›

Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) họ bạc hà (Lamiaceae)

pdf 90 trang thiennha21 15/04/2022 3670
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) họ bạc hà (Lamiaceae)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_cua_cay_huong_nhu_tia.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) họ bạc hà (Lamiaceae)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA HÓA  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC. Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ. Đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (Ocimum sanctum L.) HỌ BẠC HÀ (Lamiaceae) Người hướng dẫn khoa học: Ths. PHÙNG VĂN TRUNG. Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỤY KHẢ ÁI. THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 2012
  2. LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên – Viện Công Nghệ Hóa Học – Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam; số 1 Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, quận 1, tp.Hồ Chí Minh; năm 2012. Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hạnh Cô luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận. ThS. Phùng Văn Trung Trưởng phòng Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên Thầy đã tận tình hướng dẫn em các kỹ thuật, truyền đạt những kiến thức chuyên môn, giúp em giải quyết những khó khăn gặp phải trong quá trình thực hiện luận văn. ThS. Phan Nhật Minh, cử nhân Nguyễn Tấn Phát, cử nhân Nguyễn Trung Kiên, cử nhân Võ Thị Bé cùng các anh chị trường Đại học Cần Thơ, các bạn sinh viên cùng thực hiện luận văn tại phòng Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên, năm 2012 đã giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý, cung cấp tài liệu, tạo điều kiện để em làm tốt công việc của mình Quý thầy cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Hóa-Tổ Hóa Hữu Cơ, cùng tất cả quý thầy cô giáo đã trang bị cho em những kiến thức nền tảng vững chắc trong suốt thời gian học tại trường, niên khóa 2008-2012. Cuối cùng con rất cảm ơn gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. TP.Hồ Chí Minh, tháng 05, năm 2012. NGUYỄN THỤY KHẢ ÁI.
  3. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ B.W Body Weight CHCl3 Chloroform COSY Correlation Spectroscopy D Doublet Dd Doublet of doublet DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation J Coupling constant M Multiplet MeOH Methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance
  4. PA Pure analysis ppm Parts per million PNP para-Nitrophenol PNP-Glc para-Nitrophenyl-α-D-glucoside Rf Retention factor s Singlet t Triplet T Technical TLC Thin Layer Chromatography UV Ultra Violet δ Chemical shift
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG: Trang Bảng 1.1. Khảo sát đường kính vòng vô khuẩn 5 Bảng 1.2: Tổng quan về thành phần hóa học của cây hương nhu tía. 27 Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột HPLC cao EtOAc. 40 Bảng 3.2: Cách pha mẫu thử hoạt tính. 45 Bảng 41: Khối lượng các loại cao so với nguyên liệu 46 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ HSQC của Os01 48 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của Os01. 49 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os01. 50 Bảng 4.5: So sánh dữ liệu phổ Os01 với tài liệu tham khảo. 51 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR và phổ DEPT của Os02. 56 Bảng 4.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os02 57 Bảng 4.8: So sánh dữ liệu phổ Os02 với tài liệu tham khảo. 57 Bảng 4.9: So sánh dữ liệu phổ Os03 với tài liệu tham khảo. 60 Bảng 4.10: Dữ liệu phổ 13C và DEPT của Os04 67 Bảng 4.11: Dữ liệu phổ 1H, 13C, HMBC của Os04 68 Bảng 4.12: Kết quả đo mật độ quang mẫu dựng đường chuẩn 70 Bảng 4.13: Kết quả đo mật độ quang mẫu Os03 70
  6. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ- BIỂU ĐỒ: Sơ đồ: Trang Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao EtOH. 38 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc. 40 Biểu đồ 4.1 : Phương trình đường chuẩn 68 Biểu đồ 4.2 : Phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế Os03. 69 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH: Trang Hình 1.1: Cây hương nhu tía. 4 Hình 1.2: Lá hương nhu tía 4 Hình 1.3: Cụm hoa hương nhu tía. 4 Hình 1.4: Quả hương nhu tía. 4 Hình 2.1: Sắc ký lớp mỏng. 33 Hình 2.2: Sắc ký cột. 33 Hình 3.1: Nguyên liệu được cắt nhỏ trước khi chiết với EtOH. 35 Hình 3.2: Sắc kí lớp mỏng cao EtOAc hương nhu tía. 39 Hình 3.3: Tinh chế Os01: (a): Trước, (b): Sau 41 Hình 3.4: Tinh chế Os03: (a) Trước, (b) sau. 42 Hình 3.5: Mẫu ức chế ở các nồng độ. 44 Hình 3.6: Mẫu thử hoạt tính 44 Hình 4.1 : Hợp chất Os01 47 Hình 4.2 : Sắc kí lớp mỏng Os01. 47
  7. Hình 4.3: Hợp chất Os02. 53 Hình 4.4: Sắc kí lớp mỏng Os02. 53 Hình 4.5 : Hợp chất Os03. 59 Hình 4.6 : Sắc kí lớp mỏng Os03. 59 Hình 4.7: Sắc kí lớp mỏng Os03 và ursolic acid 64 Hình 4.8: Hợp chất Os04 66 Hình 4.9 : Sắc kí lớp mỏng Os04 66
  8. MỤC LỤC: Trang Lời mở đầu 1 Chương 1: Tổng quan 2 1.1.Đại cương về cây hương nhu tía 2 1.1.1. Mô tả cây 2 1.1.1.1. Khái quát 2 1.1.1.2. Mô tả 2 1.1.2. Phân bố và sinh thái 3 1.2. Các nghiên cứu về hương nhu tía 5 1.2.1. Tác dụng dược lý 5 1.2.1.1. Các nghiên cứu trong nước 5 1.2.1.2. Các nghiên cứu ngoài nước 6 1.2.2. Thành phần hóa học 13 1.2.2.1. Các nghiên cứu trong nước 13 1.2.2.2. Các nghiên cứu ngoài nước 13 Chương II: Các phương pháp 30 2.1. Phương pháp chiết ngâm dầm 31 2.2. Phương pháp sắc kí lớp mỏng 32 2.3. Phương pháp sắc kí cột 32 2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng tiểu đường 33 Chương III: Thực nghiệm 35 3.1. Nguyên liệu-Hóa chất- Thiết bị 35 3.1.1. Nguyên liệu 35 3.1.2. Hóa chất 36 3.1.3. Thiết bị 36 3.2. Chiết xuất cao 37 3.2.1. Chiết xuất cao EtOH 37 3.3. Phân lập hoạt chất từ cao 39 3.3.1. Cô lập 39 3.3.2. Tinh chế 40 3.3.2.1. Os01 41 3.3.2.2. Os02 41 3.3.2.3. Os03 42 3.3.2.4. Os04 42 3.4. Xác định cấu trúc các hợp chất cô lập được 42 3.5. Thử hoạt tính kháng tiểu đường các chất phân lập được 42 3.5.1. Pha hóa chất 42 3.5.2. Tiến hành 42 Chương IV: Kết quả và thảo luận 46 4.1. Kết quả chiết xuất cao 46
  9. 4.1.1. Chiết xuất cao EtOH 46 4.2. Kết quả cô lập và tinh chế 46 4.2.1. Os01 47 4.2.1.1. Các đặc tính của Os01 47 4.2.1.2. Nhận danh cấu trúc Os01 47 4.2.2. Os02 52 4.2.2.1. Các đặc tính của Os02 52 4.2.2.2. Nhận danh cấu trúc Os02 53 4.2.3. Os03 60 4.2.3.1. Các đặc tính cuả Os03 61 4.2.3.2. Nhận danh cấu trúc Os03 61 4.2.4. Os04 66 4.2.4.1. Các đặc tính của Os04 66 4.2.4.2. Nhận danh cấu trúc Os04 66 4.3. Kết quả thử hoạt tính 70 Chương V: Kết luận và kiến nghị 72 5.1. Các kết quả đạt được 72 5.2. Kiến nghị 74 Tài liệu tham khảo 75
  10. LỜI MỞ ĐẦU Thiên nhiên cung cấp cho nhân loại một nguồn nguyên liệu lớn để tạo ra những phương thuốc chữa bệnh. Từ nhiều thế kỷ trước, các loại thảo mộc đã được sử dụng để chữa bệnh. Theo tổ chức y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số thế giới dựa vào y học cổ truyền để thực hiện việc chăm sóc sức khỏe thông thường. Hiện nay, bệnh đái tháo đường là một trong các bệnh mãn tính, gây tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư. Đái tháo đường ngày trở nên là vấn đề lớn đối với giới y khoa cũng như đối với cộng đồng. Vì vậy, đòi hỏi phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả đối với bệnh đái tháo đường. Theo kinh nghiệm dân gian, có khá nhiều dược liệu được dùng làm thuốc cho bệnh đái tháo đường. Trong đó, có hương nhu tía. Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) đã được biết đến hàng ngàn năm với nhiều nền văn minh trên thế giới. Loại thảo mộc này được xem như là biểu tượng thiêng liêng của đạo Hindu. Khoa học nghiên cứu về đặc tính chữa bệnh của hương nhu tía đã được phát triển từ giữa thế kỉ XX. Những năm gần đây, hương nhu tía được biết đến với nhiều công dụng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống mẫn cảm, làm lành vết thương, giảm nguy cơ ung thư, tăng cường sức khỏe Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học của cây hương nhu tía”. Trong luận văn này, chúng tôi trình bày một số kết quả chiết tách, cô lập, xác định cấu trúc đồng thời khảo sát hoạt tính kháng tiểu đường của các hợp chất cô lập được. Qua đó, góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây hương nhu tía .
  11. Chương I: TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY HƯƠNG NHU TÍA: 1.1.1. MÔ TẢ CÂY [2,3,4,5,8]: 1.1.1.1. KHÁI QUÁT: • Tên khoa học: Ocimum sanctum L. • Ngành: Magnoliophyta • Lớp: Magnoliophyta • Phân lớp: Lamiidae (hoa môi) • Bộ : Lamiales (hoa môi) • Họ: Lamiaceae (bạc hà) • Chi: Ocimum • Loài: B. monnieri • Tên Việt Nam: é tía, é rừng, é đỏ, • Tên nước ngoài: Monk’s basil, sacred basil, holy basil, rough basil, tulsi, mosquito plant of South Africa (Anh) ; basilic saint, basilic sacré (Pháp). 1.1.1.2. MÔ TẢ[3,4]: Cây nhỏ, sống hàng năm hay sống dai, cao đến gần 1m, thân cành đỏ tía (Hình 1.1). Lá mọc đối, có cuốn dài, hình mác hoặc thuôn, dài 2-5 cm, rộng 1-3 cm, mép khía răng, hai mặt màu tím có lông mềm (Hình 1.2) Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh, lá bắc nhỏ, hoa màu trắng hay tím tía, xếp thành tứng vòng 5-6 cái trên cụm hoa, đài hoa dài 3-5 mm,
  12. thùy trên hình mắt chim, thùy dưới hình giùi, dài hơn, những thùy bên rất ngắn, tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép, nhị 4, vươn ra ngoài tràng (Hình 1.3) Quả bế tư, gần hình cầu, hơi dẹt, màu nâu nhạt hoặc đỏ, có đốm đen nhỏ, nằm trong đài tồn tại (Hình 1.4) Mùa hoa quả: tháng 5-7. 1.1.2. PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI [3]: Ocimum L. có 8 loài, ở Việt Nam có 5 loài đều là cây trồng. Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới châu Á, trồng rải rác ở Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị. Ở Việt Nam, hương nhu tía mới được trồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc ở các cơ sở chữa bệnh theo y học cổ truyền. Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, nhiệt độ trung bình khoảng 25-300C, lượng mưa 1800-2600 mm/năm. Ở các vùng núi cao có khí hậu cận nhiệt đới và hơi lạnh không thấy trồng. Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu mùa đông thì tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều. Quả tự chín mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5-6 tháng. Cây trồng dễ dàng bằng hạt.
  13. Hình 1.1: Cây hương nhu tía. Hình 1.2: Lá hương nhu tía Hình 1.3: Cụm hoa hương nhu tía. Hình 1.4: Quả hương nhu tía.
  14. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HƯƠNG NHU TÍA: 1.2.1. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ: 1.2.1.1. Các nghiên cứu trong nước: Hương nhu tía là loài thực vật có ở Việt Nam, nhân dân hay dùng lá cây này để chữa một số bệnh. Song cho đến nay chưa có tài liệu nào công bố về thành phần hóa học của cây hương nhu tía. Ngoại trừ một số tác dụng và bài thuốc có hương nhu tía sau đây: Tác dụng kháng khuẩn: Ở Việt Nam, tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu hương nhu tía đã được viện nghiên cứu Đông y thí nghiệm trên các chủng sau, với sự đánh giá bằng đường kính vòng vô khuẩn[1] Bảng 1.1. Khảo sát đường kính vòng vô khuẩn[1]. Chủng vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Basillus mecoydes 22 B.subtilis 60 Diplococcus pneumoniae 0 Escherichia coli 15 Klebsiella sp 12 Mycobacterium tuberculosi 18 Proteus vulgaris 18 Salmonella typhy 22
  15. Shigella dysenteriae 30 Sh.flexneri 12 Staphylococcus aureus 20 Streptococcus haemolyticus 15 Chữa cảm sốt, nhức đầu, đau bụng, tay chân lạnh: Hương nhu tía 500g, hậu phác (tẩm gừng nướng) 200g, bạch biến đậu (sao) 2000g. tất cả tán nhỏ, trộn đều, mỗi lần uống 10g có khi đền 20g với nước sôi để nguội[2,3]. Chữa cảm, làm ra mồ hôi, hạ sốt: Hương nhu tía, hoắc hương, bạc hà, sả, tía tô, lá bưởi, lá chanh mỗi thứ 10g. Tất cả rủa sạch, đun sôi, dùng xông hơi [2,3] Phòng, chữa cảm nắng, say nắng: Lá hương nhu tía 32g, hạt đậu ván 32g, củ sắn dây 32g, gừng sống 12g. Các vị phơi khô, tán nhỏ, rây bột mịn. Mỗi lần người lớn dùng 16g, trẻ em 8g, hãm với nước sôi, gạn uống[2,3]. Chữa hôi miệng: Hương nhu tía 10g, sắc với 200ml nước, dùng súc miệng và ngậm[3]. Tác dụng khác: Tinh dầu hương nhu tía còn được chứng minh là có tác dụng diệt amid- Entamoeba moskowskii trên môi trường nuôi cấy với nồng độ 1/1280[1]. Ngoài ra, tinh dầu hương nhu tía đã được xác nhận có tác dụng kháng histamin trong thí nghiệm gây co bóp hồi trường cô lập chuột lang[1].
  16. 1.2.1.2. Các nghiên cứu ngoài nước: Những nghiên cứu của nền y học hiện đại cho thấy, những phần khác nhau của cây hương nhu tía như lá, hoa, hạt, rễ, thân, đều có khả năng chữa bệnh. Và một số đã được sử dụng trong hỗ trợ điều trị các loại bệnh như làm thuốc long đờm, giảm đau, kháng ung thư, chống hen, làm tiết mồ hôi, chống nôn, bảo vệ gan, giảm huyết áp, giảm mỡ trong máu, giảm căng thẳng, hạ sốt, viêm phế quản, viêm khớp, co giật[14] Sau dây là một số nghiên cứu trên Thế giới về dược tính của hương nhu tía: • Tính kháng khuẩn: Tinh dầu hương nhu tía được nghiên cứu có tác dụng ngăn cản sự phát triển của Mycobacterium tuberculosis và Micrococcus pyogenes var.aureus, Anthrobacter globiformis, Bacillus megaterium, Escherichiacoli, Pseudomonas spp. Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus và Vibrio cholerae[18, 37], các chủng nấm Alternaria solani, Candida guillermondii, Colletotricum capsici, Curvularia spp.Fusarium solani, Helminthosporium oryzae. Tinh dầu hương nhu tía có thể tác dụng với cả hai loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Tinh dầu hương nhu tía tác dụng bằng 1/10 hiệu lực của streptomycin và bằng 1/4 isoniazid trong việc điều trị lao phổi[10]. Cao nước hay aceton của hương nhu tía có tác dụng chống lại nhiều loại nấm mốc như Alternaria tenuis, Helminthosporium spp, và Curvularia penniseli[41]. Cao nước và cao cồn hương nhu tía đều cho thấy tác dụng chống khuynh hướng kháng lại thuốc của S.aureus, Neisseria gonorrhe[12]. Tính kháng khuẩn của hương nhu tía nói chung cao hơn so với các cây khác cùng loài Ocimum (i.e. O. canum, O. gratissimum, O. basilicum) ở Ấn Độ. Lá hương nhu tía tươi có tính kháng khuẩn và nấm mạnh hơn so với lá khô. • Kháng tiểu đường:
  17. Điều trị trên 15 ngày bằng cao chiết lá hương nhu tía làm hạ mức đường huyết xuống 43% thí nghiệm trên chuột tiểu đường. Việc kiểm soát mức đường huyết trên của chuột dừng lại ngay khi ngừng cho ăn cao chiết lá hương nhu tía. Điều này chứng minh một cách rõ ràng hoạt tính giảm glycemic của hương nhu tía[9]. Tương tự, tác dụng của cao ethanol hương nhu tía trên chuột tiểu đường gây ra bởi glucose và streptozotocin, cho thấy tác dụng hạ mức glucose trong huyết thanh là 91.55% trên chuột bình thường và 70,43% trên chuột bệnh [9]. Cao methanol hương nhu tía (200 mg/kg, bw) dùng trong 30 ngày trên động vật thí nghiệm, hoạt động của glucokinase và hexokinase tăng lên đáng kể[55]. Cao nước toàn cây hương nhu tía (200mg/kg, bw) dùng trong 60 ngày làm trì hoãn sự kháng insulin ở chuột thí nghiệm được cho ăn fructose[40]. Hương nhu tía cũng thể hiện tính kháng tiểu đường khi phối trộn với các thảo dược khác. Sử dụng 1% bột lá hương nhu tía khô trong khẩu phần ăn của chuột bệnh trong 30 ngày, kết quả mức đường huyết, axit uronic, tổng lượng amino axit, triglyceride, phospholipid và tổng lượng lipid hạ xuống cách đáng kể[38]. Cao ethanol và các dung môi hữu cơ khác đều được nhân thấy có tác dụng kích thích sự tiết insulin ở chuột. Trong một thử nghiệm ban đầu tính kháng tiểu đường của hương nhu tía trên người, người ta nghiên cứu trên 40 bệnh nhân không insulin . Thực tế cho thấy, sử dụng khi đói, liều 2.5g/ngày bột lá hương nhu tía tươi có thể giảm mức đường huyết xuống 21mg/dl và mức đường huyết ngay sau bữa ăn là 15.8 mg/dl[9]. • Bảo vệ gan: Cao ethanol hương nhu tía có thể bảo vệ gan khỏi những tổn thương do sử dụng thuốc điều trị lao phổi và paracetamol trên chuột thí nghiệm[50]. Nó làm tăng đáng kể các enzyme (aspartate, aminotransferase, alkaline và acid phosphatase) và glutathione trên chuột thí nghiệm[17].
  18. Dùng cao cồn chiết lá hương nhu tía (200 mg/kg, bw) ở chuột cho thấy tác dụng bảo vệ khỏi tổn thương gan gây bởi paracetamol. Cao nước, lạnh hương nhu tía (3g/100g, dùng 6 ngày) cho thấy tác dụng chống tổn thương gan ở chuột gây bởi carbon tetrachloride (0,2 ml/100g)[46]. • Kháng viêm: Nhũ dịch và cao methanol của hương nhu tía cho thấy tác dụng ngăn cản chứng viêm cấp tính và mãn tính ở chuột với liều lượng (500mg/day/kg, bw)[21]. Tinh dầu chiết từ lá tươi và hạt hương nhu tía có tác dụng kháng viêm trong chứng phù chân gây bởi carrageenan, serotonin, histamine và prostaglandin-E-2 ở những loài thú có móng. Trong một thí nghiệm, người ta cho chuột ăn tinh dầu lá (200mg/kg,bw) và tinh dầu hạt hương nhu tía (0.1ml/kg,bw) trước khi tiêm vào cơ thể tác nhân gây viêm. Kết quả cho thấy tác dụng của hương nhu tía có thể so sánh được nhưng ít hơn so với thuốc kháng viêm tiêu chuẩn flurbiprofen [47] So sánh tính kháng viêm của những cây khác cùng chi Ocimum (có tỷ lệ cao chất béo chưa bão hòa). Ocimum basilicum chứa hàm lượng axit linolenic cao nhất (21%) và tác dụng cao nhất (72,42%), Ocimum sanctum chứa 16,63% axit linolenic tác dụng kháng viêm 68,97%. Trong khi Ocimum americanum tác dụng kháng viêm ít nhất [44] • Kháng ung thư: Cao chiết acol của lá hương nhu tía ảnh hưởng lên enzyme chuyển hóa chất sinh ung thư như cytochrome P450, cytochome b5, aryl hydrocarbon hydroxylase và glutathione S-transferase nhờ đó giải độc chất sinh ung thư và biến đổi gen[42]. Tác dụng kháng ung thư của hương nhu tía đã được nghiên cứu cho thấy nó ngăn chặn chứng xơ hóa cấu trúc tế bào, liều lượng tối thiểu gây đầu độc tế bào là [54] 50µg/ml . Về mặt hình thái, tế bào chất bị teo lại và nhân tế bào bị cô đặc. DNA quan sát thấy bị phân mảnh trong gel agarnose tích điện[23]. Hương nhu tía có ý
  19. nghĩa trong việc giảm tác động của benzo(a)pyrine gây khối u ở dạ dày trước và 3’- methyl-4-dimethylaminoazo-benzene gây ung thư gan trên chuột[11]. Cao chiết cồn của hương nhu tía cho thấy tác dụng ngăn chặn tác nhân hóa học gây ung thư da chuột[53]. Tác dụng của hương nhu tía trên 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) giảm đáng kể khối u gây bởi papillomagenesis. Hương nhu tía còn có tác dụng ngăn ngừa sớm tác động của DMBA gây ung thư thành dạ dày[24] và làm trở ngại hay ngăn chặn sự kết hợp các chất sinh ung thư, ngăn sự chuyển hóa, hoạt hóa chất sinh ung thư[34]. • Tăng cường miễn dịch: Những hợp chất cô lập từ hương nhu tía thể hiện tính chống viêm hoặc ngăn chặn hoạt động của cyclooxygenase[42]. Eugenol ngăn chặn 97% hoạt động của cyclooxygenase khi làm thí nghiệm ở 1000µM cô đặc. Civsilineol, Cirsimaritin, Isothymusin, Apigenin và axit Rosmarinic cũng chứng minh tác dụng ngăn chặn hoạt động của cyclooxygenase. • Chống phóng xạ: [52] Umadevi và cộng sự (đại học y dược Kasturba, Ấn độ) là những người tiên phong trong việc nghiên cứu khả năng chống phóng xạ của hương nhu tía.Tác dụng này lần đầu tiên được công bố vào năm 1995 bởi Umadevi và Ganasoundari với nghiên cứu về khả năng gây chết của cao nước và cao cồn hương nhu tía thử nghiệm trên chuột bạch. Nghiên cứu trên cũng cho thấy sử dụng cao nước có tỉ lệ sống sót cao hơn so với cao cồn ở cùng một điều kiện thử nghiệm. Liều tối ưu được đưa ra là (50 mg/kg, bw) và liều gây chết 50% LD50 là (6 g/kg, bw). Ngoài ra, việc tăng liều lượng sử dụng không làm tăng hiệu quả chống phóng xạ[51]. Nghiên cứu còn cho thấy hai flavonoid cô lập từ hương nhu tía: orientin và vicenin từ lá hương nhu tía cho thấy tác dụng bảo vệ khỏi phóng xạ. Hai flavonoid trên cho thấy tác dụng tốt hơn khi kết hợp với chất chống phóng xạ tổng hợp. Nó đã cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể cho tế bào bạch huyết người khỏi tác dụng của chất phóng xạ ở nồng độ thấp và không gây độc cho cơ thể. Sự kết hợp của cao
  20. chiết hương nhu tía với WR-2721(chất chống phóng xạ tổng hợp) cho kết quả cao hơn ở tế bào tủy xương[51]. Việc kết hợp này hứa hẹn một phương pháp chống phóng xạ hiệu quả cho con người trong tương lai. • Diệt côn trùng, ấu trùng: Dịch chiết hương nhu tía được nghiên cứu cho thấy tác dụng bảo vệ các sản phẩm tự nhiên khỏi sự tấn công của côn trùng, ấu trùng Khi ngâm hạt hương nhu tía trong nước trong vòng 1 giờ, nó sẽ rỉ ra một loại chất nhầy, giữ lấy và làm chết các ấu trùng. Thí nghiệm phân tán 100 ấu trùng Culex fatigans trong nước rỉ chứa lần lượt 25, 50, 75 hạt hương nhu tía trên 1m2. Trong 48 giờ, 100% ấu trùng chết trong dịch nước rỉ chứa 75 hạt/m2, 89% với 50 hạt/m2 và 65% với 25 hạt/m2[22]. Ngoài ra, hương nhu tía còn chống lại sự phát triển của Anopheles stephensi, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatu [15], A. stephensi, A. aegypti, C. quinquefasciatus, Helicoverpa armigera, Sylepta derogata, Anopheles stephensi [25] Dịch chiết hương nhu tía gây chết 100% ở A. stephensi, A. aegypti với liều 0,003 ml/ 43 cm2[15]. • Giảm căng thẳng: Cao chiết EtOH toàn cây hương nhu tía, làm tăng sức chịu đựng vật lý của chuột thí nghiệm, cao EtOH ngăn chặn hepatotocicity và leukocytosis ở liều (100 mg/kg, bw)[13]. • Kháng oxy hóa: Nghiên cứu in vivo ở chuột cho thấy tính kháng oxy hóa của flavonoid orientin và vicenin, sự giảm đáng kể của bức xạ nhiệt gây ra peroxid hóa lipid trong gan chuột. Cao chiết hương nhu tía có khả năng phản ứng và làm giảm các gốc tự do[54].
  21. Các hợp chất của phenol như cirsilineol, cirsimaritin, isothymusin, apigenin, axit rosmarinic và eugenol trong lá tươi và hạt cũng có tác dụng chống oxy hóa cao. • Chống lở loét [16]: Một nhóm các nhà khoa học ở trung tâm nghiên cứu thuốc, Lucknow Ấn độ đã nghiên cứu và đánh giá khả năng chống lở loét của hương nhu tía ở chuột. Hương nhu tía cho thấy tác dụng trên chứng thắt môn vị. Tính chất trên có được là nhờ khả năng làm giảm tiết axit và tăng tiết chất nhầy của hương nhu tía. • Hạ sốt, giảm đau, làm lành vết thương: Dịch chiết MeOH và dạng nhũ dịch chiết xuất từ hương nhu tía đã được kiểm tra khả năng chống viêm và hạ sốt trong thí nghiệm dùng tấm nóng ở chuột. Thí nghiệm cho thấy cả hai dạng chiết xuất đều có tác dụng giảm đau. Tuy nhiên, dịch chiết có tác dụng cao hơn. Ngoài ra, dịch chiết còn có khả năng kéo dài thời gian gây phản ứng cong đuôi của morphin trên chuột cống trắng[47]. Trên súc vật gây sốt bằng cách tiêm vaccin thương hàn và phó thương hàn, dung dịch chiết MeOH (250 mg/kg, bw) và nhũ dịch (100 mg/kg, bw) đều tỏ ra có tác dụng hạ sốt [47]. Tinh dầu hương nhu tía cũng có khả năng tác dụng tương tự, với liều (3ml/kg, bw) tác dụng hạ sốt có thể so sánh với aspirin. Dịch chiết bằng nước của hương nhu tía làm thuận lợi cho quá trình biến thành biểu mô của vết cắt và tăng khả năng liền sẹo. • Tăng cường trí nhớ: Dịch chiết hương nhu tía tỏ ra có tác dụng cải thiện chứng hay quên gây ra bởi scopolamine (0,4mg/kg) và lão hóa dẫn đến suy giảm trí nhớ ở chuột. Nó làm giảm điện áp ngầm và sự chuyển hóa acetylcholinesterase một cách đáng kể. Từ đó, hương nhu tía có thể được dùng trong hỗ trợ điều trị các chứng rối loạn nhận thức như tâm thần phân liệt và Alzheimer [55] • Ngừa đục nhân mắt:
  22. Dịch chiết nước từ lá hương nhu tía tươi làm trì hoãn quá trình đục nhân mắt trên hai mẫu (galactosemic cataract ở chuột bởi 30% galactose và napthalene cataract ở thỏ bởi 1g/kg napthalene). Hương nhu tía 1 và 2 g/kg, bw trì hoãn sự tấn công gây mưng mủ theo sau của bệnh đục nhân mắt một cách hiệu quả ở cả hai mẫu[55]. • Liều gây độc: Liều gây chết của tinh dầu không bay hơi hương nhu tía được đo lường sau khi nghiên cứu trên chuột. Liều dùng tối ưu là (30 ml/kg, bw). Trong khi với liều (55 ml/kg, bw) sẽ gây chết 100%. Liều gây chết 50% LD50 là (42,5 ml/kg, bw). Không nhận thấy rủi ro nào trong nghiên cứu sử dụng với liều 3ml/kg/ngày trong 14 ngày ở chuột. [33] 1.2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC: 1.2.2.1. Các nghiên cứu trong nước[2,3,4]: -Hàm lượng tinh dầu trong cây đạt 0,5%. -Thành phần tinh dầu trong cây được phân thành nhiều nhóm hóa học: • Nhóm Methyl eugenol: 72,7% • Carophylen 17,3% Hương nhu tía Việt Nam chứa 30-40% eugenol. Tinh dầu hương nhu tía Việt Nam chứa α- pinen, sapinen, β- pinen, myrcen, 1- 8 cineol, linalol, camphor, borneol, linalyl acetate, terpinen-4-ol, α- terpineol, geraniol, cetral, eugenol, methyleugenol và β-carophylen, α-humulen, methyl iso eugenol, β- elemen, δ- elemen, sesquiterpen. Các thành phần chính là eugenol (trên 70 %) và methyl eugenol (trên 12%) và β- carophylen. Các thành phần này giống như thành phần của tinh dầu hương nhu tía Ân Độ. 1.2.2.2. Các nghiên cứu ngoài nước:
  23. Người ta đã tìm ra một số hợp chất trong cây hương nhu tía và được thống kê sơ bộ thành các nhóm chính như sau: CÁC HỢP CHẤT PHENOL: Hợp chất phenol nói chung dùng để chỉ những hợp chất mà trong cấu trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy –OH. Trong thiên nhiên, các hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, coumarin, quinon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (lignin, tanin ). Flavonoid: Flavonoid là những hợp chất có màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các Flavonoid có màu vàng,. Tuy vậy, một số có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có khung sườn căn bản. 2 3 2'' 3'' 5' 8 O OH 1 7 9 O1 1'' 4' 7 1 B 4'' 6' 4 2 B A A 5 6 4 3 6'' 5'' 3' 6 10 1' 5 2' O O Thường thì Flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3,4,5 trên nhân B. Các Flavonoid đã cô lập được từ cây hương nhu tía: [15, 30, 43] OH OH OH HO O HO O OH O OH O Apigenin Luteolin
  24. Cirsimaritin Isothymusin Navadensin Acacetin Isothymonin Gardenin B
  25. Genkwanin Ladanein Cirsilineol Euparotin Xanthomicrol Salvigenin
  26. Apigenin-7,4’-dimethyl
  27. Dạng glycosid: OH OH HO O O HO OH O HO OH OH Isoorientin Orientin Vicenin-1 Vicenin-2
  28. Molludistin Vitexin Galuteolin Isovitexin
  29. O OH OH HO HO O OH OH O O OH O Apigenin-7-glucuronide O OH OH HO OH O OH OH O O OH O OH O Luteolin-7-glucuronide
  30. Loại C6C3 (Phenylpropanoid): Loại này được chia thành nhiều nhóm: nhóm trực tiếp, nhóm được este hóa, nhóm đóng vòng, nhóm các hợp chất lignan Nhóm trực tiếp: Nhiều hợp chất trong nhóm này là thành phần chủ yếu của các loại tinh dầu như eugenol, anethol, safrol Nhóm được este hóa: rất thường gặp trong giới thực vật. Acid clorogenic có tính chất gần giống như tanin, acid rosmarinic được xem là “tanin của họ Lamiaceae” Nhóm đóng vòng: dẫn xuất o-hydroxycinamat đóng vòng tạo thành coumarin. Coumarin cộng thêm một đơn vị isopren thành furocoumarin, cũng có thể cộng thêm hai đơn vị isopren Các mạch nhánh isopren rất hoạt tính, có thể được epoxy hóa, hydroxyl hóa, đóng vòng tạo ra những hợp chất khác nhau. Nhóm các hợp chất lignan: tạo thành khi hai đơn vị phenylpropanoid được nối lại với nhau qua một nối carbon-carbon. [30, 43] Các hợp chất phenol C6C3 đã được cô lập từ hương nhu tía : OH H3CO HO H3CO Carvacrol Eugenol Estragol
  31. HO HO O O Methyl eugenol Aeculectin HO O O O O H OH O OH OH Aeculin OH O OH OH O O HO OH Rosmarinic acid Chlorogenic acid
  32. Eugenyl-β-D-glucoside 4-allyl-1-O-β-D glucopyranosyl-2-hydroxybenzene
  33. Loại C6C1 và C6C2: Các hợp chất này do sự β-oxid hóa đã cắt ngắn mạch nhánh của cinamat, cùng các dẫn xuất của nó có mang nhóm hydroxy –OH hoặc methoxi –OCH3: Các hợp chất loại C6C1 và C6C2 đã phân lập được: Gallic acid Protocatechuic Gallic acid methyl ester Gallic acid ethyl ester Vanilic acid 4-hydroxybenzoic acid
  34. TRITERPEN: Triterpen có công thức tổng quát C30H48. Chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp là pharnesyl pyrophosphate. Triterpen được phân bố rộng rãi trong giới động và thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside. Cấu trúc của triterpen có thể là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng. Một số khung sườn triterpen: Loại mạch hở Loại 3 vòng Loại 4 vòng Loại 5 vòng
  35. Các Triterpen đã phân lập được: Ursolic acid Oleanoic acid CÁC STEROL: Stigmasterol β−sitosterol
  36. Bảng 1.1 : Tổng quan về thành phần hóa học của cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) [2,3,4,20,30,43] Tinh dầu lá Cao chiết cồn lá, Tinh dầu không bay hơi Chất thân từ hạt khoáng α–Thujene Ursolic acid Palmitric acid Vitamin C Octane Apigenin Stearic acid Carotene Benzene Luteolin Linoleic acid Ca (Z)-3-hexanol Apigenin–7–O– Oleic acid P Ethyl 2- methyl glucuronide Sitosterol Cr butyrate Luteolin-7–O– Dilinoleno– inolins Cu glucuronide α−pinene Linolenodilinolin Zn Salvigenin β−pinene Hexourenic acid V Eupatorin Toluene Fe Isorientin Citronellal Ni Orientin Camphene Muối Genkwanin Sabinene Oxalate Apigenin-7,4’- Dimethyl benzene dimethyl Myrecene Molludistin Ethyl benzene Stigmasterol Limocene β– stigmasterol 1, 8 – cineol Triacontanol ferulate Cis– β-ocimene Xanthomicrol Trans–β–ocimene
  37. Tinh dầu lá Cao chiết cồn lá, Tinh dầu không bay Chất thân hơi từ hạt khoáng p- cymene Vicenin – 2 Terpiniolene Vicenin – 1 Allo–ocimene Vitexin Butyl–benzene Isovitexin α–cubebene Gadenin B γ - terpene Ladanein Trans–linalool Acacetin oxide Aesculectin α – copaene Aesculin β–bourbonene Chlorogenic acid β–cubebene Galuteolin Linalool Circineol Eugenol Gallic acid Methyl eugenol Gallic acid methyl ester β – farnesene Gallic acid ethyl β – elemene ester (E)–cinnamyl Procatechuic acid acetate Vanillin acid Isocaryophyllene Vanilin
  38. Tinh dầu lá Cao chiết Tinh dầu Chất khoáng cồn lá, thân không bay hơi từ hạt β-caryophyllene 4– hydroxybenzoic acid Iso–eugenol Eugenyl-β-D- α – guainene glucoside α – amorphene Phenylpropane α – humulene glucoside 2 γ – humulene Oleanoic acid 4, 11 – selinadiene β−sitosterol α – terpeneol Navadesin Isoborneol Borncol Germacrene – D α – selinene β–selinene Myrtenylformat α – muurolene δ – cadinene Cuparene Calamenene
  39. Tinh dầu lá Cao chiết cồn lá, Tinh dầu không Chất khoáng thân bay hơi từ hạt Ledol Humulene oxide α – guadiol τ – cadinol α – bisbolol (EZ) – farnesol Cis-sesquisabinene Geraneol Nerolidol Caryophyllene oxide Ledol
  40. ChươngII: CÁC PHƯƠNG PHÁP. 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT NGÂM DẦM[6]: Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi sử dụng để chiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc thu được dịch chiết. Thu hồi dung môi thu được cao chiết. Rót tiếp dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. 2.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG:[6] Còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxid alumin). Bình sắc ký làm bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy. Pha tĩnh được tráng thành lớp mỏng (0,25 mm), đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, nhôm hoặc plastis. Do vậy, được gọi là sắc ký lớp mỏng. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1µl, nồng độ 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên, cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình giải ly.
  41. Khi pha động di chuyển chậm, dọc theo tấm lớp mỏng sẽ lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển của các loại hợp chất đều khác nhau. Với chất hấp thu là silica gel, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm (Hình 2.1) 2.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT:[6] Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Adsorption chromatography). Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn. Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách nhau ra (Hình 2.2) Hình 2.1.: Sắc ký lớp mỏng. Hình 2.2: Sắc ký cột. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực.
  42. 2.4. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG (ức chế α – glucosidase): Phương pháp ức chê men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường type 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy như các phương pháp khác. Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc: Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo mật độ hấp thu ở bước sóng λ = 405nm. Từ đó xác định lượng D-glucose sinh ra: OH OH OH H O H O α HO HO _glucosidase HO HO OH OH α_ D_glucose OH O NO2 O2N p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không có ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
  43. IC50 được định nghĩa: Là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Từ giá trị I%, ta tính được giá trị IC50. Cách tính IC50 Khả năng ức chế α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I %). Phần trăm ức chế (I %) được xác định theo công thức: A - A I % = 0 S x 100% A0 Với Ao: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất. As: Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu có hoạt chất.
  44. Chương III: THỰC NGHIỆM 3.1. NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ: 3.1.1. NGUYÊN LIỆU: Nguyên liệu sử dụng cho đề tài này là phần thân, lá, hoa, hạt trên mặt đất của cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). Nguyên liệu được cắt nhỏ trước khi thực hiện quá trình chiết với EtOH. Nguyên liệu này được lấy từ Bình Dương vào tháng 8 năm 2011. Hình 3.1: Nguyên liệu được cắt nhỏ trước khi chiết với EtOH. 3.1.2. HÓA CHẤT:  Etanol 960, (T), Việt Nam  Hexan, (PA), Trung Quốc  Etyl acetate, (PA), Trung Quốc  Metanol, (PA), Trung Quốc  Chloroform, (PA), Trung Quốc  Silica gel 60, schariau, đường kính hạt: 0.04 – 0.06mm  DMSO, (PA), Merck
  45. • Nước khử ion • α−Glucosidase, type I Bakers Yeast, USA • Dung dịch đệm pH= 6.8 (Na2HPO4, KH2PO4) • p- Nitrophenol, Trung Quốc. • p- Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, Trung Quốc. • Thuốc đặc trị tiểu đường Glucobay (50 mg Acarbose), Đức 3.1.3. THIẾT BỊ  Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R-200  Sắc ký lớp mỏng TLC được thực hiện trên bản Silica gel 60 F254, MERCK tráng sẵn  Đèn UV: MINERALIGHT® LAMP, U.S.A  Bình phun xịt thuốc thử  Bếp điện dùng để nướng bản mỏng Blacker®  Các loại cột sắc ký  Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân  Máy đọc đĩa 96 giếng, Elx800 (Bioteck)  Pipet  Micropipet 100 –1000µl, 20-2000µl.  Máy đo pH. 3.2. CHIẾT XUẤT CAO 3.2.1. CHIẾT XUẤT CAO EtOH:
  46. Từ mẫu nguyên liệu ban đầu, đem chiết với EtOH 960, lọc tách bã, cô quay đuổi dung môi ở áp suất kém thu được cao EtOH. Đem cao EtOH chiết lần lượt với các dung môi từ không phân cực đến phân cực để thu được cao n-hexan, cao EtOAc, cao MeOH. Sử dụng nguyên liệu là 5 kg hương nhu tía tươi chiết bằng phương pháp ngâm dầm với 10 lít dung môi EtOH 960. Lọc lấy dịch chiết, cô quay ở áp suất thấp đuổi dung môi thu được cao EtOH (146g). Đem cao EtOH chiết lần lượt với các dung môi từ không phân cực đến phân cực: n-hexan, EtOAc, MeOH. Sau khi chiết với 4 lít n-hexan, lọc lấy phần dịch tan trong n-hexan đem cô quay đuổi dung môi thu được cao n-hexan (27g), phần không tan trong n-hexan đem chiết tiếp với 6 lít EtOAc, làm tương tự như trên ta thu được cao EtOAc (12.3g), phần không tan trong EtOAc đem chiết với 1.5 lít MeOH, sau đó cô quay đuổi dung môi thu được cao MeOH (94g)
  47. Hương nhu tía tươi (5kg) - EtOH 96o (10 lít) - lọc - cô quay đuổi dung môi Bã Cao EtOH (146g) - n-hexan (4 lít) - cô quay đuổi dung môi Phần không tan Cao hexan (27g) - EtOAc (6 lít) - cô quay đuổi dung môi Phần không tan Cao EtOAc (12.3g) - MeOH (1.5 lít) - cô quay đuổi dung môi Phần không tan Cao MeOH (94g) Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao EtOH
  48. 3.3. PHÂN LẬP HOẠT CHẤT TỪ CAO: 3.3.1. CÔ LẬP: Các mẫu cao chiết thu được từ cây hương nhu tía là những hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ. Việc tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp được thực hiện trên cột silicagel với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại một vài lần để thu được chúng ở dạng tinh sạch, đáp ứng yêu cầu xác định cấu trúc hóa học. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành phân lập hoạt chất từ mẫu cao bằng phương pháp sắc ký cột cao áp và trung áp. Nhận thấy cao EtOAc có hoạt tính và cho nhiều vết rõ ràng trên bản mỏng. Do đó, chúng tôi lựa chọn cao EtOAC để cô lập các hợp chất. Hình 3.2: Sắc kí lớp mỏng cao EtOAc hương nhu tía. Tiến hành cô lập bằng phương pháp sắc ký cột hấp thu với máy sắc ký cột HPLC. • Kích thước cột 40 x 300mm. • Khối lượng mẫu: 10g.
  49. • Silicagel 0.04 x 0.06 mm. • Dung môi ổn định cột là n-hexan Dùng bơm để bơm dung môi n-hexan ổn định cột. Sau khi ổn định cột, nạp mẫu cao EtOAc (10g) dạng khô vào cột. Tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly. Lấy thể tích mỗi phân đoạn 250mL. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện. Cao EtOAc 10 g Phân Phân Phân Phân Phân Phân Phân Phân Phân đoạn đoạn đoạn đoạn đoạn đoạn đoạn đoạn đoạn I A B C D E F G H Os03 Os04 Os01 Os02 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc. Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột HPLC điều chế cao EtOAc Phân Hệ dung môi Kết quả thử TLC đoạn A HE 75:25 Một vết chính màu tím hồng
  50. B HE 75:25 Một vết chính màu vàng C HE 50:50 Một vết chính màu vàng D HE 50:50 Nhiều vết E HE 25:75 Nhiều vết F HE 25:75 Một vết chính màu vàng nâu G HE 25:75 Nhiều vết H EtOAc Vệt kéo dài I EtOAc Vệt kéo dài 3.3.2. TINH CHẾ: 3.3.2.1. Os01: Ở phân đoạn C xuất hiện kết tinh màu vàng. Rửa nhiều lần bằng n-Hexan. Kết tinh lại nhiều lần trong MeOH. Thu được 22 mg chất kết tinh hình kim màu vàng. Ký hiệu: Os01. (a) (b) Hình 3.3: Tinh chế Os01: (a): Trước, (b): Sau 3.3.2.2.Os02:
  51. Ở phân đoạn F (m=196.4mg) thấy có một vết chính màu vàng nâu, tiến hành sắc ký cột gradient bắt đầu từ hệ dung môi CHCl3 100% đến hệ dung môi CHCl3: MeOH 92:8. Thu được 13 mg chất dạng bột vô định hình màu trắng. Ký hiệu là Os02. 3.3.2.3. Os03:Ở phân đoạn A xuất hiện khối bột vô định hình màu trắng. Tiến hành rửa nhiều lần bằng MeOH. Nhận thấy khối bột màu trắng tan một phần trong MeOH. Kết tinh lại nhiều lần thu 25mg được chất bột vô định hình màu trắng. Ký hiệu: Os03. (a) (b) Hình 3.4: Tinh chế Os03: (a) Trước, (b) sau. 3.3.2.4. Os04: Ở phân đoạn B (m= 274mg) thấy có một vết chính màu vàng, tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi sử dụng giải ly là CHCl3 – MeOH 95:5. Thu được 5 phân đoạn. Ở phân đoạn EB1 thu được một hỗn hợp chất dạng bột màu vàng nhạt (53mg). Tiếp tục tiến hành sắc ký cột hỗn hợp trên với hệ dung môi 97:3. Thu được 14mg chất kết tinh hình kim màu vàng nhạt. Ký hiệu là Os04. 3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC: Nhận danh cấu trúc của chất đã phân lập được thông qua phổ 1H-NMR, 13C- NMR, HSQC, HMBC.
  52. 3.5. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG CỦA CAO VÀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC: 3.5.1.PHA HÓA CHẤT: - Dung dịch chất ức chế: • Cân 1mg chất sạch (đã khô dung môi) pha trong 2.5ml dung môi DMSO, tương ứng với nồng độ 100 µg/ml (khi pha vào tổng thể tích 100 µl của mẫu thử hoạt tính) • Hút lần lượt 800; 600; 400; 200; 0 µl dung dịch nồng độ 100 µg/ml pha với các thể tích DMSO tương ứng: 200; 400; 600; 800; 1000 µl. Ta có một dãy các nồng độ giảm dần của chất ức chế: 100; 80; 60; 40; 20; 0 µg/ml. - Dung dịch đệm Phosphate pH = 6.8: • Cân 7.2 mg Na2HPO4 và 2.8625 mg KH2PO4 pha trong 250 ml nước khử ion. - Dung dịch PNP chuẩn nồng độ 100 µmol/l: • Cân 1.4 mg PNP khan định mức trong 10 ml nước khử ion. • Hút 1ml dung dịch trên định mức lại bằng nước khử ion thành 10 ml. - Dung dịch PNP-Glc: • Cân 21.625 mg PNP-Glc khan định mức bằng nước khử ion thành 25 ml dung dịch. - Enzym 0.03U/ ml: - Mẫu đối chứng: • Nghiền nát một viên thuốc Glucobay( 50mg Acarbose) hòa tan trong dung dịch nước, khuấy đều, để lắng, lọc nhiều lần bằng phễu hút chân không. Định mức dung dịch trên thành 125 ml.
  53. Hình 3.5: Mẫu chất ức chế ở các nồng độ. Hình 3.6: Mẫu thử hoạt tính. 3.5.2. TIẾN HÀNH: Dựng đường chuẩn: Cân PNP pha trong đệm pH = 6.8 có nồng độ 100 µM, sau đó pha loãng lần lượt thành các dung dịch có nồng độ 80, 60, 40, 20, 0 µM. Thể 0 20 40 60 80 100 tích (µL) V dd 0 20 40 60 80 100 100µM V dd pH 100 80 60 40 20 0 6.8 Thử hoạt tính: Thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase của các mẫu chất/cao và so sánh với Acarbose để so sánh:
  54. Lần lượt cho vào plate thí nghiệm các hóa chất theo bảng sau: Bảng 3.2 : Cách pha mẫu thử hoạt tính: Tác chất Thể tích (µl) Mẫu Blank Mẫu đối chứng Mẫu ức chế Ci Dung dịch chất ức 25 25 25 chế Đệm phosphate 25 25 25 pH=6.8 Enzyme 0 25 25 Nước khử ion 25 0 0 Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút Chất nền PNP-Glc 25 25 25 Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phút Đo độ hấp thu quang Đo độ hấp thu quang A λ = 405nm các mẫu thử. Dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định phần trăm ức chế và suy ra chỉ số IC50.
  55. Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 4.1. KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO: 4.1.1. CHIẾT XUẤT CAO EtOH: Từ 5kg nguyên liệu tươi thu được146g cao etanol thô. Đem cao EtOH thô lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, EtOAc thu được các loại cao như sau: Bảng 4.1. Khối lượng các loại cao so với nguyên liệu Cao Khối lượng Độ ẩm (%) % Nguyên liệu Tổng 146 21,2 2.3 n-Hexan 27 16.3 0.452 EtOAc 12.3 11.6 0.206 MeOH 94 35.4 1.214 Từ bảng số liệu trên, nhận thấy thành phần của hương nhu tía chứa nhiều hợp chất có độ phân cực mạnh do lượng cao MeOH chiếm tỷ lệ cao nhất. 4.2. KẾT QUẢ CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ Từ 10g cao EtOAc tiến hành sắc ký cột tách ra thành 9 phân đoạn. Cô lập được 4 hợp chất. 4.2.1. Os01: 4.2.1.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA Os01: - Kết tinh hình kim màu vàng trong MeOH, tan trong MeOH và CHCl3.
  56. - Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH 9:1 cho vết màu vàng có Rf = 0.25. 85:15 cho vết màu vàng có Rf = 0.37. Hình 4.1 : Hợp chất Os01 Hình 4.2 : Sắc kí lớp mỏng Os01 (hệ dung môi CHCl3-Me 85 :15) 4.2.1.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os01: Phổ 13C-NMR (phụ lục 2) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 3) cho thấy tín hiệu của 15 carbon: 9 carbon tứ cấp và 6 carbon olefin. Trong đó: • Một nhóm carbonyl >C=O ở độ chuyển dịch 181.6 ppm. • Sáu nhóm cacbon tứ cấp nối với oxy(=C–O) ở các độ chuyển dịch (163.9; 161.5; 164.1; 157.3; 145.7; 149.7)ppm. • Hai nhóm cacbon tứ cấp kề nối đôi >C= ở độ chuyển dịch 103.7ppm và 121.5 ppm. • Sáu nhóm cacbon metin kề nối đôi –CH= ở các độ chuyển dịch (102.8; 98.8; 93.8; 113.3; 116.0; 118.9) ppm.
  57. Phổ 1H-NMR (phụ lục 1)cho tín hiệu của tổng cộng 7 proton. Trong đó: • Tín hiệu tại độ chuyển dịch 12.938 ppm là tín hiệu của liên kết hydro nội phân tử. (-OH-5) • Có 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại 6.16 ppm (1H, d, J=2Hz, H–6) và ở 6.41 ppm (1H, d, J=1.5, H–8) tương tác meta trên vòng thơm. Suy ra Os01 có một vòng benzen thế ở 4 vị trí. • Một mũi đơn của proton nhân thơm tại độ chuyển dịch 6.63 ppm (1H, s,H-3) chứng tỏ proton này không có tương tác với các proton khác • Hai proton nhân thơm H–2’ và H–6’ cho tín hiệu bị xen phủ ở vùng trường thấp 7.38 ppm. • Một mũi đôi của proton nhân thơm tại độ chuyển dịch 6.86 ppm (1H, d, J=8.5, H–5’) chứng tỏ nó tương tác với proton kề bên ở vị trí ortho. Phổ HSQC(phụ lục 4) Cho các tín hiệu của các proton và carbon tương tác trực tiếp. Bảng 4.2: Dữ liệu phổ HSQC của Os01 Vị trí H 1H-NMR δppm ( số H, HSQC dạng mũi, J (Hz)) 1H → 13C 3 6.63 (1H,s) H-3 → C-3 6 6.16 (1H, d, J=2) H-6 → C-6 8 6.41 (1H, d, J=1.5) H-8 → C-8 2’ Xen phủ ở 7.38ppm H-2’ → C-2’ 5’ 6.86 (1H, d, J=8.5) H-5’ → C-5’
  58. 6’ Xen phủ ở 7.38ppm H-6’ → C-6’ Phổ HMBC (phụ lục 5): • Cho tín hiệu tương tác giữa –OH kiềm nối và carbon carbonyl (δC = 181.6 ppm), giữa –OH kiềm nối và các carbon tứ cấp khác. Chứng tỏ có nhóm –OH trên C5 của khung flavonoid. Từ những tính chất vật lý và dữ kiện phổ trên có thể suy luận Os01 là hợp chất có khung flavonoid. Bảng 4.3 : Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của Os01 Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận 2 163.9 Biến mất Biến mất =C–O 3 102.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 4 181.6 Biến mất Biến mất >C=O 5 161.5 Biến mất Biến mất =C–O 6 98.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 7 164.1 Biến mất Biến mất =C–O 8 93.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 9 157.3 Biến mất Biến mất =C–O 10 103.7 Biến mất Biến mất >C= 1’ 121.5 Biến mất Biến mất >C=
  59. 2’ 113.3 Mũi dương Mũi dương –CH= 3’ 145.7 Biến mất Biến mất =C–O 4’ 149.7 Biến mất Biến mất =C–O 5’ 116.0 Mũi dương Mũi dương –CH= 6’ 118.9 Mũi dương Mũi dương –CH= Bảng 4.4 : Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os01 Vị trí C/H 1H-NMR δ ppm 13C-NMR HMBC (số H; dạng mũi; J = Hz) δ ppm 1H → 13C 2 163.9 3 6.63 (1H; s) 102.8 H-3 → C-2,10,1’ 4 181.6 5 161.5 6 6.16 (1H; d; J = 2) 98.8 H-6 → C-5,7,8,10 7 164.1 8 6.41 (1H; d; J = 1.5) 93.8 H-8→ C-6,7,9,10 9 157.3 10 103.7 1’ 121.5
  60. 2’ 7.38 (2H; dd; J = 2; 9) 113.3 H-2 → C-2,4’,6’ 3’ 145.7 H-3’ → C-1’,4’,5’ 4’ 149.7 5’ 6.86 (1H; d; J = 8.5) 116.0 H-5’ → C-1’,3’,4’ 6’ 7.38 (2H; dd; J = 2; 9) 118.9 H-6’ → C-2,2’,4’ Các số liệu phổ của Os01 rất phù hợp với các số liệu của hợp chất: luteolin (3’,4’,5, 7- Tetrahydroxyflavone) đã được công bố trên tài liệu [57] Bảng 4.5: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Os01 với tài liệu tham khảo: [57] Vị trí C Os01 Luteolin 2 163.9 164.2 3 102.8 103.6 4 181.6 182.4 5 161.5 162.7 6 98.8 99.0 7 164.1 164.5 8 93.8 99.4 9 157.3 158.1 10 103.7 104.7
  61. 1’ 121.5 123.1 2’ 113.3 113.5 3’ 145.7 145.8 4’ 149.7 149.4 5’ 116.0 116.0 6’ 118.9 119.5 - Từ những dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và một số tài liệu tham khảo suy ra cấu trúc của Os01 trùng với cấu trúc Luteolin: 3’,4’,5,7-Tetrahydroxyflavone 4.2.2. Os02: 4.2.2.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA Os02: - Dạng bột vô định hình màu trắng. - Tan trong MeOH, kết tinh trong MeOH. - Sắc kí lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH. Giải li bằng hệ dung môi CHCl3: MeOH
  62. 9:1 cho vết màu nâu vàng Rf = 0.12 85:15 cho vết màu vàng nâu Rf = 0.44 Hình 4.3: Hợp chất Os02 Hình 4.4: Sắc kí lớp mỏng Os02 (Hệ dung môi CHCl3-MeOH 9:1) 4.2.2.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os02: Phổ 13C-NMR (phụ lục 7) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 8) cho thấy Os02 có 16 carbon gồm: 9 nhóm CH, 3 nhóm CH2, 1 nhóm CH3 và 3 carbon tứ cấp. Trong đó: • Ba carbon olefin ở các độ chuyển dịch 113.048; 115.64; 120.31ppm. • Hai carbon tứ cấp nối với oxy (=C-O) ở các độ chuyển dịch 144,98ppm và 148.90ppm • Một carbon tứ cấp tại độ chuyển dịch 133.49ppm. • Năm nhóm carbon metin nối với oxy (>CH-O) ở các độ chuyển dịch 100.34; 76.94; 76.82; 73.23; 69.72 ppm. Trong đó, đặc biệt là tín hiệu ở độ chuyển dịch 100.34 là tín hiệu của carbon anomer (O-C-O). • Một nhóm CH2 có nối với oxy (-CH2-O) ở độ chuyển dịch 60,69ppm
  63. • Một nhóm CH2 alcen ở độ dịch chuyển 115.47 ppm. • Một -CH2- của gốc anlyl δC = 39.1 ppm. • Một carbon olefin ở độ chuyển dịch 137.84 ppm. • Một nhóm methoxy CH3-O- ở độ chuyển dịch 55.68 ppm Phổ 1H NMR (phụ lục 6) cho thấy các tín hiệu của tổng cộng 22 proton: • Ba proton nhân thơm ở các độ chuyển dịch 7.00 ppm (1H, d, J = 8.3, H -6), 6.79 ppm (1H, d, J =1.9, H-3) và 6.66 ppm (1H, dd, J = 8.3; 1.9, H-5). Suy ra H-5 tương tác meta với H-3 và tương tác ortho với H-6 trên vòng thơm. • Các tín hiệu của năm proton trong vùng chuyển dịch 5.07 – 3.15 ppm cho thấy Os02 có chứa năm nhóm proton gắn trên carbon mang oxy (>CH-O) • Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.66 ppm (1H, ddd, J = 11.7; 5.2; 1.9) và 3.44 ppm (1H, dt, J = 11.9; 6.0) là tín hiệu của hai proton gắn trên carbon mang oxy. • Tín hiệu tại độ chuyển dịch 5.02 ppm (2H, dtd, J = 3.2; 2.2; 1.1, H-3’’) và 5.94 ppm (1H, ddt, J = 16.8; 10.0; 6.7, H-2”) là tín hiệu của những proton vinil gắn trên carbon mang nối đôi • Tại độ chuyển dịch 3.29 ppm (2H, d, J = 6.6, H-1”) là tín hiệu của hai proton gắn trên carbon kề carbon nối đôi (C=C-CH2-) • Tín hiệu tại độ chuyển dịch 3.74 ppm (3H, s) là của proton trong nhóm methoxy (CH3-O-) Phổ HSQC(phụ lục 9): • Suy ra được các carbon tương tác trực tiếp với các proton đã biết từ phổ 1H- NMR. • Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.66 ppm (1H, ddd, J = 11.7; 5.2; 1.9) và 3.44 ppm (1H, dt, J = 11.9; 6.0) là cùng cho tương tác với một carbon có độ
  64. dịch chuyển là 60.69 ppm. Suy ra hai proton này cùng gắn trên một carbon mang oxy (CH2-O) • Các proton cho tín hiệu trong phổ 1H-NMR nhưng không cho tín hiệu tương tác trực tiếp với carbon trong phổ HSQC. Suy ra chúng là những proton gắn trên dị nguyên tố khác (-O-H), cho tín hiệu tại các độ chuyển dịch 5.15; 5.07; 4.96; 4.48 ppm trong phổ 1H-NMR. Từ những dữ kiện trên có thể suy ra Os02 có cấu tạo gồm 3 phần: Một gốc anlyl, một vòng thơm bị thế ở 3 vị trí và một phân tử đường. OH O OH O OH OH Phổ HMBC (phụ lục 10) • Tín hiệu của proton ở độ chuyển dịch 4.84 ppm (1H, d, J =7.4, H-1’) cho tương tác với tín hiệu của carbon tứ cấp có nối với oxy (độ chuyển dịch 144.98, C1) suy ra phân tử đường gắn vào vị trí C-1 của nhân thơm. • Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.29 ppm (2H, d, J = 6.6, H-1’’) cho tương tác với các carbon số 3, 4, 5 của nhân thơm. Suy ra, gốc anlyl gắn vào vị trí C-4 của nhân thơm. • Proton trong nhóm methoxy tương tác mạnh với C2. Do đó suy ra –OCH3 thế vào vị trí C-2 của nhân thơm.
  65. Ngoài ra, dữ liệu phổ 1H-NMR của proton 1’ có độ chuyển dịch 4.84 (1H, d, J = 7.4). Giá trị của hằng số ghép J = 7.4 cho ta biết phân tử đường trên là đường β. Những dữ liệu phổ trên của Os02 có nhiều điểm tương đồng với dữ liệu phổ của Eugenyl-β−D-glucoside (đã được cô lập từ cây hương nhu tía). Được công bố trên tài liệu[19, 51] Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR và phổ DEPT của Os02: Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận 1 144.98 Biến mất Biến mất =C-O 2 148.90 Biến mất Biến mất =C-O 3 113.04 Mũi dương Mũi dương =CH- 4 133.49 Biến mất Biến mất =C< 5 120.31 Mũi dương Mũi dương =CH- 6 115.64 Mũi dương Mũi dương =CH- 1’ 100.34 Mũi dương Mũi dương =CH- 2’ 73.23 Mũi dương Mũi dương =CH- 3’ 76.82 Mũi dương Mũi dương =CH- 4’ 69.72 Mũi dương Mũi dương =CH- 5’ 76.94 Mũi dương Mũi dương =CH- 6’ 60.69 Biến mất Mũi âm -CH2-
  66. 1’’ 39.10 Biến mất Mũi âm -CH2- 2’’ 137.84 Mũi dương Mũi dương =CH- 3’’ 115.47 Biến mất Mũi âm =CH2 55.68 Biến mất Mũi dương -OCH3 Bảng 4 7 Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os02 Vị trí 1H-NMR δ ppm 13C-NMR HMBC C/H (số H; dạng mũi; J = Hz) δ ppm 1H → 13C 1 144.98 2 148.90 3 6.79 (1H, d, J = 8.3) 113.04 H-3 → C-1,2,5 4 133.49 5 6.66 (1H, dd, J = 8.3; 1.9) 120.31 H-5 → C-1,3,6 6 7.00 (1H, d, J = 8.3) 115.64 H-6 → C-1,2,4 1’ 4.84 (1H, d, J = 7.4) 100.34 H-1’ → C-1 2’ Chồng chập trong vùng 3.21-3.28 73.23 3’ Chồng chập trong vùng 3.21-3.28 76.82 4’ 3.15 (1H, td, J = 9.1; 5.4) 69.72 H-4’ → C-3’,5’ 5’ Chồng chập trong vùng 3.21-3.28 76.94
  67. 6’a 3.66 (1H, ddd, J = 11.7; 5.2; 1.9) 60.69 6’b 3.44 (1H, dt, J = 11.9; 6.0) 1’’ 3.29 (2H, d, J = 6.6) 39.10 H-1’’→ C-3,4,5,6,2”,3” 2’’ 5.94 (1H, ddt, J = 16.8; 10.0; 6.7) 137.84 H-2’’ → C-1”,3” 3’’ 5.02 (2H, dtd, J = 3.2; 2.2; 1.1) 115.47 H-3’’ → C-1”,2” -OCH3 3.74 (3H, s) 55.68 -OCH3 → C2 -OH2’ 5.15 (1H, d, J = 4.8) -OH3’ 5.07 (1H, ddd, J = 17.0; 3.6; 1.6) -OH4’ 4.96 (1H, d, J = 5.3) -OH6’ 4.48 (1H, d, J = 5.7) Các số liệu phổ của Os02 rất phù hợp với các số liệu của hợp chất: Eugenyl-β- D-Glycoside đã được công bố trên tài liệu [19, 48] Bảng 4.8: So sánh dữ liệu phổ Os02 với tài liệu tham khảo[19, 48] Vị trí 1H-NMR 13C-NMR C/H Os02 Tài liệu Os02 Tài liệu 1 144.98 144.9 2 148.90 148.92 3 6.79 (1H, d, J = 8.3) 6.82 (1H, d, J = 1.6) 115.47 115.52
  68. 4 133.49 133.48 5 6.66 (1H, dd, J = 8.3; 6.72 (1H, dd, J = 8.4; 120.31 120.32 1.9) 1.6) 6 7.00 (1H, d, J = 8.3) 7.08 (1H, d, J = 8.4) 115.64 115.62 1’ 4.84 (1H, d, J = 7.4) 4.84 (1H, d, J = 7.4) 100.34 100.32 2’ Chồng chập trong vùng 2.98 (1H, d, J = 7.62) 73.23 73.26 3.21-3.28 3’ Chồng chập trong vùng 3.22 (1H, m) 76.82 76.99 3.21-3.28 4’ 3.15 (1H, td, J = 9.1; 5.4) 3.19 (1H, m) 69.72 69.73 5’ Chồng chập trong vùng 3.10 (1H, m) 76.94 76.87 3.21-3.28 6’a 3.66 (1H, ddd, J = 11.7; 3.68 (1H, dd, J = 12.1; 5.2; 1.9) 4.8) 60.69 60.72 6’b 3.44 (1H, dt, J = 11.9; 3.87 (1H, d, J = 11.9) 6.0) 1’’ 3.29 (2H, d, J = 6.6) 3.31 (2H, d, J = 6.5) 39.10 39.05 2’’ 5.94 (1H, ddt, J = 16.8; 5.95 (1H, dd, J = 14.2; 137.84 137.90 10.0; 6.7) 6.6) 3’’ 5.02 (2H, dtd, J = 3.2; 5.05 (1H, dd, J = 17.4; 113.04 113.02 2.2; 1.1) 1.6)
  69. 5.04 (1H, dd, J = 10.1; 1.6) -OCH3 3.74 (3H, s) 3.83 (3H, s) 55.68 55.68 OH2’ 5.15 (1H, d, J = 4.8) 5.13 (1H, d, J = 4.47) OH3’ 5.07 (1H, ddd, J = 17.0; 5.02 (1H, d, J = 5.03) 3.6; 1.6) OH4’ 4.96 (1H, d, J = 5.3) 4.94 (1H, d, J = 4.89) OH6’ 4.48 (1H, d, J = 5.7) 4.45 (1H, t, J = 5.53) Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và một số tài liệu tham khảo suy ra cấu trúc của Os02 trùng với cấu trúc của eugenyl-β-D-glucoside: 4-allyl-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-methoxybenzene. 4.2.3. Os03: 4.2.3.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA OS03: -Là chất bột vô định hình màu trắng. - Kết tinh trong MeOH. - Tan trong MeOH và CHCl3. - Điểm chảy: 2450C.
  70. - Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH 96:4 cho vết màu tím hồng có Rf = 0.46 Hình 4.5 : Hợp chất Os03 Hình 4.6 : Sắc kí lớp mỏng Os03 (Hệ dung môi CHCl3-MeOH 96 :4) 4.2.3.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os03 : Phổ 1H-NMR (phụ lục 11) cho thấy có : • Bảy tín hiệu của nhóm CH3 ở các độ dịch chuyển 0.77ppm (3H, s, 24-CH3), 0.81ppm (3H, s, 26-CH3), 0.85 (3H, d, J =6.4Hz, 30-CH3), 0.90ppm (3H, d, J = 4.2Hz, 25-CH3), 0.92 (3H, s, 29-CH3), 0.94 (3H, d, J =6.2Hz, 23-CH3), 1.08 (3H, s, 27-CH3). • Tín hiệu của proton CH gắn với nhóm OH ở độ dịch chuyển 3.20ppm (1H, dd, J 6.8Hz và 9.9Hz, H-3). • Tín hiệu của proton ở độ dịch chuyển 0.72ppm (1H,d, J=11.3Hz,H-5). • Tín hiệu doublet của proton ở độ dịch chuyển 2.19ppm (1H, d, J 13.1Hz, H- 18), chứng tỏ proton này chỉ tương tác với một proton khác. Đây là sự khác biệt rõ
  71. ràng, đặc trưng cho các triterpen thuộc kiểu khung ursan, phân biệt với khung olean (sẽ cho tín hiệu dạng triplet). • Ở độ dịch chuyển 5.24ppm (1H, td, J =3.4Hz và 6.8Hz) là tín hiệu của proton H-12 Tất cả những dữ liệu trên cho phép kết luận Os03 là một triterpen thuộc kiểu khung ursan [61]. Các proton ở vùng trường cao tập trung hiện diện trong một vùng nhỏ khó phân tích. Theo các tài liệu [34, 36, 42], Ursolic acid là thành phần chính trong các triterpen cô lập được từ hương nhu tía. Dựa trên một số tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy các số liệu về phổ của Os03 hoàn toàn phù hợp với phổ của ursolic acid hay (3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic). Bảng 4.9: So sánh dữ liệu phổ Os03 và tài liệu tham khảo[61] Vị trí 1H-NMR H Os03 Ursolic acid 1 1.56 (2H, m) 2 1.43 (2H, m) 3 3.00 (1H, td, J = 6.8; 9.9) 3.01 (1H, dd, J = 5.2; 9.5) 4 5 0.66 (1H, d, J = 11.3) 0.66 (1H, s) 6 1.99 (1H, dd, J = 4.1;13.4) 1.47 (1H, m, H-6a) 1.29 (1H, m, H-6b)
  72. 7 1.27 (2H, m) 8 9 1.58 (1H, s) 10 11 1.92 (2H, dd, J = 13.7; 3.5) 12 5.14 (1H, td, J = 3.4;6.8) 5.14 (1H, dd, J = 13.7; 3.5) 13 14 15 1.01 (2H, m) 16 1.53 (2H, m) 17 18 2.11 (1H, d, J = 13.1) 2.12 (1H, d; J = 11.1) 19 1.31 (1H, m) 20 1.52 (1H, m) 21 1.29 (2H, m) 22 1.54 (2H, m) 23 0.94 (3H, d, J = 6.2) 0.90 (3H, s) 24 0.77 (3H, s) 0.68 (3H, s)
  73. 25 0.90 (3H, d, J = 4.2) 0.87 (3H, s) 26 0.81 (3H, s) 0.69 (3H, s) 27 1.08 (3H, s) 1.05 (3H, s) 28 29 0.85 (3H, d, J = 6.4) 0.82 (3H, d, J = 5.9) 30 0.92 (3H, s) 0.92 (3H, d, J = 6.8) Tiến hành sắc kí lớp mỏng Os03 và ursolic acid để so sánh. Nhân thấy hai mẫu hiện vết có cùng màu sắc, không che UV (λ= 254nm) và có Rf tương đương nhau Hình 4.7 : Sắc kí lớp mỏng Os03 và ursolic acid.
  74. Từ những tính chất vật lý, dữ liệu phổ 1H-NMR và tài liệu tham khảo suy ra cấu trúc của Os03 trùng với cấu trúc ursolic acid: (3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic). 4.2.4. Os04: 4.2.4.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA Os04 - Là tinh thể dạng hình kim màu vàng. - Kết tinh trong MeOH. - Tan trong MeOH. - Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH:  Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH 95:5 cho vết màu vàng có Rf = 0.15. 9:1 cho vết màu vàng có Rf = 0.37.
  75. Hình 4.8: Hợp chất Os04 Hình 4.9: Sắc ký lớp mỏng Os04 (Hệ dung môi CHCl3-MeOH 95:5) 4.2.4.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os04: - Phổ 13C-NMR (phụ lục 13) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 14) cho thấy Os04 có 15C, trong đó có 4C bị chập thành 2 mũi ở 115.9 và 128.4 ppm.  Một nhóm cacbonyl >C=O ở 181.7 ppm.  Năm nhóm cacbon tứ cấp kề oxi =C–O ở độ dịch chuyển (164.1; 161.4; 163.7; 157.3; 161.1) ppm.  Hai nhóm cacbon tứ cấp kề nối đôi >C= ở các độ dịch chuyển 103.7 và 121.1 ppm.  Bảy nhóm cacbon metin kề nối đôi –CH= ở các độ dịch chuyển (102.8; 98.8; 93.9; 128.4; 115.9; 115.9; 128.4) ppm. Phổ 1H-NMR (phụ lục 12) cho các tín hiệu của khung proton nhân thơm thuộc khung flavonoid:  Có 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại độ dịch chuyển 6.20 ppm (1H; d; J = 2Hz; H–6) và 6.48 ppm (1H; d; J = 2Hz; H–8) chứng tỏ chúng tương tác meta với nhau trên vòng thơm.
  76.  Một mũi đơn tại vùng trường thấp tại 6.77 ppm (1H, s, H–3) chứng tỏ proton này không có tương tác với proton kề bên nó.  Có 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại 6.93 ppm (2H; d; J = 8.5Hz; H– 3’; H–5’) và 7.92 ppm (1H; d; J = 8.5Hz; H–2’; H–6’) chứng tỏ chúng tương tác ortho với nhau trên vòng thơm.  Một mũi đơn tại độ chuyển dịch 12.96 ppm cho thấy Os04 có nhóm – OH kiềm nối. Bảng 4.10: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của Os04 Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận 2 164.1 Biến mất Biến mất =C–O 3 102.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 4 181.7 Biến mất Biến mất >C=O 5 161.4 Biến mất Biến mất =C–O 6 98.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 7 163.7 Biến mất Biến mất =C–O 8 93.9 Mũi dương Mũi dương –CH= 9 157.3 Biến mất Biến mất =C–O 10 103.7 Biến mất Biến mất >C= 1’ 121.1 Biến mất Biến mất >C= 2’ 128.4 Mũi dương Mũi dương –CH=
  77. 3’ 115.9 Mũi dương Mũi dương –CH= 4’ 161.1 Biến mất Biến mất =C–O 5’ 115.9 Mũi dương Mũi dương –CH= 6’ 128.4 Mũi dương Mũi dương –CH= • Phổ HMBC: Cho tín hiệu tương tác giữa –OH kiềm nối với nhóm carbon cacbonyl và các carbon tứ cấp khác.Suy ra Os04 là hợp chất có khung flavone. • Bảng 4.11 : Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os04 Vị trí C/H 1H-NMR δ ppm 13C-NMR HMBC (số H; dạng mũi; J = Hz) δ ppm 1H → 13C 2 164.1 3 6.77 (1H; s) 102.8 H-3 → C-2,4,10,1’ 4 181.7 5 161.4 6 6.20 (1H; d; J = 2) 98.8 H-6 → C-5,7,8,10 7 163.7 8 6.48 (1H; d; J = 2) 93.9 H-8 → C-6,7,9,10 9 157.3 10 103.7 1’ 121.1
  78. 2’ 7.92 (1H; d; J = 8.5) 128.4 H-2’ → C-3’,4’,6’ 3’ 6.93 (2H; d; J = 8.5) 115.9 4’ 161.1 5’ 6.93 (2H; d; J = 8.5) 115.9 H-5’→C-3,1’,3’,4’ 6’ 7.92 (1H; d; J = 8.5) 128.4 H-6’ → C-2,2’,4’ Từ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HBMC và tài liệu tham khảo suy ra cấu trúc của Os04 trùng với cấu trúc của Apigenin: 3' OH 2' OH 4' 8 1 1' 1 5' HO 7 9 O 5' 2 6' 6 3 10 5 4 OH O 4’,5,7-trihydroxyflavone 4.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH: Sau khi tiến hành đo mật độ quang các mẫu thử hoạt tính. Thu được các kết quả sau: Bảng 4.12: Kết quả đo mật độ quang mẫu dựng đường chuẩn : Nồng độ 0 20 40 60 80 100 (µmol/l) Atb 0.0613 0.1013 0.14367 0.189 0.23167 0.2767
  79. 0.3 0.25 0.2 y = 0.0022x + 0.0592 0.15 R2 = 0.9996 0.1 0.05 0 0 20 40 60 80 100 120 Biểu đồ 4.1 : Phương trình đường chuẩn Mẫu Os01, Os02 và Os04 không có hoạt tính ức chế men α-glucoside. Mẫu Os03 ức chế mạnh đối với men α-glucosidase. Thể hiện qua các số liệu sau : Bảng 4.13: Kết quả đo mật độ quang mẫu Os03 : Mẫu trắng 0.109 0.108 0.105 0.111 0.108 0.106 Lần 1 1.444 0.192 0.132 0.123 0.109 0.109 Mẫu ức chế Lần 2 1.481 0.194 0.133 0.134 0.113 0.108 Lần 3 1.431 0.124 0.135 0.131 0.108 0.105 A 1.343 0.062 0.028333 0.018333 0.002 0.002 %I 0 95.38347 97.8903 98.6349 99.85108 99.85108
  80. 150.0 100.0 y = 3E-07x5 - 8E-05x4 + 0.0085x3 - 0.4479x2 + 11.05x - 1.0005 R2 = 1 50.0 - 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 Biểu đồ 4.2: Phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế Os03. Suy ra giá trị IC50= 6 µg/ml = 13.15 µmol/ml. [62] So sánh với giá trị IC50 của Acarbose (IC50= 50 µM) . Nhân thấy : Giá trị IC50 của Os03 rất thấp chứng minh hoạt tính ức chế men α−glucosidase của Os03 rất cao.
  81. Chương V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 5.1. CÁC KẾT QUẢ ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC - Từ cao EtOH, chúng tôi đã tiến hành tách riêng thành 3 loại cao theo độ phân cực của các hợp chất có trong cây hương nhu tía :  Cao n-hexan 27g (16.3% ẩm độ)  Cao EtOAc 12,3g (11.6% ẩm độ)  Cao MeOH 94g (35.4% ẩm độ) - Từ cao EtOAc, đã cô lập, tinh chế và định danh được 4 chất. Luteolin Hay 3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone. OCH3 OH O OH O OH OH Eugenyl-β-D-glucoside Hay 4-allyl-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-methoxybenzene.
  82. Ursolic acid Hay 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic. Apigenin Hay 4’,5,7-trihydroxyflavone - Khảo sát hoạt tính kháng tiểu đường các hợp chất phân lập được. So sánh với mẫu đối chứng Acarbose. • Hợp chất Os01, Os02 và Os04 không có hoạt tính kháng tiểu đường. • Hợp chất Os03 có hoạt tính kháng tiểu đường rất cao. 5.2. KIẾN NGHỊ: Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của các cao n-Hexan, MeOH, cây hương nhu tía. Khảo sát các hoạt tính khác của các hợp chất đã phân lập được.
  83. Hợp chất Os03 có hoạt tính kháng tiểu đường rất cao. Do đó kiến nghị tiến hành khảo sát các phương pháp phổ khác để khẳng định lại chính xác cấu trúc và tiến hành thử hoạt tính kháng tiểu đường của Os03 trên các động vật thí nghiệm. Khảo sát và ứng dụng các chất có hoạt tính trong hỗ trợ điều trị tiểu đường.
  84. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT: 1. Bộ y tế, 1977, Công trình nghiên cứu khoa học, 189,196, 198. 2. Bộ y tế, 2002, Dược điển Việt Nam I, tập 2 trang 383-384 3. Đỗ Huy Ích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, 2003, Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, trang 1027-1029 4. Đỗ Tất Lợi, 1995, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, trang 829-831 5. Ngô Văn Thu, 1998, Bài giảng dược liệu tập I, Nhà xuất bản Bộ Y Tế và Giáo dục Đào tạo. 6. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, trang 91, 138, 213. 7. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, trang 176-178 8. Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây Cỏ Việt Nam, Nhà Xuất Bản Trẻ, trang 847 TIẾNG NƯỚC NGOÀI: 9. Agrawal P, Rai V, Singh RB, 1996, Int J Clin Pharmol Ther: 34, Randomized placebo-controlled, single blind trail of holy basil leaves in patients with noninsulin dependent diabetes mellitus, 406–409. 1-56 10. Anonymous., 1991, Wealth of India Vol. 7, Publication and Information Directorate, CSIR, New Delhi, pp 79–89. 1-1 11. Aruna K, Sivaramakrishnan VM, 1992, Food Chem Toxicol, Anticarcinogenic effects of some Indian plants products, 953. 2-14
  85. 12. Auil F, Khan MS, Owais M, Ahmad I, 2005, . J Basic Microbiol , Effect of certain bioactive plant extracts on clinical isolates of beta-lactamase producing methicillin resistant Staphylococcus aureus , pp 106-114. 2-32 13. Bhargava KP, Singh N, 1981, J Res Edu Indian, Anti-stress activity of Ocimum sanctum Lin. 73: 443–451 1-20 14. Batta SK, Santhakumari G, 1971, Indian J Medical Research, The antifertility effect of Ocimum sanctum and Hibiscuc Rosa Sinensis, 59: 777– 781. 15. Bhatnagar M, Kapur KK, Jalees S, Sharma SK, 1993, J Entomol Res, Laboratory evaluation of insecticidal properties of O. basilicum Lin. and O. sanctum Lin. Plant essential oil and their major constituents against vector mosquito species, 17: 21–26. 1-86 16. Brophy JJ, Goldsack RJ, Clarkson JR, 1993, . J Essent Oil Res, The essential oil of Ocimum tenuiflorum L. (Lamiaceae) growing in Northern Australia 459–461. 1-10 17. Chattopadhyay RR, Sarkar SK, Ganguly S, Medda C, Basu TK, 1992, Indian J Physiol Pharmacol, Hepato-protective activity of Ocimum sanctum leaf extract against paracetamol induced hepatic damage in rats, 24: 163–165.1-59 18. Dey BB, Choudhury MA, 1984, Indian Perfumer, Essential oil of Ocimum sanctum L. and its antimicrobial activity, 28: 82–87. 1-24 19. Josip Masteli, Igor Jerkovi, Marijana Vinkovi, Zoran Dzoli, and Drazen Viki-Topi, Josip Masteli, 2004, Synthesis of Selected Naturally Occurring Glucosides of Volatile Compounds. Their Chromatographic and Spectroscopic Properties, 1735 20. Dey BB, Choudhary MA, 1980, Indian Perfumer, Effect of plant development stage and some micronutrients on eugenol content in O. sanctum L. Determination of eugenol by Folin-Ciocalteu reagent 24: 199–203 1-100
  86. 21. Godhwani S, Godhwani JL, Vyas DS, 1987, J Ethnopharmacol , Ocimum sanctum: an experimental study evaluating its anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activity in animals, 21:153–163. 1-61 22. Hasan SB, Deo PG, 1994, Int Pest Control, Ocimum sanctum seeds for mosquito control, 20–21 1-85. 23. Kathiresan K, Guanasekan P, Rammurthy N, Govidswami S, 1999, Pharmaceutical Biology 37(4), Anticancer activity of Ocimum sanctum. 285- 290. 2-13 24. Karthikeyan K, Ravichadran P, Govindasamy S, 1999, Oral Oncol 35, Chemopreventive effect of Ocimum sanctum on DMBA-induced hamster buccal pouch carcinogenesis, 112-119. 18-2 25. Kamaraj C, Rahuman AA, Bagavan A, 2008, Parasitol Res, Screening for antifeedant and larvicidal activity of plant extracts against Helicoverpa armigera (Hübner), Sylepta derogata (F.) and Anopheles stephensi (Liston), 103: 1361–1368. 1-89 26. Kicel A, Kurowska A, Kalemba D, 2005, J Essent Oil Res, Composition of the essential oil of Ocimum sanctum L. Grown in Poland during vegetation, 17: 217–219, 1-16 27. Kothari SK, Bhattacharya AK, Ramesh S, 2004, . J Chromatogr A, Essential oil yield and quality of methyl eugenol rich Ocimum tenuiflorum L.f. (syn Ocimum sanctum L.) grown in south India as influenced by method of harvest :1054: 67–72. 1-7 28. Lawrence BM, Hogg JW, Terhune SJ, Pichitakul N, 1972, Flav Industry, Essential oils and their constituents. IX. The Oils of Ocimum sanctum and Ocimum basilicum from Thailand, 47–49. 1-8 29. Machado MIL, Silva MGV, Matos FJA, Craverio AA, Alencar WJ, 1999, J Essent Oil Res, Volatile constituents from leaves and inflorescence oil of Ocimum tenuiflorum L.f. (syn Ocimum sanctum L) grown in Northeastern Brazil, 11: 324–326, 1-15
  87. 30. Mondello L, Zappia G, Cotroneo A, Bonaccorsi I, Chowdhury JU, Yusuf M, Dugo G, 2002, Studies onthe essential oil-bearing plants of Bangladesh, Part VIII, Composition of some Ocimum oils O.basilicum L. var. purpurascens ; O. sanctum L. green; O. sanctum L. purple; O. americanum L., citral type; O. americanum L., camphor type, 17: 335–340. 1-17 31. Nadkarni GB, Patwardhan VA, 1952, CurSci, Fatty oil from the seeds of Ocimum sanctum Linn. (Tulsi), 91: 68–69. 1-113 32. Nguyen H, Lemberkovics E, Tarr K, Mathe IJ, Petri G, 1993, Acta Agronomica Hungarica, A comparative study on formation of flavonoid, tannin, polyphenol contents in ontogenesis of Ocimum basilicum L, 42: 41–50. 1-11 33. Norr H, Wanger H, 1992, Planta Med, New constituents from Ocimum sanctum, 58: 574. 1-13 34. Prajapati ND, Purohit SS, Sharma AK, Kumar T, 2003, Agrobios, India, A Hand Book of Medicinal Plant, 1st Ed, p. 367. 2-2 35. Prashar R, Kumar A, Hewer A, Cole KJ, Davis W, Phillips DH, 1998, Cancer Lett , Inhibition by an extract of Ocimum sanctum of 7, 12- dimethylbenz(a)anthracene in rat hepatocytes in vitro, 155-160. 2-19 36. Phillip MP, Damodaran NP, 1985, Indian Perfumer, Chemo-types of Ocimum sanctum Linn, 29: 49–56. 1-4 37. Rao BG, Nigam SS, 1970, Indian J Med Res, The in vitro antimicrobial efficiency of essential oils, 58: 627–633 1-25 38. . Rai V, Iyer U, Mani UV, 1997, Plant Foods Hum Nutri, Effect of Tulasi (Ocimum sanctum) leaf powder supplementation on blood sugar levels, serum lipids and tissue lipids in diabetic rats, 50: 9-16. 1-50 39. Ravid Z, Putievsky E, Katzir I, Lewinsohn E, 1997, Flav Frag, Enantiomeric composition of linalol in the essential oils of Ocimum species and in commercial Basil oils, 12: 393–396. 1-14
  88. 40. Reddy SS, Karuna R, Saralakumari, 2008, Horm Metab, Prevention of insulin resistance by ingesting aqueous extract of Ocimum sanctum to fructose- fed rats, 40: 44-49 1-54 41. Sekhawat PS, Prasada R, 1971, Sci Cult, Antifungal properties of some plant extracts. II growth inhibition studies,37: 40–4 1-23 42. Skaltsa H, Philianos S, Singh M, 1987, Fitoterapia Phytochemical study of the leaves of Ocimum sanctum 1987; 8: 286. 1-12 43. Skaltsa H, Tzakou O, Singh M, 1999, Pharmaceut Biol, Polyphenols of Ocimum sanctum from Suriname, 1999; 37: 92–94. 1-112 44. Singh S, Majumdar DK, Rehan HMS, 1996, Ethanopharmacol, Evaluation of anti-inflammatory potential of fixed oil of Ocimum sanctum (holy basil) and its possible mechanism of action. 54: 19–26.1-63 45. Singh S, Taneja M, Majumdar DK, 2007, Indian J Exp Biol 45, Biological activities of Ocimum sanctum L. fixed oil, 403-412. 46. Singh S, Agrawal SS, 1991, J Res Edu Indian Med, Anti-asthematic and anti-inflammatory activity of Ocimum sanctum Linn. 7–9: 23–28. 1-62 47. Singh S, Agrawal SS, 1991, J Res Edu Indian Med, Anti-asthematic and anti-inflammatory activity of Ocimum sanctum Lin. 7–9: 23–28. 48. S. Hammami, M. L. Ciavatta, H. Ben Jannet, G. Cimino and Z. Mighria, 2006, Croatica chemica acta ccacaa 79, Three Phenolic and a Sterol Glycosides Identified for the First Time in Matthiola longipetala Growing in Tunisia. 49. Sukari MA, Rahmani M, Lee GB, 1995, Fitoterapia Constituents of stem barks of Ocimum sanctum, LXVI: 552–553. 1-9 50. Ubaid RS, Anantrao KM, Jaju JB, Mateenuddin MD, 2003, Indian J Physiol Pharmacol, Effect of Ocimum sanctum leaf extract on hepatotoxicity induced by antitubercular drugs in rats. 2003; 47:465–470. 1-58
  89. 51. Uma Devi P, Bisht KS, Vinitha M, 1998, Br J Radiol, A comparative study of radioprotection by Ocimum flavonoids and synthetic aminothiol protectors in the mouse, 71: 782–784. 1-76 52. Uma Devi P, Ganasoundari A, 1999, Indian J Exp Biol , Modulation of glutathione and antioxidant enzymes by Ocimum sanctum and its role in protection against radiation injury, 37: 262–268. 1-78 53. Uma Devi P. Radioprotective,2001, Indian J Exp Biol, Anticarcinogenic and antioxidant properties of the Indian holy basil, Ocimum sanctum (Tulasi), 39:185-190. 2-15 54. Uma Devi P, Gonasoundari A, Vrinda B, Srinivasan KK, Unnikrishanan MK, 2000, Radiat Res, Radiation protection by the Ocimum sanctum flavonoids orientin and vicenin: Mechanism of action,455-460. 55. Vats V, Yadav SP, Grover JK, 2004, Jethanopharmacol, Ethanolic extract of Ocimum sanctum leaves partially attenuatesstreptozotocin-induced alteration in glycogencontent and carbohydrate metabolism in rats, 90: 155– 160. 1-51 56. Vina A, Murillo E, 2003, J Braz Chem Soc, Essential oil composition from twelve varieties of Basil (Ocimum spp) grown in Colombia, 14: 744–749. 1-18 57. I. Wawer and A. Zielinska, 2001, Magn. Reson. Chem. 39(7), 13C CP/MAS NMR studies of flavonoids, 374-380. 58. Yanpallewar SU, Rai S, Kumar M, Acharya SB, 2004, Pharmacol Biochem Behav 79, Evaluation of antioxidant and neuroprotective effect of Ocimum sanctum on transient cerebral ischemia and long term cerebral hypoperfusion, 155-164. 2-5 59. Y. Orihara, T. Furuya, N. Hashimoto, Y. Deguchi, K, 1992, Tokoro, and T. Kanisawa, Phytochemistry 31, 827–831. 6-hamimi os02 60. Y. Takeda, Y. Ooiso, T. Masuda, G. Honda, H. Otsuka, E.Sezik, and E. Yesilada, 1998, Phytochemistry 49, 787–791. hamama -7
  90. 61. Harmand, P.O.; Duval, R.; Liagre, B.; Jayat-Vignoles, C.; Beneytout, J.L.; Delage, C.; Simonb, A, 2003, . Int. J. Oncol, Ursolic acid induces apoptosis through caspase-3 activation and cell cycle arrest in HaCat cells, 105-112. 62. Syed Shahzad ul Hussan, 2005, Institute of Chemistry University of Lubeck, Small Ligand Effectors of Bio-macromolecules, Exploration of Novel α-Glucosidase Inhibitors and NMR Investigation of tRNAPhe-bound Aminoglycosides, 99.