›

Khóa luận Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 3201
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_khao_sat_co_che_chong_ngung_tap_tieu_cau_voi_chat.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A. Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A. Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Vũ Thị Thơm 2. TS. Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội – 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Khi nhận được đề tài khóa luận này, tôi cảm thấy bản thân rất may mắn khi được học tập và nghiên cứu về lĩnh vực mà tôi yêu thích. Tôi không chỉ học hỏi thêm được nhiều kiến thức mà còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin gửi cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở cùng các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và TS. Nguyễn Thị Vân Anh. Các cô là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Không chỉ truyền đạt kiến thức khoa học cùng những kinh nghiệm quý báu của mình, các cô còn truyền cho tôi lòng yêu nghề, nhiệt huyết và tận tâm với công việc. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Hồng Luyến và nhóm sinh viên đến từ Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ và nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, khuyến khích, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận. Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Lương Phú Hưng
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A Phần trên mặt đất (Aerial) AC Adenylyl cyclase ADP Adenosine diphosphate APTT Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activated partial thromboplastin time) Arg-Gly-Asp Arginylglycylaspartic acid ATP Adenosine triphosphate AUC Mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation Curve) Ca++ Ion Canxi CalDAG-GEFI Yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1 cAMP Cyclic adenosine monophosphate COX-1 Cyclooxygenase 1 CW Canna warszewiczii A. Dietr DCM Dichloromethane DEA Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation) DMSO Dimethyl sulfoxide EA Ethyl acetate FPA Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final Platelet Aggregation) GDP Guanine diphosphate GP Glycoprotein GTP Guanine triphosphate G-actin Monomer actin IP3 Inositol (1,4,5) trisphosphate K+ Ion Kali LTA Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry) Mg++ Ion Magie
  5. MPA Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximal Platelet Aggregation) nH n-Hexan NTTC Ngưng tập tiểu cầu PAR Thụ thể hoạt hóa bởi protease (Protease – activated receptor) PC Phosphatidylcholine PE Phosphatidylethanolamine PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PI 3-K Phosphoinositide 3-kinase PKB/Akt Serine-threonine protein kinase B/Akt PLC Phospholipase C PLCγ Phospholipase Cγ PPADS Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet-poor plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet-rich plasma) PS Phosphatidylserine PT Thời gian prothrombin (Prothrombin time) R Phần thân rễ (Rhizome) Slope Tốc độ ngưng tập tiểu cầu TXA2 Thromboxane A2 t-SNARE Protein liên kết màng bào tương UDP Uridine diphosphate UTP Uridine triphosphate vWF Yếu tố von Willebrand v-SNARE Protein liên kết màng hạt tiểu cầu
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm của một số GP chính 4 Bảng 1.2 Thành phần của hạt α 6 Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu 26 Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29 Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30 Bảng 3.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 32 Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm 32 Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA) 33 Bảng 3.6 Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết 39
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3 Hình 1.2 Giai đoạn bám dính 8 Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu 9 Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng 13 Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa 14 Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16 Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các 17 thuốc kháng tiểu cầu Hình 2.1 Mẫu cây Dong riềng đỏ C. warszewiczii A. Dietr 22 Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C. warszewiczii 23 A. Dietr Hình 2.3 Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP 5 M 25 Hình 3.1 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình Slope của các 30 nhóm Hình 3.2 So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình MPA của các 31 nhóm Hình 3.3 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của các nhóm 34
  8. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Sinh lý học tiểu cầu 3 1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu 3 1.1.2. Chức năng tiểu cầu 7 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu 7 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương 10 1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP 10 1.2.1. Thụ thể purinergic 10 1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP 12 1.2.2.1. Pha ngưng tập nguyên phát 12 1.2.2.2. Pha ngưng tập thứ phát 15 1.3. Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu 16 1.3.1. Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) 17 1.3.2. Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 18 1.3.3. Nhóm ức chế thụ thể của thrombin 18 1.3.4. Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa 19 1.3.5. Nhóm ức chế phosphodiesterase 19 1.4. Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr 19 1.4.1. Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng 19 1.4.2. Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A. Dietr 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu 22
  9. 2.1.1. Đối tượng 22 2.1.2. Thu thập mẫu máu 23 2.1.3. Dụng cụ nghiên cứu 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất 24 2.2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm 24 2.2.3. Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu 24 2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu 27 2.2.5. Đạo đức nghiên cứu 28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1. Kết quả 29 3.1.1. Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29 3.1.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30 3.1.3. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 31 3.1.4. Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) 33 3.1.5. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33 3.2. Bàn luận 35 3.2.1. Thiết kế nghiên cứu 35 3.2.2. Kết quả nghiên cứu 35 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu 40 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý về tim mạch hiện đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Phần lớn trong số đó có liên quan đến các cơn đau tim và đột quỵ. Đây là những triệu chứng cấp tính gây ra bởi sự tắc nghẽn lưu thông máu đến tim hoặc não bộ mà tác nhân chính là sự xuất hiện của huyết khối [32, 48]. Những nghiên cứu về sinh lý học đã chứng minh vai trò quan trọng của tiểu cầu trong hình thành cục máu đông. Nằm trong chuỗi các biến đổi xảy ra kể từ khi tiểu cầu được hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, sự kết tập của các tiểu cầu tạo thành đám tiểu cầu, được xem là tiền đề để hình thành huyết khối. Để ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiều thuốc kháng tiểu cầu đã được nghiên cứu và ra đời. Bên cạnh những lợi ích mang lại trong điều trị, các thuốc kháng tiểu cầu cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như làm tăng nguy cơ chảy máu hay loét dạ dày. Do đó, xu hướng nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâm với mong muốn phát triển các thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt hơn và quan trọng là gây ít tác dụng không mong muốn hơn đối với người sử dụng. Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vô cùng phong phú. Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh của người dân cũng rất dồi dào. Điều này giúp cho Việt Nam có một nguồn tài nguyên cây thuốc quý giá. Theo kinh nghiệm dân gian của một số địa phương, cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr đã được sử dụng để điều trị một số triệu chứng trong bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, cơn đau tim [6, 35]. Theo đó, một vài nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết của Canna warszewiczii A. Dietr. Tổng hợp kết quả các nghiên cứu cho thấy các phân đoạn dịch chiết ethyl acetate, dichloromethane, n-hexan đều có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi các chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31]. Do đó, đề tài “Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr” được thực hiện với mục tiêu: 1
  11. Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr với chất kích tập ADP và chất ức chế nhóm thụ thể P2 là PPADS. 2
  12. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Sinh lý học tiểu cầu Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, hình đĩa, không có nhân, đường kính trung bình 2 đến 5 m, dày 0,5 m [2, 20]. Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi ở người khỏe mạnh khoảng 150 – 400 x 109/L [5, 47]. Trong quá trình tạo máu, tiểu cầu được tách ra từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo ra 3000 tiểu cầu [5, 7]. Đời sống của tiểu cầu ngắn, trung bình khoảng 10 ngày, bị tiêu hủy bởi đại thực bào ở gan và lách [2, 47]. 1.1.1. Cấu trúc tiểu cầu Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng. Hình 1.1. Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51] Khu ngoại vi 3
  13. Khu ngoại vi gồm lớp áo ngoài glycocalyx, màng bào tương và vùng dưới màng. Glycocalyx được cấu thành từ rất nhiều loại glycoprotein (GP). Các GP này hoạt động như các receptor bề mặt, có vai trò vô cùng quan trọng trong sự bám dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu [20, 51]. Bảng 1.1. Đặc điểm của một số GP chính [51] Glycoprotein Cấu trúc Chất liên kết GPIIb/IIIa Integrin αIIbβ3 Fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin và thrombospondin GPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen GPIb/IX/V Thụ thể nhiều đoạn acid vWF amin giàu leucine lặp lại GPVI Thụ thể thuộc siêu họ Collagen globulin miễn dịch Màng bào tương là màng lipid kép với thành phần chính là các phospholipid như phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS) cùng với một lượng đáng kể sphingolipid, sphingomyelin và cholesterol. Các phospholipid này phân bố không đều. PC cấu trúc nên lớp ngoài; ngược lại, PE và PS cấu trúc nên lớp trong của màng. Sự phân bố này được kiểm soát bởi các enzyme phụ thuộc ATP là flipase và flopase [47]. Nằm ngay dưới màng bào tương, vùng dưới màng là nơi vùng nội bào của các thụ thể xuyên màng tương tác với các protein phụ trách quá trình truyền tin trong tiểu cầu. Vùng dưới màng còn có một cấu trúc đặc biệt dính vào màng bào tương giúp ổn định hình dạng bình thường của tiểu cầu, gọi là hệ khung màng spectrin. Hệ thống này là một chuỗi polymer xoắn được tạo ra bởi từ các tiểu đơn vị α và  của spectrin. Cấu trúc này tồn tại những vị trí gắn với các protein giúp liên kết hệ thống màng spectrin với hệ thống các vi sợi, tạo nên một mạng lưới liên tục [47]. 4
  14. Khu sol – gel Thành phần chính của khu sol – gel là hệ thống vi ống và hệ thống vi sợi. Hai hệ thống này cùng với hệ thống màng spectrin cấu thành hệ khung nâng đỡ tiểu cầu. Hệ thống vi ống nằm ngay dưới hệ thống màng spectrin, là tập hợp của 3 – 24 vi ống, bao quanh chu vi tiểu cầu, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểu cầu. Mỗi vi ống được tạo nên từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, hình thành những ống rỗng, cứng, đường kính mỗi ống khoảng 25 nm. Chức năng của hệ thống vi ống là duy trì kích thước, hình dạng bình thường của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích [5, 47]. Các vi sợi là các chuỗi polymer được hình thành từ các monomer actin (G- actin). Đây là những sợi mỏng, dẻo, có ái lực với ATP khác nhau ở mỗi đầu. 98% đầu có ái lực cao với ATP gắn với các protein CapZ và adducin, trong khi phần lớn đầu có ái lực thấp với ATP gắn với phức hợp Arp2/3. Trong khi CapZ ức chế phản ứng trùng ngưng, Arp2/3 có thể kéo dài sợi acin và bảo vệ sợi khỏi sự khử trùng ngưng (depolymerization). Hệ thống vi sợi được hình thành chủ yếu nhờ filamin và α-actinin. Filamin là protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào tương tác với phần nội bào của GPIb và các -integrin, hai đầu còn lại gắn với hai sợi actin. α-actinin giữ các vi sợi gần nhau hơn [47]. Hệ thống vi sợi trong tế bào chất, giữ các bào quan cách xa nhau và tham gia tạo chân giả của tiểu cầu [5, 20]. Khi bị kích thích, hệ thống vi sợi trong tế bào chất làm co hệ thống vi ống lại, đẩy các hạt α và các hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu. Các hạt này giải phóng các chất ra bên ngoài qua hệ thống các kênh mở. Ngoài ra, khu sol – gel còn bao gồm một lượng lớn glycogen và một vài túi trơn hoặc được bọc clathrin [20]. Khu bào quan Khu bào quan chứa hệ thống các hạt đặc hiệu và các thành phần tế bào như lysosome, ty thể, bộ máy Golgi Các bào quan này thực hiện các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu, dự trữ enzyme và một lượng lớn cơ chất cần thiết cho hoạt động của tiểu cầu [51]. 5
  15. Hệ thống hạt đặc hiệu được chia thành 3 nhóm: hạt α, hạt đặc và túi lysosome [7]. Có mặt ít nhất trong tiểu cầu là túi lysosome (< 3 hạt/tiểu cầu). Thành phần trong túi lysosome là các enzyme phân giải protein (cathepsins, elastase, collagenase, carboxypeptidase); enzyme phân giải carbohydrate (glucosidase, galactosidase, mannosidase) và enzyme cắt cầu ester (acid phosphatase). Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm. Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca++, Mg++, K+); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate. Các chất này tham gia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm. Trong các loại hạt, hạt α có số lượng nhiều nhất với 50 đến 80 hạt/tiểu cầu, kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm và cũng đa dạng nhất về thành phần chứa trong hạt. Thành phần của hạt α được trình bày ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Thành phần của hạt α [20] Nhóm chất Thành phần Protein kết hợp màng αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin Chất tham gia quá trình Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein đông máu S, plasminogen, α2-macroglobulin Protein dính Fibrinogen, vWF, thrombospondin Hóa chất CXCL1, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CCL2 Yếu tố tăng trưởng Yếu tố tăng trưởng biểu bì, yếu tố tăng trưởng tế bào gan Chất ức chế Angiostatin, endostatin Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG Protein vi sinh Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2 Khu màng 6
  16. Khu màng chứa hệ thống các ống dày đặc và hệ thống các kênh mở. Hệ thống các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, là nơi dự trữ Ca++, tổng hợp prostaglandin và chứa nhiều enzyme cyclooxygenase tham gia vào con đường chuyển hóa prostaglandin [5, 51]. Hệ thống các kênh mở là các ống mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu. Các hạt tiểu cầu giải phóng các chất cũng như các chất ngoại bào có thể thâm nhập vào tổ chức bên trong tiểu cầu qua hệ thống kênh này (như sự hấp thu fibrinogen vào hạt α) [5, 43, 47]. 1.1.2. Chức năng tiểu cầu Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng thái nghỉ. Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trải qua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục. Nhìn chung, quá trình này gồm các bước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập. 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu Giai đoạn bám dính ban đầu Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phã vỡ, một số protein ở tổ chức dưới nội mô được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu, bao gồm: yếu tố von Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 [7, 40]. Trong đó, collagen và vWF có vai trò quan trọng nhất. vWF bám vào collagen, dãn thẳng và bộc lộ nhiều vị trí liên kết (vùng A1) với phức hợp glycoprotein (GP) Ib/IX/V trên màng tiểu cầu. Dưới tốc độ dòng máu cao, sự bám dính của tiểu cầu phụ thuộc chủ yếu vào liên kết giữa GPIb và vWF. Liên kết này được hình thành nhanh và chịu áp lực đẩy của dòng máu nhưng tồn tại không lâu. Tuy nhiên, nó lại quan trọng do giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặt bám dính, tạo điều kiện để collagen liên kết với GPVI và tương tác này lại hoạt hóa GPIa/IIa gắn với collagen [1, 32, 40]. 7
  17. Hình 1.2. Giai đoạn bám dính [40] Sự phối hợp giữa những tín hiệu sinh ra bởi các tương tác vWF – GPIb, collagen – GPVI, collagen – GPIa/IIa thúc đẩy một chuỗi các biến đổi phức tạp bên trong tiểu cầu dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và tạo ra inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) từ sự thủy phân màng phospholipid. IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các ống dày đặc để huy động Ca++ từ kho dự trữ này. Nồng độ Ca++ nội bào tăng kích hoạt một loạt các biến đổi quan trọng của tiểu cầu có ý nghĩa trong giai đoạn ngưng tập sau đó như thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành hình cầu gai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt và tổng hợp TXA2. 8
  18. GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40]. Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu Hình 1.3. Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40] Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là hiện tượng các tiểu cầu liên kết với nhau để tạo thành nút tiểu cầu và là giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu. Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao, kích hoạt tiểu cầu biến đổi từ hình đĩa thành hình cầu gai. Đây được cho tín hiệu đầu tiên của sự NTTC [44]. GPIIb/IIIa bộc lộ trên bề mặt tiểu cầu và được hoạt hóa từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái lực cao, liên kết được với các protein hòa tan trong huyết tương như vWF, fibronectin, fibrinogen [32]. Đồng thời, sự giải phóng chất từ hệ thống các hạt đặc hiệu thông qua hệ thống các kênh mở cũng diễn ra. Các chất chủ vận được giải phóng hay hình thành trong quá trình bám dính như ADP, thrombin, TXA2 gắn với thụ thể của chúng trên màng tiểu cầu, hoạt hóa tiểu cầu theo những cơ chế 9
  19. khác nhau. Các tiểu cầu này cũng trải qua một loạt biến đổi như thay đổi hình dạng, giải phóng chất từ các hạt và ngưng tập với nhau thông qua liên kết GPIIb/IIIa – fibrinogen – GPIIb/IIIa, GPIIb/IIIa – vWF, GPIb – vWF. Cứ như vậy, quá trình hoạt hóa và ngưng tập diễn ra làm bền nút tiểu cầu và chuẩn bị cho giai đoạn tạo cục máu đông [40]. 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Quá trình đông máu là một chuỗi phản ứng hoạt hóa các yếu tố đông máu hay còn gọi là dòng thác đông máu và kết quả cuối cùng là hình thành cục máu đông từ mạng lưới fibrin. Trong đó, có hai con đường khởi động quá trình đông máu. Con đường đông máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổn thương, trong khi con đường đông máu nội sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ [2]. Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cả hai con đường này. Màng tiểu cầu có chứa các phospholipid tích điện âm, phosphatidylserine (PS) và phosphatidylethanolamin (PE). Các aminophospholipid này chỉ được bộ lộ ra khi hoạt hóa tiểu cầu. Nhờ đó, các yếu tố đông máu gắn có hồi phục với màng tiểu cầu. Phức hợp TF-VIIa có thể hoạt hóa yếu tố IX và X một cách hiệu quả. Yếu tố XII tự động hoạt hóa trên bề mặt tích điện âm, khởi động con đường đông máu nội sinh theo nguyên lý khuếch tán diễn tiến cùng với prekallikrein và kinninogen trọng lượng phân tử cao [7, 45]. Tiểu cầu hoạt hóa còn giải phóng hàng loạt chất tham gia quá trình đông máu như yếu tố V, IX, XIII, fibrinogen. 1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP ADP là phân tử trọng lượng thấp gây NTTC được biết đến đầu tiên. Tuy là một chất chủ vận yếu, ADP đóng vai trò quan trọng trong chức năng tiểu cầu bởi vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu với các chất chủ vận khác [34]. Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã chống đông bằng citrate, ADP gây NTTC thông qua tương tác các thụ thể purinergic của nó. 1.2.1. Thụ thể purinergic 10
  20. Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm 1972 để chỉ những thụ thể của các nucleotide trên màng tế bào. Ban đầu, các thụ thể purinergic được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận. Tuy nhiên, hệ thống sắp xếp đã được thay đổi dựa trên không chỉ những thông tin dược lý mà còn cả những thông tin hóa sinh [38]. Theo đó, các thụ thể được phân loại thành hai nhóm lớn: P1, các thụ thể được hoạt hóa bởi adenosine và P2, các thụ thể được hoạt hóa bởi purine và pyrimidine nucleotide (ATP, ADP, UTP và UDP) [41]. Nhóm P1 là các thụ thể bắt cặp protein G, bao gồm bốn thụ thể A1, A2A, A2B và A3. Các thụ thể A1 và A3 bắt cặp với protein Gi/o, ức chế adenylyl cyclase (AC), trong khi thụ thể A2A và A2B bắt cặp với protein Gs, hoạt hóa AC, dẫn đến sự tổng hợp cAMP. Ngoài ra, thụ thể A2B cũng bắt cặp với protein Gq, chịu trách nhiệm cho sự hoạt hóa phospholipase C và huy động Ca++ [29, 33]. Dựa vào cấu trúc phân tử, nhóm thụ thể P2 tiếp tục được chia thành hai phân nhóm: P2X, các kênh ion hoạt hóa bởi phối tử và P2Y, các thụ thể bắt cặp với protein G. Hầu hết các thụ thể P2Y đều có cơ chế truyền tín hiệu chung là hoạt hóa phospholipase C (PLC) và/hoặc kiểm soát hoạt động của AC. Các thụ thể P2X là các kênh ion điều hòa sự vận chuyển Na+, K+ và Ca++ dẫn đến sự khử cực tế bào và hoạt hóa các enzyme nội bào [9]. Bốn thụ thể purinergic xuất hiện trên màng tiểu cầu là P2X1, P2Y1, P2Y12 và A2A. P2X1 được hoạt hóa bởi ATP, trong khi P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể của ADP [33]. P2Y1 là thụ thể được tìm ra trước và mỗi tiểu cầu chỉ có khoảng 150 thụ thể này. P2Y1 là thụ thể bắt cặp với protein Gq. Hoạt hóa thụ thể này bởi ADP ++ dẫn đến kết quả là nồng độ Ca nội bào tăng cao. Do đó, P2Y1 điều khiển quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu và khởi động quá trình ngưng tập [9, 17, 27]. P2Y12 là thụ thể có vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu. P2Y12 bắt cặp với protein Gi, khuếch đại và ổn định ngưng tập thông qua tác dụng ức chế AC và tham gia quá trình giải phóng chất từ hạt. Sự phối hợp của hai thụ thể này là cần thiết để quá trình NTTC do ADP diễn ra trọn vẹn [9, 27, 42]. 11
  21. Chất ức chế thụ thể purinergic Nhiều chất ức chế hay đối vận các thụ thể purinergic đã được phát hiện hoặc tổng hợp trong quá trình nghiên cứu cơ chế của các thụ thể này cũng như quá trình phát triển thuốc mới. Nhóm thụ thể của adenosine P1 bị ức chế không chọn lọc bởi caffeine, trong khi các dẫn xuất của xanthine được tổng hợp và tối ưu để ức chế đặc hiệu các thụ thể P1. Phần lớn các chất đối vận nhóm thụ thể P2X đều gắn vào vị trí dị lập thể, không cạnh tranh vào vị trí gắn của ATP. Tác dụng của những chất đối vận này đã và đang được đánh giá lâm sàng. Các chất ức chế thụ thể P2Y đa dạng về cấu trúc, một số cạnh tranh vị trí gắn của các chất chủ vận, một số gắn vào vị trí dị lập thể của thụ thể. Trong đó, thụ thể P2Y12 là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu [33]. Một trong những chất ức chế nhóm thụ thể P2Y được sử dụng nhiều trong nghiên cứu là pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid (PPADS). Ban đầu được mô tả là chất ức chế chọn lọc thụ thể P2X1, tuy nhiên PPADS đã được chứng minh có tác dụng không đặc hiệu nhóm thụ thể P2. Nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12 là 100 M. Ái lực của PPADS với P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30]. 1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP Born là người đầu tiên chỉ ra ADP gây ngưng tập tiểu cầu in vitro vào năm 1962 [8]. Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP gồm hai pha. Pha ngưng tập nguyên phát, có hồi phục, nghĩa là tiểu cầu ngưng tập rồi sau đó giải ngưng tập và pha ngưng tập thứ phát, không hồi phục, liên quan chặt chẽ đến phản ứng giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu [19]. 1.2.2.1. Pha ngưng tập nguyên phát P2Y1 chịu trách nhiệm chính cho sự xuất hiện của pha ngưng tập nguyên phát do đáp ứng làm tăng nồng độ Ca++ nội bào của nó, dẫn đến sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu. Lý do tại sao tiểu cầu phải thay đổi hình dạng trước khi ngưng tập có thể là do hình dạng mới làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa hai tiểu cầu. Nhìn 12
  22. chung, quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu được chia thành hai bước. Đầu tiên, tiểu cầu từ hình đĩa trở thành hình cầu do các sợi actin bị phân mảnh, kéo theo là sự phá hủy của hệ khung màng spectrin. Sau đó, màng tiểu cầu lồi lên, hình thành các chân giả và phần mở rộng (lamellipodia) do sự tổng hợp của các sợi actin mới. Mỗi bước của quá trình thay đổi hình dạng đều có sự tham gia của rất nhiều protein gắn với actin [44]. Hình 1.4. Hiện tượng thay đổi hình dạng [47] ADP gắn vào thụ thể P2Y1, phát ra tín hiệu hoạt hóa phospholipase C (PLC), kéo theo sự tổng hợp phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) và inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3). IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các ống dày đặc và huy động Ca++ từ đây. Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao hoạt hóa gelsolin, cho phép protein này cắt và gắn luôn vào đầu các sợi actin vừa cắt. Cofilin cũng được kích hoạt để giải phóng các G-actin đơn lẻ ra khỏi chuỗi polymer. Những G-actin sau đó này gắn với β-thymosin hoặc profilin. Sự xuất hiện của PIP2 cắt đứt liên kết giữa hệ khung màng spectrin với màng bào tương. Đồng thời, hệ thống vi ống bị mất cân bằng, các vi ống xoắn lại và chuyển động rộng. Điều này làm cho tiểu cầu phồng lên thành hình cầu. Khi nồng độ Ca++ giảm xuống, các 13
  23. protein gelsolin, CapZ, cofilin gắn với PIP2, cùng với hoạt động của Arp2/3 và Formin đã tạo điều kiện để các sợi actin tiếp tục phản ứng trùng ngưng kéo dài chuỗi. Chính sự tổng hợp này đã tạo ra lực đẩy để hình thành chân giả và phần mở rộng. Các vi ống lúc này co lại vào trung tâm tiểu cầu, bị phân mảng và phân bố rải rác. Cuối cùng, các protein gắn trở lại đầu các sợi actin và hình thành hình dạng cuối cùng của tiểu cầu sau khi được hoạt hóa: hình cầu gai với những chân giả dài vài micromet [44, 47]. Song song với quá trình thay đổi hình dạng, nồng độ Ca++ cao cũng hoạt hóa phospholipase A2, khởi đầu một chuỗi phản ứng để cuối cùng hình thành thromboxane A2 (TXA2), một chất kích tập, giúp khuếch đại và củng cố ngưng tập gây ra bởi ADP. Sự phối hợp giữa P2Y1 và P2Y12 là cần thiết để giải phóng TXA2 [25]. Ca++ cũng hoạt hóa yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1 (CalDAG-GEFI) xúc tác chuyển Rap1-GDP thành Rap1-GTP. Quá trình biến đổi ngược lại được xúc tác bởi RASA3 đã bị ức chế do phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) được hoạt hóa bởi tương tác P2Y12 – ADP. Điều này cho thấy sự phối hợp giữa thụ thể P2Y1 và P2Y12 là rất quan trọng để ổn định sự ngưng tập giữa các tiểu cầu [9]. Hình 1.5. Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa [9] 14
  24. RAP1-GTP kích thích talin và kindlin 3 gắn vào miền nội bào của GPIIb/IIIa, hoạt hóa thụ thể này từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái lực cao và liên kết được với fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Nhờ đó, tiểu cầu ngưng tập với nhau thông qua cầu fibrinogen, hình thành sự ngưng tập nguyên phát. Tuy nhiên, sự ngưng tập nguyên phát có thể hồi phục nếu phản ứng giải phóng chất từ các hạt không diễn ra do liên kết giữa các tiểu cầu không được củng cố. 1.2.2.2. Pha ngưng tập thứ phát Ngưng tập thứ phát xảy ra khi có phản ứng giải phóng các chất từ hạt. Phản ứng này giúp bài tiết các thành phần chứa trong hạt α và hạt đặc giúp khuếch đại quá trình ngưng tập và tạo điều kiện cho quá trình hình thành cục máu đông. P2Y12 được chứng minh có vai trò trung tâm trong ngưng tập thứ phát. Điều này được chứng minh ở sự vắng mặt của sóng ngưng tập thứ phát ở những bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt P2Y12 [10, 22]. Một trong những tác động của thụ thể P2Y12 giúp ổn định sự ngưng tập một cách gián tiếp là ức chế adenylyl cyclase (AC), dẫn đến ngăn cản sự thoái hóa của ATP thành cAMP. cAMP làm giảm NTTC bằng cách hoạt hóa protein kinase A (PKA), dẫn đến phosphoryl hóa và ức chế thụ thể của ++ IP3, do đó làm giảm huy động Ca nội bào [29]. Sự hoạt hóa PI 3-K ngoài tham gia vào cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa như đã trình bày ở trên, còn dẫn đến sự phosphoryl hóa serine-threonine protein kinase B/Akt (PKB/Akt). Con đường tín hiệu này đóng vai trò quan trọng trong phản ứng giải phóng chất từ các hạt. Tuy nhiên, cơ chế hoạt hóa các protein tham gia phản ứng giải phóng chưa được làm rõ [9, 14]. Hòa màng là cơ chế chính của phản ứng giải phóng chất từ các hạt. Trong quá trình thay đổi hình dạng, các hạt được kéo vào trung tâm tiểu cầu do chuyển động của hệ thống vi sợi. Các hạt này có thể hòa màng với nhau để tạo thành hạt lớn hơn. Sau đó, các hạt này hòa màng với hệ thống các kênh mở hoặc màng bào tương, giải phóng các chất ra môi trường ngoại bào. Các protein liên kết màng hạt (v-SNARE) và màng bào tương (t-SNARE) có vai trò quan trọng trong quá trình 15
  25. hòa màng và được điều hòa chặt chẽ bởi các protein Sec1/Munc, Rab [20]. Nhìn chung, quá trình giải phóng chất từ các hạt diễn ra theo ba bước chính: gắn màng (docking), chuẩn bị (priming) và hòa màng. Rab27 trên màng hạt đặc (hoặc Rab4 trên màng hạt α) cùng với protein giống syntaptotagmin (SLPs) và Munc13-4 là cần thiết cho sự gắn với màng bào tương. Sự hoạt hóa tiểu cầu dẫn đến sự thay đổi hình dạng của syntaxin, vốn bị cô lập bởi Munc18b ở trạng thái nghỉ. Sau đó, một phức hợp liên kết các SNARE được hình thành trong đó có một v-SNARE (VAMP) và hai t-SNARE (syntaxin và SNAP-23). Sự kết hợp chặt chẽ của các SNARE cung cấp năng lượng cần thiết cho quá trình hòa màng [16, 39]. Hình 1.6. Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu [16] Hạt đặc giải phóng một lượng lớn ADP, ATP, serotonin và các cation. ATP ++ hoạt hóa kênh ion P2X1, làm tăng nồng độ Ca , khuếch đại tín hiệu của thụ thể P2Y1, đóng góp vào sự giải phóng TXA2 và bắt đầu quá trình ngưng tập gây ra bởi ++ TXA2 [23]. Serotonin làm tăng trương lực mạch máu trong khi Ca và polyphosphate giúp hình thành cục máu đông. Hạt α giải phóng fibrinogen và vWF, thúc đẩy hình thành liên kết giữa các tiểu cầu [16, 20]. Nhờ đó, pha ngưng tập thứ phát là không hồi phục và quá trình NTTC in vitro do ADP diễn ra trọn vẹn. 1.3. Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu 16
  26. Hình 1.7. Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu [37] Thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu là những thuốc ức chế hoạt hóa tiểu cầu [5]. Do đó, chúng có vai trò quan trọng trong kiểm soát và ngăn ngừa các bệnh mạch vành và mạch máu não liên quan đến huyết khối [37]. Nhìn chung, hoạt động của tiểu cầu được vận hành bởi ba nhóm chất. Nhóm thứ nhất gồm các chất được tổng hợp bên ngoài tiểu cầu và tương tác với các thụ thể trên màng tiểu cầu: collagen, thrombin. Nhóm thứ hai gồm các chất được tổng hợp bên trong tiểu cầu và tương tác với các thụ thể trên màng: ADP, serotonin, prostaglandin D2. Nhóm thứ ba gồm các chất được tổng hợp và hoạt động bên trong tiểu cầu: cAMP, cGMP. Dựa vào cách phân loại trên, các đích tác dụng của thuốc kháng tiểu cầu được xác định và làm cơ sở để phát triển thuốc mới [26]. 1.3.1. Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) Aspirin được tổng hợp vào cuối thế kỷ 19, ban đầu được sử dụng để giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Đến những năm 1970, tác dụng kháng NTTC của aspirin mới được phát hiện và làm rõ cơ chế. Cho đến nay, aspirin vẫn là thuốc hàng đầu trong điều trị hội chứng mạch vành cấp, giảm 23% nguy cơ tử vong sau 5 tuần sử 17
  27. dụng [32]. Aspirin ức chế không hồi phục COX-1 bằng cách acetyl hóa enzyme này, ngăn cản sự tổng hợp TXA2, một chất gây ngưng tập rất mạnh. Sự ức chế rất mạnh và kéo dài suốt đời sống của tiểu cầu [7, 26]. Liều 75 – 100 mg/ngày là đủ để ức chế hoàn toàn sự tổng hợp TXA2 ở tiểu cầu [18]. Ngoài ra, aspirin còn ức chế tổng hợp prostaglandin I2 (PGI2), có tác dụng chống đông, do ức chế prostacyclin synthetase. Tuy nhiên, sự ức chế này không mạnh bằng tác dụng ức chế COX-1 và cũng không kéo dài [7]. Các thuốc khác thuộc nhóm chống viêm không steroid (NSAID) như mobic, apo – piroxicam cũng có tác dụng chống NTTC với cơ chế tương tự aspirin nhưng tác dụng không dài bởi chúng không acetyl hóa được COX-1 [7, 26]. 1.3.2. Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 Nhóm Thienopyridin gồm ticlodipin, clopidogrel và prasugrel là các tiền thuốc (prodrug), dùng đường uống. Sau khi hấp thu vào cơ thể, chúng chuyển hóa thành các chất có hoạt tính, ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP [37]. Nhóm dẫn chất nucleotide gồm ticagrelor và cangrelor. Ticagrelor dùng đường uống, gắn vào vị trí dị lập thể của P2Y12, không cạnh tranh vị trí gắn của ADP, ức chế chọn lọc có hồi phục P2Y12. Sản phẩm chuyển hóa của ticagrelor cũng có hoạt tính tương đương [18, 37, 46]. Cangrelor dùng đường tiêm tĩnh mạch, thời gian bán hủy của thuốc rất ngắn (3 – 6 phút), thời gian bắt đầu cho tác dụng nhanh (2 phút) và duy trì tác dụng trong khoảng 1 – 2 giờ [37]. Vì các đặc tính đặc biệt, cangrelor được sử dụng cho những tình huống khẩn cấp, cho bệnh nhân đang chờ phẫu thuật hay không thể sử dụng thuốc đường uống [18, 32]. 1.3.3. Nhóm ức chế thụ thể của thrombin Thrombin là một serine protease, hoạt hóa tiểu cầu chủ yếu thông qua hai thụ thể bắt cặp protein G, PAR1 và PAR4, trong đó PAR1 có ái lực với thrombin mạnh nhất. Hiện nay, nhóm này mới chỉ có vorapaxar đang được sử dụng. Vorapaxar ức chế chọn lọc có hồi phục PAR1, dẫn đến ức chế NTTC gây ra bởi 18
  28. thrombin nhưng không ảnh hưởng đến cầm máu ban đầu. Do lo ngại về độ an toàn, việc sử dụng vorapaxar trên lâm sàng còn hạn chế [21, 32]. 1.3.4. Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa Nhóm thuốc ức chế phức hợp GPIIb/IIIa là những phân tử bắt chước phối tử của GPIIb/IIIa, ngăn fibrinogen gắn với các tiểu cầu hoạt hóa, do đó ức chế sự ngưng tập của chúng. Các thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa được sử dụng trong hội chứng mạch vành cấp tính. Ba thuốc hiện đang được sử dụng: abciximab, một kháng thể đơn dòng; eptifibatid, một heptapeptid vòng có nguồn gốc từ nọc độc rắn chuông chứa chuỗi Arg-Gly-Asp giống với trình tự của fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa và tirofiban, một phân tử nhỏ cũng chứa chuỗi Arg-Gly-Asp. Do có nửa đời thuốc ngắn, các thuốc này phải được tiêm truyền liên tục [18, 32]. 1.3.5. Nhóm ức chế phosphodiesterase Dipyridamol là thuốc ức chế phosphodiesterase, do đó làm tăng nồng độ cAMP dẫn đến làm ức chế tổng hợp TXA2 và gián tiếp tăng nồng độ adenosine. Ngoài ra, dipyridamol còn có tác dụng giãn mạch vành [7]. Nếu chỉ sử dụng một mình dipyridamol thì hầu như không có tác dụng nên dipyridamol thường được sử dụng phối hợp với aspirin hoặc warfarin [26]. Cilostazol là một thuốc ức chế phosphodiesterase mới, có tác dụng giãn mạch và ức chế NTTC. Cilostazol được sử dụng để điều trị đau cách hồi ở chân [26]. 1.4. Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A. Dietr 1.4.1. Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng Họ Dong riềng (hay Ngải hoa) Cannaceae là họ thực vật một lá mầm, trong đó chi Canna là chi duy nhất của họ này với khoảng 10 – 20 loài trên thế giới. Hiện nay, ở Việt Nam, các nhà khoa học đã phát hiện 6 loài thực vật thuộc họ Cannaceae. Đó là Canna edulis Ker., C. generalis Bail., C. glauca L., C. indica L., C. sylvestris Rosc và C. warszewiczii A. Dietr mới được phát hiện và định danh gần đây [3, 6]. C. warszewiczii là một loài cây chịu bóng râm, thường mọc dưới 19
  29. tán cây, nơi ẩm ướt. Cây cao khoảng 1.5 mét. Lá nhỏ và thô, gân ở giữ to, gân phụ song song. Hoa xếp thành cụm ở ngọn cây, màu đỏ thẫm. Thân mảnh nhưng chắc, màu tím đỏ. Thân rễ to thành củ. Cây phát triển mạnh mẽ và xanh tốt quanh năm [4, 13]. C. warszewiczii phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Trên thế giới, loài này có thể được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Châu) và Nam Mỹ. Ở Việt Nam, C. warszewiczii phân bố tự nhiên ở một số vùng miền núi như Mộc Châu (Sơn La), Võ Nhai (Thái Nguyên) và Bắc Sơn (Lạng Sơn) [6, 13, 31]. Ở Việt Nam, C. warszewiczii đã được sử dụng như một loại thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh tim mạch như bệnh động mạch vành, thiếu máu cơ tim. Ngoài ra, người Dao ở bản Piềng Sàng (Sơn La) còn trồng và sử dụng loài cây này làm thuốc chữa đau dạ dày, đau nhức xương và tức ngực [6, 35]. Mặc dù còn thiếu bằng chứng khoa học, một số thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch đã được đưa ra thị trường như Cardocorz của Công ty Dược phẩm NanoFrance hay An Tim Tuệ Linh của Công ty Dược phẩm Tuệ Linh [13, 31]. 1.4.2. Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A. Dietr Nghiên cứu của Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự công bố năm 2018 lần đầu tiên cho thấy phân đoạn dịch chiết ethyl acetate (EA) của phần thân rễ và của phần trên mặt đất của C. warszewiczii đều kéo dài thời gian đông máu, thể hiện qua hai thông số PT và APTT, từ 1,5 đến 2,5 lần giá trị bình thường. Xét nghiệm PT thăm dò con đường ngoại sinh, trong khi xét nghiệm APTT khảo sát con đường đông máu nội sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy phân đoạn dịch chiết EA của cả hai phần đều cho tác dụng chống đông máu ở nồng độ 8 mg/mL. Ở nồng độ 16 mg/mL, dịch chiết của phần trên mặt đất cho kết quả hai chỉ số PT và APTT đều rất cao, có thể phản ánh nguy cơ chảy máu cao. Kết quả nghiên cứu ban đầu này cho thấy C. warszewiczii có tác dụng chống đông máu, tác động đến cả hai con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh [35]. Nghiên cứu của Đỗ Nhật Hạ năm 2018 cho thấy một loạt phân đoạn dịch chiết của C. warszewiczii bao gồm EA, dichloromethane (DCM), n-hexan (nH) 20
  30. của phần thân và phần trên mặt đất có tiềm năng chống NTTC khi thử với ba chất kích tập khác nhau là ADP, collagen, ristocetin. Số liệu cho thấy phân đoạn dịch chiết EA của phần trên mặt đất và phân đoạn DCM của phần thân rễ ở nồng độ 1,5 mg/mL có tác dụng mạnh nhất trong ức chế NTTC gây ra bởi ADP và collagen. Trong khi đó, phân đoạn nH của phần thân rễ có tác dụng ức chế mạnh nhất ngưng tập gây ra bởi ristocetin [13]. Công bố năm 2020, nghiên cứu của Lê Hồng Luyến và cộng sự đánh giá tác dụng ức chế NTTC, chống oxy hóa và thành phần hóa học chính trong phần thân rễ và phần trên mặt đất của C. warszewiczii A. Dietr. Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết (DCM, nH, EA) của cả phần thân rễ và phần trên mặt đất có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu và chống oxy hóa phụ thuộc nồng độ mẫu thử. Nhiều hợp chất sinh học cũng đã được phát hiện trong các phân đoạn như flavonoid, polyphenol, glycosid, glycosid tim, coumarin, steroid, emodol, tannin và cholesterol [31]. Từ các nghiên cứu tiền đề trên về tác dụng chống NTTC của C. warszewiczii A. Dietr, chúng tôi thực hiện đề tài này với mong muốn tìm hiểu sâu hơn về cơ chế NTTC của các phân đoạn dịch chiết này thông qua thụ thể của chất kích tập tiểu cầu ADP. 21
  31. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Mẫu cây Dong riềng đỏ được thu hái tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 12/2019, được giám định tên khoa học là C. warszewiczii (A. Dietr) Nb. Tanaka bởi chuyên gia thực vật học của Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Hình 2.1. Mẫu cây Dong riềng đỏ C. warszewiczii A. Dietr (Hình trên trái: phần trên mặt đất, hình bên phải: phần thân rễ) Cây sau khi thu hái được rửa sạch, tách riêng phần thân rễ và phần trên mặt đất. Thái nhỏ phần thân rễ và phần trên mặt đất, phơi khô trong nhà kính đến khi đạt độ ẩm dưới 10%. Xay nhỏ đến kích thước phù hợp, bảo quản trong túi nilon. Ngâm hai phần dược liệu đã xay với ethanol 96% (tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1/5) và lọc bằng giấy lọc. Lặp lại bước trên 3 lần. Dung dịch sau khi lọc được cô quay dưới áp suất giảm đến khi thu được cắn. Hòa tan cắn bằng nước nóng. Tách các thành phần có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan (nH), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EA). Dung môi sau đó được thu hồi bằng cô quay dưới áp suất giảm, thu được cắn các phân đoạn dịch chiết. 22
  32. Mẫu cây 04/12/2019 Phần thân rễ (CW.R) Phần trên mặt đất (CW.A) (1085,63 g) (1000,67 g) Phân đoạn tổng Phân đoạn tổng (35,68 g) (69,29 g) CW.R.nH CW.A.nH (1,59 g) (19,60 g) CW.R.DCM CW.A.DCM (4,77 g) (1,19 g) CW.R.EA CW.A.EA (4,33 g) (2,02 g) CW.R.H2O CW.A.H2O Hình 2.2. Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C. warszewiczii A. Dietr 2.1.2. Thu thập mẫu máu Tiêu chuẩn lựa chọn: Người tình nguyện khỏe mạnh, 20 – 25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, hiện không sử dụng các thuốc tác động lên quá trình đông máu, tiêu fibrin. Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng lớn hơn 450 mL trong vòng 20 ngày trước. 2.1.3. Dụng cụ nghiên cứu Ống chống đông citrate, xy lanh 20 mL, kim lấy máu 20 gauge, đầu côn, micropipette, ống eppendorf, ống falcon, găng tay, bút viết kính, sổ ghi chép, cuvet thủy tinh, bi khuấy, máy siêu âm, máy ly tâm, máy đo ngưng tập tiểu cầu Chrono- Log-490 của Mỹ, hóa chất dimethyl sulfoxide (DMSO) của Sigma-Aldrich (Mỹ), 23
  33. ADP của hãng Chrono-Log (Mỹ), PPADS tetrasodium của Tocris Bioscience (Anh), ethanol 96%, ethyl acetate (EA), dichloromethane (DCM), n-hexan (nH) dung dịch NaCl 0,9%. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất Cắn của dịch chiết phân đoạn ethyl acetate (EA) và dichloromethane (DCM) của phần trên mặt đất (Aerial – A) được pha trong dung môi DMSO 5% để thu được phân đoạn dịch chiết có nồng độ lần lượt là 40 mg/mL và 120 mg/mL, ký hiệu là CW.A.EA 40 mg/mL và CW.A.DCM 120 mg/mL. PPADS tetrasodium được hòa tan trong nước muối sinh lý NaCl 0,9% để thu được dung dịch nồng độ 10 mmol/L, ký hiệu là PPADS 10 mM. 2.2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm Tất cả các nghiên cứu được bắt đầu vào buổi sáng với các tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu. Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge. Lấy 20 mL máu tĩnh mạch toàn phần, chống đông bằng natri citrate 3,2% (tỷ lệ 9:1). Lắc đều để đảm bảo chống đông hoàn toàn. Ly tâm ở tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet hút lấy phần huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) màu vàng đục nổi ở trên, cho vào ống thủy tinh đã ký hiệu PRP. Ly tâm phần còn lại ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipet hút lấy phần huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) vàng trong nổi ở trên, cho vào ống thủy tinh đã ký hiệu PPP. Mẫu huyết tương bảo quản ở nhiệt độ phòng, chỉ sử dụng trong vòng 4 giờ kể từ thời điểm thu được huyết tương. 2.2.3. Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu Sử dụng phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry – LTA) với chất kích tập ADP trên máy Chrono-Log-490. Được phát triển từ năm 1962, độc lập bởi Born và O’Brien, LTA được coi là tiêu chuẩn vàng để đánh giá nhiều chức năng khác nhau của tiểu cầu. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian và chịu 24
  34. nhiều biến thiên kỹ thuật [10]. Nguyên lý của phương pháp này là mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ với nồng độ của tiểu cầu có trong huyết tương đó [7]. Thiết bị cần sử dụng cho LTA là một quang phổ kế. Để thực hiện phương pháp này, cần chuẩn bị một cuvet chứa huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) và một viên bi khuấy từ; một cuvet chứa huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP). Mỗi cuvet được đặt vào một giếng riêng đã được xác định. Bên trong mỗi giếng, nhiệt độ được duy trì hằng định ở 370C, một chùm tia ánh sáng với bước sóng xác định chiếu qua cuvet tới một tế bào quang điện. Tín hiệu thu được từ tế bào này sẽ được tự động chuyển thành một đồ thị đường cong trên máy tính. Coi độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PRP trước khi thêm chất gây ngưng tập là 0%, nghĩa là ánh sáng bị cản lại hoàn toàn; độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PPP là 100%, nghĩa là ánh sáng đi qua hoàn toàn; hiệu chỉnh đường nền về 0% [10, 36]. Quá trình NTTC gây ra bởi ADP được mô tả bằng Hình 2.3. Hình 2.3. Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP 5 M Khi thêm chất kích tập ADP 5 M (nồng độ cuối cùng), tiểu cầu bắt đầu thay đổi hình dạng. Từ hình đĩa, tiểu cầu phồng lên thành hình cầu, đồ thị đi lên nhẹ do ánh sáng truyền qua giảm. Sau đó, tiểu cầu co lại thành hình cầu nhỏ và 25
  35. mọc các chân giả. Các thụ thể GPIIb/IIIa được hoạt hóa và bộc lộ trên bề mặt, khởi động pha ngưng tập nguyên phát. Ánh sáng truyền qua tăng, đồ thị đi xuống đến khi uốn cong nhẹ lên báo hiệu phản ứng giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu xảy ra. Một lượng lớn các chất (ADP, ATP, Ca++) được giải phóng tham gia hoạt hóa những tiểu cầu khác và ổn định liên kết của các đám ngưng tập. Đồ thị tiếp tục đi xuống nhưng thoải dần, thể hiện sự ngưng tập đã ổn định cho tới khi kết thúc thí nghiệm đo ở thời điểm 6 phút. Thí nghiệm của chúng tôi sử dụng 5 L ADP 10 M (nồng độ cuối cùng). Sự uốn cong nhẹ báo hiệu phản ứng giải phóng không xuất hiện trên đồ thị ngưng tập nên khó xác định được thời điểm bắt đầu của pha ngưng tập thứ phá [50]. Tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono-Log-490: Bảng 2.1. Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu Bi Ký hiệu (nồng độ Cuvet Thành phần khuấy cuối cùng) 0 500 L PPP Không Nền 1 500 L PRP Có Chứng âm 2 450 L PRP + 50 L DMSO 5% Có DMSO 0,5% 3 495 L PRP + 5 L PPADS 10 mmol/L Có PPADS 100 M 445 L PRP + 50 L DMSO 5% + 5 DMSO 0,5% + 4 Có L PPADS 10 mmol/L PPADS 100 M 450 L PRP + 50 L CW.A.EA 40 5 Có EA 4 mg/mL mg/mL 445 L PRP + 50 L CW.A.EA 40 EA 4 mg/mL + 6 Có mg/mL + 5 L PPADS 10 mmol/L PPADS 100 M 450 L PRP + 50 L CW.A.DCM 120 7 Có DCM 12 mg/mL mg/mL 445 L PRP + 50 L CW.A.DCM 120 DCM 12 mg/mL + 8 Có mg/mL + 5 L PPADS 10 mmol/L PPADS 100 M 26
  36. Lưu ý rằng: - Đối với các ống có dịch chiết dược liệu: Ủ 5 phút ở 370C trước khi đo. - Đối với các ống có PPADS: Ủ 30 phút ở 370C trước khi đo. - Đối với các ống có dịch chiết dược liệu và PPADS: Ủ hỗn hợp PRP và PPADS 30 phút ở 370C. Thêm dịch chiết dược liệu, ủ 5 phút ở 370C trước khi đo. - Coi độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PRP trước khi thêm chất gây ngưng tập là 0%, độ dẫn truyền ánh sáng qua cuvet chứa PPP là 100%, hiệu chỉnh đường nền về vạch 0. 2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu Các thông số của quá trình được tính toán bởi phần mềm AggroLink bao gồm: Slope, Amplitude và AUC (Area Under the aggregation Curve). Slope phản ánh tốc độ NTTC. Chỉ số này càng lớn có nghĩa là tiểu cầu ngưng tập càng nhanh. Phần trăm NTTC tối đa được biểu diễn qua thông số Amplitude. Tuy nhiên, để hạn chế sai số giữa những lần lấy mẫu ở các ngày khác nhau, coi phần trăm NTTC tối đa (Maximal Platelet Aggregation – MPA) của chứng âm là 100%, MPA của các nhóm còn lại được tính bằng công thức: 푙𝑖푡 푒 ủ ẫ 푃 (%) = 100 % 푙𝑖푡 푒 ủ ℎứ푛𝑔 â Thông số quan trọng nhất là AUC, bản chất là diện tích dưới đường cong ngưng tập, phản ánh mức độ NTTC [23]. Một chỉ số nữa cũng được phân tích là mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA). Để tính toán DEA, cần xác định phần trăm NTTC ở thời điểm kết thúc thí nghiệm (Final Platelet Aggregation – FPA) một cách tương đối dựa vào đồ thị ngưng tập do phần mềm không ghi nhận FPA. DEA được tính bằng công thức: 푙𝑖푡 푒 − 퐹푃 (%) = 100 % 푙𝑖푡 푒 Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn), được phân tích bằng phần mềm Minitab 19.2 và SPSS 20.0. Số liệu của 27
  37. các nhóm được kiểm định phân phối chuẩn và đồng nhất phương sai. Sử dụng kiểm định ANOVA một yếu tố với hậu kiểm Tukey để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm. Nếu số liệu của các nhóm không đáp ứng những giả định của phân tích phương sai, sử dụng kiểm định Kruskal – Wallis với hậu kiểm Dunn và không sử dụng hiệu chỉnh Bonferroni. P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. 2.2.5. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu được chấp nhận và thông qua bởi Hội đồng đạo đức cấp cơ sở Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu này thuộc nội dung đề tài khoa học cấp Bộ Khoa học và Công nghệ - Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số loài Dong riềng (Canna) nhằm phát triển cây dược liệu trọng điểm ứng dụng trong điều trị bệnh tim mạch”, mã số đề tài: 106.02-2018.334. 28
  38. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả Chúng tôi tiến hành đo độ ngưng tập tiểu cầu in vitro của 8 nhóm thí nghiệm trên máy Chrono-Log-490. Kết quả của các quá trình ngưng tập được mô tả qua các thông số là tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope), phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA), mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) và mức độ phân rã ngưng tập (DEA). 3.1.1. Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) Bảng 3.1. Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) Nhóm N Slope PANOVA Chứng âm 3 81,67 ± 2,40 0,000 DMSO 0,5% 3 85,00 ± 4,36 PPADS 100 M 5 58,80 ± 5,30 DMSO 0,5% + PPADS 100 M 3 52,00 ± 2,08 EA 4 mg/mL 5 61,80 ± 3,40 EA 4 mg/mL + PPADS 100 M 5 34,20 ± 7,79 DCM 12 mg/mL 4 63,75 ± 6,18 DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M 4 26,25 ± 4,85 Nhận xét: Nhìn chung, tốc độ NTTC của chứng âm và DMSO 0,5% tương đương nhau. Các nhóm chứa dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS đều làm giảm tốc độ NTTC khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%. 29
  39. Hình 3.1. So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình Slope của các nhóm Nhận xét: Hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M có tốc độ NTTC thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm chứng âm, DMSO 0,5%, PPADS 100 M, EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL (P < 0,05). 3.1.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) Bảng 3.2. Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) Nhóm N MPA (%) PANOVA Chứng âm 3 100 0,000 DMSO 0,5% 3 96,03 ± 2,19 PPADS 100 M 5 51,56 ± 11,53 DMSO 0,5% + PPADS 100 M 3 35,22 ± 4,42 EA 4 mg/mL 5 42,75 ± 5,24 30
  40. EA 4 mg/mL + PPADS 100 M 5 21,17 ± 5,52 DCM 12 mg/mL 4 42,67 ± 4,74 DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M 4 9,50 ± 3,82 Nhận xét: Phần trăm NTTC tối đa của nhóm DMSO 0,5% tương đương với chứng âm. Sự có mặt của dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS đều làm giảm MPA. Hình 3.2. So sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình MPA của các nhóm Nhận xét: Các nhóm có chứa PPADS và/hoặc dịch chiết dược liệu đều làm giảm phần trăm NTTC tối đa rõ rệt khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5% (P < 0,05). Hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M ức chế ngưng tập mạnh hơn so với nhóm chỉ có PPADS 100 M (P < 0,05). Đặc biệt, nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M ức chế ngưng tập mạnh hơn hai nhóm chỉ có dược liệu một cách có ý nghĩa thống kê. 3.1.3. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 31
  41. Bảng 3.3. Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) Nhóm N AUC PKruskal-Wallis Chứng âm 3 281,27 ± 20,33 0,002 DMSO 0,5% 3 272,93 ± 21,31 PPADS 100 M 5 143,14 ± 40,27 DMSO 0,5% + PPADS 100 M 3 73,70 ± 18,78 EA 4 mg/mL 5 93,60 ± 25,04 EA 4 mg/mL + PPADS 100 M 5 56,52 ± 17,81 DCM 12 mg/mL 4 50,85 ± 24,83 DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M 4 5,28 ± 2,49 Nhận xét: Nhóm chứng âm và DMSO 0,5% có mức độ NTTC tương đương nhau. Nhìn chung, các nhóm chứa dịch chiết dược liệu và/hoặc PPADS đều làm giảm mức độ NTTC khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%. Bảng 3.4. Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm Nhóm DMSO PPADS DMSO + EA EA + DCM DCM + PPADS PPADS PPADS Chứng âm 0,97 0,14 0,08 0,09 0,017 0,009 0,000 DMSO 0,13 0,07 0,08 0,015 0,008 0,000 PPADS 0,64 0,79 0,30 0,18 0,01 DMSO + PPADS 0,82 0,66 0,46 0,06 EA 0,44 0,28 0,02 EA + PPADS 0,72 0,10 DCM 0,23 32
  42. Nhận xét: Các nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M, DCM 12 mg/mL và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M đều làm giảm mức độ NTTC một cách rõ rệt khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%. Đặc biệt, AUC của nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với AUC của nhóm PPADS 100 M và EA 4 mg/mL. 3.1.4. Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) Bảng 3.5. Mức độ phân rã ngưng tập (DEA) Nhóm N DEA (%) PKruskal-Wallis Chứng âm 3 0 DMSO 0,5% 3 0 PPADS 100 M 5 27,99 ± 14,50 0,097 DMSO 0,5% + PPADS 100 M 3 53,32 ± 22,69 EA 4 mg/mL 5 67,70 ± 13,42 EA 4 mg/mL + PPADS 100 M 5 38,43 ± 16,17 DCM 12 mg/mL 4 94,12 ± 5,88 DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M 4 75,00 ± 25,00 Nhận xét: Hai nhóm chứng âm và DMSO 0,5% không có xảy ra hiện tượng phân rã ngưng tập. Hai nhóm có chứa phân đoạn DCM có mức độ phân rã mạnh nhất. PKruskal-Wallis > 0,05 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ phân rã ngưng tập (DEA) giữa các nhóm. 3.1.5. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33
  43. Hình 3.3. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của các nhóm (A: Chứng âm, B: DMSO 0,5%, C: PPADS 100 M, D: DMSO 0,5% + PPADS 100 M, E: EA 4 mg/mL, F: EA 4 mg/mL + PPADS 100 M, G: DCM 12 mg/mL, H: DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M) Nhận xét: Hai nhóm chứng âm và DMSO 0,5% cho đồ thị đặc trưng của quá trình NTTC in vitro gây ra bởi chất kích tập ADP. Đồ thị của các nhóm chứa 34
  44. PPADS và/hoặc phân đoạn dịch chiết đều chỉ xuất hiện pha ngưng tập nguyên phát, vắng mặt pha ngưng tập thứ phát. Một cách trực quan, sự phối hợp của dịch chiết dược liệu và PPADS cho thấy tác dụng ức chế ngưng tập mạnh hơn nhóm chỉ có một trong hai dịch chiết dược liệu. Xu hướng phân rã ngưng tập sau khi ngưng tập đạt cực đại cũng được ghi nhận, thể hiện qua phần trăm NTTC điểm cuối (FPA) thấp hơn phần trăm NTTC tối đa (MPA). Tuy nhiên, tốc độ và mức độ phân rã là khác nhau giữa các nhóm, trong đó hai nhóm chứa phân đoạn DCM đều phân rã ngưng tập rất nhanh và hoàn toàn. 3.2. Bàn luận 3.2.1. Thiết kế nghiên cứu Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu được sử dụng là phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry – LTA). Được giới thiệu lần đầu tiên hơn 50 năm trước, đến nay, LTA vẫn là tiêu chuẩn vàng để đánh giá chức năng tiểu cầu và hiệu quả của những thuốc kháng tiểu cầu [10, 28]. ADP là chất kích tập được sử dụng. ADP gây NTTC qua tương tác với hai thụ thể P2Y1 và P2Y12. Sự phối hợp của hai thụ thể này giúp quá trình ngưng tập gây ra bởi ADP diễn ra đầy đủ. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng 5 L ADP 10 M (nồng độ cuối cùng). Sự uốn cong nhẹ báo hiệu phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu, bắt đầu pha ngưng tập thứ phát không được quan sát thấy. PPADS được sử dụng làm chất ức chế không đặc hiệu các thụ thể purinergic trên màng tiểu cầu. PPADS ức chế thụ thể P2X1 hoạt hóa bởi ATP, P2Y1 và P2Y12 hoạt hóa bởi ADP. Nồng độ cuối cùng của PPADS trong thí nghiệm đo NTTC là 100 M. Đây cũng là nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12. Ái lực của PPADS với P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30]. 3.2.2. Kết quả nghiên cứu Đồ thị ngưng tập miêu tả một cách trực quan nhất diễn biến của quá trình NTTC. Kết hợp với bốn thông số: tốc độ NTTC (Slope), phần trăm NTTC tối đa 35
  45. (MPA), mức độ phân rã ngưng tập (DEA) và mức độ NTTC (AUC), quá trình NTTC với chất kích tập ADP được đánh giá và phân tích đầy đủ hơn [11]. Từ Hình 3.3, sau khi thêm chất kích tập ADP, sự kiện tiểu cầu thay đổi hình dạng đều được ghi nhận ở tất cả các nhóm, thể hiện ở việc đồ thị đi lên nhẹ, hình thành đỉnh nhọn, rồi đi xuống báo hiệu pha ngưng tập nguyên phát bắt đầu [24]. Thụ thể P2Y1 chịu trách nhiệm cho giai đoạn thay đổi hình dạng và pha ngưng tập nguyên phát. ADP gắn vào P2Y1 châm ngòi cho một chuỗi phản ứng hoạt hóa và cuối cùng dẫn đến tương tác giữa IP3 với thụ thể của nó trên hệ thống ống dày đặc, huy động và làm tăng nồng độ Ca++ nội bào. Sự gia tăng Ca++ nội bào dẫn đến một số thay đổi. Thứ nhất, một loạt các protein tham gia vào quá trình cắt, ghép các vi sợi actin được hoạt hóa. Từ đó, hệ khung xương tế bào bị phá vỡ. Từ hình đĩa, tiểu cầu phồng lên thành hình cầu. Sau đó, tiểu cầu co lại, đồng thời hình thành các chân giả và phần mở rộng (lamellipodia) [9], [44], [47]. Đồ thị của tất cả các nhóm đều ghi nhận hiện tượng này. Do đó, có thể phân đoạn EA 4 mg/mL, DCM 12 mg/mL hay PPADS 100 M không ảnh hưởng đến giai đoạn tiểu cầu thay đổi hình dạng. Hiện tượng thứ hai gây ra bởi sự gia tăng nồng độ Ca++ nội bào là hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa (Hình 1.5), dẫn đến hình thành ngưng tập giữa các tiểu cầu. Theo đó, CalDAG-GEFI xúc tác phản ứng biến đổi RAP1-GDP thành RAP1-GTP, hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa từ trạng thái ái lực thấp thành trạng thái ái lực cao và liên kết được với fibrinogen tan trong huyết tương [9]. Nhờ đó, tiểu cầu liên kết với nhau thông qua cầu fibrinogen, hình thành ngưng tập nguyên phát. Tiểu cầu ngưng tập càng nhiều thì độ dẫn truyền ánh sáng càng tăng. Do đó, đồ thị ngưng tập có xu hướng đi xuống. Pha ngưng tập nguyên phát được đánh giá thông qua tốc độ NTTC (Slope). Slope được tính bằng cách vẽ đường tiếp tuyến với đồ thị ngưng tập ngay sau giai đoạn tiểu cầu thay đổi hình dạng và phản ánh sự thay đổi của ngưng tập trong một phút. Bởi vậy, tiểu cầu ngưng tập càng nhanh và nhiều, đồ thị đi xuống càng dốc, giá trị Slope càng lớn. Dựa vào Bảng 3.1 và Hình 3.1, các nhóm có chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS đều làm giảm tốc độ 36
  46. NTTC khi so sánh với nhóm chứng âm và DMSO 0,5%. Điều đáng chú ý là hai nhóm EA 4 mg/mL + PPADS 100 M và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M đều có tốc độ ngưng tập thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm PPADS 100 M, EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL. Kết quả này có thể đưa ra phỏng đoán về tác dụng hiệp đồng của PPADS và hai phân đoạn dịch chiết trong ức chế tiểu cầu ngưng tập với nhau và làm giảm tốc độ NTTC. Quá trình ngưng tập tiếp tục diễn ra theo một trong hai xu hướng. Xu hướng đầu tiên gọi là ngưng tập ổn định, phản ứng giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu xảy ra, khuếch đại và củng cố ngưng tập, hình thành pha ngưng tập thứ phát. Thụ thể P2Y12 thể hiện vai trò trung tâm trong giai đoạn này. ADP tương tác với P2Y12, hoạt hóa phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) thông qua tiểu đơn vị . PI 3-K có hai tác động quan trọng. Thứ nhất, PI 3-K ức chế RASA3, chất xúc tác biến đổi RAP1-GTP trở lại thành RAP1-GDP. Do đó, PI 3-K duy trì trạng thái hoạt hóa của GPIIb/IIIa, làm bền vững liên kết giữa các tiểu cầu và củng cố đám ngưng tập. Thứ hai, PI 3-K tác động đến quá trình giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu theo cơ chế chưa được làm rõ. Hạt đặc bài tiết ra một lượng lớn ADP, ATP, Ca++, serotonin, histamine giúp khuếch đại sự ngưng tập tiểu cầu. ATP gắn với P2X1, hoạt hóa kênh ion vận chuyển Ca++, làm tăng nồng độ Ca++ nội bào. ADP được giải phóng sẽ hoạt hóa các tiểu cầu khác tham gia vào quá trình ngưng tập. Hạt α bài tiết ra các protein dính như fibrinogen, vWF củng cố liên kết giữa các tiểu cầu. Ngoài ra, P2Y12 cũng gián tiếp ổn định ngưng tập thông qua ức chế adenylyl cyclase (AC). Quá trình ngưng tập ổn định này được quan sát thấy ở đồ thị ngưng tập của chứng âm và DMSO 0,5% (Hình 3.3 A và B). Theo đó, phản ứng giải phóng xảy ra, pha ngưng tập thứ phát bắt đầu, đồ thị tiếp tục đi xuống nhưng thoải dần cho tới khi kết thúc thí nghiệm đo. Bởi vậy, phần trăm NTTC tối đa (MPA) của hai nhóm này cũng chính là phần trăm NTTC điểm cuối (FPA). Tuy nhiên, đồ thị của các nhóm còn lại (Hình 3.3 C – H) đều diễn ra theo xu hướng phân rã ngưng tập. Đồ thị khi đạt đến điểm thấp nhất, uốn cong ngược trở lại và đi lên. Do đó, FPA < MPA. MPA của các nhóm này đều thấp hơn MPA 37
  47. của chứng âm và DMSO 0,5%. Đặc biệt, nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M có phần trăm NTTC tối đa thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm PPADS 100 M, EA 4 mg/mL và DCM 12 mg/mL. Tiểu cầu ngưng tập với nhau hầu hết thông qua liên kết của thụ thể GPIIb/IIIa với fibrinogen. Do đó, hiện tượng phân rã ngưng tập chính là sự phá vỡ liên kết này. Hiện tượng này xuất hiện ở những nhóm có chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS. Tuy nhiên, mức độ và tốc độ phân rã lại khác nhau giữa các nhóm. Đối với nhóm PPADS 100 M hoặc DMSO 0,5% + PPADS 100 M, các thụ thể P2Y1 và P2Y12 bị ức chế. Do đó, tín hiệu đáp ứng ngưng tập của ADP không đủ mạnh để gây ra phản ứng giải phóng khi nồng độ của PPADS (100 M) lớn hơn khoảng 10 lần nồng độ ADP (10 M). Củng cố cho lập luận này thể hiện ở những ngưng tập gây ra bởi ADP nồng độ thấp (< 2,5 M) thường không xuất hiện pha ngưng tập thứ phát [24]. Thụ thể GPIIb/IIIa không được duy trì ở trạng thái hoạt hóa khiến liên kết giữa các tiểu cầu lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ trong dòng chất lỏng chuyển động tạo ra bởi viên bi khuấy. Đồ thị ngưng tập của hai nhóm này đi lên từ từ và ngưng tập vẫn chưa phân rã hết ở điểm cuối (Hình 3.3 C và D). Xu hướng phân rã này cũng được quan sát thấy ở đồ thị ngưng tập của nhóm EA 4 mg/mL và EA 4 mg/mL + PPADS 100 M (Hình 3.3 E và F). Tuy nhiên, nhóm DCM 12 mg/mL và DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M (Hình 3.3 G và H) cho ngưng tập phân rã rất nhanh và hầu hết đều phân rã hoàn toàn trước phút thứ 4 của thí nghiệm đo NTTC. Điều này có thể do các chất có mặt trong phân đoạn DCM đã tác động trực tiếp đến liên kết giữa GPIIb/IIIa và fibrinogen, làm ngưng tập phân rã nhanh hơn. Nghiên cứu của Lê Hồng Luyến và cộng sự đã chỉ ra sự khác biệt về thành phần các chất trong hai phân đoạn dịch chiết. Theo đó, ngoài những chất xuất hiện trong cả hai phân đoạn (glycoside, glycoside tim, steroid, cholesterol), phân đoạn EA của phần trên mặt đất chứa lượng polyphenol và flavonoid lớn nhất. Trong khi đó, phân đoạn DCM có thêm coumarin và tannin [31]. Polyphenol và coumarin đã được chứng minh có tác dụng ức chế NTTC [12]. Đặc biệt, flavonoid ức chế ngưng 38
  48. tập gây ra bởi nhiều chất kích tập khác nhau trên in vitro như TXA2, thrombin, collagen và ADP. Flavonoid và coumarin cũng có khá năng gắn với thụ thể GPIIb/IIIa [15, 49]. AUC là thông số quan trọng nhất bởi nó đánh giá quá trình ngưng tập một cách tổng quan. Mức độ NTTC của nhóm DMSO 0,5% tương đương nhóm chứng âm (lần lượt là 272,93 ± 21,31 và 281,27 ± 20,33) chứng tỏ không có sự ảnh hưởng của dung môi lên quá trình ngưng tập gây ra bởi ADP. AUC của PPADS 100 M (143,14 ± 40,27) và DMSO 0,5% + PPADS 100 M (73,70 ± 18,78) đều thấp hơn so với chứng âm và DMSO, có thể cho thấy khả năng ức chế NTTC của PPADS. Các phân đoạn dịch chiết EA 4 mg/mL (93,60 ± 25,04) và DCM 12 mg/mL (50,85 ± 24,83) cũng cho thấy tác dụng ức chế NTTC. Sự phối hợp đồng thời của PPADS và phân đoạn dịch chiết đều làm giảm mức độ NTTC thấp hơn so với nhóm chỉ có dược liệu đơn lẻ. Bảng 3.6. Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết M1 M2 Slope MPA AUC EA + PPADS EA *   DMSO + PPADS    DCM + PPADS DCM * *  DMSO + PPADS    ( : Giá trị M1 thấp hơn M2; *: Sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)) Sự phối hợp của PPADS với hai phân đoạn dịch chiết đều làm giảm các thông số phản ánh quá trình ngưng tập tiểu cầu khi so sánh với nhóm phân đoạn dịch chiết đơn lẻ hay nhóm DMSO 0,5% + PPADS 100 M. Đây có thể là tác dụng hiệp đồng trong ức chế hiện tượng ngưng tập của tiểu cầu với chất kích tập ADP. ADP hoạt hóa tiểu cầu qua tương tác với hai thụ thể P2Y1 và P2Y12. Tín hiệu nội bào hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa và tiểu cầu ngưng tập với nhau qua cầu fibrinogen. Số lượng liên kết giữa các tiểu cầu giảm là nguyên nhân dẫn đến sụt 39
  49. giảm các thông số. Điều này có thể là do ADP phải cạnh tranh với nhiều chất đối vận trong các phân đoạn dịch chiết hơn để gắn được vào thụ thể của nó, dẫn đến đáp ứng ngưng tập yếu. Tín hiệu kích thích phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu bị ức chế. Fibrinogen phải cạnh tranh với flavonoid, coumarin để tạo liên kết với GPIIb/IIIa. Với sự đa dạng trong thành phần các chất, có thể hai phân đoạn dịch chiết EA và DCM ức chế ngưng tập theo nhiều con đường khác nhau. 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu Cỡ mẫu của nghiên cứu nhỏ, độ lặp lại chưa cao. Phương pháp đo NTTC bằng kỹ thuật LTA tốn nhiều thời gian và chịu ảnh hưởng bởi nhiều biến thiên kỹ thuật. Thiết bị đo độ NTTC Chrono-Log-490 không tính toán được phần trăm NTTC điểm cuối (FPA). Nghiên cứu chưa khảo sát được với chất hoạt hóa chọn lọc thụ thể P2Y1, P2Y12 nên chưa đánh giá được đầy đủ tác dụng ức chế ngưng tập của phân đoạn dịch chiết. Nghiên cứu mới khảo sát cơ chế chống NTTC gây ra bởi ADP. Trong khi đó, phân đoạn dịch chiết cho thấy khả năng ức chế ngưng tập với nhiều chất kích tập khác (collagen, ristocetin). 40
  50. KẾT LUẬN Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ C. warszewiczii A. Dietr, chúng tôi rút ra một số kết luận theo mục tiêu đã đề ra như sau: Sự phối hợp của các phân đoạn dịch chiết CW.A.EA 4 mg/mL và CW.A.DCM 12 mg/mL với PPADS 100 M có tác dụng hiệp đồng, làm tăng khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro thể hiện qua các thông số là tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope), phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA), mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) và mức độ phân rã ngưng tập (DEA). Do đa dạng trong thành phần các chất, hai phân đoạn dịch chiết có thể chống ngưng tập tiểu cầu theo nhiều cơ chế khác nhau. 41
  51. KIẾN NGHỊ Nghiên cứu với các chất ức chế và hoạt hóa đặc hiệu P2Y1 và P2Y12. Đo ngưng tập tiểu cầu với các chất kích tập khác như collagen, ristocetin để đánh giá cơ chế đầy đủ hơn. Phân tích và xác định thành phần và cấu trúc các chất trong các phân đoạn dịch chiết. Tiến hành nghiên cứu với các thiết bị hiện đại hơn như Lumiaggregometry (khảo sát được phản ứng giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu) hay PAP-8E (tính toán được thêm các thông số như pha lag, slope của pha ngưng tập thứ phát, phần trăm ngưng tập điểm cuối và mức độ phân rã). 42
  52. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Quang Đông. (2015), Nghiên cứu chất lượng và một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng khối tiểu cầu, Luận văn tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội. 2. Phạm Thị Minh Đức. (2006), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội. 3. Phạm Hoàng Hộ. (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ. 4. Đỗ Tất Lợi. (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 5. Đỗ Trung Phấn. (2006), Bài giảng Huyết học - Truyền máu sau đại học, NXB Y học, Hà Nội. 6. Ngô Đức Phương, Nguyễn Duy Như, và Nguyễn Duy Thuần. (2015). Bổ sung một loài cây thuốc mới - Canna warszewiczii A.Dietr. - cho hệ thực vật Việt Nam. Tạp chí Dược học, 476, 20–23. 7. Nguyễn Anh Trí. (2008), Đông máu ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y học. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 8. Born G.V. (1962). Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature, 194, 927–929. 9. Cattaneo M. (2019). 14 - The Platelet P2 Receptors. Platelets (Fourth Edition). Academic Press, 259–277. 10. Cattaneo M. (2009). Light transmission aggregometry and ATP release for the diagnostic assessment of platelet function. Semin Thromb Hemost, 35(2), 158– 167. 11. Cattaneo M., Cerletti C., Harrison P. và cộng sự. (2013). Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 12. Costa A.G.V., Garcia-Diaz D.F., Jimenez P. và cộng sự. (2013). Bioactive compounds and health benefits of exotic tropical red–black berries. Journal of Functional Foods, 5(2), 539–549.
  53. 13. Do Nhat H. (2018), In vitro anti-platelet aggregation of Canna warszewiczii extracts, Bachelor Thesis, University of Science and Technology of Hanoi. 14. Estevez B. và Du X. (2017). New Concepts and Mechanisms of Platelet Activation Signaling. Physiology (Bethesda), 32(2), 162–177. 15. Faggio C., Sureda A., Morabito S. và cộng sự. (2017). Flavonoids and platelet aggregation: A brief review. Eur J Pharmacol, 807, 91–101. 16. Flaumenhaft R. và Sharda A. (2019). 19 - Platelet Secretion. Platelets (Fourth Edition). Academic Press, 349–370. 17. Gachet C. (2012). P2Y12 receptors in platelets and other hematopoietic and non-hematopoietic cells. Purinergic Signal, 8(3), 609–619. 18. Gachet C. (2015). Antiplatelet drugs: which targets for which treatments?. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13(S1), S313–S322. 19. Gachet C. và Cazenave J.P. (1991). ADP induced blood platelet activation: a review. Nouv Rev Fr Hematol, 33(5), 347–358. 20. Gremmel T., Iii A.L.F., và Michelson A.D. (2016). Platelet Physiology. Semin Thromb Hemost, 42(3), 191–204. 21. Gryka R.J., Buckley L.F., và Anderson S.M. (2017). Vorapaxar: The Current Role and Future Directions of a Novel Protease-Activated Receptor Antagonist for Risk Reduction in Atherosclerotic Disease. Drugs R D, 17(1), 65–72. 22. Gurney D. (2016). Platelet function testing: from routine to specialist testing. Br J Biomed Sci, 73(1), 10–20. 23. Hanke A.A., Roberg K., Monaca E. và cộng sự. (2010). Impact of platelet count on results obtained from multiple electrode platelet aggregometry (MultiplateTM). European Journal of Medical Research, 15(5), 214. 24. Hayward C.P.M. và Moffat K.A. (2019). 34 - Platelet Aggregation. Platelets (Fourth Edition). Academic Press, 609–626. 25. Jennings L.K. (2009). Mechanisms of platelet activation: need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis. Thromb Haemost, 102(2), 248–257. 26. Katzung B.G. và Trevor A.J. (2015), Basic & Clinical Pharmacology, Lange.
  54. 27. Kauskot A. và Hoylaerts M.F. (2012). Platelet receptors. Handb Exp Pharmacol, (210), 23–57. 28. Koltai K., Kesmarky G., Feher G. và cộng sự. (2017). Platelet Aggregometry Testing: Molecular Mechanisms, Techniques and Clinical Implications. IJMS, 18(8), 1803. 29. Koupenova M. và Ravid K. (2018). Biology of Platelet Purinergic Receptors and Implications for Platelet Heterogeneity. Front Pharmacol, 9. 30. von Kügelgen I. (2019). Pharmacology of P2Y receptors. Brain Research Bulletin, 151, 12–24. 31. Luyen L., Thom V., Huong L.T. và cộng sự. (2020). Inhibitory effect on human platelet aggregation, antioxidant activity, and phytochemicals of Canna warszewiczii (A. Dietr) Nb. tanaka. Phcog Res, 12(1), 47. 32. McFadyen J.D., Schaff M., và Peter K. (2018). Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nat Rev Cardiol, 15(3), 181– 191. 33. Müller C.E., Baqi Y., và Namasivayam V. (2020). Agonists and Antagonists for Purinergic Receptors. Methods Mol Biol, 2041, 45–64. 34. Murugappa S. và Kunapuli S.P. (2006). The role of ADP receptors in platelet function. Front Biosci, 11, 1977–1986. 35. Nguyen T.V.A., Ly H.D.T., Vu T.T. và cộng sự. (2018). Novel finding on anticoagulant activity of Canna warszewiczii extracts. Asian Journal of Pharmacognosy, 6. 36. Paniccia R., Priora R., Alessandrello Liotta A. và cộng sự. (2015). Platelet function tests: a comparative review. Vasc Health Risk Manag, 11, 133–148. 37. Patrono C., Morais J., Baigent C. và cộng sự. (2017). Antiplatelet Agents for the Treatment and Prevention of Coronary Atherothrombosis. J Am Coll Cardiol, 70(14), 1760–1776. 38. Puri R.N., Colman R.W., và Liberman M.A. (1997). ADP-lnduced Platelet Activation. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 32(6), 437–502.
  55. 39. Rendu F. và Brohard-Bohn B. (2001). The platelet release reaction: granules’ constituents, secretion and functions. Platelets, 12(5), 261–273. 40. Ruggeri Z.M. và Jackson S.P. (2013). Chapter 20 - Platelet Thrombus Formation in Flowing Blood. Platelets (Third Edition). Academic Press, 399– 423. 41. Sarikaya E. (2019). Functions of Purinergic Receptors. Receptors P1 and P2 as Targets for Drug Therapy in Humans. 42. Savage B., Cattaneo M., và Ruggeri Z.M. (2001). Mechanisms of platelet aggregation. Curr Opin Hematol, 8(5), 270–276. 43. Selvadurai M.V. và Hamilton J.R. (2018). Structure and function of the open canalicular system - the platelet’s specialized internal membrane network. Platelets, 29(4), 319–325. 44. Shin E.-K., Park H., Noh J.-Y. và cộng sự. (2017). Platelet Shape Changes and Cytoskeleton Dynamics as Novel Therapeutic Targets for Anti-Thrombotic Drugs. Biomol Ther (Seoul), 25(3), 223–230. 45. Smith S.A. và Morrissey J.H. (2019). 21 - Interactions Between Platelets and the Coagulation System. Platelets (Fourth Edition). Academic Press, 393–400. 46. Teng R. (2015). Ticagrelor: Pharmacokinetic, Pharmacodynamic and Pharmacogenetic Profile: An Update. Clin Pharmacokinet, 54(11), 1125– 1138. 47. Thomas S.G. (2019). 3 - The Structure of Resting and Activated Platelets. Platelets (Fourth Edition). Academic Press, 47–77. 48. WHO Cardiovascular diseases (CVDs). , accessed: 03/04/2020. 49. Zaragozá C., Monserrat J., Mantecón C. và cộng sự. (2016). Antiplatelet activity of flavonoid and coumarin drugs. Vascul Pharmacol, 87, 139–149. 50. Zhou L. và Schmaier A.H. (2005). Platelet Aggregation Testing in Platelet- Rich Plasma: Description of Procedures With the Aim to Develop Standards in the Field. Am J Clin Pathol, 123(2), 172–183.
  56. 51. Treatment_of_H_mophilia_2008._Platelet_Function_Disorders.pdf. , accessed: 21/03/2020.