›

Khóa luận Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên

pdf 60 trang thiennha21 18/04/2022 3240
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_xay_dung_tieu_chuan_co_so_duoc_lieu_thit.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ THANH THÚY BƯỚ C ĐẦ U XÂ Y DƯNG̣ TIÊ U CHUẨ N CƠ SỞ DƯƠC̣ LIỆ U THỊT QUẢ ĐÀO TIÊN (Crescentia cujete L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI- 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ THANH THÚY BƯỚ C ĐẦ U XÂ Y DƯNG̣ TIÊ U CHUẨ N CƠ SỞ DƯƠC̣ LIỆ U THỊT QUẢ ĐÀO TIÊN (Crescentia cujete L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCNGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2014 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI 2. TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN HÀ NỘI- 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. Lời cảm ơn Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải, TS. Nguyễn Thị Hải Yến, những người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên thuộc Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm tại trường. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Cảm ơn các thầy cô Khoa Y Dược, ĐHQGHN đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua. Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm và giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Viết đầy đủ CD Chuẩn độ CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOH Ethanol MS Phương pháp khối phổ PTN Phòng thí nghiệm STT Số thứ tự TT Thuốc thử @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1: Danh sách thực vật chi Crescentia 2 Bảng 2: Giá trị trung bình nồng độ khoáng chất có trong trái Crescentia 7 cujete L. Bảng 3: Các hợp chất nổi bật trong quả Crescentia cujete L. 9 Bảng 4: Các chất thuộc nhóm p-hydroxybenzoyloxy 11 Bảng 5: Các hợp chất thuộc nhóm n- alkyl glycosid 12 Bảng 6: Độ ẩm của bột thịt quả đào tiên 34 Bảng 7: Độ ẩm của thịt quả đào tiên tươi 34 Bảng 8: Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu đào tiên 35 Bảng 9: Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu đào tiên 35 Bảng 10: Kết quả định tính mẫu tươi 36 Bảng 11: Kết quả định tính mẫu khô 37 Bảng 12: Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn 39 Bảng 13: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang 40 Bảng 14: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp đo quang 40 Bảng 15: Một số chỉ số của dầu hạt đào tiên 41 Bảng 16: Thành phần chính trong dầu hạt đào tiên 43 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình, đồ thị Trang Hình 1: Cây đào tiên 4 Hình 2: Quả và hạt đào tiên 5 Hình 3: Công thức cấu tạo iridoid của Crescentia cujete L. 9 Hình 4: Hoạt tính chống oxi hóa của Cresscentia cujete L. trong 13 các dung môi chiết. Hình 5: Bảng xác định đường glucoza 27 Hình 6: Ruột tươi quả Đào tiên 31 Hình 7: Ruột khô quả đào tiên 31 Hình 8: Vi phẫu thịt quả 32 Hình 9: Bột thịt quả đào tiên dưới kính hiển vi 32 Hình 10: Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng 37 từ 330-800nm Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ 38 chất chuẩn tại bước sóng 347,5nm Hình 12: Sắc ký đồ các acid béo của dầu hạt đào tiên 41 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CRESCENTIA CUJETE L. 2 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CRESCENTIA 2 1.2 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CRESCENTIA CUJETE L. (QUẢ ĐÀO TIÊN) 6 1.2.1 Thành phần hóa học 7 1.2.2 Tác dụng dược lý 15 1.2.3 Công dụng 17 1.2.4 Độc tính 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Mô tả 20 2.2.2 Vi phẫu 20 2.2.3 Độ ẩm 20 2.2.4 Tro toàn phần 20 2.2.5 Tro không tan trong acid 21 2.2.6 Định tính 21 2.2.7 Định lượng 25 2.2.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Mô tả 35 3.2 Đặc điểm vi phẫu thịt quả và soi bột 36 3.3 Độ ẩm @ School of Medicine 37 and Pharmacy, VNU
  8. 3.4 Tro toàn phần 37 3.5 Tro không tan trong acid 38 3.6 Định tính 39 3.7 Định lượng. 41 3.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Tài liệu tham khảo 49 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên. Việt Nam chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loại cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt để ngành Dược phát triển thuốc từ Dược liệu [8]. Cây Đào tiên có tên khoa học là Crescentia cujete L., là loại cây thân gỗ, sống lâu năm thuộc họ Chùm Ớt (Bignoniaceae). Quả của cây đào tiên có hình cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục bóng, đường kính 6-12 cm, có thể đến 20cm.Trong dân gian người ta hay sử dụng thịt quả đào tiên tươi hoặc khô ngâm với rượu để uống nhằm đem lại tác dụng chữa bệnh. Công dụng của đào tiên được biết đến như bồi bổ sức khỏe, chữa ho, nhuận tràng [9]. Theo một số nghiên cứu nước ngoài thịt quả đào tiên còn có các tác dụng dược lý như: hoạt tính kháng khuẩn từ chiết xuất thịt quả [28], tác dụng chống oxi hóa [26], tác dụng hạ đường huyết được thử nghiệm trên chuột [25]. Đây là loại quả hữu ích và tiềm năng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu này. Tuy nhiên, cho đến nay, ở nước ta những nghiên cứu về loại quả này là rất ít. Vì vậy việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu này là điều cần thiết. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho nghiên cứu sau này, tôi thực hiện đề tài: "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên" với các mục tiêu sau: - Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với một số tiêu chí chung trong Dược điển Việt Nam IV. - Bước đầu nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CRESCENTIA CUJETE L. 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CRESCENTIA Chi Crescentia thuộc họ Chùm Ớt (Bignoniaceae) thuộc nhóm thực vật hạt kín (thực vật có hoa). Crescentia là một chi của sáu loài của thực vật có hoa thuộc họ Chùm Ớt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, châu Phi, châu Úc và vùng Đông nam Á [5], [7]. Loài này là những cây có kích thước vừa phải, cao tới 10m và tạo ra những quả hình cầu lớn, vỏ mỏng, cứng và cùi mềm, đường kính lên đến 25cm [41]. Cây gỗ nhỏ hay lớn, lá mọc so le, đơn. Hoa ở nách lá, có tràng hoa hình ống lớn, phình ở bụng, quả mọng. Hạt nhiều, kích thước khoảng 8mm x 9mm, mặt ngoài nhẵn, không có cánh, nằm lẫn trong quả. [43] Theo The Plant List [40] bao gồm 45 tên thực vật khoa học xếp hạng các loài cho chi Crescentia. Trong số đó chỉ có 6 tên loài được chấp nhận. Dưới đây là tên của 6 loài đó: Bảng 1: Danh sách thực vật chi Crescentia Mức độ tin Tên Trạng thái Nguồn cậy Crescentia alata Kunth Chấp nhận iPlants Crescentia amazonica Ducke Chấp nhận iPlants Crescentia cujete L. Chấp nhận iPlants Crescentia linearifolia Miers Chấp nhận iPlants Crescentia mirabilis Ekmanex Urb. Chấp nhận iPlants Crescentia portoricensis Britton Chấp nhận iPlants Crescentia cujete L. Theo các tài liệu thực vật trong nước và nước ngoài, vị trí của Đào tiên được sắp xếp trong các bậc taxon như sau [4, 5, 6, 14]: @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. Nghành Magnoliophyta (Nghành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Phân lớp Lamiadae (Phân lớp Hoa môi) Bộ Scrophulariales (Bộ Hoa mõm chó) Họ Bignoniaceae (Họ Chùm Ớt) Chi: Crescentia L. Nguồn gốc xuất xứ: Châu Mỹ nhiệt đới Phân bố ở Việt Nam: được trồng ở gần như khắp các tỉnh thành, chủ yếu trồng ở miền Nam. Còn được gọi là Calabacero (Tây Ban Nha), Cujeté (Brazil), Totumo (Panama, Colombia, Venezuela và Peru), Tutumo (Bolivia), Taparo (Venezuela), Mate (Ecuador), Huinga (Peru), Pate (Peru), Cuyabra (Colombia), Morro (Guatemala), Cujete (Tây Ban Nha, Philippines), Trái cây kỳ diệu (Philippines), Kalbas (Dominica và St. Lucia), Higuera (Puerto Rico) và cây Rum (Sri Lanka) [42]. * Đặc điểm hình thái [12, 30, 34, 46]: Thân, tán, lá: Cây gỗ nhỏ hay nhỡ, sống lâu năm, cao từ 4-5m. Tán lá hình tháp, vỏ thân màu xám. Lá mọc so le, thường thu tập 3 cái ở một mấu, lá hình trái xoan ngược, thon hẹp dài ở gốc, dài 10-15cm, rộng 3-4cm, mọc khít nhau thành chùm 3 cái hay hơn, màu xanh đậm, bóng, cứng, tán dày, lá rụng vào mùa khô. (Hình 1) Hoa, quả, hạt: Hoa to thường mọc đơn độc ở đầu cành hay kẽ lá, màu trắng đục, mùi hôi, dài hình chuông, nhẵn, dễ rụng, chia 2 thùy không đều; tràng gần hình chuông, ống rộng loe ở đầu, dài 5cm, 5 cánh không đều, mép uốn lượn; nhị 4, chỉ nhị dính ở gốc ống tràng; bầu hình chóp, 1 ô. Quả mọng, hình cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục bóng, đường kính 6-12 cm, có thể đến 20cm, vỏ xanh cứng, thịt màu trắng có vị hơi chua. Hạt nhiều, phẳng nhỏ, không cánh, nằm lẫn chìm trong thịt. Trái chín phải mất vào khoảng 6 tháng. Mùa hoa quả gần như quanh năm [39]. (Hình 2,3) *Đặc điểm sinh lý, sinh thái: Tốc độ sinh trưởng: Trung bình @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. Phù hợp với: Cây ưa sáng, nhu cầu nước trung bình. Nhân giống từ hạt. Đào tiên ở Việt Nam được trồng bằng cách cắm cành hay tách các nhánh con mọc từ chồi rễ. Cây có thể ra hoa và trái trong bất cứ mùa nào trong năm. Có khả năng chịu mặn và có thể trồng những nơi có nước thoát tốt. Cây cần trồng những nơi không có sương lạnh bởi vì nó không thích ứng với những độ lạnh cao. [45] Hình 1: Cây @đào Schooltiên of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. 1.2 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CRESCENTIA CUJETE L. (QUẢ ĐÀO TIÊN) Mô tả: Quả hình cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục, đường kính từ 6-12cm, có thể đến 20cm, cuống ngắn, vỏ láng, quả bì dày, ngoại quả rất cứng. Thịt quả có màu trắng, hơi nhớt, có vị chua, có nhiều hạt dẹt nhỏ, không cánh cũng màu trắng nằm lẫn trong thịt quả. Trái chín phải mất khoảng 6 tháng. Thịt quả khi nạo ra để ngoài trời nhanh chóng bị chuyển sang màu đen và biến thành màu nâu khi khô [9, 12]. Hình 2: Quả và hạt đào tiên Chú thích: 1: Quả đào tiên non 2: Quả trưởng thành 3: Quả già rụng, ruột chuyển sang màu đen 4: Hạt đào tiên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. 1.2.1 Thành phần hóa học Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của quả Crescentia cujete L. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào lá và vỏ cây. Trong thịt quả đào tiên người ta phát hiện có một số acid hữu cơ như axit xitric, axit tactric, axit clorogenic, axit creosentic [9]. Trong trái còn chứa vitamin B1, và giàu lượng vitamin C [45]. Nghiên cứu hóa chất thực vật trên trái cây thu được saponin, flavonoid, cardenolides, tannin và phenol, cũng như sự hiện diện của hydro xyanua. Kết quả cũng cho thấy nồng độ trung bình tương đối thấp đối với kim loại nặng, nhưng nồng độ trung bình cao đối với mangan, sắt, kẽm và đồng. Giá trị cho chất béo, protein, nitơ, chất xơ thô, độ ẩm, sucrose, fructose, galactose và hàm lượng năng lượng khá cao tương ứng: 1,13; 8,35; 1,34; 4,28; 84,92; 59,86, 25,09; 18,24 và 88,69%. [23] Bảng 2: Giá trị trung bình của nồng độ khoáng chất có trong trái Crescentia cujete L. Khoáng chất Nồng độ Calcium (%) 0,04 Magnesium (%) 0,01 Potassium (%) 0,02 Sodium (ppm) 59,77 Manganese (ppm) 21,74 Iron (ppm) 7,88 Zinc (ppm) 3,97 Copper (ppm) 6,90 Phosphorus (ppm) 53,01 Lead (ppm) 0,17 Chromium (ppm) 0,07 Nickel (ppm) 0,10 Cobalt (ppm) 0,03 Cadmium (ppm) 0,01 Selenium (ppm) 0,02 Arsenic (ppm) 0,00 Tin (ppm) 0,01 HCN (ppm) 0,11 Các hợp chất của chiết xuất trái cây Crescentia cujete L. được phân tích bằng phương pháp GC-MS chỉ ra sự hiện diện của 12 thành phần hóa học [27]. Được biểu diễn trong hình 6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. Bảng 3: Các hợp chất nổi bật trong quả Crescentia cujete L. Pubchem STT Tên hợp chất CTHH CTCT CID I II III IV V 1 Furfuran C5H4O2 7362 2 2,4(1h,3h)-pyrimidinedion C4H4N2O2 1174 Pyrazole, 1,4-dimethyl, 3 C5H8N2 6210 3,5-dimethyl-1H-pyrazole 4 1.2.3 Benzenetriol C6H6O3 10787 5 4H-pyran-4-one C5H4O2 7968 6 2,5-diflourophenylhydrazine C6H6F2N2 10920925 7 1,2,4,5-tetrazine-3,6-diamine C2H4N6 49863143 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. I II III IV V 8 Furancarbonxaldehyde C5H4O2 7968 9 4-mercaptophenol C6H6OS 240147 10 2-propenoic acid, 3-phenyl C9H8O2 444539 11 1,3,5-Triazine-2,4,6-Triamine C2H4N6 61176 12 Trans-Cinnamic acid C9H8O2 444539 Một nghiên cứu khác của Tetsuo Kaneko và các cộng sự [16], bằng phương pháp phân tích dữ liệu quang phổ xác định trong thành phần quả đào tiên có đủ 16 iridoid và iridoid glycosid (hình 5) gồm: ➢ Crescentins I, II, III, IV, V ➢ Crescentins A, B, C ➢ Aucubin (5) ➢ 6-O-p-hydroxybenzoyl-6-epiaucubin (6) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ➢ Agluside (7) 9
  18. ➢ 5,7-bisdeoxy-cynanchoside (8) ➢ Ajugol (9) ➢ 6-O-p-hydroxy-benzoylajugol (10) ➢ Ningpogenin (11) ➢ Crescentoside C; 6ß, 7ß- epoxide (16) Trong đó, có 5 loại iridoid mới được đặt tên là crescentins I (l), II (2), III (3), IV (4) và V (13) và 3 loại iridoid glycosid mới được đặt tên là crescentosides A (12), B (14) và C (15) [11]. Các nhà khoa học đã phân lập được các chất từ quả của loài Crescentia cujete L., trong đó các hợp chất chủ yếu thuộc nhóm iridoid, ngoài ra còn có các nhóm chất chính như nhóm n-alkyl glycosid, nhóm p-hydroxybenzoyloxy (bảng 3,4) [17]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Hình 3: Công thức cấu tạo iridoid và iridoid glycosid của Crescentia cujete@ School L. of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. Bảng 4: Các chất thuộc nhóm p-hydroxybenzoyloxy STT Tên chất CTPT CTCT 6- O-(p-hydroxybenzoy)- D- 1 C13H16O8 Glucose 2 Acanthosid D C34H46O18 Beta- D- Glucopyranosyl 3 C13H16O7 benzoat Beta-D-fructofuranosyl-6-O- 4 (p-hydroxybenzoyl)-α-D- C19H26O12 glucopyranosid @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. Bảng 5: Các hợp chất thuộc nhóm n- alkyl glycosid STT Tên chất CTPT CTCT (2R, 4S)- 2 - O- Beta- D- 1 C11H22O7 Glucopyranosyl- 2,4-Pentanediol (2R, 4S) -2- O- Beta- D- 2 Glucopyranosyl- (1→ 6) - Beta- C17H32O12 D-Glucopyranosyl- 2,4- Pentanediol (2R, 4S) -2- O- Beta- D- 3 C H O Xylopyransyl- (1→6) -Beta- D- 16 30 11 Glucopyranosyl- 2,4- Pentanediol (R)- 4 - O-Beta- D- Glucopyranosyl- 4 C11H20O7 4- hydroxy- 2- pentanol (R)- 4- O- Beta- D- 5 Glucopyranosyl- (1→ 6) - Beta- D- C17H30O12 Glucopyranosyl- 4- hydroxy- 2- pentanol (R)- 1- O- Beta- D- apiofuranosyl- 6 C H O (1→2)- Beta- D- Glucopyranosyl- 17 32 12 1,3- octanediol (R)- 1- O- Beta- D- Glucopyranosyl- 7 C H O (1→ 6) - Beta- D- Glucopyranosyl- 20 38 12 1,3- octanediol 8 (R)- 1- O- Beta- D- Glucopyranosyl- C14H22O12 1,3- octanediol @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. 1.2.2 Tác dụng dược lý Tác dụng nổi bật của thịt quả đào tiên được biết đến trong y học cổ truyền ở nước ta như: bồi bổ cơ thể, nhuận tràng, long đờm [45]. Tác dụng kháng khuẩn, chống oxi hóa, hạ đường huyết được nghiên cứu bởi các nhà khoa học ở nước ngoài [23, 25, 26, 27] . Và còn có nhiều tác dụng khác nhờ thành phần hóa học đa dạng, chứa nhiều các hợp chất hữu ích với cơ thể con người. 1.2.2.1 Tác dụng chống viêm, kháng khuẩn Sinval Garcia Pereira và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống lại vi khuẩn Rhipicephalus bằng phương pháp in vitro và cho rằng Crescentia cujete L. đóng vai trò quan trọng trong việc giảm sử dụng hóa chất để kiểm soát Rhipicephalus [23]. Chiết xuất ethanol từ thịt quả có khả năng kháng khuẩn đối với Vibrio harveyi ở nồng độ 10mg/ml. Trong báo cáo của Sri Rahmaningsih và cộng sự còn giải thích rằng flavonoid có trong thịt quả ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách can thiệp vào tính thấm tế bào của chúng, làm cho các hợp chất khác như saponin, tanin, phenol, triterpenoid, alkaloid xâm nhập vào và làm hỏng thành tế bào vi khuẩn [27]. 1.2.2.2 Tác dụng chống oxi hóa Flavonoid có trong Crescentia cujete L. có thể hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo vệ các tế bào của cơ thể khỏi gốc tự do hư hại; gốc tự do được cho là làm hỏng tế bào. Mô hình khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất tự nhiên và chiết xuất thực vật. Giá trị độ hấp thụ được đo tại bước sóng là 517 nm. Axit ascobic được sử dụng làm chất chuẩn, trong khi dung dịch trắng sử dụng 70 μL metanol, 70μl của dung dịch đệm Tris-HCl và 70μL DPPH 0,1mM. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bởi IC50. Kết quả cho thấy các giá trị IC50 thấp nhất là được tìm thấy trong chiết xuất dichloromethane với 95,83 μg / mL, trong khi giá trị cao nhất được tìm thấy ở chiết xuất ethyl acetat với 174,56 μg / ml [26]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. Hình 4: Hoạt tính chống oxi hóa của Cresscentia cujete L. trong các dung môi chiết. 1.2.2.3 Tác dụng hạ đường huyết Nghiên cứu đánh giá nước ép trái cây của Crescentia cujete L. về tác dụng hạ đường huyết tiềm tàng ở chuột Sprague-Dawley. Không có độc tính được ghi nhận ở mức 2000 mg/kg liều uống ở chuột sử dụng hướng dẫn OECD. Crescentia cujete L. gây ra sự gia tăng nồng độ glucose ban đầu sau đó giảm đáng kể vào lúc 4h và 6h (P <0,05). Hiệu quả không khác biệt đáng kể so với metformin [25]. 1.2.2.4 Các tác dụng khác Saponin có mặt trong Crescentia cujete L. được biết đến như là thuốc kháng sinh tự nhiên và cũng tăng cường năng lượng. Nó cũng hữu ích trong việc giảm viêm đường hô hấp trên và như chất tạo bọt, nhũ hóa, chất tẩy rửa. Saponin trong Crescentia cujete L. có thể sử dụng như chất chống viêm và kháng sinh trong điều trị bệnh [18, 37]. Cardenolide và anthraquinone cũng có mặt trong các mẫu trái cây. Cardenolides là chất kích thích tim [38]. Điều đó cho thấy rằng nó có thể hữu ích trong việc điều trị một số bệnh liên quan đến tim. Sự hiện diện của anthraquinone trong Crescentia cujete L. có thể giải thích tại sao nó được sử dụng như thuốc nhuận tràng [18]. Alkaloid đã được quan sát thấy trong các mẫu trái cây. Các alkaloid rất quan trọng trong y học bởi vì một số alkaloid đã được sử dụng để giảm đau, chống co thắt và tác dụng diệt khuẩn [37]. Vì thế nó được sử dụng làm thuốc giảm đau trong điều trị ho và các chất chống viêm @ [23]. School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Tannin có chất làm se đặc tính đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương, ngăn ngừa sâu răng và có hoạt tính kháng khuẩn. Tannin và các hợp chất của chúng được biết đến là chịu trách nhiệm phòng ngừa và điều trị đường tiết niệu nhiễm trùng và nhiễm khuẩn khác [23]. Sự hiện diện của tannin trong trái cây cho thấy nó có thể phục vụ như một tác nhân kháng khuẩn hữu ích. 1.2.3 Công dụng Bộ phận dùng: Thịt quả hay còn gọi là cơm hay nạc. Quả có vị chua tính mát, vào 2 kinh phế và đại tràng. Công dụng: Trị đau nhức xương khớp, thải độc tố ở hệ tiêu hóa, trị tình trạng ăn uống kém, mất ngủ và dùng làm thuốc bổ. Bổ quả đào tiên, cạo lấy phần thịt trắng thái nhỏ, cho vào chảo hay nồi đung nóng và đảo chín rồi chế thành siro dùng để chữa ho. Thịt quả đào tiên chưa chín, được dùng làm thuốc tẩy và nhuận tràng. Cơm quả đào tiên ngâm rượu dùng với liều nhỏ (với liều 10 centigam) làm thuốc khai vị, với liều 60 centigam làm thuốc tẩy mạnh do tác dụng tăng cường co bóp [9]. Hạt trái cây Crescentia cujete L. đốt cháy thành bột và làm thành bột nhão được ăn để chữa ho ở Curacao. Người Panama sử dụng bột Crescentia cujete L. để nhuộm vải đen. [18] Nước ép của trái cây được sử dụng để điều trị tiêu chảy, viêm phổi và rối loạn đường ruột. Nó được pha thành một loại trà mạnh và say để phá thai, để dễ sinh con và được sử dụng trong hỗn hợp để giảm đau bụng kinh nghiêm trọng bằng cách loại bỏ cục máu đông [23]. Ở một số quốc gia, vỏ quả khô được sử dụng để làm bát đựng nước uống, rượu, trà hoặc giữ trái cây hoặc thực phẩm. Vỏ được sử dụng trong thủ công, trang trí bằng tranh hoặc chạm khắc. Công dụng được biết đến ở các quốc gia như: [33], [44] ✓ Antilles và Tây Phi: bột trái cây được ngâm trong nước được coi là thuốc khử trùng, làm mát, và được áp dụng cho bỏng và đau đầu. ✓ Tây Phi: trái cây rang trong tro là thuốc tẩy và lợi tiểu. Khắp vùng Caribbean, được sử dụng làm thuốc giảm đau và chống viêm. ✓ Côte-d'Ivoire: được sử dụng cho bệnh @ cao Schoolhuyết áp vì oftác dMedicineụng lợi tiểu củ aand Pharmacy, VNU nó. 17
  26. ✓ Columbia: được sử dụng cho các vấn đề về hô hấp. ✓ Việt Nam: được sử dụng như thuốc trừ sâu, chống ho, nhuận tràng và dạ dày. Thuốc sắc trái cây dùng để điều trị tiêu chảy, đau dạ dày, cảm lạnh, viêm phế quản, ho, hen suyễn và viêm niệu đạo. ✓ Haiti: trái cây của Crescentia cujete L. là một phần của hỗn hợp thảo dược được báo cáo trong y học cổ truyền. Tại tỉnh Camaguey ở Cuba, được coi là thuốc chữa bách bệnh. Panam: nơi được gọi là totumo, trái cây được sử dụng cho bệnh tiêu chảy và đau dạ dày. Ngoài ra đối với các bệnh về đường hô hấp, viêm phế quản, ho, cảm lạnh, đau răng. đau đầu, kinh nguyệt không đều; như thuốc nhuận tràng, chống viêm [33]. ✓ Xi-rô làm từ trái cây dùng để điều trị bệnh kiết lỵ và đau dạ dày. 1.2.4 Độc tính Thịt quả sống gây nôn, gây sổ, gây độc với các loài chim, gây sảy thai ở các loài động vật có sừng. Trong thịt quả chứa acid HCN [35, 36]. Một loại siro chế từ thịt quả đào tiên được thêm vào nước uống của chuột nhắt thấy gây ung thư hạch thể bạch cầu trong nhiều trường hợp [14]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị * Nguyên liệu -Thịt quả đào tiên (Crescentia cujete L.) tươi và khô, hạt quả đào tiên đã sấy khô. - Nơi thu hái: Lạng Sơn - Thời gian thu hái: Tháng 3/2019 * Hóa chất - Các loại thuốc thử dùng trong định tính: TT Mayer, Dragendoft, Buncharat, Balijet, thuốc thử vannilin-sulfuric, TT Fehling -Dung môi hóa chất: EtOH 96̊, EtOH 90̊, Cloroform, MeOH, FeCl3, AlCl3, NaOH 40 %, NaOH 5%, H2SO4 đặc, HCL đặc, nước cất, dung dịch HCl, dung dịch gelatin, butanol, n-hexan và các hóa chất khác thuộc khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội và khoa Hóa Đại học khoa học tự nhiên [1, 2, 3]. * Trang thiết bị, dụng cụ ❖ Máy Quang phổ UV-VIS Cary 60 ❖ Máy đo độ ẩm Precisa HA 60 ❖ Máy siêu âm Utrasonic cleaner- MRC ❖ Máy đo pH AL20 pH-Aqualitic ❖ Cân phân tích AUW 220 ❖ Nồi cách thủy ❖ Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc có mỏ, đũa thủy tinh , ❖ Micropipet ❖ Các máy xay dược liệu, bếp điện, bếp đun cách thủy, kính hiển vi ❖ Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội. [1] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Mô tả Dựa vào cảm quan. Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu. 2.2.2 Vi phẫu Cắt vi phẩu: Cắt xuyên tâm bằng tay với lưỡi lam. Chọn lát cắt thật mỏng để nhuộm. Nhuộm vi phẩu tiến hành tuần tự như sau: - Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-30 phút, rửa bằng nước cất nhiều lần. - Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1-3% trong 2 phút để tẩy Javel còn sót lại. Rửa bằng nước cất. - Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat (nếu thấy lát cắt chưa thật trắng và trong) khoảng 10-15 phút nữa. Rửa lại bằng nước cất. - Ngâm vào dung dịch xanh methylen từ 5-10 giây. Rửa lại bằng nước cất. 2.2.3 Độ ẩm Sử dung̣ câ n xác đinḥ độ ẩm Precisa HA 60: cân chính xác khoảng 1g phần thịt quả khô đa ̃ cắt nhỏ, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng. 2.2.4 Tro toàn phần Cho 2g đến 3g bột mẫu thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 °c tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Tập trung dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 °c đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí [13]. (Phụ lục 9.8 DĐVN V) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. 2.2.5 Tro không tan trong acid Cho vào chén nung chứa tro toàn phần hay tro Sulfat (nếu trong chuyên luận riêng không có chỉ dẫn khác) 15 ml nước và 10 ml acid hydrocloric. (TT). Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 min rồi để nguội. Rửa mặt kính đồng hồ với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung. Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc không trơ, rửa bằng nước nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính. Làm khô rồi nung tới đỏ tối, đế nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung tiếp tới khi giữa 2 lần cân khối lượng chênh lệch nhau không vượt quá 1 mg. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã được làm khô trong không khí [13]. (Phụ lục 9.7 DĐVN V) 2.2.6 Định tính Tiến hành định tính trên cả 2 mẫu tươi và khô Mẫu tươi Chuẩn bị mẫu: Thịt quả tươi sau khi lấy ra bỏ hột, nghiền nhuyễn thành hỗn hợp đồng nhất. Sử dụng phương pháp định tính bằng các phản ứng hóa học như phương pháp được mô tả bởi Hartern (1973), Trease và Evan (1989), để định tính các nhóm hóa chất thực vật [23]. Mẫu khô Chiết mẫu: Mẫu 1: Lấy 50,0g bộ t dược liệu, thê m 200 ml nước tinh khiết, đun hồi lưu 45 phút, loc,̣ dicḥ loc̣ . Mẫu 1 dùng để xác định carbonhydrat, axit hữu cơ, tannin, acid hydroxycinnamic, acid amin. Mẫu 2 tương tự: thay dung môi nước bằng rượu 70%. Mẫu 2 dùng để xác định coumarin, flavonoid, saponin. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. Thực hiện định tính mẫu khô bằng các phản ứng hóa học Định tính đường khử Phản ứng Fehling: Thêm vào ống nghiệm 2ml dịch chiết mẫu 1. Thêm 5 giọt acid H2SO4 đậm đặc đun sôi trong 5 phút. Để nguội, trung hoà acid bằng dd NaOH 10%, sau đó thêm 10 gioṭ thuốc thử Fehling. Đun cách thủy 10 phút, nếu xuất hiệ n kết tủa đỏ gacḥ là dương tính. Định tính polysaccharid 2ml dịch chiết 1 và 8ml rượu 96%. Nếu xuất hiện tủa bông trắng là dương tính. Định tính flavonoid ❖ Phản ứng với dung dịch FeCl3 Thê m vài gioṭ FeCl3 5% vào ống nghiệ m chứ a 1ml dicḥ chiết mẫu 2, dung dicḥ màu xanh đen - phản ứ ng dương tính. ❖ Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệ m 1 ml dicḥ chiết mẫu 2, thê m mộ t ít bộ t Mg (khoảng 10mg). Nhỏ từ ng gioṭ HCl đậ m đặ c (3-5) giot.̣ Để yê n mộ t vài phút, dung dicḥ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ, phản ứ ng dương tính. Sau đó cho 1 lượng butanol– quan sát màu của pha dung môi và pha nước. ❖ Phản ứng vớI dung dịch NaOH Cho 1ml dung dicḥ NaOH 10% vào ống nghiệ m chứ a 1ml dicḥ chiết mẫu 2, xuất hiệ n tủa vàng. ❖ Phản ứng với dung dịch AlCl3 Cho 1ml dung dicḥ rượu AlCl3 2% vào ống nghiệ m chứ a 1ml dicḥ chiết mẫu 2, xuất hiệ n dung dịch màu vàng xanh. ❖ Phản ứng với dung dịch chì axetat Cho 1-2 giọt dung dicḥ chì axetat 10% vào ống nghiệ m chứ a 1ml dicḥ chiết mẫu, xuất hiệ n tủa màu vàng. Định tính coumarin ❖ Phản ứ ng mở đóng vòng lacton Cho vào 2 ống nghiệ m mỗi ống 1ml dicḥ chiết mẫu 2: - Ố ng 1: thê m 0,5ml NaOH 10%. - Ố ng 2: để nguyê n. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. Đun cả hai ống nghiệ m đến sô i, để nguộ i rồi thêm mỗi ống 1ml nướ c cất thấy: -Ố ng 1: trong hơn. -Ố ng 2: có tủa đuc.̣ Thêm vài gioṭ HCl đặ c, ống 1 trở về giống ống 2 thì dương tính. Định tính saponin ❖ Phản ứng tạo bọt Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm khoảng 25ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm nước cất đến khoảng 10ml lắc mạnh trong 5 phút, để yê n trong 15 phút. Nếu boṭ còn bền vững sau 15 phút thì dương tinh.́ ❖ Phản ứng với dung dịch chì axetat Cho 1-2 giọt dung dicḥ chì axetat 10% vào ống nghiệ m chứ a 1ml dicḥ chiết mẫu 2, xuất hiệ n tủa màu vàng. ❖ Phản ứng Lafon Ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu 2, thêm 1 giọt dung dịch đồng sunfat 10% và 1 ml dung dịch axit-sunfuric đậm đặc, đun nóng nhẹ. Nếu có saponin, dung dịch có màu xanh lam. ❖ Phản ứng Salkowski Cho 1 ml chloroform và 5-6 giọt axit sulfuric đậm đặc vào 2 ml dịch chiết mẫu 2. Xuất hiện màu cam là dương tính. Định tính acid amin Hòa tan 3 gioṭ TT Ninhydrin 3% trong 2ml dicḥ chiết Mẫu 1. Đun cách thủy sô i 10 phút, dung dicḥ có màu xanh tím là dương tinh.́ Định tính acid hữu cơ Thêm mộtt ít bộ t Na2CO3 vào ống nghiệ m chứ a 4ml dicḥ chiết mẫu 1, phản ứ ng dương tính khi có boṭ khí bay lê n. Định tính chất béo, sterol, caroten Ngâ m 10g bộ t dươc̣ liệ u trong n-hexan để qua đê m. Loc,̣ thu lấy dicḥ loc̣ để làm phản ứ ng: ◆ Đinḥ tính chất béo: nhỏ 2 gioṭ dicḥ chiết lê n giấy loc.̣ Hơ nóng bay hơi hết dung mô i, nếu còn vết mờ trê n giấy l o@c̣ th ì Schooldương tính. of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. ◆ Đinḥ tính sterol: Cô cách thủ y bốc hơi dung mô i đến cắn. Thê m vào ống nghiệ m 1ml anhydrid acetic, lắc ky;̃ nghiê ng ống 45 độ , nhỏ từ từ 3 gioṭ acid sulfuric đặ c theo thành ống nghiệ m, thấy mặ t phâ n cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trê n có màu xanh lá thì dương tính. ◆ Đinḥ tính caroten: Cô cách thủ y bốc hơi dung mô i đến cắn. Thê m 2 gioṭ H2SO4 đặ c vào cắn. Dung dicḥ có màu xanh đậ m thì dương tính. Định tính tanin ❖ Phản ứng tủa với gelatin Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết mẫu 2, thêm 1ml dung dịch gelatin 1% có chứa 10% NaCl. Xuất hiện tủa là dương tính. Định tính iridoid Cân khoảng 1 gam dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml dung dịch HCl 1% ngâm trong 5 giờ. Lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc. Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc thêm 1ml TT Trim Hill thấy xuất hiện màu xanh ở mẫu quả thì dương tính. Định tính glycosid tim ❖ Vi thăng hoa Cho một ít bột dược liệu vào 1 nắp nhôm. Đặt nắp trên lưới amiang, đun nóng nhẹ bằng đèn cồn cho hơi nước bay đi sau đó đậy lên nắp nhôm 1 phiến kính đã đặt sẵn 1 miếng bông thấm nước lạnh ở trên. Giữ đèn cồn đến khi bột có mùi thơm và chuyển sang màu nâu đậm, lấy phiến kính ra để nguội và soi lên kính hiển vi thấy có tinh thể hình kim thì dương tính. ❖ Phản ứng Borntraeger Cân khoảng 5g dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml H2SO4 1N, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Để nguôi, lọc qua giấy lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10ml CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3 vào ống nghiệm, cô cách thủy 70 C̊ đến khi lượng CHCl3 còn khoảng 1ml, thêm 1ml Amoniac 10%, lắc đều xem có xuất hiện màu hồng không, tiếp tục thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy lớp nước có màu đỏ hồng thì dương tính. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. 2.2.7 Định lượng 2.2.7.1 Định lượng đường trong quả đào tiên bằng phương pháp đo quang Dựa vào tài liệu tham khảo [10, 11, 29], tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau: a, Chuẩn bị các dung dịch Chuẩn bị dung dịch chiết: Mẫu khô: 2g bột mẫu khô, thêm 300ml nước cất đun cách thủy 15 phút, sau đó lọc dung dịch thu được dung dịch chiết khô. Mẫu tươi: Nghiền nhuyễn 100g mẫu tươi bằng cối chiết lấy nước được 25ml dịch chiết. Lấy 1,25ml dịch chiết tươi vào bình định mức 25ml thêm nước cất đến vạch, thu được dung dịch chiết tươi. Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Lấy chính xác khoảng 26,7mg chất chuẩn đường glucose pha trong nước cất vừa đủ 10,0ml. Thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 2,67 (mg/ml). Chuẩn bị dung dịch thử 1 (1,5% acid p-aminobenzoic trong acid acetic băng) Chuẩn bị dung dịch thử 2 (1,3% acid phosphoric trong acid acetic băng) b, Khảo sát cực đại hấp thụ quang [10, 11] Tiến hành quét phổ với 3 dung dịch: dung dịch chuẩn, dung dịch chiết sau khi tiến hành phản ứng với thuốc thử 1 và 2. Sau đó quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 –800nm. Cuvet thạch anh có bề dày 1cm. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu. c, Tiến hành đo quang và tính toán kết quả Bước 1: Đo dung dịch chuẩn Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn, 4ml dung dịch thử 1, 4ml dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch nguội tiến hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Dung dịch chuẩn đem đi đo quang có nồng độ là 0,267(mg/ml). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với dung dịch chuẩn, chỉ không chứa mẫu chuẩn phân tích. Bước 2: Đo dung dịch chiết Làm tương tự như cách đo dung dịch chuẩn, thay 1ml dung dịch chuẩn bằng 1ml dung dịch chiết khô và khô. Cách tính kết quả: Hàm lượng (%) của đường tính theo glucose trong nguyên liệu khô hoàn toàn được tính theo công thức: * Mẫu khô: A .a .1.300.10.100 X = 1 0 .100% 10.10.A .1.1.a (100− h) 0 1 * Mẫu tươi: A.a .1.25.25.10.100 X = o .100% 10.10.Ao.a.1,25.1.(100 − w) Trong đó: A1: độ hấp thụ của dung dịch chiết khô; Ao: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn glucose; A: độ hấp thụ của dung dịch chiết tươi; a: khối lượng thịt quả đào tiên tươi, g; ao: khối lượng đường glucose trong dung dịch chuẩn, g; a1: khối lượng thịt quả đào tiên khô, g; h: độ ẩm thịt quả đào tiên khô w: độ ẩm thịt quả đào tiên tươi c, Thẩm định và đánh giá phương pháp Thực hiện thẩm định và đánh giá phương pháp được tiến hành trên mẫu khô của thịt quả đào tiên. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. ⚫ Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R. Cách xác định: khảo sát trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và mật độ quang bằng phương trình hồi quy tuyến tính. Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan R ≥ 0,99. ⚫ Độ lặp lại Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD. Tiến hành: Phân tích mẫu 6 lần. Xác định kết quả định lượng tiến hành trong cùng điều kiện và tính RSD. ⚫ Độ đúng Là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Để xác định độ đúng, thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu glucose có nồng độ chính xác 0,134g/ml. Sau đó tiến hành phân tích mẫu lặp lại 6 lần trong cùng điều kiện. 2.2.7.2 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Bertrand [32] a, Chuẩn bị mẫu Cân 10g tươi hoặc 2g khô. Nghiền cẩn thận và cho vào 30mL nước cất nóng 70-80 C̊ để hoà tan mẫu, lấy nước trích ly. Cho thêm 30 mL nước vào cối chứa xác dược liệu tiến hành trích ly như trên tới lần thứ 3. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình nón 250 mL, thê m tiếp 5ml HCl đậ m đặ c (d = 1,19g/ml). Đậ y ninh̀ bằng nút cao su có gắn ống thủ y tinh dài (hoặc dùng ống sinh hàn). - Đặ t bình vào nồi cách thủ y, nhiệ t độ 100 C̊ , thời gian là 3 giờ kể từ lúc bắt đầu sô i. -Lấy bình ra làm nguộ i nhanh dướ i dòng nước lanḥ đến nhiệ t độ phòng. Trung hòa acid dư bằng NaOH 20% với @chi ̉ thSchooli ̣phenolphtalein of Medicine đến dung dicḥ and Pharmacy, VNU có màu hồng. 27
  36. -Khử tạp chất: Thê m mộ t ít axetat chi ̀ bộ t (1,5g) lắc đều và loc̣ qua phễu có giấy loc̣ A. Hứ ng dung dicḥ loc̣ vào bình định mức dung tích 250 mL. -Dùng nước cất tráng bình nón và lọc qua giấy lọc A. Nước tráng cho vào bình không được quá 250mL. Định mức bằng nước cất tới 250mL. Đem đi xác định hàm lượng đường. b, Xác định hàm lượng đường Lần lượt cho vào bình nón 250mL: Dung dịch fehling A 10 mL; Dung dịch fehling B 10 mL; 10 ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên. Đun sôi trên bếp điện hỗn hợp đúng 3 phút tính từ khi bọt nước xuất hiện đầu tiên. Sau khi đun sôi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng. Nếu dung dịch bị mất màu hoàn toàn, màu lục, vàng hoặc nâu chứng tỏ lượng dung dịch feling cho vào không đủ để oxi hoá lượng đường trong mẫu. Do đó, phải làm laị với thể tích dung dicḥ loc̣ ít hơn (5ml), nhưng phải thê m nước cất cho đủ 10 ml. Lấy bình ra và để nghiêng cho cặn Cu2O lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2. c, Gaṇ loc̣ kết tủ a: Khi kết tủa Cu2O lắng xuống, gaṇ phần nước bê n trê n và loc̣ qua phễu loc̣ xốp cắm xuyê n qua nút cao su của bình loc̣ có nhánh nối với máy hút châ n khô ng. Rửa kết tủa bằng nước đa ̃ đun sô i và gaṇ loc̣ tiếp tuc̣ vào phễu cho đến khi trong bình nón mất màu xanh. Trong quá trình gaṇ loc,̣ khô ng để kết tủa Cu2O loṭ vào phễu và luô n luô n giữ có mộ t lớp nước đa ̃ đun sô i trê n mặ t Cu2O để tránh tiếp xúc với khô ng khí. d, Hoà tan kết tủ a: Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho ngay vào bình nón 20mL dung dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan kết tủa Cu2O. Rút hết nước trong phễu, thay bình hút lọc cũ bằng bình mới. Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan hết kết tủa Cu2O trong bình nón, lên trên lớp cặn còn lại trên phễu. Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)3 cho đến khi không còn vệt Cu2O trong bình nón và trong phễu. Tráng phễu, rử a laị bình nón bằng nước cất đun sô i rồi đổ cả vào phễu và hút hết xuống bình loc.̣ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. e, Chuẩn độ: Lấy bình lọc ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt vững bền trong 15 giây. Làm song song với mẫu kiểm chứng thay dung dịch đường bằng nước cất. Ghi nhận số mL KMnO4 đã dùng và đem tra ở bảng để có lượng nghịch chuyển tùy theo yêu cầu. f, Tính toán kết quả Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucoza (g) trong 100g mẫu thịt quả khô hoặc tươi. Tính bằng công thức: a Vdm 100 X = . . 1000 Vxd Gbd Trong đó: X: Hàm lượng đường khử tính theo % a: Số mg đường glucoza(mg) tương ứng với số ml KMnO4 0,1N, được ghi ở trong bảng của mẫu thí nghiệm trừ đi mẫu kiểm chứng. Gbd: lượng mẫu cân ban đầu, g. Vxd: lượng dung dịch thử lấy để làm thí nghiệm (mL) Vdm: thể tích sau khi định mức. 1000: chuyển từ mg sang g. 100: Hệ số chuyển tính thành % @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. Hình 5: Bảng xác định đường glucoza @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. 2.2.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên [15, 24] 2.2.8.1 Đánh giá tính chất cảm quan và chỉ số lý hóa của dầu a, Mô tả Mô tả màu sắc, độ trong và mùi của dầu thô. b, Chỉ số lý hóa Chỉ số acid ( Phụ lục 7.2 DĐVN V): cân chính xác khoảng 10 g chế phẩm, thêm 50 ml hỗn hợp đồng thể tích ethanol 96 % và ether đã được trung hòa trước với dung dịch natri hydroxyd 0,1 N(CD), dùng 0,5 ml dung dịch phenolphtalein (TT) làm chỉ thị. Lắc để chế phẩm tan hoàn toàn. Nếu chế phẩm khó tan , có thể đun hồi lưu trên cách thủy. Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CD), lắc liên tục cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 15s. Tính chỉ số acid theo công thức [13]: 5,610.a Chỉ số acid = P Trong đó: a: là số ml NaOH 0,1N (CD) đã dùng. P: là số lượng dầu mang đi thử (g). Chỉ số peroxid ( Phụ lục 7.6 DĐVN V): Cân 5,00 g dầu cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 30 ml hỗn hợp gồm 3 thể tích acid axetic băng (TT) và 2 thể tích cloroform (TT), lắc cho tan và thêm 0.5 ml dung dịch kali iodid bão hòa (TT). Lắc đúng 1 min, thêm 30 ml nước. Chuẩn độ chậm bằng dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CD), liên tục lắc mạnh, cho đến khi màu vàng gần như biến mất. Thêm 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột (TT) và tiếp tục chuẩn độ, lắc mạnh, đến khi dung dịch mất màu. Song song tiến hành một mẫu trắng. Lượng dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng trong mẫu trẳng không được vượt quá 0,1 ml. Chỉ số peroxyd của chế phẩm được tính theo công thức sau[13]: (a −b).10 Chỉ số peroxyd = P Trong đó: a: là số ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng trong mẫu thử; b: là số ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng trong mẫu trắng; P: là lượng dầu đem thử (g). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Chỉ số iod ( Phương pháp Wijs): Hòa tan phần mẫu thử trong dung môi và cho thêm thuốc thử Wijs. Sau một thời gian quy định, bổ sung dung dịch kali iodua và nước, chuẩn độ iôt được giải phóng bằng dung dịch natri thiosulfat. Tiến hành các bước như trong TCVN 6122-2010. Trị số iôt, wi, tính bằng gam trên 100 g chất béo, theo công thức sau đây: 12,69.c.(V −V ) wi = 1 2 m trong đó: c: là nồng độ của dung dịch chuẩn natri thiosulfat (5.3) đã dùng, tính bằng mol trên lít (mol/l); V1: là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép thử trắng, tính bằng mililit (ml); V2: là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép xác định, tính bằng mililit (ml); m: là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g). Chỉ số xà phòng hóa (Phụ luc 7.7 DĐVN V): Cân chính xác lượng chế phẩm đã chỉ dẫn cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml. Thêm 25,0 ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CD) và vài viên bi thủy tinh. Lắp ống sinh hàn ngược và, trừ khi có chỉ dẫn khác, đun sôi 30 min trên cách thủy, thỉnh thoảng lắc. Thêm 1 ml dung dịch phenolphtalein (TT1) và chuẩn độ ngay (khi dung dịch còn đang nóng) bằng dung dịch acid hydrocloric 0,5 N (CĐ). Song song tiến hành một mẫu trắng. Chỉ số xà phòng hóa của chế phẩm được tính theo công thức sau [13]: 28,05.(b − a) Chỉ số xà phòng hóa = p Trong đó: a: là số ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CĐ) đã dùng trong mẫu trắng; b: là số ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CĐ) đã dùng trong mẫu thử; p: là lượng chế phẩm đem thử (g). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. 2.2.8.2 Định lượng dầu thô bằng phương pháp cân [13] Nguyê n liệ u hạt đã đuợc làm khô , sau đó ly trích dầu thô khỏi nguyê n liệ u bằng hệ thống Soxhlet với dung mô i n-hexan. Chiết hồi lưu trong 3 giờ. Tách dung mô i ra khỏi dầu thô bằng phương pháp cô quay chân không và xác đinḥ khối lương̣ dầu thô. Cân bình cầu chịu nhiệt (m1), cân khối lượng nguyên liệu (m) xác định, thực hiện trích ly và tách dung môi. Cân khối lượng bình cầu và dầu (m2). m − m % chất béo = 2 1 .100% m 2.2.8.3 Định tính thành phần acid béo của dầu bằng phương pháp GC/MS. Trích ly dầu: Thực hiện trích ly dầu như được mô tả ở mục 2.2.8.2 Chuẩn bị methyl este: Thực hiện chuẩn bị mẫu metyl este các theo tài liệu [33]. Cho 10ml dung dịch NaOH 2% trong methanol vào bình cầu chứa 1,0g dầu. Bình cầu gắn với ống sinh hàn, đun cách thuỷ trong 15ph. Sau đó để phễu trên miệng ống sinh hàn, cho từ từ 13ml acid H2SO4 1M trong methanol, đun trong 15ph. Lấy bình cầu ra làm nguội thực hiện chiết bằng 10ml dung môi n-hexan (2 lần), (pha nước bỏ, pha hexan giữ lại gộp chung với nhau). Rửa lại pha hexan trong phễu chiết mỗi lần với 7ml nước cất cho đến khi hết acid (kiểm tra bằng giấy thử pH) (pha nước bỏ, pha hexan giữ lại gộp chung với nhau). Dung dịch thu được lọc qua phễu có Na2SO4 khan để loại bỏ nước rồi tiến hành nghiên cứu. Phân tích thành phần dầu được thực hiện trên máy GC- MS/MS 7000D Triple Quad của hãng Aligent Technologies, thư việ n phổ NIST. Điều kiện sắc ký khí: - Cột: Elite-5MS kích thước 25m x 30m x 0,25 mm - Chế độ sắc ký: nhiệt độ ban đầu của bộ điều nhiệt cột là 50 ° C, giữ nhiệt trong vòng 10 phút; lập trình nhiệt độ - từ 50 đến 270 ° C với tốc độ 20 ° C / phút, giữ ở nhiệt độ cuối cùng - 10 phút. Nhiệt độ của thiết bị bay hơi là 250 ° C. Khí mang là khí heli với tốc độ nạp 0,2 ml / phút. Thể tích mẫu là 0,5 μl. Hệ số tách là 20: 1, phương pháp ion hóa ESI, bộ lọc khối là tín hiệu tứ cực có độ phân giải thấp. Tổng thời gian phân tích là 45 phút. - Phân tích định tính các metyl este bằng thư viện NIST. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mô tả Thịt quả có màu trắng, hơi nhớt, có vị chua, có nhiều hạt dẹt nhỏ hình trái tim có màu nâu nhạt hoặc trắng, kích thước khoảng 8mm x 9mm, mặt ngoài nhẵn, không có cánh. Thịt quả khi nạo ra để ngoài trời nhanh chóng bị chuyển sang màu đen Hình 6: Ruột tươi quả đào tiên Hình 7: Ruột khô quả đào tiên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. 3.2 Đặc điểm vi phẫu thịt quả và soi bột a, Vi phẫu thịt quả Thịt quả màu trắng, soi dưới kính hiển vi thấy: Các mảnh mạch xoắn (1,2), mảnh mô mềm hình đa giác (3), tế bào thịt quả trontg chứa các hạt tinh bột (4,5), tinh thể calci oxalat hình khối (6). Hình 8: Vi phẫu thịt quả b, Soi bột Bột có màu đen, mùi thơm đặc trưng, để ngoài không khí dễ hút ẩm trở nên kết dính với nhau trông như cao. Quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy: các mảnh mạch (1,2), mảnh mô mềm màu vàng (3,8), rất nhiều các hạt tinh bột tập trung trong tế bào mô mềm (4), các hạt tinh bột rải rác ở các tế bào (6), hình dạng tế bào thịt quả (5), ngoài ra còn có các mảnh mang màu (7). Hình 9: Bột thịt quả đào tiên@ dưSchoolới kính hi ofển viMedicine and Pharmacy, VNU 36
  45. 3.3 Độ ẩm Dùng phương pháp xác định hàm ẩm bằng sử dụng máy đo độ ẩm Precisa HA 60, kết quả thu được như sau: Bảng 6: Độ ẩm của dược liệu bột quả đào tiên STT Hàm ẩm Giá trị trung bình (%) 1 13,16 2 13,94 13,91 3 14,63 Nhận xét : Độ ẩm các mẫu dược liệu khô của đào tiên khoảng 13,91 %. Cao nhất là 14,63% và thấp nhất là 13,16%. Do vậy quy định độ ẩm không quá 15%. Bảng 7: Độ ẩm của thịt quả đào tiên tươi STT Hàm ẩm Giá trị trung bình (%) 1 83,7 2 84,56 84,12 3 84,1 Nhận xét: Độ ẩm các mẫu dược liệu khô của đào tiên khoảng 84,12 %. Cao nhất là 84,56% và thấp nhất là 83,7%. Do vậy quy định độ ẩm không quá 85%. 3.4 Tro toàn phần Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức: 100*m X (%) = .100% M (100 − A) Trong đó: m: khối lượng tro (g); M: khối lượng mẫu thử (g); A: độ ẩm của mẫu thử (%). Với độ ẩm mẫu mang đi thử là 14,63 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. Bảng 8: Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu đào tiên Khối lượng Khối lượng Tỷ lệ tro toàn STT dược liệu(g) tro(g) phần(%) 1 1,035 0,068 7,69 2 1,056 0,070 7,76 3 1,015 0,061 7,03 Trung bình 7,49 Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu trung bình là 7,49%, mẫu cao nhất là 7,76%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 8 %. 3.5 Tro không tan trong acid Tỷ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính theo công thức: 100*m X (%) = .100% M (100 − A) Trong đó: m: khối lượng tro (g); M: khối lượng mẫu thử (g); A: Độ ẩm của mẫu thử (%). Với độ ẩm mẫu mang đi thử là 14,63 Tiến hành theo phương pháp 2 (Phụ lục 9.7 DĐVN V), kết quả thu được như bảng sau: Bảng 9: Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu đào tiên Khối lượng Khối lượng Tỷ lệ tro không tan STT dược liệu(g) tro(g) trong acid(%) 1 1,035 0,012 1,358 2 1,056 0,016 1,774 3 1.015 0.009 1,038 Trung bình 1,39 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu trung bình là 1,39%, mẫu cao nhất là 1,774%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 2%. 3.6 Định tính * Mẫu tươi Kết quả sơ bộ cho thấy trong mẫu tươi thịt quả có chứa tanin và phenol, saponin, flavonoid, glycosid tim, iridoid. Bảng 10: Kết quả định tính mẫu tươi Nhóm Kết Thí nghiệm kiểm tra Quan sát chất luận Tanin và 10ml mẫu+ nước cất+ nhiệt và lọc Quan sát thấy màu Dương phenol + FeCl3 1% xanh đen tính Lắc mạnh trong 5 phút. Để nguyên sau Dương Saponin 20ml mẫu+ nước cất+ nhiệt + lọc 15 phút vẫn còn cột tính bọt 10ml mẫu +5ml HCl 1% + nhiệt Dung dịch thu được Âm Alkaloid +lọc+ acid picric không đục tính 10ml mẫu + 10ml ethyl acetat + Quan sát Dương Flavonoid Nhiệt + Lọc + 1ml dung dịch NH3 thấy có màu vàng tính 5ml mẫu + acid acetic băng + lọc Glycosid Quan sát Dương + Vài giọt FeCl3+ 1ml H2SO4 đậm tim thấy có màu nâu tính đặc 10ml mẫu+ nước cất + nhiệt + lọc Quan sát thấy có Dương Iridoid + TT Trim Hill màu xanh tính * Mẫu khô Kết quả định tính mẫu khô thấy chứa đường khử, polysaccarid, flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, tanin, chất béo. Được thể hiện rõ qua bảng 11. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
  48. Bảng 11: Kết quả định tính mẫu khô Phản ứng định tính thuốc Kết quả sơ bộ Nhóm chất thử Kết quả Kết luận 1. Đường khử Phản ứng Fehling + Có 2. Polysaccarid Rượu 96% + Có FeCl3 5% + Phản ứng Cyanidin + 3. Flavonoid NaOH 10% - Có Rượu AlCl3 - Chì Acetat + 4. Coumarin Mở đóng vòng lacton - Không có Phản ứng tạo bọt + Chì acetat - 5.Saponin Có Phảng ứng lafon - Phản ứng Salkowski + 6. acid amin TT Ninhydrin + Có 7.Acid hữu cơ Na2CO3 + Có 8. Tanin Phản ứng gelatin + Có 9. Iridoid TT Trim Hill - Không có Vi thăng hoa - 10. Glycosid tim Không có Phản ứng Borntraeger - 11.Chất béo Hơ trên giấy lọc + Có Cô cách thủy + Anhydryd 12.Sterol - Không có acetic + H2SO4 đặc 13. Caroten Cô cách thủy + H2SO4 đặc - Không có Nhận xét: Kết quả cho thấy trong thịt quả tươi có chứa glycosid tim, iridoid còn trong thịt quả khô phần này là âm tính. Có thể do quá trình làm khô làm biến đổi chất hoặc với chiết xuất ethanol không thu được nhóm chất này so với không sử dụng dung môi chiết. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
  49. 3.7 Định lượng 3.7.1 Định lượng đường trong thịt quả đào tiên bằng phương pháp đo quang a, Khảo sát cực đại hấp thụ quang Từ kết quả trên thấy độ hấp thụ quang của dung dịch đạt giá trị cực đại tại bước sóng 347,5nm. Do đó chọn bước sóng 347,5 là bước sóng khảo sát. b, Tiến hành đo quang và tính toán kết quả Hình 10: Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng từ 330-800nm Chú thích: 1. Phổ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng 2. Phổ hấp thụ của dung dịch chiết 3. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn glucose Kết quả thực nghiệm thu được mật độ quang của dunng dịch chuẩn và dung dịch thử tươi và khô lần lượt là 0,990 và 0,890, 0,771. Áp dụng công thức ta tính được hàm lượng đường tính theo glucose trong nguyên liệu khô hoàn toàn là: * Mẫu khô 0,771.26,7.10−3.300.10.100 X = .100 = 36,23% 10.10.0,990.1.1.2.(100 −13,91) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
  50. *Mẫu tươi 0.89.26,7.10−3.1.25.25.10.100 X = .100% = 7,55% 10.10.0,99.100.1,25.1.(100 −84,12) c, Thẩm định và đánh giá phương pháp ⚫ Xác định khoảng tuyến tính Tiến hành pha 1 dãy dung dịch chuẩn glucose với nồng độ như bảng . Hút lần lượt chính xác 1ml dung dịch chuẩn, 4ml dung dịch thử 1, 4ml dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch nguội tiến hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa dung dịch chiết. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn. Bảng 12: Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn Nồng độ 0,052 0,069 0,089 0,135 0,267 0,331 (mg/ml) Abs 0,198 0,250 0,310 0,480 0,990 1,188 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 3,6317x - 0,0015 Hệ số tương quan: R2= 0,9989 1.4 1.2 y = 3.6317x - 0.0015 R2 = 0.9989 1 0.8 0.6 0.4 Độ hấp thụ quang hấp quang (Abs) thụ Độ 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ glucose(mg/ml) Hình 11 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng @ 347,5nmSchool of Medicine and Pharmacy, VNU 42
  51. Từ kết quả ở bảng và hình trên cho thấy với nồng độ của chất chuẩn từ 0,052- 0,54 (mg/ml) có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 3,6317x - 0,0015 với hệ số tương quan R2= 0,9989. ⚫ Khảo sát độ lắp lại của phương pháp Để xác đinh độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu chiết khô thịt quả đào tiên trong cùng điều kiện chiết. Tiến hành: Hút chính xác 1ml dung dịch chiết, 4ml dung dịch thử 1, 4ml dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch nguội tiến hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa dung dịch chiết. Kết quả thu được như sau: Bảng 13: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang STT 1 2 3 4 5 6 Abs 0,777 0,789 0,792 0,798 0,767 0,798 Khối lượng 2,0016 2,0034 2,0048 2,0052 2,006 2,0068 bột khô (g) Số liệu thống kê SD= 0,0124; RSD= 1,576% Kết quả ở bảng cho thấy phương pháp có độ lặp có thể chấp nhận được thông qua RSD= 1,576%. ⚫ Độ đúng của phương pháp Để xác định độ đúng thực hiện với dung dịch chuẩn glucose có nồng độ chính xác 0,135 (mg/ml). Các bước tiến hành như trên nhưng lặp lại 6 lần. Bảng 14: Kết quả xác định độ đúng phương pháp STT 1 2 3 4 5 6 Abs 0,480 0,482 0,489 0,491 0,0,495 0,489 Nồng độ 0,1357 0,1366 0,1372 0,1399 0,1347 0,1355 Glucose (mg/ml) Ctrung bình= 0,1366 @; SD= School 0.0018 of Medicine and Pharmacy, VNU 43
  52. 0,135 −Ctb 0,1350 − 0,1366 ttn = = = 2,17 SD2 0,00182 n 6 Tra bảng t(0.95;5)=2,57 > ttn=2,17 Như vậy: tc > ttn: không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa 5%, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu. 3.7.2 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Bertrand * Mẫu tươi: Khối lượng mẫu ban đầu đem đi định lượng là 10g, thể tích KMnO4 đem chuẩn độ là 24,7ml (tra bảng xác định đường glucoza tương đương với 87mg đường glucoza). Lượng dung dịch thử đem đi làm thí nghiệm là 10ml. Thể tích dung dịch sau định mức là 76,4ml. Từ đó áp dụng công thức ta tính được hàm lượng đường toàn phần là: 87 76,4 100 X = . . = 6,72% 1000 10 10 * Mẫu khô: Khối lượng mẫu ban đầu đem đi định lượng là 2g, thể tích KMnO4 đem chuẩn độ là 25,5ml (tra bảng xác định đường glucoza tương đương với 90mg đường glucoza). Lượng dung dịch thử đem đi làm thí nghiệm là 10ml. Thể tích dung dịch sau định mức là 77,5ml. Từ đó áp dụng công thức ta tính được hàm lượng đường toàn phần là: 90 77,5 100 X = . . = 35,01% 1000 10 2 Nhận xét: Hàm lượng đường trong thịt quả khô cao hơn trong thịt quả tươi. Định lượng đường bằng phương pháp đo quang (36,23%) cho kết quả cao hơn với phương pháp Bertrand (đôi với mẫu khô) có thể do định lượng trên 2 mẫu quả khác nhau dẫn tới kết quả khác nhau. Quá trình định lượng theo phương pháp Bertrand thực hiện nhiều bước, kết quả sai số lớn hơn dẫn tới sự chênh lệch về kết quả. 3.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên 3.8.1 Đánh giá tính chất cảm quan và chỉ số lý hóa của dầu a, Mô tả Dầu thô chiết từ hạt của quả đào tiên có màu vàng nâu đậm, trong suốt, có mùi thơm nhẹ, đặc trưng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 44
  53. b, Chỉ số lý hóa Kết quả thực nghiệm được ghi lại trong bảng dưới đây. Bảng 15: Một số chỉ số của dầu hạt đào tiên Chỉ số acid (mg Chỉ số peroxid Chỉ số iod (Wijs) Chỉ số xà phòng KOH/g) (mEq/kg) (gI2/100g) hóa (mg KOH/g) 4,02 9,6 92 188,5 Về mặt ý nghĩa của các chỉ số, chỉ số acid tương đối cao cho thấy dầu dễ bị phân hủy hoặc oxi hóa. Còn các chỉ số còn lại đều bình thường. 3.8.2 Định lượng dầu thô bằng phương pháp cân Sau khi trích ly dầu từ 39g hạt bằng hệ thống soxlet và cô quay chân không để tách hết dung môi thu được dầu có màu vàng nâu đậm. m1 = 271,74g; m2= 278,16; m = 39,04g; 278,16 − 271,74 % chất béo = .100% =16,44% 39,04 3.8.3 Định tính thành phần acid béo của dầu bằng phương pháp GC/MS. Từ lượng dầu đã được trích ly, tiến hành methyl hóa sau đó sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ để định tính các acid béo có trong dầu. Thu được kết quả như sau: Hình 12: Sắc ký đồ các acid béo của dầu hạt đào tiên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 45
  54. Kết quả phân tích bằng GC- MS thấy peak có cường độ lớn nhất tại thời gian lưu 21,949, cho thấy đây là thành phần chiếm nhiều nhất trong dầu hạt đào tiên. Qua nhận dạng cấu trúc hóa học bằng khối phổ xác định hợp chất có thời gian lưu 21,949 là 14,17- Octadecadienoic acid. Dưới đây là kết quả tóm tắt những thành phần hóa học chính trong dầu hạt đào tiên được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC- MS): Bảng 16: Thành phần chính trong dầu hạt đào tiên STT RT Thành phần acid béo CTPT Tỉ lệ (%) 1 20,788 Palmitoleic acid C16: 1 C16H30O2 0,31 2 20,931 Palmitic acid C16: 0 C16H32O2 19,56 12,15- Octadecadienoic acid 21,884 5,9 C18: 2 3 C18H32O2 14,17- Octadecadienoic acid 21,949 67,85 C18: 2 4 22,044 Stearate acid C18: 0 C18H36O2 3,85 5 23,129 11-Eicosenoic acid C19: 1 C19H38O2 0,15 6 25,250 Nonadecanoic acid C19:0 C19H38O2 1,2 7 23,326 Eicosanoic acid C20:0 C20H40O2 0,54 Qua kết quả thấy rằng trong dầu hạt đào tiên chứa 9 thành phần, trong đó chủ yếu là 14,17- Octadecadienoic acid, Palmitic acid. Hàm lượng acid béo không no chiếm khá nhiều trong tổng lượng acid có trong dầu hạt đào tiên, loại acid có lợi cho sức khỏe con người. Đây sẽ là nguồn nguyên liệu tiềm năng để nghiên cứu và phát triển dầu ăn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 46
  55. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau một thời gian thực hiện đề tài thu được kết quả như sau: - Đã mô tả được hình thái thực vật quả đào tiên và đặc điểm vi phẫu thịt quả. - Đã định tính và xác định một số nhóm chất có trong thịt quả đào tiên là: tanin và phenol, flavonoid, iridoid, glycosid tim trong mẫu thịt quả tươi. Trong mẫu thịt quả khô định tính sơ bộ được: acid hữu cơ, acid amin, saponin, chất béo, polysacarid, tanin, saponin, flavonoid, đường khử. - Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thành chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu thịt quả đào tiên theo tiêu chuẩn DĐVN V. Trong đó, độ ẩm không quá 15% với thịt quả khô và 85% với thịt quả tươi; tro toàn phần không quá 8%; tro không tan trong acid không quá 2%. Định lượng đường tổng theo 2 phương pháp: phương pháp Bertrand và phương pháp đo quang thu được các kết quả lần lượt là 6,72%, 7,55% với thịt quả tươi và 35,01%, 36,23% với thịt quả khô. - Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên xác định được các chỉ số acid, peroxid, iod, xà phòng hóa lần lượt là: 4,02; 9,6; 92; 188,5. Định lượng dầu thô tính được dầu chiếm 16,44%. Định tính các chất có trong dầu bằng phương pháp GC- MS thu được các chất là: Palmitoleic acid, Palmitic acid, 12,15- Octadecadienoic acid, 14,17- Octadecadienoic acid, Stearate acid, 11- Eicosenoic acid, Eicosanoic acid, Nonadecanoic acid. Kiến nghị Do thời gian có hạn, đề tài mới chỉ xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở với một mẫu trồng tại Lạng Sơn. Do đó, cần tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu nhiều hơn để việc kết luận các chỉ tiêu mới có thể mang tính đại diện cho dược liệu thịt quả đào tiên. - Đề xuất xây dựng chỉ tiêu định lượng thành phần chính, đặc trưng của dược liệu thịt quả đào tiên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao góp phần đánh giá chính xác hàm lượng hóa chất thực vật hữu ích có trong thịt quả đào tiên. - Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu thịt quả đào tiên. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 47
  56. - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu Đào tiên trong Dược điển Việt Nam. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 48
  57. Tài liệu tham khảo Tiếng việt [1] Bộ môn dược liệu (2010), Thực tập dược liệu, Trường đại học dược Hà Nội. [2] Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr68-79. [3] Bộ Y tế (2007), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr857-862. [4] Bộ môn thực vật, Trường ĐH Dược Hà Nội (2005), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học. [5] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam- tập III, Nhà xuất bản trẻ, tr83-85. [6] Võ Văn Chi (1997), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam- tập I, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr136. [7] Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam- tập I, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, tr209, 305, 747- 748. [8] Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Hoàng Thanh và Đinh Hoa Lĩnh (2004),"Luận văn Nghiên cứu một số bài thuốc, cây thuốc dân gian của cộng đồng dân tộc thiểu số tại buôn Đrăng Phôk –vùng lõi vườn quốc gia Yokđôn –huyện Buôn Đôn –tỉnh Đaklak". [9] Đỗ Tất Lợi (1962), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr897. [10] Nguyễn Quốc Tuấn (2012), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối, Luận văn thạc sĩ- Trường ĐH Khoa học tự nhiên. [11] Nguyễn Thị Huế (2017), Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng) Trồng tại Sapa- Lào Cai, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Khoa Y Dược, ĐHQGHN. [12] Trần Hà Ngân (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Đào tiên, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Trường ĐH Dược Hà Nội. [13] Dược điển Việt Nam (2010), Tập IV. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 49
  58. [14] Nguyễn Thế Cường (2011), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của thịt quả đào tiên (Crescentia cujete Linn.), họ Núc Nác (Bignoniaceae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Trường ĐH Dược Hà Nội [15] Trần Bích Lam, Lê Xuân Hải, Nguyễn Thị Triều My, Lâm Quốc Trình (2011), “Nghiên cứu quá trình thu nhận dầu thô bằng phương pháp ép và trích ly từ hạt cây cao su Nam Bộ”, Science and Technology Development, Vol 14, No.K3- 2011. Tiếng anh [16] Tetsuo Kaneko, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki and Nguyen Minh Duc (1997), “Iridoid and Iridoid Glucosides from fruits of Crescentia cujete”, Phytochemistry, 46, pp.907-910. [17] Tetsuo Kaneko, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki and Nguyen Minh Duc (1998), “n-alkyl glycosides and p-hydoxybenzoyloxy glucose from fruit of Crescentia cujete”, Phytochemistry, 47, pp.259-263. [18] Michael, 2004; Burkill, 1985; Plant Database, 2004. [19] Khandaker Rayhan Mahbub, Md. Mojibul Hoq, Monzur Morshed Ahmed, Animesh Sarker (2011), “In vitro Antibacterial activity of Crescentia cujete and Moringa oleifera”. [20] Julia F. Morton, “The Calabash (Crescentia cujete) in Folk Medicine”. [21] Linda B. Nielsen, Riskiono Slamet, Dieter Wege (2009), “The synthesis of 3-hydroxymethylfuro[3,2-b] naphtho [2,3-furan-5,10-dione, a novel metabolite isolated from Crescentia cujete”. [22] Sinval Garcia Pereira1 & Sandra Alves de Araújo1 & Giselle Maria Skelding Pinheiro Guilhon & Lourivaldo Silva Santos &Livio Martins Costa Junior (2016), “In vitro acaricidal activity of Crescentia cujete L. fruit pulp against Rhipicephalus microplus”. [23] The chemical constituents of calabash (Crescentia cujete) / Ejelonu BC, Lasisi AA,Olaremu AG and Ejelonu OC/ African Journal of Biotechnology Vol. 10(84), pp. 19631-19636, 26 December, 2011 / DOI: 10.5897/AJB11.1518 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 50
  59. [24] B A Smith, F G Dollear,“Oil from calabash seed, Crescentia cujete L.”, Journal of the American Oil Chemists' Society 24(2):52-54. February 1947 / DOI: 10.1007/BF02642127 [25] C Alay-ay, A Hermoso, R Li, M Quinto, P Santos, I Tan, M Villa, R Cadiang, M Corpuz, “Hypoglycemic Effect Of Crescentia Cujete Linn. (Bignoniaceae) Fruit Juice In Normal Sprague-Dawley Rats”, Planta Med 2016; 82 - PB2 / DOI: 10.1055/s-0036-1578650. [26] Syaefudin, D Nitami, M D M Utari , M Rafi and U Hasanah, “Antioxidant and Antibacterial Activities of Several Fractions from Crescentia cujete L. Stem Bark Extract”, Earth and Environmental Science 197 (2018). [27] Sri Rahmaningsih, Arief Prajitno, Aulanni’am Aulanni’am, “Maftuch, Bioactive Compounds From Majapahit Fruit (Crescentia cujete) As a Potential Natural Antibacterial”, International Journal of ChemTech Research, Vol.10 No.3, pp 90-99. [28] U Hasanah, HT Widhiastuti and Syaefudin, “Potency of Ethanol Extract from Berenuk (Crescentia cujete L.) Fruit Rind and Flesh as Antibacterial Agents”, Earth and Environmental Science 187 (2018). [29] Leopold, B. (1962), “Spectrophotometric Determination of Sugars Using p-Aminobenzoic Acid”, Analytical Chemistry, 34(1), 170-171. [30] Mesoamerica, A.F. (2008), The Mysterious Tree, Biologist mirtha cano. [31] The stephen H.B., Crescentia alata. The Institute of Food and Agricultural Sciences, U.S Department of Agricultural, Cooperative Extension Service, University of Florida, IFAS, Florida A.& M. [32] G. Bertrand, N. Gabriel. Le dosage des sucres reducteurs. Bul. Soc. Chim. Paris, 35: 1285-1299. 1906. [33] GOST 31665-2012 Animal and vegetable fats and oils- Preparation of methyl esters of fatty acids. Euro- Asian council for standardization, metrology and certification. 2012 [34] The United Nations Conferencen on trade and Development (2005), Market Brief in the European Union for selected natural ingredients from native species Crescentia cujete, United Nation. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 51
  60. [35] David W. Nellis (1997), “Poisonous plants and animal of Florida and the Caribbean”, Pineapple Press, Inc., pp.156- 157. [36] Ogbuagu, M.N (2008), “The nutritive and Anti-Nutritive Compositions of Calabash (Cresscentia cujete) Fruit pulp”, Journal of Food Technology, 6, pp.267- 270. [37] Frantisek S. (1998), “The Natural Guide to Medicinal Herb Plants”, Tiger book Intenrational Plc, Twickers. 8:20. [38] Finar IL (2000), “Stereochemistry and the Chemistry of Natural Products”, Organic Chemistry vol. 2 5th Edn. pp.603, 811. [39] Turner (1965), “A screening Methods in Pharmacology”, Academic Press, New York and London, pp.66-68. Internet [40] The Plant List. Crescentia . [Accessed: 23/3/2019]. [41] Wikipedia. Crescentia [Accessed: 2/4/2019]. [42] Plant for a future. Crescentia cujete- L. [Accessed: 2/4/2019]. [43] United States Department of Agriculture. Crescentia cujete L. [Accessed: 2/4/2019]. [44] Philippine medicinal plant. Cujete [Accessed: 2/4/2019]. [45] Vĩnh Sinh Ngọc Hà, 2015. Đào Tiên [Ngày truy cập 16/5/2019]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 52