›

Khóa luận Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann)

pdf 56 trang thiennha21 18/04/2022 3591
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_chiet_xuat_phan_lap_mot_so_hop_chat_trong_la_tra_h.pdf

Nội dung text: Khóa luận Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng cúc phương (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ THƠM CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ TRÀ HOA VÀNG CÚC PHƯƠNG (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ THƠM CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ TRÀ HOA VÀNG CÚC PHƯƠNG (Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHĨA : QHY. 2014 NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS. VŨ ĐỨC LỢI PGS. TS. ĐỖ THỊ HÀ HÀ NỘI 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện khĩa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ các thầy cơ Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, các anh chị của Khoa Hĩa Thực vật – Viện Dược liệu, cùng bạn bè và người thân. Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Đức Lợi – Chủ nhiệm Bộ mơn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, PGS. TS. Đỗ Thị Hà, Khoa Hĩa Thực Vật - Viện Dược liệu đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện và hồn thành khĩa luận này. Em xin chân thành cảm ơn tới ThS. Phạm Thị Thúy và các anh chị chuyên viên của Phịng Hĩa Thực vật II - Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ dạy em trong quá trình thực hiện và hồn thành khĩa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cơ giảng viên trong Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thân trong gia đình, bạn bè đã truyền dạy kiến thức, kỹ năng, đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong 5 năm học tại trường. Cuối cùng, em xin kính chúc các thầy cơ luơn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành cơng trong cuộc sống, luơn giữ vững được nhiệt huyết trên con đường truyền đạt tri thức của mình! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Thơm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Về thực vật 2 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và lồi Camellia cucphuongensis 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L. 2 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của lồi Camellia cucphuongensis 3 1.2. Thành phần hĩa học 8 1.2.1. Thành phần hĩa học của chi Camellia 8 1.2.1.1. Nhĩm polyphenol 8 1.2.1.2. Nhĩm saponin 9 1.2.1.3. Nhĩm polysaccarit 9 1.2.1.4. Nhĩm sterol và tinh dầu 9 1.2.1.5. Nhĩm acid amin và vitamin 10 1.2.2. Thành phần hĩa học của các lồi Trà hoa vàng 10 1.2.2.1. Nhĩm polyphenol 10 1.2.2.2. Nhĩm saponin 12 1.2.2.3. Nhĩm tinh dầu 12 1.2.2.4. Nhĩm acid amin 13 1.3. Tác dụng sinh học 14 1.3.1. Tác dụng chống oxi hĩa 14 1.3.2. Tác dụng chống ung thư 14 1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn 15 1.3.4. Tác dụng giảm cân và làm đẹp 15 1.3.5. Tác dụng theo y học cổ truyền 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG @ PHÁPSchool NGHIÊN of CMedicineỨU and Pharmacy, 17 VNU
  5. 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Phương pháp định tính các nhĩm chất 18 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập 18 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Định tính các nhĩm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hĩa học 20 3.1.1. Định tính các nhĩm chất trong dịch chiết ether dầu hỏa 20 3.1.2. Định tính các nhĩm chất trong dịch chiết cồn 20 3.1.3. Định tính các nhĩm chất trong dịch chiết nước 23 3.1.4. Định tính các nhĩm chất khác khác 24 3.2. Chiết xuất và phân lập các chất 27 3.2.1. Chiết xuất cao tồn phần và cao phân đoạn 27 3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC1 29 3.2.3. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC5 30 3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 31 3.2.4.1. Hợp chất CC1 31 3.2.4.2. Hợp chất CC5 32 3.3. Bàn luận 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu, chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 1H-NMR Phổ proton 2 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 2,2'-Azobis (2-amidinopropan) 3 AAPH dihydrochlorid 4 CC Sắc ký cột 6 CDCl3 chloroform 7 d doublet Distortionless Enhancement by Polarization 8 DEPT Transfer 9 ESI-MS Phổ khối ion hĩa phun mù điện tử 10 FASN Fatty acid synthase 11 GABA Gamma-Aminobutyric Acid 12 IC50 Nồng độ ức chế 50% International Union of Pure and Applied 13 IUPAC Chemistry 14 LDL Lipoprotein trọng lượng phân tử thấp 15 MeOD Methanol D4 16 MIC Nồng độ ức chế tối thiểu 17 MS Phổ khối lượng phân tử 18 m/z Khối lượng/ điện tích 19 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 20 s singlet 21 SKLM Sắc ký lớp mỏng o 22 t nc Nhiệt độ nĩng chảy 23 v/v Thể tích/ thể tích @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Danh mục một số lồi Trà hoa vàng ở Việt Nam 4 - 7 Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhĩm chất cĩ trong 2 25 - 27 dược liệu Bảng 3.2 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1 3 31 và kaempferol Bảng 3.3 Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC5 4 32 - 33 và vanillin DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Một số polyphenol chính 11 2 Hình 1.2. Một số tinh dầu chính 12 3 Hình 1.3. Một số acid amin chính 13 4 Hình 2.1. Hình ảnh lá và hoa Trà hoa vàng Cúc Phương 17 5 Hình 2.2. Hình ảnh mẫu dược liệu 17 Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp chiết xuất và phân lập các 6 19 chất Hình 3.1. Sơ đồ chiết cao cồn 96% và các cao phân đoạn lá 7 28 Trà hoa vàng Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất CC1 từ phân đoạn ethyl 8 29 acetat của lá Trà hoa vàng Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất CC5 từ phân đoạn 9 30 dichloromethan của lá Trà hoa vàng 10 Hình 3.4. Cấu trúc hĩa học của hợp chất CC1 32 11 Hình 3.5 Cấu trúc hĩa học củ a@ hợ pSchool chất CC5 of Medicine and33 Pharmacy, VNU
  8. ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, vấn đề chống oxi hĩa, chống lão hĩa và chống ung thư đang là đề tài nĩng được rất nhiều người quan tâm. Một trong những xu hướng đi đầu đĩ là các sản phẩm bảo vệ sức khỏe cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên, các loại thảo dược cĩ lợi cho sức khỏe, tiểu biểu là các loại trà thuộc chi Camellia L. Từ xa xưa, trà đã là một thức uống phổ biến và được yêu thích nhờ các tác dụng cĩ lợi cho sức khỏe. Trong các lồi trà thì Trà hoa vàng là một loại trà đặc biệt quý, được mệnh danh là nữ hồng của các lồi trà. Các nghiên cứu từ y học cổ truyền phương Đơng đến các bằng chứng khoa học hiện đại đều chỉ ra các tác dụng nổi bật của Trà hoa vàng như chống oxi hĩa, chống ung thư, chống nhiễm khuẩn, hạ mỡ máu, giảm cân và làm đẹp, [44], [27], [41], [8]. Hiện nay, Việt Nam đã trở thành một trong những trung tâm phân bố với hơn 40 lồi Trà hoa vàng được cơng bố. Lồi Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann được giới lần đầu tiên trong một bài viết của Jean-Claude Rosmann vào năm 1995 trên tờ Jardins de France, Pháp, sau đĩ là đăng trên tạp chí International Camellia Journal [29]. Đây là một lồi đặc hữu của Việt Nam, được phát hiện tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước hầu như chỉ tập trung vào phát hiện và mơ tả đặc điểm hình thái của các lồi mới, trong khi các thành phần hĩa học làm nên cơng dụng giá trị của Trà hoa vàng thì vẫn chưa được tìm hiểu sâu sắc và tồn diện. Về lồi Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann, nhĩm nghiên cứu của TS. Nguyễn Đức Tùng, Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu là nghiên cứu lần đầu tiên, đã mơ tả chi tiết đặc điểm thực vật, đặc điểm sinh thái và phân lập được một số thành phần hĩa học của lồi này. Chính vì vậy, đề tài “ Chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá trà hoa vàng Cúc Phương (Camellia cucphuongensis) ” - là một phần của nghiên cứu trên, đã được thực hiện với các mục tiêu: 1. Định tính một số nhĩm chất hữu cơ trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương. 2. Chiết tách, phân lập 1- 2 hợp chất từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương. 3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  9. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Về thực vật 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. và lồi Camellia cucphuongensis Vị trí của chi Camellia L. trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) [39] như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Trà (Theales) Họ: Trà ( Theaceae) Chi: Trà (Camellia) Lồi Camellia cucphuongensis: Tên khoa học: Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann. Tên Việt Nam: Trà hoa vàng Cúc Phương. 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Camellia L. Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh, cành nhẵn hay cĩ lơng. Lá thường cĩ cuống; đơn, mọc cách, khơng cĩ lá kèm, kích thước lá thay đổi, dài từ vài cm đến 45 cm; chất lá thường dạng da, dày mỏng khác nhau, ít khi chất màng mỏng; chĩp lá nhọn, cĩ đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuơi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, trịn hay hình tim; mép lá cĩ răng cưa nhọn hay tù. Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-5 hoa ở nách lá hoặc đỉnh cành. Hoa màu đỏ, trắng hay màu vàng. Cuống hoa ngắn hoặc gần như khơng. Lá bắc 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa, tồn tại hoặc sớm rụng. Lá đài thường 5 phiến, tồn tại hoặc sớm rụng. Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vịng nhị ngồi. Nhị nhiều, những nhị ngồi thường dính nhau thành cái chén hay ống ở phía gốc; vịng nhị phía trong rời nhau; chỉ nhị dài. Bầu trên, 1-5 ơ; vịi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau ở mức độ khác nhau, bầu và vịi nhụy nhẵn hay phủ lơng mịn. Quả nang hình cầu, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khơ chẻ ơ từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; cĩ trụ quả hay khơng; vỏ quả dày hay mỏng, hố gỗ. Hạt thường 1 đến nhiều @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  10. hạt trong mỗi ơ, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm; vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lơng hay nhẵn [3]. Cĩ khoảng 280 lồi, phân bố chủ yếu ở Nhiệt đới và Á nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Vệt Nam, Thổ Nhĩ Kì, Brazil, Australia, Ở Việt Nam đã bắt gặp 58 lồi Camellia [3], trong đĩ cĩ hơn 40 lồi cĩ hoa màu vàng, tập trung ở khu vực phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, ) và phía Nam ở một số tỉnh như Lâm Đồng, Đồng Nai, ( xem bảng 1.1) 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của lồi Camellia cucphuongensis Cây gỗ nhỏ, cao 3 - 6 m. Cành già màu nâu đậm, sần sùi. Lá cĩ cuống ngắn, dài 2,5 mm, cĩ lơng. Lá thuơn dài hoặc hình elip, dài 6-12 cm, rộng 2,7 – 4,5 cm, mỏng, gốc lá trịn nhẵn. Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành, đường kính khi nở 4,5 – 5 cm; cuống hoa nhẵn, dài 5 – 7 mm; lá bắc 5 – 6 lá, hình trứng, dài 2 – 5 mm; lá đài 8 – 9 lá, dài 0,4 – 1 cm, cĩ lơng. Cĩ 13 – 15 cánh hoa, hình trứng, dài 1,8 – 2,3 cm, rộng 1,5 cm, đầu trịn, mặt dưới cĩ lơng. Nhị hoa dài 0,8 – 2,4 cm, chỉ nhị rời, cĩ lơng. Nỗn cĩ 5 ơ, cĩ 5 vịi nhụy, rời, dài khoảng 1,3 cm. Quả hình cầu, dài 3,9 cm, đường kính 3,8 cm, màu đen gỗ khi khơ, quả cĩ 5 ơ với 6 – 8 hạt trong mỗi ơ, hạt hình nêm dài 1,2 – 1,4 cm [29]. Mùa hoa kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau [2]. Lồi này ưa ẩm mọc trong các thung lũng của rừng nhiệt đới ở độ cao 300- 400 m (khu vực gần hồ Mạc thuộc Vườn Quốc gia Cúc Phương) [2]. Đây là lồi đặc hữu, được phát hiện tại Vườn quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình bởi Jean-Claude Rosmann và Tiến sĩ Trần Ninh của Khoa Thực vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội [29]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  11. Bảng 1.1. Danh mục một số lồi Trà hoa vàng ở Việt Nam STT Tên lồi Tên thường gọi Phân bố TLTK 1 Camellia aurea Hung T. Chang Trà hoa vàng kim Lạng Sơn [31] Camellia bugiamapensis Orel, Curry, Vườn quốc gia Bù Gia Mập, Bình 2 Trà bù gia mập [31] Luu & Q.D Phước 3 Camellia capitata Orel Trà đầu Vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng [14] 4 Camellia cattienensis Orel Trà Cát Tiên Vườn Quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng [34] Quảng Ninh; Quế Phong, Nghệ An; Tam Đảo, Vĩnh Phúc; Ninh Bình; Đà 5 Camellia chrysantha (Hu) Tuyama Trà hoa vàng [3] Lạt; Tuyên Quang; Ba Vì,Hà Nội; Vĩnh 4 Cửu, Đồng Nai. Camellia cucphuongensis Ninh & Trà hoa vàng Cúc Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh 6 [29] Rosmann Phương Bình Camellia crassiphylla Ninh & 7 Trà vàng lá dày Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] Hakoda Camellia dalatensis V.D.Luong, 8 Trà mi Đà Lạt Đà Lạt, Lâm Đồng [30] Ninh & Hakoda 9 Camellia dilinhensis Tran & Luong Trà mi Di Linh Di Linh, Lâm Đồng [31] 10 Camellia dongnaiensis Orel Trà hoa vàng Đồng Đồng Nai [31] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  12. Nai Hồi Xuân, Thanh Hĩa; Nghệ An; 11 Camellia dormoyana (Pierre) Sealy Trà vàng đo-mơi Quảng Trị; Lâm Đồng; Tây Ninh; Biên [31] Hịa, Đồng Nai, Phú Quốc, Kiên Giang. Sơn Động, Bắc Giang; Ba Chẽ, Quảng 12 Camellia euphlebia Merr.ex Sealy Trà gân [31] Ninh; Lạng Sơn Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh 13 Camellia flava (Pitard) Sealy Trà hoa vàng nhạt [31] Bình; Hịa Bình; Nghệ An 14 Camellia fleuryi (A.Chev) Sealy Chè sốp Diên Khánh, Khánh Hịa; Vĩnh Phúc [31] 5 15 Camellia gilberti (A.Chev) Sealy Trà vàng Ginbec Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] 16 Camellia hakodae Ninh.T Trà vàng Hakoda Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] Trà vàng nhiều 17 Camellia hirsuta Hakoda. Ninh Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] lơng Trà hoa vàng Hàm 18 Camellia hamyenensis M.Sealy Hàm Yên, Tuyên Quang [31] Yên Camellia hatinhensis Luong, Tran & 19 Vũ Quang, Hà Tĩnh [26] L. T. Nguyen Camellia huulungensis Rosmann & Trà hoa vàng Hữu 20 Hữu Lũng, Lạng Sơn [31] Ninh Lũng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  13. 21 Camellia indochinensis Merr Lạng Sơn [31] Camellia inusitata Orel, Curry & Vườn quốc gia Biduop-Núi Bà, Lâm 22 Trà mi cánh dẹt [35] Luu Đồng 23 Camellia kirinoi Ninh Trà hoa vàng Kiri Lạng Sơn [31] Camellia limonia C.F.Liang & Trà hoa vàng da 24 Lạng Sơn [31] S.L.Mo cam Camellia luteopallida Luong, 25 Trà hoa vàng trắng Lạng Sơn [33] T.Q.T.Nguyen, Luu 26 Camellia luongii Tran et Le Thái Nguyên [31] 6 Camellia megasepala Hung T.Chang Trà hoa vàng Ba 27 Tuyên Quang, Bắc Cạn [31] & Trin Ninh Bể 28 Camellia murauchii Ninh & Hakoda Trà hoa vàng Murơ Lạng Sơn [31] 29 Camellia ninhii Luong & Le Lâm Đồng [15] Camellia oconoriana Orel, Curry & 30 Trà âu-con-nơ Lâm Đồng [36] Luu 31 Camellia petelotii (Merr) Sealy Trà vàng petelo Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] 32 Camellia phanii Hakoda & Ninh Trà vàng phan Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] Camellia quephongensis Hakoda et Trà hoa vàng Quế 33 Quế Phong, Nghệ An [31] Ninh Phong @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  14. Trà hoa vàng Yên 34 Camellia rosmannii Ninh Yên Tử, Quảng Ninh [31] Tử Camellia sonthaiensis Luu, Luong, 35 Trà Sơn Thái Sơn Thái, Khánh Hịa [31] Q.D.Nhuyen & T.Q.T.Nguyet Camellia tamdaoensis Hakoda & Trà hoa vàng Tam 36 Tam Đảo, Vĩnh Phúc [3] Ninh Đảo Camellia thanxaensa Hakoda et 37 Thái Nguyên [31] Kirino Hải đường hoa 38 Camellia tienii Ninh.T Tam Đảo, Vĩnh Phúc [31] 7 vàng Camellia thuongiana Luong, Anna 39 Trà mi Thưởng Đạ Huoai, Lâm Đồng [14] Le & Lau Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen- Trà hoa vàng Bắc 40 Ba Vì, Hà Nội [31] Stuart bộ Camellia vuquangensis Luong, Tran 41 Vũ Quang, Hà Tĩnh [26] & L. T. Nguyen 42 Camellia vidalii Rosmann Lâm Đồng [31] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  15. 1.2. Thành phần hĩa học Hiện nay trên thế giới đã cĩ nhiều nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần hĩa học của các lồi hay gặp thuộc chi Camellia L, đặc biệt là trà xanh. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã thực hiện về thành phần hĩa học của các lồi Trà hoa vàng cho thấy cĩ điểm khác biệt với trà xanh thơng thường. Các nghiên cứu đã xác định thành phần của Trà hoa vàng thuộc 13 nhĩm chất khác nhau, trong đĩ các thành phần quan trọng nhất liên quan đến các nhĩm chất polyphenol, flavonoid, tanin, saponin, đường khử tự do, acid amin, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các nguyên tố vi lượng [10], [44]. 1.2.1. Thành phần hĩa học của chi Camellia L. 1.2.1.1. Nhĩm polyphenol Thành phần hĩa học của chi Camellia rất đa dạng, các alcaloid purin và polyphenol là các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học chính trong trà, được báo cáo rộng rãi là đĩng vai trị quan trọng trong việc giảm nguy cơ mắc bệnh [46]. Các alcaloid purin chính trong trà bao gồm caffein (1), theobromin (2), theophylin (3) và theacrin (4) [4], [5], [48], [49]. Các hợp chất phenolic là axit gallic và tám loại catechin tự nhiên bao gồm (+) - catechin (C) (5), (-)-epicatechin (EC) (6), (-)-gallocatechin (GC) (7), (-)- epigallocatechin (EGC) (8), (-)-catechin gallat (CG) (9), (-)-gallocatechin gallat (GCG) (10), (-)-epicatechin gallat (ECG) (11) và (-)-epigallocatechin gallat (EGCG) (12) [47]. Nghiên cứu năm 2016 của Wang Xin đã phân lập được 17 loại flavonol là (- )-epicatechin-3-O-(Z)-coumarat (13), (-)-epicatechin-3-O-(E)-coumarat (14), (-)- epicatechin-3-O-(E)-caffeat (15), (+)-catechin (5), ampelopsin (16), (-)-epicatechin (6) , (-)-epiafzelechin (17), (-)-epicatechin-3-O-gallat (11), (-)-epiafzelechin-3-O- gallat (18), (+)-catechin-3-O-gallat (9), (+)-epiafzelechin-3-O-gallat (19), epicatechin- 3-O-p-hydroxybenzoat (20), (-)-epigallo-catechin (8), (-)-gallocatechin (7), (-)-epigallo-catechin-3-O-gallat (12), (+)-gallocatechin-3-O-gallat (10) và (-)- epicatechin-3-O- (3”-O-methyl)-gallat (21) [42]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  16. 1.2.1.2. Nhĩm saponin Cho đến nay, chỉ cĩ saponin triterpenoid pentacyclic được báo cáo phát hiện từ chi Camellia, và hầu hết chúng là các saponin triterpenoid loại oleanane. Các nghiên cứu đã phân lập được 188 hợp chất saponin từ rễ, thân, lá, hoa và hạt của các lồi thuộc chi Camellia. Trong đĩ cĩ 87 saponin từ C. sinensis; 33 từ C. japonica; 24 từ C. sinensis var. assamica; 37 từ C. oleifera và 7 từ C. sasanqua [18]. Một nghiên cứu năm 2018 trên các bộ phận của sáu lồi gồm C. sinensis, C. sinensis var. assamica, C. oleifera, C. japonica và C. sasanqua cho kết quả các nhĩm saponin chính là camelliasaponin (22); theasaponin (23); assamsaponin (24); teaseedsaponin (25); oleiferasaponin (26); floratheasaponin (27); camelliosid (28); chakasaponin (29); yuchasaponin (30); jegosaponin (31); sasanquasaponin (32); sanchakasaponin (33); maetenosid (34); ternstoemiasid (35); oleiferosid (36); camelliaolean (37); [12]. 1.2.1.3. Nhĩm polysaccarit Polysaccarit trong trà (TPS) là một polysacarit cĩ tính axit liên kết với protein khơng chứa tinh bột, chứa 44,2% đường trung tính, 43,1% axit uronic và 3,5% protein . Thành phần carbohydrate của TPS bao gồm glucose (Glc), galactose (Gal), arabinose (Ara), rhamnose (Rha), xyloza (Xyl), mannose (Man), ribose (Rib) và axit glucuronic. TPS cĩ thể được chia thành polysacarit trung tính (NTPS) và polysacarit axit (ATPS). Đường và axit uronic cĩ nhiều trong TPS. NTPS chứa 82,7% đường, 12,9 % axit uronic, trong khi ATPS chứa 85,5% đường, 39,8% axit uronic. Thành phần đường trong NTPS chủ yếu là Gal (67,6%), trong khi Rha, Ara, Gal thường nằm trong ATPS. Axit nucleic cũng được phát hiện trong ATPS. TPS từ một số nguồn trà cũng mang các nguyên tố đất hiếm (REE) bao gồm La, Ce và Nd, trong đĩ La chiếm hơn 75% tổng số REE. Sắt, magiê, kẽm và selen cũng được phát hiện trong TPS [28]. 1.2.1.4. Nhĩm sterol và tinh dầu Dầu từ hạt của các lồi trà đã được biết đến từ lâu, với thành phần chính là sterol và acid béo. Theo một nghiên cứu của Wang Xin và cộng sự năm 2017 cĩ thể thấy rằng C. sinensis và các lồi khác cĩ thành phần sterol như sau: các loại dầu C. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  17. sinensis cĩ hàm lượng tương đối cao của canophyllol (38), 24-methylenecycloartan- 3-ol (39), spinasterol (40) và (-)sitosterol (41); dầu C. oleifera cĩ hàm lượng tương đối cao của (-)amyrin (42) và stigmast-7-en-3-ol (43); các loại dầu C. chekiangoleosa cĩ hàm lượng tương đối cao của betulin (44), 24- methylenecycloartan-3-ol (45), amyrin (46) và stigmast-7-en-3-ol (47). Trong khi đĩ lupanol (48) và obtusifoliol (49) chỉ được phát hiện trong dầu C. magnocarpa từ Quảng Châu - Ngơ Châu, Trung Quốc [43]. 1.2.1.5. Nhĩm acid amin và vitamin Các lồi thuộc chi Camellia cũng chứa nhiều vitamin, đặc biệt là vitamin C, mang lại tác dụng giải nhiệt và chống oxi hĩa của trà [38]. Trong khi đĩ, theanin (29) là axit amin đặc trưng và chính trong trà [25]. 1.2.2. Thành phần hĩa học của các lồi Trà hoa vàng 1.2.2.1. Nhĩm polyphenol Nhĩm polyphenol được coi là nhĩm chất quan trọng nhất trong Trà hoa vàng do các tác dụng sinh học nổi bật của chúng. Nghiên cứu năm 2013 của Jia-Ni Lin và cộng sự trên 6 lồi Trà hoa vàng là Camellia murauchii, Camellia impressinervis, Camellia euphlebia, Camellia tunghinensis, Camellia nitidissima var. microcarpa và Camellia nitidissima đã phát hiện 8 loại catechin là (-)-epigallocatechin gallat (EGCG) (12), (-)-epigallocatechin (EGC) (8), (-)-epicatechin gallat (ECG) (11), (-)-epicatechin (EC) (6), (+)-catechin (C) (5), (-)-gallocatechin (GC) (7), (-)-gallocatechin gallat (GCG) (10), (-)-catechin gallat (CG) (9) [44]. Bên cạnh đĩ, các flavonol như quercetin (50), kaempferol (51), myricitin (52) và các glycosid của chúng như myricetin-3-glucosid (53), kaempferol-3- glucosid (54), quercetin-3- hamnoglucosid (55), cũng được tìm thấy, trong đĩ flavonol glycosid chiếm 2 đến 3% chất rắn chiết xuất tan trong nước của trà [13], [27], [41], [44]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  18. OH OH OH OH HO O HO O OH OH O OH HO O OH OH OH O OH OH OH OH OH (-) – Epicatechin galltat Catechin (5) (-) – Epigallocatechin (8) (11) OH OH OH OH HO O HO O HO O OH O OH OH O OH O OH O OH OH OH O O OH OH OH OH (-) – Epigallocatechin gallat Kaempferol-3-glucosid Kaempferol (51) (12) (54) OH OH OH OH HO O OH OH OH HO O HO O O OH OH O OH OH OH O OH O OH O OH OH OH Myricitin (52) Myricetin-3-glucosid (53) Quercetin (50) Hình 1.1. Một số polyphenol chính @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  19. 1.2.2.2. Nhĩm saponin Các saponin (triterpenoid saponin) là nhĩm chất được tìm thấy từ tất cả các bộ phận của cây, trong đĩ bộ phận phân lập được nhiều nhất là hạt. Các saponin đại diện như camelliasid A, B (19); [12]. 1.2.2.3. Nhĩm tinh dầu Từ lồi C. nitidissima, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 56 chất tinh dầu từ lá và 34 chất từ hoa. Các tinh dầu chính là linalool (56), phytol (57), cis-geranyl aceton (58), n-hexanal (59), methyl salicylat (60), eudesmol (61), [41]. CH3 CH3 H3C CH3 CH3 H OH O CH3 CH3 CH2 CH3 Eudesmol (61) cis-Geranyl aceton (58) O CH OH O 3 H3C N O OH Methyl salicylat (60) n-Hexanal (59) HO CH3 CH2 H3C CH3 Linalool (56) Hình 1.2. Một số tinh dầu chính @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  20. 1.2.2.4. Nhĩm acid amin Cũng trong nghiên cứu của Jia-Ni Lin và cộng sự đã phát hiện các acid amin trong 6 lồi trà hoa vàng như GABA (62), theanin (63), Arg (64), Glu (65), Tyr (66), Trp (67), Thr (68), [27]. GABA (Gamma-Aminobutyric Acid) (62) là một dẫn truyền thần kinh quan trọng với hoạt động chính trong hệ thống thần kinh trung ương của động vật cĩ vú. Trong nghiên cứu này, C. euphlebia cĩ hàm lượng GABA cao nhất trong số sáu lồi [27]. Theanin (63) là một axit amin tự do được tìm thấy độc quyền trong cây trà. Nĩ là một thành phần chính chịu trách nhiệm cho vị ngọt và hương vị umami của trà, đồng thời sở hữu một số tác dụng dược lý. Kết quả nghiên cứu cho thấy C. nitidissima var. microcarpa cĩ hàm lượng theanin cao nhất trong số sáu lồi được nghiên cứu [27]. O O O O H2N N OH N OH H H NH2 NH2 GABA (62) Theanin (63) O O O HO OH OH NH NH2 2 HO Glu (65) Tyr (66) O OH O OH H3C OH NH2 N NH2 H Trp (67) Thr (68) Hình 1.3. Một số acid amin chính @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  21. 1.3. Tác dụng sinh học 1.3.1. Tác dụng chống oxi hĩa Các nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hĩa của các lồi thuộc chi Camellia, đặc biệt là trà xanh đã được thực hiện từ lâu, cả trong nước và quốc tế. Từ kết quả các nghiên cứu cho thấy tác dụng chống oxi hĩa của trà là do hoạt tính của các hợp chất nhĩm polyphenol, đây cũng là nhĩm chất đặc trưng của Trà hoa vàng. Nghiên cứu năm 2014 về tác dụng chống oxi hĩa của lồi Camellia chrysantha (Hu) Tuyama đã tìm thấy các chất cĩ tác dụng chống gốc tự do, theo thứ tự tác dụng là glucopyranosid > catechin > epicatechin > kaempferol > vitexin > isovitexin [44]. Một nghiên cứu năm 2017 so sánh khả năng chống gốc tự do của các catechin với các chất chống oxi hĩa khác (các flavonoid, vitamin C) cho thấy khả năng bắt các gốc tự do của catechin cao hơn các chất cùng so sánh. Trong đĩ (+)- catechin và (-)-epicatechin là những hợp chất hiệu quả nhất trong việc bảo vệ chống lại sự tan máu hồng cầu do AAPH (2,2'-Azobis (2-amidinopropan) dihydrochlorid), trong khi (-)-epicatechin gallat, (-)-epigallocatechin gallat và (-)-epigallocatechin chống tan máu do thuốc. (-)-Epigallocatechin gallat và (-)-epicatechin gallat cĩ hiệu quả nhất trong việc ức chế quá trình oxy hĩa do AAPH gây ra bởi 2'7'- dichlorodihydroflurescein cĩ trong hồng cầu [16]. Trong nghiên cứu của Wang Bing và cộng sự năm 2018 đã cho thấy tác dụng chống oxi hĩa và bắt gốc tự do của thành phần tinh dầu và chiết xuất ethanol của Camellia nitidissima. Bằng cách so sánh chỉ số IC50 của tinh dầu hoa và lá cây, chiết xuất ethanol với vitamin C trong các test DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) và ABTS (2,2’- azino-bis(3-ethylbenz -thiazoline-6-sulfonic acid), đã cho thấy tác dụng tương đương [41]. 1.3.2. Tác dụng chống ung thư Nghiên cứu năm 2016 của Małgorzata Kujawska và các cộng sự về tác dụng của chiết xuất Camellia sinensis chống lại tác nhân gây ung thư gan là N- nitrosodiethylamine (NDEA) ở chuột bằng cách sử dụng phương pháp mơ học và @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  22. sinh hĩa đã cho kết luận rằng điều trị bằng chiết xuất của lá trà cho tác dụng bảo vệ một phần gan chuột khỏi bệnh ung thư tế bào gan do NDEA gây ra [22]. Độc tính lên tế bào của trà hoa vàng đã được thử nghiệm in vitro lên tế bào ung thư vú của người MDA-MB231. Sau 48 giờ điều trị với 100−800 g / mL chiết xuất từ lá hoa trà vàng, Tỷ lệ ức chế khả năng sống của tế bào tại 800 μg / mL dao động từ khoảng 80% ở C. tunghinensis đến khoảng 25% ở C. impressinervis và C. nitidissima var. microcarpa, theo thứ tự C. tunghinensis> C. murauchii> C.euphlebia> C. nitidissima> C. nitidissima var. microcarpa> C. impressinervis [27]. FASN được xác định là đĩng một vai trị quan trọng trong quá trình tạo mỡ và ung thư tiến triển. Để làm sáng tỏ tác dụng của lá hoa Trà hoa vàng với sinh tổng hợp axit béo, một nghiên cứu đã được thực hiện . Kết quả nghiên cứu cho thấy điều trị với 400 g / mL lá hoa trà vàng C. nitidissima cĩ tác dụng ức chế tốt đối với FASN . Ức chế FASN làm suy giảm sự phát triển và tăng sinh tế bào khối u bằng một số cơ chế như ngăn chặn cung cấp năng lượng, xáo trộn chức năng màng, ức chế sao chép DNA Ngồi ra chiết xuất Trà hoa vàng cịn được chứng minh là cĩ khả năng khởi động quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư [27]. 1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn Hai vi khuẩn gram dương (S. aureus và B. subtilis) và hai vi khuẩn gram âm (E. coli và P. aeruginosa) được chọn để đánh giá các hoạt động diệt khuẩn trong in vitro của tinh dầu và chiết xuất ethanol C. nitidissima trên đĩa thạch agar lỗng. Các giá trị MIC cho thấy hiệu quả kháng khuẩn đáng kể khi so sánh với ampicillin và tobramycin, trong đĩ phần tinh dầu hiệu quả hơn với S. aureus, B.subtilis và E. coli (các giá trị MIC lần lượt là 0,625; 1,25 và 1,25 mg/mL), nhưng khơng chống lại P. aeruginosa (MIC 10,0 mg/mL). Chiết xuất ethanol của C. nitidissima thể hiện hiệu quả tốt hơn với hai chủng vi khuẩn gram dương [41]. 1.3.4. Tác dụng giảm cân và làm đẹp Nhĩm catechin (EG, EC, ECG, EGCG, ) được biết đến là nhĩm chất chính tạo nên tác dụng giảm cân và làm đẹp của trà. Một nghiên cứu về việc sử dụng catechin liều cao chiết xuất từ trà xanh trên đối tượng phụ nữ béo bụng cho thấy sau @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  23. 12 tuần điều trị mang lại hiệu quả giảm cân đáng kể, giảm chu vi vịng eo, giảm nồng độ cholesterol và LDL trong huyết tương. Bên cạnh đĩ khơng cĩ tác dụng phụ hoặc tác dụng bất lợi nào được ghi nhận. Trong đĩ, EGCG là catechin dồi dào nhất và được coi là thành phần cĩ hoạt tính sinh học cao nhất để giảm trọng lượng cơ thể, bằng cách giảm sự biệt hĩa và tăng sinh tế bào mỡ trong quá trình tạo mỡ [8]. 1.3.5. Tác dụng theo y học cổ truyền Theo cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, Trà hoa vàng được sử dụng để chữa bệnh kiết lỵ, các bệnh chốc lở [1]. Ở Trung Quốc, ngồi việc pha trà, làm cây cảnh, Trà hoa vàng được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc Trung y để điều trị chứng bệnh khác nhau, chẳng hạn như kiết lỵ, đau họng, tăng huyết áp và phịng chống ung thư [9], [17], [45]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  24. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Hình 2.1. Hình ảnh lá và hoa Trà hoa Hình 2.2. Hình ảnh mẫu dược liệu vàng Cúc Phương [2]. - Nơi thu hái: Vườn quốc gia Cúc Phương, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình, Việt Nam. - Thời điểm thu hái: 26/02/2018. Mẫu thực vật được giám định bởi Thạc sĩ Nguyễn Anh Đức, đại diện Tổ giám định mẫu, Bảo tàng Thực vật, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả cho thấy mẫu dược liệu cĩ tên khoa học là Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann, thuộc chi Camellia, họ Chè – Theaceae. Mẫu cây được lưu tại Bảo tàng Thực vật, số hiệu mẫu HNU 024061(xem phụ lục 1). 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.2.1. Dụng cụ, thiết bị, máy mĩc - Tủ sấy Memmert, Binder-FD115. - Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc cĩ mỏ, bình nĩn, ống nghiệm, đũa thuỷ tinh, pipet, bình gạn, phễu lọc, giấy lọc - Máy cơ cách thủy GFL. - Cân kỹ thuât Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR. - Đèn soi từ ngoại hai bước sĩng 254 nm và 365 nm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  25. - Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck); Sephadex LH-20 (Amersham Bioscience, Uppsala, Thụy Sỹ). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) - Sắc ký cột: các loại cột sắc ký cĩ kích cỡ khác nhau. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. 2.1.2.2. Hĩa chất, dung mơi - Dùng trong nghiên cứu thành phần hĩa học: TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Legal, dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 96%, dicloromethan, ether, acid formic, acid chlohidric, acid sulfuric, - Dung mơi hĩa chất dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 96%, n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton (Ace) đạt tiêu chuẩn tinh khiết. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp định tính các nhĩm chất Định tính sơ bộ các nhĩm chất cĩ trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương: tiến hành định tính các nhĩm chất bằng các phản ứng hĩa học đặc trưng cho từng nhĩm chất theo tài liệu. 2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập Phương pháp chiết xuất và phân lập các chất từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương được thể hiện trong sơ đồ Hình 2.3 sau đây: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  26. Lá Trà hoa vàng Cúc Phương Chiết bằng dung mơi ethanol 96% Cao chiết ethanol 96% Chiết phân đoạn bằng các dung mơi phân cực tăng dần Cao chiết phân đoạn Phân lập bằng sắc ký cột cộtcột Các phân đoạn tiềm năng Phân lập bằng sắc ký cột Phân lập 1-2 hợp chất từ các phân đoạn tiềm năng Xác định cấu trúc các hợp chất Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp chiết xuất và phân lập các chất 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã cơng bố. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  27. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Định tính các nhĩm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hĩa học 3.1.1. Định tính các nhĩm chất trong dịch chiết ether dầu hỏa Cân khoảng 10g dược liệu vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Shoxhlet. Chiết hồi lưu trên bếp cách thủy với dung mơi là ether dầu hỏa trong 3 giờ, thu được dịch lọc. 3.1.1.1. Định tính chất béo Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ khơ thấy để lại vết mờ trên giấy thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu khơng chứa chất béo. 3.1.1.2. Định tính caroten Cho 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cơ trên bếp cách thủy đến cắn. Nhỏ vào vài giọt acid sulfuric đặc; nếu thấy xuất hiện màu xanh ve thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ chứa caroten. 3.1.1.3. Định tính sterol - Phản ứng Lierbermann – Burchardt: + Thuốc thử: 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform để lạnh ở 0oC, thêm vài giọt acid sulfuric đặc. + Cách thử: lấy 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào vài giọt thuốc thử đã pha ở trên; nếu thấy xuất hiện màu xanh lục, hồng, cam , đỏ và màu bền là phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ chứa sterol. 3.1.2. Định tính các nhĩm chất trong dịch chiết cồn Cân 20g dược liệu, xay nhỏ, ngâm lạnh với ethanol 96% trong 3 ngày. Lấy 15 ml dịch chiết, pha lỗng với 20 ml ethanol 96% thu được dịch chiết cồn để làm phản ứng. 3.1.2.1. Định tính flavonoid @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  28. - Phản ứng với kiềm: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đặc. Đun nĩng trên bếp cách thủy sau vài phút nếu xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu dung dịch xuất hiện màu xanh sẫm thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. -Phản ứng Diazo hĩa: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, kiềm hĩa bằng NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ gạch. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ flavonoid. 3.1.2.2. Định tính saponin - Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2 ml nước cất. Bịt ống nghiệm bằng ngĩn tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút, để yên và quan sát. Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút. Kết quả: Phản ứng dương tính. -Phản ứng Salkowski: cho 5 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, bốc hơi đến cắn. Hịa tan cắn bằng 2 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 1 ml chloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đặc vào thành ống nghiệm. nếu mặt phân cách xuất hiện vịng màu đỏ tím, lắc nhẹ dung dịch cĩ màu đỏ thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ saponin. 3.1.2.3. Định tính coumarin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  29. - Phản ứng mở và đĩng vịng lacton: cho vào hai ống nghiệm mối ống 1 ml dịch chiết cồn. + Ống 1: Thêm 0.5 ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên. Đun sơi cả hai ống nghiệm, để nguội. Quan sát nếu cĩ hiện tượng sau thì dương tính: +Ống 1: Dung dịch cĩ tủa vàng hoặc tủa đục cĩ màu vàng. +Ống 2: Trong. Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều, thấy: +Ống 1: Trong suốt +Ống 2: Cĩ tủa đục Acid hĩa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. Kết quả: Phản ứng âm tính. Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: dược liệu khơng cĩ coumarin. 3.1.2.4. Định tính acid amin -Phản ứng ninhydrin: cho 3 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử ninhydrin 0.5%, đun sơi trong 2 phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu tím. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ chứa acid amin. 3.1.2.5 Định tính glycosid tim Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào bình nĩn, thêm vào 4 ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc bằng giấy lọc để loại tủa, thử dịch lọc vẫn cịn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. tiếp tục thử thấy dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat. Cho tồn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ với chloroform ( 3 lần, mỗi lần 5 ml), gạn lấy lớp chloroform cho vào ống nghiệm lớn khơ sạch. Loại bỏ nước bằng Na2SO4 khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung mơi trên nồi cách thủy đến khơ. Cắn cịn lại để làm các phản ứng định tính sau: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  30. - Phản ứng Baljet: hịa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 2 ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ từ từ thuốc thử Baljet mới pha, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam đậm màu hơn ống chứng 2 chỉ chứa thuốc thử thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính -Phản ứng Legal: hịa tan cắn trong 2 ml ethanol 90%, lắc kỹ. Nhỏ vào 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 1% và 2 giọt đung dịch NaOH 10%. Lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính - Phản ứng Keller – Kiliani: hịa tan cắn trong 2 ml ethanol 90%, lắc đều đến khi tan hết cắn. thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn bề mặt chất lỏng. Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vịng tím đỏ. Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên cĩ màu xanh lá. Kết quả: Phản ứng âm tính. Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: dược liệu khơng cĩ glycosid tim. 3.1.3. Định tính các hợp chất trong dịch chiết nước Cân 5g dược liệu vào bình nĩn, thêm 20 ml nước cất, đun sơi trực tiếp 5 phút. Lọc lấy dịch lọc, để nguội để làm các phản ứng. 3.1.3.1. Định tính acid hữu cơ Cho 1 ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm vài tinh thể Na2CO3. Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí. Kết quả: Phản ứng dương tính Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ acid hữu cơ. 3.1.3.2. Định tính đường khử Cho 1 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy 10 phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa. Kết quả: phản ứng dương tính. Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu cĩ chứa đường khử tự do. 3.1.3.3. Định tính tanin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  31. -Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen, xanh nâu nhạt. Kết quả: Phản ứng dương tính -Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 2 giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bơng. Kết quả: Phản ứng dương tính. -Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. Kết quả: Phản ứng dương tính. Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu chứa tanin. 3.1.4. Định tính các nhĩm chất khác 3.1.4.1. Định tính alcaloid Cho 2g bột dược liêu vào ống nghiệm lớn. Thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun cách thuỷ 30 phút. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hĩa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac 6N đến pH base (thử bằng giấy quỳ). Chiết alkaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết chloroform. Lắc dịch chiết chlorofrom với acid H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml, để làm các phản ứng sau: - Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính. Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu khơng chứa alcaloid. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  32. 3.1.4.2. Định tính anthranoid Cho vào ống nghiệm 2 g dược liệu, thêm 5ml H2SO4 1N. đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sơi. Lọc nĩng thu được dịch lọc, để nguội. Chiết với 5 ml chloroform, thu lấy phần chloroform để làm phản ứng. -Phản ứng Borntraeger: lấy 1 ml dịch chloroform cho vào một ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ thấy lớp nước cĩ màu đỏ sim thì phản ứng dương tính. Kết quả: Phản ứng âm tính Từ kết quả trên, sơ bộ kết luận: Dược liệu khơng cĩ anthranoid. Các kết quả định tính được trình bày tĩm tắt ở Bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ các nhĩm chất cĩ trong dược liệu Kết Kết STT Nhĩm chất Phản ứng định tính Hình ảnh quả luận - Khơng 1 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy Phản ứng với H2SO4 2 Caroten + Cĩ đặc Phản ứng Lierbermann 3 Sterol + Cĩ – Burchardt Phản ứng với kiềm + Cĩ 4 Flavonoid Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với dung + dịch FeCl3 5% @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  33. Phản ứng Diazo hĩa + Quan sát hiện tượng + tạo bọt 5 Saponin Cĩ Phản ứng Salkowski + Phản ứng mở và đĩng 6 Coumarin - Khơng vịng lacton 7 Acid amin Phản ứng ninhydrin + Cĩ Phản ứng Keller – - Kiliani Glycosid Phản ứng Baljet - 8 tim Khơng Phản ứng Legal - Acid hữu Phản ứng với tinh thể Cĩ 9 cơ Na2CO3 + Phản ứng với thuốc 10 Đường khử thử Fehling B + Cĩ Phản ứng với dung 11 Tanin dịch FeCl3 5% + @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  34. Phản ứng với dung dịch chì acetat 10% + Cĩ Phản ứng với dung dịch gelatin 1% + Phản ứng với thuốc thử Mayer - Phản ứng với thuốc 12 Alcaloid thử Bouchardat - Phản ứng với thuốc Khơng thử Dragendorff - 13 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Khơng 3.2. Chiết xuất và phân lập các chất 3.2.1. Chiết xuất cao tồn phần và cao phân đoạn Lá Trà hoa vàng Cúc Phương (4 kg) đã rửa sạch, phơi khơ ( hàm ẩm 12,4 %), được thái nhỏ, ngâm chiết tại nhiệt độ phịng với ethanol 96% (48h/lần x 3 lần), tỉ lệ dung mơi/dược liệu là 5:1 (l/kg). Lọc, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm thu được cao cồn 96% (CCE, 409 g). Lưu lại một phần cao cồn 96%, lượng cịn lại m = 390 g phân tán trong nước nĩng (tỉ lệ 1:1, v/v), rồi chiết lần lượt với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần là n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat, n-buthanol. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng là phân đoạn n-hexan (CCH, 100,01 g), phân đoạn dichloromethan (CCD, 38,63 g), phân đoạn ethyl acetat (CCE, 60,15 g), phân đoạn n-buthanol (CCBu, 38,70 g) và phân đoạn nước (CCW, 125,0 g). Quy trình chiết xuất cao cồn 96% và cao các phân đoạn được thể hiện ở Hình 3.1 sau đây: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  35. Dược liệu (4 kg) Chiết với ethanol 96% (24h x 20 lít x 3 lần) Dịch chiết ethanol 96% Thu hồi ethanol Cao ethanol (409 g) Phân tán 380 g cao trong 0,5 lít nước nĩng Hỗn dịch trong H2O Chiết với n-hexan Phân đoạn Phân đoạn H2O n–hexan Chiết với dichloromethan Thu hồi n-hexan Cao n–hexan Phân đoạn (100,01 g) dichloromethan Phân đoạn H2O Thu hồi dichloromethan Cao dichloromethan Chiết với ethyl acetat (38,63 g) Phân đoạn Phân đoạn Thu hồi ethyl acetat ethyl acetat H2O Cao ethyl acetat Chiết với n-buthanol (60,15 g) Phân đoạn Phân đoạn H2O n-buthanol Thu hồi n-buthanol Thu hồi H2O Cao n–buthanol (38,70 g) Cao H2O (125,0 g) Hình 3.1. Sơ đồ chiết cao cồn 96% và các cao phân đoạn lá Trà hoa vàng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  36. 3.2.2 Chiết xuất và phân lập hợp chất CC1 Từ cao phân đoạn ethyl acetat CCE (m = 50 g), tiến hành phân tách bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung mơi n-hexan:aceton (50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, v/v), kiểm tra bằng SKLM, gộp các phân đoạn cĩ sắc kí đồ giống nhau, cất loại bỏ dung mơi dưới áp suất giảm thu được 10 phân đoạn, kí hiệu lần lượt là CCE1-CCE10. Phân đoạn CCE5 (1,5 g) tiếp tục được tiến hành phân lập trên cột silica gel sử dụng hệ dung mơi rửa giải n-hexan:aceton (10:1-1:1, v/v) thu được 3 phân đoạn (CCE5.1-CCE5.3). Phân đoạn CCE5.2 (0,5 g) được tinh chế trên cột Sephadex LH- 20 sử dụng hệ dung mơi methanol-nước (2:1, v/v) để rửa giải, thu được hợp chất CC1 (10,0 mg). Quy trình phân lập hợp chất CC1 từ phân đoạn ethyl acetat của lá Trà hoa vàng được tĩm tắt ở Hình 3.2 như sau: Cao phân đoạn ethyl acetat CCE (50 g) CC, Silica gel, H:A (50:1-1:5, v/v) CCE1- CCE5 CCE6- CCE8 CCE9 CCE10 CCE4 (1,5 g) CCE7 CC, Silica gel, H:A (10:1-1:1,v/v) CCE5.2 CCE5.1 (0,2 g) CCE5.3 CC, Sephadex LH-20, M-W (2:1, v/v) CC1 (10 mg) Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất CC1 từ phân đoạn ethyl acetat của lá Trà hoa @ vàng School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  37. 3.2.3. Chiết xuất và phân lập hợp chất CC5 Từ cao phân đoạn dichloromethan CCD (m = 38,63 g), tiến hành phân tách bằng sắc kí cột pha thường, rửa giải với hệ dung mơi dichloromethan : methanol (100:0, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:2, v/v), kiểm tra bằng SKLM, gộp các phân đoạn cĩ sắc kí đồ giống nhau, cất loại bỏ dung mơi dưới áp suất giảm thu được 13 phân đoạn, kí hiệu lần lượt là CCD1-CCD13. Phân đoạn CCE3 (0,75 g) tiếp tục được tiến hành phân lập trên cột silica gel sử dụng hệ dung mơi rửa giải n – hexan : ethyl acetat (8:2, v/v) thu được 3 phân đoạn (CCD3.1-CCD3.3). Phân đoạn CCD3B (0,46 mg ) được tinh chế bằng SKLM sử dụng hệ dung mơi dichloromethan : methanol (8:2, v/v), thu được hợp chất CC5 (17,0 mg). Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn dichloromethan của lá Trà hoa vàng được tĩm tắt ở Hình 3.3 như sau: Cao phân đoạn dichloromethan CCD (38,63 g) CC, Silica gel, D:M (100:0-1:2, v/v) CCD CCD3 CCD CCE8 CCE CCE12 CCE13 1-2 (0,75 g) 4-7 9-11 CC, Silica gel, H:E (8:2, v/v) CCD3.1 CCD3.2 CCD3.3 (0,46 mg) mg) TLC, D:M (8:2, v/v) CC5 (17 mg) Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất CC5 từ phân đoạn dichloromethan @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  38. 3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 3.2.4.1. Hợp chất CC1 o o Chất rắn màu vàng; t nc: 277 - 279 C; Phổ ESI-MS m/z: 287 [M+H]+; Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD); Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD): Xem bảng 3.2. Bảng 3.2. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1 và kaempferol [23] Vị CC1 (MeOD) Kaempferol (MeOD) trí 13C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR (125 MHz) (500MHz) (75 MHz) (300MHz) 2 148,1 146,3 3 137,1 135,2 4 177,4 175,2 5 160,5 160,4 6 99,3 6,20 (1H, d, 2,0 Hz) 98,4 6,19 (1H, d, 1,8 Hz) 7 162,5 163,7 8 94,5 6,40 (1H, d, 2,0 Hz) 93,8 6,43 (1H, d, 1,8 Hz) 9 158,2 156,7 10 104,6 103,1 1′ 123,7 122,1 2′ 130,7 8,09 (1H, d, 8,5 Hz) 129,4 8,09 (1H, d, 8,7 Hz) 3′ 116,3 6,92 (1H, d, 8,5 Hz) 115,3 6,91 (1H, d, 8,7 Hz) 4′ 165,6 158,7 5′ 116,3 6,92 (1H, d, 8,5 Hz) 115,3 6,91 (1H, d, 8,7 Hz) 6′ 130,7 8,09 (1H, d, 8,5 Hz) 129,4 8,09 (1H, d, 8,7 Hz) Biện luận cấu trúc: Phổ 1H-NMR của CC1 cho các tín hiệu proton đặc trưng của khung kaempferol. Tín hiêụ doublet tại H 6,20 (1H, d) và 6,40 (1H, d) với hằng số tương tác J = 2,0 Hz đặc trưng cho các proton @tại ví School trí C-6 và Cof-8 thuMedicineộc vịng A và andtín Pharmacy, VNU 31
  39. hiêụ doublet của các proton taị H 8,09 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) và 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) thuơc̣ vòng B. Phở 13C-NMR của CC1 xuất hiêṇ tiń hiêụ của 15 nguyên tử carbon, trong đĩ cĩ 14 tín hiệu carbon thơm (C từ 94,5-165,6 ppm), 1 tín hiệu carbon carbonyl (C=O). Phổ khối ESI-MS của CC1 cho pic m/z 287,2 [M+H]+ phù hợp với cơng thức phân tử là C15H10O6 (M = 286). Từ kết quả phân tích phổ 1D-NMR, MS, kết hợp với so sánh tài liệu [23] cĩ thể kết luận chất hợp chất CC1 là kaempferol cĩ cấu trúc như Hình 3.4. 3' OH 2' 8 HO 9 O 2 5' 6' 6 10 3 5 OH OH O Hình 3.4. Cấu trúc hĩa học của hợp chất CC1 3.2.4.2. Hợp chất CC5 Hợp chất CC5: dạng bột, màu trắng, tan trong dichloromethan, methanol. 1 13 Phổ H-NMR (500 MHz, CDCl3); Phổ C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xem bảng 3.3. Bảng 3.3. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC5 và vanillin [37]. CC5 (CDCl3) Vanillin (CDCl3) Vị trí 13C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR (125 MHz) (500MHz) (125 MHz) (500MHz) 1 190,89 9,829 (1H, s) 191,0 9,78 (1H, s) 2 151,73 151,8 3 147,20 147,2 4 129,95 129,6 5 127,52 7,423 (1H) 127,4 7,40 (1H, s) 6 114,75 7,051 (1H, d, 3,5 Hz) 114,4 7,00 (1H, s) 7 108,87 7,265 (1H, s) @ School108,8 of Medicine7,37 (1H and, s) Pharmacy, VNU 32
  40. 8 56,16 3,970 (3H, s) 55,9 3,90 (3H, s) -OH 6,39 (1H, s) Phổ 1H NMR của hợp chất CC5 ở vùng trường thấp cĩ ba tín hiệu δH 7,051 (1H; d; J= 3,5 Hz; H-6); 7,423 (1H; dd; H-5) và 7,265 (1H; s; H-7) cho thấy cĩ một proton ghép ortho và ghép meta với hai proton cịn lại. Đĩ là ba proton của vịng benzen mang ba nhĩm thế tương ứng với hệ ABX. Ngồi ra, cịn cĩ sự xuất hiện của một nhĩm aldehyd với tín hiệu proton δH 9,829 (1H, s, -CHO) và một nhĩm methoxy với tín hiệu δH 3,97 (3H, s, -OCH3). Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất CC5 cĩ tám carbon, trong đĩ cĩ một carbon carbonyl của aldehyd δC 190,89 (C-1); ba carbon nhân thơm tam cấp δC 108,87 (C- 7); 114,43 (C-6) và 127,52 (C-5); ba carbon vịng benzen tứ cấp δC 129,95 (C-4); 151,73 (C-2) và 147,20 (C-3); một carbon nhĩm methoxy δC 56,16 (-OCH3). Đối chiếu với tài liệu tham khảo [37] cĩ thể xác nhận hợp chất CC5 là vanillin (tên IUPAC: 4-hydroxy-3-methoxy benzaldehyde) cĩ cấu trúc như Hình 3.5. 5 6 1 2 4 OH 3 O 7 O CH3 8 Hình 3.5. Cấu trúc hĩa học hợp chất CC5 3.3. Bàn luận Về chiết xuất: việc ngâm chiết dược liệu trong ethanol 96% là phương pháp đơn giản, rẻ tiền, ít độc hại, tiết kiệm do cĩ thể thu hổi dung mơi để tái sử dụng. Ngâm chiết nhiều lần với lượng dung mơi lớn và thời gian dài giúp thu được lượng cao tồn phần đạt hơn 10% so với lượng dược liệu khơ. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  41. Cao tồn phần được phân tán vào nước và chiết với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần là n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat và n-buthanol thu được cao các phân đoạn tương ứng. Việc chiết giúp phân tách sơ bộ các chất theo độ phân cực của chúng, tách riêng phân đoạn cĩ nhiều chất diệp lục để thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất tinh khiết. Việc phân lập bằng sắc ký cột: cao phân đoạn được khảo sát bằng SKLM với các hệ dung mơi khác nhau, từ đĩ chọn ra hệ dung mơi tối ưu để phân lập các chất. Trong quá trình tách chất bằng sắc ký cột thu được các phân đoạn nhỏ hơn, các phân đoạn này cũng được khảo sát bằng SKLM, sau đĩ chọn các phân đoạn tiềm năng để tinh chế chất tinh khiết bằng sắc ký cột pha thường hay pha đảo. Kết quả phân lập được hai chất là kaempferol (CC1) từ phân đoạn ethyl acetat và vanillin (CC5) từ phân đoạn dichloromethan, kết quả này phù hợp với kết quả định tính các nhĩm chất đã thực hiện. Trong đĩ kaempferol trùng với các hợp chất đã cơng bố trước đĩ của nhĩm nghiên cứu, cịn vanillin là hợp chất lần đầu tiên phân lập được ở lồi Camellia cucphuongensis. Kaempferol là một flavonoid cĩ rất nhiều tác dụng cĩ lợi cho sức khỏe như chống oxi hĩa [7]; chống ung thư [7], [11], [19], [32], [21]; chống virut [7]; chống nhiễm khuẩn [7]; tác dụng cĩ lợi với các bệnh tiểu đường [40], [7], tim mạch [20], Vanillin là chất được sinh tổng hợp tự nhiên trong thực vật, gĩp phần tạo nên vị umami, vị ngon cho trà. Bên cạnh đĩ, vanillin cũng cĩ các tác dụng sinh học như chống oxi hĩa, chống viêm [6]; bảo vệ da và tế bào [24], Từ các kết quả trên sẽ tạo cơ sở cho việc phân lập các hợp chất khác từ lồi Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann cũng như các lồi Trà hoa vàng khác ở Việt Nam, gĩp phần làm rõ thành phần hĩa học và chứng minh các tác dụng sinh học cĩ lợi của Trà hoa vàng. Điều đĩ cũng sẽ tạo động lực thúc đẩy cho việc bảo tồn, nhân giống và phát triển lồi cây cĩ giá trị cao về kinh tế và y học này. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  42. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu và nội dung đặt ra như sau: 1. Định tính các nhĩm chất hữu cơ thường gặp trong lá Trà hoa vàng Cúc Phương, thu được kết quả: • Các nhĩm chất cĩ mặt trong mẫu dược liệu: Caroten, Sterol, Flavonoid, Saponin, Acid amin, Acid hữu cơ, Đường khử, Tanin. • Các nhĩm chất khơng cĩ mặt trong mẫu dược liệu: Chất béo, Coumarin, Glycosid tim, Alcaloid, Anthranoid. 2. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc được hai hợp chất từ lá Trà hoa vàng Cúc Phương: • Từ cao chiết phân đoạn ethyl acetat đã phân lập được hợp chất kaempferol (CC1). • Từ cao chiết phân đoạn dichloromethan đã phân lập được hợp chất vanillin (CC5). Kiến nghị • Tiếp tục phân lập các hợp chất khác từ lồi Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann. • Từ các kết quả về thành phần hĩa học, tiến hành nghiên cứu các tác dụng sinh học tiềm năng như chống oxi hĩa, chống ung thư, hỗ trợ bệnh nhân đái tháo đường, tim mạch, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  43. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tập 2, trang 1025. 2. Ngơ Thị Minh Duyên và cộng sự (2011), "Đánh giá tình hình sinh trưởng và khả năng tái sinh của trà hoa vàng tại một số tỉnh phía Bắc", Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp. số 4, trang 1954-1965. 3. Trần Ninh và Hakoda Naotoshi (2009), Các loại trà của Vườn quốc gia Tam Đảo. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 4. Ashihara H, et al (1998), "Biosynthesis and metabolism of purine alkaloids in leaves of cocoa tea (Camellia ptilophylla)", Journal of Plant Research. 111, pp. 599–604. 5. Axel M, et al (1996), "Determination of adenine, caffeine, theophylline and theobromine by HPLC with amperometric detection", Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 356, pp. 284–287. 6. Ben Saad H, et al (2017), "Effects of vanillin on potassium bromate-induced neurotoxicity in adult mice: impact on behavior, oxidative stress, genes expression, inflammation and fatty acid composition", Arch Physiol Biochem. 123 (3), pp. 165-174. 7. Calderĩn-Montađo JM , et al (2011), "A review on the dietary flavonoid kaempferol", Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 11 (4), pp. 298–344. 8. Chen IJ, et al (2016), "Therapeutic effect of high-dose green tea extract on weight reduction: A randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial.", Clinical Nutrition. 35 (3), pp. 592-599. 9. Chen JH, et al (1993), "The healthcare value of yellow Camellia", Study Trace Elements Health. 10 (51-52), pp. 61. 10. Chen JH, et al (1993), "The wholesome function and trace elements of leaves in artificial asexual propagation of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama (golden camellia).", Weiliang Yuansu @ SchoolYu Jiankang of Yanjiu Medicine. 10, pp. 51−52. and Pharmacy, VNU
  44. 11. Chen SS, et al (2012), "Advances in the treatment of ovarian cancer: a potential role of antiinflammatory phytochemicals", Discovery Medicine. 13 (68), pp. 7-17. 12. Cui C, et al (2018), "Triterpenoid Saponins from the Genus Camellia: structures, biological activities, molecular simulation for structureactivity relationship ", Food & Function. 9 (6), pp. 3069–3091. 13. Douglas AB, et al (1997), "The Chemistry of Tea Flavonoids", Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 37 (38), pp. 693-704 14. Dung VL, et al (2016), "Camellia thuongiana - a new yellow camellia species from vietnam", Dalat University journey of science. 6 (3), pp. 338– 344. 15. Dung VL, et al (2016 ), "Camellia Ninhii – A New Yellow Camellia Species from Vietnam", Proceedings of Dali International Camellia Congress. pp. 75-78. 16. Grzesik M (2017), "Antioxidant properties of catechins: Comparison with other antioxidants", Food Chemistry. 241, pp. 480-492. 17. Huang XC (1994), "Development and prospect forecast of yellow Camellia", Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 1, pp. 10– 11. 18. Itokawa H, et al (1968), "Isolation of Camelliagenin A, B and C from the Fruits of Camellia japonica L", Yakugaku zasshi : Journal of the Pharmaceutical Society of Japan. 88, pp. 1463-1466. 19. Jaganathan SK, et al (2009), "Antiproliferative effects of honey and of its polyphenols: a review", Journal of Biomedicine & Biotechnology, pp. 1-13. 20. Khalil MI, et al (2010), "The potential role of honey and its polyphenols in preventing heart diseases: a review", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines. 7 (4), pp. 315-321. 21. Kim SH, et al (2013), "Anti-cancer Effect and Underlying Mechanism(s) of Kaempferol, a Phytoestrogen, on the Regulation of Apoptosis in Diverse Cancer Cell Models", Toxicological Research. 29 (4), pp. 229-234. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  45. 22. Kujawskaa M, et al (2016 ), "Protective effect of yellow tea extract on N- nitrosodiethylamine-induced liver carcinogenesis", Pharmaceutical Biology. 54 (9), pp. 1891–1900. 23. Kurihara HKJ, et al (1991), "Oligostilbenes from Carex kobomugi", Phytochemistry. 30 (2), pp. 649-653. 24. Lee J, et al (2014), "Vanillin protects human keratinocyte stem cells against ultraviolet B irradiation", Food Chem Toxicol. 63 (7), pp. 30. 25. Li YF, et al (2008), "An improved HPLC method for simultaneous determination of phenolic compounds, purine alkaloids and theanine in Camellia species", Journal of Food Composition and Analysis. 21, pp. 559– 563. 26. Lieu TN, et al (2018), "Two new species of Camellia (Theaceae) from Vietnam", Korean Journal of Plant Taxonomy. 48 (2), pp. 115-122. 27. Lin JN, et al (2013), "Chemical Constituents and Anticancer Activity of Yellow Camellias against MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells ", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, pp. 9638−9644. 28. Ling-Ling D, et al (2016), "Tea Polysaccharides and Their Bioactivities", Molecules. 21 (11), pp. 1449. 29. Ninh T, et al (1998), "Camellia cucphuongensis: a new species of yellow Camellia from Vietnam ", International Camellia Journal 1998, pp. 71 - 72. 30. Ninh T, et al (2012), "A New Species of Yellow Camellia (Sect. Piquetia) from Vietnam. ", International Camellia Journal. 44, pp. 161- 162. 31. Ninh T, et al (2016), " General information about the Yellow Camellia species in Vietnam", Proceedings of Dali International Camellia Congress. Dali, Yunnan, China, pp. 76 - 84. 32. Nưthlings U, et al (2007), "Flavonols and pancreatic cancer risk: the multiethnic cohort study", American Journal of Epidemiology. 166 (8), pp. 924-931. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  46. 33. Orel G, et al (2010), "Camellia luteocerata sp. nov. and a new section of Camellia (Dalatia) from Vietnam", Nordic Journal of Botany. 28, pp. 280- 284. 34. Orel G, et al (2012), "Camellia cattienensis: a new species of Camellia (sect. Archaecamellia: Theaceae) from Vietnam", Kew Bulletin. 66, pp. 565-569. 35. Orel G, et al (2012), "Camellia inusitata (Theaceae), a new species forming a new section (Bidoupia) from Vietnam", Edinburgh Journal of Botany. 69, pp. 347-355. 36. Orel G, et al (2013), "Camellia oconoriana (Theaceae), a new species from Vietnam", Edinburgh Journal of Botany. 70, pp. 439-447. 37. Pouységu L, et al (2010), "Hypervalent iodine-mediated oxygenative phenol dearomatization reactions", Tetrahedron, pp. 5908-5917. 38. Sahar R, et al (2016), "Evaluation of seven different drying treatments in respect to total flavonoid, phenolic, vitamin C content, chlorophyll, antioxidant activity and color of green tea (Camellia sinensis or C. assamica) leaves", Journal of Food Science and Technology. 53 (1), pp. 721–729. 39. Takhtajan (2009), Flowering plant. 40. Veeresham C, et al (2014), "Aldose reductase inhibitors of plant origin", Phytotherapy Research. 28 (3), pp. 317-333. 41. Wang B, et al (2018), "Essential oils and ethanol extract from Camellia nitidissima and evaluation of their biological activity", Journal of Food Science and Technology. 55 (12), pp. 5075-5081. 42. Wang X, et al (2016), "Flavanols from the Camellia sinensis var. assamica and their hypoglycemic and hypolipidemic activities", Acta Pharmaceutica Sinica B, pp. 7(3):342-346. 43. Wang X, et al (20217), "Fatty acid and sterol composition of tea seed oils: Their comparison by the "FancyTiles" approach", Food Chemistry. 233, pp. 302-310. 44. Wei JB, et al (2015), "Characterization and determination of antioxidant components in the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama based on @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. compositioneactivity relationship approach", Journal of food and drug analysis. 23 (1), pp. 40-48. 45. Xiao TJ, et al ( 1991 ), "Development and utilization of Camellia genus plant resources.", China's Wild Plant Resources. 1, pp. 44–45. 46. Yang CS, et al (2002), "Inhibition of carcinogenesis by tea", Review of Pharmacology and Toxicology. 42, pp. 25–54. 47. Yang XR, et al (2007), "Simultaneous analysis of purine alkaloids and catechins in Camellia sinensis, Camellia ptilophylla and Camellia assamica var. kucha by HPLC", Food Chemistry. 100, pp. 1132–1136. 48. Ye CX, et al (1997), "Isolation and analysis of purine alkaloids from Camellia ptilophylla Chang ", Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni. 36, pp. 30–33. 49. Zheng XQ, et al (2002), "Theacrine (1,3,7,9- tetramethyluric acid) synthesis in leaves of a Chinese tea, kucha (Camellia assamica var. kucha)", Phytochemistry. 60, pp. 129–134. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả giám định tên khoa học Phụ lục 2: Bộ dữ liệu phổ của hợp chất CC1 Phụ lục 3: Bộ dữ liệu phổ của hợp chất CC5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. PHỤ LỤC 2: BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT CC1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. PHỤ LỤC 3: BỘ DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT CC5 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  55. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  56. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU