Vis. chủ yếu thuộc nhóm chất saponin triterpen , đây là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú. Cho đến nay những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Trevesia, kể cả trong nƣớc và nƣớc ngoài vẫn còn rất hạn chế. Năm 2000, từ phân đoạn n-BuOH của dịch chiết EtOH lá loài T. palmata, nhóm nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 8 saponin triterpenoid, trong đó có 6 chất mới . Phần lớn các saponin này là các bisdesmoside, chỉ có 3 saponin monodesmoside, nhƣng tất cả đều có phần aglycon là acid oleanolic hoặc dẫn chất của acid này. SV. Nguyễn Thị Tâm 4 K40C – Hóa học
  12. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.2.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ rừng Hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của Đu đủ rừng (Trevesia palmata ( Roxb.& Lindl ) Vis.) Năm 1999, Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Ý) đã chứng minh dịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ rừng và một số saponin phân lập đƣợc đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào J774, HEK- 293c , WEHI-164d [6]. Một nghiên cứu ở Thái Lan dã cho thấy dịch chiết ethanol phần trên mặt đất cây Đu đủ rừng có tác dụng chống oxi hóa rất yếu trên in vitro [8]. Năm 2001, Srianidkulchai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ rễ đu đủ có tác dụng lợi tiểu , cho chuột uống liều 10mg/kg, gây gia tăng khối lƣợng nƣớc tiểu tổng xuất ra ngoài ( p<0,01), so sánh đƣợc với hydrochlothiazid, và sự tống xuất các chất điện giải trong nƣớc tiểu cũng có SV. Nguyễn Thị Tâm 5 K40C – Hóa học
  13. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 các thông số tƣơng tự . Hoạt tính này đƣợc giải thích là do ở lƣợng muối khoáng tƣơng đối cao trong dung dịch chiết [9]. Năm 2014, Hasanur Rahman và cộng sự nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết và giảm đau của dịch chiết methanol lá loài T. palmata. Kết quả cho thấy ở mức liều 100, 200 và 400 mg/kg thể trọng đã làm giảm đƣờng huyết của động vật thực nghiệm 17,9, 28,1 và 47,4% so với đối chứng; Đối với tác dụng giảm đau, ở mức liều 50, 100, 200 và 400 mg/kg thể trọng đã làm giảm 17,9, 28,1 và 47,4% so với đối chứng [14]. Một nghiên cứu khác về tác dụng tan huyết khối và chống viêm khớp của dịch chiết methanol chiết xuất từ lá loài T. palmata cũng đƣợc Mohammed Aktar Sayeed và cộng sự công bố. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này cho thấy dịch chiết n- hexane và ethyl acetate có tác dụng tốt trên in vitro của hoạt tính tan huyết khối trong khi đó dịch chiết methanol có tác dụng mạnh đối với hoạt tính kháng viêm [15]. 1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật. Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu,tùy thuộc vào đối tƣợng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.3.1. Chọn dung môi chiết Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn. Dung môi trong quá trình chiết phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ cấp đang đƣợc nghiên cứu thƣờng thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có SV. Nguyễn Thị Tâm 6 K40C – Hóa học
  14. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 độ phân cực khác nhau. Ngoài ra dung môi cần dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy không độc. Hiệu quả của quá trình chiết có thể bị ảnh hƣởng nếu dung môi có lẫn tạp chất. Vì vậy những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để thu ở dạng sạch trƣớc khi sử dụng. Thƣờng có một số chất dẻo lẫn trong dung môi ở quá trình sản xuất hoặc khâu bảo quản (trong các thùng chứa hoặc nút đậy bằng nhựa), ví dụ : các diakyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar, tributyl phosphat. Methanol và chlorofrom thƣờng chứa dioctylphtalat [di-(2etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom metylen clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá thân rễ Những tạp chất của chlorofrom nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất nhƣ các ancoloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tƣơng tự nhƣ vậy sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác có thể sảy ra với sự có mặt của một lƣợng nhỏ axit clohidric (HCl). Chlorofrom có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen cloritits độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào.Trái lại khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol SV. Nguyễn Thị Tâm 7 K40C – Hóa học
  15. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, các chất này cũng bị hóa tan đồng thời khi chiết bằng ancol. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên cũng có một số sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết [10]. Ví dụ trechlonolide A thu đƣợc từ trechlonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense đƣợc chiết trong methanol nóng. Thƣờng thì nƣớc ít đƣợc sử dụng để thu dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của methanol. Dietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hƣớng tạo thành peoxit dễ nổ. Peoxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hóa với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol nhƣ các carotenoid. Axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trƣờng axit. Qúa trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazo thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.3.2. Qúa trình chiết. Hầu hết quá trình chiết đơn giản đƣợc phân loại nhƣ sau: - Chiết ngâm. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết xoclet. SV. Nguyễn Thị Tâm 8 K40C – Hóa học
  16. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 - Chiết sắc với dung môi nƣớc. - Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc. Một phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị đƣợc sử dụng là một bình thủy tinh với cái khóa ở dƣới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Hiện nay máy chiết ngâm có thể dùng bình chiết thủy tinh mà không đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣ trƣớc đây. Thông thƣờng quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết không còn chứa những chất giá trị nữa và quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết sẽ đƣợc lấy ra. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài cách khác nhau, chẳng hạn: khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. Nhƣ vậy, để đạt đƣợc hiệu quả cao, tùy thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì mà chúng ta cần lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quá trình chiết hƣợp lý . Ngoài ra, dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.4. Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.[11,12] Phƣơng pháp sắc ký (chromatography) là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. SV. Nguyễn Thị Tâm 9 K40C – Hóa học
  17. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký. Sắc ký là phƣơng pháp tách, phân tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sụ phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ) tƣơng ứng với pha động và pha tĩnh. Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh có sự khác nhau. Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh. Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí nhờ vào đặc điểm trên. 1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. Phƣơng pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần): n b C n 1. bC n: lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng. n : lƣợng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. SV. Nguyễn Thị Tâm 10 K40C – Hóa học
  18. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 b: hằng số. C: nồng độ của chất hấp phụ. 1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. Trong phƣơng pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh thƣờng là chất lỏng hoặc rắn. Theo bản chất của hai pha sử dụng: -Pha tĩnh có thể là chát rắn hoặc chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn: thƣờng là alumin hoặc silicagel đã đƣợc xử lí, nó có thể nạp nén vào trong một cột. + Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng đƣợc tẩm lên bề mặt một chất mang. -Pha động có thể là chất lỏng hoặc chất khí. + Pha động là chất khí: thí dụ trong sắc kí khí. Trong trƣờng hợp này chất khí gọi là khí mang hay khí vecto. + Pha động là chất lỏng: thí dụ trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột. Theo bản chất của hiện tƣợng xảy ra trong quá trình phân tách chất. - Sắc kí phân chia. + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí. + Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất mỏng với chiều dày rất mỏng, chất mỏng này đƣợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn. - Sắc kí hấp thụ. + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí. + Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ đƣợc nhồi trong một ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thƣờng sử dụng các hạt silicagel hoặc alumin. - Sắc kí trao đổi ion. SV. Nguyễn Thị Tâm 11 K40C – Hóa học
  19. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 + Pha động chỉ có thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hoá học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. - Sắc kí lọc gel + Pha động chỉ có thể là chất lỏng. + Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng. - Sắc kí ái lực + Sắc kí ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở. + Đây là một phƣơng pháp rất hiệu quả và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. - Sắc kí lỏng cao áp. Kỹ thuật sắc kí lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc kí cột có khả năng phân tách protein đƣợc cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và nhƣ thế sẽ có nhiều vị trí tƣơng tác dẫn đến khả năng phân tách đƣợc tăng lên đáng kể. Bởi vì cột đƣợc làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có đƣợc một tốc độ chảy thích hợp. Phân loại sắc kí theo cấu hình. - Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng Trong sắc kí giấy + Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos. + Pha động: là chất lỏng. Trong sắc kí lớp mỏng: SV. Nguyễn Thị Tâm 12 K40C – Hóa học
  20. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 + Chất hấp phụ thông dụng trong sắc kí lớp mỏng là silicagel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. + Pha động luôn luôn là chất lỏng. - Sắc kí cột hở cổ điển + Sắc kí cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc kí sử dụng một ống hình trụ, đƣợc đặt dựng đứng, với đầu trên hở đầu dƣới gắn một khóa. + Pha tĩnh rắn đƣợc nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách đƣợc đặt trên bề mặt của pha tĩnh. + Pha động là dung môi liên tục đƣợc rót vào đầu cột. Theo trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí. Theo cách tiến hành sắc kí, ngƣời ta chia sắc kí thành những nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng. 1.4.3.1. Sắc ký cột Sắc kí cột là phƣơng pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất. Sắc ký cột đƣợc tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Chất hấp thụ là pha tĩnh gồm các loại silicagen những hạt có kích thƣớc tƣơng đối lớn (50-150 µm), pha thƣờng và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp thụ đƣợc nhồi vào cột (cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp thụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp thụ. Độ hạt của chất hấp thụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp thụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suât trung bình (MPC), áp suất cao ( HPLC). Trong sắc kí cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu SV. Nguyễn Thị Tâm 13 K40C – Hóa học
  21. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí, tỷ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau của Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp ( từ 1/5 -1/10 ), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách ( tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30. Trong sắc kí cột, mẫu chất cần phân tích đƣợc đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đƣợc đặt phải trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dƣới cột đƣợc hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phƣơng pháp này thƣờng làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ƣu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn.  Các bước thực hiện sắc ký cột: - Lựa chọn chất hấp thu: pha tĩnh là silicagel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. - Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5µl dd(A). Mỗi bản mỏng đƣợc triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém SV. Nguyễn Thị Tâm 14 K40C – Hóa học
  22. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 phân cực thí dụ nhƣ ete dầu hỏa: etyl acetate. - Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt đƣợc chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dƣới cột, dung môi này dẽ đƣợc rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất. - Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký.  Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau: + Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột. + Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu. + Mở khoá bên dƣới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đƣợc thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô. + Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. + Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp lại vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu. SV. Nguyễn Thị Tâm 15 K40C – Hóa học
  23. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 + Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. + Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột. 1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tƣợng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ nhƣ: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này đƣợc gọi là sắc ký lớp mỏng. Bình sắc ký: Hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) đƣợc tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ. Mẫu cần phân tích: thƣờng là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình. Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tƣơng tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.  Ưu điểm: SV. Nguyễn Thị Tâm 16 K40C – Hóa học
  24. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 - Chỉ cần một lƣợng rất ít mẫu để phân tích. - Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. - Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể đƣợc định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.  Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng: - Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đƣờng kính trong ống nhỏ, khỏang 1- 2mm, một đầu đƣợc vót nhọn, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung môi hữu cơ nhƣ aceton. - Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thƣơng mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kích thƣớc cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi. - Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, còn mẫu làdung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ƣu) mẫu chất. - Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly - Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòa dung môi, ngƣời ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dƣới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trong dung môi giải ly khoảng 0.5-1cm. Các vết mẫu không đƣợc ngập trong dung môi giải ly, vì nhƣ thế dung môi sẽ khuếch tán vào trong dung môi. - Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ đƣợc nhìn SV. Nguyễn Thị Tâm 17 K40C – Hóa học
  25. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 thấy bằng mắt thƣờng, nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phƣơng pháp hóa học (Bằng cách dùng thuốc thử hiện hình nhƣ hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4- dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid, ) - Ðại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm) b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết (cm). Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. 1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp với các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, ngƣời ta phải dựa vào các phƣơng pháp bổ xung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, các phƣơng pháp sắc SV. Nguyễn Thị Tâm 18 K40C – Hóa học
  26. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 kí so sánh 1.5.1. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR) Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 4000 đến 400 cm–1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự hấp thu ấy có định lƣợng nhƣng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành đƣờng thẳng mà là các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau, bởi vì sự biến đổi năng lƣợng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi của năng lƣợng quay. Nhƣ vậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lƣợng trong phân tử: năng lƣợng dao động và năng lƣợng quay. Dựa vào sự hấp thụ này, có thể chia phổ hồng ngoại thành 3 vùng: -Vùng sóng ngắn (4000-1300 cm-1 ) gọi là vùng các nhóm chức vì các băng hấp thụ của các nhóm chức hữu cơ nhƣ OH, NH, CO đều xuất hiện ở đây. -Vùng sóng dài (900-400 cm-1 ) đặc trƣng cho các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng. -Vùng sóng trung bình (1300-900 cm-1 ) đƣợc gọi là vùng chỉ vân tay vì nó đƣợc dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem có đồng nhất hay không về phƣơng diện hóa học. Phƣơng pháp phân tích này cho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có trong phân tử. 1.5.2. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Khi chúng ta đặt một chất có chứa nguyên tử 1H và 13C vào một từ trƣờng rất mạnh và đồng thời chiếu xạ nó với một năng lƣợng điện từ, những hạt nhân của các nguyên tử đó có thể hấp thu năng lƣợng qua một quá trình gọi là cộng hƣởng từ, sự hấp thụ này đƣợc lƣợng tử hóa và cho ra một phổ đặc trƣng của hợp chất. Trong phân tử, các hạt nhân hydro ở trong những vùng có mật độ điện tử khác nhau nên hấp thụ năng lƣợng ở từ trƣờng có cƣờng độ hơi khác nhau. Điều này dẫn đến các tín hiệu ứng với các proton đó SV. Nguyễn Thị Tâm 19 K40C – Hóa học
  27. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 sẽ xuất hiện ở những vị trí khác nhau trên phổ NMR. Ngoài ra còn có sự tƣơng tác của từ trƣờng của proton lân cận nhau gây ra sự chẻ tín hiệu, vì vậy khi quan sát tín hiệu có các trƣờng hợp chùm đôi 1:1 (doublet), chùm ba 1:2:1 (triplet), chùm bốn 1:3:3:1 (quartlet), Với phổ 13C-NMR, mỗi carbon trong một phân tử hữu cơ bình thƣờng chỉ cho một pic không có hiện tƣợng chẻ tín hiệu thành nhiều pic. Khi nghiên cứu các kết quả phân tích của phổ này, cùng với các kỹ thuật DEPT, COSY, HMBC, HSQC có thể xác định đƣợc số lƣợng proton và carbon và vị trí của chúng trong phân tử. 1.5.2.1. Phổ 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Ngƣời ta có thể xác định cấu trúc hóa học của hợp chất dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chuyển hóa học và tƣơng tác spin. 1.5.2.2. Phổ 13C-NMR Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm. 1.5.2.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT135. Trên phổ DEPT90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH. 1.5.2.4. Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ sau: SV. Nguyễn Thị Tâm 20 K40C – Hóa học
  28. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Phổ HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence): các tƣơng tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, trục còn lại là 13C-NMR. Các tƣơng tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. Phổ 1H-1H COSY (1H-1H Corelation Spectroscopy): phổ này biểu diễn tƣơng tác H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần tử của phân tử đƣợc nối ghép lại với nhau. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu diễn tƣơng tác xa của H và C trong phân tử. Nhừ vào các tƣơng tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn phân tử đƣợc xác định về cấu trúc. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. Ngƣời ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE một chiều để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Các proton có cùng phía cũng nhƣ gần nhau về không gian sẽ cộng hƣởng mạnh hơn và cho tín hiểu phổ với cƣờng độ mạnh hơn bằng vệc đƣa chúng vào một xung đúng bằng từ trƣờng cộng hƣởng của một proton xác định. Ngoài ra ngƣời ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dang đơn tinh thể. Vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể nên phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế. Đây là điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ. Ngoài việc sử dụng các loại phổ, ngƣời ta còn sử dụng các phƣơng pháp chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích , so sánh, kết SV. Nguyễn Thị Tâm 21 K40C – Hóa học
  29. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác đƣợc chiều dài các mạch, cũng nhƣ đối với các phân tử có các đơn vị đƣờng thì việc xác định chính xác loại đƣờng cũng nhƣ cấu hình đƣờng thông thƣờng phải sử dụng phƣơng pháp thủy phân rồi xác định bằng phƣơng pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đƣờng chuẩn dự kiến. 1.5.3. Phương pháp khối phổ (MS) Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lƣợng nhỏ chất thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dƣơng. Các mảnh ion này nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cƣờng độ khác nhau tƣơng ứng với lƣợng khối của mỗi ion, đó là khối phổ. Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị phá rất nhanh từ 10-10 đến 10-3 giây để hình thành các mảnh ion mang điện dƣơng, những ion này lại tiếp tục bị phá thành những ion nhỏ hơn. Chỉ có một số ít ion phân tử chƣa kịp bị bắn phá di chuyển đến bộ phận tập hợp và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic này sẽ cho ta biết khối lƣợng phân tử của chất thử. Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ cho chúng ta khối lƣợng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng. SV. Nguyễn Thị Tâm 22 K40C – Hóa học
  30. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu Đu đủ rừng Trevensia palmata (Robx. ex Lindl.) Vis. đƣợc thu hái ở Hà Giang vào tháng 7/2017. Mẫu đƣợc giám định bởi TS. Bùi Văn Thanh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Tiêu bản đƣợc lƣu trữ tại phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển. 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất. 2.2.1. Sắc kí lớp mỏng ( TLC) Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất đƣợc phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu. 2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế Sắc kí lớp mỏng điều chế thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, kí hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. 2.2.3. Sắc kí cột Sắc ký cột (CC) đƣợc tiến hành với chất hấp phụ pha thƣờng (Silica gel 240-430 mesh, Merck). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50) μm, FuJisilisa Chemical Ltd.). SV. Nguyễn Thị Tâm 23 K40C – Hóa học
  31. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.4. Dụng cụ Các dụng cụ dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch bao gồm: + Bình chiết 30 lít + Máy cô quay chân không + Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 365nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Các loại cột sắc ký: các cột thủy tinh (Duran-Đức) + Bếp điện 2.5. Hóa chất + Dung môi hữu cơ thông thƣờng nhƣ n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol là loại dung môi kỹ thuật và đƣợc chƣng cất lại trƣớc khi sử dụng. + Bản mỏng pha thƣờng/pha đảo: bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). + Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (Merck)/pha đảo RP-18 cỡ hạt 75; 150 m (Fuji Silysia Chemical Ltd.). + Diaion HP-20 (Nhật Bản). SV. Nguyễn Thị Tâm 24 K40C – Hóa học
  32. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Phân lập các hợp chất Lá của loài T. palmata (3 kg) đƣợc chiết siêu âm với methanol (3 lần x 5 lít) ở 50 oC, mỗi lần 30 phút. Các dịch chiết đƣợc gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 330 g cặn chiết metanol. Cặn chiết này đƣợc lắc đều với 2 lít nƣớc cất và chiết phân bố lần lƣợt với n-hexan (2 x 2 L), dicloromethan (2 x 2 L) và ethyl acetat (2 x 2 L) sau đó cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các phân đoạn n-hexan (TP-H, 38 g), dicloromethan (TP-D, 60 g), ethyl acetat (TP-E, 45 g) và lớp nƣớc (TP-W, 270 g) Cặn MeOH (330 g) n-Hexan: nƣớc 1/1 Lớp nƣớc Bổ sung CHCl3 Cặn n-Hexan (38 g) CH2Cl2: nƣớc 1/1 Lớp nƣớc Cặn CH2Cl2 (60 g) EtOA c: nƣớc 1/1 Lớp nƣớc Cặn EtOAc (45 g) Lớp nƣớc (270 g) Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết methanol từ lá đu đủ rừng SV. Nguyễn Thị Tâm 25 K40C – Hóa học
  33. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Phân đoạn nƣớc TP-W đƣợc đƣa lên cột diaion HP-20 để loại đƣờng bằng nƣớc, sau đó rửa giải bằng methanol trong nƣớc có nồng độ tăng dần (25, 50, 75 và 100 %, v/v) thu đƣợc 4 phân đoạn, TP-W1 TP-W4. Phân đoạn TP-W3 đƣợc phân tách thô trên cột sắc ký silica gel, rửa giải với hệ dung môi gradient dicloromethan /methanol (50/1 → 1/1, v/v) thu đƣợc 4 phân đoạn TP-W3A TP-W3D. Phân đoạn TP-W3C tiếp tục đƣợc phân tách trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan/aceton/nƣớc (1/5/0,4, v/v/v) thu đƣợc 5 phân đoạn TP- W3C1 TP-W3C5. Phân đoạn TPW3C2 tiếp tục đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải aceton/nƣớc (2/3, v/v) thu đƣợc hợp chất 1 (20,3 mg) và hợp chất 2 (40,0 mg). SV. Nguyễn Thị Tâm 26 K40C – Hóa học
  34. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Phân đoạn nƣớc TP-W Methanol/nƣớc : 25/1-100% TP-W1 TP-W2 TP-W3 TP-W4 Silica gel, CC Dicloromethan/methanol: 50/1-1/1 TP -W3A TP-W3B TP-W3C TP-W3D Silica gel, CC Dicloromethan/aceton/nƣớc: 1/5/0,4 TP-W3C1 TP-W3C2 TP-W3C3 TP-W3C4 TP-W3C5 Sắc kí pha đảo Aceton/nƣớc : 2/3 Hợp chất 1 Hợp chất 2 (20,3 mg ) (40,0 mg ) Sơ đồ 2 : Sơ đồ phân lập phân đoạn nƣớc của lá đu đủ rừng SV. Nguyễn Thị Tâm 27 K40C – Hóa học
  35. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất . 3.2.1.Hợp chất 1: 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid . Chất bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử C36H58O8(M = 618). 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem bảng 1. 3.2.2. Hợp chất 2:Hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside . Chất bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử C47H76O17, M = 912. 1 13 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem bảng 2. SV. Nguyễn Thị Tâm 28 K40C – Hóa học
  36. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 Hợp chất 1 phân lập đƣợc dƣới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu proton của bảy nhóm nhóm methyl tại δH 0.77, 0.83, 0.93, 0.95, 0.97, 0.99, 1.18 (mỗi tín hiệu 3H, singlet); một proton olefin tại δH 5.27 (1H, br s); một proton anome tại δH 5.40 (1H, d, J = 8.0 Hz), gợi ý hợp chất này có một đơn vị đƣờng. Các tín hiệu proton của phần đƣờng, tín hiệu proton dạng singlet của bảy nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lƣợng lớn các tín hiệu proton ở vùng trƣờng cao (δH 0.76 ~ 2.06) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu trúc khung aglycone dạng olean Hình 4.1.a: Phổ proton 1H của hợp chất 1 Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của 1 nhận thấy xuất hiện tín hiệu cộng hƣởng của 36 nguyên tử carbon bao gồm: một nhóm carbonyl (δC SV. Nguyễn Thị Tâm 29 K40C – Hóa học
  37. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 178.1) và bảy carbon khác không liên kết với hydro (C), 11 nhóm methine (CH), 10 nhóm methylene (CH2), và 7 methyl (CH3). Sự xuất hiện tín hiệu 1 của một proton olefin và hai carbon olefin (δC 123.8 và 144.8) trên phổ H- và 13C-NMR của hợp chất 1 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton trong cấu trúc của 1. Hình 4.1.b : Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 SV. Nguyễn Thị Tâm 30 K40C – Hóa học
  38. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Hình 4.1.c: Phổ cacbon 13C và DEPT của hợp chất 1 Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 đƣợc thực hiện bằng phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC. Tƣơng tác HMBC từ H-24 (δH 0.77) tới C-3 (δC 79.7)/ C- 4 (δC 39.9)/ C-5 (δC 56.8)/ C-23 (δC 28.7) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3. Đồng thời các tƣơng tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này. Tƣơng tác HMBC từ H-25 (δH 0.97) tới C-1 (δC 39.8)/ C-5 (δC 56.8)/ C-9 (δC 49.0)/ C-10 (δC 38.1) và tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C-1, H-9/C-9, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10, và C-25. Tƣơng tác HMBC từ H-26 (δH 0.83) tới C-7 (δC 33.1)/ C-8 (δC 40.7)/ C-9 (δC 49.0)/ C-14 (δC 42.9) và tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14, và C-26. Tƣơng tác HMBC từ H-27 (δH 1.18) tới C-8 (δC 40.7)/ C-13 (δC 144.8)/ C-14 (δC 42.9)/ C-15 (δC 28.9) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-13 kết hợp với tƣơng tác trực tiếp trên phổ SV. Nguyễn Thị Tâm 31 K40C – Hóa học
  39. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 HSQC (H-27/C-27, H-15/C-15, H-12/C-12) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15, và C-27. Các tƣơng tác HMBC từ H-29 (δH 0.95) và H- 30 (δH 0.93) tới C-19 (δC 47.2), C-20 (31.5), C-21 (33.9) và các tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H-21/C-21) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29, và C-30. Các tƣơng tác COSY giữa H-3/H-2, H-5/H-6, H-12/H-11, H-15/H-16, H- 18/H-19, H-21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C-11, C- 16, C-18, và C-22. Hai tín hiệu carbon còn lại δC 48.0 và 178.1 lần lƣợt qui kết cho giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-17 và C-28. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-28 đặc trƣng cho nhóm chức carboxylic đã bị ester tại C- 28 của cácj hợp chất triterpen dạng olean-28-oic acid. Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đƣờng trong hợp chất 1 cũng đƣợc qui kết bằng phân tích phổ hai chiều HSQC, HMBC. Tƣơng tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 5.40) với aglyone C-28 (δC 178.1). Các số liệu phổ carbon của hợp phần đƣờng tại δC 95.7, 73.9, 78.3, 71.1, 78.7, và 62.4 cho thấy sự có mặt của một đơn vị đƣờng glucose liên kết với alycon tại C-28. Hình 4.1.d : Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1 SV. Nguyễn Thị Tâm 32 K40C – Hóa học
  40. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Hình 4.1.e: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 1 Nhƣ vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 đã đƣợc xác định là 28-O- β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid, với công thức phân tử C36H58O8 và số khối M=618. Hình 4.1.f: Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của 1 SV. Nguyễn Thị Tâm 33 K40C – Hóa học
  41. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Bảng 4.1.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 # 1 C δC a,b a,c δC δH (J, Hz) 1 38.4 39.8 1.01 (m)/ 1.64 (m) 2 27.3 27.9 1.58 (m)/ 1.64 (m) 3 78.6 79.7 3.16 (dd, 4.0, 11.0) 4 38.3 39.9 - 5 55.0 56.8 0.76 (m) 6 18.0 19.5 1.42 (m)/1.58 (m) 7 31.7 33.1 1.62 (m)/ 1.73 (m) 8 38.4 40.7 - 9 47.4 49.0 3.32 (m) 10 36.7 38.1 - 11 22.7 24.5 1.92 (m)/ 2.06 (m) 12 122.4 123.8 5.27 (br s) 13 143.1 144.8 - 14 41.0 42.9 - 15 27.7 28.9 1.10 (m)/ 1.82 (m) 16 22.7 24.0 1.92 (m) 17 45.6 48.0 - 18 41.5 42.6 2.87 (m) 19 46.7 47.2 1.17 (m)/ 1.72 (m) 20 30.3 31.5 - 21 33.6 33.9 1.33 (m)/ 1.49 (m) 22 32.7 34.9 1.22 (m)/ 1.41 (m) 23 29.4 28.7 0.99 (s) 24 15.2 16.3 0.77 (s) 25 15.0 15.9 0.97 (s) 26 16.5 17.7 0.83 (s) 27 26.5 26.3 1.18 (s) 28 176.9 178.1 - 29 23.1 23.9 0.95 (s) 30 32.5 33.4 0.93 (s) 28-O-ß-D-glucopyranosyl 1′ 94.0 95.7 5.40 (d, 8.0) 2′ 72.2 73.9 3.35 (m) 3′ 76.5 78.3 3.41 (m) 4′ 69.6 71.1 3.37 (m) 5′ 76.5 78.7 3.36 (m) 6′ 61.3 62.4 3.68 (m)/ 3.81 (m) a b c # Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, C 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid [13]. SV. Nguyễn Thị Tâm 34 K40C – Hóa học
  42. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 Hợp chất 2 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu proton của bảy nhóm nhóm methyl tại δH 0.72, 0.83, 0.93, 0.96, 0.99, 1.19 (mỗi tín hiệu 3H, singlet); và 1.28 (3H, d, J = 6.0 Hz); một proton olefin tại δH 5.26 (1H, br s); ba proton anome tại δH 4.52 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.54 (1H, d, J = 7.5 Hz), 5.18 (1H, br s) gợi ý hợp chất này có ba đơn vị đƣờng. Các tín hiệu proton của phần đƣờng, tín hiệu proton dạng singlet của sáu nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lƣợng lớn các tín hiệu proton ở vùng trƣờng cao (δH 0.72 2.02) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu trúc khung aglycone dạng oleane tƣơng tự 1. Hình 4.2.a: Phổ proton 1H của hợp chất 2 Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của 2 nhận thấy xuất hiện tín hiệu cộng hƣởng của 47 nguyên tử carbon bao gồm: một nhóm carboxyl (δC 181.9) và sáu carbon khác không liên kết với hydro (C), 22 nhóm methine (CH), 11 nhóm methylene (CH2), và 7 methyl (CH3). Sự xuất hiện tín hiệu SV. Nguyễn Thị Tâm 35 K40C – Hóa học
  43. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 1 của một proton olefin và hai carbon olefin (δC 123.5 và 145.2) trên phổ H- và 13C-NMR của hợp chất 2 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton Hình 4.2.b: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 13 Hình 4.2.c: Phổ cacbon C và DEPT của hợp chất 2 Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 2 đƣợc thực hiện bằng phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, và COSY. Tƣơng tác HMBC từ H-24 (δH 0.72) tới C-3 (δC SV. Nguyễn Thị Tâm 36 K40C – Hóa học
  44. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 82.4)/ C-4 (δC 43.9)/ C-5 δC 48.0)/ C-23 (δC 64.5) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 và C-23 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3 và một nhóm hydroxy tự do tại C-23. Đồng thời các tƣơng tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này. Tƣơng tác HMBC từ H-25 (δH 0.99) tới C-1 (δC 39.6)/ C-5/ C-9 (δC 48.9)/ C-10 (δC 37.6) và tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C- 1, H-9/C-9, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10, và C-25. Tƣơng tác HMBC từ H-26 (δH 0.83) tới C-7 (δC 33.4)/ C-8 (δC 40.4)/ C-9 / C-14 (δC 42.9) và tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14, và C-26. Tƣơng tác HMBC từ H-27 (δH 1.19) tới C-8 / C-13 (δC 145.2)/ C-14/ C-15 2 (δC 28.8) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-13 kết hợp với tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-27/C-27, H-15/C-15, H-12/C-12) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15, và C-27. Các tƣơng tác HMBC từ H-29 (δH 0.93) và H-30 (δH 0.96) tới C-19 (δC 47.2), C-20 (31.6), C-21 (34.9) và các tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H- 21/C-21) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29, và C-30. Các tƣơng tác COSY giữa H-3/H-2, H-5/H-6, H-12/H-11, H-15/H- 16, H-18/H-19, H-21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C- 11, C-16, C-18, và C-22. Hai tín hiệu carbon còn lại δC 47.6 và 181.9 lần lƣợt qui kết cho giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-17 và C-28. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-28 đặc trƣng cho nhóm chức carboxylic tự do tại C-28 của các hợp chất triterpen dạng olean-28-oic acid. Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đƣờng trong hợp chất 2 cũng đƣợc qui kết bằng phân tích phổ hai chiều COSY, HSQC, HMBC. Tƣơng tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 4.52) với aglyone C-3 (δC 82.4), chuỗi tƣơng tác quan sát đƣợc trên phổ COSY gồm SV. Nguyễn Thị Tâm 37 K40C – Hóa học
  45. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 H-1ʹ/ H-2ʹ/ H-3ʹ/ H-4ʹ/ H-5ʹ cùng với các tƣơng tác trực tiếp trên phổ HSQC của các proton này cho phép qui kết các giá trị phổ của đơn vị đƣờng arabinose và liên kết O-glycoside của đƣờng này với aglycone tại C-3. Tƣơng tác HMBC giữa Hʺ-1 (δH 5.18) và C-2ʹ (δC 76.9), cùng với chuỗi các tƣơng tác COSY H-1ʺ/ H-2ʺ/ H-3ʺ/ H-4ʺ/ H-5ʺ/ H-6ʺ cho phép qui kết các giá trị phổ của đơn vị đƣờng rhamnose, và liên kết (1→2) giữa đơn vị đƣờng rhamnose với đơn vị đƣờng arabinose. Các số liệu phổ carbon còn lại của hợp phần đƣờng tại δC 105.7, 75.3, 77.7, 71.2, 77.7, 62.4 và tƣơng tác HMBC giữa H-1‴ (δH 4.54) với C-3ʺ (δC 82.7) cho thấy sự có mặt của một đơn vị đƣờng glucose tự do ở cuối chuỗi mạch trisaccharide và liên kết với đơn vị rhamose bởi liên kết (1→3) O-glycoside. Hóa lập thể của khung aglycone của hợp chất 2 tiếp đó đƣợc minh chứng dựa trên phân tích phổ tƣơng tác không gian ROESY. Các tƣơng tác ROESY giữa H-25/H-26, H- 18/H-30 cho thấy các proton này gần nhau trong không gian và cùng định hƣớng beta nhƣ sinh tổng hợp của các hợp chất thứ cấp khung oleane. Tƣơng tự nhƣ vậy, tƣơng tác ROESY giữa H-5/H-9/H-27 cũng minh chứng cho sự định hƣớng alpha của các proton này. Ngoài ra trên phổ ROESY của 2 còn quan sát thấy tƣơng tác giữa H-25 (δH 0.99) và H-24 (δH 0.72) cho thấy nhóm methyl C-24 cũng định hƣớng beta, tức là nhóm hydroxymethyl C-23 định hƣớng alpha. Tƣơng tác ROESY giữa H-3 (δH 3.64) và H-5 (δH 1.29) cho phép xác định proton H-3 định hƣớng alpha giống H-5, hay nhóm oxygen thế ở C-3 định hƣớng beta. SV. Nguyễn Thị Tâm 38 K40C – Hóa học
  46. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Hình 4.1.d: Phổ COSY của hợp chất 2 . Hình 4.1.e: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2 SV. Nguyễn Thị Tâm 39 K40C – Hóa học
  47. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Hình 4.1.f: Phổ 2 chiều HMBC c ủa hợp chất 2 Nhƣ vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 2 đã đƣợc xác định là hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl- (1→2)-α-L-arabinopyranoside , ứng với công thức phân tử C47H76O17, M=92 Hình 4.1.g: Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC của hợp chất 2 SV. Nguyễn Thị Tâm 40 K40C – Hóa học
  48. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 Bảng 4.2.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 @ δC 2 C a,b a,c δC δH (J, Hz) 1 39.2 39.6 0.99 (m)/1.63 (m) 2 26.5 26.5 1.75 (m)/1.90 (m) 3 81.4 82.4 3.64 (m) 4 43.8 43.9 - 5 47.8 48.0 1.29 (m) 6 18.3 18.8 1.38 (m)/1.52 (m) 7 33.0 33.4 1.29 (m)/1.64 (m) 8 39.9 40.4 - 9 48.4 48.9 1.65 (m) 10 37.1 37.6 - 11 24.0 24.5 1.91 (m) 12 122.6 123.5 5.26 (br s) 13 145.3 145.2 - 14 42.4 42.9 - 15 28.6 28.8 1.10 (m)/1.80 (m) 16 24.0 24.0 1.61 (m)/2.02 (m) 17 46.9 47.6 - 18 42.3 42.7 2.86 (br d, 10.5) 19 46.8 47.2 1.16 (m)/1.71 (m) 20 31.1 31.6 - 21 34.4 34.9 1.22 (m)/1.40 (m) 22 30.1 33.8 1.56 (m)/1.77 (m) 23 64.3 64.5 3.35 (d, 11.5)/3.58 (d, 11.5) 24 14.3 13.7 0.72 (s) 25 16.3 16.4 0.99 (s) 26 17.7 17.8 0.83 (s) 27 26.4 26.5 1.19 (s) 28 181.1 181.9 - 29 33.5 33.6 0.93 (s) 30 24.0 24.0 0.96 (s) 3-O-α-L-arabinopyranosyl 1′ 104.8 104.9 4.52 (d, 5.5) 2′ 75.6 76.9 3.67 (m) 3′ 74.8 73.9 3.68 (m) 4′ 69.6 69.6 3.80 (m) 3.53 (dd, 3.5, 11.0) 5′ 66.2 65.6 3.86 (br d, 11.0) 6′ - - - 2′- O-α-L-rhamnopyranosyl 1′′ 101.4 101.7 5.18 (br s) 2′′ 71.6 71.0 4.26 (br s) SV. Nguyễn Thị Tâm 41 K40C – Hóa học
  49. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 3′′ 82.8 82.7 3.90 (m) 4′′ 72.8 72.5 3.59 (m) 5′′ 69.7 70.1 3.93 (m) 6′′ 18.4 18.1 1.28 (d, 6.0) 3′-O-ß-D-glucopyranosyl 1′′′ 106.5 105.7 4.54 (d, 7.5) 2′′′ 75.6 75.3 3.33 (m) 3′′′ 78.4 77.7 3.41 (dd, 8.5, 9.0) 4′′′ 71.6 71.2 3.34 (m) 5′′′ 78.3 77.7 3.34 (m) 62.5 62.4 3.89*/3.71 (dd, 4.5, 11.5) a b c @ Đo trong CD3OD, 125 MHz, 500 MHz, δC hederagenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside [16]. SV. Nguyễn Thị Tâm 42 K40C – Hóa học
  50. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 KẾT LUẬN Bằng các phƣơng pháp chiết và sắc kí kết hợp nhƣ sắc kí cột nhồi silica gel pha thƣờng, sắc kí cột nhồi silicagel pha đảo, sắc kí lớp mỏng điều chế đã phân lập đƣợc hai hợp chất tritecpen saponin, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1) Hợp chất (1): 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid 2) Hợp chất (2): hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1 và hợp chất 2 đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại bao gồm phổ cộng hƣởng hạt nhân một chiều và hai chiều. SV. Nguyễn Thị Tâm 43 K40C – Hóa học
  51. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. [2] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. [3] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển 2, nxb.Trẻ, thành phố Hồ Chí Minh. [4] Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phƣơng Anh (2013), Bƣớc đầu xây dựng khóa định loại các chi trong họ Ngũ Gia Bì (Araliaceae) ở Việt Nam. Tiếng Anh. [5] Committee E.(2007), Flora of China.13, 436-438. [6] De Tommasi,Nunziatuna, Autore Giuseppina, Bellino Aurora, Pinto Aldo, Pizza Cosima, Sorrentino Raffaella,63 (3), 308-314. [7] Jebb, Matthew HP (1998), A reviesion of the genus Trevesia (Araliaeae). Glasra.3(2), 85-113. [8] Kannika banyaphu, Panee Sirisa – ard, Preeyaws Na Ubol, Surapol Nathaka Karnkitkul, Sunee Chansakaou, Tran Van On (2012), Phytochemical, an tioxidant and antibacterial activities of medicinal plants used in Northern Thailand as postpartum herbal bath recipes by the Mien (Yac) community, Phytopharmacology.2(1), 92-105. [9] Sripanidkulchai B, Wongpanich V, Laupattarakasem P, Suwansaksri J, Jirakulsomchok D, (2001), Diuretic effetic of selected Thai indigenous medicinal plants in rats. J Ethnopharmacol. May; 75 (2-3):185-90. [10] Duc Do Khac, Sung Tran An, Angela Martha Campos, Jean – Yves Lallemand and Marcel Fetizon, Ellagic acid compounds from Diplopanax stachy anthus, Phytochemical, Vol.29(1), pp25 – 256 (1990). [11]. Peter J.Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainiaspinosa, Phytochemical, Vol.25 (8) , pp 1939 – 1944 (1986). [12] Liang Guang – Yi, Alexander I.Gray amh Peter G.Waterman, Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162 -167 (1989). SV. Nguyễn Thị Tâm 44 K40C – Hóa học
  52. Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2 [13] M.Cláudia Marx Young, A. Potomati, E. Paulo Chu, M. Haraguchi, M. Yamamoto, and T. Kawano, 13C NMR analysis of monodesmosidic saponinis from Gomphrena macrocephala. Phytochemistry, 1997. 46(7): p. 1267-1270 . [14] K.M. Hasanur Rahman, Joyanto Kumar Nandi, Samira Sultana, Shahnaz Rahman, Shahadat Hossan, Mohammed Rahmatullah (2014), Phytochemical screening, antihyperglycemic and analgesic activity studies with methanol extract of Trevesia palmata leaves, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Volume 3, Issue 10, 91-101. [15] Mohammed Aktar Sayeed, Md. Faruk, Ahmad Ibtehaz Chowdhury, Ahmmed Rusti Faisal, Abdullah Al Mamun, Mujahidul Islam (2014), Thrombolytic and anti-arthritic activities of methanolic extract of Trevesia palmata, e-Journal of Science & Technology (e-JST), Vol. 9 (5), 119-124. [16 ] Saito, S., et al., Saponins from the Leaves of Aralia elata SEEM. : Araliaceae. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1990. 38(2): p. 411-414. [17] Takhtajan Armen (2009), Flowering Plants, ed 2, Springer. [18] Xiao K., Yi Y. H., et al. (1999) "A cytotoxic triterpene saponin from the root bark of Aralia dasyphylla", Journal of Natural Products, 62, pp. 1030-1032. [19] Yoshikawa M., Yoshizumi S., et al. (1995) "Medicinal foodstuffs. I. Hypoglycemic constituents from a garnish foodstuff "taranome," the young shoot of Aralia elata SEEM.: elatosides G, H, I, J, and K", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 43, pp. 1878-1882. [20] Yoshizaki K., Devkota H. P., et al. (2013) "Saponins composition of rhizomes, taproots, and lateral roots of Satsuma-ninjin Panax japonicus", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 61, pp. 344-350. [21] Yu S. S., Yu D. Q., et al. (1994) "Triterpenoid saponins from the roots of Aralia spinifolia", Journal of Natural Products, 57, pp. 978-982. [22] Zhang J., Wang H., et al. (2013) "Cardioprotective and antioxidant activities of a polysaccharide from the root bark of Aralia elata (Miq.) Seem", Carbohydrate Polymers, 93, pp. 442-448. SV. Nguyễn Thị Tâm 45 K40C – Hóa học