›

Khóa luận Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 3963
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_buoc_dau_danh_gia_tac_dung_chong_oxy_hoa_va_uc_che.pdf

Nội dung text: Khóa luận Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LƯU THỊ HUYỀN TRANG BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2018
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LƯU THỊ HUYỀN TRANG BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Dương Thị Ly Hương 2. PGS. TS. Bùi Thanh Tùng HÀ NỘI - 2018 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điếu kiện giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Dương Thị Ly Hương và PGS. TS. Bùi Thanh Tùng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận. Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận được thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên Lưu Thị Huyền Trang @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholine iodid DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’- dithiobis-2- nitrobenzoic IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) MeOH Methanol ROS Các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species) RNS Các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitogen Species) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. 5 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Hình 1.2 6 Tsai et K. M. Feng) Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE 13 Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ Hình 2.1 18 Sâm vũ diệp Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Hình 2.2 19 Tam thất hoang Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng Hình 2.3 21 chống oxy hóa trong phương pháp DPPH Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử Hình 2.4 22 Ellman Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in Hình 3.1 vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao 27 giàu saponin Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in Hình 3.2 28 vitro của vitamin C Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym Hình 3.3 29 AChE in vitro của berberin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính 8 Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C 26 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ Bảng 3.2 26 diệp cao giàu saponin Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất Bảng 3.3 27 hoang cao giàu saponin Giá trị IC50 chống oxy hóa in vitro của Sâm Bảng 3.4 vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong 28 phương pháp DPPH Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in Bảng 3.5 29 vitro của berberin Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in Bảng 3.6 30 vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in Bảng 3.7 30 vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Panax L. 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L. 3 1.1.3. Phân bố 3 1.1.4. Thành phần hóa học chính của chi Panax L. 4 1.1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L 4 1.1.6. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) 5 1.2. Tổng quan về gốc tự do 8 1.2.1. Khái niệm 8 1.2.2. Các ROS và RNS 8 1.2.3. Stress oxy hóa 9 1.2.4. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 10 1.3. Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan 11 1.3.1. Acetylcholin 11 1.3.2. Enzym Acetylcholinesterase 12 1.3.3. Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13 1.3.4. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.2. Dung môi, hóa chất 20 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.3. Máy móc, dụng cụ 20 2.4. Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 20 2.4.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 22 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Kết quả thực nghiệm 26 3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 26 3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 29 3.2. Bàn luận 31 3.2.1. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 31 3.2.2. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là một thuật ngữ đã trở lên quen thuộc với giới y khoa và ngày càng được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn. Bởi gốc tự do có nhiều tác hại với sức khỏe của con người. Nó là nguồn gốc của sự lão hóa và hơn 100 bệnh tật nguy hiểm, bao gồm các bệnh về não, mắt, da, hệ miễn dịch, tim, mạch máu, phổi, thận, đa cơ quan và khớp. Đồng thời, gốc tự do còn là nguyên nhân gây ung thư [22]. Sau khi lấy đi điện tử, gốc tự do làm tổn thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các acid béo, dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào. Số lượng gốc tự do tích lũy theo tuổi và tác hại ngày càng nghiêm trọng [1]. Gốc tự do tác động tới tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể, trong đó có các tế bào thần kinh. Gốc tự do là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa tế bào thần kinh và bệnh lý mạch máu não [1, 20]. Một trong những bệnh thoái hóa tế bào thần kinh được quan tâm là bệnh Alzheimer. Thống kê ở châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, con số này được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới 62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer [3]. Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ làm giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cộng đồng xã hội. Các nhà khoa học đã đưa ra các nguyên nhân để giải thích cho bệnh Alzheimer. Trong đó, giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh bằng Acetylcholin (cholinergic) [21]. Bệnh Alzheimer là do giảm tổng hợp của Acetylcholine (ACh) (một chất dẫn truyền thần kinh). Trong thực hành lâm sàng, các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế enzym Acetylcholinesterase duy trì được nồng độ của ACh bằng cách giảm tốc độ phân hủy ACh. Chi Panax L. gồm nhiều loài cây thuốc quý như Nhâm sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng) đã được sử dụng từ lâu đời. Các loài thuộc chi Panax L. có thành phần hóa học chính là saponin. Đây là hợp chất @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  10. cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Trong đó, tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của dịch chiết saponin từ các loài thuộc chi Panax ngày càng được quan tâm nghiên cứu nhiều. Theo nghiên cứu của Cheng et al. (2005), các ginsenosid Rg1, Rb1 giúp tăng độ bền các tế bào thần kinh [45]. Nghiên cứu của Cheng et al. (2016) cho thấy Nhân sâm và Ginsenosid Rg1, Rg3 và Re giảm Aβ trong não động vật [45]. Ngoài ra, trong nghiên cứu của Zhong, Z. et al. (2005), Saponin trong Tam thất giúp tăng nồng độ và hoạt tính của Cholin acetyltransferase, do đó giúp bảo vệ và cải thiện hệ thần kinh cholinergic [52]. Saponin cho tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh theo nhiều cơ chế khác nhau, một trong số các cơ chế liên quan đến khả năng chống oxy hóa của hợp chất saponin [45]. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhân sâm (Araliaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc. Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế. Qua các nghiên cứu của Liang, Chun, et al. (2010) và Nguyễn Hữu Tùng, et al. (2011) về thành phần hóa học của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cho thấy saponin khung drammaran và oleanan chiếm tỷ lệ cao trong rễ và lá. Với tỷ lệ hàm lượng saponin cao trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, liệu 2 loài này có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer không? Tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm” với mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Panax L. 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L. có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) Chi Panax L. Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax L 1.1.2. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L. Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Thân rễ ngắn hoặc thon dài, phân nhánh. Các loài khác nhau của chi Panax L. có sự khác nhau về độ bền của rễ (rễ các loài P. japonicus C. A. Mayer, P. vietnamensis Ha & Grushv., và P. wangianus S. C. Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng từ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới. Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5. Bầu 2-3 có khi đến 5 ô. Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41]. 1.1.3. Phân bố Trên thế giới, theo trang The plant list, đã có 261 loài đã được định danh. Trong đó, có 13 tên khoa học đã được chấp thuận, 235 tên đồng nghĩa và 13 tên loài chưa xác định chính xác thông tin. Có 2 loài phân bố ở Đông Bắc Mỹ Seemann 1868; Burkill 1902; Graham 1966; Proctor and Bailey 1987). Các loài khác phân bố ở châu Á (Burkill 1902; Hara 1970; Wen and Zimmer 1996). Ở châu Á, vùng Đông Nam Trung Quốc và phía Đông của dãy Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L. (Burkill 1902; Hara 1970; Hu 1976; Wen and Zimmer 1996) [32]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. 1.1.4. Thành phần hóa học chính của chi Panax L. Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L. Ngoài ra, nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, các polysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben cũng đã được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L. 1.1.4.1. Hợp chất saponin Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoid khung dammaran hoặc oleanan. Các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau. Dựa vào cấu trúc của các sapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khác nhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác. Trong đó, sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổ biến nhất. [49] 1.1.4.2. Hợp chất polyacetylen Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon. 1.1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L 1.1.5.1. Nhâm sâm (Panax ginseng C.A. Mey) Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần và mệt mỏi. Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác dụng khác nhau. Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của hệ tim mạch, hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu. [29] 1.1.5.2. Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen) (Sanchi ginseng) Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Dịch chiết saponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim mạch. Thành phần saponin trong dược liệu cũng cho thấy tác dụng hạ đường @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp và tăng hoạt động của tinh trùng. [40] 1.1.5.3. Sâm Mỹ ( Panax quinquefolius) Các nghiên cứu cho thấy Sâm Mỹ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch, nhờ sự kích thích sản sinh tế bào lympho B, tăng (interleukin) IL-2, IL-10, interferon- γ và làm tăng tế bào diệt tự nhiên (NK). Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơ tim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim. Tương tự như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tập tiểu cầu. Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39]. 1.1.6. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm (Araliaceae). Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng. Các nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế. Hình 1.1. Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. Hình 1.2. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) Về thành phần hóa học: Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. a. Sâm vũ diệp Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá Sâm vũ diệp ở Trung Quốc, trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [50]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được cấu trúc của 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũ diệp trong dịch chiết methanol. Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là các bifinoside A—C và 7 hợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl ester. [46] Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β- D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ của Sâm vũ diệp. Ngoài ra, trong Sâm vũ diệp cũng có các hợp chất @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và những nguyên tố vi lượng [5, 6]. Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen được nhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6]. b. Tam thất hoang Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. [34] Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48]. Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [53]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định được 15 hợp chất saponin khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester, 3 hợp chất polyme, một sesquitecpen và một acid béo. [34] Ngoài ra, Tam thất hoang cũng chứa các thành phần như triterpenoid, tinh dầu, đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, các nguyên tố vi lƣợng, và polyuronic [5, 6]. Về tác dụng dược lý: Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau Các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định có trong Sâm vũ diệp có thể giải thích một phần cho các tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống mệt mỏi, chống bệnh tiểu đường, cải thiện chức năng sinh sản của cây theo y học cổ truyền đã sử dụng. [29, 39, 40] Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Liang, Chun, et al. tiến hành đánh giá khả năng ức chế khối u của các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang. Kết quả cho thấy các hợp chất trong dịch chiết cho tác dụng chống khối u trên các dòng tế bào ung thư của người HL-60 (bệnh bạch cầu ác tính) và HCT-116 (ung thư ruột kết) với các giá trị IC50 là khác nhau của từng hợp chất [34]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
  16. năng ức chế NF – κB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợp chất có tác dụng ức chế phụ thuộc liều đến khả năng phiên mã của TNF – α có ảnh bởi NF – kB. [35] 1.2. Tổng quan về gốc tự do 1.2.1. Khái niệm Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có một điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [31], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [4, 20]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình. [4] 1.2.2. Các ROS và RNS Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do). [18] (Bảng 1.6) Bảng 1.1. Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  17. ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô. Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa. ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47]. Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống. Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit. [18] Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể. [1,18] Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tím hiệu làm nhiệm vụ: [1] • Điều hòa phân ly tế bào • Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase, ) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm. • Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: [1] • Đột biến ở DNA • Biến tính protein • Oxy hóa lipid 1.2.3. Stress oxy hóa 1.2.3.1. Khái niệm Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa sự sản xuất các gốc tự do và khả năng của cơ thể sống trong việc khử các chất trung gian hoạt tính cao hay sửa chữa các hư hại do những chất này gây ra. Sự nhiễu loạn của trạng thái oxy hóa khử của các mô có thể gây ra các ảnh hưởng độc hại thông qua sự sản @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. sinh của các peroxid và gốc tự do làm hư hại tất cả các thành phần của tế bào, trong đó bao gồm protein, chất béo và DNA [13]. 1.2.3.2. Ảnh hưởng của stress oxy hóa Stress oxy hóa là nguyên nhân quan trọng trong các bệnh gây thoái triển thần kinh, bao gồm bệnh xơ cứng teo cơ một bên (Amyotrophic Lateral Sclerosis - ALS) hay bệnh Lou Gehrig, bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer [30]. Sự sản xuất ROS, RNS liên quan đến con đường bệnh sinh của các bệnh này. Sự tích lũy quá trình stress oxy hóa cùng với sự rối loạn quá trình hô hấp của ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson và các bệnh lý thần kinh khác. [44] Stress oxy hóa cũng được cho là có liên quan đến một số bệnh tim mạch, do sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein - LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và nhiều bệnh tim mạch khác [1]. Đồng thời, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân gây đột quỵ, nhồi máu cơ tim, bệnh tiểu đường. Ngoài ra, stress oxy hóa cũng tham gia vào quá trình phát triển bệnh ung thư liên quan đến tuổi. Các chất hoạt động ROS và RNS gây stress oxy hóa có thể phá hủy trực tiếp DNA, gây ra đột biến và có thể gây ngăn chặn quá trình phân ly tế bào; từ đó thúc đẩy quá trình phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào khối u [20]. Nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sự sản xuất của ROS và RNS trong dạ dày của người, là nguyên nhân của sự phát triển ung thư dạ dày. [23] 1.2.4. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 1.2.4.1. Phương pháp quét gốc tự do DPPH Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl; DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm. [11, 42] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. So với các phương pháp khác, phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp nhanh, đơn giản và ít tốn kém hơn. 1.2.4.2. Phương pháp đánh giá sự khử màu của 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu. Phương pháp sử dụng quang phổ diod-array để đo sự mất màu khi thêm một chất chống oxy hóa gốc có màu xanh lam ABTS· + (2,2-azino-bis (3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)). ABTS· + là một gốc tự do ổn định không tìm thấy trong cơ thể của người. Chất chống oxy hóa sẽ làm chuyển ABTS· + thành ABTS và do đó làm mất màu. [11] 1.2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl Hydroxyl là một chất hoạt động chứa oxy phản ứng mạnh trong hệ thống sống. Nó phản ứng với các acid béo không bão hòa trên màng phospholipid và do đó gây tổn thương tế bào. Khả năng quét gốc tự do hydroxyl được đo bằng phương pháp của Kunchandy và Rao (1990). Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl 2-deoxy-Dribose (28 mM trong 20 mM đệm KH2PO4- KOH, pH 7.4), 500 µl dịch chiết 200 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeCl3 (1:1 v/v), 100 μl H2O2 (1.0 mM) và 100 μL ascorbic acid (1.0 mM), sau đó ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm vào hỗn hợp 1 ml acid thiobarbituric và 1 ml acid trichloroacetic (2,8%) sau đó ủ ở 100ºC trong 20 phút. Đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp cuối ở 532 nm. [11] 1.3. Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan 1.3.1. Acetylcholin Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh có ở tất cả các hạch thần kinh tự chủ và các cơ quan nội tạng được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ, ở các khớp nối thần kinh cơ và có ở nhiều các synap ở hệ thần kinh trung ương. ACh là chất dẫn truyền thần kinh ở sợi tiền hạch của các tế bào thần kinh giao cảm và phó giao cảm, đồng thời chất dẫn truyền thần kinh ở @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. tuyến thượng thận và ở các cơ quan được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ. Tại hệ thần kinh trung ương, ACh được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào thần kinh liên lạc. ACh đươc̣ tổng hơp̣ từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym Cholin acetyltransferase, rồ i bi đ̣ óng gói vào các túi màng bi ̣ràng buôc.̣ Sau sư ̣ xuấ t hiêṇ của môṭ tín hiêụ thầ n kinh ở đầu tận cùng của môṭ sơị truc,̣ các túi màng hơp̣ nhấ t với màng tế bào se ̃ giải phóng ra ACh vào khe synap. Đố i vớ i các tín hiêụ thầ n kinh để đươc̣ dâñ truyền đi tiếp tuc̣ thì ACh phải khuyếch tán sang môṭ tế bào thầ n kinh hoăc̣ tế bào cơ bắ p ở gầ n ngay đó, nơi nó se ̃ ràng buôc̣ và kích hoaṭ môṭ protein thu ̣thể. Sau khi ACh được giải phóng, nó sẽ gắn vào các thụ thể của ACh (thụ thể Nicotinic và Muscarinic). [15] Trong hê ̣ thố ng thầ n kinh trung ương, ACh đóng vai trò quan trong̣ trong viêc̣ dâñ truyền các xung đông̣ thầ n kinh, đảm bảo cho các hoaṭ đông̣ cao cấ p của vỏ naõ như các quá trình nhâṇ thứ c, quá trình trí nhớ , chú ý Khi mức nồng độ ACh giảm xuống thấp, không đủ để gây khử cực, tín hiệu thần kinh sẽ không được truyền đi. Vì vâỵ ACh có liên quan chăṭ che ̃ với bênḥ Alzheimer. 1.3.2. Enzym Acetylcholinesterase Enzym Acetylcholinesterase (AChE) hay acetylhydrolase, là cholinesterase chính trong cơ thể. Nó là enzym xúc tác cho sự phân hủy của acetylcholin và của một vài ester cholin khác có chức năng là các chất dẫn truyền thần kinh. AChE được tìm thấy chủ yếu ở các khớp nối thần kinh cơ và các khớp nối thần kinh của hệ cholinergic. [15] Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, mặc dù sự kết hợp ban đầu của enzym AChE diễn ra ở rìa ngoài, ở vùng ngoại biên. Ở vị trí trên cùng của hẻm, nơi mà quá trình thủy phân xảy ra, có 4 vị trí hoạt động chính của enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl. Các vị trí hoạt động được minh họa như trên hình 1.3 [24]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. Hình 1.3. Các vị trí gắn của enzym AChE [24] 1.3.3. Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến. Bệnh Alzheimer liên quan đến việc mất các tế bào thần kinh cholinergic ở não và sự giảm nồng độ của ACh [1]. Bệnh này thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi [3], tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1 trên 85 vào năm 2050. [3] Các nhà khoa học đã đưa ra một số nguyên nhân để giải thích cơ chế bệnh Alzheimer. Giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt thần kinh bằng ACh (cholinergic). Trong đó, bệnh Alzheimer được cho là do giảm tổng hợp ACh. Các chất ức chế Cholinesterase sẽ làm tăng chức năng của hệ cholinergic bởi nó ức chế enzym phân hủy ACh, do đó làm tăng nồng độ của ACh, kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. Trong thực hành lâm sàng, các chất ức chế ChE vẫn là được sử dụng chính để điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer [20]. Các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế AChE, giúp duy trì được nồng độ ACh bằng cách giảm tốc độ phân hủy ACh. Các loại thuốc hiện đang được các cơ quan quản lý: Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) chấp thuận để điều trị các biểu hiện về nhận thức của bệnh Alzheimer và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân gồm: donepezil, rivastigmine và galantamine là thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là một chất đối kháng thụ thể NMDA. Tacrine là chất ức chế AChE đầu tiên được chấp thuận cho điều trị AD năm 1993, nhưng việc sử dụng nó đã bị bỏ vì có nhiều tác dụng phụ bao gồm gan nhiễm độc gan. [15] 1.3.4. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B. 1.3.4.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB). ❖ Phương pháp đo quang Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [19]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412 nm. Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế enzym AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]. Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [9]. 1.3.4.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double). ❖ Phương pháp đo quang Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [17]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch cơ chất. ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [17]. Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển khai. Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. Ngoài việc sử dụng 2 phương pháp trên, để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z. M. và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di mao quản. Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp. Ngoài ra, những hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Sâm vũ diệp cao giàu saponin. Mẫu nghiên cứu thân rễ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3 - 2016 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Cao chiết Sâm vũ diệp giàu saponin được tiến hành tại khoa Y – Dược, ĐHQGHN, do TS. Nguyễn Hữu Tùng cung cấp. Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ Sâm vũ diệp @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. Tam thất hoang cao giàu saponin. Mẫu nghiên cứu toàn cây tươi Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) được thu hái ở Sa Pa, Lào Cai. Mẫu được giám định tên khoa học Tam thất hoang - Panax stipuleanatus Tsai & Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Cao chiết Tam thất hoang phân đoạn giàu saponin được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp. Bột thô tam thất hoang Kiểm nghiệm dược liệu - Chiết EtOH 50 % - Dung môi/dược liệu (10/1) - To = 90oC - Chiết 1h/lần 3 lần / mẻ. Dịch chiết cồn 50% Cô dưới áp suất giảm Cao lỏng 1:20 Cột resin D101, EtOH 80% Kiểm tra TLC Dịch rửa giải - Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Sấy chân không tại 55-60oC, 24 h Cao giàu hoạt chất Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. 2.2. Dung môi, hóa chất - Hóa chất: • 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck), L-acid ascorbic (Merck) • Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore); 5,5’-dithiobis- (2- nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ). - Dung môi: MeOH (Merck), DMSO 100% (Merk), nước cất. 2.3. Máy móc, dụng cụ - Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ - Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg. - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ) - Pipet, bình định mức - Đầu côn các loại - Cuvet 1ml và 3ml - Eppendorf 1,5 ml (50 chiếc/túi) 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin. ❖ Nguyên tắc của phương pháp DPPH có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm. (hình 2.3) [42] Hình 2.3. Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH ❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Tiến hành pha dung dịch DPPH, dung dịch mẫu thử, mẫu mẫu chứng ở nồng độ thí nghiệm. - Pha dung dịch DPPH: cân chính xác 24 mg DPPH, pha trong 100 ml methanol, thu được dung dịch có nồng độ 0,6 mM. - Pha dung dịch mẫu chứng: cân chính xác 9,3 mg vitamin C, pha trong 1 ml dung dịch DMSO 0,1%. Từ dung dịch vitamin C có nồng độ 9,3 mg/ml pha loãng trong dung dịch methanol thành các nồng độ 1,86 mg/ml, 0,93 mg/ml, 0,46 mg/ml, 0,2325 mg/ml, 0,11625 mg/ml, 0,058125 mg/ml, 0,0290625 mg/ml. - Pha dung dịch mẫu thử: cân chính xác 124 mg Sâm vũ diệp cao giàu saponin trong 1 ml DMSO 0,1 %. Từ dung dịch Tam thất hoang có nồng độ 124 mg/ml pha loãng trong dung dịch methanol thành các nồng độ: 49,6 mg/ml, 24,8 mg/ml, 12,4 mg/ml, 6,2 mg/ml. Dung dịch thử của Tam thất hoang tiến hành tương tự như trên. ❖ Cách tiến hành - Xác định dung dịch làm việc (mẫu chuẩn): hòa tan dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH để thu được dung dịch có độ hấp thụ quang trong khoảng 0,98 ± 0,02 tại bước sóng 517 nm. - Thêm 100 µl dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng ở các nồng độ khác nhau vào 3 ml dung dịch làm việc đã tìm được ở trên. Sau đó ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. - Đo độ hấp thụ quang dung dịch tại bước sóng 517 nm. - Sử dụng MeOH là mẫu trắng. Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần. Phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức: − % Chống oxy hóa = 푠 x 100% Trong đó: là độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn 푠 là độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử/ chứng 2.4.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay. ❖ Nguyên tắc của phương pháp: Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’- dithiobis-2- nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio- 2- nitrobenzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của enzym AChE. [31] Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử Ellman @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. ❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Tiến hành pha đệm Natri phosphat pH 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử và mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm. - Pha đệm Natri phosphat: ➢ Pha dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: hòa tan 31,2g Na 2P 4.2 2O trong 1000 ml nước cất (dung dịch a) ➢ Pha dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: hòa tan 71,6 g 2HP 4.12 2O trong 1000 ml nước cất (dung dịch b) ➢ Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất, định mức trong bình định mức 1000ml. ➢ Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M. ➢ Pha enzym AChE: Cân chính xác 1mg bột AChE (mã số EC 3.1.1.7) tương ứng với 265 đơn vị (265 IU) pha trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl tạo thành dung dịch 5 IU/ml. Từ dung dịch này pha loãng 10 lần thu được dung dịch enzym nồng độ 0,5 IU/ml sử dụng cho phương pháp đo quang. ➢ Pha cơ chất: cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ATCI) pha trong 25ml nước cất thu được dung dịch nồng độ 20 mM. Từ dung dịch này pha loãng 8 lần thành dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM. ➢ Pha thuốc thử: Cân 0,1982g thuốc thử DTNB pha trong 25ml dung dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM. ➢ Pha dung dịch mẫu chứng: Cân chính xác 10 mg berberin clorid hòa tan trong 10 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng thành nồng độ 100 µg/ml, sau đó pha loãng tiếp thành các nồng độ 20 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 2 µg/ml; 0,1 µg/ml và 0,05 µg/ml để tiến hành thử. ➢ Pha dung dịch mẫu thử: Cân chính xác 100 mg Sâm vũ diệp cao giàu saponin, pha trong 10 ml dung dịch DMSO 0,1%, thu được dung dịch nồng độ 10 mg/ml. Từ dung dịch @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. này pha loãng thành các nồng độ 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml và 250 µg/ml để tiến hành thử. Dung dịch thử Tam thất hoang cao giàu saponin được tiến hành tương tự như trên. ❖ Cách tiến hành: - Thêm lần lượt 700 µl dung dịch đệm phosphat 0,1 M, 100 µl dung dịch thử/ chuẩn và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml. Sau đó, trộn đều và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. - Thêm lần lượt 50 µl dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 µl dung dịch ACTI 2,5 mM vào hỗn hợp trên. Sau đó, trộn đều và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 412 nm. - Mẫu chuẩn: được tiến hành như trên nhưng không cho dung dịch thử hoặc chứng. - Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat. Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần. Phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế (% I) được tính theo công thức: − %I = 푠 x 100% Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế : độ hấp thu quang của mẫu chuẩn 푠: độ hấp thu quang của mẫu thử/ mẫu chứng. 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu Sai số giữa các lần đo của cùng một mẫu thử được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn (SD). Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức: ⅀( − ̅)2 SD = √ 푖 푛−1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. Trong đó: 푖 là giá trị đo được lần thứ i ̅ là giá trị trung bình các lần đo n là số lần đo Số liệu thực nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp thống kê thường dùng trong sinh học với sự trợ giúp của phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm 3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Phương pháp quét gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa, với ưu điểm là đơn giản, tiết kiệm và được sử dụng phổ biến. Kết quả về khả năng chống oxy hóa in vitro của vitamin C, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 và hình 3.1, 3.2. Bảng 3.1. Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số 0,0290625 8,41 0,0311 0,058125 25,63 0,0127 0,11625 46,20 0,0141 0,2325 73,71 0,0275 0,46 81,81 0,0063 0,93 97,92 0,0063 1,86 98,38 0,0042 Bảng 3.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số 6,2 30,74 0,0247 12,4 42,65 0,0084 24,8 58,16 0,0169 49,6 75,28 0,0311 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  35. Bảng 3.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa Sai số 6,2 19,00 0,0176 12,4 33,38 0,0176 24,8 42,20 0,0084 49,6 62,46 0,0134 Sâm vũ diệp cao giàu saponin Tam thất hoang cao giàu saponin Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của vitamin C Bảng 3.4. Giá trị IC50 chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong phương pháp DPPH Mẫu thử 푰푪 (mg/ml) Sâm vũ diệp cao giàu saponin 18,000 Tam thất hoang cao giàu saponin 31,620 Vitamin C 0,126 Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy cao giàu saponin Sâm vũ diệp cho tác dụng chống oxy hóa tốt hơn Tam thất hoang trong phương pháp DPPH, với giá trị IC50 lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml. Tuy nhiên, giá trị IC50 chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao hơn rất nhiều so với giá trị IC50 của vitamin C (0,126 mg/ml). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. 3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.5, 3.6, 3.7 và hình 3.3. Bảng 3.5. Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin Nồng độ (µg/ml) % Hoạt tính enzym Sai số AChE bị ức chế (%) 0,05 6,50 0,0113 0,1 18,70 0,0247 2 51,92 0,0063 5 54,71 0,0077 10 56,68 0,0544 20 60,74 0,0516 Giá trị IC50 = 1,454 µg/ml Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. Bảng 3.6 . Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin Nồng độ (µg/ml) % Hoạt tính enzym Sai số AChE bị ức chế (%) 250 18,35 0,0579 500 26,48 0,0183 1000 13,24 0,0523 2000 31,53 0,0063 4000 26,19 0,0021 Bảng 3.7. Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin Nồng độ (µg/ml) % Hoạt tính enzym Sai số AChE bị ức chế (%) 250 15,33 0,0113 500 14,92 0,0247 1000 14,23 0,0049 2000 14,29 0,0183 4000 11,32 0,0473 Giá trị IC50 của berberin là 1,454 µg/ml. Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi chưa tính được giá trị IC50 của mẫu thử Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. Nhận xét: % Hoạt tính enzym AChE bị ức chế của cả Sâm vũ diệp và Tam thất hoang không có sự khác nhau nhiều giữa các nồng độ thử. Khi tăng nồng độ thử thì % hoạt tính enzym AChE bị ức chế của mẫu thử không tăng. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. Bước đầu thí nghiệm cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE. 3.2. Bàn luận 3.2.1. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Sâm vũ diệp và Tam thất hoang là 2 loài thuộc chi Panax L Các kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của 2 loài này là saponin với hàm lượng cao. Nhiều loài cây thuốc thuộc chi Panax L. đã được khẳng định giá trị sử dụng như Panax ginseng C.A. Meyer , Panax quinquefolius L., Panax notoginseng, Panax japonicus và Panax vietnamensis Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài cây đều cho thấy thành phần hóa học chính là các saponin. Đây cũng là thành phần chính cho tác dụng sinh học của các loài cây này [26]. Trong đó có tác dụng chống oxy hóa. Một số nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các loài Panax ginseng C.A. Meyer và Panax quinquefolius L Dịch chiết của Nhân sâm châu Á và Nhân sâm Bắc Mỹ đều có khả năng ngăn cản phản ứng mạnh của gốc tự do hydroxyl trong in vitro và cản trở quá trình lấy oxy trong quá trình oxy hóa nhũ tương acid linoleic có xúc tác của sắt [30, 51]. Trong một thử nghiệm ex vivo, các ginsenosid Rb1 và Rg1 có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan và não chuột [16]. Các ginsenosid Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Re, Rg1, Rg2 và Rh1 có tác dụng làm giảm mức độ superoxid trong hệ thống enzym xanthin oxidase [26]. Gần đây, hỗn hợp saponin được phân lập từ lá và thân loài sâm Mỹ (Panax quinquefolius L.) được trồng tại Trung Quốc được báo cáo là có tác dụng ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) với sự có mặt của ion đồng [36]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, hoạt tính chống oxy hóa của các loài thuộc họ Nhâm sâm và một số loài thực vật khác liên quan đến quét các gốc tự do có thể liên quan đến thành phần ginsenoside Rb1/Rb2 trong chúng [26]. Năm 2001, Hu, C., & Kitts, D. D. đã tiến hành đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các loài thuộc chi Panax. L với thành phần các ginsenosid chiếm tỷ lệ cao, sử dụng phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyd. Kết quả cho thấy ở mức liều 5 mg/ml, % chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  40. của P. ginseng C.A. Meyer và P. quinquefolium L lần lượt là 64,7% ± 2,1 và 52,1% ± 1,5. [26] Với thành phần tương tự như các loài khác trong chi Panax L., Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa. Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của 2 loài này được tiến hành sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH. Đây là phương pháp phổ biến, nhanh và tiết kiệm hơn so với các phương pháp khác. Bước đầu nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin có tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp quét gốc tự do DPPH. Tuy nhiên, khả năng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin thấp, thấp hơn nhiều lần so với khả năng chống oxy hóa của vitamin C. Giá trị IC50 chống oxy hóa của vitamin C là 0,126 mg/ml. Giá trị này khá gần so với giá trị IC50 của vitamin C trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa khác cũng sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH với vitamin C là chất chứng. Trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al. (2014) đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết saponin từ Radix Trichosanthis, sử dụng phương pháp DPPH, giá trị IC50 của vitamin C là 0,9908 ± 0,08 mg/ml [23]. Sự khác nhau nhỏ về giá trị IC50 của vitamin C trong nghiên cứu được công bố này với giá trị thu được từ nghiên cứu tiến hành có thể do sự khác nhau về nguyên liệu vitamin C sử dụng làm mẫu chứng và điều kiện tiến hành thí nghiệm. Trong nghiên cứu của Chen, Ying, et al. (2014), 1 ml mẫu thử ở điều kiện khác nhau được thêm vào 2 ml dung dịch DPPH (dung dịch DPPH pha bằng cách thêm 10 mg DPPH pha trong 1 ml MeOH), hỗn hợp sau đó được ủ trong 30 phút.[14] Kết quả nghiên cứu tiến hành cho giá trị IC50 chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml. Kết quả thu được cho thấy tác dụng chống oxy hóa của cao giàu saponin của 2 loài này không cao. So với nghiên cứu trước đó, năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao thân rễ và rễ củ của Tam thất hoang cho thấy cao saponin toàn phần của @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Tam thất hoang thể hiện tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl diandehyd ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml [5]. Kết quả này cho thấy cao saponin toàn phần của Tam thất hoang cho tác dụng chống oxy hóa trên in vivo cao. Sự khác biệt về kết quả thu được giữa nghiên cứu được tiến hành và nghiên cứu của Trần Công Luận có thể do sự khác nhau về đối tượng nghiên cứu và phương pháp tiến hành. Nghiên cứu của Trần Công Luận được thực hiện trên in vivo và đánh giá cao saponin toàn phần. Trong cao saponin toàn phần, thành phần các hợp chất khác trong 2 loài có thể cao hơn trong cao giàu saponin sử dụng trong nghiên cứu này. Điều này có thể ảnh hưởng đến kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa bởi các thành phần phenolic và các flavonoid (là những thành phần hiện diện trong các loài thuộc chi Panax L.) cũng cho tác dụng chống oxy hóa cao [26]. Ở các nghiên cứu trên các loài khác không thuộc chi Panax L., thành phần saponin trong dịch chiết các loài thực vật khác nhau cũng được đánh giá cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh. Nghiên cứu của Chen, Ying, et al. (2014) cho thấy dịch chiết saponin các phân đoạn của Radix Trichosanthis cho tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH. Tổng hàm lượng saponin trong dịch chiết các phân đoạn n-butanol, EtOAc và hỗn hợp dịch chiết 2 phân đoạn n-butanol và EtOAc lần lượt là 1,824, 1,678 và 2,3998 mg. Giá trị IC50 chống oxy hóa trong phương pháp DPPH của các phân đoạn này lần lượt là 2,9246 ± 0,15, 2,8428 ± 0,11 và 4,3972 ± 0,23 mg/ml. Giá trị này cho thấy dịch chiết saponin các phân đoạn khác nhau của Radix Trichosanthis cho tác dụng chống oxy hóa mạnh [14]. Trong nghiên cứu được tiến hành, mặc dù Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng có hàm lượng saponin cao, tuy nhiên chưa thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh trong phương pháp DPPH. Sự sai khác về kết quả thu được với các nghiên cứu trước đó có thể do sự khác nhau về điều kiện thí nghiệm như đã trình bày ở trên cũng như đối tượng nghiên cứu. Trong các phân đoạn chiết khác nhau, hàm lượng các saponin là khác nhau. Các saponin cấu trúc khác nhau cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa là khác nhau. Đồng thời, các thành phần không phải là saponin cũng có thể cho tác dụng chống oxy hóa. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. Hơn nữa, theo nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết các loài thuộc chi Panax L. liên quan đến cả các hợp chất phân cực và không phân cực trong dịch chiết [26]. Khi đó, phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH cũng có những hạn chế nhất định. Phương pháp đánh giá qua sự khử màu ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic acid) có thể áp dụng cho cả các chất chống oxy hóa thân nước và các chất chống oxy hóa thân dầu cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu [11, 26]. Khi đó, kết quả về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết thực vật có thể sẽ cao hơn khi sử dụng phương pháp này. 3.2.2. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang Các loài thực vật chứa saponin sớm được biết đến có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe trước khi thành phần saponin được phân lập, xác định là thành phần cho hoạt tính sinh học. Các saponin đã được báo cáo là cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau bao gồm chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, có tác dụng cải thiện nhận thức và giúp giảm đau [45]. Tác dụng bảo vệ thần kinh của saponin trong các bệnh như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, bệnh teo cơ xơ cứng một bên, rối loạn tiểu não, được báo cáo ngày càng nhiều. Một vài saponin được báo cáo có tác dụng bảo vệ thần kinh là ginsenoside (Takagi et al., 1972), xanthocerasid (Chi et al., 2009), panaxatriol saponin (Yao and Li, 2002) [45]. Theo nghiên cứu, hợp chất ginsenosid K, một hợp chất chuyển hóa của saponin khung protopanaxadiol được sản xuất từ ruột của vi khuẩn, được chứng minh cho tác dụng cải thiện đáng kể sự suy giảm trí nhớ và mất các khớp nối thần kinh trên chuột. Ginsenosid Rg1 và Rb1 có thể làm tăng độ bền của dây thần kinh. Những kết quả nghiên cứu thu được có giá trị lớn cho việc điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh rối loạn đặc trưng bởi sự mất tế bào thần kinh (Cheng et al., 2005) [45]. Hơn nữa, Nhâm sâm và các ginsenosid Rg1, Rg3 và Re cho kết quả làm giảm đáng kể lượng Aβ được phát hiện trong não động vật (những đoạn Aβ ngắn là dạng Aβ gây bệnh chủ yếu. Chúng liên kết với thụ thể bề mặt của tế bào thần kinh và thay đổi cấu trúc của khớp thần kinh, do đó ngăn cản dẫn truyền tín hiệu thần kinh). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. Các loài thuộc chi Panax L. với thành phần hóa học chủ yếu là saponin cũng đã được nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ tế bào thần kinh, ngăn ngừa stress oxy hóa trong sự cải thiện tình trạng bệnh Alzheimer. Trong một nghiên cứu nhãn mở đánh giá tác dụng lên nhận thức của Nhâm sâm trong bệnh Alzheimer, Nhân sâm giúp tăng nhận thức cho bệnh nhân bệnh Alzheimer. Các ginsenosid ngoài tác dụng giúp làm giảm lượng Aβ còn giúp làm tăng mật độ các khớp nối thần kinh ở vùng hồi hải mã. Đồng thời các ginsenosid có tác dụng chống oxy hóa, quét các gốc tự, do đó có tác dụng ức chế sự chết của tế bào theo chương trình (apoptosis) và sự quá tải Canxi. Nhân sâm cũng giúp làm tăng lượng máu lưu thông lên não [33]. Trong nghiên cứu của Zhong, Z., et al. (2005), Tam thất (Panax notoginseng) cho tác dụng bảo vệ các tế bào thần kinh cholinergic trên chuột mắc bệnh Alzheimer. Saponin trong Tam thất cũng giúp làm tăng số lượng và chất lượng tế bào thần kinh, đồng thời giúp làm tăng nồng độ và hoạt tính của Cholin acetyltransferase do đó giúp bảo vệ và cải thiện hệ thần kinh cholinergic; giúp ức chế quá trình lão hóa và chứng mất trí qua việc cải thiện và sửa chữa các tế bào thần kinh hỏng. [52] Nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của Tam thất với hàm lượng cao saponin trên chuột SAMP8 cho thấy Tam thất có tác dụng giảm sự mất các tế bào thần kinh ở vùng CA1 dưới đồi. Hơn nữa, thành phần saponin trong Tam thất có tác dụng ức chế sự sản xuất của 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), giúp tăng cường sự biểu hiện và hoạt động của SOD, CAT và GSH- PX; đồng thời cải thiện mức độ mARN và sự biểu hiện của protein của UCP4 và UCP5 ở não chuột SAMP8. Nghiên cứu cũng cho thấy saponin trong Tam thất có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh đối với não bộ mắc bệnh Alzheimer do sự phá hủy của stress oxy hóa thông qua việc làm giảm hoạt động của 8- OHdG; qua việc tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa và mức độ biểu hiện của UCP4 và UCP5 [25]. Do vậy mà thành phần saponin trong Tam thất hứa hẹn là ứng viên trong điều trị bệnh Alzheimer. [27] Với thành phần tương tự như các loài khác trong chi Panax L., Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin cũng có thể cho tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer. Nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  44. enzym AChE in vitro của 2 loài này được tiến hành sử dụng phương pháp đo quang in vitro dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử Ellman. Bước đầu nghiên cứu cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE trên in vitro. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của dịch chiết saponin của nhiều loài thực vật và kết quả cho thấy tác dụng ức chế cao. Nghiên cứu dịch chiết saponin từ hạt fenugreek (cỏ ca ri) của Khalil, W. K., Roshdy, H. M., & Kassem, S. M. (2016), cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE và hoạt tính ức chế enzym AChE tăng khi nồng độ của saponin trong dịch chiết tăng [28]. Trong một nghiên cứu khác của Asaduzzaman M et al (2014), dịch chiết lá cây Aegle marmelos phân đoạn ethyl acetate cho tác dụng ức chế AChE và có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất trong phương pháp DPPH. Thành phần trong dịch chiết này bao gồm các phenol, các flavonoid, alkaloid, saponin, glycosid, tannin và các steroid. [12] Sự khác biệt giữa kết quả thu được và các nghiên cứu trước đó có thể do một số nguyên nhân. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa dịch chiết của các loài thực vật chứa saponin với bệnh Alzheimer trên in vitro, trong đó có tác dụng ức chế enzym AChE, còn hạn chế, hầu hết các nghiên cứu, đánh giá được tiến hành trên in vivo. Kết quả thu được trên in vitro có thể không tương đồng với kết quả trên in vivo. Mặc dù, cao chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hàm lượng cao các saponin, song có thể các thành phần ginsenosid Rg1, Rg3 Re, Rb1 (theo nghiên cứu là những saponin cho tác dụng sinh học đối với bệnh Alzheimer) có hàm lượng không cao trong cao chiết sử dụng. Hơn nữa, các thành phần khác không phải là saponin trong các dịch chiết thực vật cũng có thể cho tác dụng đối với bệnh Alzheimer. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã: 1. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin, sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH. - Sâm vũ diệp cao giàu saponin thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH với giá trị IC50 là 18,000 mg/ml - Tam thất hoang cao giàu saponin cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH với giá trị IC50 là 31,620 mg/ml Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin thể hiện tác dụng chống oxy hóa thấp, giá trị IC50 chống oxy hóa của cao giàu saponin của 2 loài này thấp hơn nhiều so với vitamin C. 2. Bước đầu đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin, sử dụng phương pháp đo quang in vitro dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử Ellman. Bước đầu nghiên cứu cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE in vitro. ĐỀ XUẤT 1. Đây là các nghiên cứu đánh giá bước đầu. Các phương pháp sử dụng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE có ưu điểm là được sử dụng phổ biến, nhanh, đơn giản và tiết kiệm. Tuy nhiên, trong mỗi phương pháp, các điều kiện nghiên cứu như hàm lượng chất, thời gian ủ cũng có sự khác nhau ở mỗi nghiên cứu đã được công bố. Trong thời gian tới, tiếp tục tối ưu hóa phương pháp sử dụng. 2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn khác của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang hoặc của các saponin tinh khiết đã phân lập được của 2 loài này. 3. Đánh giá lại tác dụng chống oxy hóa của cao chiết ở các phân đoạn khác nhau của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vivo, sử dụng phương pháp nghiền đồng thể, định lượng enzym MDA. 4. Đánh giá lại tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh Alzheimer trên in vivo. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lại Thị Ngoc Hà (2009), “Stress oxy hóa và các chất chống oxy hóa tự nhiên”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2009, Tập 7, số 5, 667 – 677. 2. Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi (2014), “Thành phần hóa học cặn chiết ethyl acetat Sâm vũ diệp”, Tạp chí Dược liệu, 2. 3. Phạm Khuê (2002), “Bệnh Alzheimer”, Nhà xuất bản Y học. 4. GS. Phan Chúc Lâm, ‘Tham luận về gốc tự do”, Tạp chí hội thần kinh học Việt Nam tập 7. 5. Trần Công Luận (2002), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của 2 loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí Dược liệu, 8 (2), 93 - 94.21. (20) 6. Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học của 2 loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí Dược liệu, 1(14), 17-23. 7. Lã Đình Mỡi, et al, “Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) – Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam ”, Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. 8. Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), Triterpene trong cây thuộc chi nhân sâm và mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý, Thực vật phân loại học báo cáo, 13(2), 29 - 44 TIẾNG ANH 9. Adewusi, E. A., & Steenkamp, V. (2011), “In vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from southern Africa”, Asian Pacific journal of tropical medicine, 4(10), 829-835. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  47. 10. Adsersen, Anne, et al. (2006), "Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity" Journal of ethnopharmacology 104(3), 418-422 11. Alam, M. N., Bristi, N. J., & Rafiquzzaman, M. (2013), “Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity”, Saudi Pharmaceutical Journal, 21(2), 143-152. 12. Asaduzzaman, Md, et al. (2014), "In vitro acetylcholinesterase inhibitory activity and the antioxidant properties of Aegle marmelos leaf extract: implications for the treatment of Alzheimer's disease", Psychogeriatrics 14(1), 1-10. 13. Betteridge, D. J. (2000), “What is oxidative stress?”, Metabolism, 49(2), 3-8. 14. Chen, Ying, et al. (2014), "Antioxidant activities of saponins extracted from Radix Trichosanthis: an in vivo and in vitro evaluation", BMC complementary and alternative medicine 14(1), 86. 15. Colovic, Mirjana B., et al. (2013), "Acetylcholinesterase inhibitors: pharmacology and toxicology." Current neuropharmacology 11(3), 315-335. 16. Deng, H.L., and J.T. Zhang (1991), “Anti-Lipid Peroxidative Effect of Ginsenoside Rb1 and Rg1”, Chinese Med. J. 104, 395–398. 17. Di Giovanni, Saviana, et al. (2008), "In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods" european journal of pharmaceutical sciences 33(2), 109-119 18. Di Meo, Sergio, et al. (2016), "Role of ROS and RNS sources in physiological and pathological conditions" Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016. 19. Ellman, George L., et al. (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity" Biochemical pharmacology 7(2): 88-95. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 20. Gilgun-Sherki, Y., Melamed, E., & Offen, D. (2001), “Oxidative stress induced-neurodegenerative diseases: the need for antioxidants that penetrate the blood brain barrier”, Neuropharmacology, 40(8), 959-975. 21. Grossberg, G. T. (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer's Disease: Getting On and Staying On”, Current Therapeutic Research, 64(4), 216-235. 22. Halliwell, B. (2007), “Oxidative stress and cancer: have we moved forward?”, Biochemical Journal, 401(1), 1-11. 23. Handa, O., Naito, Y., & Yoshikawa, T. (2011), “Redox biology and gastric carcinogenesis: the role of Helicobacter pylori”, Redox Report, 16(1), 1-7. 24. Houghton, P. J., Ren, Y., & Howes, M. J. (2006), “Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi”, Natural Product Reports, 23(2), 181-199. 25. Huang, Jin-Lan, et al. (2017), “Neuroprotective properties of Panax notoginseng saponins via preventing oxidative stress injury in SAMP8 mice", Evidence-based Complementary and Alternative Medicine 2017. 26. Hu, C., & Kitts, D. D. (2001), “Free radical scavenging capacity as related to antioxidant activity and ginsenoside composition of Asian and North American ginseng extracts”, Journal of the American Oil Chemists' Society, 78(3), 249-255. 27. Jiang, Y., Gao, H., & Turdu, G. (2017), “Traditional Chinese Medicinal Herbs as potential AChE inhibitors for anti-Alzheimer’s Disease: A review”, Bioorganic chemistry. 28. Khalil, W. K., Roshdy, H. M., & Kassem, S. M. (2016), “The potential therapeutic role of Fenugreek saponin against Alzheimer's disease: Evaluation of apoptotic and acetylcholinesterase inhibitory activities”, Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol, 6(09), 166-173. 29. Kim, J. H. (2017), “Pharmacological and medical applications of Panax ginseng and ginsenosides: A review for use in cardiovascular diseases”, Journal of Ginseng Research. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 30. Kitts, D.D., A.N. Wijewickreme, and C. Hu (2000), “Antioxidant Properties of North American Ginseng Extract”, Mol. and Cell. Biochem. 203, 1–10. 31. Komersová, A., Komers, K., & Čegan, A. (2007), “New findings about Ellman’s method to determine cholinesterase activity”, Zeitschrift für Naturforschung C, 62(1-2), 150-154. 32. Kumar Sharma, S., & Krishan Pandit, M. (2009), “A new species of Panax L.(Araliaceae) from Sikkim Himalaya, India”, Systematic botany, 34(2), 434-438. 33. Lee, Soon-Tae, et al. (2008), "Panax ginseng enhances cognitive performance in Alzheimer disease." Alzheimer Disease & Associated Disorders 22(3), 222-226. 34. Liang, Chun, et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities" Bioorganic & medicinal chemistry letters 20(23), 7110-7115. 35. Liang, Chun, et al. (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB" Journal of ginseng research 37(1), 74. 36. Li, J.P., M. Huang, H. Teoh, and R.Y.K. Man (1999), “Panax quinquefolium Saponins Protect Low-Density Lipoproteins from Oxidation”, Life Sci. 64, 53–62. 37. Lobo, Vijaya, et al. (2010), "Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health", Pharmacognosy reviews 4(8), 118. 38. Mancuso, C., & Santangelo, R. (2017), “Panax ginseng and Panax quinquefolius: From pharmacology to toxicology”, Food and Chemical Toxicology, 107, 362-372. 39. Nguyen, M. D., et al. (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. I", Chemical & pharmaceutical bulletin 41(11), 010-2014. 40. Ng, T. B. (2006), “Pharmacological activity of sanchi ginseng (Panax notoginseng)”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58(8), 1007-1019. 41. Pandey, A. K., Ali, M. A., & Mao, A. A. (2007), “Genus Panax L.(Araliaceae) in India”, Pleione, 2, 46-54. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. 42. Patel Rajesh, M., & Patel Natvar, J. (2011), “In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical scavenging methods”, Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 1, 52-68. 43. Patel, V. P., & Chu, C. T. (2011), “Nuclear transport, oxidative stress, and neurodegeneration”, International journal of clinical and experimental pathology, 4(3), 215. 44. Ramalingam, M., & Kim, S. J. (2012), “Reactive oxygen/nitrogen species and their functional correlations in neurodegenerative diseases”, Journal of neural transmission, 119(8), 891-910. 45. Sun, Aijing, et al. (2015), "Neuroprotection by saponins", Phytotherapy research 29(2), 187-200. 46. Tung, Nguyen Huu, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 59(11), 1417-1420. 47. Valko, Marian, et al. (2007), "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease" The international journal of biochemistry & cell biology 39(1), 44-84. 48. Yang C. R., Jiang Z. D., et al. (1985), “Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus”, Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 103 - 106. 49. Yang, Wen-zhi, et al. (2014), "Saponins in the genus Panax L.(Araliaceae): a systematic review of their chemical diversity." Phytochemistry 106, 7-24. 50. Wang D. Q., et al. (1988), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng", Acta pharmaceutica Sinica, 24(8), 593 - 599 51. Zhang, D., T. Yasuda, Y. Yu, P. Sheng, T. Kawabata, Y. Ma, and S. Okada (1996), “Ginseng Extract Scavenges Hydroxyl Radicals and Protects Unsaturated Fatty Acid from Decomposition Caused by Iron- Mediated Lipid Peroxidation”, Free Radicals Biol. Med. 20, 145–150. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. 52. Zhong, Z., et al. (2005), "Protective effects of Panax notoginseng saponins against pathological lesion of cholinergic neuron in rat model with Alzheimer's disease." Zhong yao cai= Zhongyaocai= Journal of Chinese medicinal materials 28(2), 119-122. 53. Zou K., et al. (2002), “Analysis of saponins of Panax stipuleanatus by using HPLC and APIMS/MS techniques”, Journal of University of Hydraulicand Electric Engineering/yichang, 24, 355 - 358 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU