›

Khóa luận Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang

pdf 71 trang thiennha21 18/04/2022 6781
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_hoat_tinh_chong_oxy_hoa_cua_re_cay_dinh_l.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. TRẦN CÔNG LUẬN ĐẶNG KIM THOA ThS. ĐỖ VĂN MÃI MSSV: 12D720401167 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. TRẦN CÔNG LUẬN ĐẶNG KIM THOA ThS. ĐỖ VĂN MÃI MSSV: 12D720401167 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017
  3. LỜI CÁM ƠN Để có thể hoàn thành khoá luận này, trong thời gian nghiên cứu tại bộ môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình. Với lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn đầu tiên em muốn gửi đến thầy PGS.TS Trần Công Luận, Ths. Đỗ Văn Mãi, hai Thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, chỉnh sửa và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô của bộ môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện khoá luận này. Em xin gửi đến toàn thể thầy cô Khoa Dược- Điều dưỡng, trường đại học Tây Đô lời cám ơn sâu sắc, trong suốt 5 năm tại giảng đường các thầy cô đã không ngừng truyền đạt những kiến thức, kỹ năng có được để em trưởng thành hơn. Ngoài ra, không thể không kể đến những người bạn của em, cám ơn các bạn đã ở bên cạnh em, cùng em vượt qua các khó khăn và làm cho khoảng thời gian làm khóa luận của em trở nên ý nghĩa và khó quên. Và cuối cùng, em muốn dành lời cám ơn chân thành nhất cho gia đình, gia đình là nguồn động lực để em cố gắng học tập, luôn bên cạnh em lúc em gặp khó khăn, luôn tạo điều kiện để em có thể hoàn thành chương trình đại học. Xin chân thành cám ơn mọi người. Cần Thơ, ngày 01 tháng 6 năm 2017 Sinh viên Đặng Kim Thoa i
  4. LỜI CAM KẾT Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Sinh viên Đặng Kim Thoa ii
  5. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Khóa học: 2012 – 2017 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG TÓM TẮT Mở đầu và đặt vấn đề Trong y học cổ truyền, cây Đinh lăng từ lâu đã được sử dụng phổ biến với công dụng nổi bật là bổ dưỡng. Ngày nay, Đinh lăng còn được chứng minh với nhiều công dụng như: Kháng viêm, chống trầm cảm, lợi tiểu, ức chế enzym. Ở Việt Nam, Đinh lăng được trồng phổ biến, là nguồn cung cấp nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người. Đề tài này góp phần khảo sát về hoạt tính chống oxy hóa và sơ bộ thành phần hóa học của rễ cây Đinh lăng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Dược liệu là Đinh lăng được thu hái ở huyện Tri Tôn, An Giang vào tháng 11/2016. Sau khi mô tả hình thái và khảo sát vi phẫu dược liệu, rễ Đinh lăng được phơi khô và xay thành bột. Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng được chiết ngấm kiệt với cồn 96 %, thu cao cồn (cao toàn phần). Cao cồn được hòa với một lượng nước tối thiểu sau đó lắc phân bố tuần tự với diethyl ether, ethyl acettat, n - butanol, cô thu hồi dung môi thu các cao phân đoạn tương ứng. Tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng thử nghiệm sử dụng DPPH, chọn ra phân đoạn cho HTCO cao nhất đem đi phân tích sơ bộ thành phần hóa học và phân lập bằng SKC cổ điển nhằm tạo ra những phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo sau này. Kết quả và bàn luận Từ 9,3 kg bột rễ Đinh lăng, sau khi chiết và lắc phân bố thu được: 300 g cao Et2O, 30 cao EA, 405 g cao n-BuOH, 800 g cao nước. Tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn cho kết quả cao EA có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất (HTCO = 67,82 %, IC50 = 758,55 µg/ml). Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thấy rằng cao EA có chứa: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử. Bước đầu phân lập 10 g cao EA bằng SKC cổ điển thu được: 5 phân đoạn từ I → V (có thành phần đơn giản hơn) với khối lượng lần lượt là: 1,5311 g, 1,2835 g, 0,5612 g, 0,5824 g, 0,1889 g. Kết luận Cao EA có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong các cao với IC50 = 758,55 µg/ml, và thành phần hóa học gồm: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử. iii
  6. MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1. CÂY ĐINH LĂNG 2 2.1.1. Vị trí phân loại 2 2.1.2. Đặc điểm thực vật họ Nhân sâm 2 2.1.3. Đặc điểm thực vật chi Polyscias 3 2.1.4. Đặc điểm thực vật cây Đinh lăng 3 2.1.5. Thành phần hóa học 5 2.1.6. Tác dụng dược lý và công dụng 15 2.1.7. Một số bài thuốc có Đinh lăng 17 2.1.8. Một số chế phẩm từ Đinh Lăng 20 2.2. GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 21 2.2.1. Khái niệm gốc tự do 21 2.2.2. Tác động của gốc tự do và sự liên quan đến bệnh tật con người 21 2.2.3. Chất chống oxy hóa 22 2.2.4. Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro 22 2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP 25 2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng 25 2.3.2. Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng 26 2.3.3. Một số phương pháp phân lập hợp chất hữu cơ 29 CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 3.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31 3.2.1. Dung môi, hóa chất 31 3.2.2. Thiết bị, dụng cụ 31 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.3.1. Khảo sát đặc điểm thực vật học 32 3.3.2. Thử tinh khiết 32 3.3.3. Nghiên cứu hóa học 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 4.1. THỰC VẬT HỌC 39 4.1.1. Đặc điểm hình thái 39 iv
  7. 4.1.2. Đặc điểm vi phẫu rễ 43 4.1.3. Đặc điểm bột rễ Đinh lăng 45 4.2. THỬ TINH KHIẾT 46 4.2.1. Độ ẩm 46 4.2.2. Xác định độ tro 46 4.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 47 4.3.1. Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn 47 4.3.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn 48 4.3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trên cao ethyl acetat 53 4.3.4. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat 54 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1. KẾT LUẬN 57 5.2. KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 v
  8. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Phản ứng thử nghiệm DPPH 36 Bảng 4.1. Kết quả thử tinh khiết bột rễ Đinh lăng 47 Bảng 4.2. Kết quả xác định độ ẩm của các cao phân đoạn 48 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát HTCO của 5 cao, ở nồng độ 1000 µg /ml 50 Bảng 4.4. Kết quả đo OD của cao EA ở 5 nồng độ 50 Bảng 4.5. Kết quả đo OD của Vitamin C ở 5 nồng độ 51 Bảng 4.6. Kết quả xác định giá trị IC50 của cao EA và vitamin C 52 Bảng 4.7. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cao ethyl acetat 53 Bảng 4.8. Kết quả SKC trên cao EA (10 g) 56 vi
  9. DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ Hình 2.1. Sơ đồ vị trí phân loại của Polyscias fruticosa (L.) Harms. 2 Hình 2.2. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 7 Hình 2.3. Một số chế phẩm từ Đinh lăng 20 Hình 2.4. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 23 Hình 2.5. Phản ứng trong phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA 23 Hình 2.6. Phản ứng FRAP 25 Hình 3.1. Sơ đồ điều chế các loại cao bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 34 Hình 4.1. Cây Đinh lăng 39 Hình 4.2. Lá Đinh lăng 40 Hình 4.3. Hoa Đinh lăng 41 Hình 4.4. Quả Đinh lăng 42 Hình 4.5. Rễ Đinh lăng 42 Hình 4.6. Vi phẫu rễ Đinh lăng 44 Hình 4.7. Bột rễ Đinh lăng 45 Hình 4.8. Soi bột rễ Đinh Lăng 46 Hình 4.9. Sơ đồ chiết và tách phân đoạn từ rễ Đinh lăng 48 Hình 4.10. Sắc kí đồ các phân đoạn trong khảo sát HTCO 49 Hình 4.11. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ cao EA 51 Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ của vitamin C 52 Hình 4.13. Biểu đồ so sánh khả năng chống oxy hóa của cao EA với vitamin C 53 Hình 4.14. Sắc kí đồ thăm dò hệ dung môi cho cao EA 55 vii
  10. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT EA : Ethyl acetat Et2O : Diethyl ether n –BuOH : n – butanol n-Hex : n – hexan MeOH : Methanol SKLM : Sắc kí lớp mỏng SKC : Sắc kí cột CHCl3 : Clorofrom IC50 : Khả năng đánh bắt 50 % gốc tự do HTCO : Hoạt tính chống oxy hóa OD : Mật độ quang TP : Toàn phần PE : Pertroleum ether TT : Thuốc thử DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV viii
  11. CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Việt Nam vốn có nền văn hóa phương Đông nên việc sử dụng cây cỏ, dược liệu để làm thuốc phục vụ sức khỏe trở nên quen thuộc, phổ biến; lại thêm có khí hậu nóng ẩm, nhiều mưa, là điều kiện thuận lợi để thực vật phát triển phong phú đa dạng, tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dạo có thể nói là vô tận để phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên mang lại lợi ích sức khỏe cho con người. Ngày nay, xã hội phát triển hiện đại thì cũng phát sinh nhiều yếu tố mới như: Môi trường ô nhiễm, chất phụ gia trong thức ăn, các chất có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, rượu bia, thức ăn nhanh hay căng thẳng thần kinh (stress) Đây là những tác nhân chính gây ra gốc tự do. Theo thời gian gốc tự do không ngừng sản sinh và gây hại trong khi hệ thống phòng vệ của cơ thể lại từng bước suy yếu dần. Gốc tự do được xem là “ sát thủ giấu mặt ” gây ra quá trình lão hóa và phần lớn các bệnh tật nguy hiểm như: Trầm cảm, tăng huyết áp, ung thư, đái tháo đường, sa sút trí tuệ, Alzheimer (Viện dược liệu, 2006 ; Lại Thị Ngọc Hà và cs, 2009). Vậy nên, để bảo vệ sức khỏe, bên cạnh việc hạn chế các yếu tố làm tăng sinh gốc tự do cần phải bổ sung các chất chống gốc tự do cho cơ thể. Việc sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên để trung hòa gốc tự do, hạn chế quá trình oxy hóa đang được quan tâm và phát triển vì tính hiệu quả và an toàn mà nó đem lại. Ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, Đinh lăng đã được trồng và sử dụng từ rất lâu và phổ biến. Ngoài việc sử dụng để làm gia vị trong một số món ăn, Đinh lăng được sử dụng như một vị thuốc trong nền y học cổ truyền. Ngoài tác dụng bồi bổ tăng cường sức khỏe giống như Hải Thượng Lãn Ông có ví "Đinh lăng là nhân sâm của người nghèo", Đinh lăng còn được biết đến với tác dụng khác như lợi tiểu, chống trầm cảm, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt, ức chế enzym (Bensita mary bernard et al., 1998 ; Đỗ Tất Lợi, 2004 ; Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, 2001 ; Hồ Lương Nhật Vinh, 2014). Nhưng tác dụng chống oxy hóa của Đinh lăng thì chưa được nghiên cứu. Nhằm góp phần tìm hiểu thêm về tác dụng và giá trị mà cây Đinh lăng mang lại, đề tài " Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang " được tiến hành với mục tiêu sau: - Khảo sát sơ bộ về hình thái cây Đinh lăng và đặc điểm vi học của rễ Đinh lăng. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ Đinh lăng để chọn ra phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. - Khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học của phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. 1
  12. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. CÂY ĐINH LĂNG 2.1.1. Vị trí phân loại Cây Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm (họ Ngũ gia bì) có vị trí phân loại như sau (Trương Thị Đẹp, 2011): Giới thực vật (Plantae) Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionta) Ngành ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp ngọc lan (Magnoliopsida) Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionta) GiớPhâni thự cl ớvpậ tThù (Plantae) du (Cornidae) Bộ ngũ gia bì (Araliales) Họ ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Polyscias Loài Polyscias fruticosa (L.) Harms Hình 2.1. Sơ đồ vị trí phân loại của Polyscias fruticosa (L.) Harms. 2.1.2. Đặc điểm thực vật họ Nhân sâm Ở Việt Nam, họ Nhân sâm bì có trên 20 chi: Acanthopanax, Aralia, Aralidium, Arthrophyllum, Brassaiopsis, Dendropanax, Dizygotheca, Evodiopanax, Grushvitzkia, 2
  13. Hedera, Heteropanax, Macropanax, Panax, Pentapanax, Plerandropsis, Polycias, Pseudopanax, Scheffleropsis, Tetrapanax, Trevesia, Tupidanthus: Gần 120 loài. Thân: Thân cỏ hay cây gỗ nhỏ mọc đứng hoặc cây gỗ to ít phân nhánh, đôi khi leo. Lá: Lá thường mọc cách ở gốc thân mộc đối ở ngọn, đôi khi mọc vòng. Lá có thể đơn hay kep hình lông chim hoặc kép hình chân vịt. Phiến lá nguyên, có khía răng hoặc có thùy. Lá kèm rụng sớm hay đính vào cuống lá. Bẹ lá phát triển. Cụm hoa: Tán đơn hay kép, tụ thành chùm, đầu, gié ở nách lá hay ngọn cành. Hoa: Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5, 4 vòng. Bao hoa: Lá đài thu hẹp chỉ còn 5 răng, 5 cánh hoa rời và rụng sớm. Bộ nhị: 5 nhị xen kẽ cánh hoa. Bộ nhụy: 5 lá noãn dính nhau thành bầu dưới có 5 ô, mỗi ô 1 noãn; đôi khi có 10 lá noãn, ít khi giảm còn 3 hay 1 lá noãn; vòi rời. Quả: Quả mọng hay quả hạch. Hạt có nội nhũ (Trương Thị Đẹp, 2011). 2.1.3. Đặc điểm thực vật chi Polyscias Chi Polyscias Forst. & Forst. F. có gần 100 loại trên thế giới, phân bố rải rác ở cận vùng nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam có 7 loài đều là cây trồng (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Cây gỗ nhỏ hay vừa có dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai. Lá kép lông chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ. Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van. Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thuôn. Bầu dưới 2 ô, ít khi 3 – 4 ô; vòi nhụy 2 – 4 rời hay hợp ở gốc. Quả dẹt, ít khi gần hình cầu. Hạt dẹt (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). 2.1.4. Đặc điểm thực vật cây Đinh lăng Đinh lăng còn gọi là cây Gỏi cá. Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc họ Nhân sâm- Araliaceae. (Võ Văn Chi, 1997). Tên khác: Nam dương lâm Tên đồng nghĩa: Panax fruticosum L, Nothopanax fruticosum(L.) Miq. Tieghenopanax fruticosus(L.) R. Vig. (Đỗ Tất Lợi, 2004). Mô tả: Cây nhỏ dạng bụi, cao 1,5 – 2m. Thân nhẵn, ít phân nhánh, các nhánh non có nhiều lỗ bì lồi. Lá kép mọc so le, có bẹ, phiến lá xẻ 3 lần lông chim, mép có răng cưa không đều, chóp nhọn, lá chét và các đoạn đều có cuống. Cụm hoa chùy ở ngọn, gồm nhiều tán. Hoa nhỏ, màu trắng xám. Quả hình trứng, dẹt, màu trắng bạc. (Võ Văn Chi, 1997). 3
  14. Phân bố sinh thái Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie ở Thái Bình Dương. Cây được trồng ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, Đinh lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện Để làm cảnh, làm thuốc và làm rau gia vị. Đinh lăng là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được, theo kiểu cây cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2 – 3năm cây có hoa quả. Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Đinh lăng có khả năng tái sinh vô tính khỏe, với một đoạn thân hoặc cành cắm xuống đất đều trở thành cây mới (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Cách trồng Đinh lăng được trồng phân tán ở khắp nơi, để làm cảnh, lá làm gia vị, rễ làm thuốc. Hiện nay, một số nơi đã bắt đầu trồng Đinh lăng ở quy mô sản xuất thử (1000 – 2000 m2). Đinh lăng được nhân giống bằng cành. Trong nhân gian, khi trồng một vài cây trong chậu, trong bồn, góc sân, góc vườn người ta chỉ cần lấy một đoạn thân cành cắm xuống đất là được. Cành giâm lúc đầu chỉ ra rễ ở đầu dưới của cành. Thực tiễn thấy rằng, rễ này nhỏ và chất lượng kém hơn rễ phát sinh từ gốc chồi tái sinh. Tuy nhiên chồi tái sinh của Đinh lăng ra rễ rất chậm. Đó lý do tại sao Đinh lăng lâu được thu hoạch. Vấn đề này đang được nghiên cứu để tìm giải pháp khắc phục. Đất trồng Đinh lăng cần màu mỡ, tầng canh tác sâu, tơi xốp, cao ráo, thoát nước và tiện tưới. Đinh lăng được trồng quanh năm, tốt nhất là giâm cành vào tháng 5 – 6 và trồng vào tháng 7 – 8. Khi trồng nên cắt bớt lá để hạn chế thoát hơi nước, giúp cây nhanh phục hồi. Cây ưa bóng và ưa ẩm nên có thể trồng xen dưới tán cây trong vườn. Thường xuyên làm cỏ nhất là đối với cây mới trồng. Đinh lăng không có sâu bệnh nghiêm trọng. Cây trồng sau 7 – 10 năm mới thu hoạch. Cây càng già, năng suất và chất lượng rễ càng cao (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Bộ phận dùng Rễ, thân, lá – Radix, Caulis et Folium Polyscias. Thu hoạch rễ của những cây đã trồng từ 3 năm trở lên, đem rửa sạch phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi hương và phẩm chất. Khi dùng, đem rễ tẩm nước gừng tươi 5 % sao qua, rồi tẩm 5 % mật ong hoặc mật mía. Lá thu hái quanh năm thường dùng tươi. (Võ Văn Chi, 1997). 4
  15. 2.1.5. Thành phần hóa học Rễ Đinh lăng có glycosid, alcaloid, saponin, flavonoid, tannin, vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C ), polyacetylen, các phytosterol và tới 20 acid amin (Arginin, alanin, asparagin, cystein, acid glutamic, leucin, lysin ). Các saponin triterpen trong cây Đinh lăng đều có phần sapogenin là acid oleanolic, phần đường là glucose, galactose, rhammose , với tỷ lệ hàm lượng là: rễ 0.49 %; vỏ rễ 1.00 %; lõi rễ 0.11%. ( Võ Xuân Minh, 1992 ; Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992 ; Vo D. H., et al.,1998 ; Võ Xuân Minh và cs, 1991 ; Nguyễn Thời Nhâm và cs, 1990 ; Lutomski J et al., 1992). Trong lá Đinh lăng cũng có các thành phần hóa học như trong rễ Đinh lăng nhưng hàm lượng ít hơn. Hàm lượng saponin toàn phần trong lá là 0,38 %. Ngoài ra còn có tinh dầu với thành phần chính là β-elemen, α-bergamoten, germacren, γ- bisabolen (Võ Văn Chi ,1997 ; Võ Xuân Minh và cs, 1991 ; Brophy J.J et al., 1990). β-Elemen β-Germacren-D E-γ-Bisabolen α-Bergamoten 5
  16. Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng như: (8E)-Heptadeca-1,8-dien-4,6- diyn-3,10-diol; Palcarinol; (8Z)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on; (8E)- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, Panaxydol (Lutomski J. et al., 1992): HO 4 6 8 OH 10 3 17 1 (8E)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol 9 10 HO 4 6 3 17 1 Palcarinol HO 4 6 8 3 1 10 O 17 (8Z)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on HO 4 6 8 O 10 3 17 1 (8E)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on HO 4 6 8 3 10 1 O 17 Panaxydol Một số loại saponin có trong cây Đinh lăng đã phân lập được có công thức như sau ( Proliac J. et al., 1996 ; Vo D. H. et al., 1998 ; Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992): 6
  17. COOR2 R1O Hình 2.2. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng CH3 CH3 CH3 CH3 COOH H CH3 HO H H3C CH3 Acid oleanolic H3C CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 OH O O O HO O H H3C CH3 OH OH HO HO Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic. 7
  18. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH H CH3 HOOC HO O O OH HO H H3C CH3 O O HO HO OH Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC OH O O O H HO OH HO H3C CH3 O O HO HO OH Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HOOC OH O O O H HO HO OH H3C CH3 O O HO OH Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic. 8
  19. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH HOOC 3 HO O O O O HO H H3C CH3 HO OH OH O HO O HO OH Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic. CH3 CH3 O CH3 CH3 C OH H CH O HOOC 3 O O O O HO O HO HO H H3C CH3 OH HO OH OH HO HO 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D- glucopyranosyl ester. 9
  20. CH3 CH3 CH3 CH3 COO O OH H CH HO HOOC 3 O HO O O O H OH H3C CH3 HO HO HO O HO OH HO O OH HO HO 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester. CH3 CH3 CH3 CH3 COO O OH H CH HO HOOC 3 O HO O O O H OH H3C CH3 HO O HO HO HO OH HO O OH HO HO 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester. 10
  21. CH3 CH3 CH3 CH3 COO O OH H CH HO HOOC 3 O HO O O O H OH H3C CH3 HO O HO HO HO OH HO O OH HO HO 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester. CH3 CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH HO HOOC 3 O O O O HO HO H OH HO H3C CH3 OH OH HO O H C 3 O HO HO OH 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester. 11
  22. CH3 CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH HO HOOC 3 O O O HO O H OH HO H C CH HO O 3 3 OH HO HO O H C 3 O HO HO OH HO HO OH 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- glucopyranosyl ester. CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH H CH3 HO O O OH HO H OH H3C CH3 O O HO Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] oleanolic. 12
  23. H3C CH3 CH3 CH3 COO OH O H CH3 HO OH O O HO O H H3C CH3 O HO OH OH CH3 OH OH HO Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D- glucopyranosyl] oleanolic. Trong những năm gần đây, có nhiều hợp chất saponin mới được phân lập. Năm 2014, Hồ Lương Nhật Vinh đã phân lập được 3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-D- galactopyranosy l(1→4)]-β-D-glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D- glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] ester từ lá cây Đinh lăng. Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu và cộng sự lần đầu tiên phân lập được hợp chất falcarindiol từ rễ Đinh lăng. Cùng năm 2016, Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự lần đầu tiên phân lập được 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- galactopyranosyl ester (từ lá Đinh lăng) và được đặt tên là polyscioside I (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014 ; Nguyễn Thị Bích Thu và cs, 2016 ; Trần Thị Hồng Hạnh và cs, 2016). 13
  24. CH3 CH3 O CH CH OH 3 3 OH OH O H CH3 O OH O COOH OH OH O O O H O HO OH HO H C CH 3 3 O OH O HO OH HO HO O HO OH 3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-D-galactopyranosy l(1→4)]-β-D- glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D- glucopyranosyl] ester OH 3 8 17 OH Falcarindiol CH3 CH3 O CH3 CH3 OH O H CH HOOC 3 O O O O OH OH HO HO H H3C CH3 HO OH O O HO HO O O HO O HO HO HO OH OH Polyscioside I 14
  25. Viện hóa sinh biển-Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ lá Đinh lăng là quercitrin, afzelin và kaempferol-3-O-rutonosid (Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012): OH OH OH O OH O OH O O O OH O CH3 OH O OH O OH HO H3C OH OH OH Quercitrin Afzelin OH OH O O OH O OH O OH O OH O H3C OH OH OH Kaempferol-3-O-rutinosid 2.1.6. Tác dụng dược lý và công dụng Cây Đinh lăng được coi như nhân sâm Việt Nam vì nó có rất nhiều tác dụng tương tự như nhân sâm: làm tăng cường sức dẻo dai và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, chống được hiện tượng mệt mỏi, bổ dưỡng, làm cho cơ thể ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, lên cân và chống độc (Võ Văn Chi, 1997 ; 15
  26. Đỗ Tất Lợi, 2004). Đinh lăng có tác dụng làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật. Đinh lăng có tác dụng tăng co bóp tử cung, có tác dụng an thần và ít độc, có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen. Nước sắc Đinh lăng có tác dụng đối kháng trùng roi Euglena viridis, trùng tiêm mao Paramoecium caudatum và một số động vật nguyên sinh khác trong nước ngâm rơm và nước ao. Nước săc Đinh lăng còn có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ vừa, bảo vệ được 60 % chuột Lang qua cơn choáng. Đinh lăng có tác dụng kháng Entamoeba histolyca, làm đơn bào co thành kén. Đinh lăng đã được nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt bằng hồng cầu cừu. Đinh lăng có tác dụng ức chế mạnh hoạt độ men MAO ở não và gan. Dịch chiết Đinh lăng còn được thử tác dụng đối với ATPase màng tế bào, và thấy K+, Na+, ATPase đều được kích thích bởi dịch chiết thân, rễ và lá của cây. Đinh lăng còn có tác dụng kích thích sinh dục ở động vật già và kích thích tăng sinh lực ở động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài và bền vững (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Ở Ấn Độ, người ta cho là cây có tính làm săn, dùng trong điều trị sốt. Ở Campuchia, người ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ nhiệt, thuốc giảm đau. Lá dùng xông để ra mồ hôi và chữa chứng chóng mặt, dùng tươi giã nát đắp ngoài trị viêm thần kinh khớp và vết thương. Lá nhai nuốt với chút phèn giúp trị hóc xương cá (Võ Văn Chi, 2004). Cụ thể các nghiên cứu cho thấy: - Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như nhân sâm. (Đỗ Tất Lợi, 2004) - Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Đinh lăng có tác dụng lợi tiểu, làm tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tần (Đỗ Tất Lợi, 2004 ; Đỗ Huy Bích và cs., 2004). - Cây Đinh lăng có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao (Nguyễn Thị Thu Hương và Lương Kim Bích, 2001). - Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol phân lập được từ cây Panax vietnamensis và Polycias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được vi khuẩn Gram (-) (Lutomski J. et al., 1992). - Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng. Kết quả cho thấy 16
  27. cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress với liều 45 – 180 mg/kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch (Nguyễn Thị Thu Hương và Lương Kim Bích, 2001). - Dịch chiết cồn của rễ Đinh lăng được nuôi cấy mô trong 6 tháng đã thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày, chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như dịch chiết cồn của rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Ngọc Dung, 1998). - Dịch chiết n-butanol của lá cây Đinh lăng với liều 500 mg/kg có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm và diệt nhuyễn thể trên chuột nhắt trắng (Bernard M.B. et al., 1998 ). - Cao lá Đinh lăng ở liều 200 mg/kg và 500 mg/kg làm giảm lượng Malondialdehyde trong não và gan chuột nhắt trắng sau khi được gây tăng bằng CCl4 và làm giảm nồng độ cholesterol trong máu so với lô không điều trị. Cao lá Đinh lăng ở liều 200 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa và hạcholesterol ở chuột nhắt cao hơn so với liều 500 mg/kg (Nguyễn Trần Châu và Đỗ Mai Anh, 2008). - Năm 2011, Varadharajan và cộng sự đã chứng minh được hoạt tính lợi tiểu của dịch chiết dầu hỏa rễ Đinh lăng trên động vật thí nghiệm (Varadharajan R. and Rajalingam D., 2011) - Năm 2012, viện Hóa sinh biển – Viện khoa học công nghệ Việt Nam đã chứng minh trên in vitro tác dụng ức chế enzyme α-amylase của 2 flavonoid phân lập là quercitrin và kaempferol-3-O-rutonosid với giá trị IC50tương ứng là 4,61 µg/ml và 59,4 µg/ml (Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012). - Năm 2014, kết quả thử in vitro cho thấy lá Đinh lăng có tác dụng ức chế tốt 2 enzyme α- amylase và α- glucosidase. Đây là 2 enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân, hấp thu tinh bột và chuyển hóa đường trong cơ thể và việc ức chế 2 enzyme này có thể giúp ngăn chứng tăng đường huyết (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014). 2.1.7. Một số bài thuốc có Đinh lăng Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình. Lá Đinh lăng có vị nhạt, hơi đắng, tính bình (Võ Văn Chi, 1997) Theo dân gian, rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, chữa cơ thể suy nhược, gầy 17
  28. yếu mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi tiểu. Thân và cành dùng chữa phong thấp, đau lưng. Lá dùng chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú (Võ Văn Chi, 2004).Dưới đây là một số bài thuốc dân gian có Đinh lăng: Thuốc bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực: Rễ củ Đinh lăng thái lát, phơi khô, sao vàng sắc uống hằng ngày, có thể nghiền thành bọt mịn để uống ngày 20 – 30 g (Quách Tuấn Vinh, 2006). Chữa Phong thấp, thấp khớp: Rễ Đinh lăng 12 g; Cối xay, Hà thủ ô, Huyết rồng, cỏ Rễ xước, Thiên niên kiện tất cả 8 g; vỏ Quýt, Quế chi 4 g (riêng vị Quế chi bỏ vào sau cùng khi sắp nhấc ấm thuốc xuống). Đổ 600 ml nước sắc còn 250 ml. Chia làm hai lần uống trong ngày. Uống khi thuốc còn nóng (Võ Hà, 2008). - Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 0.50 g thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 – 3 lần uống trong ngày. Thông tia sữa, căng vú sữa: Rễ Đinh lăng 30 – 40 g. Thêm 500 ml nước sắc còn 250 ml. Uống nóng. Uống luôn 2 – 3 ngày, vú hết nhức, sữa chảy ra bình thường (Đỗ Tất Lợi, 2004). Chữa vết thương: Giã nát lá Đinh lăng đắp lên ( Đỗ Tất Lợi, 2004). Lợi sữa: Lá Đinh lăng tươi 50 – 100g, bong bóng lợn 1 cái, băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn. Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30 – 40g, thêm 500 ml nước, sắc còn 250 ml, uống nóng, ngày uống 1 – 2 lần, uống trong 2 – 3 ngày (Võ Văn Chi, 1997). Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật (Đỗ Tất Lợi, 2004). Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30 g, lá hoặc vỏ Chanh 10 g, vỏ Quýt 10 g, Sài hồ (rễ, lá,cành) 20 g, lá Tre tươi 20 g, Cam thảo dây hoặc Cam thảo đất 30 g, Rau má tươi 30 g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong ngày (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Chữa đau tử cung: Cành và lá Đinh lăng rửa sạch sao vàng, sắc uống thay chè (Đỗ Huy Bích và cs, 18
  29. 2006). Chữa mẫn ngứa do dị ứng: Lá đinh lăng 80 g, sao vàng, sắc uống. Dùng trong 2 – 3 tháng (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Chữa thiếu máu: Rễ Đinh lăng, Hà thủ ô, Thục địa, Hoàng tinh, mỗi vị 100 g, Tam thất 20 g. Tán bột, sắc uống ngày 100 g (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Chữa viêm gan mạn tính: Rễ Đinh lăng 12 g, Nhân trần 20 g, Ý dĩ 16 g; Chi tử, Hoài sơn, Biển đậu, rễ Cỏ tranh, Xa tiền tử, Ngũ gia bì, mỗi vị 12 g; Uất kim, Nghệ, Ngưu tất, mỗi vị 8 g. Sắc uống, ngày một thang (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Chữa liệt dương: Rễ Đinh lăng, Hoài sơn, Ý dĩ, Hoàng tinh, Hà thủ ô, Kỷ tử, Long nhãn, cám Nếp, mỗi vi 12 g; Trâu cổ, cao long ban, mỗi vị 8 g; Sa nhân 6 g. Sắc uống, ngày một thang (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Chữa sốt rét: Rễ Đinh lăng, Sài hồ, mỗi vị 20 g; Rau má 16 g; lá Tre, Cam thảo nam, mỗi vị 12 g; Bán hạ sao vàng 8 g, Gừng 6 g, sắc uống (Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Phòng tác dụng của thuốc chữa lao: Lá Đinh lăng sao vàng 20 – 25 g, hãm nước uống hàng ngày (Quách Tuấn Vinh, 2005). Chữa ho suyễn lâu năm: Rễ đinh lăng, Bách bộ, Đậu săn, rễ cây Dâu, Nghệ vàng, rau tần dày lá, mỗi vị 8 g, củ Xương bồ 6 g, Gừng khô 4 g. Đổ 600 ml sắc còn 250 ml. Chia làm hai lần uống trong ngày. Uống lúc thuốc còn nóng (Võ Hà, 2008). 19
  30. 2.1.8. Một số chế phẩm từ Đinh Lăng Trên thị trường hiện nay, có các chế phẩm từ Đinh lăng sau: Trà Đinh lăng Rượu Đinh lăng Hòa Bình Công ty TNHH Lava (www.goidinhlangthienduong.com) (www.quagac.com) Viên nang Vanina Cebraton Học viện quân y Traphaco ( www.giamcanlishou.com) (www.baomoi.com) Hình 2.1. Một số chế phẩm từ Đinh lăng 20
  31. 2.2. GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 2.2.1. Khái niệm gốc tự do Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (ROS và RNS), là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do. Gốc tự do là những phân tử hoặc nguyên tử có điện tử độc thân, điện tử này làm cho gốc tự do có khả năng oxy hóa rất cao. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd là tiền chất của các gốc tự do. Các gốc tự do không bền với thời gian nên nó phải nhận điện tử từ các phân tử khác để đạt được cấu trúc bền vững. Quá trình này tạo thành một dây chuyền phản ứng với các phân tử chung quanh nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989 ; Favier A., 2003 ; Viện dược liệu, 2006). Trong cơ thể người và động vật, thường xuyên có sự hình thành các gốc tự do, phát sinh trong quá trình chuyển hóa hay là sản phẩm của phản ứng khử độc đối với một số chất hoặc yếu tố ngoại lai trong hệ thống lưới nội bào. Ngoài ra chúng có thể được sinh ra do một số tác nhân bên ngoài như tia tử ngoại, nhiễm độc lân hữu cơ, hay bệnh lý gây ra bởi stress như chấn thương, bỏng . Khi có sự gia tăng hình thành gốc tự do, làm mất cân bằng hệ thống oxy hóa, kết quả làm tổn thương cấu trúc phân tử của tế bào như lipid, ADN, protein dẫn đến thay đổi chức năng hoạt động của tế bào (Viện dược liệu, 2006) 2.2.2. Tác động của gốc tự do và sự liên quan đến bệnh tật con người Gốc tự do sinh ra quá mức sẽ vượt qua hệ thống enzym bảo vệ của cơ thể (enzym superoxid dismutase - SOD, catalase, peroxidase ) và không tránh khỏi việc các gốc này tấn công vào tất cả các chất trong cơ thể. Những thành phần tế bào như ADN, protein, phospholipid, carbohydrat . dễ bị gốc tự do tấn công, là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm. Gốc tự do tấn công vào phospholipid màng tế bào gây ra quá trình peroxy hóa lipid. Hậu quả dẫn đến tính lỏng, tính thấm của màng tế bào thay đổi. Quá trình peroxy hóa ở quanh bao myelin của sợi tế bào thần kinh có thể dẫn tới các dấu hiệu của bệnh thần kinh (bệnh não suy Alzheimer). Nếu peroxy hóa các chất xảy ra trên bề mặt phế nang sẽ gây ra dấu hiệu rối loạn chức năng phổi. Quá trình peroxy hóa lipid xảy ra mãnh liệt ở cơ quan, tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy một cách nghiêm trọng dẫn đến đột biến, ung thư hoặc tổn thương các phân tử ADN. Sự tác động đến các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại các phân tử polysaccharid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyalunoric (một chất làm trơn khớp), ảnh 21
  32. hưởng tới quá trình viêm có thể dẫn tới bệnh viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ . Gốc tự do liên quan chặt chẽ đến sự điều hòa các chất tiết ra từ thành trong mạch máu (prostacyclin, nitrogen oxyd ) để quyết định tính bám dính của tiểu cầu và các mảng xơ vữa là nguyên nhân của một số bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não ) Nói chung gốc tự do liên quan đến khá nhiều bệnh tật trong cơ thể vì thế nếu khả năng chống oxy hóa của cơ thể cao thì xác suất mắc bệnh và mức độ bệnh tật sẽ giảm. Vì thế người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa cho cơ thể nhằm nâng cao và bảo vệ sức khỏe con người (Lại Thị Ngọc Hà và cs, 2009 ; Nguyễn Ngọc Hồng, 2009). 2.2.3. Chất chống oxy hóa Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa việc tạo ra các gốc oxy hóa và các chất chống oxy hóa, đó là trạng thái căn bản của cân bằng nội môi. Các chất chống oxy hóa là những chất giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do tạo ra trong các quá trình oxy hóa nên ngăn cản hay làm chậm quá trình này. Ngoài ra, các chất chống oxy hóa còn được sử dụng trong ngành dược và mỹ phẩm với mục đích bảo vệ sự ổn định của dược chất. Do đó, chất chống oxy hóa cũng được định nghĩa là những chất khử mạnh có hoạt tính oxy hóa cao hơn so với dược chất. Các chất chống oxy hóa trong dược phẩm được chia ra làm nhiều nhóm dựa trên cơ chế khác nhau bao gồm các cơ chế chống oxy hóa trực tiếp và chống oxy hóa gián tiếp. - Các chất chống oxy hóa gián tiếp là những tác nhân chelat hóa tác động lên các ion kim loại như Fe2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+ . Vì đây là các ion xúc tác cho các quá trình khơi mào phản ứng oxy hóa. - Các chất chống oxy hóa trực tiếp bao gồm các chất khử hóa, các chất oxy hóa chọn lọc và các chất ngắt mạch. Trong thiên nhiên, các chất chống oxy hóa có từ nhiều nguồn gốc khác nhau nhưng cây cỏ vẫn là nguồn quan tâm chủ yếu. Một số chất chống oxy hóa đã được tìm ra, chứng minh và sử dụng hàng loạt như: Vitamin E, vitamin C, polyphenol, flavonoid (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J. et al, 2007). 2.2.4. Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro 2.2.4.1. Thử nghiệm sử dụng DPPH DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. 22
  33. Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm. Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm nhạt dần màu tím của DPPH ( Huang D. et al, 2005 ; Wang J. et al, 2007). N N NH N + RH + R O2N NO2 O2N NO2 NO2 NO2 Hình 2.4. Phản ứng trung hòa gốc DPPH Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100 OD: Mật độ quang 2.2.4.2. Thử nghiệm sử dụng TBA - đo lượng MDA MDA (Malonyl dialdehyd) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Sử dụng acid thiobarbituric (TBA) để xác định hàm lượng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxy hóa của chất nghiên cứu thể hiện qua việc giảm hàm lượng MDA. Một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử TBA tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 523 nm (Nguyễn Thượng Dong và cs, 2006 ; Viện dược liệu, 2006). O O O H2 HN -2H HN NH OHC C CHO + 2 t S N O S N O O N S H H H Hình 2.5. Phản ứng trong phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(CMDA chứng – CMDA thử)/ CMDA chứng] x 100 Nồng độ MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. 23
  34. 2.2.4.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với thuốc thử Ferrozin (Viện dược liệu, 2006). EDTA được sử dụng như chất đối chiếu dương tính. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)]x100 2.2.4.5. Thử nghiệm đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử, sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J, 2007). Enzym superoxyd dismutase (SOD) được sử dụng như chất đối chiếu dương tính. HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100 2.2.4.6 Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Phương pháp FRAP) Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power) được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử hóa của các chất trong huyết tương, nhưng đây cũng là phương pháp được sử dụng để thử nghiệm các chất chống oxy hóa trong thực vật. Phương pháp này dựa vào sự khử phức ferric 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe3+ – TPTZ) thành phức chất ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe2+ – TPTZ) bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxy hóa) ở pH thấp. Phức Fe2+ – TPTZ tạo thành có màu xanh dương đậm, bền vững và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 593 nm ( Benzie I.F.F and Strain J.J, 1999 ; Wojdylo A. et al, 2007 ; Nguyen Thi Hoai Thu et al, 2011) 24
  35. N N N N N N antioxidant N N N N N N Fe3+ +e Fe2+ N N N N N N N N N N N N Hình 2.6. Phản ứng FRAP 2.2.4.7. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 (Hydrogen peroxide scavenging activity) - Hai tiểu phân O2 và H2O2 sinh ra từ chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng 1 . độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzym peroxydase từ cải gia (Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý, 2006) 2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây. Nhưng các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng- lỏng và chiết rắn- lỏng. - Chiết lỏng – lỏng (phân bố lỏng– lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. - Chiết rắn – lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010). 2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt 25
  36. các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan các hợp chất có tính phân cực mạnh. Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K. Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. Ca K Cb Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó. Nhược điểm: Do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2. Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng Trong thực ngiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhều, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự chiết bằng máy chiết Soxhlet, sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu với nước còn được gọi là nước sắc. Ngoài ra còn có sự chiết với các phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn, (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. 26
  37. Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn. Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết. Có 3 phương pháp ngấm kiệt: - Ngấm kiệt thường. - Ngấm kiệt kèm sấy phun. - Ngấm kiệt ngược dòng. Ngấm kiệt thường là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi thời điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong Dược liệu. Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Phương pháp ngâm lạnh Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. Trong thời gian này, cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Phương pháp ngâm nóng 27
  38. Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước. Chưng cũng có thể coi là một biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.3. Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. Túi đựng bột dược liệu của kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt hơn. Ưu điểm: Lượng dung môi sử dụng nhỏ mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất. Nhược điểm: Khó thực hiện cho một lượng lớn Dược liệu. Thông thường, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot. Không khấy trộn được trong quá trình chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước. Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính bay hơi được, ví dụ như tinh dầu. Dụng cụ: Có thể tự lắp ráp hệ thống lôi cuốn hơi nước theo kiểu cổ điển với nhứng dụng cụ thủy tinh sẵn có trong phòng thí nghiệm (bình cầu, bếp đun, ống ngưng hơi, các ống nối bằng thủy tinh, ) hoặc theo kiểu cải tiến Dean – Start (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.5. Chiết các nguyên liệu tươi Với các mô sống của động vật hay các dược liệu mỏng manh như lá, hoa người ta có thể chiết nhanh các chất trong tế bào với các dung môi nước hoặc thân nước bằng cách xay nhỏ mô động thực vật trong dung môi. Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) trong một thời gian ngắn khoảng 5 - 10 phút. Với tốc dộ này, các mô được phân tán rất nhỏ, tế bào bị 28
  39. vỡ và các chất tan đi thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu bằng quá trình hòa tan. Sự thẩm thấu, nếu có cũng chỉ đóng vai trò thứ yếu. Với cách chiết này, toàn bộ các chất trong tế bào gồm cả các chất chuyển hóa bậc II lẫn các chất đại phân tử đều có mặt trong dịch chiết. Cách chiết này có lợi khi nghiên cứu các protein, các chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ các của phân tử. Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động của các enzym có thể làm thay đổi cấu trúc các chất và hạn chế các tạp chất như protein, polysaccharid, dung môi sử dụng có thể là cồn hay aceton. Quá trình chiết này do được thực hiện bằng máy khuấy có tốc độ cao nên cũng được gọi là turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.2.6. Các phương pháp chiết khác Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.3. Một số phương pháp phân lập hợp chất hữu cơ 2.3.3.1. Sắc ký lớp mỏng Nguyên tắc Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silica gel nhôm oxyt) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất béo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010). Các ứng dụng của SKLM (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010): - Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được. - So sánh với một chất chuẩn. - Kiểm nghiệm dược liệu. - Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu. - Xác định sự có mặt của một dược liệu nào đó trong hỗn hợp. - Xác định một hợp chất là thành phần của một hỗn hợp - Theo dõi phản ứng, tối ưu hóa phản ứng. 29
  40. - Bán định lượng. - Đối với bản mỏng chế hóa, có thể phân lập và thu được hợp chất tinh khiết. 2.3.3.2. Sắc kí cột SKC nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lượng lớn từ một hỗn hợp nhiều thành phần (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010). Sắc kí cột cổ điển Nguyên tắc: Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyt). Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010). Một vài SKC cải tiến Sắc kí cột khô:Kỹ thuật này tương đồng với kỹ thuật SKLM điều chế. Sắc kí cột chớp nhoáng (FC): Đây là kỹ thuật sắc kí lỏng dùng áp suất nén ở đầu cột. Có thể tách chất nhanh trong 10 – 15 phút một hỗn hợp mẫu chất ( từ 10 mg – 10 g) chứa những hợp chất mà SKLM cho các vết ΔRf ≥ 0.15. Sắc kí cột chân không (VLC): VLC là một dạng SKC nhanh không tiêu chuẩn, là một dạng sắc kí hấp phụ trên cột pha thuận khai triển với tốc độ nhanh. Về khả năng tách, VLC đạt khả năng tách trung bình (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 2.3.3.3. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là kỹ thuật sắc kí với các ưu điểm: Tốc độ cao, độ phân giải cao, độ nhạy cao, cột có thể tái sử dụng, không phá hủy các thành phần, các thiết bị được tự động (máy vi tính), mẫu được phục hồi hoàn toàn, việc đinh lượng dễ dàng và nhanh, HPLC có thể chia thành 2 loại chính theo mục đích sử dụng: Loại sắc kí phân tích và loại sắc kí điều chế hoặc bán điều chế. Hệ thống HPLC gồm: Bình chứa dung môi ( pha động), bơm áp lực cao, thiết bị đầu vào mẫu, cột, đầu dò, bộ phận ghi nhận (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 30
  41. CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Cây Đinh lăng được thu hái ngày 11/2016 tại Tri tôn – An giang, dược liệu thu hái về được nhận dạng bởi PGS.TS.Trần Công Luận và so sánh với các mô tả trong tài liệu tham khảo (Đỗ Tất Lợi, 2004 và Võ Văn Chi, 2004), là đúng loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms). Lá, hoa, quả, rễ tươi được rửa sạch và khảo sát hình thái. Rễ tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó thái lát mỏng và đem sấy ở 50 oC (bằng tủ sấy). Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu. Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn Dược liêu, trường Đại Học Tây Đô. 3.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.2.1. Dung môi, hóa chất Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản sẵn có trong phòng thí nghiệm, trong phần thực nghiệm có sử dụng: - Chất đối chứng: Vitamin C (Ấn Độ). - Chất DPPH ( Anh) - Dung môi chiết xuất: cồn 96 %. - Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol, methanol, cloroform, acid acetic, n-hexan, - SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm Merck (Đức). - Silica gel cỡ hạt 37 – 63 μm (Ấn Độ). - Thuốc thử vanillin sufuric (VS), thuốc thử H2SO4 10%, FeCl3 5% 3.2.2. Thiết bị, dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 1800 SHIMADZU (Nhật Bản) - Đèn soi UV-Vis Desaga Sarstedt Gruppe. (USA) - Cân hồng ngoại, cân phân tích, cân kỹ thuật OHAUS (Trung Quốc). - Máy cô quay (Trung Quốc). - Bếp cách thủy (Trung Quốc). - Máy xay nguyên liệu, máy lắc phân bố (Trung Quốc). - Bình ngấm kiệt, bình hút ẩm (Việt Nam). - Tủ sấy Shanghai Fengling (Trung Quốc). - Cột sắc kí. - Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm. 31
  42. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Khảo sát đặc điểm thực vật học 3.3.1.1. Khảo sát hình thái Quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và các bộ phận của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng, 3.3.1.2. Khảo sát vi phẫu rễ Rễ tươi được cắt bằng tay với dao lam theo phẫu thức ngang. - Nhuộm vi phẫu bằng phương pháp nhuộm kép với thuốc nhuộm lục iod và son phèn. - Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính. 3.3.1.3. Khảo sát bột rễ dược liệu Rễ Đinh lăng được phơi sấy ở nhiệt độ 50 oC đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây để lấy hết. - Bột rễ Đinh lăng được quan sát trong môi trường nước ở vật kính 10X, 40X. - Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính. 3.3.2. Thử tinh khiết Theo các phụ lục trong Dược Điển Việt Nam IV (DĐVN IV) 3.3.2.1. Độ ẩm dược liệu: Được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô bằng cách dùng cân hồng ngoại theo phụ lục 9.6 (trang PL – 182). Độ ẩm không quá 13,0 %. 3.3.2.2. Xác định tro toàn phần: Được tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp 2 (trang PL – 183). Không quá 8,0 %. Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 oC đến 105 oC rồi đem nung trong lò nung ở 600 oC ± 25 oC. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khôi lượng không đổi. Các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên được tiến hành thử 3 lần độc lập và lấy giá 32
  43. trị trung bình. 3.3.3. Nghiên cứu hóa học 3.3.3.1. Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn Chiết xuất Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt Dược liệu sau khi được làm ẩm bằng dung môi chiết ethanol 96 % , được cho vào bình ngấm kiệt. Sau 24 giờ, rút dịch chiết với tốc độ 1.5 ml/ phút, chiết kiệt đến khi dịch chiết không còn chất, kiểm tra bằng SKLM với thuốc thử H2SO4/EtOH 20 % (không còn vết màu trên bản mỏng). Gộp tất cả dịch chiết lại, trộn đều, cô thu hồi dung môi trong điều kiện áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 60 oC để đuổi hết ethanol, ta thu được cao toàn phần. Cao được bảo quản trong chai kín, dán nhãn và bảo quản lạnh. Điều chế cao phân đoạn Điều chế cao phân đoạn từ cao toàn phần bằng kỹ thuật lỏng – lỏng Cao toàn phần được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dịch này lần lượt với các dung môi sau: Diethyl ether, ethyl acetat, n - butanol. Các phân đoạn thu được đem cô dưới áp suất giảm tới cao đặc. Tóm tắt quy trình chiết xuất và thu cao phân đoạn theo sơ đồ hình 3.1. 33
  44. Bột dược liệu Chiết ngấm kiệt/ cồn 96 % Dịch chiết cồn Bã dược liệu Cô quay Cao cồn Hòa với nước Dịch nước Lắc với diethyl ether Dịch diethyl ether Dịch nước Cô quay Lắc với ethyl acetat Cao diethyl ether Dịch ethyl acetat Dịch nước Cô quay Lắc với n-butanol Cao ethyl acetat Dịch n-butanol Dịch nước Cô quay Cô quay Cao n-butanol Cao nước Hình 3.1. Sơ đồ điều chế các loại cao bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 34
  45. 3.3.3.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn Phương pháp sử dụng DPPH Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả ổn định. Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu. Nguyên tắc: Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm (Viện dược liệu, 2006; Wojdylo A. et al, 2007). Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol bằng cách hòa tan 5,915 mg DPPH với một lượng methanol vừa đủ, sau đó cho vào bình định mức và thêm methanol vừa đủ 25 ml. Pha xong dùng ngay, đựng trong chai thủy tinh màu. Mẫu thử:: Khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các mẫu cao toàn phần, cao diethyl ether, cao ethyl acetat, cao n-butanol, cao nước. Các cao này được hòa tan với MeOH để đạt được nồng độ ban đầu là 1000 μg/ml. Nếu khó tan có thể dùng DMSO trợ tan. Đối chứng dương được sử dụng là vitamin C. a) Sàng lọc HTCO của cao phân đoạn bằng SKLM. Phương pháp hiện màu trực tiếp trên bản mỏng đã chạy sắc ký là phương pháp đơn giản và rẻ tiền nhất, dễ dàng thực hiện và đòi hỏi rất ít các trang thiết bị để phát hiện các thành phần có hoạt tính. Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong việc định vị và xác định đặc tính của chất trong quá trình phân lập chất theo định hướng hoạt tính sinh học, là việc kết hợp chạy SKLM với thử nghiệm sinh học tại chỗ. Nó cho phép định vị vị trí chất có hoạt tính trên bản mỏng trong một hỗn hợp chất nền. Tuy nhiên phương pháp này chỉ có tác dụng chủ yếu là phát hiện ra các chất mới có hoạt tính, thường là các chất dẫn đường cho nghiên cứu tiếp theo (Masoko P. and Eloff J.N., 2007; Wang J. et al, 2012). Bản mỏng: Silica gel 60 F254. Dung dịch thử: Lấy 0,1 g cao hòa tan với 2 ml MeOH. Dung môi khai triển:n-butanol - acid acetic - nước (7:1:2). Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Sau đó bản mỏng sẽ được nhúng với TT DPPH /MeOH trong 5 giây. Sau khi nhúng 2 35
  46. phút những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa sẽ hiện màu vàng sáng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxy hóa làm mất màu tím của TT. DPPH. Đồng thời triển khai thêm 1 bản mỏng cùng điều kiện và mỗi bản mỏng sau khi khai triển được nhúng vào TT. FeCl3 5% /cồn. Chứng dương sử dụng là vitamin C. So sánh bằng mắt thường giúp ta định hướng được những phân đoạn và vết chất nào nào có thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. b) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng quang phổ UV – Vis Phương pháp này giúp khẳng định chính xác hơn về hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn dựa trên HTCO của các cao phân đoạn (Nguyễn Thượng Dong và cs, 2006): Tiến hành quy trình khảo sát Bảng 3.1. Phản ứng thử nghiệm sử dụng DPPH Dung dịch thử Dung dịch MeOH Dung dịch DPPH Ống (ml) (ml) (ml) Trắng 0 4 0 Chứng 0 3,5 0,5 Thử 0,5 3 0,5 Hỗn hợp sau khi pha để trong tối, ở nhiệt độ phòng, trong 30 phút. Đo quang ở bước sóng 517 nm. Tính kết quả Hoạt tính đánh bắt gốc tự do HTCO (%) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ ODchứng ] x 100 Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau. Cùng với vitamin C, chọn cao cho kết quả HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn tính được IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngược lại. Cách tính IC50: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do theo nồng 36
  47. độ khảo sát của thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách thay y = 50 vào phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b. 3.3.3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trên cao ethyl acetat Mục đích: Để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp có trong cao ethyl acetat bằng các phản ứng hóa học dựa trên nguyên tắc: Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch thử. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính một hợp chất mà chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện. Chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. 3.3.3.4. Phân Lập Phân tách cao ethyl acetat bằng SKC cổ điển Mục đích: Tách hỗn hợp toàn phần trong cao ethyl acetat ra các phân đoạn đơn giản hơn. Lựa chọn hệ dung môi bằng cách dò tìm bằng sắc kí lớp mỏng. Chọn hệ dung môi có: Hệ càng đơn giản càng tốt, thông thường hệ gồm 2 thành phần. Các vết có di chuyển, có tách nhau. Các vết cần tách có Rf = 0,25 – 0,35 khi khai triển trên bản mỏng cùng loại. Tiến hành SKC cổ điển Dung môi khai triển: Chọn hệ đã khảo sát bằng kỹ thuật SKLM. Nhồi cột: Silica gel được nhồi cột ở dạng sệt với lượng silica gel khô gấp 30 lần lượng mẫu khô. Ổn định cột bằng dòng dung môi chảy qua cột và để yên 12 giờ. Nạp mẫu: Mẫu được nạp ở dạng bột khô (mẫu được hòa tan với một lượng dung môi, ví dụ methanol gấp 50 lần lượng mẫu, sau đó silica gel được thêm vào với lượng gấp 10 lần lượng mẫu, đem hỗn hợp này cô quay đến khi có bột silica gel khô). Khai triển cột: Ly giải với dung môi có tính phân cực tăng dần theo kiểu bậc thang- luân phiên đẳng dòng, với vận tốc 50 giọt/phút. Gộp phân đoạn: Các phân đoạn được chấm lên bản mỏng, khai triển với hệ 37
  48. dung môi thích hợp. So sánh dựa trên số vết, Rf của các vết và tỉ lệ các vết khi soi dưới đèn UV 254 nm và 365 nm. Phân đoạn sau khi gộp được cô giảm áp đến cắn khô hoặc dịch đậm đặc (Nguyễn Thị Kim Phụng, 2007). 38
  49. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. THỰC VẬT HỌC 4.1.1. Đặc điểm hình thái Cây xanh tốt quanh năm, thân tròn sần sùi không gai, mang nhiều vết sẹo lồi to màu nâu xám. (Đinh lăng 3 năm) (Đinh lăng con) (Đoạn thân) Hình 4.1. Cây Đinh lăng 39
  50. Lá mọc cách, kép lông chim 2 - 3 lần. Lá chét chia thùy nhọn không đều, màu xanh, bóng mặt dưới nhiều hơn, gốc lá và phiến lá thuôn nhọn dài 3 - 5 cm, rộng 0,5 - 1,5 cm. Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ, 3 - 4 cặp gân phụ. Cuống lá dài, tròn, màu xanh sậm, có những đốm xanh nhạt trên cuống, đáy cuống phình to thành bẹ lá. Hình 4.1. Lá Đinh lăng 40
  51. Cụm hoa tán tụ thành chùm ở ngọn cành. Hoa nhỏ, đều. Cuống hoa hình trụ, màu xanh, dài 0,3-0,4 cm. Bao hoa: đài hoa thu hẹp chỉ còn 5 răng, đều, rời, dạng vảy màu xanh; 5 cánh hoa rời, đều, màu xanh, hình bầu dục thuôn nhọn ở đỉnh. Hình 4.2. Hoa Đinh lăng 41
  52. Quả hạch hình bầu dục mang trên đỉnh quả vòi nhụy tồn tại mọc chìa ra và đài tồn tại, vỏ quả màu xanh đậm có những nốt tròn màu xanh nhạt hơn, dài 4-6 mm, rộng 3-4 mm. Hình 4.3. Quả Đinh lăng Rễ cong queo, mặt cắt ngang màu vàng nhạt. Mặt ngoài màu trắng xám có nhiều vết nhăn dọc, nhiều lỗ vỏ nằm ngang và vết tích của các rễ con. Hình 4.4. Rễ Đinh lăng Nhận xét: Mẫu Đinh lăng được trồng tại Tri Tôn, An Giang về mặt thực vật học tương tự với những miêu tả trong Từ điển cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi, 2004) và Dược điển Việt Nam IV (Dược điển Việt Nam IV, 2009). 42
  53. 4.1.2. Đặc điểm vi phẫu rễ Rễ Vi phẫu tiết diện gần tròn. Các mô gồm: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn. Libe gỗ: Libe 2 nhiều tạo thành chùy libe, tế bào đa giác vách uốn lượn dày mỏng xen kẽ nhau thành tầng. Gỗ 2 chiếm tâm không liên tục; mạch gỗ tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế bào đa giác, vách cellulose. Tia tủy 1 - 4 dãy tế bào hình chữ nhật. Tinh thể calci oxalate hình cầu gai nhiều trong mô mềm vỏ và libe 2 (Hình 4.6). Nhận xét: Vi phẫu rễ Đinh lăng tương tự với những miêu tả trong Dược điển Việt Nam IV, 2009. 43
  54. Toàn rễ Vùng tủy Bần Tinh thể cacli oxalat hình cầu gai Bần Mô mềm vỏ Libe 2 Gỗ 2 Tia tủy Mô mềm tủy Hình 4.5. Vi phẫu rễ Đinh lăng 44
  55. 4.1.3. Đặc điểm bột rễ Đinh lăng Bột rễ Đinh lăng có màu vàng, thể chất tơi thô, không có mùi, có vị ngọt. Hình 4.6. Bột rễ Đinh lăng Soi dưới kính hiển vi tìm thấy các cấu tử như sau: Nhiều hạt tinh bột hình chuông, hình đa giác, nằm riêng lẻ, hạt tinh bột kép 2, 3, 4 hay tụ tập thành khối. Tinh thể calci oxalat hình khối. Nhiều mảnh mạch vạch có khoang rộng, mạch điểm, mạch mạng, lông che chở (Hình 4.8). Nhận xét: Kết quả soi bột rễ Đinh lăng cho thấy có nhiều cấu tử được tìm thấy tương tự giống trong miêu tả của Dược Điển Việt Nam IV như: Tinh bột, mảng mạch mạng, mạch vạch. Ngoài ra còn tìm thấy các cấu tử khác như: Mạch điểm, tinh thể calci oxalate hình khối, lông che chở mà Dược Điển Việt Nam IV chưa đề cập 45
  56. Lông che chở Mạch vạch Mạch mạng Mạch điểm Tinh thể cacli oxalat Hạt tinh bột hình khối Hình 4.7. Soi bột rễ Đinh Lăng 4.2. THỬ TINH KHIẾT 4.2.1. Độ ẩm Cân khoảng 1,5 g bột dược liệu, xác định độ ẩm bằng cân hồng, thực hiện 3 lần riêng biệt, lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 4.2.2. Xác định độ tro Cân khoảng 1 g bột dược liệu, sấy 1 giờ ở 100 oC đến 105 oC rồi đem nung trong lò nung ở 600 oC 25 oC. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm và cân, thực hiện 3 lần riêng biệt, lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 46
  57. Bảng 4.1.Kết quả thử tinh khiết bột rễ Đinh lăng Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ ẩm (%) 5,2 6,4 7,9 6,5 ± 1,4 Tro toàn phần (%) 0,4 0,7 0,3 0,5 ± 0,2 Nhận xét: - Độ ẩm trung bình của bột rễ Đinh lăng khô là 6,3 % (< 13,0 %) đạt tiêu chuẩn của DĐVN IV. - Độ tro trung bình của bột rễ Đinh lăng là 0,47 % (< 8,0 %) đạt tiêu chuẩn của DĐVN IV. Kết luận: Kết quả thử tinh khiết của bột rễ Đinh lăng khô đạt tiêu chuẩn của DĐVN IV. 4.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 4.3.1. Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn Từ 9 kg rễ Đinh lăng được chiết ngấm kiệt với cồn 96 %, thu được 1,75 kg cao toàn phần. Cao toàn phần được pha loãng với một lượng nước tối thiểu và sau đó lần lượt lắc phân bố với diethyl ether, ethyl acetat, n - butanol. Các dịch diethyl ether, ethyl acetat, n – butanol được cô quay chân không thu hồi dung môi thu được 300 g cao diethyl ether và 30 g cao ethyl acetat, 405 g cao n – butanol và 800 g cao nước. 47
  58. Rễ Đinh lăng (9,3 kg) Chiết ngấm kiệt với cồn 96 % Cô quay Cao toàn phần (1,75 kg) Thêm nước Lắc tuần tự với Et2O, EA và n – butanol Cô quay Cao Et2O Cao EA Cao n-BuOH Cao nước (300 g) (30 g) (405 g) (800 g) Hình 4.8. Sơ đồ chiết và tách phân đoạn từ rễ Đinh lăng Bảng 4.2. Kết quả xác định độ ẩm của các cao phân đoạn Lần 1 (%) Lần 2 (%) Lần 3 (%) Trung bình (%) Cao TP 0, 6 0,4 0,5 0,5 ± 0,1 Cao Et2O 1,0 1,6 1,1 1,2 ± 0,3 Cao EA 0,7 0,5 1,8 1,0 ± 0,7 Cao n-bu 1,2 1,0 1,4 1,2 ± 0,2 Cao nước 0,7 0,8 0,9 0,8 ± 0,1 4.3.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn 4.3.2.1. Sàng lọc HTCO của cao phân đoạn bằng SKLM Tiến hành SKLM theo mục 3.3.3.2 thu được kết quả như hình 4.10. Dung môi khai triển:n-butanol - acid acetic - nước (7:1:2). 48
  59. UV 254 nm UV 365 nm TT. DPPH TT. FeCl3 5% Hình 4.10. Sắc kí đồ các phân đoạn trong khảo sát HTCO Chú thích: TP : Toàn phần. n-BuOH : Cao n- butanol. Et2O : Cao diethyl ether. Nước : Cao nước. EA : Cao ethyl acetat. Vit C : Vitamin C. 49
  60. Nhận xét: Trong các cao phân đoạn và cao toàn phần thì cao ethyl acetat, cao diethyl ether và cao toàn phần có vết làm mất màu tím của thuốc thử DPPH. Trong đó cao ethyl acetat có vết hiện màu vàng sáng trên nền tím của thốc thử DPPH nhất trong các phân đoạn, chứng tỏ trong cao ethyl acetat có chứa các hợp chất có tác dụng chống oxy hóa. Đồng thời, một số thành phần trong cao ethyl acetat hiện màu với thuốc thử FeCl3 5%. 4.3.2.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng quang phổ UV – Vis Để khẳng định chính xác hơn khả năng chống oxy hóa của các cao, tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên gía trị HTCO. Khảo sát 5 cao, ở nồng độ 1000 µg/ml, thu được kết quả như bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả khảo sát HTCO của 5 cao, ở nồng độ 1000 µg /ml OD OD OD OD trung bình HTCO (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0,6080 0,8120 0,8610 0,7603 - Cao TP 0,6630 0,6330 0,6380 0,6447 15,20 Cao Et2O 0,4050 0,3670 0,4670 0,4130 45,68 Cao EA 0,2910 0,2020 0,2410 0,2447 67,82 Cao n-BuOH 0,6180 0,6140 0,5940 0,6087 19,94 Cao nước 0,6450 0,6580 0,649 0,6507 14,42 Nhận xét : Cao EA có HTCO = 67,82 %, cao nhất trong các cao. Cao EA và vitamin C được tiến hành xây dựng đường chuẩn và tính IC50 ở 5 nồng độ khác nhau thu kết quả như bảng 4.4, bảng 4.5, hình 4.11, hình 4.12. Bảng 4.4. Kết quả đo OD của cao EA ở 5 nồng độ Nồng độ OD OD OD OD trung bình HTCO (%) (µg/ml) Lần1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0,6080 0,8120 0,8610 0,7603 - 1000 0,2910 0.2020 0,2410 0,2447 67,82 900 0,3810 0,3660 0,3230 0,3567 53,08 800 0,3890 0,3713 0,3560 0,3721 51.06 400 0,5440 0,4980 0,5100 0,5173 31,96 200 0,6070 0,5920 0,6100 0,6030 20,69 50
  61. Hình 4.11. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ cao EA Bảng 4.5. Kết quả đo OD của Vitamin C ở 5 nồng độ Nồng độ OD OD OD OD trung bình HTCO (%) (µg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0,8620 0,9260 0,9220 0,9033 - 25 0,1560 0,1810 0,1620 0,1663 81,59 20 0,3270 0,3230 0,3240 0,3247 64,05 15 0,4350 0,3780 0,3990 0,4043 55,24 10 0,5670 0,5570 0,5560 0,5600 38,01 5 0,6520 0,6770 0,6210 0,6500 28,04 51
  62. Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ của vitamin C Từ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ của vitamin C, ta có phương trình tuyến tính hoạt tính dạng y = ax + b. Thay y = 50 ta được kết quả IC50 như bảng 4.6 và hình 4.13. Bảng 4.6. Kết quả xác định giá trị IC50 của cao EA và vitamin C Mẫu Phương trình hồi quy IC50 (µg/ml) Vitamin C y = 2,662x + 13,44 13,73 Cao EA y = 0,053x + 9,797 758,55 52
  63. Hình 4.13. Biểu đồ so sánh khả năng chống oxy hóa của cao EA với vitamin C Nhận xét : Giá trị IC50 của cao EA là 758,55 µm/ml, của vitamin C là 13,73 µm/ml so với nồng độ mẹ ban đầu là 1000 µg/ml. từ đó thấy rằng mặc dù cao EA có hoạt tính chống oxy hóa nhất trong các cao phân đoạn còn lại nhưng so với vitamin C thì IC50 của phân đoạn EA còn cao hơn nhiều, chứng tỏ phân đoạn EA có đáp ứng chống oxy hóa còn thấp. 4.3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trên cao ethyl acetat Cân 1 g cao ethyl acetat, hòa tan trong cồn, tiến hành định tính sơ bộ thành phần hóa học nhằm xác định các nhóm hợp chất có trong cao ethyl acetat. Bảng 4.7. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cao ethyl acetat Thành phần Phản ứng định tính Kết quả Chất béo Làm mờ giấy lọc ++ Carotennoid Phản ứng Carr – Price - H2SO4 - Tinh dầu Có mùi thơm ± Triterpenoid tự do Libermann – Burchard + Alkaloid TT alkaloid ++ Coumarin Phát quang trong kiềm - 53
  64. Antraglycosid KOH 10 % ++++ Flavonoid Mg / HCl đđ +++ Glycosid tim TT vòng lacton + TT đường 2 – desoxy + Anthocyanoid HCl / KOH ++ Proanthocyanidin HCl / to +++ Tanin Gelatin muối / FeCl 5 % + Triterpenoid thủy Libermann – Burchard + phân Saponin Libermann – Burchard + Lắc mạnh dung dịch nước ++++ Acid hữu cơ Na2CO3 ++ Chất khử TT Fehling ++++ Chú ý: (-) không có; (±) không rõ; (+) có ít; (+++) có nhiều; (++++) có rất nhiều. Nhận xét: Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy trong cao ethyl acetat của rễ Đinh lăng có chứa các hợp chất như: Chất béo, alkaloid, triterpenoid tự do, flavonoid, anthocyanosid, proanthocyanidin, polyphenol, tanin, saponin, acid hữu cơ, chất khử. 4.3.4. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat Thăm dò hệ dung môi cho SKC Tiến hành SKLM cao EA với các hệ dung môi: S1= PE - EA (3:7) S2= n-Hex – EA (1:1) S3= EA bão hòa nước S4= CHCl3 – MeOH (8:2) Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm; phun TT VS sấy ở 105 oC đến khi hiện màu, quan sát dưới ánh sáng thường. 54
  65. S1 S2 S3 S4 UV 254 nm UV 365 nm TT VS Hình 4.14. Sắc kí đồ thăm dò hệ dung môi cho cao EA 55
  66. Nhận xét: Từ 4 hệ dung môi thăm dò thì hê dung môi S2 = n-Hex – EA (1:1) cho kết quả tách tốt nhất, vết gọn và Rf thích hợp, đo đó S2 được chọn làm hệ dung môi phát hiện vết trên SKLM và đồng thời cũng là pha động cho SKC (với tỉ lệ thay đổi dần). Tiến hành SKC Cao EA (m= 10 g) được SKC cổ điển với điều kiện: - Cột thủy tinh: Cột 5,5 x 50 cm, được rửa sạch sấy khô. - Nhồi cột: 270 g Silica gel (cỡ hạt 37 – 63 μm) được nhồi cột ở dạng sệt (với dung môi n - hexan). - Mẫu: Mẫu cao EA = 10 g được hòa tan với 500 ml methanol và trộn với 100 g silica gel (cỡ hạt 37 – 63μm), hỗn hợp này cô quay chân không ở nhiệt độ 50 oC tới khi thu được bột tơi mịn màu vàng và được nạp khô vào cột. - Pha động: Hệ n-Hex – EA (1:0) đến (80:20). - Thể tích hứng: 100 ml. - Theo dõi thành phần các phân đoạn bằng SKLM, dung môi khai triển n-Hex - EA (1:1), phát hiện bằng UV 254 nm và 365 nm, thuốc thử VS. - Gộp phân đoạn: Gộp các phân đoạn chứa các vết có độ phân cực tương tự nhau. Kết quả các phân đoạn được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả SKC trên cao EA (10 g) Phân đoạn Dung môi ly giải Trọng lượng cao (g) I n- Hex (100:0) 1,5311 II n-Hex – EA (95:5) 1,2835 III n-Hex– EA (90:10) 0,5612 IV n-Hex – EA (90:10) 0,6824 V n-Hex – EA (80:20) 0,1889 Ghi chú: Tiếp tục phân lập để thu các phân đoạn tiếp theo. 56
  67. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Sau 6 tháng thực hiện đề tài, khóa luận này đạt được một số kết quả như sau: - Đã tiến hành khảo sát hình thái cây Đinh lăng và vi học của rễ Đinh lăng. - Đã tiến hành khảo sát về độ ẩm và độ tro của bột rễ Đinh lăng. - Từ 9,3 kg bột rễ Đinh lăng thu được 300 g cao diethyl ether, 30 g cao ethyl acetat, 405 g cao n - butanol và 800 cao nước. - Từ 30 g cao ethyl acetat , phân lập SKC tạm thời thu đươc 5 phân đoạn. - Tiến hành khảo sát hoạt tính oxy hóa các cao phân đoạn của rễ Đinh lăng, kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong các phân đoạn. - Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong cao ethyl acetat từ rễ Đinh lăng, kết quả cho thấy trong cao ethyl acetat có chứa: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử. 5.2. KIẾN NGHỊ Do điều kiện thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế, khóa luận này chỉ đạt được một phần kết quả khiêm tốn. Kết quả này chỉ là một bước phục vụ nhỏ cho việc định hướng nghiên cứu về các thành phần hóa học trong cây Đinh lăng sau này. Sau khi kết thúc khóa luận này, chúng em xin kiến nghị: - Tiếp tục phân lập thành phần hóa học của cao ethyl acetat từ rễ Đinh lăng để thu được hợp chất tinh khiết. Và tái đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các chất tinh khiết phân lập được sau này. - Phân lập thành phần hóa học của các phân đoạn còn lại. - Tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học khác (độc tính tế bào, kháng vi khuẩn và nấm, kháng khối u ) của cây Đinh lăng. 57
  68. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt và tiếng nước ngoài: [1]. Benzie I.F.F. and Strain J.J. (1999), "Ferric reducing antioxidant power assay: direct measurement of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration", Methods in Enzymology, 299, pp. 15–27. [2]. Bernard B.M., Pakianathan N., Divakar M.C. (1998 ), "On the antipyretic, anti- inflammatory, analgesic, and molluscicidal properties of Polyscias fruticosa (L.) Harms" Ancient Science of Life, Vol. No 17(4), pp. 313 - 319. [3]. Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2010). Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr. 2-5, 26-42, 118-125. [4]. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nxb Y học Hà Nội, tr. 764-765, PL- 9.6, PL-9.8, PL-12.10. [5]. Brophy J.J, Lassak E.V, Suksamrarn A (1990), "Constituent of Volatile leaf oils of Polyscias fruticosa L. Hams", Flavour Fragrance J, vole 5, pp. 179-182. [6]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đõ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn. (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc, tập I, NXB. Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. [7]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. [8]. Favier A. (2003). Le stress oxydant: Intéréte conceptuel et expérimental dans la compréhension des mécanismes des maladies et potentiel thérapeutique. L’actualité chimique, novembre – décembre 2003.pp. 108 – 115. [9]. Hồ Lương Nhật Vinh (2014). Nghiên cứu thành phần hóa học. tác dụng ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms). Luận văn thạc sĩ dược học ngành Dược học cổ truyền. Khoa Dược. Trường Đại học Dược Hà Nội. [10]. Lutomski J., Luan T. C. and Hoa T. T. (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family", Herba Polonica, vole 38(1), pp. 3-11. [11]. Masoko P. and Eloff J.N. (2007), "Screening of twenty - four south african Combretum andsix Terminalua species (Combretaceae) for antioxidant activities", Afr. J. Trad. CAM 4 (2), pp. 231-239. [12]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập các hợp chất tự nhiên. NXB ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. [13]. Nguyễn Ngọc Dung (1998), Nhân giống cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. 58
  69. Hams thông qua con đường tạo phôi soma trong nuôi cấy in-vitro, NXB. Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. [14]. Nguyễn Ngọc Hồng (2009), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan, Luận án Tiến sĩ, Trường đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. [15]. Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Nguyen The Duy, Nguyen Thi Kim Chanh, Nguyen Kim Phi Phung and Poul Erick Hansen (2011), "Chemical constituents from leaves of Sonneratia alba J. E.Smith(Sonneratiaceae)", Tập chí phát triển khoa học và nghiên cứu, 14 (6), pp. 11-17. [16]. Nguyễn Thị Luyến, Nguyễn Duy Công và cs. (2012), "Hợp chất flavonoid glycoside có tác dụng ức chếalpha-amylase phân lập từlá Đinh lăng", Tạp chí Dược liệu, tập 17, số6, tr. 348-351. [17]. Nguyễn Thị Nguyệt (1992), "Một số kết quả nghiên cứu về saponin trong Đinh lăng", Tạp chí dược học, số3, tr.15-16. [18]. Nguyễn ThịThu Hương, Lương Kim Bích (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng", Tạp chí dược liệu, tập 6, tr. 84-86. [19]. Nguyễn Thời Nhâm, Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích (1990), "Tác dụng dược lý của cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harm, Araliaceae, "Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Viện Dược liệu". [20]. Nguyễn Thượng Dong, Đoàn Thị Nhu, Phạm Duy Mai, Nguyễn Thị Thu Hương (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo.Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.tr. 279 – 292. [21]. Nguyễn Trần Châu, Đỗ Mai Anh (2008), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol của cao toàn phần chiết xuất từ lá Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms, Nghiên cứu khoa học cấp cơ sở Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. [22]. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 957- 962. [23]. Proctor P. H. (1989). Free radicals and human disease.CRC handbook of free radicals and antioxidants.1. p. 209 – 221. [24]. Proliac J., Chaboud A., Rougny A. (1996), "A oleanolic saponin from Polyscias fruticosa Harms var yellow leaves", Pharmazie, vole 51(8), pp. 611-612. [25]. Quách Tuấn Vinh (2005), Dùng cây thuốc, NXB Y học. [26]. Trương Thị Đẹp (2007). Thực vật học. Nxb Giáo Dục Hà Nội, tr. 260-262. [27]. Trương Thị Đẹp (2011). Thực vật dược. Bộ môn Thực vật, khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Tr.265. 59
  70. [28]. Varadharajan R., Rajalingam D. (2011), " Diiuretic activity of Polyscias fruticosa (L.) Harm", International Journal of Innovative Drug Discovery, Vol 1 (1),pp. 15-18. [29]. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 279-293 [30]. Võ Hà (2008), Chữa bệnh không dùng thuốc, NXB Phương Hiền. [31]. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam,tập 1, NXB. Y học. [32]. Võ Văn Chi (2004). Từ điển thực vật thông dụng. Tập 1. Nxb khoa học kỹ thuật. [33]. Võ Xuân Minh, Phạm Hữu Dương, Lê Thanh Hà (1991), "Góp phần tìm hiểu về thành phần hóa học và dạng bào chế của cây Đinh lăng", Tạp chí dược học, số3, tr.19-21. [34]. Vo D.H., Yamamura, S., Ohtani, K., Kasai, R., Yamasaki, K., Nham, N.T. , Chau, H.M., 1998. Oleane saponins from Polyscias fruticosa L. Harms. Phytochemistry 47, p. 451-457 [35]. Wang J., Yuan X., Jin Z., Tian Y. and Song H. (2007), "Free radical and reactive oxygen species scavenging activities of peanut skins extract", Food Chemistry, 104, pp. 242-250. [36]. Wang J., Yue Y.D., Tang F. and Sun J. (2012), "TLC screening for antioxidant activity of extracts from fifteen bamboo species and identification of antioxidant flavone glycosides from leaves of Bambusa. textilis McClure", Molecules,17, pp. 12297-12311. [37]. Wojdylo A., Oszmianski J. and Czemerys R. (2007), "Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs", Food Chemistry, 105, pp. 940–949. Trang Web: [38]. Rượu Đinh lăng quà tặng ngày xuân, Công ty TNHH nông nghiệp Thiên Đường,. cua-nguoi-viet-qua-tang-ngay-xuan-tim-dai-ly-phan-phoi-cap-huyen-489.html. Ngày truy cập 01/6/2017. [39]. Thuốc bổ não từ dược liệu, Báo mới,. duoc-lieu-quy-dinh-lang/c/14432591.epi. Ngày truy cập 01/6/2017. [40]. Trà Đinh lăng, Công ty TNHH MTV GacViet. pham/tra-dinh-lang-614.html. Ngày truy cập 01/6/2017. [41]. Viên uống giảm cân, Học viện quân y. vien-uong-giam-can-hoc-vien-quan-y.htm. Ngày truy cập 01/6/2017. 60
  71. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG Độc lập – Tự do – Hạnh phúc GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA LUẬN VĂN THEO Ý KIẾN ĐÓNG GÓP CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM KHÓA LUẬN Họ tên sinh viên: ĐẶNG KIM THOA Tên đề tài luận văn: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG. Chuyên ngành: Dược học. MSSV: 12D720401167 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Công Luận, ThS. Đỗ Văn Mãi Khóa luận đã được bổ sung và sửa chữa các điểm sau: Lược bỏ một số nội dung trong phần trồng trọt cây Đinh lăng và mục 2.3. Một số phương pháp chiết xuất và phân lập. Hoàn thiện cách tính IC50 của cao ethyl acetat trong khảo sát hoạt tính chống oxy hóa. Thống nhất vị trí phân loại Họ thực vật. Sửa một số lỗi chính tả và giãn dòng. TP. Cần Thơ, ngày tháng 7 năm 2017 Giảng viên hướng dẫn 1 Giảng viên hướng dẫn 2 Họ tên sinh viên Thư ký hội đồng Chủ tịch Hội đồng