Khóa luận Khảo sát tác động chống đông máu của các phân đoạn nọc bọ cạp (Heterometrus laoticus)

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát tác động chống đông máu của các phân đoạn nọc bọ cạp (Heterometrus laoticus)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN HỒNG MỸ AN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP Heterometrus laoticus KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC TP.HCM – 2018
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH TRANG PHỤ BÌA NGUYỄN HỒNG MỸ AN KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP Heterometrus laoticus Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. Hồng Thị Phương Liên TP.HCM – 2018
3. LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: - Đây là đề tài nghiên cứu của tơi. - Số liệu trong đề tài này là chính xác và trung thực. - Tơi xin chịu trách nhiệm về đề tài nghiên cứu của tơi. Chữ ký sinh viên Nguyễn Hồng Mỹ An
4. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Nguyễn Tất Thành, khoa Dược và bộ mơn Dược lý đã tạo điều kiện tốt nhất để em hồn thành khĩa luận tốt nghiệp. Em xin cảm ơn TSKH. Hồng Ngọc Anh đã đặt nền mĩng cho những nghiên cứu về lồi Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus), để từ đĩ em cĩ cơ sở thực hiện đề tài này. Em xin đặc biệt cảm ơn ThS.DS. Hồng Thị Phương Liên - bộ mơn Dược lý đã truyền đạt những kiến thức cần thiết, những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học và đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn em thực hiện khĩa luận. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên trong bộ mơn Dược lý đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cơ trong Hội đồng phản biện đã đưa ra các nhận xét và gĩp ý quý giá để báo cáo khĩa luận của em được hồn thiện hơn. Cuối cùng, mình cảm ơn các bạn trong nhĩm monitor bộ mơn Dược lý đã hỗ trợ, giúp đỡ mình hồn thành khĩa luận. Sinh viên Nguyễn Hồng Mỹ An
5. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỊ CẠP 2 1.1.1. Giới thiệu về bị cạp 2 1.1.2. Độc tính của nọc bọ cạp 4 1.1.3. Tác dụng dược lý của nọc bọ cạp 5 1.1.4. Cơ chế tác động của nọc bọ cạp 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ BỊ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus) 10 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU 12 1.3.1. Tiểu cầu 12 1.3.2. Cầm máu 15 1.3.3. Rối loạn đơng máu 19 1.3.4. Những chất chống đơng máu 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. NGUYÊN LIỆU 23 2.1.1. Nọc Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 23 2.1.2. Động vật thử nghiệm 23 2.1.3. Dụng cụ 23 2.1.4. Hĩa chất 23 2.2. PHƯƠNG PHÁP 24 2.3. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 25 3.1. KẾT QUẢ 25 i
6. 3.1.1. Tác động của chất khảo sát lên quá trình đơng máu 25 3.1.2. Tác động của chất khảo sát lên quá trình chảy máu 26 3.2. BÀN LUẬN 28 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 31 4.1. KẾT LUẬN 31 4.2. ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii
7. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt chữ viết tắt ADP Adenosine diphosphate BKCa Big conductance potassium Kênh Kali được hoạt hĩa bởi Calci channel cĩ độ dẫn lớn BmK Buthus martensi Karsch. DIC Disseminated intravascular Hội chứng đơng máu rải rác/ lan tỏa coagulation DS. Dược sĩ hNav Human voltage-gated sodium Kênh Natri cảm ứng điện thế ở channel người IKCa Intermediate conductance Kênh Kali được hoạt hĩa bởi Calci potassium channel cĩ độ dẫn trung bình KCa Calcium-activated potassium Kênh Kali được hoạt hĩa bởi Calci channel KTx Toxin tác động lên kênh Kali Kv Voltage-gated potassium Kênh Kali cảm ứng điện thế channel Nav Voltage-gated sodium channel Kênh Natri cảm ứng điện thế PAF Platelet activator factor Yếu tố hoạt hĩa tiểu cầu PĐ Phân đoạn PĐTC Phân đoạn thứ cấp PPP Platelet poor plasma Huyết tương nghèo tiểu cầu iii
8. PRP Platelet rich plasma Huyết tương giàu tiểu cầu rNav Human voltage-gated sodium Kênh Natri cảm ứng điện thế ở channel chuột RyR Ryanodine receptor Thụ thể Ryanodin SKCa Small conductance potassium Kênh Kali được hoạt hĩa bởi Calci channel cĩ độ dẫn nhỏ ThS. Thạc sĩ TSKH./ Doctor of Science Tiến sĩ khoa học D.Sc. iv
9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bọ cạp hĩa thạch 2 Hình 1.2. Cấu tạo cơ thể bị cạp Androctonus crassicauda 3 Hình 1.3. Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 10 Hình 1.4. Phần đuơi (metasoma) của Heterometrus laoticus 11 Hình 1.5. Các giai đoạn của quá trình sinh tiểu cầu 13 Hình 1.6. Các tế bào máu 13 Hình 1.7. Hình dạng tiểu cầu 13 Hình 1.8. Cấu trúc của tiểu cầu 14 Hình 1.9. Quá trình đơng máu 17 Hình 1.10. Các giai đoạn của quá trình đơng máu 17 Hình 1.11. Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu, tạo cục máu đơng 18 Hình 1.12. Quá trình tan cục máu đơng 19 Hình 3.1. Thời gian đơng máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg 25 Hình 3.2. Thời gian chảy máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg 27 v
10. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các yếu tố đơng máu trong huyết tương 18 Bảng 3.1. Thời gian đơng máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lơ chứng (NaCl 0,9%) 25 Bảng 3.2. Thời gian chảy máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lơ chứng (NaCl 0,9%) 27 vi
11. Khĩa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 - 2018 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỌ CẠP (Heterometrus laoticus) Nguyễn Hồng Mỹ An Hướng dẫn khoa học: ThS. Hồng Thị Phương Liên Đặt vấn đề Phân đoạn 5 của nọc bị cạp Heterometrus laoticus An Giang cĩ tác động chống đơng mạnh vượt trội ở thử nghiệm in vitro. Từ phân đoạn 5, đã phân lập được 24 phân đoạn thứ cấp, trong đĩ cĩ 3 phân đoạn sạch là 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3. Đề tài này được thực hiện nhằm khảo sát tác động của phân đoạn 5 và các phân đoạn thứ cấp trên lên thời gian đơng – chảy máu. Đối tượng – phương pháp Nọc bọ cạp: phân đoạn 5, các phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 được cung cấp bởi TSKH. Hồng Ngọc Anh (Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện hàn lâm khoa học và cơng nghệ Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh). Động vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss albino do Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp. Phương pháp: Tiêm tĩnh mạch đuơi chuột dung dịch NaCl 0,9% (lơ chứng) và các phân đoạn khảo sát pha trong NaCl 0,9% với liều 2,48 mg/kg (lơ thử), thể tích tiêm là 0,1 ml/10g thể trọng chuột. Thời gian chảy máu: Cắt 1 đoạn đuơi chuột (dài 5 mm, đường kính 1,5 mm) từ đầu mút ngồi. Nhúng phần đuơi cịn lại vào dung dịch NaCl 0.9% ở 37oC. Tính thời gian chảy máu tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm. Thời gian đơng máu: Lấy 1 giọt máu (đường kính 6-7 mm) từ vết cắt đuơi chuột lên lam kính. Tính thời gian đơng máu tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm. Kết quả Phân đoạn 5 và các phân đoạn thứ cấp được khảo sát cho thấy tác dụng kéo dài thời gian đơng – chảy máu so với nhĩm chứng. Trong đĩ, phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.22.3 cĩ tác động mạnh hơn và phân đoạn thứ cấp 5.21.1 cĩ tác động yếu nhất. Kết luận Phân đoạn 5 và các phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 cĩ tác động chống đơng máu ở liều 2,48 mg/kg Từ khĩa: nọc bị cạp, Heterometrus laoticus, chống đơng máu, thời gian chảy máu, thời gian đơng máu
12. Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2013 – 2018 ANTICOAGULANT ACTIVITY OF FRACTIONS FROM Heterometrus laoticus SCORPION VENOM Nguyen Hoang My An Supervisor: Hoang Thi Phuong Lien Introduction The fraction 5 of Heterometrus laoticus venom (from An Giang province, Viet Nam) shows anticoagulant activity in vitro. This fraction was separated into 24 sub-fractions and 3 of them (5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3) are clean. Therefore, this study was conducted to investigate the anticoagulant activity of fractions 5, 5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3 in vivo. Materials – Methods Scorpion venom: fraction 5, sub-fractions 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (provided by D.Sc. Anh Ngoc Hoang, Institute in Applied Materials Science, Vietnam Academy of Science and Technology, Ho Chi Minh City). Mice: Swiss albino mice were provided by Institute of Vaccines and Biological Medical- IVAC. Method: Solution of the fractions in 0,9% NaCl were injected into the lateral vein of the mouse tail at a dose of 2,48 mg/kg (injection volume 0,1 ml/10g of body mouse weight). The mice of the control group received only 0,9% NaCl solution. Determination of Bleeding Time: Amputate the mouse tail (about 5 mm long from the outside end, diameter of about 1,5 mm), soak the remaining tail into the 0,9% NaCl solution at 37oC. Calculate the bleeding time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection. Determination of Blood Coagulation Time: Take a drop of blood from the amputated tail on the glass (diameter of about 6-7 mm). Calculate the clotting time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection. The results Fraction 5 and 3 sub-fractions have bleeding time and blood coagulation time longer than control. Specifically, sub-fraction 5.5.1, 5.22.3 have stronger effect and sub-fraction 5.21.1 has weaker effect. Conclusion Fraction 5 and sub-fraction 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 have anticoagulant activity at a dose of 2,48 mg/kg. Key words: scorpion venom, Heterometrus laoticus, anticoagulation, bleeding time, blood coagulation time
13. ĐẶT VẤN ĐỀ Bị cạp là lồi động vật chân đốt, thuộc lớp Arachnida, đã cĩ mặt trên Trái đất từ trước khi con người xuất hiện và chúng được mệnh danh là “hĩa thạch sống” [27]. Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, bị cạp đã được sử dụng như một vị thuốc chữa kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván, tràng nhạc [3]. Trong y học hiện đại, nọc bị cạp trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong và ngồi nước. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được các polypeptide trong nọc bị cạp cĩ hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và kháng virus [53], thể hiện được tác động giảm đau, kháng viêm, chống động kinh và chống đơng máu [14, 17, 29-31, 38, 41, 54-56]. Ngồi ra, chúng đã mở ra tiềm năng phát triển các thuốc điều trị rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50] và điều trị ung thư [24]. Heterometrus laoticus cịn được gọi là bị cạp đen hoặc bị cạp rừng là một trong những loại bị cạp phổ biến ở miền Nam Việt Nam. Những năm qua đã cĩ những nghiên cứu về nọc độc của lồi bị cạp này và đã chứng minh được chúng cĩ tác dụng kháng khuẩn [51], giảm đau – kháng viêm [6-10, 33]. Từ nọc bị cạp Heterometrus laoticus An Giang, đã tách được 5 phân đoạn (PĐ). TSKH. Hồng Ngọc Anh cùng các đồng sự đã chứng minh được các PĐ 2, 4 và 5 cĩ tác dụng chống đơng máu trong thử nghiệm in vitro [2]. Cũng từ PĐ 5, đã cĩ 24 phân đoạn thứ cấp (PĐTC) được phân lập, trong đĩ cĩ 3 PĐTC sạch là 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3. Đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐƠNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỊ CẠP Heterometrus laoticus” được thực hiện nhằm khảo sát hoạt tính chống đơng máu của 3 PĐTC. Từ đĩ, đĩng gĩp thêm một phần nguyên liệu nhằm phát triển các thuốc chống đơng máu, hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối – nguyên nhân chủ yếu dẫn đến đột quỵ. 1
14. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỊ CẠP 1.1.1. Giới thiệu về bị cạp Bị cạp là một lồi động vật thuộc ngành Arthropoda, phân ngành Chelicerata và lớp Arachnida. Chúng được xem là lồi chân đốt cổ xưa nhất về nguồn gốc và hình thái cơ thể. Chúng lần đầu xuất hiện trên Trái đất từ kỷ Silur (416 – 444 triệu năm trước) dưới dạng động vật thủy sinh. Trong suốt quá trình phát triển, hình thể của bị cạp thay đổi rất ít. Vì vậy mà chúng được gọi là những “hĩa thạch sống” [27]. a b c d e f Hình 1.1. Bọ cạp hĩa thạch (a) Allopaleopholus caledonicus (b) Protobuthus elegans (c) Gallioscorpio voltzi (d) Protoischnurus axelrodorum (e) Archaeobuthus estephani (f) Palaeolychas balticus [27] Bị cạp được tìm thấy ở khắp nơi trên Thế giới, trừ Bắc Cực, nhưng phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, sa mạc và bán sa mạc. Chúng là động vật ăn đêm và nhút nhát, thường chỉ sống dưới các tảng đá, các khe nứt, lớp vỏ cây và gốc tối của những ngơi nhà [27]. 2
15.  Đặc điểm hình thái của bị cạp Cơ thể bị cạp được chia thành 2 phần: phần đầu-ngực (prosoma) và phần bụng (opisthosoma). Tồn thân bị cạp được bao phủ bởi một lớp vỏ gồm chitin, protein và chúng lớn lên bằng cách lột xác [27]. Phần prosoma được bảo vệ bởi một “cái mai” cĩ hình thang hoặc hình chữ nhật. Bộ phận này mang 1 cặp mắt trung tâm, 2-5 cặp mắt bên và cĩ cánh thìa. Chúng cĩ 1 cặp chi phụ trước miệng (chân kìm), 1 cặp càng, 4 cặp chân đi và khơng cĩ râu [27]. Phần opisthosoma lại được chia thành 2 phần nhỏ hơn là phần bụng trước (mesosoma) và phần đuơi (metasoma). Mesosoma cĩ 7 đốt, chứa phổi và bộ phận sinh dục. Metasoma cĩ 5 đốt hẹp và cĩ thể chuyển động linh hoạt. Opisthosoma kết thúc ở bộ phận telson (túi chức nọc độc) và ngịi đốt [27]. Chân kìm Càng Mắt Chân 1 Chân 2 Chân 3 Đốt bụng trước Chân 4 Đốt đuơi Telson Ngịi đốt Hình 1.2. Cấu tạo cơ thể bị cạp Androctonus crassicauda 3
16. 1.1.2. Độc tính của nọc bọ cạp Bị cạp là lồi động vật cĩ độc và cĩ thể gây chết người, cĩ 2100 lồi thuộc 190 chi và 16-19 họ. Trong đĩ, Buthidae và Hemiscorpiidae là 2 họ bọ cạp rất nguy hiểm cho con người [27]. Nọc độc của bị cạp cĩ khả năng làm tê liệt các bộ phận của cơ thể con người và súc vật. Bị cạp châu Phi là lồi độc nhất, giết chết người nhanh hơn cả rắn độc. Vết đốt của nĩ gây ra đau đớn dữ dội, làm nạn nhân vã mồ hơi, tim đập nhanh, co giật mạnh, các cơ bị tê liệt dẫn đến tử vong. Bị cạp Việt Nam đốt chỉ gây sưng đau, nhức nhối và phù nề, nhưng khơng gây chết người [3]. Độc tính nọc bị cạp ảnh hưởng chủ yếu lên hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hĩa, [36] - Hệ thần kinh thực vật: nọc độc bị cạp gây kích thích hệ thần kinh thực vật, bao gồm cả hệ giao cảm và hệ phĩ giao cảm. . Hệ phĩ giao cảm (hệ cholinergic): tăng tiết nước bọt, chảy nước mắt, co đồng tử, tăng tiết phế quản, tiêu chảy, nơn mửa, nhịp tim chậm, hạ huyết áp, cương dương, . Hệ giao cảm (hệ adrenergic): nhịp tim nhanh, tăng huyết áp, giãn đồng tử, thân nhiệt cao, tăng đường huyết, lo âu, bồn chồn, Trong hầu hết các trường hợp, phản ứng phĩ giao cảm thường xảy ra sớm hơn. - Hệ thần kinh cơ: sự kích thích hệ thần kinh ngoại biên của nọc độc dẫn đến hoạt động thần kinh cơ bất thường như rối loạn thị giác, co cơ và động kinh, - Hệ tim mạch: loạn nhịp tim, ngoại tâm thu thất, đảo ngược sĩng T, block nhánh (bundle-branch block), suy tim, hơn mê, suy đa tạng là những tình trạng cĩ thể gặp phải khi bị bị cạp đốt. - Hệ tiêu hĩa: nọc độc cĩ thể làm nạn nhân nơn mửa, tiêu chảy, viêm tụy cấp Nọc độc tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mơ ống thận, gián tiếp lên hệ thần kinh thực vật và gây ra phản ứng viêm, nên thận (đặc biệt là ống thận) là một trong những cơ quan chịu ảnh hưởng nặng nề của nọc bị cạp [46]. 4
17. Ngồi ra, nọc độc lồi này cịn ảnh hưởng đến sự phát triển của thai nhi và trẻ nhỏ khi được sử dụng cho phụ nữ cĩ thai hoặc đang cho con bú. Tuy nhiên, cần cĩ những nghiên cứu sâu hơn nhằm xác định các cơ quan và mức độ ảnh hưởng của nọc độc lên sự phát triển của trẻ [25]. 1.1.3. Tác dụng dược lý của nọc bọ cạp Trong y học cổ truyền, bị cạp được sử dụng cả con (tồn yết) hoặc chỉ sử dụng đuơi (yết vĩ). Nọc bị cạp cũng được sử dụng rộng rãi. Bị cạp cĩ vị mặn, hơi ngọt, cay, tính bình, cĩ độc, vào kinh can, cĩ tác dụng trấn kinh, khu phong. Vị thuốc được dùng để chữa kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván, tràng nhạc [3]. Trong nền y học hiện tại, nọc bị cạp là một đối tượng nghiên cứu tiềm năng do cĩ các tác dụng dược lý quan trọng. Các peptide trong nọc độc bị cạp đã được chứng minh là cĩ tác dụng kháng khuẩn (trên cả các chủng gram dương và gram âm), kháng nấm (Candida albicans, Fusarium culmorum và Fusarium oxysporum), kháng virus (virus viêm gan C (HCV), herpes simplex virus type 1 (HSV-1), virus sởi, SARS-CoV, virus cúm H5N1, H1N1, ), và kháng kí sinh trùng (Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum) [53]. Lồi Buthus martensi Karsch. (bị cạp vàng Trung Quốc) cĩ khả năng giảm đau do chứa các toxin BmK IT-AP, BmK dIT-AP3 (hoặc BmK IT2), BmK AngP1, BmK AS và BmK AS1 [17, 29-30, 38, 54]. BmK AS thể hiện tác động giảm đau cả ngoại biên lẫn trung ương và phản ứng đau giảm rõ rệt theo các liều thử nghiệm [38]. Hơn nữa, BmK IT2 và BmK AS cịn cho thấy tác động kháng viêm [17, 29], chống co giật [55- 56]. Từ đĩ, chúng tạo tiềm năng phát triển các thuốc chống động kinh. Cơ chế được đưa ra cho các tác dụng này là sự tác động lên kênh Na+ trên các tế bào thần kinh của các toxin trong nọc bị cạp [18, 55-56]. Các peptide trong nọc của lồi động vật này cho thấy tác động thúc đẩy hội chứng priapism – hội chứng cương dương kéo dài dai dẳng, khơng liên quan đến kích thích tình dục. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng nọc của các lồi bị cạp Androctonus 5
18. australis, Buthotus judaicus, toxin Ts3 trong nọc của Tityus serrulatus (bị cạp vàng Brazil) cĩ tác động kích thích giải phĩng nitric oxide (NO) khỏi các dây thần kinh nonadrenergic và noncholinergic (NANC), gây giãn cơ trơn thể hang trong cấu trúc dương vật, thúc đẩy hình thành priapism. Điều này cĩ ý nghĩa trong việc phát triển các tác nhân dược lý mới nhằm điều trị các rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50]. Nọc bị cạp cịn mở ra tiềm năng phát triển các thuốc điều trị ung thư. Chlorotoxin (một peptide nhỏ được tinh chế từ nọc lồi bị cạp Leiurus quinquestriatus) là một chất độc thần kinh, đĩng vai trị như chất chẹn kênh Cl-. Toxin cĩ tác động ưu tiên trên một loạt các khối u ác tính ở người, điển hình là các u thần kinh đệm (glioma) nhưng lại ít hoặc khơng liên kết với các mơ bình thường [40, 43, 47]. Trong các nghiên cứu khác, những peptide tương tự chlorotoxin đã được tinh chế, tái tổ hợp từ bị cạp Buthus martensi là rBmK Cta, Bm-12 và Bm-12b cũng cho thấy tác động lên kênh Cl-, đặt biệt là rBmK Cta gây ức chế sự tăng trưởng của các tế bào u thần kinh theo liều nhưng khơng cĩ tác động lên các tế bào hình sao [26, 29]. Ngồi ra, lồi bị cạp Rhopalurus junceus ở Cuba cũng đã được chứng minh là cĩ tác động chọn lọc trên các tế bào ung thư biểu mơ [24]. Năm 1974, nọc thơ của lồi Leiurus quinquestriatus đã được chứng minh cĩ tác dụng chống đơng máu ở động vật cĩ vú và các yếu tố chống đơng trong các PĐ tinh khiết của nọc lồi Palamneus gravimanus cĩ tác động ngăn cản hoạt động của thrombin [31]. Trong nọc lồi Tityus discrepans cũng chứa các thành phần cĩ hoạt tính ức chế yếu tố X hoạt hĩa [14]. Nọc độc từ bị cạp Mexico Anuroctonus phaiodactylus đã được báo cáo là gây ra tác động làm chậm thời gian đơng máu của PRP và PPP ở người [41]. 1.1.4. Cơ chế tác động của nọc bọ cạp Nọc bị cạp là một hỗn hợp phức tạp của các peptide, nucleotide, lipid, mucoprotein, amin sinh học, vài enzyme hiếm và các chất chưa được biết đến khác [27]. Trong đĩ, các polypeptide neurotoxic tác động lên các kênh ion của hệ thần kinh, đĩng vai trị quan trọng giúp nọc bị cạp cĩ độc tính cũng như thể hiện các tác dụng dược lý [16, 6
19. 29]. Các kênh ion mà các toxin trong nọc bị cạp tác động đến bao gồm: kênh Natri cảm ứng điện thế (Nav), kênh Kali cảm ứng điện thế (Kv), kênh Kali được hoạt hĩa bởi Calci (KCa), kênh Calci và kênh Chloride. Trong bài tổng hợp “Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level” được đăng trên tờ Neuropharmacology năm 2017 của David M. Housley và các đồng sự [34] đã cho thấy cĩ: - 63 peptid tác động lên Nav. - 98 peptide cĩ tác động ức chế Kv, trừ AaTXKb2-64 (Androctonus australis) cĩ tác động kích thích. - 20 peptide tác động lên KCa. Tất cả đều ức chế IKCa và SKCa, chỉ cĩ 7 peptid liên quan đến BKCa. Iberiotoxin (Buthus tamulus) ức chế chọn lọc mạnh nhất lên BKCa, Maurotoxin (Scorpio maurus palmatus) ức chế chọn lọc mạnh nhất lên IKCa và Tamapin (Mesobuthus tamulus) cĩ tác động mạnh nhất lên SKCa. - Cĩ 16 peptide ảnh hưởng lên kênh Ca2+ và cĩ 2 peptide tác động lênh kênh Cl-.  Toxin tác động lên kênh Natri cảm ứng điện thế (Nav) Peptid trong nọc bị cạp tác động lên Nav gồm 2 loại toxin: α-toxin và β-toxin. Các peptide được gọi là α-toxin hay β-toxin là do vị trí gắn kết của chúng trên kênh Na+. α-toxin liên kết với receptor site 3, trong khi β-toxin liên kết với receptor site 4 của kênh Na+ [27]. α-toxin cĩ ái lực phụ thuộc điện thế màng, cĩ tác dụng chính là làm chậm hoặc ức chế quá trình bất hoạt của kênh Na+ trong các tế bào thần kinh, cơ và tim [20, 29]. Chúng là các polypeptide gồm các chuỗi cĩ 61-76 amino acid nối với nhau bằng 4 cầu nối disulfide, được chia thành 3 nhĩm chính [28]: (1) Các α-toxin cổ điển, hoạt động mạnh trên não động vật cĩ vú và cĩ ái lực cao với synaptosome trong não chuột. Các toxin như Aah1, Aah2, Aah3 (Androctonus australis hector), Lqq5 (Leiurus quinquestriatus quinquestriatus) và Bot3 7
20. (Buthus occitanus tunetanus) là những toxin lần đầu tiên được xác định thuộc nhĩm này vì cĩ độc tính cao với con người [28, 44]; (2) Các α-toxin hoạt động mạnh trên cơn trùng như LqhαIT (Leiurus quinquestriatus hebraeus), Lqq3 (Leiurus quinquestriatus quinquestriatus), BotIT1 (Buthus occitanus tunetanus) và BjαIT (Hotentota Judaica) cĩ ái lực cao với tế bào thần kinh cơn trùng [28]; (3) Các toxin tương tự α-toxin cĩ hoạt tính trên cả động vật cĩ vú và cơn trùng như Lqh3 và Lqh6 (Leiurus quinquestriatus hebraeus), Bom3 và Bom4 (Buthus occitanus mardochei) và BmK M1 (Mesobuthus martensii Karsch.) [28]. β-toxin gắn với một vị trí thụ thể cụ thể cĩ trong các synaptosome độc lập với điện thế màng cĩ trong não chuột [15], làm thay đổi quá trình hoạt động của các kênh Na+ [29]. Các β-toxin là các polypeptie cĩ 61 amino acid với 8 cystein nối với nhau qua 4 cầu nối disulfide [29], được chia làm 4 nhĩm dược lý [27]: - β-toxin tác động trên động vật cĩ vú như Css4 (Centruroides suffusus suffusus), Cn2 (Centruroides noxious) gắn kết ái lực cao với synaptosomes não chuột; - β-toxin kích thích chọn lọc với cơn trùng như AahIT (Androctonus australis), Bj- xtrIT (Hottentotta judaicus) gây liệt co cứng do tác động lặp đi lặp lại của dây thần kinh vận động, làm tăng dịng điện và làm chậm lại quá trình khử hoạt của Nav; - β-toxin ức chế cơn trùng như LqhIT2 và Lqh-dprIT3 (Leiurus quinquestriatus hebraeus), BotIT2 (Buthus occitanus tunetanus) cĩ ái lực cao với Nav của cơn trùng và khơng gây hại trên chuột, toxin gây liệt mềm, trái ngược với chứng liệt cứng ở toxin kích thích; - β-toxin cĩ ái lực cao với cả động vật cĩ vú và cơn trùng như Ts1 (Tityus serrulatus) và Lqhβ1 (Leiurus quinquestriatus hebraeus). Hầu hết β-toxin cĩ tác động thay đổi sự hoạt hĩa của rNav1.2 não chuột và rNav1.4 cơ xương cùng cơ chế, nhưng khơng ảnh hưởng hNav1.5 trên tim.  Toxin tác động lên kênh Kali (KTx) Các peptide ức chế kênh K+ đầu tiên được phân lập là từ nọc độc của lồi bị cạp Centruroides noxius [29]. 8
21. Nhĩm KTx bao gồm các peptide chuỗi ngắn với 23-43 dư lượng amino acid và chuỗi dài với 42-84 dư lượng và cấu trúc được ổn định bởi 3-4 cầu nối disulfide. Các toxin này được chia thành 4 nhĩm: α, β, γ và κ dựa vào cấu trúc giống nhau và đặc trưng cho từng kênh K+ riêng biệt [27]. - α-KTx được phát hiện sớm nhất, đến nay đã cĩ 133 chất là các chuỗi peptide ngắn (23-43 acid amin), ổn định bằng 3-4 cầu disulfide, cĩ tác động chẹn kênh KCa; - β-KTx dài hơn α-KTx (47-84 acid amin và 3 cầu disulfide), cĩ nguồn gốc từ họ Buthidae, Caraboctonidae và Scorpionidae. Toxin này chứa 2 miền: N-terminal cĩ hoạt tính phân giải độc tố và C-terminal chẹn kênh K+; - γ-KTx cĩ 36-47 amino acid và phần lớn cĩ 4 cầu disulfide. Hiện nay đã cĩ 29 toxin thuốc nhĩm này; - κ-KTx là nhĩm mới nhất của KTx gồm các peptide cĩ 22-28 acid amin và 2 cầu disulfide. Chúng cĩ nguồn gốc từ họ Scorpionaidae và Liochelidae. Hiện nay đã cĩ 18 κ-KTx được liệt kê trong danh sách của UniProt;  Toxin tác động lên kênh Calci Các peptide đầu tiên được biết là cĩ hoạt tính trên receptor ryanodine (RyR) – receptor của kênh Calci nhĩm ligand-activated channel, được tìm thấy trong nọc lồi bị cạp Buthotus hottentota. Ryanotoxin (peptide 11KD của Buthotus judaicus) làm tăng phĩng thích Ca2+ từ mạng nội cơ tương và cũng gây ra giảm độ dẫn của các RyR. 2 peptid khác của Buthotus judaicus là BjtX-1 và BjtX-2 cũng ảnh hưởng kênh Ca2+ ở màng nội cơ tương của cơ vân nhưng khơng ảnh hưởng đến gan và tim. Toxin BmK-AS và BmK-AS1 (từ lồi BmK) kích thích sự gắn kết với ryanodine với RyR trong cơ vân thỏ. IpTxi và Iptxa (Pandinus imperator) là 2 peptide đầu tiên được báo cáo là cĩ ái lực cao với RyR. IpTxi ức chế gián tiếp RyR xương và tim, IpTxa (Imperatoxin A) làm tăng gắn kết ryanodine với RyR xương nhưng khơng cĩ tác dụng ở tim [45]. 9
22. Ngồi ra, kurtoxin (toxin của Parabuthus transvaalicus) cĩ ái lực cao với α1G T-type của kênh Ca2+. Toxin này cĩ sự phân biệt giữa các kênh Calci T-type α1G và các kênh khác gồm α1A, α1B, α1C và α1E [19].  Toxin tác động lên kênh Chloride Nọc độc lồi Leiurus quinquestriatus đã được chứng minh là cĩ khả năng chẹn kênh Cl- cĩ độ dẫn điện nhỏ [23]. Đĩ là 1 peptid cơ bản nhỏ cĩ 4070 Da [22]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ BỊ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus) Heterometrus thuộc phân họ Scorpioninae, họ Scorpionnidae – 1 trong 24 họ bị cạp cịn tồn tại đến ngày nay. Các lồi Heterometrus phân bố ở Ấn Độ, Sri Lanka, Burma, Borneo, Philipine và châu Phi. Cĩ khoảng 33 lồi Heterometrus được tìm thấy chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đơng Nam Á [27]. Lồi Heterometrus laoticus phân bố chủ yếu ở Lào, Campuchia, miền Nam Thái Lan và miền Nam Việt Nam [21].  Đặc trưng về hình thái của Heterometrus laoticus Heterometrus laoticus trưởng thành dài từ 90-125 mm và cĩ màu đen, riêng manus (phần thịt của chela trước các ngĩn (finger)) và telson cĩ thể cĩ màu nâu đỏ. Ở cả hai giới đực và cái, các răng số 15-19 xếp thành dạng lược [37]. telson chela patella manus finger Hình 1.3. Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) Chela của lồi này cĩ tỷ lệ dài và rộng là 2 – 2,3 và cĩ manus nhẵn. Lớp giáp và phần mesosoma nhẵn và khơng cĩ các hạt nhỏ. Telson cĩ nhiều lơng, thuơn dài và cĩ bọng dài hơn phần ngịi đốt [37]. 10
23. Hình 1.4. Phần đuơi (metasoma) của Heterometrus laoticus  Nọc bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) Các dấu hiệu lâm sàng gặp phải khi bị các loại bị cạp trong lồi Heterometrus đốt là: sưng – đau cục bộ, tấy đỏ hoặc đổi màu, hạ huyết áp, bồn chồn, suy hơ hấp, buồn nơn, nơn, đau bụng, khát nước, đau đầu, sốt, run và sốc [27]. Ở Việt Nam, nọc bị cạp Heterometrus laoticus của 2 tỉnh An Giang và Tây Ninh đã được tiến hành nghiên cứu. Nọc Heterometrus laoticus 2 vùng này tương đối giống nhau, đều tách được 10 PĐ (bằng phương pháp sắc ký cột Bio-gel P 10 và phương pháp điện di). Trong đĩ, 2 PĐ độc 6 và 7 chứa các neurotoxin – các protein nằm trong vùng 3-8 kDa. Tuy nhiên, trong nọc bị cạp An Giang, PĐ 6 độc hơn 7, trong khi nọc bị cạp Tây Ninh thì phân đọc 7 độc hơn. Như vậy, nọc của bị cạp tại 2 tỉnh này khơng giống nhau hồn tồn [1]. Qua mơ hình thử độc tính cấp, nọc độc bị cạp Heterometrus laoticus An Giang cĩ LD50 được xác định là 190,0 ± 1,7 mg/kg cân nặng chuột qua đường tiêm dưới da và 12,0 ± 0,6 mg/kg qua đường tiêm tĩnh mạch. Cịn trong mơ hình độc tính bán trường diễn, nọc bị cạp tiêm hàng ngày dưới da với liều 0,1 mg/ 10g thể trọng/ ngày trong 30 ngày gây hoại tử da nhưng chưa biểu hiện độc tính trên gan, thận và huyết học trong một tháng thử nghiệm. Nọc lồi bị cạp này thể hiện được tác dụng giảm đau – kháng viêm trên chuột [6-7, 10, 33]. Tác dụng này cũng cĩ đối với Heterometrus laoticus Tây Ninh (LD50 = 170 ± 0,95 mg/kg qua đường tiêm dưới da) [8-9]. Đã cĩ vài polypeptide được phân lập ra từ nọc Heterometrus laoticus là Heteroscorpine 1 (HS-1), HelaTx1, Hetlaxin và Heteromtoxin (HmTx). HS-1 là toxin đầu tiên được phân lập, cĩ khối lượng phân tử là 8293 Da và cĩ tác động chẹn kênh 11
24. K+. HS-1 cĩ tác động trên các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa mạnh gấp 300 lần so với nọc thơ [51]. HelaTx1 là thành viên đầu tiên của phân họ κ-KTx5 [52]. Toxin này tác động trên các kênh K+ khác nhau và hoạt động mạnh nhất trên Kv1.1 [33]. Hetlaxin (thuộc nhĩm α-toxin) là toxin đầu tiên được phân lập từ nọc Heterometrus laoticus cĩ ái lực cao với Kv1.3 [32-33]. Heteromtoxin (HmTx) cĩ nucleotide chứa 649 bp (base pair) với cấu trúc protein trưởng thành gồm 131 amino acid dư lượng (tiểu đơn vị lớn gồm 104 amino acid, tiểu đơn vị nhỏ gồm 27 amino acid) [35]. Cũng như một vài lồi bị cạp khác, Heterometrus laoticus cũng thể hiện hoạt tính chống đơng máu. Từ nọc Heterometrus laoticus An Giang, đã tách ra được 5 PĐ. Trong đĩ, PĐ 2, 4 và 5 thể hiện được tác động chống đơng máu trong các thử nghiệm in vitro. Ở nồng độ 5 mg/ml, PĐ 2 cĩ thời gian đơng máu gấp đơi so với mẫu đối chứng trong xét nghiệm Prothrombin; PĐ 4 và 5 gây ra quá trình chậm đơng máu trong xét nghiệm APTT (thời gian đơng máu cục bộ) do tăng thời gian đơng máu cục bộ và PĐ 5 cĩ tăng thời gian đơng máu hơn 10 lần so với mẫu đối chứng [2]. 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU 1.3.1. Tiểu cầu  Nguồn gốc Tiểu cầu là những mảnh tế bào được tách ra từ một tế bào rất lớn, được gọi là mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) – cĩ nguồn gốc từ tế bào gốc sinh máu vạn năng trong tủy xương. Một mẫu tiểu cầu cĩ thể sinh ra 6000 tiểu cầu [11]. Phần lớn mẫu tiểu cầu nằm lại trong tủy xương và giải phĩng tiểu cầu vào máu. Tuy nhiên, cĩ một số mẫu tiểu cầu theo máu đến các cơ quan khác, đặc biệt là phổi và chúng sản sinh tiểu cầu tại đây. Lách cũng là một cơ quan dự trữ tiểu cầu. Số lượng tiểu cầu ở nam là 263 ± 61 G/l, ở nữ là 274 ± 63 G/l [11]. 12
25. Hình 1.5. Các giai đoạn của quá trình sinh tiểu cầu  Cấu trúc Tiểu cầu là những mảnh hình đa giác, hình đĩa rất nhỏ (nhỏ nhất trong số các tế bào máu), đường kính từ 2-4 μm và khơng cĩ nhân. Hồng cầu Bạch cầu Tiểu cầu Hình 1.6. Các tế bào máu Hình 1.7. Hình dạng tiểu cầu Màng tiểu cầu tích điện âm mạnh, cĩ nhiều chỗ lõm vào trong bào tương làm tiểu cầu cĩ tính xốp và tăng diện tích bề mặt lên rất nhiều. Trên màng tiểu cầu cĩ các receptor với collagen, yếu tố von-Willebrand thành mạch và fibrinogen. Bào tương tiểu cầu cĩ actin, myosin và thrombosthenin. Các protein này giúp tiểu cầu co lại và giải phĩng các chất chứa trong các hạt đĩ như: - Hạt alpha chứa nhiều enzyme và một protein cĩ tác dụng sửa chữa thành mạch sau tổn thương (yếu tố tăng trưởng) - Thể đơng đặc rất giàu Ca2+, serotonin, adenosinediphosphat (ADP) 13
26. Ngồi ra, tiểu cầu cịn chứa yếu tố von-Willebrand, yếu tố hoạt hĩa tiểu cầu (platelet activator factor – PAF) và yếu tố ổn định fibrin (XIII) [11]. Vi ống Glycogen Hạt đặc Màng tế bào Ty thể Hệ thống kênh mở bề mặt Hạt lysosoma Chất chuyển hĩa Hạt α Hình 1.8. Cấu trúc của tiểu cầu  Đặc tính chính Khả năng hấp phụ và vận chuyển các chất: trong quá trình tiếp xúc, tiểu cầu cĩ khả năng hấp phụ các chất trong huyết tương và các tế bào của tổ chức khác để tạo thành lớp khí quyển quanh tiểu cầu. Nhờ đĩ mà các chất thiết yếu cho quá trình cầm máu và đơng màu được lưu hành tới nơi cần thực hiện nhiệm vụ [11]. Khả năng kết dính của tiểu cầu: tiểu cầu cĩ khả năng dàn ra vào bám dính vào các tổ chức dưới nội mạc, collagen, do lực hút tĩnh điện giữa tiểu cầu và cơ chất, cùng với sự tham gia của một số yếu tố: Ca2+, các yếu tố huyết tương, yếu tố von- Willebrand, [11] Khả năng ngưng tập của tiểu cầu: tiểu cầu cĩ khả năng kết dính lẫn nhau tạo thành các kết tập tiểu cầu gọi là hiện tượng ngưng tập tiểu cầu. Nhờ đĩ mà tiểu cầu cĩ thể thực hiện chức năng của mình [11]. Khả năng thay đổi hình dạng và giải phĩng của tiểu cầu: sau ngưng tập là quá trình thay đổi hình dạng và giải phĩng của tiểu cầu: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại, Sau đĩ, tiểu cầu co rút, giải phĩng một loạt các yếu tố (serotonin, adrenalin, histamine, yếu tố 3 tiểu cầu, ). Quá 14
27. trình xảy ra cĩ sự tham gia của thrombin, collagen và cĩ tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Khả năng này đĩng vai trị quan trọng trong việc hình thành đinh cầm máu khi mạch máu bị tổn thương [11].  Chức năng Bảo vệ thành mạch: tiểu cầu cĩ khả năng làm non hĩa các tế bào nội mạc và củng cố màng nội mạc qua vai trị của yếu tố tăng trưởng tế bào nội mạc nguồn gốc từ tiểu cầu. Vì vậy, tiểu cầu giúp củng cố tính bền vững của thành mạch [11]. Tham gia vào quá trình cầm máu: nhờ cĩ khả năng bám dính, ngưng tập và giải phĩng các chất [11]. Tham gia vào quá trình đơng máu: ngay khi tiếp xúc với collagen, ngồi quá trình dính, ngưng tập, trên màng tiểu cầu cịn xảy ra quá trình hoạt hĩa chuyển yếu tố IX thành IXhoạt hĩa, đồng thời giải phĩng yếu tố 3 tiểu cầu, đĩng vai trị quan trọng 2+ trong tạo các phức hợp (IXhoạt hĩa, VIIIhoạt hĩa và Ca ) trong quá trình đơng máu [11]. 1.3.2. Cầm máu Cầm máu là chấm dứt quá trình mất máu do tổn thương thành mạch [15], gồm 5 giai đoạn chính: 1. Co mạch tại chỗ 2. Hình thành nút tiểu cầu 3. Tạo cục máu đơng 4. Co cục máu đơng 5. Tan cục máu đơng  Co mạch tại chỗ Co mạch máu tại chỗ giúp hạn chế lượng máu thốt ra ngồi. Đồng thời làm chậm tốc độ dịng máu, tạo điều kiện hình thành nút tiểu cầu và cục máu đơng [11]. Quá trình co mạch xảy ra nhờ vào phản xạ co mạch của thần kinh giao cảm khi thành mạch bị tổn thương, điện thế hoạt động xuất hiện tại vị trí tổn thương và sự lan truyền 15
28. của điện tế này dọc thành mạch. Ngồi ra cịn cĩ sự tham gia của serotonin và thromboxane A2 do tiểu cầu phĩng thích ra [11]. Quá trình cĩ thể xảy ra vài phút đến vài giờ nhằm tạo điều kiện cho tiểu cầu kết dính và kết tập tại nơi tổn thương [11].  Tạo nút tiểu cầu Khi thành mạch bị tổn thương, lớp nội mơ bị rách làm lộ lớp collagen tích điện dương (+). Các tiểu cầu mang điện âm (-) nhanh chĩng di chuyển đến nơi tổn thương và gắn vào màng nội mơ nhờ lực hút tĩnh điện, yếu tố von-Willebrand và receptor. Ngay khi gắn vào thành mạch, tiểu cầu được hoạt hĩa và phĩng thích các yếu tố cần thiết: chất kích thích kết tập tiểu cầu (ADP, thromboxane A2) và chất chống kết tập tiểu cầu (prostaglandin). Song song đĩ, các tiểu cầu liên kết với nhau nhờ receptor GPIIb/IIIa và cầu nối fibrinogen [5, 11]. Quá trình này tạo ra các nút tiểu cầu bịt kín vết thương, giúp cầm máu tạm thời [5, 11].  Tạo cục máu đơng (cơ chế đơng máu) Đơng máu là quá trình biến máu từ dạng lỏng sang dạng sol-gel (huyết khối). Huyết khối gồm mạng lưới fibrin bao lấy các tế bào máu, làm chặt thêm nút tiểu cầu, bịt kín vết thương [5]. Quá trình đơng máu là một loạt các phản ứng hĩa học nối tiếp nhau của các yếu tố đơng máu trong huyết tương, mơ tổn thương và tiểu cầu [11]. Đa phần các yếu tố này đều là tiền chất và ở trạng thái bất hoạt. Khi được hoạt hĩa, chúng sẽ trở thành các enzyme cĩ hoạt tính và tiếp tục hoạt hĩa một yếu tố bất hoạt tiếp theo [11]. Fibrin được thành lập từ fibrinogen nhờ tác động của thrombin. Thrombin lại được tạo thành từ 2 con đường: nội sinh và ngoại sinh [5]. 16
29. CON ĐƯỜNG NỘI SINH Bề mặt bị tổn thương Kininogen Kallikrein CON ĐƯỜNG NGOẠI SINH Tổn thương XII XIIa Yếu tố mơ XI XIa a VII IX IXa VII VIII Yếu tố Tổn thương a mơ X Xa X Va Prothrombin Thrombin (II) (IIa) Fibrinogen Fibrin (I) (Ia) XIIIa HUYẾT KHỐI Hình 1.9. Quá trình đơng máu Hình 1.10. Các giai đoạn của quá trình đơng máu 17
30. Hình 1.11. Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu, tạo cục máu đơng Bảng 1.1. Các yếu tố đơng máu trong huyết tương [5] Yếu tố Tên khác Vị trí tác động I Fibrinogen Heparin (IIa) II Prothrombin Warfarin (ức chế tổng hợp) III Thromboplastin mơ IV Calci V Proaccelerin VII Proconvertin Warfarin (ức chế tổng hợp) VIII Globulin chống bệnh ưa chảy máu (antihemopphilic globulin = AHG) IX Yếu tố Christmas (= thromboplastin Warfarin (ức chế tổng hợp) huyết tương) X Yếu tố Stuart – Prower Heparin (Xa) Warfarin (ức chế tổng hợp) XI Plasma thromboplastin antecedent (PTA) XII Yếu tố Hageman XIII Yếu tố ổn định fibrin Protein Warfarin (ức chế tổng hợp) và S 18
31.  Co cục máu đơng và tan cục máu đơng Co cục máu đơng: sau khi máu đơng khoảng 1-2 giờ, cục máu đơng co lại và giải phĩng huyết thanh (huyết tương khơng cĩ các yếu tố đơng máu). Quá trình này cĩ sự tham gia của các chất như thrombosthenin, actin, myosin và ion Ca2+. Quá trình này giúp cho mép vết thương khép lại gần nhau, tạo điều kiện cho sự hĩa sẹo [11]. Tan cục máu đơng: là hiện tượng cục máu đơng tan ra do tác động phân hủy fibrin của plasmin. Plasmin được hoạt hĩa từ plasminogen và plasminogen cĩ thể được hoạt hĩa bởi vài yếu tố: yếu tố hoạt hĩa plasminogen của mơ, thrombin, yếu tố XIIhoạt hĩa, các enzyme của lysosome từ mơ tổn thương, urokinase trong nước tiểu, độc tố streptokinase từ vi khuẩn [11]. Plasminogen Kinase Urokinase Streptokiase Plasmin Fibrin Fibrin Degradation Product (FDP) Fibrinogen Fibrinogen Degradation Product và các protein khác Hình 1.12. Quá trình tan cục máu đơng Quá trình tan cục máu đơng cũng chính là một trong những cơ chế chống đơng máu của cơ thể khi xuất hiện cục máu đơng để ngăn ngừa tắc mạch và tạo điều kiện cho quá trình liền sẹo [11]. 1.3.3. Rối loạn đơng máu Rối loạn đơng máu cĩ thể phân thành 2 dạng: - Tình trạng tăng đơng (hypercoagulability status) - Tình trạng giảm đơng (hypocoagulability status) 19
32.  Tình trạng tăng đơng Nguyên nhân cĩ thể do [4]: - Tăng hoạt động tiểu cầu - Tăng hoạt động của các yếu tố đơng máu - Tăng hoạt động đồng loạt tiểu cầu và mọi yếu tố đơng máu Tăng hoạt động tiểu cầu: do rối loạn dịng chảy trong mạch hoặc tổn thương nội mạc, tạo điều kiện thuận lợi cho tiểu cầu bám dính, ngưng tập, đồng thời hoạt hĩa các yếu tố đơng máu nội tại [4]. Tăng hoạt động các yếu tố đơng máu: hay gặp khi ứ trệ tuần hồn lâu dài, nhất là khi cơ thể bất động lâu ngày. Nồng độ các yếu tố này tăng lên ở vùng ứ trệ do hậu quả của sự thốt nước ra khỏi thành mạch (áp lực thủy tĩnh và do thiếu oxy) và chúng bị hoạt hĩa do tiểu cầu cĩ điều kiện bám dính vào mạc nội mạc (máu chảy chậm, nội mạc thay đổi do thiếu oxy). Cũng vì vậy, huyết khối dể hình thành ở tĩnh mạch hơn động mạch [4]. Tăng hoạt động đồng loạt tiểu cầu và mọi yếu tố đơng máu: gặp trong hội chứng DIC. Các yếu tố đơng máu bị tiêu thụ quá mức, đến cạn kiệt, dẫn đến người bệnh bị chảy máu khơng cầm được. Hội chứng bắt đầu bằng sự hoạt hĩa tiểu cầu ở phạm vi tồn thân. Các tiểu cầu bám vào vách đến mức làm giảm hẳn số lượng trong máu. Đồng thời, theo đĩ các yếu tố đơng máu cũng bị hoạt hĩa với cường độ cao, để tạo ra các hậu quả [4]: Tạo ra vơ số cục đơng vi thể ở khắp cơ thể, gây thiếu oxy nặng cho các mơ và cơ quan. Máu trở nên khĩ đơng và xuất huyết do các yếu tố đơng máu bị tiêu thụ quá mức khiến nồng độ của chúng ở máu tồn thân giảm mạnh. Các sản phẩm tiêu hủy fibrin tăng vọt trong máu do rất nhiều cục máu đơng bị tiêu cấp diễn. 20
33. Cĩ nhiều cơ chế dẫn đến hội chứng DIC: đưa vào máu một lượng lớn thromboplastin mơ (trong vết thương bị dập nát, bỏng rộng, can thiệp ngoại khoa rộng, ), độc tố một số virus và vi khuẩn gram âm (sốc nhiễm khuẩn, sốt xuất huyết, ), sự hủy hoại rộng (nhiễm độc thai, lupus nặng, ung thư giai đoạn muộn, ) [4].  Huyết khối (thrombosis): là tình trạng bệnh lý liên quan nút cầm máu do bệnh động mạch hoặc do ứ máu trong tĩnh mạch hoặc tâm nhĩ. Các mảnh huyết khối bị vỡ theo dịng máu gây tắc nghẽn các mạch máu nhỏ như mạch phổi, mạch não, tĩnh mạch, các vị trí khác nhau ở tim [5]. 1.3.4. Những chất chống đơng máu  Trong lịng mạch Bình thường, ngay trong lịng mạch đã cĩ sẵn các yếu tố ngăn cản quá trình đơng máu, quan trọng nhất là [11]: - Lớp glycocalyx cĩ bản chất là mucopolysaccharid (tích điện âm): đẩy tiểu cầu và các yếu tố đơng máu. - Prostacyclin (bài tiết từ tế bào nội mơ): ức chế sự kết dính tiểu cầu - Thrombomodulin (bài tiết từ tế bào nội mơ): tạo phức hợp thrombomodulin- thrombin, làm bất hoạt thrombin và hoạt hĩa protein C. Protein C gây bất hoạt yếu tố V và VIII. - Antithrombin III: bất hoạt phần thrombin khơng bị hấp phụ vào mạng lươi fibrin và bất hoạt các yếu tố IX, X, XI, XII. - Heparin (bài tiết từ các dưỡng bào và bạch cầu ưa base cĩ nhiều ở mơ phổi và gan): tăng tác dụng của antithrombin III lên hàng trăm đến hàng nghìn lần. Heparin là một trong các thuốc chống đơng máu trong phịng và điều trị huyết khối gây tắc mạch đặc biệt trong viêm tắc tĩnh mạch, nhồi máu cơ tim.  Sử dụng trong lâm sàng - Aspirin: ở liều thấp (81mg) cĩ tác dụng ức chế tổng hợp thromboxane A2, do đĩ ức chế co mạch và kết tập tiểu cầu [11]. 21
34. - Streptokinase (sinh ra từ tiểu cầu): hoạt hĩa plasminogen từ plasmin, làm tan sợi fibrin [11]. - tPA (tissue plasminogen activation): yếu tố hoạt hĩa plasminogen cĩ nguồn gốc từ mơ [11]. - Heparin: tăng tác dụng của antithrombin III, ngăn chuyển fibrinogen thành fibrin [11]. 22
35. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nọc Bị cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) - PĐ 5 phân lập từ nọc Bị cạp đen An Giang Heterometrus laoticus - Các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (thu được từ PĐ 5) Các mẫu đều được cung cấp bởi TSKH. Hồng Ngọc Anh (Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh). 2.1.2. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, khơng dị tật, thể trọng 20 ± 02 g/ con, do Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp. Chuột khi mua về, được nuơi ổn định, cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống ít nhất 2 ngày trong phịng thí nghiệm của Bộ mơn Dược lý, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, Thành phố Hồ Chí Minh. Sau đĩ, chúng sẽ được tiến hành làm thử nghiệm. 2.1.3. Dụng cụ - Cân phân tích 4 số - Nhiệt kế thủy ngân (TLD204E, hãng Mettler – Toledo, Thụy Sĩ) - Kim tiêm - Bếp điện - Lọ bi - Cốc cĩ mỏ 500ml - Micro pipet - Đĩa petri - Vĩ bắt chuột - Kéo cắt - Bocal nhựa - Đồng hồ bấm giờ 2.1.4. Hĩa chất NaCl 0,9% (cơng ty Cổ phần thương mại thiết bị y tế Vĩnh Phúc) Các hĩa chất thường quy khác do bộ mơn Dược lý, khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành cung cấp. 23
36. 2.2. PHƯƠNG PHÁP Các chất khảo sát được hịa tan trong dung dịch NaCl 0,9% và sau đĩ được tiêm vào tĩnh mạch đuơi chuột để khảo sát tác động của PĐ5 và các PĐTC lên quá trình đơng – chảy máu (thể tích tiêm là 0,1 ml/10g thể trọng chuột). Chuột tham gia thử nghiệm được phân thành các lơ (6 chuột/ lơ): - Lơ chứng: chuột được tiêm tĩnh mạch đuơi dung dịch NaCl 0,9% - Lơ thử: chuột được tiêm tĩnh mạch đuơi các PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg (1/5 của LD50, LD50 = 12,4 mg/kg).  Thời gian chảy máu: được tiến hành theo mơ hình chuẩn hĩa của Yang Liu và các đồng sự [39]. Cầm chuột bằng cách giữ phần da đầu và da lưng chuột, thả lỏng đuơi chuột và tránh tác động vào đuơi. Cắt 1 đoạn đuơi chuột dài khoảng 5mm tính từ chĩp đuơi và đường kính vết cắt khoảng 1,5 mm. Phần đuơi cịn lại được nhúng vào dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ duy trì 37oC. Tính thời gian chảy máu từ lúc bắt đầu chảy máu đến khi ngừng chảy. Tiến hành các thao tác tại các thời điểm 20, 30, 60, 90, 120 phút kể từ sau khi tiêm thuốc.  Thời gian đơng máu: sau cắt đuơi chuột, hứng 1 giọt máu từ vết cắt lên lam kính được đặt trong đĩa petri cĩ nắp đậy (nhằm tránh các tác động từ mơi trường) trước khi nhúng đuơi vào NaCl 0,9%. Giọt máu được lấy cĩ đường kính khoảng 6-7 mm. Theo dõi thời gian từ lúc lấy giọt máu ra khỏi đuơi đến khi giọt máu đơng hồn tồn. Tiến hành lấy máu tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút kể từ sau khi tiêm thuốc. 2.3. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ Các số liệu được trình bày dưới dạng Số trung bình (Mean) ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn của số trung bình). Nếu cĩ khác biệt giữa các lơ, xác định sự khác biệt giữa hai lơ bằng phép kiểm Mann-Whitney với phần mềm thống kê Minitab 16.0. Sự khác nhau được xem là cĩ ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm SigmaPlot 11.0. 24
37. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. Tác động của chất khảo sát lên quá trình đơng máu Kết quả khảo sát tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 lên thời gian đơng máu so với lơ chứng (NaCl 0,9%) đã được thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thời gian đơng máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lơ chứng (NaCl 0,9%) Thời gian đơng máu (giây) Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút PĐ5 422.3± 48.4* 391.7± 48.1* 387.5± 35.0 360.2± 56.5 358.8± 26.6* 5.5.1 442.5± 20.6 426.2± 25.6 366.2± 25.0 428.3± 51.1 296.3± 37.4 5.21.1 401.5± 31.2 340.8± 29.1 300.3± 32.1 460.5± 41.7 313.3± 24.9* 5.22.3 556.5± 87.2 426.2± 53.7* 388.0± 46.3* 367.0± 25.5* 261.8± 16.4 Chứng 307.7± 17.4 290.67± 9.58 286.00± 6.31 256.3± 20.4 229.7± 13.2 * p < 0,05 p < 0,01 so với chứng Hình 3.1. Thời gian đơng máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg 25
38. Nhìn chung, các PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đều cho tác động kéo dài thời gian đơng máu trong suốt quá trình thử nghiệm (thời gian đơng máu được xác định tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm tĩnh mạch đuơi chuột các PĐ khảo sát). PĐ 5 sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p 0,05). Trong 30 phút đầu kể từ sau khi tiêm thuốc, ngoại trừ PĐTC 5.21.1, các PĐTC khác đều cho thời gian đơng máu dài hơn hẳn so với nhĩm chứng và sự khác biệt này cĩ ý nghĩa thống kê. PĐTC 5.21.1 tuy kéo dài thời gian đơng máu đáng kể so với nhĩm chứng nhưng lại khơng mang ý nghĩa thống kê. Sau 60 phút thì chỉ cịn 2 PĐCT là 5.5.1 và 5.22.3 cho sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. PĐTC 5.21.1 dù cĩ kéo dài thời gian đơng máu nhưng lại khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Sau 90 phút, các PĐTC đều kéo dài thời gian đơng máu đáng kể so với nhĩm chứng. Tuy nhiên, sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê chỉ được thể hiện ở PĐTC 5.22.3, các PĐTC cịn lại thì khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Sau 120 phút đã cĩ sự khác biệt so với các thời điểm trước. Các PĐTC vẫn cho tác động kéo dài thời gian đơng máu, nhưng 5.21.1 cho thấy sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê, trong khi 5.5.1 và 5.22.3 cho thấy sự khác biệt khơng đáng kể và cũng khơng mang ý nghĩa thống kê. Như vậy, cả PĐ 5 và 3 PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg đều tăng thời gian đơng máu so với lơ chứng. Trong đĩ, PĐTC 5.21.1 cho tác động chậm nhất. 3.1.2. Tác động của chất khảo sát lên quá trình chảy máu Kết quả khảo sát tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 lên thời gian chảy máu so với lơ chứng (NaCl 0,9%) đã được thể hiện ở Bảng 3.2. 26
39. Bảng 3.2. Thời gian chảy máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lơ chứng (NaCl 0,9%) Thời gian chảy máu (giây) Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút PĐ 5 386.2±57.3* 187.0±64.6* 86±2.38 119.3±29.2* 183±80.7 5.5.1 248.2±66.7* 314±58.6* 146.7±46.0* 65±14.5 40.2±10.3 5.22.3 233.0±30.6 179.0±41.4* 218.7±78.5 151.5±57.4 83.8±13.7 5.21.1 314.5±85.2* 84.8±16.7 81.2±15.4 61.8±14.8 68.8±16.4 Chứng 79.5±13.7 43.33±1.94 45.83±3.95 40.67±5.02 49.67±7.85 * p < 0,05 p < 0,01 so với chứng Hình 3.2. Thời gian chảy máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg Nhìn chung, các PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đều cĩ tác động kéo dài thời gian chảy máu trong suốt quá trình thử nghiệm (thời gian chảy máu được xác định tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm tĩnh mạch chuột các chất khảo sát). 27
40. PĐ 5 sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p 0,05). Sau 20 phút kể từ khi tiêm thuốc, cả 3 PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu so với nhĩm chứng từ 3-5 lần và tất cả sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. Sau 30 phút, các PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 đều kéo dài thời gian chảy máu đáng kể so với nhĩm chứng và các khác biệt đều cĩ ý nghĩa thống kê. Đáng chú ý, PĐTC 5.5.1 cĩ thời gian chảy máu gấp khoảng 7,2 lần so với nhĩm chứng và sự chênh lệch này là cao nhất so với các thời điểm khảo sát khác của PĐTC này và các PĐTC khác trong suốt quá trình thử nghiệm. Ở PĐTC 2.21.1, thời gian chảy máu mặc dù cĩ kéo dài nhưng lại khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Sau 60 phút, mặc dù các PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu so với nhĩm chứng nhưng chỉ cĩ 5.5.1 và 5.22.3 cĩ ý nghĩa thống kê, 5.21.1 cĩ sự khác biệt so với nhĩm chứng khơng lớn (1,8 – 1,9 lần, trong khi 5.5.1 và 5.22.3 tương ứng là 3,2 và 4,8 lần) và cũng khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Sau 90 phút, cả 3 PĐTC 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 dù cĩ kéo dài thời gian chảy máu so với nhĩm chứng nhưng khơng mang ý nghĩa thống kê. Sau 120 phút, so với nhĩm chứng, hầu hết các PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu, chỉ cĩ duy nhất PĐTC 5.5.1 cĩ thời gian chảy máu ngắn hơn. Tuy nhiên, cả 3 PĐTC được khảo sát đều cho thấy sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê Như vậy, cả PĐ 5 và 3 PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg đều tăng thời gian chảy máu so với lơ chứng. Trong đĩ, PĐTC 5.21.1 cho tác động yếu nhất. 3.2. BÀN LUẬN Theo các nghiên cứu trước đây, nọc thơ bị cạp Heterometrus laoticus được tách ra 5 PĐ (cột Saphadex G-50 1,5 x 100cm). Trong đĩ, PĐ 5 làm tăng thời gian đơng máu lên 10 lần so với mẫu đối chứng qua xét nghiệm APTT [2]. 28
41. Trong thử nghiệm in vivo, PĐ 5 thể hiện rõ ảnh hưởng lên thời gian đơng – chảy máu thơng qua việc kéo dài thời gian đơng – chảy máu so với nhĩm chứng suốt 120 phút của quá trình thử nghiệm. Cụ thể, PĐ 5 cĩ thời gian đơng máu gấp 1,1 – 1,4 lần nhĩm chứng và thời gian chảy máu gấp 2,9 – 4,9 lần nhĩm chứng. Như vậy, kết quả in vivo đã gĩp phần củng cố thêm bằng chứng chứng minh tác dụng chống đơng máu của PĐ 5 nọc bị cạp Heterometrus laoticus. Từ PĐ 5 Heterometrus laoticus, đã tách được 24 PĐTC qua sắc ký pha đảo. Trong đĩ, các PĐTC sạch tách được là 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đều cho thấy tác động kéo dài thời gian đơng – chảy máu trong suốt quá trình thử nghiệm.  Tác động lên quá trình đơng máu của các PĐTC Kết quả khảo sát cho thấy tác động kéo dài thời gian đơng máu của các PĐTC khảo sát khơng cao, chỉ từ 1,3 – 1,8 lần so với nhĩm chứng. Trong đĩ, PĐTC 5.21.1 và 5.22.3 cho tác động nhanh và kéo dài. Cả 2 PĐTC trên đều thể hiện tác động ngay từ phút thứ 20 sau tiêm và kéo dài suốt 60 ở PĐTC 5.5.1 và 90 phút ở PĐTC 5.22.3. Đáng chú ý, tại thời điểm 20 phút kể từ khi tiêm thuốc, PĐTC 5.22.3 cĩ thời gian đơng máu kéo dài đến 1,8 lần so với nhĩm chứng. Ngược lại, PĐTC 5.21.1 lại cho tác động yếu và chậm hơn hẳn. PĐTC này phát huy tác động sau 120 phút kể từ khi tiêm thuốc và cho kèo dài thời gian đơng máu chỉ 1,4 lần so với nhĩm chứng.  Tác động lên quá trình chảy máu của các PĐTC Kết quả khảo sát cho thấy tác động kéo dài thời gian chảy máu của các PĐTC khảo sát khá rõ ràng, từ khoảng từ 2,9 đến 7,2 lần so với nhĩm chứng. Trong khi PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 thể hiện tác động mạnh hơn thì PĐTC 5.21.1 là yếu nhất. Cả 2 PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 đều thể hiện tác động kéo dài thời gian chảy máu trong suốt 1 giờ đầu thử nghiệm. Đáng chú ý, tại thời điểm 30 phút sau tiêm thuốc, PĐTC 5.5.1 cĩ thời gian chảy máu dài gấp 7,2 lần nhĩm chứng. 29
42. Ngược lại, PĐTC 5.21.1 thể hiện tác động yếu nhất và ngắn nhất trong số các PĐTC được khảo sát. PĐTC này chỉ cho tác động trong 20 phút đầu. 30
43. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN - PĐ 5, các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đều cho thấy tác động kéo dài thời gian đơng máu và chảy máu. - Tác động kéo dài thời gian chảy máu của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 rõ hơn đơng máu. - PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 cĩ tác động kéo dài thời gian đơng – chảy máu mạnh hơn. - PĐTC 5.21.1 cĩ tác động kéo dài thời gian đơng - chảy máu yếu nhất. 4.2. ĐỀ NGHỊ Tiến hành các nghiên cứu nhằm xác định đích tác động và cơ chế tác động của các PĐ lên hoạt động chống đơng máu. Từ đĩ triển khai các nghiên cứu tối ưu hĩa quá trình chiết tách, tinh sạch các chất, nghiên cứu thành phẩm và ứng dụng vào điều trị bệnh. 31
44. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Hồng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đơng Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Trần Thanh Đức, Võ Phùng Nguyên (2010), "Khảo sát thành phần protein của nọc bọ cạp Heterometrus laoticus phân bố ở Tây Ninh và so sánh nĩ với nọc bọ cạp này phân bố ở An Giang", Tạp chí Hĩa học, 48(4B), tr. 285-289. 2. Hồng Ngọc Anh, Võ Đỗ Minh Hồng, Nikitin Ilya, Utkin Yurin (2011), "Tách và bước đầu nghiên cứu các toxin ngắn của nọc bọ cạp Heterometrus laoticus", Tạp chí Hĩa học, 49(1), tr. 117-121. 3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đồn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Tồn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1074- 1076. 4. Bộ mơn Miễn dịch-Sinh lý bệnh - Trường đại học Y Hà Nội (2012), Sinh lý bệnh học, tái bản lần thứ 2, NXB Y học, Hà Nội, tr. 297-298. 5. Trần Thị Thu Hằng (2018), Dược lực học, tái bản lần thứ 22, NXB Phương Đơng, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 947-964. 6. Võ Đỗ Minh Hồng, Phạm Nguyên Đơng Yên, Lưu Hồng Lê Giang, Võ Phùng Nguyên, Hồng Ngọc Anh (2014), "Khảo sát tính chất hĩa học và dược tính của nọc bọ cạp đen Heterometrus laoticus (An Giang)", Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ, 52(1C), tr. 217-224. 7. Võ Phùng Nguyên, Hồng Ngọc Anh, Lưu Hồng Lê Giang (2009), "Độc tính cấp - bán trường diễn và tác động giảm đau, kháng viêm của nọc bọ cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)", Tạp chí Dược học, 400, tr. 13-17. 8. Võ Phùng Nguyên, Hồng Ngọc Anh, Nguyễn Thị Phương Khuê (2008), "Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng giảm đau của nọc bị cạp nâu và bị cạp đen Việt Nam", Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, Tập 12(1), tr. 106.
45. 9. Võ Phùng Nguyên, Hồng Ngọc Anh, Nguyễn Thị Phương Khuê (2008), "Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng giảm đau, kháng viêm của nọc bọ cạp đen Tây Ninh", Tạp chí Dược học, 389, tr. 31-34. 10. Nguyễn Thị Thùy Trang, Trần Hiếu Trung, Nguyễn Hồi Nam, Nguyễn Cửu Khoa, Võ Phùng Nguyên, Yuri Utkin, Hồng Ngọc Anh (2014), "Khảo sát tác động kháng viêm, giảm đau các phân đoạn nọc bọ cạp Heterometrus laoticus", Tạp chí Dược học, 464, tr. 41-45. 11. Vụ Khoa học và Đào tạo - Bộ Y tế (2012), Giải phẩu sinh lý người (Dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), NXB Giáo dục Việt Nam, tr. 75-85. TIẾNG ANH 12. Andrade E., Villanova F., Borra P., Leite K., Troncone L., Cortez I., Messina L., Paranhos M., Claro J., Srougi M. (2008), "Penile erection induced in vivo by a purified toxin from the Brazilian spider Phoneutria nigriventer", BJU Int, 102(7), p. 835-837. 13. Berger R., Billups K., Brock G., Broderick G. A., Dhabuwala C. B., Goldstein I., Hakim L. S., Hellstrom W., Honig S., Levine L. A., Lue T., Munarriz R., Montague D. K., Mulcahy J. J., Nehra A., Rogers Z. R., Rosen R., Seftel A. D., Shabsigh R., Steers W. (2001), "Report of the American Foundation for Urologic Disease (AFUD) Thought Leader Panel for evaluation and treatment of priapism", Int J Impot Res, 13 Suppl 5, p. S39-43. 14. Brazĩn Josmary, Guerrero Belsy, D´Suze Gina, Sevcik Carlos, Arocha-Piđango Carmen L (2013), "Anticoagulant and factor Xa-like activities of Tityus discrepans scorpion venom", Acta Toxicol. Argent., 21(1), p. 26-32. 15. Brunton Laurence L., Chabner Bruce A., Knollmann Bjorn C. (2011), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basic of Therapeutics, 12th edition, McGraw Hill Medical, New York, p. 849. 16. Catterall W. A., Cestele S., Yarov-Yarovoy V., Yu F. H., Konoki K., Scheuer T. (2007), "Voltage-gated ion channels and gating modifier toxins", Toxicon, 49(2), p. 124-41.
46. 17. Chen B., Ji Y. (2002), "Antihyperalgesia effect of BmK AS, a scorpion toxin, in rat by intraplantar injection", Brain Res, 952(2), p. 322-326. 18. Chen J., Feng X. H., Shi J., Tan Z. Y., Bai Z. T., Liu T., Ji Y. H. (2006), "The anti-nociceptive effect of BmK AS, a scorpion active polypeptide, and the possible mechanism on specifically modulating voltage-gated Na+ currents in primary afferent neurons", Peptides, 27(9), p. 2182-2192. 19. Chuang R. S., Jaffe H., Cribbs L., Perez-Reyes E., Swartz K. J. (1998), "Inhibition of T-type voltage-gated calcium channels by a new scorpion toxin", Nat Neurosci, 1(8), p. 668-674. 20. Couraud F., Jover E., Dubois J.M., Rochat H. (1982), "Two types of scorpion toxin receptor sites, one related to the activation, the other to the inactivation of the action potential sodium channel", Toxicon, 20(1), p. 9-16. 21. Couzijn H.W.C. (1981), "Revision of the Genus Heterometrus Hemprich & Ehrenberg (Scorpionidae, Arachnidea)", Zoologische Verhandelingen, 184(1), p. 1-196. 22. DeBin J. A., Maggio J. E., Strichartz G. R. (1993), "Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion", Am J Physiol, 264(2 Pt 1), p. C361-369. 23. DeBin J. A., Strichartz G. R. (1991), "Chloride channel inhibition by the venom of the scorpion Leiurus quinquestriatus", Toxicon, 29(11), p. 1403-1408. 24. Diaz-Garcia A., Morier-Diaz L., Frion-Herrera Y., Rodriguez-Sanchez H., Caballero-Lorenzo Y., Mendoza-Llanes D., Riquenes-Garlobo Y., Fraga-Castro J. A. (2013), "In vitro anticancer effect of venom from Cuban scorpion Rhopalurus junceus against a panel of human cancer cell lines", J Venom Res, 4, p. 5-12. 25. Dorce A. L. C., Martins A. D. N., Dorce V. A. C., Nencioni A. L. A. (2017), "Perinatal effects of scorpion venoms: maternal and offspring development", J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis, 23(1), p. 31.
47. 26. Fu Y. J., Yin L. T., Liang A. H., Zhang C. F., Wang W., Chai B. F., Yang J. Y., Fan X. J. (2007), "Therapeutic potential of chlorotoxin-like neurotoxin from the Chinese scorpion for human gliomas", Neurosci Lett, 412(1), p. 62-67. 27. Gopalakrishnakone P., Possani Lourival D., Schwartz Elisabeth F., Vega Ricardo C. Rodríguez de la (2014), Scorpion venoms, Springer, Dordrecht, p. 3-496. 28. Gordon D., Karbat I., Ilan N., Cohen L., Kahn R., Gilles N., Dong K., Stuhmer W., Tytgat J., Gurevitz M. (2007), "The differential preference of scorpion alpha-toxins for insect or mammalian sodium channels: implications for improved insect control", Toxicon, 49(4), p. 452-472. 29. Goudet C., Chi C. W., Tytgat J. (2002), "An overview of toxins and genes from the venom of the Asian scorpion Buthus martensi Karsch", Toxicon, 40(9), p. 1239-58. 30. Guan R., Wang C. G., Wang M., Wang D. C. (2001), "A depressant insect toxin with a novel analgesic effect from scorpion Buthus martensii Karsch", Biochim Biophys Acta, 1549(1), p. 9-18. 31. Hamilton P. J., Ogston D., Douglas A. S. (1974), "Coagulant activity of the scorpion venoms Palamneus gravimanus and Leiurus quinquestriatus", Toxicon, 12(3), p. 291-296. 32. Hoang Anh N. , Vo Hoang D.M. , Kudryashova K. S., Nekrasova O. V., Feofanov A. V., Andreeva T. V., Tsetlin V. I., Utkin Y. N. (2013), "Hetlaxin, a new toxin from the Heterometrus laoticus scorpion venom, interacts with voltage-gated potassium channel Kv1.3", Dokl Biochem Biophys, 449, p. 109-111. 33. Hoang Anh N. , Vo Hoang D.M. , Vo Nguyen P., Kudryashova K. S., Nekrasova O. V., Feofanov A. V., Kirpichnikov M. P., Andreeva T. V., Serebryakova M. V., Tsetlin V. I., Utkin Y. N. (2014), "Vietnamese Heterometrus laoticus scorpion venom: evidence for analgesic and anti-inflammatory activity and isolation of new polypeptide toxin acting on Kv1.3 potassium channel", Toxicon, 77, p. 40-48.
48. 34. Housley D. M., Housley G. D., Liddell M. J., Jennings E. A. (2017), "Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level", Neuropharmacology, 127, p. 46-78. 35. Incamnoi P., Patramanon R., Thammasirirak S., Chaveerach A., Uawonggul N., Sukprasert S., Rungsa P., Daduang J., Daduang S. (2013), "Heteromtoxin (HmTx), a novel heterodimeric phospholipase A(2) from Heterometrus laoticus scorpion venom", Toxicon, 61, p. 62-71. 36. Isbister G. K., Bawaskar H. S. (2014), "Scorpion envenomation", N Engl J Med, 371(5), p. 457-463. 37. Kovařík František (2004), "A review of the genus Heterometrus Ehrenberg, 1828, with descriptions of seven new species (Scorpiones, Scorpionidae)", Euscorpius, 2004(15), p. 1-60. 38. Liu T., Pang X. Y., Jiang F., Bai Z. T., Ji Y. H. (2008), "Anti-nociceptive effects induced by intrathecal injection of BmK AS, a polypeptide from the venom of Chinese-scorpion Buthus martensi Karsch, in rat formalin test", J Ethnopharmacol, 117(2), p. 332-338. 39. Liu Y., Jennings N. L., Dart A. M., Du X. J. (2012), "Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice", World J Exp Med, 2(2), p. 30-36. 40. Mamelak A. N., Jacoby D. B. (2007), "Targeted delivery of antitumoral therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin (TM-601)", Expert Opin Drug Deliv, 4(2), p. 175-186. 41. Manjunatha Kini R., Clemetson Kenneth J, Markland Francis S., McLane Mary Ann, Morita Takashi (2011), Toxins and Hemostasis: From Bench to Bedside, Springer, New York. 42. Nunes K. P., Costa-Goncalves A., Lanza L. F., Cortes S. F., Cordeiro M. N., Richardson M., Pimenta A. M., Webb R. C., Leite R., De Lima M. E. (2008), "Tx2-6 toxin of the Phoneutria nigriventer spider potentiates rat erectile function", Toxicon, 51(7), p. 1197-1206.
49. 43. Pennington M. W., Czerwinski A., Norton R. S. (2018), "Peptide therapeutics from venom: Current status and potential", Bioorg Med Chem, 26(10), p. 2738- 2758. 44. Possani Lourival D., Becerril Baltazar, Delepierre Muriel, Tytgat Jan (1999), "Scorpion toxins specific for Na+-channels", FEBS Journal, 264(2), p. 287-300. 45. Quintero-Hernandez V., Jimenez-Vargas J. M., Gurrola G. B., Valdivia H. H., Possani L. D. (2013), "Scorpion venom components that affect ion-channels function", Toxicon, 76, p. 328-342. 46. Saidani C., Hammoudi-Triki D., Laraba-Djebari F., Taub M. (2016), "In vitro studies with renal proximal tubule cells show direct cytotoxicity of Androctonus australis hector scorpion venom triggered by oxidative stress, caspase activation and apoptosis", Toxicon, 120, p. 29-37. 47. Soroceanu L., Gillespie Y., Khazaeli M. B., Sontheimer H. (1998), "Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors", Cancer Res, 58(21), p. 4871- 4879. 48. Teixeira C. E., de Oliveira J. F., Baracat J. S., Priviero F. B., Okuyama C. E., Rodrigues Netto N., Jr., Fregonesi A., Antunes E., De Nucci G. (2004), "Nitric oxide release from human corpus cavernosum induced by a purified scorpion toxin", Urology, 63(1), p. 184-189. 49. Teixeira C. E., Faro R., Moreno R. A., Rodrigues Netto N., Jr., Fregonesi A., Antunes E., De Nucci G. (2001), "Nonadrenergic, noncholinergic relaxation of human isolated corpus cavernosum induced by scorpion venom", Urology, 57(4), p. 816-820. 50. Teixeira C. E., Teixeira S. A., Antunes E., De Nucci G. (2001), "The role of nitric oxide on the relaxations of rabbit corpus cavernosum induced by Androctonus australis and Buthotus judaicus scorpion venoms", Toxicon, 39(5), p. 633-639. 51. Uawonggul N., Thammasirirak S., Chaveerach A., Arkaravichien T., Bunyatratchata W., Ruangjirachuporn W., Jearranaiprepame P., Nakamura T., Matsuda M., Kobayashi M., Hattori S., Daduang S. (2007), "Purification and
50. characterization of Heteroscorpine-1 (HS-1) toxin from Heterometrus laoticus scorpion venom", Toxicon, 49(1), p. 19-29. 52. Vandendriessche T., Kopljar I., Jenkins D. P., Diego-Garcia E., Abdel-Mottaleb Y., Vermassen E., Clynen E., Schoofs L., Wulff H., Snyders D., Tytgat J. (2012), "Purification, molecular cloning and functional characterization of HelaTx1 (Heterometrus laoticus): the first member of a new kappa-KTX subfamily", Biochem Pharmacol, 83(9), p. 1307-1317. 53. Wang X., Wang G. (2016), "Insights into Antimicrobial Peptides from Spiders and Scorpions", Protein Pept Lett, 23(8), p. 707-721. 54. Xiong Y. M., Lan Z. D., Wang M., Liu B., Liu X. Q., Fei H., Xu L. G., Xia Q. C., Wang C. G., Wang D. C., Chi C. W. (1999), "Molecular characterization of a new excitatory insect neurotoxin with an analgesic effect on mice from the scorpion Buthus martensi Karsch", Toxicon, 37(8), p. 1165-1180. 55. Zhao R., Weng C. C., Feng Q., Chen L., Zhang X. Y., Zhu H. Y., Wang Y., Ji Y. H. (2011), "Anticonvulsant activity of BmK AS, a sodium channel site 4- specific modulator", Epilepsy Behav, 20(2), p. 267-276. 56. Zhao R., Zhang X. Y., Yang J., Weng C. C., Jiang L. L., Zhang J. W., Shu X. Q., Ji Y. H. (2008), "Anticonvulsant effect of BmK IT2, a sodium channel-specific neurotoxin, in rat models of epilepsy", Br J Pharmacol, 154(5), p. 1116-1124.
51. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM KHẢO SÁT TÁC DỤNG LÊN THỜI GIAN ĐƠNG MÁU CỦA PĐ5 VÀ CÁC PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 Ở LIỀU 2,48mg/kg Nhĩm thử Chuột Thời gian đơng máu (giây) nghiệm Sau 20 Sau 30 Sau 60 Sau 90 Sau 120 phút phút phút phút phút PĐ5 1 643 437 482 391 355 2 337 222 295 447 447 3 341 282 496 532 378 4 298 212 386 123 299 5 350 430 206 329 304 6 465 567 360 339 340 PĐTC 5.5.1 1 374 397 359 550 376 2 450 404 340 307 288 3 522 336 312 316 223 4 410 492 341 610 435 5 366 503 486 413 257 6 433 425 359 374 199 PĐTC 5.21.1 1 488 406 363 414 372 2 424 409 307 409 314 3 330 304 270 401 272 4 365 353 414 479 394 5 387 219 198 400 359 6 315 354 250 660 296 PĐTC 5.22.3 1 389 291 295 267 177 2 495 357 450 289 274 3 407 305 184 134 158 4 712 524 580 445 327 5 918 648 224 365 213 6 418 262 295 382 272 CHỨNG 1 558 381 684 640 712 2 654 505 594 604 457 3 401 313 344 391 218 4 172 288 279 213 285 5 174 116 271 303 242 6 235 203 208 269 325 PL1
52. PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM KHẢO SÁT TÁC DỤNG LÊN THỜI GIAN CHẢY MÁU CỦA PĐ5 VÀ CÁC PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 Ở LIỀU 2,48mg/kg Nhĩm thử Chuột Thời gian đơng máu (giây) nghiệm Sau 20 Sau 30 Sau 60 Sau 90 Sau 120 phút phút phút phút phút PĐ5 1 558 115 197 74 55 2 121 68 74 253 204 3 600 40 53 47 1530 4 600 600 20 99 39 5 530 600 1800 1800 1017 6 122 112 86 124 97 PĐTC 5.5.1 1 419 215 465 72 44 2 135 296 77 26 18 3 76 26 48 21 18 4 600 1217 90 71 54 5 147 125 113 87 25 6 122 88 94 113 82 PĐTC 5.21.1 1 302 62 91 74 17 2 511 119 122 118 53 3 58 66 80 44 39 4 141 54 44 30 92 5 275 56 119 82 128 6 600 152 31 23 84 PĐTC 5.22.3 1 322 36 194 48 115 2 125 317 88 147 122 3 292 102 114 99 87 4 184 164 1800 420 51 5 273 250 199 159 90 6 202 205 117 36 38 CHỨNG 1 181 52 191 65 50 2 600 138 209 100 71 3 600 76 61 33 28 4 68 106 1800 184 69 5 411 511 465 175 110 6 89 64 233 41 17 PL2
53. PHIẾU XÁC NHẬN SỬA CHỮA Nội dung khĩa luận đã được chỉnh sửa theo gĩp ý của Hội đồng. GVHD Sinh viên (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên) Chủ tịch Hội đồng GV phản biện (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)