Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)

pdf 49 trang thiennha21 18/04/2022 210
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_danh_gia_tac_dung_uc_che_enzym_acetylcholinesteras.pdf

Nội dung text: Khóa luận Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2017
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS. BÙI THANH TÙNG HÀ NỘI - 2017
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Bùi Thanh Tùng – giảng viên bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành nghiên cứu. Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô phụ trách trong các phòng thí nghiệm của Khoa. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y dược đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất, các dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn bộ thầy cô trong bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng cùng toàn thể các thầy cô Khoa Y Dược đã giúp đỡ, trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới ông bà, bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Bích Hạnh
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) ACh Acetylcholin AChE Enzym actylcholinesterase ACTI Acetylthiocholine iodid BuOH Butanol CV Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HCl Acid hydro clorid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) MeOH Methanol NXB Nhà xuất bản pH Chỉ số đo hoạt động của ion hidro (Hydrogen power) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) STT Số thứ tự TCL Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Giá trị trung bình UV Tia tử ngoại (Ultraviolet)
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng 27 Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên 28 chân gà và Berberin clorid
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) .4 Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên .7 Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE 14 Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên 20 Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 21 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro 23 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro 25 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà 29 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của Berberin clorid 29 Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH. 31 Hình 3.4. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng số ức chế Ki. 31
  7. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái 4 1.1.3. Thành phần hóa học 5 1.1.4. Bộ phận dùng 8 1.1.5. Tác dụng dược lý 8 1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 13 1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13 1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 15 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên vật liệu 19 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 19 2.1.2. Hóa chất, dung môi 19 2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 19 2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE 24 2.3. Phương pháp xử lý số liệu 25
  8. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE 27 3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE 30 3.3. Bàn luận 32 3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32 3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  9. MỞ ĐẦU Cuộc sống hiện đại ngày càng phát triển cùng với đó cũng là sự gia tăng của bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt là Alzheimer không chỉ ở người cao tuổi mà thậm chí người trẻ tuổi cũng mắc phải. Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới đã cảnh báo về mối lo ngại do bệnh này gây ra và đưa bệnh Alzheimer vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được ưu tiên [11]. Nghiên cứu cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê tại châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này có thể tăng lên đến 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng điển hình là Alzheimer. Đây được coi là căn bệnh nặng nhất trong các nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [6]. Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức và hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và xã hội. Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin. Ba nhóm thuốc này đa số là các thuốc tân dược, giá thành còn tương đối cao và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Do đó nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị Alzheimer là rất cần thiết. Acetylcholinesterase (AChE) là enzym có mặt ở khe synap của hệ thần kinh trung ương và có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin [8]. Với việc Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer vào năm 1982, AChE cũng được xác định là một trong những đích phân tử đối với bệnh này. Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng. Trong đó, phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro. Đây cũng là một hướng quan trọng và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học 1
  10. trên thế giới và trong nước, đặc biệt đối với các thuốc có nguồn gốc dược liệu [27,34]. Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên là thân rễ phơi khô của nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao, Coptis quinquesecta thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae được biết đến với nhiều công dụng như kháng khuẩn, chống virus, chống viêm Ở Việt Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) được dùng khá phổ biến trong các bài thuốc với nhiều tác dụng tốt. Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy hợp chất berberin và một số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm năng ức chế enzym AChE cao mở ra hướng mới trong điều trị bệnh Alzheimer. Nhận thấy, trong dịch chiết của Hoàng liên cũng có chứa một lượng lớn các alkaloid đặc biệt là berberin có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ - Alzheimer. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu: Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch). Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết. 2
  11. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) 1.1.1. Đặc điểm thực vật Hiện nay có rất nhiều loài Hoàng liên chân gà được đưa vào sử dụng và nghiên cứu như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta. Họ Hoàng liên: Ranunculaceae. Hoàng liên: Coptis chinensis Franch, là một cây thuốc thuộc loại quý với nhiều tác dụng được dùng trong nhiều bài thuốc ở Việt Nam. Tên khác: Hoàng liên chân gà, Xuyên liên, Phàng lình (H’Mông) [9]. Read Coptis (Anh), Coptis savoyard (Pháp) [2,9] Gia liên (Trung Quốc) [9]. Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao 10-25 cm. Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc tập trung ở gốc, lá dài và mảnh chia thành 3 thùy chính. Mép khía răng không đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lông chim, không đều. Hai thùy bên giống nhau có cuống lá ngắn hơn thùy giữa. Lá có màu xanh lục, nhẵn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ trên 1 cuống chung dài khoảng 25 cm. Hoa nhỏ có màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục. Năm lá đài có hình mác, 5 cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị. Lá noãn rời nhau khoảng 8-12 noãn. Cây ra hoa từ tháng 10-12. Quả có màu đen từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau, nhỏ, dài 6-7 cm, có cuống ngắn. Vào mùa xuân cây con, chồi có thể tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9]. 3
  12. Hình 1.1. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) 1.1.2. Phân bố, trồng trọt và thu hái  Phân bố Hoàng liên là loại cây thân thảo mọc hoang trên các đỉnh núi cao. Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh” (Trung Quốc) có viết Hoàng liên là cây thuốc quý cao cấp, được xếp vào loại thượng phẩm, cây mọc ở trên núi Thái Sơn có nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết Giang [13,14]. Ở Việt Nam, Hoàng liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở vùng núi có độ cao từ 1500 – 2000 m trong các khu rừng có nhiều cây cổ thụ rậm rạp, ở nơi nửa sáng, nửa tối. 4
  13.  Trồng trọt Ở Lào Cai, Hoàng liên mọc tại dãy Hoàng Liên Sơn (xã Tả Van, San Sả Hồ, Lao Chải), Quảng Bạ (Hà Giang) [2,9]. Hoàng liên là cây ưa chỗ ẩm mát, nhiệt độ thấp khoảng 20-250C. Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già nhưng chưa nứt vỏ. Đem quả về phơi cho nứt vỏ, chọn các hạt mập chắc rồi reo ngay tránh để lâu làm mất khả năng mọc của hạt. Nếu chưa gieo ngay cần trộn ủ hạt với đất lẫn cát ẩm. Trong vòng 1 tháng phải đem trồng nếu để lâu hạt sẽ không nảy mầm.  Thu hái Thu hái Hoàng liên thường vào cuối thu đầu đông tháng 9-10, để chất lượng dược liệu đạt cao nhất, để sang xuân chất lượng sẽ kém. Cây mọc từ 4- 5 năm có thể được thu hoạch. Hoàng liên thu hái mang về rửa sạch, phơi hay sấy khô là được [7]. 1.1.3. Thành phần hóa học Thân rễ Hoàng liên chứa hầu hết là các alkaloid (5 – 8%), trong đó chủ yếu là berberin, worenin, jatrorrhizin, palmatin, coptisin, columbamin. Ngoài ra còn có các alkaloid có nhân phenol, cũng như các alkaloid không có nhân phenol. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ tử ngoại đã được dùng để xác định berberin hydrochlorid, palmatin clorid, jatrorrhizin hydrochlorid, epiberberin, coptisin, columbamin và magnoflorin trong các mô khác nhau (như phloem (libe), xylem (chất gỗ) và medulla (lõi)) và rizhome (thân rễ) của Coptis Chinensis Franch. Kết quả cho thấy khác biệt đáng kể trong việc phân bố của 7 alkaloid trong các mô được kiểm tra, tổng hàm lượng alkaloid trong xylem tương đối thấp so với hàm lượng trong phloem, medulla và rhizome của Hoàng liên [47,48]. Berberin tinh khiết là dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy 1450C, tan nhiều trong nước ở 200C, tan trong ethanol, ít tan trong clorofom, benzen, không tan trong ether ethylic. UVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [2-4]. Hàm lượng berberin trong Hoàng liên đạt 5-6% có khi tới 9% [9]. Theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, Dược liệu phải chứa ít nhất 3,5 % beberin (C20H18NO4. HCl) và 0,5% (C21H22NO4. HCl) palmatin tính theo dược liệu khô kiệt [3]. 5
  14. Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohydrat. Hàm lượng alkaloid thay đổi tùy theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây. Ở Tứ Xuyên (Trung Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ cây ra hoa. Ngoài thân rễ, lá cũng chứa berberin, hàm lượng cao nhất ở lá già. Ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9-10. Lá già chứa 2,5 – 2,8% berberin vào tháng 7-10 [4,7,9]. Ngoài ra, trong dịch chiết EtOH của Hoàng liên còn phân lập được 13 hợp chất non-alkaloid như 7 hợp chất lignan, 3 phenylpropanoid đơn giản, 2 hợp chất flavon và 1 hợp chất phenolic acid. Đó là các hợp chất: erythro-guaiacylglycerol- 8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'- methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol, chlorogenic acid, ferulic acid, Z- octadecyl caffeat, rhamnetin, wogonin, and vanillic acid [12]. 6
  15. Công thức cấu tạo của một số alkaloid phân lập từ thân rễ Hoàng Liên thể hiện ở hình 1.2. Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên 7
  16. 1.1.4. Bộ phận dùng Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng 0,2 - 0,5 cm. Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân gà nên được gọi là Hoàng liên chân gà. Mặt ngoài màu nâu mang vết tích của rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng. Phần gỗ màu vàng tươi, vị rất đắng lưu vị lâu trong miệng [2,7,9]. 1.1.5. Tác dụng dược lý  Tác dụng kháng khuẩn Dịch chiết Hoàng liên và hoạt chất berberin đều có phổ kháng khuẩn rất rộng. Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng sau: Nồng độ 1:5120 có tác dụng với Shigella shiga; nồng độ 1: 2560 có tác dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1: 1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus [4,9]. Dung dịch berberin clohydrat được pha loãng tiến hành phản ứng in vitro cho thấy: nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae; nồng độ 1:16000 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:8000 có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans [1,4,9]. Tiêm tĩnh mạch trên chó với berberin clohydrat liều lượng 19mg/kg đã cứu sống được con vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm gây ra bởi Staphylococcus aureus [1,9]. Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1]. Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn. Các chất vitamin B6, nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin. Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các bệnh liên quan đến các chủng tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực trùng lỵ, nhưng đối với bài thuốc có Hoàng liên như bài “Hoàng liên giải độc thang” thì không có hiện tượng kháng thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn lại mạnh hơn [7,9]. Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền với enzym ADN topoisomerase I ở động vật có vú. Nghiên cứu cho thấy rằng 8
  17. hai tiền chất epiberberin và gloenlandicin của berberin là những tiểu phân hoạt động có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I; song 2 alkaloid này lại không phân tách AND qua trung gian topoisomerase II. Chỉ có tiền chất berberrubin (alkaloid loại protoberberin) là chất đặc hiệu phân tách ADN qua trung gian topoisomerase II in vitro. Những kết quả này cho thấy alkaloid gốc berberin là nhóm hợp chất có khả năng tạo phức không bền với topoisomerase I và II [30].  Tác dụng kháng virus Dịch chiết nước Hoàng liên thí nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế sự phát triển của virus cúm chủng PR8 [1]. Palmatine có trong Hoàng liên có khả năng ức chế không cạnh tranh enzym protease NS2B-NS3 của virus West Nile (WNV), với IC50 là 96 µM, không gây độc tính tế bào. Hơn nữa, palmatin cũng có thể ức chế virus dengue và virus sốt vàng theo các liều lượng. Hợp chất này có thể được phát triển để điều trị các nhiễm trùng do virus [21].  Tác dụng kháng nấm, đơn bào gây bệnh Hoàng liên có tác dụng kháng một số loài nấm gây bênh ngoài da với dịch chiết nước từ dược liệu này pha loãng 1:30 đã chứng tỏ tác dụng. Quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng độ 1:5000 cho chuột nhắt trắng đã được gây nhiễm amip uống với liều lượng 50 mg/kg có tác dụng ức chế sinh trưởng của amip gây bệnh. Dịch chiết Hoàng liên cho thấy tác dụng chống đơn bào Trypanosoma cruzi gây bệnh Chagas với IC50 khá thấp là 1,7 µg/ml; và không gây độc cho tế bào [36].  Tác dụng trên đường tiêu hóa Hoàng liên có tác dụng chống loét đường tiêu hóa. Nghiên cứu cho chuột cống trắng uống dich chiết alkaloid của Hoàng liên có tác dụng ức chế nhẹ loét dạ dày thực nghiệm do stress. Bằng đường tiêm dưới da trên chuột cống trắng berberin có tác dụng ức chế hình thành vết loét và hiện tượng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [9]. Dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày từ đó kích thích tiêu hóa, có lợi cho đường tiêu hóa [4,7]. 9
  18. Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch chiết Hoàng bá (Cortex Phellodendri). Tác dụng ức chế enzym urease tiết ra bởi H.pylori và urease của đậu jack của dịch Hoàng liên cao hơn Hoàng bá và berberin (với giá trị IC50 nhỏ hơn hẳn). Sự ức chế không cạnh tranh của Coptis chinensis Franch có sự tương quan nồng độ và thời gian, có khả năng giải ức chế bằng glutathion được cho là do sự tương tác của các hợp chất trong dịch chiết với nhóm sulfhydryl của vị trí hoạt động trên enzym urease [32,51].  Tác dụng chống viêm Coptisin, thành phần chính của Coptis chinensis Franch, đã cho thấy khả năng ức chế mạnh sản xuất oxit nitơ (NO) bằng cách ức chế protein và các biểu hiện mARN của enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS) trong lipopolysaccharid (LPS) kích thích các đại thực bào RAW 264.7. Coptisin cũng ức chế sản xuất các cytokin gây viêm là interleukin-1β (IL-1β) và interleukin-6 (IL-6) bằng cách ức chế sự biểu hiện mARN của cytokin; đồng thời ức chế sự thoái hoá của protein ức chế nhân tố nhân κBα (IκBα) và phosphoryl hóa yếu tố điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), c-Jun NH2- terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), và phosphoinositide 3-kinase/Akt (PI3K/Akt). Coptisin cũng ức chế sự xuất hiện của TNF-α và NO trong các mô viêm ở chuột thí nghiệm. Các kết quả này cho thấy coptisin trong Hoàng liên ức chế sự viêm LPS bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt yết tố nhân κB, MAPK và PI3K / Akt trong các đại thực bào có tác dụng chống viêm đặc hiệu [19,45]. Dịch chiết thân rễ Coptis chinensis Franch kích hoạt tế bào MOLT-4, Th1, MAPK giúp tăng cường miễn dịch trong viêm, đóng vai trò như các chất bổ trợ, bổ sung để điều trị trong suy giảm hệ thống miễn dịch [20].  Tác dụng chống oxy hóa Dịch chiết ethanol hoa cây Hoàng liên cho thấy khả năng làm tăng lượng superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathion (GSH) trong tế bào giúp trung hòa các gốc tự do có tác dụng chống oxy hóa mạnh cả in vitro và in vivo [46]. 10
  19. Jatrorrhizin chứng tỏ khả năng chống oxy hóa do độc tính của hydrogen peroxid gây ra ở tế bào não chuột thí nghiệm [39].  Tác dụng trên tim, hạ huyết áp Tiêm dưới da dịch chiết nước của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột cống trắng [1]. Thành phần palmatin và coptisin trong dịch chiết Hoàng liên có tác dụng bảo vệ và giảm tổn thương tế bào cơ tim thông qua việc làm bền vững ty thể màng, giảm kích thước vùng bị nhồi máu, giải phóng malondialdehyd (MDA), tăng superoxid dismutase (SOD) [28,49,52].  Tác dụng phòng xơ vữa động mạch, giảm béo phì Trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng cholesterol cao, dịch chiết nước Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác dụng làm cho tỷ lệ cholesterol toàn phần/lipid trở về giá trị bình thường [4,9,24]. Berberin trong dịch chiết Hoàng liên có khả năng làm tăng sự biểu hiện của enzym adipose triglycerid lipase (ATGL) và hormone-sensitive lipase (HSL) đẩy nhanh quá trình phân giải triacylglycerol (TG) ở mô mỡ, có tác dụng đáng kể trong giảm béo phì [16,29]. Trong dịch chiết Hoàng liên chứa Jatrorrhizin hydrochlorid (JH) được nghiên cứu có khả năng ức chế hình thành lipid và tăng cường oxy hóa lipid trong gan chuột thí nghiệm [43].  Tác dụng hạ đường huyết Dịch chiết Hoàng liên làm giảm khả năng kháng insullin của tế bào trong mô hình chuột Wistar bị đái tháo đường týp II gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo và tiêm streptozotocin thông qua con đường ức chế c-Jun N terminal kinase [24,37].  Tác dụng trên hệ thần kinh Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hoàng liên cũng có tác dụng an thần, chống trầm cảm, stress, tác dụng tốt trên hệ thần kinh. Berberin, jatrorhizin và palmatin được phân lập từ dịch chiết MetOH của Hoàng liên Coptis chinensis 11
  20. Franch có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase- enzym xúc tác quá trình phân hủy chất dẫn truyền thần kinh monoamin). Jatrorrhizin ức chế không cạnh tranh MAO-A và B ở ty thể của tế bào não chuột với giá trị IC50 lần lượt là 4 và 62 µM. Berberin chỉ ức chế cạnh tranh với giá trị IC50 là 126 µM. Trong khi palmatin không có khả năng ức chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39]. Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro và in vivo ở bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridin)[41]. Trong mô hình gây stress oxy hóa tế bào thần kinh bằng tert- butylhydroperoxid (t-BOOH), dịch chiết nước Hoàng liên nồng độ 100 µg/ml cho thấy khả năng tăng sự sống sót của tế bào, giảm tỷ lệ tế bào tự chết theo chương trình (apoptosis) và tăng hoạt lực của ty thể trêng màng; tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh [40]. Hiện nay có một số nghiên cứu mới chứng minh tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của dịch chiết toàn phần Hoàng liên in vitro cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ và tiến tới điều trị bệnh Alzheimer [17,26].  Tác dụng chống ung thư Hoạt chất berberin phân lập từ chiết xuất Hoàng liên cho thấy tác dụng chống ung thư trên đích tác dụng ephrin-B2, ức chế tế bào khối u ZR-75-30 phát triển và dự di căn của chúng [43]. Trong nghiên cứu trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt in vitro, berberin cho thấy tác dụng ức chế sự ra tăng tế bào ưng thư thông qua khả năng kích thích quá trình tế bào tự chết theo chương trình apoptosis hoặc ngừng chu trình tế bào bằng cách ức chế tín hiệu của yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR (epidermal growth factor receptor) [50]. Trong thành phần dịch chiết Hoàng liên chứa jatrorrhizin hydrochlorid có tác dụng chống u ác tính trên da do có khả năng ức chế tăng sinh tân mạch máu ở tế bào u ác tính di căn ở tế bào người C8161 in vitro [35].  Độc tính Berberin ít độc. Trên người uống một lần 2 g, chưa phát hiện có triệu chứng ngộ độc [1]. Bài tiết rất nhanh, một phần qua nước tiểu, một phần bị 12
  21. chuyển hóa trong cơ thể [7]. Hiện chưa có nghiên cứu chứng minh độc tính của Hoàng liên chân gà lên cơ thể người. 1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 1.2.1. Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 1.2.1.1. Acetylcholin Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh. Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8,11]. Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33]. 1.2.1.2. Enzym Acetylcholinesterase AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa, 13
  22. vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [27]. Những vị trí hoạt động này của AChE được minh họa ở hình 1.3. Hình 1.3. Các vị trí hoạt động của enzym AChE AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [23]. 1.2.1.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [8,27]. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và 14
  23. thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [15,33]. 1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới. Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một lượng lớn các mẫu thử. Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Phương pháp thử in vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó. Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B. 1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB).  Phương pháp đo quang Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961[18,33]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm. Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, 15
  24. nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng.  Phương pháp sắc ký lớp mỏng Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]. Một trong những hạn chế của phương pháp TLC là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả. 1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp này để sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).  Phương pháp đo quang Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [7]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó, không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác 16
  25. dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [15]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch cơ chất.  Phương pháp sắc ký lớp mỏng Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp TLC để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [15]. Cũng giống phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp TLC sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch α- naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả. Bên cạnh 2 phương pháp được trình bày ở trên, phương pháp điện di mao quản cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu của Tang Z. M. (2007) [38]. Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là bởi phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp. Ngoài ra, hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc. Như vậy, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) có chứa một lượng cao các alkaloid đặc biệt là berberin cho thấy tác dụng khả quan trên enzym AChE để tiến tới điều trị các bênh thần kinh sa sút trí tuệ rất đáng quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về tác dụng tiềm năng này của Hoàng liên còn khá ít trong khi nhu cầu về thuốc điều trị và dự phòng bệnh Alzheimer càng tăng. Đây cũng là cơ sở khoa học để hình thành ý tưởng của đề tài này. 17
  26. Với mục tiêu nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên, phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được lựa chọn để áp dụng trong nghiên cứu đề tài khóa luận. 18
  27. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Thân rễ phơi khô của cây Hoàng liên chân gà thu hái vào tháng 8 năm 2016 ở Hà Giang. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.2. Hóa chất, dung môi - Hóa chất: AChE (mã số EC 3.1.1.7) (Sigma, Singapore) - Acetylthiocholine (ACTI) (Sigma, Singapore) - Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma, Singapore) - Tris-HCl và berberin clorid chuẩn (Sigma, Singapore) - HCl (Merck). - Dung môi: n-Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol, Ethanol (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất; Methanol (MeOH) (Merck). 2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ - Hệ thống máy cô quay - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis (Mỹ). - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ). - Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg. - Dụng cụ thủy tinh: các loại cốc có mỏ dung tích 25-100 ml; bình cầu dung tích 1500 ml, pipet chính xác, bình định mức và các thiết bị dụng cụ cần thiết khác. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE  Phương pháp chiết xuất phân đoạn dịch chiết Để đánh giá tác dụng ức chế AChE, đầu tiên, tiến hành chiết xuất dược liệu thân rễ Hoàng liên khô thu bằng ethanol (EtOH) được dịch EtOH chứa các thành phần alkaloid [48]. Dịch chiết này sau đó được chiết lần lượt bằng các dung môi n-Hexan, Ethyl acetat và n-Buthanol thu được các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dược liệu để tiến hành thử hoạt tính. Quá trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.1. 19
  28. Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên  Cách tiếp cận Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay. Nguyên tắc của phương pháp như sau [18]: Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE. Phương trình phản ứng được trình bày ở hình 2.2. 20
  29. Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman Đã có nhiều nghiên cứu sàng lọc áp dụng hướng thực hiện này tuy nhiên mỗi nghiên cứu đều có những điều chỉnh phù hợp với điều kiện nghiên cứu về: Nồng độ dung dịch cơ chất ACTI, nồng độ thuốc thử DTNB, hoạt độ của AChE, thời gian ủ,  Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro Tiến hành pha đệm natri phosphat pH = 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử, mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm. Quy trình thực nghiệm tiến hành như sau: Cách pha đệm natri phosphat pH=8 - Dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: 27,8g NaH2PO4 trong 500ml nước cất (dung dịch a). - Dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: 53,05g Na2HPO4 .7H2O trong 500ml nước cất (dung dịch b). - Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất định mức trong bình định mức 1000ml. - Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M. 21
  30. Cách pha enzym AChE, cơ chất, thuốc thử. - Enzym: Cân chính xác 1mg bột AChE (mã số EC 3.1.1.7) tương ứng với 265 đơn vị (265 IU) pha trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl tạo thành dung dịch 5 IU/ml, từ dung dịch này pha loãng 20 lần thu được dung dịch enzym nồng độ 0,25 IU/ml sử dụng cho phương pháp đo quang. - Cơ chất: cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ACTI) pha trong 25ml nước cất tạo thành dung dịch có nồng độ 20mM, từ dung dịch đó pha loãng 8 lần thu được dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM. - Thuốc thử: Cân 0,1982g thuốc thử DTNB pha trong 25ml dung dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM. Cách pha các dải nồng độ dung dịch mẫu thử và mẫu đối chứng - Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác 10mg cắn của 4 phân đoạn dịch chiết EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH của Hoàng liên chân gà như đã chuẩn bị trong mục chiết xuất (3.1), hòa tan hoàn toàn trong 10ml MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch có nồng độ 1mg/ml pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và 7,8125 µg/ml. - Dung dịch đối chứng: Cân chính xác 1 mg berberin clorid hòa tan trong 2ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 500 µg/ml; từ dung dịch này pha loãng thành các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,1 µg/ml và 0,05 µg/ml.  Cách tiến hành Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm natri phosphat pH=8, dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng và dung dịch enzym vào cuvet 1 cm. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ACTI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 250C, sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412nm. Mỗi thử nghiệm được lặp đi lặp lại 3 lần. Quy trình thử nghiệm được tóm tắt ở hình 2.3. 22
  31. Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức: Ac - At %I = Ac - Ao × 100 Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 100µl dung dịch thử) At: độ hấp thu của mẫu thử Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1000 µL dung dịch đệm natri phosphat) Từ giá trị I% xác định được, tiến hành tính giá trị IC50 (nồng độ của mẫu ức chế 50% hoạt tính enzym) của từng mẫu thử như sau: - Pha 1 dãy nồng độ của mẫu thử, xác định I% của từng nồng độ mẫu thử đó. - Với những mẫu thử có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị I% và nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.x + b, trong đó, y là giá trị % tác dụng ức chế enzym và x là nồng độ mẫu thử. 23
  32. - Với những mẫu không có sự tương quan tuyến tính giữa I% và nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.log(x) + b. - Thay giá trị y = 50% vào phương trình tuyến tính mới xây dựng được từ đó tính được giá trị của nồng độ x. Giá trị tìm được này chính là giá trị IC50. Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin clorid được sử dụng làm mẫu chứng dương. Hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng ức chế AChE khá mạnh được sử dụng làm mẫu chứng dương trong nhiều nghiên cứu [17,26]. 2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE Từ mẫu cắn đã được lựa chọn trên kết quả khảo sát trước về tác dụng ức chế AChE in vtro, tiếp tục tiến hành đánh giá động học ức chế AChE với phân đoạn dịch chiết này ở các nồng độ gần sát giá trị nồng độ ức chế IC50 để nghiên cứu động học ức chế. Cách pha nồng độ mẫu thử Cân chính xác 1mg cắn n-BuOH của dịch chiết Hoàng liên chân gà hòa tan trong 1 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Dung dịch này được dùng để pha loãng thành các dung dịch thử có nồng độ 5 µg/ml; 10 µg/ml; và 15 µg/ml. Cách pha nồng độ cơ chất Cân chính xác 9,90 mg ACTI (M = 289,18) pha trong 1370 ml nước cất; thu được dung dịch cơ chất nồng độ 25 mM. Từ dung dịch này tiến hành pha loãng thành các dung dịch cơ chất có nồng độ 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; và 1,25 µg/ml để tiến hành nghiên cứu. - Mẫu có nồng độ ức chế AChE IC50 thấp nhất sẽ được tiếp tục pha thêm dải nồng độ gần với nồng độ IC50 đo được để tiếp tục đánh giá. - Dung dịch cơ chất ACTI cũng được pha thành các nồng độ khác nhau để khảo sát. - Tiến hành phản ứng như trên với từng nồng độ mẫu thử và nồng độ cơ chất ACTI đã pha. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. - Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym. 24
  33. - Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ nhất] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon - Dixon plot). Quá trình tiến hành thí nghiệm được tóm tắt trong hình 2.4. Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro 2.3. Phương pháp xử lý số liệu - Số liệu thực nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp thống kê thường dùng trong sinh học với sự trợ giúp của phần mềm SigmaPlot 12 (Systat Software Inc, Mỹ). - Kết quả nghiên cứu được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn, ký hiệu: ± SD. Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức: - Độ lặp lại của thí nghiệm được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và được tính như sau: 25
  34. - So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t- student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. 26
  35. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE Thân rễ khô Hoàng liên được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50oC, thái nhỏ. 50 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) được chiết với 500ml dung môi EtOH 90o bằng phương pháp siêu âm ngấm kiệt; chiết lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết và lọc qua giấy lọc; tiến hành cô quay chân không dịch chiết trong bình cầu 1,5 lít và thu được 9 g cắn ethanol. Hòa cắn với khoảng 100 ml nước cất ấm rồi khuấy đều. Thêm khoảng 100ml dung môi n-Hexan, khuấy đều hỗn hợp trong phễu trong thời gian 20 phút. Để yên cho dung môi phân lớp. Gạn lấy lớp dung môi n-Hexan. Lớp nước trong bình được thêm tiếp 100ml n-Hexan. Tiến hành lặp lại 3 lần. Sau đó thu dịch chiết n-Hexan tiến hành cô quay thu cắn. Tiếp theo, tiến hành lần lượt tương tự với dung môi Ethyl acetat (EtOAc) và n-BuOH. Mỗi dung môi 100 ml lặp lại 3 lần. Cắn từ dịch chiết n-Hexan 2,3 (g); EtOAc 3,2 (g); n-BuOH 3,5 (g) được bảo quản để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro như sau: Thành phần hỗn hợp phản ứng được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu Mẫu trắng STT Thành phần (µl) của mẫu chứng của mẫu thử (µl) dương chứng (µl) dương (µl) 1 Đệm natri phosphat 700 800 700 800 pH=8 2 Mẫu thử 100 100 0 0 3 Berberin clorid 0 0 100 100 4 AChE 0,25 IU/ml 100 0 100 0 5 DTNB 2,5 mM 50 50 50 50 6 ACTI 2,5 mM 50 50 50 50 Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000 27
  36.  Tiến hành đo quang theo phương pháp đo quang Ellman Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphate (pH = 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều trong cuvet 1 cm và đem ủ 15 phút tại 25 0C. Các dịch chiết được thử và chất chuẩn dương (Berberin chlorid) được hòa tan trong methanol. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2,5 mM và 50 µl ACTI 2,5 mM và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 25 0C. Sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.  Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE Kết quả tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà và berberin clorid được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.1, hình 3.2. Bảng 3.2. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên chân gà và Berberin clorid Mẫu thử IC50 (µg/ml) EtOH 15,62 ± 0,26 n- hexan 57,86 ± 0,86 EtOAc 105,83 ± 1,95 n-BuOH 10,44 ± 0,16 Berberin clorid 0,282 ± 0,03 28
  37. 100 80 60 AChE chế 40 Ức n-hexan EtOAc % % 20 n-BuOH EtOH 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Log (Nồng độ) (μg/ml) Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết được tính dựa vào đồ thị và chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml. 110 100 90 80 AChE 70 chế 60 Ức % % 50 • Berberin clorid 40 30 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 Log (Nồng độ) (µg/mL) Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của Berberin clorid Giá trị IC50 Berberin clorid được tính dựa vào đồ thị và chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml. 29
  38. Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy tất cả 4 mẫu cắn đều có tác dụng ức chế AChE ở mức độ khác nhau. Tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp nhất với IC50 là 105,83 ± 1,95 µg/ml và hoạt tính này còn yếu hơn cả hoạt tính của mẫu căn toàn phần trong EtOH. Phân đoạn dịch chiết n- BuOH và dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất với IC50 là 10,44 ± 0,16 và 15,62 ± 0,26 µg/ml. Tiếp đó là phân đoạn n- Hexan có tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 là 57,86 ± 0,86 µg/ml. Tuy nhiên, hoạt tính của 2 phân đoạn n-BuOH và EtOH vẫn còn yếu hơn hoạt tính của chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 là 0,282 ± 0,03 µg/ml. Với tác dụng ức chế mạnh nhất AChE ở nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu động học. Hình 3.1 và 3.2 thể hiện mối tương quan giữa giá trị Log của nồng độ mẫu thử và Berberin clorid so với phần trăm tác dụng ức chế enzym AChE. 3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE  Tiến hành đánh giá động học ức chế AchE Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây với một chút thay đổi cho phù hợp với phòng thí nghiệm. Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH (0; 5 ; 10 và 15 μg/ml) và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2.5 mM và 50 µl với các nồng độ khác nhau của cơ chất ACTI (5; 2,5; 1,25 mM) và trộn đều. Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch được ở bước sóng 412 nm trong vòng 5 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk plot) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon plot).  Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro Đồ thị Lineweaver–Burk mô tả động học ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Hình 3.3 cho thấy kiểu ức chế là kiểu ức chế hỗn hợp 30
  39. (trong đồ thị Lineweaver–Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km). Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục ox của 3 đường trên đồ thị Dixon, được vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH2D xác Graph định 1 bởi hình 3.4. 120 100 (abs/min) 80 ứng 60 phản Y Data Y độ 40 Tốc 1/ 20 0 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 X Data -1 1/[ACTI] mM Hình 3.3. Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Kí hiệu:Col ●: 1 vs0; Col o: 2 5; ▼: 10; ∆: 15 µg/mL phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Col 1 vs Col 3 Nồng độ cơ chColất 1ACTI vs Col 4 được sử dụng là 5; 2,5; 1,25mM 2D Graph 2 Col 1 vs Col 5 Plot 1 Regr 140 120 (abs/min) 100 ứng 80 phản 60 Y Data Y độ 40 Tốc 1/ 20 0 -10 -5 0 5 10 15 20 X Data Nồng độ phân đoạn n-BuOH (mM) Col 1 vs Col 2 Hình 3.4. ĐColồ 1th vsị ColDixon 3 cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng Col 1 vs Col 4 Plot 1 Regr số ức chế Ki. Kí hiệu: ● : 1,25; o : 2,5; ▼: 5 mM ACTI. Nồng độ phân đoạn n- BuOH được sử dụng là 0; 5; 10; 15 µg/ml. 31
  40. Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của 3 đường. Nhận xét: Từ hình 3.4 cho ta thấy giá trị Ki được xác định theo đồ thị hình là 8,36 ± 0,05 µg/ml. Kiểu ức chế AChE của phân đoạn n-BuOH là kiểu ức chế hỗn hợp. Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng và Vmax giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng. 3.3. Bàn luận Bệnh Alzheimer là một bệnh thần kinh di truyền, mất trí nhớ, nguyên nhân của bệnh chưa rõ nhưng dẫn chứng cho thấy chuyển hóa não rối loạn dẫn đến β-amyloid protein tạo nên xốp não [22]. Enzym Acetylcholinesterase chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer quan sát có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh [22]. Giả thuyết hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer có vai trò quan trọng quá trình nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, các chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh. Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) là cây dược liệu quý chứa nhiều hợp chất cấu trúc alkaloid chủ yếu là berberin, worenin, coptisin, palmatin [47,48] với nhiều tác dụng chống vi khuẩn, virus, chống viêm, chống ung thư và đặc biệt tác dụng trên hệ thần kinh. Dựa trên một số nghiên cứu sàng lọc gần đây cho thấy hợp chất berberin thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro. Hơn nữa, thành phần dịch chiết Hoàng liên chân gà đã được xác định chứa berberin và một số alkaloid khác có tiềm năng ức chế AChE cần được nghiên cứu làm rõ. 3.3.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)  Về kết quả chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Trong nghiên cứu khóa luận này, dược liệu Hoàng liên chân gà được chiết xuất bằng dung môi EtOH rồi tiếp tục chiết phân đoạn với các dung môi n-Hexan, EtOAc và n-BuOH. Các dịch chiết phân đoạn được cô thành cắn 32
  41. (EtOH 9 g; n-Hexan 2,3 g; EtOAc 3,2 g và n-BuOH 3,5 g) được dùng để đánh giá các tác dụng trên enzym AChE in vitro.  Về phương pháp đánh giá sàng lọc in vitro Phương pháp in vitro được lựa chọn bởi ưu điểm của nó là cho kết quả nhanh, tiến hành đồng thời được nhiều mẫu và ít tốn kém. Đồng thời, qua thu thập tài liệu cho thấy, hầu hết các nghiên cứu liên quan ức chế AChE đều sử dụng phương pháp đo quang của Ellman với cách tiến hành và đòi hỏi điều kiẹn phòng thí nghiệm đơn giản, cho kết quả đáng tin cậy hơn các phương pháp Fast Blue B. Vì vây, nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương pháp đo quang Ellman để đánh giá với sự thay đổi một và yếu tố để phù hợp hơn với điều kiện nghiên cứu.  Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Đánh giá tác dụng ức chế của 4 dịch chiết phân đoạn của Hoàng liên chân gà cho thấy tất cả các phân đoạn dịch chiết này đều thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE, kết quả này phù hợp với kết quả một số nghiên cứu trước đây của Hengqiang Zhaoa và cộng sự [26]; và Dorothea Kaufmann và cộng sự [17]. Tuy nhiên, mức độ ức chế của các phân đoạn dịch chiết rất khác nhau với các giá trị IC50 thay đổi từ 10,44-105,83 µg/ml. So với chất đối chứng dương là berberin clorid, tác dụng ức chế của 4 phân đoạn dịch chiết yếu hơn khoảng từ 37-375 lần. Trong các phân đoạn dịch chiết nghiên cứu đánh giá, phân đoạn dịch chiết n-Butanol cho thấy tác dụng ức chế mạnh nhất; phân đoạn dịch chiết Ethyl acetat cho tác dụng ức chế yếu nhất. Phân đoạn n- BuOH của dịch chiết Hoàng liên được sử dụng để đánh giá đặc điểm động học ức chế tiếp theo. 3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. Động học ức chế enzym AChE của dịch chiết từ Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) chưa từng được công bố trước đây. Động học ức chế enzym AChE thể hiện qua đồ thị Lineweaver–Burk cho thấy hệ số góc = Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km. Giá trị Ki được xác định theo đồ thị là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của 3 đường trên đồ thị Dixon, được vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH xác định được là 8,36 ± 0,05 µg/ml. 33
  42. Từ đồ thị cho thấy, kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu, vì dược liệu có chứa các hợp chất có nhiều con đường tác dụng khác nhau [25]. Cơ chế ức chế cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH có thể cạnh tranh với ACTI để gắn vào vị trí liên kết cơ chất của AChE hoặc có thể liên kết vào vị trí khác vị trí liên kết cơ chất của AChE. Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng và Vmax giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng. Mặc dù kết quả nghiên cứu của khóa luận không tìm ra được hợp chất nào sở hữu tác dụng ức chế AChE của từng phân đoạn dịch chiết, tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành đánh giá tác dụng ức chế AChE của cả 4 phân đoạn dịch chiết EtOH; n-Hexan; EtOAC và n-BuOH của Hoàng liên chân gà. Đồng thời, đặc điểm động học ức chế AChE cũng được nghiên cứu chỉ ra kiểu ức chế hỗn hợp của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. Vì vậy, kết quả của khóa luận cũng đã góp phần bổ sung những thông tin cho cơ sở dữ liệu về những loại cây có tác dụng ức chế AChE nói chung. Cơ sở dữ liệu này là căn cứ cho những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất tinh khiết có tác dụng đặc hiệu ức chế AChE của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ứng dụng trong hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh về thần kinh trong tương lai. 34
  43. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã thu được những kết quả như sau: - Đã chiết xuất phân lập được các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch): EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH. - Đã đánh giá được tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên: + Phương pháp đo quang Ellman được sử dụng + Các phân đoạn dịch chiết được khảo sát ở các nồng độ 1000 µg/ml; 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và 7,8125 µg/ml có so sánh đối chứng với mẫu berberin clorid chuẩn. + Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 là 10,44 ± 0,16 µg/ml. - Đã đánh giá được đặc điểm động học ức chế AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH của Hoàng liên chân gà. + Kiểu ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên là kiểu ức chế hỗn hợp với hằng số Ki tìm được là 8,36 ± 0,05 µg/ml. ĐỀ XUẤT - Tiếp tục nghiên cứu tinh chế các hợp chất tinh khiết trong các phân đoạn dịch chiết của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch). - Thử tác dụng ức chế AChE của các chất phân lập được. - Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE của Hoàng liên in vivo và nghiên cứu lâm sàng. 35
  44. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) đến thành phần hóa học và tác dụng sinh học”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 2. Bộ Khoa học và Công nghệ (1996), Sách Đỏ Việt Nam. Phần thực vật (Red data book of Việt Nam volum 2 plants), NXB Khoa Học Kĩ Thuật,100. 3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam, NXB Hà Nội. 4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học,565. 5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325. 6. Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bản Y học. 7. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,189. 8. Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(1):69-71. 9. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kĩ Thuật,497. TIẾNG ANH 10. Adsersen A., Gauguin B. và Gudiksen L. et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of ethnopharmacology, 104:418-422. 11. Alzheimer's A. (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures", Alzheimer's & Dementia, 8(2): 131-168. 12. Chen L, Wang L, Zhang Q, Zhang S, Ye W (2012), “Non-alkaloid chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, May;37(9):1241-4. 13. Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity of some Asian medical plants used in dermatological disorders”, Fitoterapia (Milano),72(3):221-229.
  45. 14. Department of pharmacy, National University of Singapore (1993), “Displacement of bilirubin from albumin by berberin”, Biol-Neonate, 63(4):201-8. 15. Di Giovanni S., Borloz A. và Urbain A. et al (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, European journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119. 16. Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang, Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9;15(1):214. 17. Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s Disease Target”, Molecules, Aug 31;21(9). 18. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”, Biochemical pharmacology,(7):88-95. 19. Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan, Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping Song (2014), “Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebula) Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In Vivo”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014:510157. 20. Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis chinensis Franch. extract up-regulate type I helper T-cell cytokine through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 2;189:126-31. 21. Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification of palmatine as an inhibitor of West Nile virus”, Archives of Virology, Aug; 155(8):1325-9.
  46. 22. Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK. (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress", Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2): 137-147. 23. George T Grossberg (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer’s Disease: Getting On and Staying On”, Current Therapeutic Research, 64:216-235. 24. Hang Ma, Yinran Hu, Zongyao Zou, Min Feng, Xiaoli Ye, Xuegang Li (2016), “Antihyperglycemia and Antihyperlipidemia Effect of Protoberberine Alkaloids From Rhizoma Coptidis in HepG2 Cell and Diabetic KK-Ay Mice”, Drug Development Research, Jun;77(4):163-70. 25. Hawkins, K.I. and C.E. Knittle (1972), "Comparison of Acetylcholinesterase determinations by the Michel and Ellman methods". Analytical chemistry 44(2): p. 416-417. 26. Hengqiang Zhaoa, , Siduo Zhoua, Minmin Zhang, Jinhong Feng, Shanshan Wang, Daijie Wang, Yanling Geng, Xiao Wang (2016), “An in vitro AChE inhibition assay combined with UF-HPLC-ESI-Q- TOF/MS approach for screening and characterizing of AChE inhibitors from roots of Coptis chinensis Franch”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Feb 20;120:235-40. 27. H. P. J., Ren Y. và Howes M. J. (2005,) “Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi” Natural product report. 28. Hui-Li Tan, Kok-Gan Chan, Priyia Pusparajah, Acharaporn Duangjai et al (2016), “Rhizoma Coptidis: A Potential Cardiovascular Protective Agent”, Frontiers on Pharmacology, Oct 7;7:362. 29. Jae Sue Choi, Ji-Hye Kim, Md. Yousof Ali, Hee Jin Jung, Byung-Sun Min, Ran Joo Choi, Gun-Do Kim, Hyun Ah Jun (2015), “Anti- adipogenic effect of epiberberine is mediated by regulation of the Raf/MEK1/2/ERK1/2 and AMPKα/Akt pathways”, Archives of Pharmacal Research, Dec;38(12):2153-62. 30. Kobayashi Y, Yamashita Y et al (1995), “Inhibitors of DNA topoisomerase I and II isolated from the Coptis rhizome”, Planta Med., Oct; 61(5):414-8.
  47. 31. Kong LD, Cheng CH, Tan RX (2001), “Monoamine oxidase inhibitors from rhizoma of Coptis chinensis”, Planta Med., Feb;67(1):74-6. 32. Li C, Xie J et al (2016), “Comparison of Helicobacter pylori Urease Inhibition by Rhizoma Coptidis, Cortex Phellodendri and Berberin: Mechanisms of Interaction with the Sulfhydyl Group”, Planta Med., Mar;82(4):305-11. 33. Liang Peng, Zhengxing Rong, Hao Wang, Biyun Shao, Lei Kang, Hong Qi, Hongzhuan Chen (2017), “A novel assay to determine Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease”, Biomedical Chromatography, Mar 10. 34. Ma X., Tan C. và Zhu D. et al (2007), “Huperzine A from Huperzia species - An ethnopharmacological review”, Journal of ethnopharmacology, 113. 35. Ruifang Liu, Zhifei Cao et al (2013), “Jatrorrhizine hydrochloride inhibits the proliferation and neovascularization of C8161 metastatic melanoma cells”, Anticancer Drugs, Aug;24(7):667-76. 36. Schinella GR et al (2002), “Inhibition of Trypanosoma cruzi growth by medical plant extracts”, Dec;73(7-8):569-75. 37. Shuang Jiang, Yahong Wang, Dayong Ren et al (2015), “Antidiabetic mechanism of Coptis chinensis polysaccharide through its antioxidant property involving the JNK pathway”, Pharmaceutical Biology, Jun;53(7):1022-9. 38. Tang Z. M., Wang Z. Y, Kang J. W. (2007), “Screening of Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis, (28):360-365. 39. Tao Luo, Xiuyin Shen, Sheng Li, Ting Ouyang, Huaqiao Wang (2016), “The Protective Effect of Jatrorrhizine against Oxidative Stress in Primary Rat Cortical Neurons”, CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, Jun 10. 40. Thomas Friedmann, Bejamin Otto et al (2014), “Coptis chinensis Franch. exhibits neuroprotective properties against oxidative stress in
  48. human neuroblastoma cells”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 8;155(1):607-15. 41. Thomas Friedmann, Yue Ying, Weigang Wang (2016), “Neuroprotective Effect of Coptis chinensis in MPP+ and MPTP-Induced Parkison’s Disease Models”,The American Journal of Chinese Medicine, 44(5):907- 25. 42. Van Asperen K. (1962), “A study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric method”. J. Ins. Physiol, 8, 401-416. 43. Weina Ma, Man Zhu, Dongdong Zhang, Liu Yang, Tianfeng Yang, Xin Li, Yanmin Zhang (2017), “Berberine inhibits the proliferation and migration of breast cancer ZR-75-30 cells by targeting Ephrin-B2”, Phytomedicine, Feb 15; 25:45-51. 44. Weiwei Yang, Liping She, Kun Yu, Shan Yan, Xuefeng Zhang, Xiaoyi Tian, Shuren Ma, Xiwen Zhang (2016), “Jatrorrhizine hydrochloride attenuates hyperlipidemia in a high-fat diet-induced obesity mouse model”, Molecular Medicine Reports, Oct;14(4):3277-84. 45. Wu J, Zhang H, Hu B et al (2016), “Coptisine from Coptis chinensis inhibits production of inflammatory mediators in lipolysaccharide- stimulated RAW 264.7 murine macrophage cells”, European Journal of Pharmacology, Jun 5;780:106-14. 46. Xiaoquan Ban, Bo Huang, Jingsheng He et al (2011), “In vitro and In vivo Antioxidant Properties of Extracts from Coptis chinensis Inflorescence”, Plant Foods of Human Nutrition, Jun;66(2):175-80. 47. Xiumei Lv, Yan Li, Ce Tang, Yi Zhang, Jing Zhang & Gang Fan (2016), “Integration of HPLC-based fingerprint and quantitative analyses for differentiating botanical species and geographical growing origins of Rhizoma Coptidis”, Pharmaceutical Biology, Dec;54(12):3264-3271. 48. Yanfang Yang, Jingling Peng et al (2017), “Determination of Alkaloid Contents in Various Tissues of Coptis Chinensis Franch. By Reversed Phase-High Performance Lipuid Chromatography and Ultraviolet Spectrophotometry”, Journal of Chromatographic Science, 55(5):556- 563.
  49. 49. Yuan Yue, Lili Dou, Xin Wang, Hui Xue, Yanhong Song, Xiaoni Li (2015), “Screening β1AR inhibitors by cell membrane chromatography and offline UPLC/MS method for protecting myocardial ischemia”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Nov 10;115:339- 44. 50. Zheng‑ Hua Huang, Hong‑ Fang Zheng, Wei‑ Lu Wang, Yong Wang, Long‑ Fei Zhong, Jiu‑ Long Wu, Qiao‑ Xing Li (2014), “Berberine targets epidermal growth factor receptor signaling to suppress prostate cancer proliferation in vitro”, Molecular Medicine Reports, Mar;11(3):2125-8. 51. Zhou JT, Li CL, Tan LH, Xu YF, Liu YH, Mo ZZ, Dou YX, Su R, Su ZR, Huang P, Xie JH (2017), “Inhibition of Helicobacter pylori and Its Associated Urease by Palmatine: Investigation on the Potential Mechanism”, PloS One, Jan 3;12(1):0168944. 52. Zhu Qin-Wei, Li Yong-Guang (2016), “Berberine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by suppressing the activation of PI3K/AKT signaling”, Experimental and Therapeutic Medicine, Mar;11(3):978-984.