Khóa luận Bào chế kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh

Nội dung text: Khóa luận Bào chế kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ MAI BÀO CHẾ KEM CHỐNG CÔN TRÙNG TỪ TINH DẦU SẢ CHANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ MAI BÀO CHẾ KEM CHỐNG CÔN TRÙNG TỪ TINH DẦU SẢ CHANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này cũng như suốt quá trình học tập tại khoa. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược – Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi để có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, các Ban chủ nhiệm và các phòng ban trong Khoa Y Dược – Đại Học Quốc Gia Hà Nội vì những kiến thức đã dạy tôi trong suốt 5 năm học tập và rèn luyện tại khoa. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên tôi, động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như học tập để tôi có thể thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Mai. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ β-CD Beta – cyclodextrin CT Công thức DĐVN Dược điển Việt Nam Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm (Food and Drug FDA administration) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid HPLC Chromatography) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Số trang Bảng 1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 15 Bảng 2 Công thức bào chế mẫu kem CT1 20 Bảng 3 Công thức bào chế mẫu kem CT2 21 Bảng 4 Công thức bào chế mẫu kem CT1 22 Bảng 5 Công thức bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh 23 không sử dụng β-CD Bảng 6 Công thức bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh có 25 sử dụng β-CD Bảng 7 Hiệu suất chiết của citral 29 Bảng 8 Kết quả định lượng citral trong sản phẩm 29 Bảng 9 Theo dõi hàm lượng citral trong mẫu kem M1 32 Bảng 10 Theo dõi hàm lượng citral trong mẫu kem M2 33 Bảng 11 Số lượng kiến tập trung trên vùng giấy lọc được bôi 34 các mẫu kem theo thời gian @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
6. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Số trang Hình 1 Công thức cấu tạo của geranial 7 Hình 2 Công thức cấu tạo của neral 8 Hình 3 Các sản phẩm bán tổng hợp từ citral 9 Hình 4 Cấu trúc không gian và kích thước của các cyclodextrin 10 Hình 5 Cấu trúc không gian của β-CD 11 Hình 6 Quá trình tạo phức của β-CD 12 Hình 7 Mẫu kem chứa tinh dầu sả chanh không có β-CD 24 Hình 8 Mẫu kem chứa tinh dầu sả chanh có β-CD 26 Hình 9 Sắc ký đồ của hỗn hợp geraniol, citral ở bước sóng 28 200nm và 242nm Hình 10 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không có β-CD và 28 có β-CD Hình 11 Sắc ký đồ của dung dịch pha từ mẫu kem M1 và M2 ở 30 242nm Hình 12 So sánh màu sắc kem M1 khi mới bào chế và sau khi 31 bảo quản 136 ngày Hình 13 Số lượng kiến trên vùng bôi mẫu trắng và vùng bôi sản 35 phẩm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
7. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1 Các sản phẩm chống côn trùng 3 1.1.1 Một số hoạt chất trong các sản phẩm chống côn trùng 4 1.1.2 Một số sản phẩm phổ biến trên thị trường 5 1.2 Tinh dầu sả chanh và citral 6 1.2.1 Tinh dầu sả chanh 6 1.2.2 Cấu trúc của citral 7 1.2.3 Tính chất của citral 8 1.2.4 Ứng dụng của citral 8 1.2.5 Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng HPLC 9 1.3 Beta – cyclodextrin 10 1.3.1 Giới thiệu chung về cyclodextrin 10 1.3.2 Cấu trúc của beta – cyclodextrin 11 1.3.3 Tính chất của beta – cyclodextrin 11 1.3.4 Ứng dụng của beta – cyclodextrin 12 1.4 Khái quát về kem bôi da 13 1.4.1 Khái niệm 13 1.4.2 Kỹ thuật bào chế và sản xuất kem bôi da 13 1.4.3 Các yêu cầu chất lượng đối với kem bôi da 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
8. 2.1 Nguyên liệu, hóa chất 15 2.2 Máy móc, thiết bị 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp bào chế kem từ tinh dầu sả chanh 16 2.3.2 Phương pháp định lượng citral trong sản phẩm 18 2.3.3 Phương pháp theo dõi độ ổn định của sản phẩm 18 2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu quả chống côn trùng của sản phẩm 19 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM 20 3.1 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh 20 3.1.1 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh không sử dụng β-CD 20 3.1.2 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh có sử dụng β-CD 24 3.2 Định lượng citral trong sản phẩm 26 3.3 Độ ổn định của sản phẩm 31 3.4 Đánh giá hiệu quả chống côn trùng của sản phẩm 34 Chương 4: BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN 37 ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
9. MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nhiệt đới, với khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho các loài côn trùng sinh sống và phát triển. Các loài côn trùng không chỉ gây hại đến thực vật mà chúng còn gây ra nhiều phiền phức, tổn hại đến con người. Côn trùng đốt, cắn, giải phóng độc tố và để lại những tổn thương trên cơ thể người, gây khó chịu, dị ứng, bỏng, [1], thậm chí một số loài còn là nguyên nhân gây ra các bệnh nguy hiểm và có khả năng dẫn đến tử vong. Do đó, nhu cầu ngăn chặn và tiêu diệt côn trùng là tất yếu. Các sản phẩm chống côn trùng hiện nay tuy đa dạng về hình thức và thành phần nhưng chủ yếu là được sản xuất từ các chất hóa học như DEET, IR3535 với độc tính và nguy cơ dị ứng [3], hầu hết các sản phẩm đều không phù hợp sử dụng cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Việc sử dụng một sản phẩm chống côn trùng với thành phần tự nhiên an toàn, thân thiện với môi trường để thay thế cho các sản phẩm có nguồn gốc hóa học mang ý nghĩa rất lớn. Trong tự nhiên, không ít loài thực vật có khả năng xua đuổi, tiêu diệt côn trùng nhờ vào mùi hương, các loại tinh dầu vẫn thường được sử dụng cho các thiết bị xông xua đuổi côn trùng có thể kể đến như tinh dầu sả chanh, tinh dầu tràm, tinh dầu bạch đàn Trong số đó tinh dầu sả chanh là gần gũi nhất với đời sống hằng ngày. Thành phần chính trong tinh dầu sả chanh là citral với hai đồng phân cis (hay còn gọi là neral) và trans (hay còn gọi là geranial). Chính hoạt chất này gây nên mùi hương đặc trưng và tác động chống côn trùng của tinh dầu sả chanh. [11] Trên thực tế, tinh dầu sả chanh không thích hợp dùng trực tiếp trên da bởi citral có thể gây kích ứng khi dùng ở liều cao, các chế phẩm dạng xịt thì khó duy trì được độ ổn định do citral rất dễ bay hơi. Vì vậy việc bào chế sản phẩm dạng kem từ tinh dầu sả chanh là thích hợp nhất. Do bản chất dễ bay hơi của citral nên việc kết hợp với một chất có khả năng bảo vệ hoạt chất này sẽ khiến độ ổn định của sản phẩm tốt hơn. β-cyclodextrin, một oligosaccharide dạng vòng có khả năng bao lấy các hoạt chất trong cấu trúc không gian dạng nón cụt được thêm vào công thức bào chế để cải thiện độ ổn định của sản phẩm. β-cyclodextrin được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm với vai trò bảo vệ dược @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
10. chất, gia tăng khả năng hòa tan, dẫn truyền thuốc qua các màng sinh học, che dấu mùi, vị, [19] Nghiên cứu “Bào chế kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1, Bào chế được kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh. 2, Sơ bộ đánh giá được độ ổn định của sản phẩm. 3, Bước đầu chứng minh được tác dụng chống côn trùng của sản phẩm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
11. Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Các sản phẩm chống côn trùng Côn trùng là lớp động vật thuộc ngành chân đốt, là nhóm động vật đa dạng nhất hành tinh. Theo như các nhà khoa học ước tính lớp côn trùng có tới 8 – 10 triệu loài, với khoảng 1 triệu loài đã biết, côn trùng chiếm 78% số loài của toàn bộ giới động vật trên Trái Đất. Không chỉ đa dạng về loài, số lượng các cá thể côn trùng cũng đông đúc nhất hành tinh [1]. Côn trùng vừa có mặt lợi lại vừa có mặt hại. Lợi ích mà côn trùng mang lại đó là giúp thụ phấn cho hoa, một số loài côn trùng cung cấp các vật liệu, thực phẩm mà con người sử dụng hằng ngày như tơ tằm, mật ong, nhựa cánh kiến và nhiều loài côn trùng đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, khi chúng phân hủy chất thải giúp cho môi trường sạch sẽ hơn. Tuy nhiên, đại đa phần khi nhắc đến côn trùng thường gợi ra những tác hại mà côn trùng mang lại. Đối với nền nông nghiệp, côn trùng phá hoại mùa màng. Trong xây dựng, các loài côn trùng như mối, mọt ăn mòn gỗ. Trong đời sống hằng ngày, côn trùng gây khó chịu hoặc dị ứng, đốt hoặc cắn, đôi khi phóng chất độc khi con người vô tình tiếp xúc phải. Trong y tế, một số loài là trung gian truyền bệnh, mang ký sinh trùng gây nên các bệnh nguy hiểm cho con người, ví dụ như: muỗi Aedes là trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết, muỗi Anopheles là trung gian truyền bệnh sốt rét Vì mục đích bảo vệ con người, các sản phẩm chống côn trùng đã được ra đời và mang ý nghĩa vô cùng to lớn. Các sản phẩm chống côn trùng giúp xua đuổi côn trùng, không để chúng lại gần cơ thể người. Với thành phần là những chất có khả năng tiêu diệt hoặc gây tổn hại đến côn trùng mà côn trùng có thể cảm nhận được từ đó tránh xa khỏi vùng có sự hiện diện của những chất đó. Các sản phẩm chống côn trùng hiện nay tuy đa dạng về hình thức bào chế (dạng xịt, kem bôi ngoài da, nến, dung dịch thuốc tẩm ) nhưng về bản chất chia thành hai nhóm chính đó là: nhóm có nguồn gốc từ hóa chất tổng hợp và nhóm có nguồn gốc từ thiên nhiên. Các sản phẩm có nguồn gốc hóa học chiếm ưu thế trong cộng đồng khi nhóm sản phẩm này cho thấy hiệu quả cao và được tập trung sản @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
12. xuất công nghiệp. Tuy nhiên những sản phẩm có nguồn gốc hóa học lại mang nhiều tác dụng phụ, độc tính, gây hại cho con người. Trong khi đó, những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên mới chỉ dừng lại ở phạm vi sử dụng hẹp, mức độ nhận diện trong cộng đồng còn hạn chế mặc dù có ưu thế về tính an toàn. 1.1.1 Một số hoạt chất trong các sản phẩm chống côn trùng: a) DEET DEET tên hóa học là N,N-diethyl-meta-toluamide, lần đầu tiên được quân đội Mỹ sử dụng năm 1946 nhằm tiêu diệt các loại côn trùng. Sản phẩm chống côn trùng đầu tiên được sản xuất từ DEET vào năm 1956. Việc phát hiện ra DEET mang ý nghĩ lớn trong sự phát triển của nền y học, bởi khả năng chống côn trùng mạnh mẽ mà DEET mang lại. Từ đó, chất hóa học này được sử dụng rộng rãi và cho đến thời điểm hiện tại DEET vẫn là chất chống côn trùng được sử dụng rộng rãi nhất [2]. Tuy nhiên, trong suốt quá trình sử dụng chất hóa học này, tồn tại không ít các ghi chép về độc tính của DEET bao gồm bệnh về não ở trẻ em, hội chứng mề đay, sốc phản vệ, hạ huyết áp, tăng nhịp tim [3]. Những tác hại kể trên đặt ra yêu cầu cho một chất mới thay thế cho DEET, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm giải pháp cũng như sự hiện diện của một nguyên liệu mới với hiệu quả lý tưởng như DEET xong lại an toàn và thân thiện với con người. Kết quả là những chất hóa học mới đã ra đời tuy nhiên lại không thể đạt được sự phổ biến cũng như thành công về thương mại lớn như DEET. Như vậy, cho đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có chất nào thay thế được được hoàn toàn vai trò của DEET. b) Picaridin Picaridin hay Icaridin có tên hóa học là 1-(1-methylpropoxycarbonyl)-2-(2- hydroxyethyl) piperidine. Là một chất được nghiên cứu và phát triển khoảng những năm 1980, và chính thức được đưa vào sử dụng tại Mỹ năm 2005, với mong muốn sẽ thay thế cho DEET, đây là một chất gần như không gây kích ứng cho da, không có mùi hăng khó chịu và thời gian lưu lại trên da lâu hơn so với DEET [4]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
13. Các thử nghiệm cho thấy Picaridin không có quá nhiều sự khác biệt về hiệu quả so với DEET trên cả muỗi và các đối tượng côn trùng khác như ve, bọ [5] Xét về độ an toàn, chưa có báo cáo nào về độc tính, phản ứng phụ nghiêm trọng hay nguy cơ gây bệnh của Picaridin. Chất này từng được coi là một giải pháp tốt để thay thế cho DEET trong các sản phẩm chống côn trùng dành cho người. Tuy nhiên mức độ phổ biến của Picaridin hiện nay vẫn chưa thực sự rộng rãi. c) IR3535 IR3535 có tên hóa học là 3-[N-Butyl-N-acetyl]-aminopropionic acid, được nghiên cứu và phát triển khoảng những năm 1970, sau đó được sử dụng ở Châu Âu và khoảng hơn 20 năm sau đó mới được chính thức sử dụng tại Mỹ (1999) [6]. Hiệu quả chống muỗi của IR3535 kém hơn so với DEET và Picaridin. Không có nhiều các nghiên cứu về IR3535 và mức độ phổ biến của IR3535 cũng kém hơn nhiều so với 2 chất kể trên. 1.1.2 Một số sản phẩm phổ biến trên thị trường: a) Kem chống muỗi Soffell Xuất xứ: Indonesia. Thành phần: DEET (13%). Sử dụng: thoa lên những vùng da hở như cổ, tay, chân. Không sử dụng cho trẻ em dưới 4 tuổi. b) Kem chống muỗi OFF Xuất xứ: Philipines. Thành phần: DEET (15%) Sử dụng: thoa lên những vùng da hở như cổ, tay, chân. Không sử dụng cho trẻ dưới 4 tuổi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
14. c) Xịt chống muỗi và côn trùng AQUA Xuất xứ: Nga. Thành phần: IR3535, Aloe vera, allantoin. Sử dụng: Phun vào lòng bàn tay, xoa lên những vùng da hở như cổ, tay, chân. Sản phẩm vừa có tác dụng chống côn trùng, vừa làm dịu vết côn trùng đốt. Sản phẩm sử dụng được cho trẻ trên 1 tuổi. d) Xịt chống muỗi và côn trùng Skin Vape Xuất xứ: Nhật Bản. Thành phần: DEET (10%), ethanol, hyaluronic acid, nước, nước hoa. Sử dụng: xịt trực tiếp lên da vùng tay, chân và cổ. Sản phẩm không sử dụng cho trẻ em dưới 6 tháng tuổi. Dùng hạn chế đối với trẻ dưới 12 tuổi (1 đến 3 lần/ngày). e) Xịt chống muỗi Rohto Remos Xuất xứ: Việt Nam. Thành phần: DEET (15%). Sử dụng: Phun một lượng thích hợp lên lòng bàn tay rồi thoa lên những vùng da cần bảo vệ. Sản phẩm dùng cho người lớn và trẻ em trên 4 tuổi. 1.2 Tinh dầu sả chanh và citral 1.2.1 Tinh dầu sả chanh Sả chanh có tên khoa học là Cymbopogon citratus Stapf. thuộc họ Lúa (Poaceae), cây mọc tự nhiên tại các vùng có khí hậu nhiệt đới và có nhiệt độ ấm áp. Sả Chanh có nguồn gốc Đông Nam Á, Cây sống lâu năm, cao khoảng 1.5m, mọc thành bụi, phân nhánh nhiều. Thân rễ trắng hoặc hơi tía, lá dài tới 1m, lá hẹp, mép hơi ráp. Tinh dầu sả chanh có chứa trong các bộ phận phía trên mặt đất của cây [7]. Cây được dùng làm gia vị, tinh dầu sả chanh được ứng dụng nhiều trong các sản phẩm chăm sóc tóc và da. Cymbopogon citratrus còn được biết đến rộng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
15. rãi trong y học truyền thống với các công dụng làm thuốc chữa bệnh [8]. Bên cạnh đó tinh dầu sả chanh còn có các tác dụng xua đuổi, tiêu diệt côn trùng và tác dụng kháng khuẩn [9,10]. Tinh dầu sả chanh có mùi thơm dễ chịu, hơi giống với mùi chanh và được biết đến là một loại tinh dầu chống côn trùng vô cùng hiệu quả. Các thử nghiệm về khả năng xua đuổi và tấn công trên kiến và muỗi đã cho thấy tác dụng chống côn trùng của loại tinh dầu này. Nghiên so sánh hiệu quả của tinh dầu sả chanh so với DEET, kết quả so sánh cho thấy tinh dầu sả chanh cho hiệu quả gần như tương đương với DEET [7]. Tinh dầu sả chanh có chứa citral, geraniol, trong đó thành phần chính là citral với hàm lượng cao, chiếm từ 65 - 85% [11]. Chính sự có mặt của citral quyết định mùi hương và khả năng chống côn trùng của tinh dầu sả chanh. 1.2.2 Cấu trúc của citral Citral hay 3,7-dimethyl-2,6-octadienal hoặc lemonal là terpenoid hoặc hỗn hợp của 2 terpenoid có cùng công thức phân tử C6H10O cũng chính là 2 đồng phân: E thường gọi là geranial hay citral A (hình 1) và đồng phân Z gọi là neral hay citral B (hình 2). Khối lượng phân tử 152.237g/mol [12]. Citral có chứa nhiều trong các tinh dầu màng tang (Litsea cubeba), hương nhu (Ocimum tenuiflorum), sả chanh (Cymbopogon citratus) và nhiều loài thực vật khác. Hình 1. Công thức cấu tạo của geranial (citral A) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 7
16. Hình 2. Công thức cấu tạo của neral (citral B) 1.2.3 Tính chất của citral Geranial có hương chanh mạnh, neral có hương thơm nhẹ và ngọt hơn. Ở điều kiện thường, citral tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt. Citral kém tan trong nước, ở 25 °C 100ml nước hòa tan được 0.059g citral, tuy nhiên citral lại tan tốt trong alcohol và các dung môi hữu cơ khác. Citral kém bền ở môi trường kiềm và acid mạnh [12], có tác dụng kháng khuẩn mạnh và có tác động pheromone lên côn trùng [13]. Citral hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, khi dùng trên da phần lớn bị bay hơi. Độc tính cấp tính của citral là rất thấp, đối với trường hợp dùng trên da độc tính còn thấp hơn nữa nên trên thực tế citral không hề gây độc [14]. Tuy nhiên, citral có thể gây kích ứng khi dùng trên da ở liều cao [12]. 1.2.4 Ứng dụng của citral Citral được dùng làm chất tạo hương trong thực phẩm. Sử dụng làm nguyên liệu ban đầu trong sản xuất hương liệu, nước hoa. Ngoài ra, từ citral có thể tổng hợp được ra nhiều dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong đời sống ví dụ như: citronellol, methylone, vitamin A, geraniol [12,15] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
17. Hình 3. Các sản phẩm bán tổng hợp từ citral 1.2.5 Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng HPLC Nghiên cứu của các tác giả Roopa Gaonkar, S. Yallappa, B.L. Dhananjaya và Gurumurthy Hegde về xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu Sả Chanh bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo năm 2016. Sử dụng phương pháp đo tín hiệu sắc ký, với cột sắc ký C-18G (250x4,6mm, 5µm), pha động gồm: acetonitrile và nước (70:30), tốc độ dòng 1ml/phút, đầu dò PDA ở bước sóng 233nm. Phương pháp định lượng cho khoảng tuyến tính, tính chính xác và độ đặc hiệu trong khoảng nồng độ citral từ 3 - 100µg/ml [17]. Một nghiên cứu khác của các tác giả Diogo Miron, Fernanda Battisti, Carla Schwengber Ten Caten, Paulo Mayorga và Elfrides Eva Scherman Schapoval về xác định quang phổ của citral trong phức hợp với cyclodextrin năm 2012 đã đưa ra phương pháp định lượng hai đồng phân của citral bằng hệ thống HPLC AGILENT Series 1200 với phần mềm Agilent Chemstration, điều kiện sắc ký gồm pha động: acetonitrile, nước, methanol (47:43:10), sử dụng cột RP18 (250nm x 4mm, 5µm), tốc độ dòng 1,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 15µl, bước sóng phát hiện là 240nm ở điều kiện nhiệt độ 30oC. Với kết quả của 2 pic tín hiệu của neral và geranial có độ phân giải tốt kể cả khi ở nồng độ cao [18]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
18. 1.3 Beta – cyclodextrin 1.3.1 Giới thiệu chung về cyclodextrin Cyclodextrin là những oligosaccharide vòng, gồm một vòng macrocyclic của các tiểu đơn vị glucose nối với nhau bằng liên kết glycoside. Cyclodextrin bao gồm 5 hoặc nhiều đơn vị α-D-glucopyranoside liên kết bằng liên kết α-1,4- glycoside. Các cyclodextrin lớn nhất chứa tới 32 đơn vị. Các cyclodextrin điển hình chứa từ 6 đến 8 đơn vị α-D-glucopyranoside, tạo ra hình dạng hình nón cụt: α-cyclodextrin : 6 đơn vị α-D-glucopyranoside β-cyclodextrin : 7 đơn vị α-D-glucopyranoside γ-cyclodextrin : 8 đơn vị α-D-glucopyranoside Cấu trúc và hình dạng 3D của các cyclodextrin được mô tả trong hình 4. Hình 4. Cấu trúc không gian và kích thước của các cyclodextrin [20]. Các cyclodextrin được sản xuất từ tinh bột bằng cách xử lý với enzyme. Cyclodextrin thường được ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, các ngành công nghiệp hóa học cũng như nông nghiệp và kỹ thuật môi trường [19]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
19. 1.3.2 Cấu trúc của beta – cyclodextrin β-cyclodextrin (β-CD) có công thức phân tử là (C6H10O5)7 hay C42H70O35, khối lượng phân tử gồm 7 đơn vị α-D-glucopyranoside [21]. Với cấu trúc không gian dạng hình nón cụt có “lỗ hổng” bên trong giúp β-CD có thể giữ được các phân tử khác. Các nhóm chức hydroxyl định hướng ở mặt ngoài của hình nón, trong đó những nhóm chức hydroxyl bậc 1 ở rìa hẹp còn các nhóm chức hydroxyl bậc 2 ở rìa rộng hơn của hình nón. Lỗ hổng trung tâm bọc bởi khung carbon và nguyên tử oxygen thuộc phần ether của đường [22]. Cấu trúc không gian của β- CD được thể hiện ở hình 5. Hình 5. Cấu trúc không gian của β-CD 1.3.3 Tính chất của beta – cyclodextrin β-CD ít tan trong nước ở nhiệt độ thường tuy nhiên lại tan tốt trong nước nóng. Ổn định trong môi trường kiềm, dễ thủy phân trong môi trường acid mạnh [21]. Khả năng tạo phức: β-CD có khả năng bao các phân tử khác trong lỗ hổng của nó, bởi các nhóm hydroxyl ở mặt ngoài và mặt trong lỗ hổng là môi trường kỵ nước, do đó các phân tử β-CD thể bắt lấy các phân tử kỵ nước hay còn gọi là phân tử khách có kích thước phù hợp vào lỗ hổng khi ở trong môi trường nước. Liên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
20. kết giữa phân tử β-CD và phân tử khách gồm liên kết hydrogen, tương tác Vander waals, tương tác lưỡng cực và không phải là vĩnh viễn, được đặc trưng bởi trạng thái cân bằng động [23]. (hình 6) Hình 6. Quá trình tạo phức của β-CD [20] 1.3.4 Ứng dụng của beta – cyclodextrin β-CD có thể cải thiện độ tan của các chất không hòa tan hoặc tan kém trong nước, làm giảm sự bay hơi các thành phần dễ bay hơi, tăng tính ổn định hóa học của chất khác, β-CD được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: [23] - Trong lĩnh vực thực phẩm và hương liệu: β-CD dùng làm chất bảo vệ và dẫn truyền các hương liệu, làm giảm vị đắng hay mùi vị khó chịu của một số hợp chất. - Trong ngành mỹ phẩm: β-CD làm giảm sự bay hơi của các hợp chất dễ bay hơi. - Trong ngành dược phẩm: β-CD được dùng như tác nhân tạo phức, làm tăng khả năng hòa tan của những thuốc có độ hòa tan kém, từ đó làm tăng sinh khả dụng và độ ổn định. Cải thiện dẫn truyền thuốc qua các màng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
21. sinh học nhờ vào β-CD. Ngoài ra β-CD còn làm giảm độ rát với dạ dày – ruột. Các nghiên cứu cho thấy sử dụng β-CD trên da không gây bất kỳ phản ứng có hại hay hiện tượng kích ứng nào. Trên thực tế β-CD cũng không gây độc khi sử dụng bằng đường uống [20]. 1.4 Khái quát về kem bôi da 1.4.1 Khái niệm Kem bôi da là những chế phẩm thuộc hệ phân tán nhiều pha, bao gồm: Pha dầu, pha nước và chất nhũ hóa [30]. Theo cấu trúc hóa lý, kem bôi da chia thành 2 loại: Kem N/D: Pha nội thân nước, pha ngoại (pha liên tục) thân dầu. Trong thành phần có các chất nhũ hóa tạo nhũ tương N/D như: Lanolin, este sorbitan (Span), monoglycerid và alcol béo. Kem D/N: Pha nội thân dầu, pha ngoại (pha liên tục) thân nước. Trong thành phần có các chất nhũ hóa tạo nhũ tương D/N như: Xà phòng kiềm hóa trị một (natri, kali), xà phòng amin (mono, di và triethanolamin), alcol béo sulfat, polysorbat (Tween), ether hoặc este của acid béo với polyethylen glycol. 1.4.2 Kỹ thuật bào chế và sản xuất kem bôi da Tùy theo tính chất của dược chất và tá dược, kem bôi da được bào chế theo một trong số các phương pháp sau: - Nhũ hóa trực tiếp: Hòa tan dược chất, tá dược trong pha dầu hoặc pha nước tùy theo tính chất của các chất, sau đó đun nóng 2 pha, nhiệt độ pha nước nước cao hơn vài độ, phối hợp 2 pha và khuấy trộn bằng thiết bị thích hợp. - Trộn đều nhũ hóa: Dược chất ở thể lỏng được thêm dần từng lượng nhỏ vào tá dược khan, vừa thêm vừa khuấy nhẹ nhàng, sau khi đã thêm hết dược chất khuấy trộn mạnh đến khi thu được hỗn hợp đồng nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
22. 1.4.3 Các yêu cầu chất lượng đối với kem bôi da Để đảm bảo chất lượng trong quá trình sử dụng và bảo quản, kem bôi da phải đáp ứng được các yêu cầu sau: Đảm bảo độ đồng nhất của hỗn hợp dược chất và tá dược; có thể chất mềm mịn và không bị chảy ở nhiệt độ thường; dễ bám thành lớp mỏng khi bôi lên da hay niêm mạc; không gây kích ứng da và niêm mạc; bền vững trong quá trình bảo quản; cho hiệu quả điều trị, bảo vệ đúng với mục đích bào chế; riêng đối với loại kem bôi sử dụng với mục đích bảo vệ phải đảm bảo tạo được một lớp che phủ và duy trì trên da, không chứa các chất có khả năng thấm sâu qua da và hấp thụ vào bên trong cơ thể. Việc đánh giá chất lượng của kem bôi da dựa trên các tiêu chí sau: [24] - Độ đồng nhất của kem: Kiểm tra sự phân tán đồng đều của dược chất và tá dược. - Điểm nhỏ giọt: Chính là nhiệt độ mà ở đó nguyên liệu bị chảy thành dạng lỏng, việc xác định điểm nhỏ giọt để đảm bảo kem không bị chảy lỏng ở nhiệt độ 37oC. - Điểm đông đặc: Chính là nhiệt độ thấp nhất mà kem có tính chất của chất lỏng. - Chỉ số nước: Là lượng nước tối đa biểu thị bằng gam mà 100g tá dược khan nước ở nhiệt độ thường có khả năng hút được. - Độ nhớt: Được xác định bằng nhớt kế. - Thể chất: Có rất nhiều phương pháp, dụng cụ để kiểm tra thể chất như đo độ xuyên sâu, đo độ dàn mỏng, đo độ dính - Ngoài ra còn một số chỉ tiêu khác tùy theo tính chất, mục đích sử dụng của kem, chẳng hạn như: tính an toàn của kem, các nguy cơ gây kích ứng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
23. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất Nghiên cứu sử dụng các nguyên liệu hóa chất được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng. STT Tên Xuất xứ Tiêu chuẩn Tinh dầu sả chanh (74,94% 1 Việt Nam Nhà sản xuất citral) 2 β-cyclodextrin Roquette, Pháp FDA Hoa Kỳ 3 Cetyl alcohol Trung Quốc DĐVN V 4 Lanolin Trung Quốc DĐVN V 5 Stearic acid Trung Quốc DĐVN V 6 Dầu parafin Trung Quốc DĐVN V 7 Glycerin Trung Quốc DĐVN V 8 Kali hydroxyd Trung Quốc DĐVN V 9 Citral tinh khiết 96% Merck KGaA, Đức HPLC 10 Geraniol tinh khiết 98% Merk KGaA, Đức HPLC 11 Acetonitril Merck KGaA, Đức HPLC 12 Methanol Merck KGaA, Đức HPLC 13 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN V @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
24. 2.2 Máy móc, thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Model Ultimate 3000 – Dionex, Thermo Scientific Hoa Kỳ ghép thiết bị phát hiện đa sóng DAD - 3000 Dionex. Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250mm, 5µm). Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478. Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Thiết bị khuấy từ IKA C – MAG HS 7, Đức. Thiết bị đồng nhất hóa Homogeniser, WiseTis HG-15A. Máy đo pH spear của hãng Thermo Scientific Eutech, Singapore. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bào chế kem từ tinh dầu sả chanh Kem có cấu trúc nhũ tương dạng D/N và được bào chế với quy trình như sau: [25] Bào chế kem không sử dụng β-CD - Pha dầu gồm: cetyl alcohol, lanolin, stearic acid, dầu parafin, cân lần lượt các chất cho vào cốc đong thể tích 50ml. Đun nóng pha dầu trên bếp khuấy từ, khuấy nhẹ (nhiệt độ khoảng 75oC). - Pha nước gồm: glycerin, KOH, H2O, cân lần lượt các chất cho vào cốc đong thể tích 50ml. Đun nóng pha nước trên bếp khuấy từ, khuấy nhẹ (nhiệt độ khoảng 70oC). - Phối hợp hai pha: cho từ từ pha nước vào pha dầu, khuấy từ ở 1500 vòng/phút để tạo nhũ tương D/N. - Thêm tinh dầu sả chanh: khi nhiệt độ hỗn hợp còn khoảng 55oC thì thêm từ từ tinh dầu sả chanh vào. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
25. - Đồng nhất hóa hỗn hợp ở tốc độ 3900 vòng/phút trong 5 phút để thu được kem. - Sau khi thu được kem, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu chất lượng. Bào chế kem có sử dụng β-CD - Cân β-CD, nước vào cốc đong 50ml, đun trên bếp khuấy từ và khuấy nhẹ ở 55oC trong 10 phút. Giảm nhiệt độ về khoảng 50oC, thêm từ từ tinh dầu sả chanh vào cốc, tiếp tục khuấy từ với tốc độ 250 vòng/phút ở 25oC trong thời gian 4 giờ. - Đun nóng pha dầu (cetyl alcohol, lanolin, stearic acid, dầu parafin) khoảng o o 70 C và pha nước (glycerin, KOH, H2O) khoảng 75 C trên bếp khuấy từ, khuấy nhẹ. Phối hợp hai pha, tăng tốc độ khuấy từ lên 1500 vòng/phút để tạo nhũ tương D/N, duy trì nhiệt độ của hỗn hợp ở khoảng 55oC. - Đun hỗn hợp β-CD – tinh dầu đến khoảng 55oC rồi phối hợp với dung dịch nhũ tương ở bước trên. Đồng nhất hóa ở tốc độ 3900 vòng/phút trong 5 phút để thu được kem. - Sau khi thu được kem, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu chất lượng. Bào chế các mẫu trắng: Thực hiện với quy trình tương tự, thay lượng tinh dầu sả chanh bằng nước cất. Sản phẩm được đánh giá một số chỉ tiêu sau: - Hình thức, cảm quan: quan sát về màu sắc, đánh giá độ mềm, mịn, mùi hương. - Xác định pH: Cân 2g mẫu kem bào chế pha loãng trong 18g nước cất, đo pH trên dung dịch pha loãng. Kem không được quá acid hay quá kiềm, vì thế giá trị pH đo được nên nhỏ hơn 7 và càng gần pH của da (4,5 – 6,2) càng tốt [26]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
26. 2.3.2 Phương pháp định lượng citral trong sản phẩm Quy trình định lượng citral bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD được xây dựng và thẩm định theo hướng dẫn của ICH [31]. Các yếu tố được thẩm định gồm: tính tuyến tính và khoảng định lượng, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và hiệu suất chiết. Tất cả các mẫu đều được phân tích 3 lần, lấy giá trị trung bình. Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. (Phối hợp thực hiện cùng Nguyễn Thị Huê, sinh viên lớp Dược học, khóa QH.2014.Y, Khoa Y Dược – Đại Học Quốc Gia Hà Nội). Chuẩn bị dung dịch định lượng: Cân chính xác khoảng 0,25g mẫu thử cho vào bình định mức 50ml, thêm hỗn hợp dung môi acetonitrile : nước (60:40, v/v) đến vạch, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm. Pha loãng dịch lọc 5 lần trong cùng dung môi rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: Cân chính xác khoảng 0,1g mẫu trắng cho vào định mức 10ml, thêm hỗn hợp dung môi acetonitrile : nước (60:40,v/v) đến vạch, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm. Pha loãng dịch lọc 5 lần trong cùng dung môi rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. 2.3.3 Phương pháp theo dõi độ ổn định của sản phẩm Sản phẩm bào chế được đựng trong hộp nhựa polypropylene kích thước 7 x 5 x 3,5cm, đậy kín và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 5oC; độ ẩm 65 ± 5%, tránh ánh sáng. Độ ổn định của sản phẩm được đánh giá dựa trên: - Sự biến đổi về cảm quan của các mẫu kem theo thời gian. - Sự thay đổi của hàm lượng citral trong các mẫu kem theo thời gian. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
27. 2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu quả chống côn trùng của sản phẩm Đánh giá hiệu quả của sản phẩm qua thử nghiệm sinh học trên kiến Camponotus consobrinus với quy trình tiến hành như sau: [27] Cắt đôi một tờ giấy lọc đường kính 9cm thành hai nửa bằng nhau, một nửa bôi 0,5ml mẫu thử, nửa còn lại bôi một lượng tương đương mẫu trắng. Dùng băng dính dán 2 nửa thành hình tròn ban đầu và đặt vào đĩa petri. Thả 25 cá thể kiến vào khu vực trung tâm, dùng màng nilon bịt kín miệng đĩa để kiến không chui ra ngoài. Quan sát và đếm tổng số lượng kiến ở mỗi nửa giấy lọc 15 phút/ lần trong vòng 2 giờ. Thí nghiệm được thực hiện trên các mẫu ngay sau khi bào chế và được thực hiện lại sau khi bảo quản 3 tháng để so sánh. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
28. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM 3.1 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh 3.1.1 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh không sử dụng β-CD Tham khảo tài liệu [25], bào chế mẫu kem (ký hiệu CT1) với phương pháp được mô tả ở mục 2.3.1 và thành phần công thức trong bảng 2. Bảng 2. Công thức bào chế mẫu kem CT1 STT Tên Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 1 Cetyl alcohol 2,0 0,10 2 Lanolin 1,0 0,05 3 Dầu parafin 2,0 0,10 4 Stearic acid 15,0 0,75 5 Glycerin 10,0 0,50 6 Kali hydroxyd 1,0 0,05 7 Nước tinh khiết 69,0 3,45 Tổng 100,0 5,00 Kết quả: Kem có màu trắng đục, mịn, đồng nhất, hơi đặc. Giá trị pH = 7,9. Vì giá trị pH 7,9 là cao hơn nhiều so với pH của da (4,5 – 6,2) nên tỷ lệ KOH được giảm xuống và bào chế mẫu kem mới (ký hiệu CT2) theo quy trình tương tự, thành phần công thức trong bảng 3. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
29. Bảng 3. Công thức bào chế mẫu kem CT2 STT Tên Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 1 Cetyl alcohol 2,0 0,4 2 Lanolin 1,0 0,2 3 Dầu paraffin 2,0 0,4 4 Stearic acid 15,0 3,0 5 Glycerin 10,0 2,0 6 Kali hydroxyd 0,5 0,1 7 Nước tinh khiết 69,5 13,9 Tổng 100,0 20,0 Kết quả: Kem có màu trắng đục, mịn, đồng nhất, hơi đặc. Giá trị pH = 7,8. Vì giá trị pH = 7,8 vẫn cao, nên tỷ lệ KOH được giảm xuống và để kem có thể chất đẹp hơn, giảm tỷ lệ pha dầu : pha nước, bào chế mẫu kem thứ 3 (ký hiệu CT3) với quy trình tương tự, thành phần công thức trong bảng 4. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
30. Bảng 4. Công thức bào chế mẫu kem CT3 STT Tên Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 1 Cetyl alcohol 1,8 0,36 2 Lanolin 0,9 0,18 3 Dầu paraffin 1,8 0,36 4 Stearic acid 13,5 2,70 5 Glycerin 9,0 1,80 6 Kali hydroxyd 0,2 0,04 7 Nước tinh khiết 72,8 14,56 Tổng 100,0 20,00 Kết quả: Kem màu trắng đục, mịn, đồng nhất, mềm. Giá trị pH = 6,8. Dựa theo kết quả thể chất kem và pH, công thức CT3 cho thể chất đẹp và pH phù hợp do đó chọn công thức CT3 để bào chế kem chống côn trùng chứa tinh dầu sả chanh. Kem được bào chế với phương pháp được mô tả ở mục 2.3.1 và thành phần công thức trong bảng 5. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
31. Bảng 5. Công thức bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh không sử dụng β- CD (ký hiệu M1) STT Tên Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 1 Tinh dầu sả chanh 7,5 1,50 2 Cetyl alcohol 1,8 0,36 3 Lanolin 0,9 0,18 4 Dầu paraffin 1,8 0,36 5 Stearic acid 13,5 2,70 6 Glycerin 9,0 1,80 7 Kali hydroxyd 0,2 0,04 8 Nước tinh khiết 65,3 13,06 Tổng 100,0 20,00 Kết quả: Kem có màu trắng hơi ngả sang vàng nhạt, không phân lớp hay vón cục, thể chất mềm, mịn, đồng nhất, tạo thành lớp mỏng khi bôi lên da, có mùi thơm của tinh dầu sả chanh. pH = 6,7. (hình 7) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
32. Hình 7. Mẫu kem chứa tinh dầu sả chanh không có β-CD (M1) 3.1.2 Bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh có sử dụng β-CD β-CD được sử dụng nhằm mục đích tạo phức với các phân tử citral và bảo vệ các phân tử citral khỏi sự bay hơi, từ đó nâng cao độ ổn định của sản phẩm. Theo các khuyến cáo β-CD nên được sử dụng trong công thức bào chế với tỷ lệ mol β-CD : citral là 1:1 để đảm bảo hiệu suất của quá trình tạo phức. Tuy nhiên khi bào chế với lượng β-CD theo đúng tỉ lệ này và dùng lượng nước như trong công thức, hỗn hợp tạo thành có thể chất đặc, quánh và không thể khuấy trộn. Qua khảo sát từ thực nghiệm, đã điều chỉnh lượng β-CD sử dụng với tỷ lệ khối lượng β-CD : H2O là 1:1,5. Việc thêm β-CD (chất rắn) vào làm thay đổi thể chất kem vì vậy điều chỉnh tỷ lệ các tá dược và bào chế theo phương pháp được mô tả ở mục 2.3.1, thành phần công thức trong bảng 6. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
33. Bảng 6. Công thức bào chế kem chứa tinh dầu sả chanh có sử dụng β-CD (ký hiệu M2) STT Tên Tỷ lệ (%) Khối lượng (g) 1 Tinh dầu sả chanh 7,50 1,50 2 β-Cyclodextrin 16,50 3,30 3 Cetyl alcohol 0,90 0,18 4 Lanolin 0,45 0,09 5 Dầu paraffin 0,90 0,18 6 Stearic acid 6,75 1,35 7 Glycerin 4,50 0,90 8 Kali hydroxyd 0,05 0,01 9 Nước tinh khiết 62,45 12,49 Tổng 100,00 20,00 Kết quả: Kem có màu trắng đục, không phân lớp hay vón cục, thể chất đồng nhất, mềm và mịn, tạo thành lớp mỏng khi bôi lên da, kem có mùi thơm của tinh dầu sả chanh (mùi nhẹ hơn so với mẫu kem M1). pH = 6,9 (hình 8) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
34. Hình 8. Mẫu kem chứa tinh dầu sả chanh có β-CD (M2) 3.2 Định lượng citral trong sản phẩm Qua quá trình xây dựng và khảo sát từ thực nghiệm đã xác định được điều kiện sắc ký như sau: - Pha tĩnh là silicagel pha đảo C18 trong cột 5 μm, 4,6×250 mm. - Pha động acetonitril : nước : methanol tỷ lệ 47 : 43 : 10 với tốc độ dòng 1 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu là 10µl. - Thời gian sắc ký là 25 phút. - Bước sóng phát hiện citral là 242 nm, bước sóng phát hiện geraniol là 200nm. Phương trình hồi quy đối với đồng phân neral và geranial lần lượt là: y1 = 0,3619x1 – 0,7782; y2 = 0,5153x2 – 0,8380. Với y1;y2 lần lượt là diện tích pic (mAu.min) của neral và geranial, x1; x2 lần lượt là nồng độ (µg/ml) của neral và geranial trong dung dịch. Các kết quả thẩm định cho thấy: trong khoảng nồng độ citral 10 – 100µg/ml tương ứng với 5 – 50µg/ml neral hay geranial, phương trình hồi quy có sự tương @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
35. quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch. Đã xác định được LOD và LOQ của neral lần lượt là 0,10 và 0,33 µg/ml; LOD và LOQ của geranial lần lượt là 0,30 và 1,00 µg/ml. Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng và độ chính xác. Các kết quả này được mô tả chi tiết trong khóa luận tốt nghiệp đại học ngành dược học năm 2019 của Nguyễn Thị Huê “Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod”. Để có thể ứng dụng được phương pháp trên vào việc định lượng citral trong dạng bào chế, cần thẩm định thêm một số yếu tố khác như tính đặc hiệu và hiệu suất chiết. Kết quả như sau: Tính đặc hiệu: Tính đặc hiệu của phương pháp được xác định dựa vào khả năng phân tách của citral với tạp geraniol. Tiến hành sắc ký dung dịch geraniol 5µg/ml, quét phổ hấp thụ của dung dịch trong khoảng 190-300nm tìm được bước sóng hấp thụ cực đại là 200nm. Tiến hành sắc ký dung dịch chứa đồng thời 20µg/ml citral và 5µg/ml geraniol với các bước sóng phát hiện 200 và 242nm. Cùng với đó, tiến hành sắc ký dung dịch mẫu trắng. Kết quả cho thấy tạp geraniol không hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 242nm. Ở 200nm, geraniol cho pic có thời gian lưu 9,360 phút, tách hoàn toàn khỏi các pic neral và geranial. Độ phân giải giữa pic geraniol và pic neral là 4,78. Các pic đều tinh khiết với độ tương xứng lớn. Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không thấy xuất hiện pic khác. Các kết quả trên cho phép khẳng định tính đặc hiệu của phương pháp phân tích (hình 9 và 10). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
36. Hình 9. Sắc ký đồ của hỗn hợp geraniol, citral ở bước sóng 200nm (A) và 242nm (B) Hình 10. Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không có β-CD (A) và có β-CD (B) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
37. Hiệu suất chiết: Hiệu suất chiết được xác định dựa trên đáp ứng của dung dịch mẫu thử tự tạo so sánh với đáp ứng của mẫu chuẩn ở cùng nồng độ. Tiến hành pha mẫu thử: Cân chính xác khoảng 234,4mg mẫu trắng và 15,6mg citral cho vào bình định mức 50ml, pha loãng với cùng hệ dung môi và quy trình tương tự như đối với sản phẩm. Khi đó nồng độ citral trong dung dịch là 60µg/ml. Kết quả định lượng citral trong dung dịch và hiệu suất chiết được thể hiện trong bảng 7. Bảng 7. Hiệu suất chiết của citral mAu*min mAu*min Nồng độ citral Hiệu suất Mẫu neral geranial thực tế (µg/ml) chiết (%) Không có β-CD 9,7246 15,1274 60,0041 100,0068 Có β-CD 9,7106 15,1123 59,9360 99,8933 Như vậy phương pháp cho hiệu suất chiết cao, rất gần với giá trị 100%. Từ đó, tiến hành định lượng citral trong hai mẫu kem, kết quả cho tín hiệu sắc ký của neral và geranial như hình 11. Hàm lượng citral trong các mẫu kem được thể hiện trong bảng 8. Bảng 8. Kết quả định lượng citral trong sản phẩm Nồng độ citral Hàm lượng Mẫu trong dung dịch (µg/ml) citral trong mẫu (%) M1 60,8899 6,0890 M2 60,4971 6,0497 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
38. Hình 11. Sắc ký đồ của dung dịch pha từ mẫu kem M1 (A) và M2 (B) ở 242nm Như vậy từ phương pháp định lượng đảm bảo về tính đặc hiệu, tính đúng, tính chính xác, có độ tuyến tính và hiệu suất chiết cao đã định lượng được hàm lượng citral trong mẫu kem M1 là 6,098% và M2 là 6,0497%. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
39. 3.3 Độ ổn định của sản phẩm Biến đổi về cảm quan: Theo dõi các sản phẩm trong thời gian 3 tháng bảo quản ở điều kiện thường, tránh ánh sáng. Bằng quan sát và cảm quan, nhận thấy rằng: mẫu kem M1 có thay đổi về hình thức (màu vàng đậm hơn), thể chất khô hơn (hình 12), mẫu kem M2 không có sự thay đổi về hình thức và thể chất. Hình 12. So sánh màu sắc kem M1 khi mới bào chế (A) và sau khi bảo quản 3 tháng (B). Thay đổi hàm lượng citral: Tiến hành định lượng hàm lượng citral trong các mẫu sản phẩm theo phương pháp được mô tả ở mục 2.3.2 tại các thời điểm khác nhau. Kết quả định lượng hàm lượng citral trong các mẫu kem theo thời gian được thống kê trong bảng 9 và bảng 10. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
40. Bảng 9. Theo dõi hàm lượng citral trong mẫu kem M1 Ngày theo Hàm lượng citral Tỷ lệ so với hàm dõi trong mẫu (%) lượng ban đầu (%) 1 6,0890 100 13 6,1514 101,02 30 6,0016 98,56 43 5,7978 95,22 55 5,6403 92,63 76 5,5785 91,62 93 5,5498 91,14 104 5,4285 89,15 136 5,2225 85,77 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
41. Bảng 10. Theo dõi hàm lượng citral trong mẫu kem M2 Ngày theo Hàm lượng citral Tỷ lệ so với hàm dõi trong mẫu (%) lượng ban đầu (%) 0 6,0497 100 12 5,9719 98,71 33 5,9495 98,34 50 5,8206 96,21 61 5,7826 95,58 93 5,7112 94,40 Hàm lượng citral ở cả hai mẫu kem đều giảm dần theo thời gian. Do citral rất dễ bay hơi dẫn đến thay đổi hàm lượng như trên. Ở mẫu M1 hàm lượng citral giảm nhanh, so sánh với mẫu M2 tuy cũng có sự giảm về hàm lượng citral nhưng tốc độ giảm chậm hơn. Sau 3 tháng, hàm lượng citral trong mẫu M1 là 5,5498% tương đương 91,14 % hàm lượng ban đầu trong khi đó hàm lượng citral trong mẫu M2 là 5,7112% tương đương 94,4% hàm lượng ban đầu. Do hạn chế về mặt thời gian nên việc theo dõi độ ổn định trên mẫu kem M2 mới đạt tới ngày 93 (3 tháng). Như vậy việc sử dụng β-CD vào công thức bào chế mẫu kem M2 đã giúp gia tăng độ ổn định của sản phẩm, thể hiện ở hình thức, cảm quan của sản phẩm và hàm lượng citral ổn định hơn so với mẫu M1 (không chứa β-CD). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
42. 3.4 Đánh giá hiệu quả chống côn trùng của sản phẩm Tiến hành thử nghiệm ngay khi bào chế và sau khi bào chế 3 tháng theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3 kết quả được chụp lại (hình 13) và số liệu được trình bày trong bảng 11. Bảng 11. Số lượng kiến tập trung trên vùng giấy lọc được bôi các mẫu kem theo thời gian Số lượng kiến tập trung (cá thể) Thời gian Ngay sau khi bào chế Sau khi bào chế 3 tháng (phút) M1 MT1 M2 MT2 M1 MT1 M2 MT2 15 0 25 0 25 0 25 0 25 30 0 25 0 25 0 25 0 25 45 0 25 0 25 0 25 0 25 60 0 25 0 25 0 25 0 25 75 0 25 0 25 0 25 0 25 90 0 25 0 25 0 25 0 25 105 0 25 0 25 0 25 0 25 120 0 25 0 25 0 25 0 25 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
43. Hình 13. Số lượng kiến trên vùng bôi mẫu trắng (nửa bên trái) và vùng bôi sản phẩm (nửa bên phải): mẫu M1 ngay sau khi bào chế (A) và sau 3 tháng (B), mẫu M2 ngay sau khi bào chế (C) và sau 3 tháng (D). Toàn bộ kiến tập trung trên vùng giấy lọc bôi mẫu trắng, không có cá thể nào di chuyển đến vùng bôi kem chứa tinh dầu sả chanh. Kết quả này chứng minh được hiệu quả xua đuổi loài kiến của cả hai mẫu kem M1 và M2 là như nhau với tỷ lệ 100%, sự có mặt của β-CD không ảnh hưởng tới hiệu quả chống côn trùng của kem. Hiệu quả của kem sau thời gian bảo quản hơn 3 tháng ở cả hai mẫu kem là không đổi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
44. Chương 4: BÀN LUẬN Kem được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa trực tiếp. Tỷ lệ các thành phần trong công thức đóng vai trò quyết định chất lượng của kem. Tỷ lệ KOH ảnh hưởng đến giá trị pH của kem. Tỷ lệ các tá dược pha dầu, các tá dược pha nước ảnh hưởng đến thể chất của kem. Việc đưa β-CD vào công thức đã làm tăng độ ổn định cho sản phẩm. Nhờ vào cấu trúc đặc biệt, β-CD tạo phức với citral bằng cách “bắt giữ” các phân tử citral vào bên trong cấu trúc không gian hình nón cụt, khiến cho các phân tử này không bị bay hơi. Quá trình tạo phức diễn ra trong dung môi là nước, các phân tử nước “năng lượng cao” được giải phóng khỏi “lỗ hổng” của β-CD và thay thế bởi các phân tử kém phân cực hơn, trong trường hợp của nghiên cứu này là các phân tử citral. Liên kết giữa các phân tử citral với β-CD là liên kết hydrogen, tương tác Vander waals và tương tác lưỡng cực. Tuy lượng β-CD được sử dụng trong công thức bào chế không đảm bảo hiệu suất tạo phức với citral 100%, nhưng từ những kết quả theo dõi hàm lượng citral trong mẫu đã chứng tỏ được ý nghĩa của β-CD khi được thêm vào công thức bào chế. Lượng β-CD thêm vào đã hạn chế được đáng kể lượng citral bị bay hơi trong quá trình bảo quản 3 tháng. β-CD là một chất rắn, khi thêm vào hỗn hợp làm thay đổi thể chất của kem. Do đó cần điều chỉnh tỷ lệ các thành phần tá dược trong công thức bào chế cho phù hợp với thể chất của kem. Qua quá trình thực nghiệm, hiệu quả chống côn trùng giữa sản phẩm không chứa β-CD và sản phẩm có chứa β-CD là như nhau. Như vậy, chưa thấy sự ảnh hưởng đến tác dụng của sản phẩm khi thêm β-CD vào thành phần công thức bào chế. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
45. KẾT LUẬN Như vậy từ nghiên cứu “Bào chế kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh” chúng tôi đã thu được các kết quả sau: - Bào chế được kem chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh, sử dụng β-CD để cải thiện công thức bào chế, nâng cao độ ổn định sản phẩm. - Sơ bộ đánh giá được độ ổn định của sản phẩm trong thời gian 3 tháng. - Bước đầu chứng minh được hiệu quả chống côn trùng của sản phẩm trên loài kiến Camponotus consobrinus. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
46. ĐỀ XUẤT Từ các kết quả đạt được, nghiên cứu sẽ được tiếp tục phát triển các hướng sau: - Theo dõi độ ổn định của sản phẩm trong thời gian dài hơn. - Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm. - Nâng quy mô bào chế. - Đánh giá tác dụng của sản phẩm trên một số loài côn trùng khác như muỗi, rệp, để khẳng định hiệu quả của sản phẩm. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: [1] GS.TS Nguyễn Viết Tùng (2006), Giáo Trình Côn Trùng Học Đại cương, NXB Giáo Dục, pp.6-9. [16] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, pp.68-84. [24] Trường Đại Học Dược Hà Nội – Bộ Môn Bào Chế (2004), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc (tập 2), NXB Y học, pp.40-88. [28] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184. [29] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật,pp.10-59. [30] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học. Tiếng Anh: [3] H. O.Lawal*, G.O.Adewuyi, A. B. Fawehinmi, A.O. Adeogun, S. O. Etatuvie (2012), Bioassay of Herbal Mosquito Repellent Formulated from the Essential Oil of Plants, Journal of Natural Products, 5, pp.109-115. [4] U.S. Environmental Protection Agency (2005), New Pesticide Fact Sheet: Picaridin. [5] Larry Goodyer, Steven Schofield (2018), Mosquito Repellents for the Traveller: Does Picaridin Provide Longer Protection than DEET?, Journal of Travel Medicine, 25, pp.10-15. [6] U.S. Environmental Protection Agency (2000), 3-[N-Butyl-N-acetyl]- aminopropionic acid, ethyl ester (IR3535) (113509) Fact Sheet. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 39
48. [7] Adeniran O.I.*, Fabiyi E. et al (2012), A cream formulation of an effective mosquito repellent: a topical product from lemongrass oil (Cymbopogon citratus), Stapf Journal of Natural Product and Plant Resource, 2 (2), pp.322- 327. [8] Dalziel, J. M. (1937), Flora of West Tropical Africa, Crown Agents, London, pp.454-455. [9] Antonieta Rojas de Arias , Guillermo Schmeda‐Hirschmann, Adalberto Falcao (1992), Feeding deterrency and insecticidal effects of plant extracts on Lutzomyia longipalpis, Phytotherapy Research, 6 (2), pp.64-67. [10] Shigeharu Inouye, Toshio Takizawa, Hideyo Yamaguchi (2001), Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 47 (5), pp.565-573. [11] Teuscher E. (2006), Medicinal Spices-A Handbook of Culinary Herbs, Spices, Spice Mixtures and Their Essential Oils, Stuttgart, Germany, Medpharm Scientific Publishers. [13] Onawunmi, G.O. (1989), Evaluation of the antimicrobial activity of citral, Lettes in Applied Microbiology, 9 (3), pp.105-108. [15] O'Neil, M.J. (2006), The Merck Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, Whitehouse Station, NJ: Merck and Co.,Inc., pp.389. [17] Roopa Gaonkar, S. Yallappa, B.L. Dhananjaya và Gurumurthy Hegde (2016), Development and validation of Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography for citral analysis from essential oils, Journal of Chromatography B, 1036 – 1037, pp.50-56. [18] Diogo Mirona, Fernanda Battistia , Carla Schwengber Ten Catenb , Paulo Mayorgaa and Elfrides Eva Scherman Schapoval (2012), Spectrophotometric Simultaneous Determination of Citral Isomers in Cyclodextrin Complexes @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 40
49. with Partial Least Squares Supported Approach, Current Pharmaceutical Analysis, 8, pp.401-408. [19] Thomas Wimmer (2012), "Cyclodextrins". Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH puplisher. [20] Erem Bilensoy (2011), Cyclodextrins in Pharmaceutics, Cosmetics and Biomedicine, John Wiley & Sons, Inc. [22] T.Loftson, M.E Brewster, M. Masson (2004), Role of cyclodextrins in Improving oral drug delivery, Am J Drug Deliv, 2(4), pp.261-275. [23] R. Arun et al (2008), Cyclodextrins as drug carrier molecule: a review, Sci Pham, 76, pp.567-598. [25] Ms. Shubhangi Sharad Bhide*, Ms. Babita Himmatrao More, Ms. Suvarna Prabhakar Gajare, Mr. Sachin Vinayak Tembhurne Bhide et al (2014), Development of mosquito repellent formulations and evaluation for its activity, World Journal of Pharmaceutical Research, 3(2), pp.2910-2917. [26] Ravindra RP, Muslim PK (2013), Comparison of physical characteristics of vanishing Cream base, cow ghee and shata-dhauta- ghrita as per pharmacopoeial standards, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 4(4), pp.14-21. [27] Mohamad Adib Bin Edris, Awang Soh Yusuff Mamat, Muhammad Shahzad Aslam*, Muhammad Syarhabil Ahmad (2016), Insect Repellent Properties of Melaleuca alternifolia, Recent Advances in Biology and Medicine, 2, pp.57-61. [31] ICH (2010), International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use. Trang web: [2] [12] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 41
50. [14] bin/sis/search2/r?dbs+hsdb:@term+@rn+@rel+5392-40-5 [21] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 42