Báo cáo Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

Nội dung text: Báo cáo Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

1. Bộ khoa học và công nghệ bộ y tế Ch−ơng trình khoa học và công nghệ phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Báo cáo tóm tắt Dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà n−ớc Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp M∙ số KC.10-DA06 5971 10/8/2006 Hà Nội-2004
2. Dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà n−ớc KC.10-DA.06 ___ Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp Cố vấn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Thu Vân Chủ nhiệm dự án: TS.Ngô Thùy Anh Các cán bộ tham gia: KS. Trịnh Tuấn Việt Cn. Vũ Vân Quỳnh Cn. Vũ Hồng Nga Cn. Đinh Minh Tuấn Cn. Quách Minh Tuân Ts. Đỗ Thủy Ngân Ts. Vũ Hồng C−ơng Các cơ quan tham gia: - Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng - Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắcxin và các chế phẩm sinh học - Trung tâm y tế dự phòng - Thanh Hóa mục lục
3. Đặt vấn đề 1 CHƯƠNG I: Vật liệu và ph−ơng pháp 2 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. 2 2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam . 3 2.1. An toàn chung 3 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3 2.3. Xác định hàm l−ợng HBsAg 3 2.4. Kiểm tra chất gây sốt 4 2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4 2.6. Kiểm tra hàm l−ợng Merthiolat 4 2.7. Kiểm tra hàm l−ợng Formaldehyt 4 2.8. Kiểm tra hàm l−ợng protein toàn phần 4 2.9. Kiểm tra công hiệu 4 2.10. Thử nghiệm nhận dạng 5 3. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng . 5 3.1. Đối t−ợng nghiên cứu 5 3.2. Vật liệu nghiên cứu 5 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 5 CHƯƠNG II : Kết quả và bàn luận 7 1. Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 7 1.1. Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 7 1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 7 1.3. Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 7 1.4. Kiểm tra vỡ tế bào 8
4. 1.5. Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 8 1.6. Pha chế vắcxin và đóng ống . 12 2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam . 12 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 12 2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học . 13 3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 14 3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn 14 3.2. Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2 15 Ch−ơng III. Kết luận 18 Tài liệu tham khảo 21
5. mục lục Đặt vấn đề . 1 Ch−ơng I: Tổng quan 3 1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B 3 1.1. Thông tin đại c−ơng về virút viêm gan B 3 1.2. Lịch sử virút viêm gan B 3 1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút B 4 1.4. Bệnh lý học 12 1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B 12 1.6. Chẩn đoán viêm gan B 13 1.7. Các thể lâm sàng 14 1.8. Điều trị 15 1.9. Dự phòng 16 1.10. Chiến l−ợc loại trừ lây truyền viêm gan virút B 17 1.11. Phòng nhiễm virút viêm gan B 18 1.12. Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG) 18 2. Các loại vắcxin viêm gan B và những nghiên cứu về vắcxin viêm gan B hiện nay 18 2.1. Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu h−ớng phát triển . 18 2.2. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B 20 2.3. Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B 21 2.4. Các yếu tố ảnh h−ởng đến tính sinh miễn dịch của vắcxin phòng viêm gan B 23 3. Sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN để biểu thị kháng nguyên 26 3.1. Các hệ biểu thị khác nhau 26 3.2. Biểu thị ở nấm men 26
6. 3.3. Biểu thị ở tế bào động vật 27 3.4. Hệ biểu thị ở Pichia pastoris 27 CHƯƠNG II: Vật liệu và ph−ơng pháp 31 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. 31 1.1. Chủng sản xuất 31 1.2. Môi tr−ờng . 31 1.3. Cấy chủng 33 1.4. Nhân chủng . 33 1.5. Biến nạp nội bào . 33 1.6. Gặt tế bào 34 1.7. Tách chiết HBsAg . 34 1.8. Tinh chế HBsAg 34 1.9. Bất hoạt virút . 35 1.10. Pha chế vắcxin . 35 1.11. So sánh qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã đ−ợc hoàn thiện với qui trình sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm 35 2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam . 37 2.1. An toàn chung 37 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 37 2.3. Xác định hàm l−ợng HBsAg 38 2.4. Kiểm tra chất gây sốt 38 2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 38 2.6. Kiểm tra hàm l−ợng Merthiolat 39 2.7. Kiểm tra hàm l−ợng Formaldehyt 39 2.8. Kiểm tra hàm l−ợng protein toàn phần 40 2.9. Kiểm tra công hiệu 40
7. 2.10. Thử nghiệm nhận dạng 40 3. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng . 40 3.1. Đối t−ợng nghiên cứu 40 3.2. Vật liệu nghiên cứu 41 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 41 CHƯƠNG III: KếT QUả Và bàn luận 46 1. Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 46 1.1. Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 46 1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 46 1.3. Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 48 1.4. Kiểm tra vỡ tế bào 50 1.5. Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 50 1.6. Pha chế vắcxin và đóng ống . 58 2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam . 59 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 59 2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học . 64 3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 68 3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn 68 3.2. Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2 74 Ch−ơng IV. Kết luận 78 Tài liệu tham khảo 81
8. các chữ viết tắt aa Amino acid (axít amin) ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axít ribonucleic) AH Aluminium hydroxide (nhôm hydroxit) Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen (kháng thể kháng kháng nguyên lõi virút viêm gan B) Anti-HBe Antibody against Hepatitis B e antigen (kháng thể kháng kháng nguyên e virút viêm gan B) Anti-HBs Antibody against Hepatitis B surface antigen (kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B) Au Australia antigen (kháng nguyên Australia) CHO Chinese hamster ovary (tế bào trứng chuột đất vàng) CTTCMR Ch−ơng Trình Tiêm Chủng Mở Rộng CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ) D Dalton DR Double repeat (lặp lại kép) ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch
9. ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) FDA Food and Drug Administration (cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm) GMP Good manufacturing practice (thực hành sản xuất tốt) GMT Geometric mean titer (hiệu giá trung bình nhân) GP Glycoprotein (glycoprotein) HBV Hepatitis B virus (virút viêm gan B) HBcAg Hepatitis B core antigen (kháng nguyên lõi virút viêm gan B) HBeAg Hepatitis B e antigen (kháng nguyên e virút viêm gan B) HBsAg Hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B) HBx Hepatitis B x antigen (kháng nguyên x virút viêm gan B) HBIg Hepatitis B immunoglobulin (globulin miễn dịch phòng viêm gan B) HLKN Hàm l−ợng kháng nguyên HT Huyết thanh HT1 (n) Huyết thanh lấy lần thứ nhất (hoặc lần thứ n) HLA kháng nguyên bạch cầu ng−ời IU International unit (đơn vị quốc tế)
10. IFNβ interferon-β IFNγ interferon-γ IFNα interferon-α kb kilobase (kilôbazơ) kD kilodalton (kilôdalton) KN Kháng nguyên KT Kháng thể LD50 Lethal dose 50% (liều gây chết 50%) LHBs Large hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại lớn) LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle MHBs Medium hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại trung bình) MLD Minimal lethal dose (liều gây chết tối thiểu) MSV Master seed virus (Chủng gốc giống) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( Kích cỡ giới hạn trọng l−ợng phân tử ) OD Optical density (mật độ quang) ORF Open reading frame (khung đọc mở) P Protein PCR Polymerase chain reaction
11. (phản ứng chuỗi polymeraza) ptl Phân tử l−ợng SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamid) SD Standard deviation (độ lệch chuẩn) SHBs Small hepatitis B surface antigen (kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại nhỏ) TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 vđ vừa đủ v/p vòng/phút VSDTTƯ Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương WSV Working seed virus ( Chủng sản xuất)
12. đặt vấn đề Việt Nam là một trong những n−ớc có tỷ lệ ng−ời mang HBsAg cao trong cộng đồng, theo các báo cáo của các tác giả khác nhau có thể giao động từ 11%- 26%. HBV vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong các căn nguyên gây viêm gan ở các bệnh nhân bị viêm gan, trên 40% có căn nguyên gây bệnh là HBV. HBV cũng chịu trách nhiệm tới 90% các tr−ờng hợp ung th− gan nguyên phát, trong khi ở các n−ớc đã tiến hành tiêm phòng vắcxin viêm gan B cho cộng đồng từ những năm đầu thập niên 80 thì căn nguyên chủ yếu gây ung th− gan nguyên phát hiện nay lại là virút viêm gan C, khi tỷ lệ ng−ời mang HBsAg đã giảm xuống d−ới 1% do kết quả tiêm phòng viêm gan B. Tỷ lệ ng−ời mang ở phụ nữ có thai là khoảng 12%, trong đó nếu mẹ chỉ bị HBsAg d−ơng tính không thôi thì khả năng truyền sang cho con trong thời kỳ chu sinh là khoảng 40%, và nếu mẹ mang cả HBsAg và HBeAg d−ơng tính thì khả năng truyền cho con sẽ là khoảng > 90%. Ng−ời mang HBV mạn tính có nguy cơ cao bị bệnh gan trầm trọng khi tr−ởng thành, bao gồm ung th− gan và xơ gan. Tử vong và bệnh gây ra bởi bệnh gan mạn tính là rất phổ biến. Cũng rất khó có thể nói đ−ợc bệnh nào là do HBV gây ra vì tình trạng bệnh th−ờng không đ−ợc báo cáo đầy đủ. Tuy nhiên rõ ràng là nhiễm HBV là một vấn đề y tế cộng đồng quan trọng và có thể dự phòng đ−ợc. Năm 1991, nhóm Cố vấn toàn cầu của Ch−ơng trình tiêm chủng mở rộng đã kêu gọi tất cả các n−ớc đ−a thêm vắcxin viêm gan B vào Ch−ơng trình tiêm chủng quốc gia. ở Việt Nam, chính phủ đã cho phép đ−a vắcxin viêm gan B vào Ch−ơng trình tiêm chủng mở rộng để tiêm cho trẻ em d−ới 1 tuổi từ tháng 8 năm 1997. Bên cạnh vắcxin viêm gan B sản xuất từ huyết t−ơng ng−ời mang HBsAg cao, việc ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực công nghệ sinh học để có đ−ợc một vắcxin viêm gan B tái tổ hợp ADN là hết sức cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng vắcxin ngày càng lớn trong nhân dân. Dựa trên kết quả đáng khích lệ của đề tài KHCN-11-10A (1999) và KHCN-11-10B (2002): “Nghiên cứu tiếp thu chuyển nh−ợng kỹ thuật để xây dựng qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A và vắcxin viêm gan B tái tổ hợp ADN”, vắcxin viêm gan B tái tổ hợp (RecomBvax) do Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng sản xuất có khả năng phục vụ rộng rãi cho nhu cầu phòng bệnh. Việc bổ sung trang thiết bị để mở rộng sản xuất, hoàn thiện qui trình, đào tạo cán bộ KHCN nắm vững kiến thức và kỹ thuật để ứng dụng đ−ợc công nghệ sản xuất vắcxin là hết sức cần thiết. Do đó, dự án “Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp” có mục tiêu nh− sau: - Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. 1
13. - Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam. - Chuẩn bị năng lực khoa học công nghệ để tiếp thu dự án vay vốn của Hàn Quốc với công suất 20 triệu liều/năm. Nội dung chính của dự án là : - Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. - Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam. - Đánh giá tính an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa ở giai đoạn 3, với cỡ mẫu n=300. - Đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học, công nhân kỹ thuật lành nghề nắm vững kiến thức và kỹ thuật để có thể tiếp nhận đ−ợc công nghệ và sử dụng trang thiết bị trong dự án vay vốn của Hàn Quốc. 2
14. Ch−ơng I Tổng quan 1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B 1.1. Thông tin đại c−ơng về virút viêm gan B Genôm : ADN sợi kép một phần. Họ : Hepadna. Thời kỳ ủ bệnh : 30-180 ngày. Đ−ờng lây truyền : Máu và dịch tiết. Tấn công cấp tính : Nhẹ hoặc dữ dội. Chẩn đoán huyết thanh : Anti-HBc, anti-HBs hoặc HBsAg. Điều trị : Triệu chứng. 1.2. Lịch sử virút viêm gan B Danh từ viêm gan virút đ−ợc hiểu là một nhiễm trùng gan do một trong những virút viêm gan khác nhau gây ra. Danh từ viêm gan B đ−ợc MacCallum giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1947 nhằm phân biệt nhiễm viêm gan (gây thành dịch) và viêm gan huyết thanh. Những danh từ này sau đó đã đ−ợc ủy ban Viêm gan virút của TCYTTG sử dụng. Tr−ớc khi phát hiện ra virút, sự lây truyền viêm gan đ−ợc phân biệt dựa vào quan sát theo dõi dịch tễ học. Kiểu viêm gan B đ−ợc coi nh− là lây truyền qua đ−ờng máu. Vào năm 1963, khi nghiên cứu tính đa dạng các protein huyết thanh, Blumberg đã khám phá ra một protein ch−a từng đ−ợc biết tr−ớc đây trong máu của một thổ dân Australia. Ông gọi protein này là kháng nguyên Australia (Au). Sau này ng−ời ta thấy kháng nguyên này có liên quan đến kiểu viêm gan B. Đến năm 1968, các nhà nghiên cứu khác là Prince, Okochi và Murakami đã xác định đ−ợc kháng nguyên Au (ngày nay ng−ời ta gọi là kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B hoặc HBsAg) và đ−ợc tìm thấy một cách đặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm viêm gan kiểu B. Vào năm 1973, Dane phát hiện ra các hạt kiểu virút trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm viêm gan B. Những hạt này đ−ợc gọi là virút viêm gan B (HBV). Những virút không có liên quan khác cũng đã đ−ợc khám phá ra sau đó, song virút viêm gan B vẫn giữ tên của nó. Bản chất virút của các hạt này cũng đã đ−ợc khẳng định, Kaplan et al. đã xác định đ−ợc ADN polymeraza nội gen phụ thuộc ADN cùng với lõi của nó. Việc khám phá ra polymeraza này cho phép Robinson et al. xác định và đặc tính hoá đ−ợc genôm của HBV. 3
15. Những nghiên cứu trên toàn cầu về chu trình nhân lên của HBV với quan tâm hàng đầu là sự kết dính và xâm nhập của virút vào tế bào chủ. Những nghiên cứu lâm sàng cũng đang đ−ợc tiến hành nhằm tìm ra đ−ợc các ph−ơng pháp điều trị bệnh viêm gan B cấp tính hoặc mạn tính. Các phòng thí nghiệm khác cũng đang nghiên cứu tìm kiếm cơ chế gây ung th− của HBV. 1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút viêm gan B 1.3.1. Genôm của virút viêm gan B Genôm của virút viêm gan B đ−ợc trình bày ở hình 1. Kích th−ớc genôm giao động giữa các phân týp khác nhau của HBV, song tất cả đều có độ dài khoảng 3,2 Kb. ở viriôn của HBV ng−ời ta tìm thấy genôm ở dạng sợi kép không hoàn chỉnh. Điều này có lẽ do tính chất riêng trong chu trình sống của HBV. HBV sử dụng Transcriptaza phiên mã ng−ợc để phiên mã toàn bộ độ dài ARN sợi d−ơng trong genôm của nó ng−ợc trở lại thành ADN. Transcriptaza ng−ợc này cũng có hoạt tính ADN polymeraza và nhờ đó bắt đầu một quá trình sao chép một ADN- sợi âm mới đ−ợc tổng hợp. Tuy nhiên protein lõi capsid hoá Transcriptaza phiên mã ng−ợc/polymeraza tr−ớc khi hoàn thành quá trình sao chép. Khi nào và ở đâu ADN sợi kép một phần này của genôm đ−ợc sửa chữa thành ADN khép kín đồng hoá trị vẫn còn ch−a đ−ợc biết. 1.3.2. Quá trình sao chép genôm của HBV Sự sao chép genôm HBV xảy ra bên trong nhân một tế bào bị nhiễm. ARN polymeraza II phiên mã ADN sợi tròn của HBV thành một sợi ARNm lớn hơn độ dài đầy đủ. Một khi đã đ−ợc sao chép, ARN genôm có mặt trong nhân và xâm nhập vào bào t−ơng, ở đó đ−ợc phiên dịch để tái sinh polymeraza, protein lõi và e của HBV. Từ trạng thái tự do, tr−ớc hết virút phải kết dính bản thân nó vào màng một tế bào chủ đặc hiệu. Quá trình kết dính của virút là một trong những b−ớc quan trọng để xác định tế bào chủ và tính đặc hiệu tế bào. Tuy nhiên hiện nay cũng ch−a có một giòng tế bào nào để HBV có thể gây nhiễm đ−ợc in vitro. Một vài giòng tế bào nh− HepG2 có thể hỗ trợ quá trình nhân lên của virút chỉ ở mức gây nhiễm ngắn ngủi hoặc sử dụng ổn định HBV.ADN. Sau khi kết dính, quá trình hoà nhập vỏ virút với màng tế bào chủ phải xẩy ra để cho phép protein lõi của virút có chứa genôm và polymeraza xâm nhập vào tế bào. Những nghiên cứu tr−ớc đây cho thấy quá trình axít hoá là cho phép đối với sự xâm nhập của virút, song các kết quả nghiên cứu hiện nay lại ng−ợc lại. Cũng không đáng ngạc nhiên khi những giai đoạn đầu tiên của quá trình nhiễm trùng vẫn còn nhiều tranh luận. 4
16. Viriôn gây nhiễm, gọi một cách khác là hạt Dane có đ−ờng kính khoảng 42nm. Nh− sơ đồ trên, có chứa tất cả các protein bề mặt của HBV cũng nh− protein lõi, genôm và polymeraza của HBV. 1.3.4. Những hạt virút viêm gan B khác Có hai loại hạt khác đã đ−ợc tìm thấy trong huyết thanh của ng−ời bị nhiễm HBV và đ−ợc gọi là hạt viêm gan B hình cầu và hạt viêm gan B hình ống. Cả hai loại hạt này đều không có chứa bất kỳ một thông tin di truyền nào chứng tỏ chúng gây nhiễm. Cả hai loại hạt đều có đ−ờng kính 22 nm, tuy nhiên hạt viêm gan B hình ống có độ dài thay đổi. Mỗi loại hạt đ−ợc cấu thành độc nhất từ các protein bề mặt của virút viêm gan B. Hạt hình cầu tiết ra đ−ợc cấu tạo chủ yếu từ protein bề mặt có kích th−ớc nhỏ và trung bình trong khi hạt hình ống tiết ra có chứa cả protein bề mặt virút viêm gan B trọng l−ợng phân tử lớn. Có thể tìm thấy những hạt này với hiệu giá cao trong máu những ng−ời mang HBV. Các hạt không gây nhiễm này có hiệu giá cao cho thấy virút phải đ−ợc hình thành để sử dụng chúng theo một kiểu nào đấy. Cũng có giả thiết cho rằng các hạt không gây nhiễm có hàm l−ợng cao trong huyết thanh cho phép các hạt virút gây nhiễm chạy ngang qua máu không xác định đ−ợc bằng hệ miễn dịch. Tuy nhiên theo mô hình mẫu virút viêm gan B ở vịt hình nh− có sự tăng nhanh nhiễm trùng khi virút đ−ợc trộn ở tỷ lệ nào đó với các hạt không gây nhiễm. Sự bám dính các hạt không gây nhiễm vào tế bào có thể để hoạt hóa tế bào, chuẩn bị sẵn sàng cho virút gây nhiễm. Điều này cũng có thể đúng cho virút viêm gan B ở ng−ời, song vẫn ch−a đ−ợc kết luận. 1.3.5. Protein lõi virút viêm gan B (HBc) Protein lõi virút viêm gan B (HBc) đ−ợc cấu tạo phần lớn từ axít amin −a n−ớc và tích điện. Protein này không bao giờ đ−ợc glycosyl hoá, cũng nh− không có liên kết lipit nào. Tuy nhiên trong các tế bào eukayriot có lẽ protein này đ−ợc phosphoryl hoá. Protein này đ−ợc tổng hợp trong bào t−ơng và có thể lắp ghép với nhau thành hạt lõi có chứa genôm của virút. Biểu thị protein HBc ở vi khuẩn cho thấy ARN lắp ráp theo một kiểu không đặc hiệu. Khả năng lắp ráp hạt c− trú trong vòng 149 axít amin đầu. Bốn cụm Arginin trong vòng 36-38 axít amin cuối có lẽ tham gia vào quá trình lắp ghép các axít nucleic. Quá trình phosphoryl hoá xẩy ra hoặc ở Serin thứ 170 hoặc 172. Các axít amin này khu trú giữa cụm Arginin 3 và 4. Vì thế quá trình phosphoryl hoá các điểm Serin có thể ức chế quá trình gắn các axít amin. Những nghiên cứu sử dụng hệ lai kép cùng với kỹ thuật quét peptit đã xác định đ−ợc các axít amin t−ơng tác mạnh (aa 78 và 117) có thể tạo thành một phần bề mặt tiếp giáp dimer. Ng−ợc lại, các vị trí 113 và 143 có lẽ tham gia vào quá trình multimer hoá các dimer. Đột biến ở hai vị trí này có lẽ đã tác động đến tính ổn định của capsit. 7
17. 1.3.6. Protein e virút viêm gan B (HBe) Virút hepadna biểu thị dạng tiết của protein HBc. Điều này đạt đ−ợc nhờ quá trình phiên dịch trình tự đầu 5’ vào ORF của HBc đ−ợc gọi là trình tự tiền-C. Trình tự tiền-C có chứa vị trí xuyên màng kỵ n−ớc/tín hiệu tiết xuất dẫn đến di chuyển protein HBe vào trong lòng ống mô l−ới nội bào (ER). Trong ER, vị trí 19 trong 29 vị trí vùng tiền -C đ−ợc cắt ra nhờ một tín hiệu peptidaza trong khi 10 vị trí còn lại ngăn ngừa việc lắp ráp HBe vào hạt lõi. Một vùng khác sau này đ−ợc cắt ra bằng một proteaza Golgi ở vùng giàu Arginin. Sản xuất các thể tiết xuất này của HBc có thể bằng cách nào đấy đã đàn áp sự đào thải miễn dịch của tế bào sản xuất - HBV. HBe ở hàm l−ợng cao đ−ợc tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm HBV huyết cao với ít triệu chứng. Đồng thời, cáo đuôi chồn sẽ không phải chịu đựng nhiễm dai dẳng virút viêm gan B, nếu sử dụng ph−ơng án HBe-âm của virút. 1.3.7. Hạt lõi Hạt virion tinh khiết có chứa protein HBc tạo ra các hạt lõi bao bọc genôm và polymeraza của virút. ở virion tr−ởng thành, hạt lõi này đ−ợc tạo vỏ bọc bằng nhiều kháng nguyên bề mặt khác nhau của HBV. Hơn nữa có thể một protein- kinaza cũng đ−ợc bao vào trong hạt lõi. Có lẽ một nồng độ HBc nhất định là cần thiết cho quá trình lắp ráp hạt. Các dimer của protein HBc bắt đầu đ−ợc hình thành, lắp ráp ở nồng độ 0,8 àM thành các hạt đẳng điện đối xứng không gian ba chiều (180 tiểu đơn vị HBc tạo thành một hạt lõi). Các hạt lõi đã lắp ghép sau đó đ−ợc làm ổn định nhờ các cầu nối disulphid. Hiện nay, ng−ời ta thấy một cách rõ ràng hơn là vùng tiền -S1 và S của protein vỏ bọc sẽ t−ơng tác với hạt lõi. Điều này cũng không có gì đáng ngạc nhiên vì hạt lõi phải đ−ợc lắp ghép một cách đặc hiệu bởi màng giàu protein bề mặt của HBV để có thể sản sinh ra đ−ợc các viriôn tr−ởng thành. 1.3.8. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B Sơ đồ sau đây là các kiểu khác nhau của kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B. Trong genôm của HBV, vùng mã hoá kháng nguyên bề mặt HBV gồm ba khung bắt đầu từ các vị trí có chung một codon kết thúc. Bởi vậy, các protein bề mặt khác nhau của HBV đều có liên quan đến nhau bởi một vùng chung nhau nh− đã biết là vùng S. 1.3.8.1. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (HBsAg hay là SHBsAg) Protein này là loại protein nhỏ nhất trong số các protein bề mặt virút viêm gan B và có chứa độc nhất vùng-S. Trong lịch sử nó cũng đ−ợc gọi là kháng nguyên Australia (kháng nguyên Au). Là kháng nguyên kỵ n−ớc chứa 4 vùng xuyên màng có trật tự. HBsAg chứa một l−ợng lớn Cystein, tổng số là 14 và từng Cystein có liên kết chéo với một Cystein khác. HBsAg cũng có thể đ−ợc glycosyl hoá ở Asp 146. Hai dạng protein này th−ờng nhìn thấy đ−ợc trên gel chạy điện di 8
18. với hạt HBsAg tinh khiết từ huyết t−ơng ng−ời mang. Protein này là đoạn khởi đầu lập thành tất cả các dạng hạt của HBV, vì vậy protein này đ−ợc sản xuất với một l−ợng lớn ở virút. Nó cũng chứa epitop có tính kháng nguyên cao. Phân tích epitop này cho phép xác định đ−ợc phân týp của ng−ời mang HBV. Vi tính hoá mô hình cho thấy liên quan đến các đ−ờng xoắn ốc 3 và 4 là vùng xuyên màng ngăn nắp đ−ợc gài vào màng ER sau giai đoạn phiên dịch. Hai vòng xoắn này đ−ợc xem nh− là vị trí thực hiện quá trình multimer hoá. Điều này đ−ợc củng cố thêm nhờ quan sát HBsAg bị xén bớt vùng xoắn ốc này sẽ không có khả năng tạo thành các hạt và sẽ ở lại màng ER. Tế bào bị nhiễm ở giai đoạn sớm sản sinh ra một l−ợng lớn nhất protein. Hiệu giá hạt HBsAg không gây nhiễm tìm thấy trong huyết thanh ng−ời mang có thể cao tới 200àg/ml. Biểu thị HBsAg có thể cũng đ−ợc cảm ứng nhờ một chấn động trong lòng ống l−ới nội bào, điển hình là khi LHBsAg có ở l−ợng lớn. Mặc dù những hạt này có tính kháng nguyên và tỷ lệ mắc cao, song hệ miễn dịch hình nh− về cơ bản đã quên lãng sự có mặt của chúng. Nghiên cứu các yếu tố hoà tan điều chế từ tế bào lyphô T khi có nhiễm HBV cho thấy HBsAg có nguồn gốc từ tế bào T có lẽ đã ngăn chặn sự sản sinh ra kháng thể kháng HBsAg trong các tế bào T khác. Sự ngăn chặn này là đặc hiệu đối với HBsAg. Sự kiềm chế miễn dịch của các kháng thể kháng các thành phần khác nhau của HBV th−ờng dai dẳng ở ng−ời có tình trạng mang HBsAg mạn tính. Gen khởi động S nằm trong vùng tiền-S. Đột biến ở vùng này sẽ dẫn đến HBsAg đ−ợc sản sinh ra với mức thấp. Sản xuất HBsAg giảm đi có lẽ làm cho virút ứ đọng trong nội bào cũng nh− mất khả năng lắp ráp các hạt virút. Các phân týp của SHBsAg đã đ−ợc xác định nguồn gốc bằng sự nhận biết kháng thể. Vùng kháng nguyên có mặt ở tất cả các phân lập HBs đã biết đ−ợc gọi là quyết định kháng nguyên a. Bốn phân týp chủ yếu khác nhau là d hoặc y và w hoặc r. Hai bộ này đ−ợc cặp đôi theo kiểu thành viên của mỗi cặp sẽ loại trừ lẫn nhau. Quyết định d có Lysin ở vi trí 122, trong khi y có Arginin. T−ơng tự, quyết định w có Lysin ở vị trí 160 trong khi r có Arginin. Hiện nay ng−ời ta cũng đã tìm thấy các quyết định khác có chứa các epitop kháng nguyên không đ−ợc nhận biết bởi các kháng thể kháng lại các phân týp đã đ−ợc biết tr−ớc đây. Với cách nhận định nh− vậy, một số kháng thể đặc hiệu phân týp đặt vấn đề : liệu vắcxin sử dụng hạt HBs có gây đ−ợc đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở ng−ời với tất cả các chủng HBV không ? Câu trả lời là “có”. Tuy nhiên cũng vào những năm này kiểu đột biến “chạy thoát” (escape) đã đ−ợc phát hiện cho chúng ta thấy rằng cần phải có vắcxin hoặc ph−ơng pháp điều trị hiện đại hơn. 1.3.8.2. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại trung bình (MHBsAg) Protein bề mặt virút viêm gan B loại trung gian hoặc kích th−ớc trung bình này có chứa thêm một vùng 55 aa đã đ−ợc biết là tiền -S2. Vùng này −a n−ớc và có lẽ c− trú ở ngoại bào. Vùng tiền-S2 cũng có một vị trí glycosyl hoá bổ xung ở Asp 4. Có thể vị trí này luôn luôn đ−ợc glycosyl hoá, song vị trí glycosyl hoá ở 9
19. vùng S có lúc ở dạng glycosyl hoá hoàn toàn, có lúc ở dạng glycosyl hoá một phần protein này. Một số nghiên cứu cho rằng protein MHBsAg tham gia vào quá trình kết dính và xâm nhập của HBV vào tế bào gan. Tuy nhiên, trong một nghiên cứu phân tích di truyền HBV ở bệnh nhân viêm gan bạo phát, codon khởi đầu tiền-S2 có mang một biến dị đúp ngăn cản biểu thị protein t−ơng ứng. Nh− vậy, có lẽ tiền-S2 không cần thiết cho tính gây nhiễm của HBV cũng nh− hình thái của hạt virút. Điều này có thể loại trừ HBsAg trung bình là protein kết dính của HBV, mặc dù nó có thể chia sẻ với quá trình kết dính virút theo kiểu cơ chế thứ phát. 1.3.8.3. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại lớn (LHBsAg) Đây là protein lớn nhất trong số protein bề mặt của HBV có chứa vùng tiền- S1, tiền-S2 và S. Trình tự vùng tiền-S1 có thể giao động rất lớn trong số bệnh nhân bị nhiễm cho thấy rằng có thể đây là protein của HBV tham gia vào quá trình kết dính vào tế bào gan. Vùng tiền-S1 không có vị trí glycosyl hoá bổ sung, song có chứa tín hiệu myrin hoá ở đầu cuối -N, buộc đầu cuối -N vào màng tế bào. Có giả thiết về hai kiểu sắp xếp của protein này : Một kiểu tìm thấy trên bề mặt tế bào và trong viriôn tr−ởng thành, kiểu khác tìm thấy trên bề mặt của hệ thống l−ới nội bào (ER). Các kiểu sắp xếp đ−ợc ghi chép dựa trên những nghiên cứu proteaza và kháng thể. ở virút viêm gan B của vịt, LHBsAg có kiểu họa đồ l−ỡng cực. Có lẽ cả hai vùng tiền-S1 và tiền-S2 ở lại trong nội bào khi LHBsAg ở trong ER. Vì vậy, vùng tiền-S2 không đ−ợc glycosyl hoá trong khi vùng tiền-S1 đ−ợc myrin hoá. Khi nào, ở đâu và nh− thế nào vùng tiền-S đ−ợc di chuyển qua màng tế bào vẫn còn là một vấn đề cần tranh luận. Tuy vậy, một mô hình giả thiết cho virút viêm gan B ở vịt cũng đã đ−ợc thiết lập. Mô hình này cho biết vùng tiền-S đ−ợc di chuyển qua một lỗ n−ớc trong vỏ của virút. Lỗ này đ−ợc hình thành nhờ quá trình oligomer hoá các vùng trải rộng xuyên màng trong vùng S. Biểu thị d− thừa LHBsAg không thôi, dẫn đến ứ đọng protein này trong ER. Tuy nhiên, lúc đầu ng−ời ta nghĩ rằng sự ứ đọng trong ER là do một yếu tố bào t−ơng liên kết LHBsAg nh− một protein xuyên màng. Tuy vậy, các chứng minh mới đây cho rằng quá trình hình thành các hạt trong nội bào của LHBsAg xẩy ra trong lòng ống của l−ới nội bào. Sự ứ đọng có lẽ do liên kết LHBsAg với calnexin. Protein này, theo đa số ý kiến, là protein chịu trách nhiệm cho sự kết dính của virút vào tế bào chủ. Tuy nhiên, thụ thể cho HBV vẫn ch−a phân lập đ−ợc. 1.3.9. Polymeraza của virút viêm gan B Protein polymeraza của HBV đ−ợc lắp ráp cùng với ARN tiền genôm trong hạt lõi. Polymeraza trong virion tr−ởng thành có kích th−ớc 90 KD và có lẽ là ARN- hoặc ADN-phụ thuộc (có nghĩa là Transcriptaza phiên mã ng−ợc). Có thể nhìn thấy một băng protein có trọng l−ợng phân tử 70 KD trên điện di trên gel blot với 10
20. kháng huyết thanh tấn công vào tâm hoạt động đã đ−ợc bảo vệ của Transcriptaza phiên mã ng−ợc. Liệu đây có phải là kết quả hoá giáng protein của toàn bộ ORF- P hay là quá trình biểu thị riêng biệt của vùng ADN-polymeraza thì vẫn ch−a có câu trả lời. 1.3.10. Các vùng ORF-P trong HBV Từ kết quả nghiên cứu phân tích đột biến ORF-P, sự đồng nhất trình tự và những nghiên cứu về cơ chế sao chép của genôm virút cho thấy hầu hết các phần của ORF-P là không thể thiếu đ−ợc. Có thể có 4 vùng khác biệt của ORF-P : • Vùng đầu kết thúc amino mã hoá một protein liên kết với đầu 5’ của ADN-sợi âm của virút. Protein này là thiết yếu để khởi đầu cho quá trình tổng hợp sợi âm, vì vậy cũng đ−ợc gọi là “primaza”. • Vùng tiếp theo có lẽ có chức năng không đặc hiệu trừ khi đó có thể là một khoảng trống. • Vùng này mã hoá ARN-polymeraza hoặc ARN-polymeraza phụ thuộc ADN • Vùng cuối cùng có hoạt tính H-ARN-aza hoá giáng ARN nếu nó có mặt trong một thể lai ghép ARN và ADN. Có thể hoạt tính của protein polymeraza phụ thuộc vào ion kim loại và phần có cấu trúc hình cong kiểu elíp. Yêu cầu phải có tín hiệu elíp này để hoạt hoá polymeraza cũng đã đ−ợc chứng minh ở hệ virút viêm gan B của vịt. Ion Magnesium có lẽ là cần thiết cho quá trình sao chép ng−ợc. 1.3.11. Protein X của virút viêm gan B Protein X của HBV đ−ợc gọi nh− vậy vì chức năng đầy đủ của nó vẫn còn là một điều bí mật. Protêin X có 154 axít amin đ−ợc mã hoá bởi ORF-X. Trình tự của nó không thay đổi ở cả hai loại virút viêm gan của sóc và chuột chũi, song virút viêm gan ở vịt không có HBx. Điều này ngụ ý rằng protein HBx không tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép genôm và lắp ráp virion. Trên quan điểm triết lý di truyền học cho thấy gen HBx là một sự bổ sung tức thời từ genôm của tế bào eukariot vào genôm của HBV mà ng−ợc lại là hoàn toàn không thay đổi. Không có một chứng cớ nào chứng tỏ protein HBx là thành phần của virion tr−ởng thành hoặc hạt lõi. Phân tích aa cho thấy protein HBx có nguồn gốc bào t−ơng. Những nghiên cứu về protein HBx cho biết rất khó biểu thị protein này in vitro và rất không ổn định với thời gian bán hủy hoại rất ngắn - 20 phút. Tuy nhiên, nó có thể phosphoryl hoá. Sợi trên của gen này có một vùng đã biết là vùng tăng c−ờng I của HBV, có chứa một số trình tự hoạt hoá phần Cis- cho việc biểu thị gen của HBV có hiệu quả. Có thể một tỷ lệ vùng tăng c−ờng này là trung gian cho quá trình phiên mã gen X của HBV. Protein này có nhiều hoạt tính d− thừa từ Dinucleotit-kinaza đến ức chế proteaza. Phần lớn những luận điểm này cần phải đ−ợc nghiên cứu sâu hơn nữa. Tuy nhiên, cũng có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng HBx protein 11
21. hoạt hoá quá trình phiên mã của nhiều gen. Có thể có một kiểu là qua HBx tăng c−ờng khả năng liên kết ADN và hiệu quả phiên mã qua tác động t−ơng hỗ với vùng dây kéo Leucin (bZcp) của nhiều yếu tố phiên mã. Có lẽ khả năng đáng ghi nhận nhất của protein HBx là hoạt tính gây khối u. Hoạt tính này đã đ−ợc chứng minh ở nuôi cấy tế bào gan chuột và ở chuột truyền gen. Một con đ−ờng có khả năng là qua sự hoạt hoá Src-kinaza. Ng−ời ta cho rằng protein HBx tác động t−ơng hỗ với Ras-Raf-kinaza. Liệu sự kích thích sinh tr−ởng này có xẩy ra ở các khối u hay không vẫn đang đ−ợc xem xét. Một số công trình cho rằng HBx gây cảm ứng ARN polymeraza III-phụ thuộc phiên mã gen qua sự hoạt hoá đ−ờng tín hiệu Ras. Điều này dẫn đến làm tăng mức độ protein liên kết TATA trong tế bào. Protein X cũng có liên quan đến việc điều hoà quá trình phiên mã trung gian Sp1 của Insulin-kiểu yếu tố sinh tr−ởng II (IGF-II). Điều hoà gen IGF-II có thể khởi động sự phân chia tế bào trong quá trình phát triển của tổ chức gen. 1.4. Bệnh lý học Bệnh lý học của cả viêm gan cấp tính và viêm gan virút đều đang đ−ợc tháo gỡ một cách chậm chạp. Hơn nữa phần lớn các số liệu đều cho thấy rằng các thành viên họ Hepadnaviridae về bản chất đều không có tính gây độc cao. Virút đ−ợc lây truyền một cách có hiệu quả nhất qua đ−ờng xuyên da. Truyền nhiễm qua đ−ờng tình dục và chu sinh là ít có hiệu quả hơn, đặc biệt đòi hỏi hiệu giá virút phải cao. HBV có nồng độ đậm đặc nhất trong gan và máu và với số l−ợng ít hơn trong n−ớc bọt và tinh dịch. Hoàn toàn không có gì đáng ngạc nhiên khi virút viêm gan nhân lên đầu tiên ở gan. Tuy nhiên, nhiều vị trí khác nhau ngoài gan cũng đã đ−ợc đề cập đến. Điều này cũng đúng cho hàng loạt những thay đổi huyết học thỉnh thoảng thấy ở bệnh nhân viêm gan cấp tính. Các sản phẩm trung gian và/hoặc phiên bản của virút trong quá trình nhân lên của HBV cũng tìm đ−ợc ở các vị trí ngoài gan. 1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B Viêm gan B đ−ợc lan truyền trong cộng đồng ng−ời trên toàn thế giới. Mặc dù có nhiều báo cáo cho thấy rằng HBsAg có cả ở những động vật bậc cao khác nữa, song ng−ời vẫn là ổ chứa chủ yếu. ở những n−ớc phát triển hơn, tỷ lệ nhiễm HBV đã giảm đi, có lẽ do thay đổi cách sống của nhóm có nguy cơ cao, vắcxin viêm gan B đã sẵn có cùng với việc sàng lọc những ng−ời cho máu. Nguồn HBV đầu tiên là máu. Tuy nhiên, ng−ời ta cũng đã tìm thấy virút trong hàng loạt dịch tiết cơ thể nh− n−ớc bọt, n−ớc mũi, tinh dịch và máu hành kinh. Ng−ời ta không tìm thấy virút trong phân, có lẽ do virút đã bị bất hoạt bởi các enzym có trong niêm mạc ruột hoặc khuẩn trí đ−ờng ruột. Có thể giả thiết một cách chắc chắn rằng virút có mặt trong tất cả các dịch tiết của một bệnh nhân bị nhiễm. Máu bị nhiễm của một ng−ời mang HBeAg d−ơng tính có hiệu 12
22. 1.7. Các thể lâm sàng 1.7.1. Viêm gan cấp tính Tiến triển lâm sàng của HBV cũng t−ơng tự nh− viêm gan A (HAV), song sẽ trầm trọng hơn và có thể có liên quan với các triệu chứng nh− kiểu bị bệnh huyết thanh. Những kiểu tấn công nhẹ nhất không có biểu hiện lâm sàng và chỉ có thể xác định đ−ợc bằng mức tăng transaminaza trong huyết thanh. Nói cách khác bệnh nhân có thể không vàng da nh−ng sẽ bị mắc các triệu chứng kiểu bệnh cúm và viêm ruột- dạ dày. Những bệnh nhân này th−ờng không chẩn đoán đ−ợc trừ khi có một tiền sử mắc bệnh rõ ràng. Mức độ trầm trọng của bệnh có thể thay đổi từ không có triệu chứng và vàng da (ở những ng−ời đ−ợc hồi phục một cách điển hình) cho đến bạo phát và tử vong. Thể tấn công vàng da ở ng−ời lớn đ−ợc đánh dấu bằng một thời kỳ triệu chứng tiền lâm sàng (điển hình từ 3-4 ngày cho đến 2- 3 tuần). Trong thời kỳ này, bệnh nhân cảm thấy mệt mỏi, bị mắc các triệu chứng về đ−ờng tiêu hoá nh− chán ăn, buồn nôn và có thể sốt. Những triệu chứng chung nh− sốt, rét, chán ăn, không thích uống r−ợu và hút thuốc, mệt mỏi và thỉnh thoảng đau đầu nặng. Thời kỳ tiền triệu có kèm theo n−ớc tiểu sẫm mầu và phân bạc, vàng da tiến triển. 1.7.2. Viêm gan bạo phát Rất ít thể bệnh xẩy ra với bệnh nhân trong vòng 10 ngày. Thể này có thể tiến triển nhanh đến nỗi vàng da không nhận thấy đ−ợc và có thể nhầm lẫn với rối loạn tâm thần cấp tính hoặc viêm màng não mủ cấp tính. Mặt khác bệnh nhân có thể bị vàng da trầm trọng. Những biểu hiện của cơ thể lặp lại nh− nôn, hơi thở hôi, chứng lẫn và buồn ngủ. Hiện th−ợng run rẩy có thể chỉ thoảng qua, nh−ng co cứng là th−ờng xuyên. Những hiện t−ợng này sau đó sẽ bị gián đoạn bởi hôn mê chứng tỏ gan bị tổn th−ơng trầm trọng. Thân nhiệt của bệnh nhân tăng, vàng da trầm trọng và teo gan, có thể kèm theo xuất huyết lan tỏa. Bilirubin và Transaminaza là những dấu hiệu tiên l−ợng kém vì mức Transaminaza có thể giảm đi thật trong khi tình trạng lâm sàng của bệnh nhân lại kém đi. Promthrobin là dấu hiệu tiên l−ợng tốt nhất. Tần suất quá trình viêm gan bạo phát khác nhau phụ thuộc vào kiểu viêm gan virút và tỷ lệ mắc viêm gan B. 1.7.3. Triệu chứng hậu viêm gan Bệnh nhân lớn tuổi cảm thấy khá hơn đối với những khoảng thời gian khác nhau sau viêm gan cấp tính. Điển hình là thời kỳ này kéo dài vài tuần và có thể đến hàng tháng. Những hình ảnh chung là lo âu, mệt mỏi, sút cân, biếng ăn, sợ r−ợu và khó chịu vùng s−ờn phải trên, bờ gan có thể bị đau. Transaminaza huyết thanh có thể cao gấp 3 lần mức bình th−ờng. Tổ chức mô tế bào gan thay đổi nhẹ, có hiện t−ợng viêm và xơ hoá, đôi khi có thay đổi thành phần mỡ trong tế bào gan. Những điểm này cũng không khác so với bệnh nhân đã bình phục và cả bệnh nhân hết triệu chứng. Không đ−ợc tiến hành làm sinh thiết gan trong vòng 6 14
23. tháng sau viêm gan cấp vì có thể gặp khó khăn trong việc phân biệt những thay đổi còn lại sau một viêm gan cấp và một viêm gan tiến triển. 1.7.4. ứ mật kéo dài Thỉnh thoảng vàng da kéo dài là kết quả của kiểu ứ mật. Khởi đầu bệnh là cấp tính, song vàng da trầm trọng và trong vòng 3 tuần đầu bệnh nhân bắt đầu bị ngứa. Sau một vài tuần đầu bệnh nhân cảm thấy khoẻ mạnh, lên cân và không có biểu hiện lâm sàng trừ vàng da và gan hơi to. Hiện t−ợng vàng da dai dẳng từ 8- 29 tuần, sau đó là giai đoạn phục hồi. 1.7.5. Tái phát Một số tr−ờng hợp tấn công ban đầu đ−ợc nhân gấp đôi, song điển hình ở thể trung bình vào khoảng 1,8%-15% các tr−ờng hợp. Thông th−ờng sự tái phát đơn giản chỉ thấy đ−ợc do Transaminaza và Bilirudin huyết thanh tăng. Hiện t−ợng tái phát có thể là kết quả của một hoạt tính yếu hoặc uống một l−ợng r−ợu quá nhiều. Sự tái phát nhiều lần có thể xẩy ra, tuy nhiên bệnh nhân có thể bình phục sau tái phát. ở một số bệnh nhân, tái phát là dấu hiệu của quá trình tiến triển thành viêm gan mạn tính. 1.7.6. Ung th− biểu mô tế bào gan (HCC) Ung th− biểu mô tế bào gan là một cụm từ kỹ thuật của ung th− gan. Thể bệnh này phát triển ở các cá thể sau một thời gian dài bị nhiễm viêm gan B mạn tính. Những yếu tố nào đã thúc đẩy căn bệnh này, hiện nay ch−a biết. 1.8. Điều trị Hiện nay ch−a có ph−ơng pháp điều trị cho một viêm gan virút cấp tính. Các ph−ơng pháp trị liệu hiện nay chỉ nhằm hỗ trợ và duy trì sức khoẻ. Tuy nhiên việc sử dụng một số Adrenocorticosteroid cũng không có hiệu quả trong việc chữa chạy căn bệnh này, hơn nữa việc sử dụng Steroid trong điều trị sớm nhiễm virút viêm gan B có thể dẫn đến phát triển nhiễm trùng dai dẳng. Hiệu quả điều trị của Interferon cho tiên l−ợng nhiễm viêm gan B cấp tính là ch−a rõ. Một loạt các yếu tố đã đ−ợc sử dụng để điều trị HBV mạn tính. Mục đích của điều trị gồm ba mức: hạn chế nhiễm trùng và lây truyền HBV sang ng−ời khác, ngăn chặn viêm gan tiến triển và cải thiện tiên l−ợng lâm sàng, ngăn ngừa phát triển ung th− gan (HCC). Hiện nay điều trị bằng Interferon là một chọn lựa về ph−ơng pháp trị liệu cho những ng−ời viêm gan HBV mạn tính tiến triển. Liều Alpha-interfron điều trị có thể giao động từ 7 triệu đơn vị đến 30 triệu đơn vị/m2. Các nghiên cứu cho thấy điều trị bằng liều cao (>15 triệu đơn vị/m2) xem ra có hiệu quả hơn liều thấp. Tuy nhiên, bệnh nhân d−ơng tính với HBsAg và âm tính với HBeAg và ADN hình nh− không có lợi khi điều trị bằng Interferon. Bên cạnh đó, những ng−ời bị 15
24. viêm gan B bạo phát hoặc viêm đa động mạnh kết nối sẽ không có hiệu quả gì khi điều trị theo phác đồ này. Hiện nay có một loại thuốc đã biết là Lamivudine đang đ−ợc thử nghiệm trên thực địa ở giai đoạn ba. Trị liệu bằng Lamivudine đang đ−ợc nghiên cứu nh− là một ph−ơng pháp khả quan để điều trị những ng−ời viêm gan B mạn tính. Hơn nữa đã có những bằng chứng về sự dung nạp và ngăn chặn đ−ợc sự nhân lên của virút trong quá trình điều trị. Cũng có biểu hiện là kháng nguyên e và sự sản sinh ra HBs cũng giảm đi ở bệnh nhân đ−ợc điều trị lâu dài. Những nghiên cứu sau này nhằm mục đích có đ−ợc một hình ảnh tốt hơn về hiệu quả điều trị của loại thuốc này khi sử dụng liều cao hơn và thời gian kéo dài hơn. Mặc dù cũng đã có đ−ợc hy vọng nhỏ, song không một ph−ơng pháp điều trị nào đ−ợc gọi là chữa khỏi bệnh. Thực tế việc chữa khỏi bệnh này vẫn ch−a nắm bắt đ−ợc. 1.9. Dự phòng HBV đ−ợc tìm thấy trong hầu hết các dịch tiết của cơ thể, đặc biệt là máu vì vậy phải rất thận trọng khi tiếp xúc với máu, sản phẩm của máu hoặc dịch tiết cơ thể ng−ời. Nh− một nguyên tắc chung, tất cả máu và dịch tiết cơ thể ng−ời phải đ−ợc xử lý nh− là chúng có chứa các tác nhân gây nhiễm khác nhau nh− HIV và HBV. Những bề mặt nghi ngờ bị nhiễm phải đ−ợc tẩy trùng và làm sạch. Hiện nay ph−ơng pháp tốt nhất để phòng ngừa nhiễm HBV là tiêm vắcxin. Vắcxin chung nhất hiện nay trên thị tr−ờng đ−ợc điều chế từ nguồn nấm men tái tổ hợp. Protein bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (SHBs) đ−ợc sản xuất trong tế bào nấm men. Biểu thị protein này ở nấm men dẫn đến hình thành các hạt SHBs. Tuy nhiên các hạt này không đ−ợc nấm men tiết ra. Phá vỡ tế bào nấm men nhằm giải phóng các hạt hình cầu đã đ−ợc sản xuất vào dung dịch. Những hạt này sau đó đ−ợc làm tinh khiết nhờ các b−ớc làm sạch, siêu lọc, sắc ký và siêu ly tâm. Các hạt tinh khiết sau đó đ−ợc hấp phụ với Hydroxyt nhôm và bảo quản bằng Merthiolate. Hai loại vắcxin điều chế từ nấm men đ−ợc cấp bằng ở phần lớn các n−ớc là Engerix-B (SmithKline Beecham, Philladelphia, P.A) và Recombivax HB (Merck & Co., West Point, P.A). Cả hai sản phẩm đều t−ơng tự về mặt cấu trúc và thành phần hoá học với hàm l−ợng protein nấm men còn lại trong dung dịch ít hơn 2%. Tuy nhiên Recombivax HB đ−ợc sử lý với Formaldehyt tr−ớc khi cho hấp phụ với nhôm. Cả hai đều là sản phẩm từ nấm men, protein-S không đ−ợc glycosyl hoá (vì nấm men không chế biến theo cơ chế đúng của giai đoạn sau phiên dịch để làm việc này). Đây là những vắcxin hoàn toàn có hiệu lực cho phép gây đ−ợc miễn dịch phòng ngừa HBV. Tuy nhiên không đ−ợc làm đông băng vắcxin vì nh− vậy sẽ làm tổn hại đến tính miễn dịch. Nhiều nghiên cứu cho thấy làm đông băng sẽ dẫn đến làm giảm đáp ứng miễn dịch. Cũng có nhiều kiểu gây miễn dịch và các loại vắcxin khác, song những vắcxin nêu trên có lẽ nhìn chung là có hiệu lực nhất và đ−ợc sử dụng rộng rãi nhất. 16
25. Lịch tiêm vắcxin điển hình là các tháng 0, 1 và 6 hoặc 0, 1, 2 và 10. Lịch tiêm 0, 1 và 6 dùng tốt hơn để phòng bệnh tr−ớc khi bị phơi nhiễm. Lịch tiêm 4 liều có thể dùng tốt cho những ng−ời thỏa hiệp miễn dịch hoặc sau khi bị phơi nhiễm. Ng−ời ta cũng khuyến cáo một liều nhắc lại mỗi 5 năm hoặc 7 năm sau mũi tiêm đầu. Trẻ em cũng có thể tiêm phòng theo ph−ơng thức này. Tuy nhiên cũng có một vài báo cáo về phản ứng phụ của vắcxin điều chế từ nấm men. Các phản ứng phụ có thể là phản ứng da, khớp, mạch máu, mắt, huyết học và thần kinh. 1.10. Chiến l−ợc loại trừ lây truyền viêm gan virút B Một chiến l−ợc toàn diện đề phòng nhiễm HBV, viêm gan B cấp tính và những hệ quả của nó là phải loại trừ đ−ợc lây truyền xẩy ra ở lứa tuổi nhi đồng và thiếu niên, cũng nh− ở thanh niên và ng−ời lớn. ở Mỹ ng−ời ta đã chứng minh rằng lây truyền HBV không thể ngăn ngừa đ−ợc bằng cách tiêm vắcxin chỉ cho nhóm có nguy cơ lây nhiễm cao. Hiện nay không có ph−ơng pháp điều trị y học nào có thể loại trừ đ−ợc nhiễm HBV mạn tính cũng nh− ngăn chặn nguồn nhiễm mới ở những ng−ời cảm thụ. Vì vậy những tr−ờng hợp nhiễm mới chỉ có thể ngăn ngừa bằng cách gây miễn dịch với vắcxin viêm gan B cho những ng−ời dễ cảm thụ. Thăm khám th−ờng kỳ tr−ớc khi đẻ và chăm sóc tốt trẻ em phải là mục đích của việc dự phòng viêm gan B. Một chiến l−ợc dự phòng đầy đủ bao gồm : a) Kiểm tra các bà mẹ có thai tr−ớc khi sinh về HBsAg để xác định những trẻ sơ sinh cần phải đ−ợc ngăn ngừa lây nhiễm trong thời kỳ chu sinh bằng ph−ơng pháp dự phòng miễn dịch và xác định những ng−ời tiếp xúc trong gia đình cần phải tiêm vắcxin. b) Tiêm vắcxin th−ờng xuyên cho trẻ sinh ra từ các mẹ HBsAg-âm tính. c) Tiêm phòng vắcxin cho một số thanh niên. d) Tiêm vắcxin cho ng−ời lớn có nguy cơ lây nhiễm cao. Trẻ nhỏ và trẻ em cần đ−ợc tiêm vắcxin trong những lần thăm khám định kỳ, không cần phải có những lần thăm khám bổ sung. Việc thực thi chiến l−ợc gây miễn dịch này dễ dàng đi rất nhiều nhờ sự phát triển và sử dụng vắcxin nhiều kháng nguyên (nh− bạch hầu-uốn ván-ho gà/ DTP / viêm gan B / Haemophilus influenzae týp b / viêm gan B). Những vắcxin này sẽ làm giảm số lần tiêm ở trẻ em, giảm giá quản lý phí và việc phân phối vắcxin rộng rãi dễ dàng đi rất nhiều. Vì đại đa số nhiễm HBV xẩy ra ở ng−ời lớn, việc kiểm soát bệnh cần đ−ợc tăng c−ờng bằng việc tiêm vắcxin khẩn cấp ở nhóm cộng đồng có nguy cơ nh− thanh niên và những ng−ời cảm thụ tiếp xúc với ng−ời mang HBV mạn tính. Khuyến cáo tiêm vắcxin đại trà cho trẻ không loại trừ tiêm vắcxin cho ng−ời lớn đ−ợc xác định là có nguy cơ cao, cũng nh− các khuyến cáo tr−ớc đây về dự phòng sau khi tiếp xúc với HBV. Việc giảm tỷ lệ viêm gan B cấp tính và viêm gan B có liên quan đến bệnh gan mạn tính là kết quả của việc tiêm đại trà cho trẻ em có thể thấy rõ trong 17
26. nhiều năm. Tuy nhiên, giám sát đại trà HBsAg ở phụ nữ có thai để phòng nhiễm HBV chu sinh cho thấy đã tiết kiệm đ−ợc và −ớc tính giá thành tiêm vắcxin đại trà cho trẻ em rẻ hơn giá thành việc chăm sóc y tế trực tiếp và nghỉ làm việc có liên quan. Hiện nay giá một liều vắcxin viêm gan B cho trẻ em phân phối ở khu vực Nhà n−ớc cũng t−ơng đ−ơng các vắcxin khác cho trẻ em. Tiêm vắcxin cho thanh niên và ng−ời lớn th−ờng đắt hơn do giá vắcxin cao hơn và chi phí thực hiện cao hơn ở nhóm đích trong cộng đồng. Sau này việc tiêm đại trà vắcxin cho trẻ em có lẽ hạn chế đ−ợc nhu cầu tiêm vắcxin cho thanh niên và ng−ời lớn tuổi. 1.11. Phòng nhiễm virút viêm gan B Có hai loại sản phẩm dùng để dự phòng nhiễm HBV. Vắcxin viêm gan B dùng để bảo vệ lâu dài đối với nhiễm HBV và khuyến cáo dùng để dự phòng cả tr−ớc và sau khi phơi nhiễm. HBIG dùng để bảo vệ tạm thời (có nghĩa là 3-6 tháng) và chỉ định dùng cho một vài tr−ờng hợp sau phơi nhiễm. 1.12. Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG) HBIG đ−ợc điều chế từ huyết t−ơng ng−ời có hiệu giá kháng thể kháng HBsAg (anti-HBs) cao. ở Mỹ, HBIG có hiệu giá anti-HBs > 100.000 bằng thử nghiệm đồng vị phóng xạ. Huyết t−ơng ng−ời dùng để điều chế HBIG phải đ−ợc kiểm tra kháng thể kháng HIV, ngoài ra qui trình dùng để điều chế HBIG phải bất hoạt đ−ợc và loại trừ đ−ợc HIV ở thành phẩm cuối cùng. Không có một chứng cớ nào chứng tỏ HIV có thể lây truyền qua HBIG. 2. Các loại Vắcxin viêm gan b và những nghiên cứu về vắcxin viêm gan b hiện nay Xuất phát từ những hiểu biết về vai trò tạo miễn dịch bảo vệ của anti- HBs và tính kháng nguyên cao của HBsAg nên từ đầu những năm 80 của thế kỷ 20, ng−ời ta đã sử dụng kháng nguyên HBsAg để nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng viêm gan B. 2.1. Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu h−ớng phát triển. Năm 1971, Krugman và cộng sự là ng−ời đi tiên phong trong lĩnh vực này, các tác giả đã dùng huyết t−ơng của ng−ời nhiễm HBV đ−ợc bất hoạt bằng nhiệt tạo thành vật liệu sinh miễn dịch có thể dự phòng viêm gan B. Đến năm 1980, quy trình sản xuất vắcxin có quy mô đã đ−ợc tiến hành ở Pháp và Mỹ. Từ đó, cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu sản xuất vắcxin viêm gan B của các n−ớc. 2.1.1. Vắcxin viêm gan B từ huyết t−ơng ng−ời Năm 1981, vắcxin viêm gan B lần đầu tiên đ−ợc điều chế tại Mỹ từ HBsAg có trong huyết t−ơng những ng−ời nhiễm HBV. Vắcxin đó mang biệt d−ợc Heptavax-B của hãng Merck Sharp & Dohme. 18
27. Vắcxin này, có thành phần chủ yếu là protein S, là tập hợp những hạt HBsAg hình cầu 22nm và đ−ợc sản xuất trên nguyên lý: Lấy từ nguồn huyết t−ơng ng−ời mang HBV với hiệu giá HBsAg cao trong máu, đ−ợc xử lý qua nhiều b−ớc lấy tủa, ly tâm, lọc rửa và bất hoại virút bằng nhiệt hoặc hoá học - đ−ợc gọi là vắcxin thế hệ 1. Vắcxin huyết t−ơng đã đ−ợc sản xuất ở nhiều n−ớc trên thế giới nh− Pháp (Pasteur), Mỹ (Merck Sharp & Dohme), Hà Lan (Redcross), Nhật (Green Cross và Viện Kitasato), Đài Loan (Life Quard), Triều Tiên (Green Cross & Cheisugar) và Trung Quốc. Tính đến năm 1988 đã có 13 hãng sản xuất với 300 triệu liều một năm. Một số vắcxin huyết t−ơng đ−ợc sử dụng nh− Hevax-B, Heptavax-B, HBvaccine, Hepavax. Vắcxin từ nguồn huyết t−ơng ng−ời có hiệu lực bảo vệ tốt, giá thành phải chăng. Tuy vậy ngày nay nhiều n−ớc không sử dụng bởi vì nguồn huyết t−ơng giàu HBsAg ngày càng trở nên khó khăn hơn do hiệu quả tích cực của chính việc dùng vắcxin, mặt khác các sinh phẩm có nguồn gốc từ máu ng−ời vẫn luôn là vấn đề đáng e ngại bởi các nguy cơ tiềm ẩn lây nhiễm các bệnh lây truyền qua đ−ờng máu. Vì vậy các nhà khoa học đã l−u ý tới nghiên cứu phát triển loại vắcxin khác. 2.1.2. Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp còn gọi là vắcxin viêm gan B thế hệ thứ 2, đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp công nghệ sinh học phần tử và công nghệ di truyền. Ng−ời ta đ−a gen S của HBV vào tế bào nhận. Gen S tích hợp vào ADN plasmid của tế bào nhận. Tế bào nhận tổng hợp nhiều kháng nguyên HBsAg d−ới sự điều khiển của gen S. Có 2 loại tế bào đang đ−ợc dùng phổ biến làm tế bào nhận hiện nay là tế bào nấm men Sacharomyces cereviriae và tế bào buồng trứng của chuột đất vàng Trung Quốc (CHO). Từ năm 1986, vắcxin tái tổ hợp bắt đầu đ−ợc sản xuất, cho tới nay nhiều n−ớc nh− Mỹ, Bỉ, Nhật, Pháp, Cu Ba, Trung Quốc, Triều Tiên đã sản xuất đ−ợc vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. Xu h−ớng chung hiện nay là sản xuất và sử dụng vắcxin tái tổ hợp vì nó có nhiều −u điểm, nhất là khi vắcxin huyết t−ơng đang dần gặp khó khăn về nguồn plasma giàu HBsAg. Hơn nữa, vắcxin tái tổ hợp dễ sản xuất với số l−ợng lớn, giá cả hợp lý, có tính sinh miễn dịch cao và rất an toàn. Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp có các loại: Vắcxin tái tổ hợp từ nấm men chỉ có vùng S: Vắcxin đ−ợc sản xuất trên cơ sở sao chép HBsAg với týp huyết thanh adw2 trên tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae. Nhiều vắcxin tái tổ hợp từ nấm men đã đ−ợc cấp giấy phép trong đó có hai loại đ−ợc sử dụng nhiều nhất là Engerix-B (Smith Kline - Bỉ) và Recombivax (Merck - Mỹ). Hơn 90% l−ợng kháng thể đ−ợc hình thành là kháng thể loại “a” đặc hiệu và có khả năng bảo vệ giống nh− vắcxin làm từ huyết t−ơng ng−ời. Cho đến năm 1989, đã có 76 n−ớc sử dụng 19
28. vắcxin này trong dự phòng với hơn 15 triệu liều, riêng hãng Smith Kline sản xuất khoảng 10 triệu liều. Vắcxin tái tổ hợp từ nấm men có chứa vùng tiền S2 (Pre - S2): Thành phần bao gồm các protein trung bình là các axit amin đ−ợc mã hoá bởi gen S + tiền-S2, những thành phần mới này đã làm cho vắcxin có tính sinh miễn dịch cao hơn các đối t−ợng có đáp ứng miễn dịch và những ng−ời không có đáp ứng miễn dịch do nguồn gốc di truyền. Vắcxin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào động vật: Tế bào th−ờng dùng là trứng chuột đất vàng Trung Quốc (CHO). Các vắcxin cũng đ−ợc phát triển dựa trên nguyên lý tái tổ hợp gen, kích thích sản sinh ra đ−ợc kháng thể kháng S và tiền-S2 (một số tạo đ−ợc cả kháng thể kháng tiền-S1), nh− Genhevac B của Pháp, Biohep-B của Nhật, Hepa-gene-3 (HG3) của Đức. Qua thử nghiệm loại vắcxin này cho thấy khả năng gây đáp ứng miễn dịch sớm hơn các loại vắcxin chỉ chứa vùng gen S, ngoài ra còn gây đ−ợc đáp ứng miến dịch trên các tr−ờng hợp không có đáp ứng với các loại vắcxin chỉ chứa protein mã hóa bởi vùng gen S. Các tác giả cho rằng thành phần vắcxin có chứa vùng tiền-S1, tiền-S2 hoạt hoá đ−ợc tế bào T hỗ trợ, cũng nh− tăng c−ờng sự t−ơng tác giữa anti-HBs và anti-tiền S làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch. Hiện nay vắcxin có chứa vùng tiền-S1, tiền-S2 đã đ−ợc sản xuất và đ−ợc sử dụng trong các tr−ờng hợp đột biến, đáp ứng anti-HBs muộn hoặc không đáp ứng miễn dịch. 2.1.3. Vắcxin viêm gan B tổng hợp chuỗi polypeptit. Trên cơ sở hiểu biết cấu trúc chuỗi polypeptít ở dạng gây miễn dịch của HBsAg, ng−ời ta nghiên cứu tổng hợp ra chuỗi polypeptit để làm vắcxin. Loại vắcxin viêm gan B này hiện nay đang trong quá trình thử nghiệm. Đây là vắcxin viêm gan B thế hệ thứ 3, vắcxin này trong t−ơng lai sẽ là vắcxin rẻ nhất. 2.2. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B Cả 2 loại vắcxin làm từ huyết t−ơng ng−ời và vắcxin tái tổ hợp đều cho phản ứng tại chỗ nhẹ và phản ứng toàn thân rất hiếm khi gặp, nếu có thì sẽ nhanh chóng qua khỏi. Các phản ứng tại chỗ hoặc toàn thân gây nên th−ờng là do các chất bảo quản, các chất hấp phụ có trong thành phần vắcxin gây nên. Các phản ứng này th−ờng mất nhanh trong vòng 24-48 giờ sau tiêm. 2.2.1. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B sản xuất từ huyết t−ơng ng−ời Ngay từ những năm 80, sau khi quá trình sản xuất vắcxin phòng viêm gan B từ huyết t−ơng với quy mô lớn đ−ợc thực hiện ở Pháp (Viện Pasteur) và ở Mỹ (Công ty Merk Sharp & Dohne) và tiếp theo đó nhiều hãng trên thế giới đã sản 20
29. xuất loại vắcxin này đều cho thấy: vắcxin huyết t−ơng đã đạt đ−ợc độ an toàn cho hàng triệu ng−ời dùng. Tuy nhiên, lúc đó và sau này, một số tác giả vẫn l−u ý việc sử dụng loại vắcxin nh− thế có thể gây ra tình trạng đột biến chủng làm thay đổi yếu tố di truyền của virút viêm gan B và e ngại những khả năng an toàn của loại vắcxin này. Thực tế đã xác nhận rằng, hàng năm trên thế giới có 300 triệu liều vắcxin phòng viêm gan B đ−ợc sử dụng đã không có tr−ờng hợp nào đ−ợc báo cáo về sự lây nhiễm HIV và gây viêm gan virút do các loại vắcxin này. 2.2.2. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đ−ợc nghiên cứu đầy đủ trên nhiều đối t−ợng, với liều l−ợng kháng nguyên và các thành phần tá d−ợc cũng nh− nguồn gốc sản xuất khác nhau của nhiều hãng d−ợc phẩm. Các công bố trong 10 năm gần đây cho thấy các vắcxin viêm gan B tái tổ hợp an toàn về mọi khía cạnh và dung nạp tốt. Sau đây là một số công trình nghiên cứu: Các tác giả Tejedor - Torres - JC (1993), Goldfrab - J (1996), Yerushalmi - B (1997), Hsu-H (2001) đã đánh giá tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất từ nấm men hoặc từ tế bào buồng trứng chuột (CHO) dùng cho trẻ sơ sinh và trẻ em với các liều 5,10, 20 àg đều không thấy tác dụng phụ đáng kể nào sau tiêm. Trên đối t−ợng ng−ời lớn khoẻ mạnh, các tác giả Leroux - Roels G (1996), Joshi N (2000), Kim - Y (1993), Min C.H (1991), thấy phản ứng tại chỗ sau tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp nh− đau chiếm 3,6% - 8,6%; s−ng đỏ 2,2,% - 2,9%; Các phản ứng toàn thân nh− mệt mỏi, đau đầu, sốt nhẹ, buồn nôn chỉ xuất hiện thoảng qua với tỷ lệ nhỏ hơn 5%, tự khỏi sau 24-48 giờ và các phản ứng phụ ở những lần tiêm sau giảm dần. Các tác giả Bertinio J.S (19697), Heineman T.C (1999), Evan - J (2000), Joshi - N (2000) nghiên cứu tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp với các thành phần kháng nguyên khác nhau chứa gen S, tiền - S1, tiền-S2 cùng các tá d−ợc MF559, GM-CSF trên ng−ời khoẻ mạnh và bệnh nhân chạy thận nhân tạo dài ngày đều thấy vắcxin hầu nh− không gây phản ứng phụ tại chỗ và toàn thân. Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đảm bảo tính an toàn ngay cả khi sử dụng cho trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai hoặc ng−ời đang ốm. Nhìn chung các vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đ−ợc đánh giá là an toàn, tạo đáp ứng miễn dịch tốt và hầu nh− không có các tác dụng phụ (trừ một ít các phản ứng tại chỗ), do vậy vắcxin viêm gan tái tổ hợp hiện nay đ−ợc nhiều n−ớc trên thế giới sử dụng. 2.3. Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B Đối với bất cứ một loại vắcxin nào, ngoài các yêu cầu về an toàn, ít hoặc không có phản ứng phụ, phải đạt đ−ợc 2 yêu cầu cơ bản sau đây: - Có tính sinh miễn dịch cao tức là kích thích cơ thể sinh miễn dịch bảo vệ với hiệu giá kháng thể chấp nhận đ−ợc theo quy −ớc của TCYTTG. 21
30. - Có hiệu lực bảo vệ ở thực địa tức là hiệu quả cuối cùng cần đạt theo mục đích sử dụng vắcxin. 2.3.1. Tính sinh miễn dịch của vắcxin sản xuất từ huyết t−ơng ng−ời - Sử dụng trên ng−ời lớn: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm 3 liều 20 àg theo lịch 0-1-6 tháng, cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch 92,3% - 100%. Với các liều 5, 10, 15 àg theo lịch tiêm 0-1-6 đạt đ−ợc hiệu lực đáp ứng miễn dịch cao 93-97%. - Sử dụng trên trẻ em: Liều 10 àg theo phác đồ 0-1-2 tháng cho đáp ứng miễn dịch cao ở tất cả các nhóm tuổi: d−ới 6 tháng: 96%, 13-24 tháng: 91,3%. Với liều 3 àg theo phác đồ 0-1-2 tháng trên những trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HBV đạt 73,14%. 2.3.2. Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã đ−ợc nghiên cứu một cách đầy đủ đối với các loại vắcxin đ−ợc chế tạo ở các n−ớc khác nhau. Nhìn chung, tính sinh miễn dịch đ−ợc thể hiện qua sự chuyển dịch huyết thanh (tỷ lệ chuyển đổi từ anti-HBs âm tính sang d−ơng tính) và tỷ lệ phần trăm có hiệu giá kháng thể bảo vệ (≥10mIU/ml) và hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) của các đáp ứng miễn dịch sau từng mũi tiêm và hiệu giá cuối cùng. * Tính sinh miễn dịch của vắcxin tái tổ hợp từ nấm men - ở ng−ời lớn: Vắcxin, đ−ợc sử dụng trên các nhóm đối t−ợng nh− bệnh nhân chạy thận nhân tạo, đồng tính luyến ái nam, nhóm nhân viên y tế, nhóm ng−ời khoẻ mạnh thuộc nhiều lứa tuổi, đều đã chứng minh đ−ợc tính sinh miễn dịch đạt tỷ lệ từ 90% - 100% . ở Việt Nam, nhóm tác giả sử dụng Heberbiovac (Cu Ba) theo phác đồ 0-1-2, liều 20 àg cho đáp ứng miễn dịch đạt 98%, hiệu giá GMT là 201 mIU/ml. - ở trẻ em: Các loại vắcxin tái tổ hợp, dùng cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ lứa tuổi từ 1-10, đã chứng minh đáp ứng miễn dịch bảo vệ sau khi tiêm đủ 3 liều là 90-98% và từ 85-90% ở trẻ sinh ra từ mẹ mang HBsAg và 5 năm sau không thấy nhiễm HBV. Xu h−ớng chung trong vài năm gần đây ng−ời ta th−ờng tập trung nghiên cứu tìm kiếm một vài loại tá chất hợp lý (nh− vi khuẩn H.influenzae hoặc tá chất có nguồn gốc hoá học) để tăng c−ờng hiệu lực đáp ứng miễn dịch hoặc sự kết hợp với một vắcxin khác (ví dụ: vắcxin viêm gan A) nh− một vắcxin đa giá, đồng tác dụng hỗ trợ miễn dịch. Sau khi có sự kết hợp này trong thực nghiệm, ng−ời ta đánh giá hiệu quả sinh miễn dịch và an toàn trên ng−ời tình nguyện và kết luận về tác dụng của các tá chất này. Nhìn chung các kết quả nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy: sau mũi tiêm thứ 3 có 97,6% - 100% đạt hiệu giá bảo vệ khi kết hợp vắcxin viêm gan A và B; Còn đối với vắcxin viêm gan B có chứa chất tá d−ợc (MF 59) thì chỉ sau mũi tiêm thứ nhất đã đạt hiệu giá bảo vệ là 89% 22
31. trong khi vắcxin không có tá d−ợc tỷ lệ này là 12% và hiệu giá GMT của vắcxin HBV/MF59 cao gấp 5 lần vắcxin không có tá d−ợc. Cả 2 vắcxin dung nạp tốt, tác dụng phụ ít, nhẹ thoáng qua. * Tính sinh miễn dịch của vắcxin tái tổ hợp đ−ợc sản xuất từ tế bào động vật Vắcxin cũng đ−ợc phát triển trên nguyên lý tái tổ hợp ở tế bào CHO, gây đ−ợc hiệu quả miễn dịch cao và kích thích cơ thể tạo kháng thể kháng S, tiền-S1, tiền-S2. Vắcxin tái tổ hợp sản xuất từ tế bào CHO (vắcxin HG3) đã đ−ợc thử nghiệm lâm sàng trên nhóm ng−ời khoẻ mạnh và 3 nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo, ghép tạng, ghép tim (các nhóm này đã không có đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắcxin chỉ chứa vùng S). Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch có đ−ợc sau khi tiêm đủ 3 liều vắcxin HG3 lần l−ợt ở các nhóm trên là 100%, 92%, 42%, 40%. Viện Pasteur (Pháp) đã tiến hành nghiên cứu so sánh vắcxin huyết t−ơng Hevac B có chứa 1-2% protein tiền-S2 với vắcxin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào CHO là GenHevacB có chứa 20% protein tiền - S2. 220 trẻ em đ−ợc tiêm 3 liều 5 àg Hevac B hoặc 20 àg GenHevacB, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch ở cả 2 loại vắcxin là 100% với GMT là 3864 và 2864 mIU/ml. Kháng thể kháng kháng nguyên “a” đặc hiệu có ở 2 nhóm này là 84,2% và 98,4%. Kết quả t−ơng tự cũng thu đ−ợc ở Pháp trên trẻ sơ sinh và các bà mẹ có HBsAg (+) hoặc anti-HBe (+). Sau 3 mũi tiêm liều 20 àg GenHevac B, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% đối với anti-HBs và kháng thể kháng tiền-S2; hơn 90% trẻ em có anti-HBs với hiệu giá cao hơn 1000 mIU/ml chứng tỏ có sự miễn dịch kéo dài. 2.4. Các yếu tố ảnh h−ởng đến tính sinh miễn dịch của vắcxin phòng viêm gan B. 2.4.1. Đối t−ợng tiêm. Đã có nhiều thử nghiệm nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B trên những đối t−ợng khác nhau. Các nghiên cứu đều cho thấy sự phát triển và hiệu quả kéo dài của kháng thể bảo vệ anti-HBs đều liên quan đến tuổi, giới, cân nặng trên đối t−ợng tiêm vắcxin viêm gan B. Đáp ứng miễn dịch của trẻ nhỏ cao hơn so với ng−ời tr−ởng thành và phụ nữ có đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với nam giới. Vắcxin viêm gan B cũng có tác dụng bảo vệ tốt ở một số nhóm đối t−ợng có nguy cơ mặc dù tỷ lệ đáp ứng miễn dịch thấp hơn so với ng−òi khoẻ mạnh, điều này đã đ−ợc chứng minh trên các nhóm bệnh nhân −a chảy máu, thẩm tích máu, đồng tính luyến ái 2.4.2. Liều vắcxin Hiện nay ch−a có sự thống nhất trong việc sử dụng liều tiêm và lịch tiêm của các chế phẩm vắcxin viêm gan B. Pasteur Merieux đ−a ra lịch tiêm 4 mũi với liều 5 àg, trong khi đó Marck Sharp & Dohme và nhiều hãng khác sử dụng lịch 23
32. tiêm 3 mũi với liều 20 àg cho ng−ời lớn và 10 àg cho trẻ em. Việc sử dụng liều tiêm và lịch tiêm chủ yếu phụ thuộc vào một số yếu tố nh− đối t−ợng tiêm, mức độ l−u hành dịch ở địa ph−ơng, thành phần cấu tạo và chất l−ợng của từng loại vắcxin Liều tiêm cho nhóm vị thành niên gấp đôi liều l−ợng dùng cho trẻ d−ới 1 tuổi, với ng−ời lớn dùng liều gấp 2-4 lần liều của trẻ d−ới 1 tuổi. Các nhóm nguy cơ cao đ−ợc tiêm liều cao gấp 2 - 4 lần liều ng−ời lớn tùy theo chế phẩm. Để thăm dò và lựa chọn đ−ợc 1 liều tiêm vắcxin thích hợp trong cộng đồng cho từng loại vắcxin viêm gan B nhiều nghiên cứu đã tiến hành với những liều tiêm thay đổi. Sử dụng vắcxin ở các liều cao th−ờng đạt đ−ợc đáp ứng miễn dịch cao, khả năng tồn l−u kháng thể bảo vệ kéo dài. Những nghiên cứu đầu tiên th−ờng sử dụng ở liều 40 àg HBsAg cho ng−ời lớn và tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau 2 mũi tiêm đã đạt 100%. Tuy nhiên theo tiêu chuẩn của TCYTTG chỉ cần đạt hiệu giá anti-HBs ≥ 10 mIU/ml là có tác dụng bảo vệ và hiệu quả tích cực của mũi tiêm tiếp sau tăng tính sinh miễn dịch (nhờ vai trò của ký ức miễn dịch). Do vậy, các nghiên cứu sau này đã cho phép có thể chấp nhận và sử dụng vắcxin ở những liều thấp hơn. Việc giảm liều vắcxin mà vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch đang rất đ−ợc quan tâm đặc biệt là ở những n−ớc đang phát triển, nơi mà tỷ lệ nhiễm HBV lớn nh−ng công tác tiêm chủng đang gặp trở ngại lớn là giá thành vắcxin còn cao. Trong một số thử nghiệm giảm 1/2 liều vắcxin so với liều tiêm chuẩn 20àg của Engerix-B và 10 àg của HepavaxII-B trên đối t−ợng ng−ời lớn ở Singapo và Australia (1991), các tác giả nhận thấy việc giảm 1/2 liều vẫn tạo ra tỷ lệ bảo vệ t−ơng đ−ơng liều chuẩn. Một nghiên cứu t−ơng tự đ−ợc thực hiện trên trẻ em đ−ợc tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp theo lịch 0-1-5 tháng với liều 5; 2,5; 1,25 hoặc 0,6 àg tỷ lệ miễn dịch ở thời điểm 6 tháng sau mũi tiêm thứ 1 giao động từ 90-100%. Sau một năm 20% có hiệu giá ≤ 10 mIU/ml và sau 2 năm có 40%, song tất cả đều có đáp ứng miễn dịch tăng lên sau liều tiêm nhắc lại. Một nghiên cứu t−ơng tự trên 153 trẻ sơ sinh khoẻ mạnh với liều từ 5 àg và 10 àg vắcxin Engerix-B, cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch bảo vệ là 98,5% ở cả hai nhóm. Tuy nhiên, liều 10 àg tạo ra nồng độ GMT cao hơn so với liều 5 àg (1641 mIU/ml so với 880 mUI/ml). Các nghiên cứu nhìn chung đều đi đến thống nhất là liều tiêm có ảnh h−ởng đến hiệu giá kháng thể đạt đ−ợc sau khi tiêm ở mỗi cá thể, song nó không tạo ra một sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ có miễn dịch bảo vệ trong cộng đồng. Khi mà sự hạn chế về thời gian tồn l−u kháng thể bảo vệ sau tiêm đ−ợc giải quyết bằng một mũi tiêm nhắc lại thì việc giảm liều là một giải pháp hữu hiệu cho các n−ớc ở vùng có dịch l−u hành cao khi cần phải tiêm miễn dịch hàng loạt cho trẻ em nh−ng kinh phí lại hạn hẹp. 24
33. 2.4.3. Đ−ờng tiêm, vị trí tiêm Chỉ định thông th−ờng với vắcxin viêm gan B là đ−ờng tiêm bắp ở đùi hoặc cơ delta. Trên trẻ em, đặc biệt là trẻ sơ sinh, cơ delta quá nhỏ nên tất cả các mũi vắcxin tiêm bắp bao gồm cả vắcxin viêm gan B đều đ−ợc tiêm ở đùi. Tiêm vào mông làm giảm đáp ứng miễn dịch. Đã có hơn 100 báo cáo về tỷ lệ đáp ứng kháng thể thấp không đạt yêu cầu sau khi tiêm vắcxin viêm gan B vào mông. Shaw và cộng sự, tiến hành nghiên cứu ở Mỹ, đã chứng minh những ng−ời đ−ợc tiêm vắcxin ở cơ delta có nồng độ kháng thể cao gấp 17 lần những ng−ời đ−ợc tiêm vào mông và hơn nữa những ng−ời đ−ợc tiêm vào mông có 2 - 4 lần khả năng không đạt đến nồng độ kháng thể tối thiểu 10 mIU/ml sau tiêm. Hiện t−ợng trên có thể đ−ợc giải thích là : - Vắcxin có thể bị tiêm vào mô mỡ dày d−ới da ở mông hơn là vào cơ với kim ngắn hơn 5 cm. - Các tế bào thực bào hoặc trình diện kháng nguyên trong các lớp mỡ rất ít nên việc xử lý bởi đại thực bào và trình diện với các tế bào T và B bị chậm trễ. - Các kháng nguyên tồn tại trong mỡ nhiều giờ hoặc nhiều ngày có thể bị biến tính. Giảm liều phối hợp với kỹ thuật tiêm trong da là một vấn đề đã đ−ợc nghiên cứu. Tuy nhiên, đối t−ợng có thể áp dụng kỹ thuật này là vấn đề còn nhiều tranh luận. Tính an toàn và hiệu quả của vắcxin viêm gan B với liều nhỏ tiêm trong da đã đ−ợc xác nhận trên một nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch trên sinh viên Y khoa (ở Bethesda - Mỹ) với 4 mũi tiêm trong da với liều 2 àg vắcxin huyết t−ơng, cho thấy tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 96%, GMT là 1198 mIU/ml và sự tồn tại kháng thể sau 2 năm ở 85 - 89% tổng số ng−ời đ−ợc tiêm. Các tác giả Mỹ đã tiến hành trên binh lính đóng quân ở Hàn Quốc cho thấy cách tiêm trong da là hoàn toàn có thể chấp nhận đ−ợc trên ng−ời lớn khi cần có một sự bảo vệ ngắn hạn. Tuy nhiên, đối với trẻ em đ−ờng tiêm trong da dung nạp không tốt. Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) khuyến cáo rằng đ−ờng tiêm trong da không đ−ợc dùng cho trẻ em, đặc biệt đối với trẻ sơ sinh từ những bà mẹ là ng−ời mang mạn tính, đ−ờng tiêm trong da chỉ đ−ợc dùng đối với ng−ời lớn tuổi trong tr−ờng hợp có làm thử nghiệm huyết thanh học sau khi tiêm. Một nghiên cứu sử dụng vắcxin viêm gan B liều 0,1 ml tiêm trong da đã có đáp ứng miễn dịch tốt và không có phản ứng phụ tại chỗ xảy ra. Đ−ờng tiêm trong da có thể làm giảm giá thành chỉ cần 10% l−ợng vắcxin là có thể đạt đ−ợc mức độ đáp ứng kháng thể nh− tiêm bắp. Tuy nhiên, cho đến khi có những quyết định từ các nghiên cứu sâu hơn, đ−ờng tiêm bắp với liều đầy đủ vẫn là chỉ định với vắcxin viêm gan B. 2.4.4. Lịch tiêm Hiện nay có nhiều lịch tiêm khác nhau tùy theo loại vắcxin của các hãng sản xuất qui định. Hai lịch tiêm phổ biến nhất là 0-1-2-12 tháng và 0-1-6 tháng. 25
34. Lịch thứ nhất cho sự bảo vệ nhanh chóng, lịch tiêm thứ 2 tạo ra kháng thể hiệu giá cao hơn và sự bảo vệ kéo dài hơn. Một nghiên cứu của Đức so sánh 3 lịch tiêm 0-1-2-12; 0-1-6 và 0-1-12 tháng, đ−a đến kết luận rằng lịch tiêm cuối cùng cho hiệu giá cao nhất và sự bảo vệ kéo dài nhất, trong khi lịch 0-1-2-12 tháng cho sự bảo vệ sớm nhất. Nhiều nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắcxin trên động vật và ng−ời tình nguyện đã rút ra kết luận cần thiết ít nhất là 3 liều tiêm để có đáp ứng miễn dịch cao, ổn định và khả năng bảo vệ bền lâu. Ng−ời ta thấy rằng những đứa trẻ chỉ nhận đ−ợc 2 liều tiêm sẽ đ−ợc bảo vệ cơ bản nh−ng có thể sẽ bị nhiễm ở giai đoạn sau do các nguồn lây khác nhau. Liều nhắc lại thứ 3 là cần thiết để mang lại tỷ lệ bảo vệ cao đáng kể, duy trì sự bảo vệ lâu dài và kích thích kéo dài trí nhớ miễn dịch. 3. Sử dụng công nghệ táI tổ hợp Adn để biểu thị kháng nguyên 3.1. Các hệ biểu thị khác nhau Nghiên cứu tìm hệ biểu thị cho vắcxin viêm gan B thế hệ hai bắt đầu từ cuối những năm 70, bị ngắt quãng trong các phòng thí nghiệm có sử dụng rADN. Công việc này đ−ợc khởi động lại vào những năm đầu 80, khi ng−ời ta xác định đ−ợc gen S mã hoá kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của HBV và biểu thị gen S tái tổ hợp nh− nh− kiểu hạt HBsAg 22 nm ở nấm men và tế bào động vật. Cả hai loại vắcxin tái tổ hợp từ nấm men và tế bào động vật (CHO) đều đ−ợc phát triển và cấp bằng vào thập niên 80. Cả hai loại vắcxin tái tổ hợp đều đạt công hiệu với hiệu giá kháng thể bảo vệ anti-HBs cao ở những ng−ời đ−ợc tiêm. Tuy nhiên, các qui trình dựa trên cơ sở tái tổ hợp nấm men nhìn chung vẫn có kết quả hơn. Hơn nữa tính an toàn có liên quan đến ADN tồn d− ở sản phẩm từ nấm men về cơ bản là tốt hơn ở ADN tồn d− ở sản phẩm từ tế bào động vật, mặc dù qui trình làm sạch ADN vẫn phải sẵn sàng cho cả hai loại vắcxin. 3.2. Biểu thị ở nấm men Hệ biểu thị HBsAg ở nấm men là t−ơng tự và điển hình cho các hệ sử dụng nói chung cho S. cerevisiae. Các hệ biểu thị sử dụng plasmid có chứa một phần hoặc toàn bộ các trình tự 2 àm của nấm men, có khả năng khuyếch đại lên nhiều phiên bản, th−ờng là 100-200 phiên bản/tế bào. Các plasmid kiểu này tự thay thế các phân tử ADN trong nhân nấm men và có chứa gen chọn lọc đối với quyền sở hữu trong chủng chủ t−ơng thích, nh− kiểu gen LEU2 để chọn lọc chủng thiếu hụt Leucin (leu-). Bộ máy biểu thị bao gồm đoạn khởi động phiên dịch mạnh từ nấm men, gen S của HBV và trình tự kết thúc phiên dịch từ nấm men. Các đoạn khởi động th−ờng có cả hai vùng cấu trúc hoạt động biểu thị HBsAg. Qua quá trình lên men của nấm men, nó sẽ tái bổ sung chất cảm ứng biến nạp (thí dụ Galactose cho đoạn khởi động GAL1) hoặc giảm các thành phần môi tr−ờng (thí dụ Phosphat cho đoạn khởi động PHO5). Ngoài ra, plasmid còn chứa các yếu tố 26
35. năng AOX1 và AOX2 và phát triển trong Methanol ở tỷ lệ của chủng hoang dại. Chủng thứ hai đ−ợc gọi là sử dụng Methanol chậm (Muts) có gen AOX1 bị rối loạn. Chuyển hoá Methanol ở chủng này phụ thuộc vào gen phiên dịch yếu AOX2. Chủng thứ ba đ−ợc gọi là sử dụng Methanol âm tính (Mut-). Trong chủng này cả hai gen AOX đều bị rối loạn và kết quả chủng này hoàn toàn không có khả năng chuyển hoá Methanol. Biểu thị ở cả ba chủng P. Pastoris Mut đều đ−ợc thực hiện bằng nuôi cấy trong nồi lên men với qui trình ba b−ớc. Hai b−ớc lên men đầu là nh− nhau ở cả ba chủng. B−ớc thứ nhất là giai đoạn Glycerol để phát triển sinh khối. B−ớc thứ hai là giai đoạn nuôi khi Glycerol đ−ợc cho thêm vào ở tỷ lệ giới hạn phát triển. Glycerol có hạn trong giai đoạn này kiềm chế bộ máy chuyển hoá Methanol và cho phép tế bào chuyển dịch nhẹ nhàng từ phát triển có Glycerol sang phát triển có Methanol. Giai đoạn thứ ba là giai đoạn cảm ứng Methanol và khác nhau phụ thuộc vào phenôtyp của chủ biểu thị. Tuy vậy, hình ảnh chung của giai đoạn thứ ba này là mức độ Methanol trong nồi lên men phải đ−ợc kiểm soát chặt chẽ hoặc trực tiếp bằng sắc ký khí hoặc gián tiếp bằng nồng độ ôxy (DO) hoà tan. Chủng Mut+ Chủng Mut+ của P. pastoris rất nhậy cảm với hàm l−ợng Methanol tồn d− cao. Với một l−ợng ôxy và Methanol thừa thì Formaldehyt, sản phẩm đầu tiên của quá trình chuyển hoá Methanol tăng đến mức gây độc và “làm lên men” tế bào. Bởi vậy, để tế bào phát triển và biểu thị protein thành công với chủng Mut+ thì nhất thiết phải duy trì đ−ợc nồng độ Methanol thấp trong nồi lên men. Ưu điểm của chủng Mut+ để biểu thị so với các chủng thiếu hụt AOX là tỷ lệ phát triển trong Methanol (và sản xuất protein ngoại lai) nhanh hơn nhiều. Tuy nhiên, nồng độ Methanol phải đ−ợc kiểm soát chặt chẽ. Chủng Muts Chủng Muts (loại bỏ - AOX1) có thể nhân lên trong quá trình chuyển nạp bằng cách thay thế gen khi gen AOX1 đ−ợc thay thế bởi bộ biểu thị. Nói một cách khác, một chủng P. pastoris nh− KM71 có chứa gen AOX1 bị rối loạn có thể sử dụng làm tế bào chủ với vector biểu thị đ−ợc gài đặt vào. Nh− đã nêu trên, chủng này phát triển chậm trong Methanol do quá trình ôxy hoá r−ợu nhờ cậy vào gen AOX2. Chiến l−ợc lên men cho chủng Muts cũng nh− với chủng Mut+, trừ tỷ lệ Methanol nuôi thấp để duy trì Methanol ở hàm l−ợng 0,2 đến 0,8% trong nồi lên men. Một −u điểm của chủng Muts là nuôi cấy không nhậy cảm lắm với Methanol tồn d− trong môi tr−ờng nồi lên men so với chủng Mut+ và vì vậy qui trình có thể mở rộng dễ dàng. Một chiến l−ợc gây cảm ứng khác cho chủng Muts là sử dụng hỗn hợp nuôi Glycerol : Methanol. Brierley et al. nghiên cứu tỷ lệ nuôi 4:1 và 2:1 (g Glycerol/h : g Methanol/h). Họ cũng mô tả chiến l−ợc nuôi hỗn hợp với tỷ lệ bắt đầu là 2:1, và tăng l−ợng Methanol nuôi dần cho đến khi Methanol đ−ợc tích lũy. Tỷ lệ sử 28
36. Ch−ơng II Vật liệu và ph−ơng pháp 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 1.1. Chủng sản xuất Chủng sản xuất KM71-47-1 có nguồn gốc từ dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mã hóa sinh tổng hợp kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B (HBsAg) tái tổ hợp do Viện VSDTTƯ nghiên cứu và sản xuất. Từ ngân hàng gốc giống (MCB), chủng đ−ợc cấy chuyển một lần trên thạch đĩa YPD/Zeocin rồi nhân lên trong môi tr−ờng YPD. Lắc ủ ở nhiệt độ 30oC qua đêm, thêm Glycerol theo tỷ lệ 1:1, bảo quản -90oC để có chủng sản xuất (WSV). 1.2. Môi tr−ờng 1.2.1. Đệm ly giải x 10 Na2HPO4. 2H2O : 27,82 g NaH2PO4 : 10,446 g EDTA : 37,21 g Tween 20 : 15 ml N−ớc cất vđ : 1000 ml pH = 7,0-7,5 Hòa tan lần l−ợt Na2HPO4. 2H2O, NaH2PO4, EDTA trong 500 ml n−ớc cất. Cho tiếp 15 ml Tween 20. Khuấy cho tan hoàn toàn. Thêm n−ớc cất vừa đủ 1000ml. Dung dịch đệm ly giải x 10 đ−ợc pha loãng 10 lần trong n−ớc cất tr−ớc khi sử dụng. 1.2.2. Đệm Potassium phosphate 1M Dung dịch 1: K2HPO4 1M : 26,1 g trong 150 ml Dung dịch 2: KH2PO4 1M : 122,4 g trong 900 ml Pha 132 ml dung dịch 1 trong 868 ml dung dịch 2. Chỉnh pH = 6. 1.2.3. Môi tr−ờng canh thang YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose ) Yeast extract : 1 g Casaminoacid : 2 g Dextrose : 2 g N−ớc cất vđ : 100 ml * Dung dịch mẹ D x10 ( 20% Dextrose ) : Hòa tan 200 g D-glucose trong 1000 ml n−ớc cất. Sấy 120oC / 15 phút . 31
37. Làm tan 1 g Yeast extract , 2 g Casaminocid trong 90 ml n−ớc cất. Sấy vô trùng 120oC / 20 phút. Thêm 10 ml dung dịch mẹ D x10. Chia vào 2 bình tam giác, mỗi bình 50 ml. 1.2.4. Môi tr−ờng thạch YPD/ Zeocin Yeast extract : 0,5 g Casaminoacid : 1 g Dextrose : 1 g Agar : 1 g Zeocin (100 àg/ ml) : 50 àl N−ớc cất vđ : 50 ml Hòa tan 0,5 g Yeast extract , 1 g Casaminoacid trong 40 ml n−ớc. Thêm 1 g Agar. Cho n−ớc cất vừa đủ 50 ml. Sấy vô trùng 120oC / 20 phút. Để nguội khoảng 60oC thì thêm 10 ml D x10 và 50 àl Zeocin (100 àg/ ml). Đổ 2 đĩa petri. 1.2.5. Môi tr−ờng BMGY ( Buffered Glycerol – complex Medium) * Cho nồi lên men 2 lít: Yeast extract : 15 g Casaminoacid : 30 g Yeast nitrogen base (YNB) : 20,1 g Đệm Potassium phosphate 1M : 150 ml Glycerol : 30 ml N−ớc cất vđ : 1500 ml Lấy 30 ml, chia vào 2 ống nghiệm để lắc cặn. Sấy vô trùng 120oC/ 20 phút. Tr−ớc khi cấy, thêm 3 ml B x500 và 1 ml Antifoam. * Cho nồi lên men 10 lít: Yeast extract : 60 g Casaminoacid : 120 g YNB : 80,4 g Đệm Potassium phosphate 1M : 600 ml Glycerol : 120 ml N−ớc cất vđ : 6000 ml Sấy vô trùng 120oC/ 20 phút . Tr−ớc khi cấy, thêm 14 ml B x500 và 2 ml Antifoam. 1.2.6. BMMY x 10 ( Buffered Methanol- complex Medium ) Yeast extract : 32 g Casaminoacid : 64 g Yeast nitrogen base (YNB) : 42,88 g Đệm Potassium phosphate 1M : 320 ml 32
38. Đun nóng cho tan. Chia đều vào 4 chai. Sau khi sấy 120oC/20 phút, để nguội, thêm vào mỗi chai 1,6 ml B x500 và 320 ml Methanol (50%). 1.2.7. Đệm Borax 0,01M Na2B4O7 (Borax) : 10.061 g Sodium deoxycholate : 12,5 g N−ớc cất vđ : 5000 ml Hòa tan Borax trong 4000 ml n−ớc cất. Cho tiếp Sodium deoxycholate vào, khuấy cho tan hoàn toàn. Thêm n−ớc cất vừa đủ 5000 ml. 1.2.8. B x500 20 mg Biotin hòa tan trong 100 ml n−ớc cất. Lọc vô trùng. 1.2.9. NH4OH Lọc vô trùng. 1.3. Cấy chủng Từ chủng sản xuất, lấy 1 loop ở đầu que cấy, ria lên đĩa thạch YPD /zeocin. ủ 30oC- 72 giờ. 1.4. Nhân chủng Chọn khuẩn lạc từ đĩa thạch và cấy mỗi khuẩn lạc vào 50 ml môi tr−ờng YPD trong bình tam giác ( nhân chủng trong 2 bình tam giác). Lắc với tốc độ o 200 v/p, ở nhiệt độ 30 C- 40 giờ. Đo OD600 để kiểm tra đậm độ chủng và kiểm tra độ thuần khiết bằng nhuộm soi kính hiển vi. Ly tâm 4500 v/p - 10 phút, loại n−ớc nổi. Cặn đ−ợc hòa đều trong 30 ml môi tr−ờng BMGY rồi cấy chuyển vào nồi lên men 2 lít với thể tích môi tr−ờng BMGY là 1500 ml. Khuâý với tốc độ 300 v/p, ở o nhiệt độ 30 C- 48 giờ. Kiểm tra quá trình nhân lên bằng cách đo OD600 sau 24 giờ và sau mỗi 2 giờ ở ngày thứ hai. Kiểm tra độ thuần khiết bằng nhuộm soi kính hiển vi. Chủng tiếp tục đ−ợc nhân lên trong nồi lên men 10 lít với thể tích môi tr−ờng BMGY là 6000 ml bằng cách cấy chuyển từ nồi lên men 2 lít sang. Khuâý o với tốc độ 300 v/p, ủ 30 C- 30 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết và đo OD600 để theo dõi quá trình nhân lên. Chỉnh pH= 6,5 bằng NH4OH sau 7 giờ nuôi cấy. 1.5. Biến nạp nội bào Sử dụng Methanol là nguồn cácbon để biến nạp nội bào. Thêm 80 ml môi tr−ờng BMMY x10 và 16 ml B x500 vào nồi lên men 10 lít . Cứ sau 6 giờ bổ sung 80 ml Methanol 50% và sau 24 giờ bổ sung 80 ml môi tr−ờng BMMY x10 với 16 ml B x500. Luôn luôn giữ pH= 6,5 – 7 bằng NH4OH và DO= 30% bằng o hệ thống bơm khí. Liên tục khuâý với tốc độ 300 v/p, ủ 30 C- 72 giờ. Đo OD600 để theo dõi quá trình nhân lên và biến nạp sau mỗi 6 giờ. 33
39. 1.6. Gặt tế bào Tr−ớc khi gặt, đo OD600 và nhuộm soi kính hiển vi để kiểm tra độ thuần khiết. Ly tâm 4500 v/p trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ n−ớc nổi. Rửa cặn 4 lần bằng dung dịch đệm ly giải. Cân trọng l−ợng cặn và bảo quản ở –70oC . 1.7. Tách chiết HBsAg 1.7.1. Vỡ tế bào Tế bào nấm men đ−ợc phá vỡ bằng bi thủy tinh và đệm ly giải. Sử dụng máy phá để làm vỡ tế bào và hệ thống CO2 để giữ lạnh. Tốc độ khuấy nghiền 10 000 v/p, nhiệt độ 4oC- 10 phút. Nghỉ 10 phút giữa mỗi lần làm phá vỡ. Nhuộm soi kính hiển vi để kiểm tra tế bào vỡ. 1.7.2. Rửa tế bào và cô đặc. Rửa bi thủy tinh và tách HBsAg ra khỏi màng tế bào bằng đệm ly giải. Rửa cặn và ly tâm nhiều lần, 4500 v/p- 30 phút- 4oC, lấy n−ớc nổi. Kiểm tra n−ớc nổi bằng ELISA đến khi không còn HBsAg thì thôi. Chú ý luôn luôn giữ lạnh. Cô đặc n−ớc nổi bằng ph−ơng pháp siêu lọc Milipore Minitan với màng lọc Pellicon cassette M.W.100 000. 1.7.3. Tách hạt HBsAg Dùng ph−ơng pháp siêu âm với chu kỳ 0,3 vòng/giây, công suất 200, thời gian 5 phút để tách hạt HBsAg. 1.8. Tinh chế HBsAg 1.8.1. Hấp phụ aerosil Tỷ lệ giữa chất hấp phụ aerosil 380 và mẫu là 40 g/1000 ml. Rửa aerosil 380 bằng n−ớc cất (2 lần). Cho mẫu từ từ vào gel, khuâý nhẹ nhàng cho tan đều. ủ, lắc nhẹ 120 v/p- 37oC- 4giờ. Ly tâm 4500 v/p- 20oC-15 phút, loại n−ớc nổi. Rửa gel bằng n−ớc muối sinh lý nhiều lần cho đến khi đo OD280≤ 0,4. 1.8.2. Phản hấp Dùng đệm Borax 0,01M để phản hấp HBsAg ra khỏi gel aerosil. Phản hấp 4 lần, mỗi lần ở điều kiện 56oC- 3giờ, lắc nhẹ 120 v/p. Ly tâm 4500 v/p- 20oC- 15 phút sau mỗi lần phản hấp. Kiểm tra HBsAg trong n−ớc nổi ở lần phản hấp cuối cùng. Tổng thể tích n−ớc nổi đ−ợc cô đặc bằng Pellicon cassette. 1.8.3. Tách hạt HBsAg Dùng ph−ơng pháp siêu âm với chu kỳ 0,3 vòng/giây, công suất 200, thời gian 5 phút để tách hạt HBsAg. 34
40. 1.8.4. Tinh chế HBsAg đ−ợc tinh khiết bằng 2 lần siêu ly tâm phân vùng trong dung dịch KBr gradient (1,3 và 1,32 g/cm3) với tốc độ 25 000 v/p-24h-20oC, 1 lần trong dung dịch CsCl (1,3 và 1,32 g/cm3) với tốc độ 25 000 v/p-19h-10oC và 1 lần trong dung dịch gradient sucrose (10-20-30-40%) với tốc độ 25 000 v/p-19h-10oC. Các phân đoạn đ−ợc kiểm tra HBsAg bằng phản ứng ELISA với qui trình ủ ngắn 30’- 30’-15’. Các phân đoạn d−ơng tính cao đ−ợc thu thập cho lần siêu ly tâm sau hoặc để bất hoạt sau lần siêu ly tâm cuối cùng. 1.9. Bất hoạt virút Bất hoạt bằng Formaldehyt 1/2000 ở 37oC trong 96 h. 1.10. Pha chế vắcxin - Cô đặc và thẩm tích bằng Amicon cassette. - Lấy mẫu để kiểm tra độ tinh sạch kháng nguyên bằng điện di trên gel Polyacrylamid, PCR và hình ảnh kính hiển vi điện tử. - Định l−ợng HBsAg bằng ph−ơng pháp đo mật độ quang và ELISA. - Định l−ợng protein bằng ph−ơng pháp Lowry - Pha chế vắcxin: Vắcxin viêm gan B có hàm l−ợng HBsAg = 20 àg/ml, đ−ợc hấp phụ lên gel Al(OH)3. HBsAg tinh khiết đ−ợc pha loãng trong dung dịch đệm (có chứa NaCl và CH3COONa). Lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 àm. Thêm chất hấp phụ Al(OH)3 đến nồng độ cuối = 300 àg/ml. Hàm l−ợng HBsAg cuối cùng trong vắcxin là 20 àg/ml. Merthiolat là chất bảo quản với hàm l−ợng là 0,005%. Lắc đều các chai vắcxin trong vòng 1 tuần, mỗi ngày 2 lần. - Đóng lọ, dán nhãn, đóng gói. 1.11. So sánh qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã đ−ợc hoàn thiện với qui trình sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm Xem sơ đồ so sánh. 35
41. Sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất Sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đ∙ hoàn thiện ở qui mô phòng thí nghiệm Ngân hàng tế bào sản xuất nấm men (MCB) Ngân hàng tế bào sản xuất nấm men (MCB) ↓ ↓ Thạch đĩa YPD/Zeocin – 72 giờ - 30oC Thạch đĩa YPD/Zeocin – 48 giờ - 30oC ↓ ↓ Nuôi cấy trong canh thang (YPD) Nuôi cấy trong canh thang (BMGY) 40 giờ - 30oC- 200v/p 48 giờ - 30oC- 200v/p ↓ ↓ Nhân chủng trong nồi lên men 2 lít (BMGY) Nhân chủng trong nồi lên men 2 lít (BMGY) 48 giờ - 30oC- 300v/p 48 giờ - 30oC- 300v/p ↓ ↓ Nhân chủng trong nồi lên men 10 lít (BMGY) Nhân chủng trong nồi lên men 10 lít (BMGY) 30 giờ - 30oC- 300v/p 24 giờ - 30oC- 300v/p ↓ Methanol ↓ Methanol Biến nạp trong nồi lên men 10 lít (BMMY) Biến nạp trong nồi lên men 10 lít (BMMY) 72 giờ - 30oC- 300v/p 72 giờ - 30oC- 300v/p ↓ ↓ Gặt sinh khối Gặt sinh khối Ly tâm 4 500 v/p - 5 phút - 4oC Ly tâm 4 500 v/p - 30 phút - 10oC ↓ ↓ Phá và ly giải tế bào nấm men Phá và ly giải tế bào nấm men ↓ ↓ Ly tâm 4 500 v/p – 1 giờ - 4oC Ly tâm 14 000 v/p – 1 giờ - 4oC Loại bỏ cặn Loại bỏ cặn ↓ ↓ Hấp phụ Aerosil – 4 giờ - 37oC Hấp phụ Aerosil – 4 giờ - 37oC ↓ ↓ Phản hấp bằng đệm Borax – 3 giờ - 56oC Phản hấp bằng đệm Borax – 3 giờ - 56oC ↓ ↓ Siêu ly tâm trong dung dịch gradient KBr Siêu ly tâm trong dung dịch gradient KBr 25000 v/p - 24 giờ - 20OC ( 2 lần ) 25000 v/p - 24 giờ - 20OC ( 2 lần ) ↓ ↓ Siêu ly tâm trong dung dịch CsCl Siêu ly tâm trong dung dịch CsCl 25000 v/p - 19 giờ - 10OC ( 1 lần ) 25000 v/p - 19 giờ - 10OC ( 1 lần ) ↓ ↓ Siêu ly tâm rate zonal sucrose Siêu ly tâm rate zonal sucrose 25 000 v/p - 19 giờ - 10OC ( 1 lần ) 25 000 v/p - 19 giờ - 10OC ( 1 lần ) ↓ ↓ Bất hoạt bằng Formaldehyt Bất hoạt bằng Formaldehyt 1/2000 - 37OC - 96 giờ 1/2000 - 37OC - 96 giờ ↓ ↓ Cô đặc + thẩm tích bằng Pellicon cassette Cô đặc + thẩm tích bằng Pellicon cassette ↓ ↓ 36
42. ↓ ↓ Định l−ợng protein và HBsAg Định l−ợng protein và HBsAg Kiểm tra độ tinh khiết( SDS-PAGE ) Kiểm tra độ tinh khiết( SDS-PAGE ) Kiểm tra hình thái học ( kính hiển vi điện tử ) Kiểm tra hình thái học ( kính hiển vi điện tử ) Kiểm tra ADN tồn d− của plasmid ( PCR ) Kiểm tra ADN tồn d− của plasmid ( PCR ) ↓ ↓ Lọc vô trùng và pha vắcxin Lọc vô trùng và pha vắcxin Hàm l−ợng HBsAg = 20 àg/ml đ−ợc Hàm l−ợng HBsAg = 20 àg/ml đ−ợc hấp phụ với Al(OH)3 hấp phụ với Al(OH)3 2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam Các loạt vắcxin viêm gan B tái tổ hợp do Việt Nam sản xuất đều đ−ợc kiểm tra chất l−ợng về các mặt: vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt và các thành phần hóa học. Tiêu chuẩn quốc gia cho vắcxin viêm gan B đ−ợc xây dựng dựa trên tính ổn định về chất l−ợng của vắcxin giữa các loạt sản xuất, có so sánh với tiêu chuẩn của TCYTTG 2.1. An toàn chung Trên chuột lang Chuột lang dùng để kiểm tra cân nặng khoảng 300-350 g, không có các biểu hiện bệnh lý, khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 2 chuột lang để kiểm tra. Tiêm 5 ml vắcxin đ−ờng màng bụng cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 7 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng. Trên chuột nhắt Chuột nhắt dùng để kiểm tra là 5 tuần tuổi, không có các biểu hiện bệnh lý, tăng trọng bình th−ờng trong thời gian cách ly ít nhất là 5 ngày. Mỗi thử nghiệm dùng 2 chuột để kiểm tra. Tiêm 0,5 ml đ−ờng màng bụng cho mỗi chuột và theo dõi trong thời gian ít nhất là 7 ngày. Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu chuột khoẻ mạnh và tăng trọng bình th−ờng. 2.2. Kiểm tra vô khuẩn Cấy 10 ml mẫu cấy vào 5 ống môi tr−ờng Thioglycolat (20 ml) và 5 ống môi tr−ờng Soybean pepton (10 ml), mỗi ống 1 ml mẫu. Môi tr−ờng Thioglycolat để ở nhiệt độ 35-37oC và Soybean ở nhiệt độ 20-22oC, theo dõi trong thời gian 14 ngày. Không đ−ợc phát hiện thấy nấm và tạp khuẩn phát triển trong các ống môi tr−ờng trong suốt thời gian theo dõi. 37
43. 2.3. Xác định hàm l−ợng HBsAg Ph−ơng pháp đo trên quang phổ kế. OD280/3,726 = hàm l−ợng HBsAg có trong mẫu. Hàm l−ợng HBsAg đặc hiệu có trong protein toàn phần đ−ợc xác định bằng ph−ơng pháp ELISA (Diagnostic Pasteur) theo h−ớng dẫn của nhà sản xuất. 2.4. Kiểm tra chất gây sốt Mỗi loạt thành phẩm cuối cùng đ−ợc kiểm tra chất gây sốt trên thỏ. Dùng thỏ có cân nặng ít nhất là 1,5kg. Những thỏ đã dùng rồi có thể dùng lại sau 3 ngày hoặc hơn kể từ lần thử nghiệm tr−ớc, trừ những thỏ có phản ứng d−ơng tính ở thử nghiệm tr−ớc hoặc dùng lại để tiêm cùng một loại sản phẩm nh− thử nghiệm tr−ớc. Không dùng thỏ có thân nhiệt > 39,8oC. Cách ly thỏ 2 ngày tr−ớc khi thử nghiệm ở nhiệt độ 20-25oC. Nhiệt kế dùng để đo thân nhiệt phải có độ chia tới 0,1oC. Bơm kim tiêm phải khử trùng ở 250oC trong ít nhất 30 phút tr−ớc khi dùng. Không cho thỏ ăn mà chỉ cho uống n−ớc trong vòng 16 giờ tr−ớc khi tiêm và cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Không nên giữ thỏ chặt quá. Đ−a nhiệt kế hoặc một dụng cụ ghi nhiệt độ nào khác vào hậu môn thỏ với độ sâu cố định từ 6-9 cm. Đọc nhiệt độ sau thời gian cần thiết. Nhiệt độ “ban đầu” của thỏ đo khoảng 15 phút tr−ớc khi tiêm mẫu. Mẫu thử nghiệm phải làm ấm lên 37oC và tiêm vào tĩnh mạch tai 1 ml/kg trọng l−ợng. Ghi và đọc nhiệt độ ít nhất 3 lần trong vòng 3 giờ với khoảng cách giữa 2 lần không quá 60 phút. Nhiệt độ cao nhất của thỏ đ−ợc ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiêm đ−ợc coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ tối đa đ−ợc coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là âm tính, thì phản ứng đ−ợc đọc là 0. Thử nghiệm phải đ−ợc tiến hành lần đầu trên 3 thỏ và kết quả đ−ợc nhận định theo bảng d−ới đây. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa các cột 3 và 4 thì thử nghiệm phải tiến hành lại trên một nhóm 3 thỏ khác và tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ đ−ợc nhận định theo bảng. Không tiến hành lại thử nghiệm với hơn 3 nhóm thỏ. Bảng 1: Tiêu chuẩn kiểm tra chất gây sốt Thử Tổng số Thử nghiêm đạt nếu Thử nghiệm không đạt nghiệm thỏ tổng nhiệt độ không yêu cầu nếu tổng nhiệt số tích lũy quá độ quá 1 3 1o3 2o4 2 6 3o0 4o1 3 9 4o9 4o9 2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 Hàm l−ợng nhôm có trong mẫu thử đ−ợc xác định bằng cách đo mầu của phản ứng với thuốc thử Stilbazơ. Thử nghiệm đ−ợc tiến hành sau khi muối nhôm 38
44. không tan có trong mẫu thử đ−ợc làm tan hoàn toàn. Lắc mẫu kiểm tra thật kỹ thành một hỗn dịch đồng nhất. Lấy chính xác 1 ml hỗn dịch mẫu thử, thêm 0,2 ml axít Nitric đậm đặc, đun sôi hỗn dịch cho đến lúc tan hoàn toàn, sau đó pha loãng mẫu kiểm tra bằng n−ớc để có đ−ợc một dung dịch pha loãng có hàm l−ợng nhôm không quá 4 àg/ml (pha loãng 25 và 50 lần). Pha loãng dung dịch nhôm chuẩn 0,1% (trọng l−ợng/thể tích) trong n−ớc để có đ−ợc dung dịch chuẩn có hàm l−ợng 2 àg/ml (pha loãng 500 lần). Mẫu kiểm tra lấy : 1 ml (pha loãng 25 lần) và 1 ml (pha loãng 50 lần). Dung dịch chuẩn : 1 - 2 - 3 - 4 – 5 ml (t−ơng đ−ơng 2 - 4 - 6 - 8 – 10 àg). Thêm n−ớc cất vừa đủ 5 ml + 10 ml dung dịch đệm Acetat 1M + 5 ml thuốc thử Stilbazơ và n−ớc cất vừa đủ 25 ml. Để nhiệt độ phòng 20 phút. Đo mẫu ở b−ớc sóng 510 nm. Song song tiến hành kiểm tra với mẫu trắng là 1 ml n−ớc cất. Hàm l−ợng nhôm có trong mẫu đ−ợc xác định theo đ−ờng chuẩn. Tiêu chuẩn chấp thuận : Al+++ ≤ 1250 àg/ml . 2.6. Kiểm tra hàm l−ợng Merthiolat Ph−ơng pháp xác định Merthiolat dựa trên nguyên lý Merthiolat phản ứng với Ditizon và tạo thành một phức chất có độ hấp phụ cực đại ở 480 nm. Lấy 1 ml mẫu kiểm tra vào một bình nón thủy tinh 200 ml và các bình nón khác lấy 1 - 2 - 3 - 4 - 6 ml dung dịch Merthiolat chuẩn có hàm l−ợng 25 àg/ml. Thêm 10 ml dung dịch axít Sulfuric 3% và 10 ml dung dịch Ditizon trong Chloroform có hàm l−ợng 30 mg/l, lắc mạnh trong 2 phút, sau đó để lắng và hút bỏ phần n−ớc nổi, thêm 10 ml n−ớc Ammoniac, lắc trong 30 giây, tách phần Carbon tetrachlorit, lọc qua giấy lọc. Đo mầu ở b−ớc sóng 480 nm. Song song tiến hành thí nghiệm với mẫu trắng là 1 ml n−ớc cất. Hàm l−ợng Merthiolat có trong mẫu thử đ−ợc xác định theo đ−ờng chuẩn. Tiêu chuẩn chấp thuận : Merthiolat ≤ 0,02%. 2.7. Kiểm tra hàm l−ợng Formaldehyt Hàm l−ợng Formaldehyt có trong mẫu đ−ợc xác định bằng cách đo c−ờng độ mầu của 3,5 Diacetyl-1,4-dihydrolutidin tạo ra trong phản ứng với Acetylaceton với sự có mặt của muối Ammoniac thừa ở điều kiện phản ứng axít nhẹ. Lấy 0,5 ml mẫu thử và 0,5 - 1 - 2 - 3 - 5 ml dung dịch mẫu chuẩn Formaldehyt 0,01% (100 àg/ml) t−ơng ứng với 5 - 10 - 20 - 30 – 40 àg. Thêm n−ớc cất vừa đủ 10 ml + 4 ml dung dịch đệm Acetat + 4 ml dung dịch Acetylaceton. ủ 15 phút ở 60oC trong nồi cách thủy (trong tr−ờng hợp dùng Hexamethylen tetramin làm dung dịch chuẩn thì phải ủ ở 100oC trong nồi cách thủy). Làm nguội 5 phút trong đá lạnh. Để chính xác 20 phút ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở 410/415 nm (tr−ớc khi đo máy, lọc mẫu qua giấy lọc hoặc ly tâm 10 phút ở tốc độ 5 000 v/p). Tiêu chuẩn chấp thuận : Formaldehyt ≤ 0,012 g%. 39
45. 2.8. Kiểm tra hàm l−ợng protein toàn phần Thêm 1 ml dung dịch axít Trichloracetic 10% (TCA) vào một ống nghiệm có 1 ml mẫu thử. Đun nóng 80oC trong nồi cách thủy - 15 phút. Làm nguội, sau đó thêm 1 ml Al(OH)3, lắc đều. Ly tâm 3 500 v/p - 30 phút, bỏ n−ớc nổi (có thể lặp lại b−ớc này nếu cần thiết). Thêm 2,5 ml dung dịch Alkalin vào mỗi ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ phòng (25oC) qua đêm. Thêm 2,5 ml n−ớc cất + 0,5 ml thuốc thử Folin (pha loãng 1/2), ủ 37oC - 10 phút. Ly tâm 3 500 v/p - 30 phút. Đo mật độ quang ở b−ớc sóng 750 nm. Song song tiến hành dựng đ−ờng chuẩn với dung dịch mẫu (dung dịch Albumin chuẩn ở các nồng độ 25 - 50 – 100 àg/ml). Dựng đ−ờng chuẩn. Dựa vào hàm l−ợng protein tìm đ−ợc trên đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng protein có trong mẫu thử. Song song tiến hành thử nghiệm với mẫu trắng, thay vào 1 ml dung dịch mẫu thử nghiệm là 1 ml n−ớc cất. 2.9. Kiểm tra công hiệu Công hiệu của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đ−ợc tiến hành kiểm tra cùng với mẫu chuẩn theo ph−ơng pháp thử nghiệm song song. Vắcxin kiểm tra và vắcxin mẫu đem pha loãng ở các độ pha 1: 20 - 1: 40 - 1: 80 - 1:160 trong n−ớc muối sinh lý. Mỗi độ pha tiêm 1 ml d−ới da l−ng cho 16 chuột BALB/C 5 tuần tuổi . Toàn bộ chuột đ−ợc nuôi và theo dõi trong 28 ngày. Sau đó lấy máu riêng từng chuột vô trùng. Tách huyết thanh và tiến hành kiểm tra hiệu giá kháng thể anti-HBs có trong máu từng chuột bằng ph−ơng pháp ELISA. Kết quả đ−ợc tính theo ch−ơng trình phân tích “STAT-PROBIT”. Công hiệu của vắcxin tính theo liều ED50. Tiêu chuẩn chấp thuận : ED50 của vắcxin thử nghiệm phải t−ơng đ−ơng với ED50 của vắcxin mẫu. 2.10. Thử nghiệm nhận dạng Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp tr−ớc khi xuất x−ởng phải đ−ợc tiến hành thử nghiệm nhận dạng. Lấy 1 ml vắcxin viêm gan B, thêm vào đó 4 ml dung dịch A (gồm dung dịch Na citrat 10% và Disodium monohydrophosphat 10% tỷ lệ 1 : 1, sau đó thêm BSA sao cho có nồng độ cuối là 0,2%). ủ trong nồi cách thủy 37oC – 1giờ. Ly tâm 4 000v/p - 30 phút. Lấy n−ớc nổi làm phản ứng ELISA để xác định sự có mặt của HBsAg trong vắcxin. Tiêu chuẩn chấp thuận : HBsAg - d−ơng tính. 3. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng 3.1. Đối t−ợng nghiên cứu - Trẻ em độ tuổi từ 3 đến 6 tuổi ở 3 xã Thiệu Long, Thiệu H−ng, Thiệu Hợp- huyện Thiệu Hóa- tỉnh Thanh Hóa ch−a từng đ−ợc tiêm vắcxin viêm gan B, khoẻ mạnh, không mắc bệnh tật tại thời điểm nghiên cứu, bố mẹ đồng ý cho con tham gia sau khi đ−ợc thông tin đầy đủ về cuộc nghiên cứu. 40
46. - Từ 700 trẻ em khoẻ mạnh, sau khi sàng lọc huyết thanh học không mang dấu ấn viêm gan B, 549 trẻ em đạt tiêu chuẩn đ−ợc chia thành hai nhóm : + Nhóm chứng: 230 trẻ, tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp (r-HBvax), do Hàn Quốc sản xuất. + Nhóm nghiên cứu: 319 trẻ, tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp (RecomBvax) do Công ty VABIOTECH sản xuất. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ cần thiết - Phiếu điều tra cá nhân về các đặc tr−ng cá nhân về tiền sử (phụ lục). - Dụng cụ lấy máu: bơm và kim tiêm loại 5 ml dùng 1 lần để lấy máu tĩnh mạch, bông , cồn 70 0, dây garo, ống nghiệm - Dụng cụ tách chiết, bảo quản, xét nghiệm huyết thanh. . ống Eppendof để đựng huyết thanh. . Pipetman các loại 20 àl, 200 àl, 1000àl. . Máy ly tâm, tủ lạnh, tủ âm sâu để bảo quản huyết thanh. . Máy đọc ELISA của hãng Sanofi - Pháp. 3.2.2. Vắcxin phòng viêm gan B - Vắcxin thử nghiệm: Vắcxin tái tổ hợp RecomBvax. Loạt sản xuất: 011103 Hàm l−ợng kháng nguyên: 20 àg/ml Hạn dùng: 11/2006 Đã đ−ợc TTKĐQG kiểm định và cấp giấy phép l−u hành. - Vắcxin chứng: Vắcxin tái tổ hợp r-HBvax. Loạt sản xuất: 021003R Hàm l−ợng kháng nguyên: 20 àg/ml Hạn dùng: 10/2006 Đã đ−ợc TTKĐQG kiểm định và cấp giấy phép l−u hành. 3.2.3. Các sinh phẩm để phát hiện các dấu ấn viêm gan B và định l−ợng hiệu giá kháng thể anti-HBs - Bộ sinh phẩm phát hiện HBsAg của hãng Bio-Rad (Pháp). - Bộ sinh phẩm phát hiện và định l−ợng hiệu giá anti-HBs của hãng Bio- Rad (Pháp). - Bộ sinh phẩm phát hiện anti-HBc của hãng Bio-Rad (Pháp). 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu Tiến hành thực nghiệm lâm sàng tại thực địa kết hợp với xét nghiệm phòng thí nghiệm theo ph−ơng pháp mù kép. 41
47. Để cho việc đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin RecomBvax đ−ợc khách quan, hai loại vắcxin mẫu và chứng đ−ợc mã hóa theo chữ cái (theo màu nhãn vắcxin): vắcxin RecomBvax gọi là vắcxin T và vắcxin r-HBvax gọi là vắcxin X. Dùng ph−ơng pháp ngẫu nhiên hai lần mù để phân trẻ vào hai nhóm tiêm vắcxin T và vắcxin X. Ng−ời tiêm, ng−ời theo dõi phản ứng phụ, ng−ời làm xét nghiệm huyết thanh trong phòng thí nghiệm đều không đ−ợc biết đối t−ợng nghiên cứu tiêm loại vắcxin nào. Ngày lấy máu cũng đ−ợc mã hóa tr−ớc khi gửi đến phòng thí nghiệm. Dùng ph−ơng pháp ngẫu nhiên chẵn lẻ để chia trẻ vào hai nhóm tiêm. Chỉ đến khi có kết quả cuối cùng mới giải mã. 3.3.1.Điều tra huyết thanh học - Lấy 3 ml máu tĩnh mạch tr−ớc khi tiêm vắcxin ở cả 2 nhóm. Xác định dấu ấn virút viêm gan B, chọn ra các đối t−ợng có HBsAg, anti-HBs, anti-HBc âm tính. - Phỏng vấn, điều tra thông tin về tình trạng nhiễm HBV (xem phụ lục). 3.3.2.Ph−ơng pháp tiêm, liều tiêm, lịch tiêm - Tiêm bắp vùng cơ Delta. - Liều tiêm:10 àg/1 mũi/ trẻ em. - Lịch tiêm: 3 mũi theo phác đồ 0 - 1- 2. 3.3.3. Ph−ơng pháp thu thập huyết thanh Lấy máu nền tr−ớc khi tiêm vắcxin, và lấy máu 1 tháng sau tiêm mũi 3. Mỗi lần lấy 3 ml máu tĩnh mạch, sau đó tách huyết thanh, xét nghiệm để kiểm tra các dấu ấn huyết thanh học. 3.3.4. Ph−ơng pháp đánh giá tính an toàn Theo dõi các triệu chứng tại chỗ, toàn thân sau 15 phút và hàng ngày (trong 15 ngày) theo hai mẫu biểu h−ớng dẫn của TCYTTG (phụ lục). 3.3.5. Ph−ơng pháp đánh giá tính đáp ứng miễn dịch - Xác định tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh sau khi tiêm đủ 3 mũi vắcxin . - Xác định hiệu giá trung bình nhân (GMT) của anti-HBs ở các nhóm sau khi tiêm đủ 3 mũi vắcxin. n GMT = X 1 X 2 X 3 Κ X n Mức đáp ứng miễn dịch bảo vệ: anti - HBs > 10 mIU/ml. Mức đáp ứng miễn dịch cao: anti - HBs > 100 mIU/ml. Mức đáp ứng miễn dịch rất cao: anti - HBs > 1000 mIU/ml. 3.3.6. Các kỹ thuật phát hiện các dấu ấn của virút viêm gan B - Phát hiện HBsAg, anti-HBs, anti-HBc bằng kỹ thuật ELISA. - Định l−ợng hiệu giá anti-HBs bằng kỹ thuật ELISA. 42
48. 3.3.6.1. Xác định kháng nguyên bề mặt HBsAg bằng ph−ơng pháp ELISA Nguyên lý: Bộ sinh phẩm chẩn đoán HBsAg của Hãng BIORAD-SANOFI (Pháp) dựa trên nguyên lý của thử nghiệm miễn dịch gắn men theo ph−ơng pháp "cặp chả" với việc sử dụng 3 kháng thể đơn dòng kháng HBsAg chọn lọc có khả năng gắn với nhau và gắn với nhiều phân typ khác nhau của HBsAg. Trên các giếng đã đ−ợc gắn kháng thể đơn dòng anti-HBs gắn với Peroxidaza vào các giếng. Sau thời gian ủ kháng nguyên HBsAg trong mẫu huyết thanh sẽ gắn với kháng thể anti-HBs đã đ−ợc gắn trên phiến. Đồng thời xảy ra phản ứng giữa kháng thể - kháng nguyên đã hình thành. Sau khi hút bỏ các chất không gắn và rửa sạch các phiến, thêm dung dịch đệm cơ chất TMB có chứa Hydrogen peroxid vào các giếng. Mầu xanh sẽ xuất hiện trên các giếng có HBsAg d−ơng tính. 3.3.6.2. Xác định kháng thể (KT) anti-HBs bằng ph−ơng pháp ELISA Nguyên lý: Bộ sinh phẩm chẩn đoán anti-HBs 3.0 của Hãng BIORAD- SANOFI (Pháp), dựa trên nguyên lý của các thử nghiệm miễn dịch gắn men theo ph−ơng pháp "cặp chả" nhằm phát hiện anti-HBs trong huyết thanh ng−ời. Giai đoạn đầu tất cả các kháng thể anti-HBs nếu có trong mẫu huyết thanh sẽ gắn với kháng nguyên HBsAg tinh khiết của phân týp ad và ay đã đ−ợc gắn trên phiến. Sau khi rửa sạch và loại bỏ các protein không gắn, thêm dung dịch cộng hợp (kháng nguyên HBsAg tinh khiết đã đ−ợc Biotin hoá và Peroxidaza gắn Streptavidin) vào các giếng sẽ phản ứng với phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Sau khi rửa để loại bỏ những cộng hợp không gắn, dung dịch cơ chất TBM có chứa Hydrogen peroxid đ−ợc gắn thêm vào các giếng. Màu xanh sẽ xuất hiện trên các giếng có mẫu anti-HBs d−ơng tính. 3.3.6.3. Xác định kháng thể anti-HBc bằng ph−ơng pháp ELISA Nguyên lý: Mẫu thử và cộng hợp đ−ợc cho vào giếng gắn HBcAg. Kết quả tạo thành phức hợp HBcAg -anti-HBc peroxidaza. Sau khi rửa để loại bỏ những chất không gắn, mẫu thử đ−ợc ủ với chất hiện mầu. Nếu kháng thể anti-HBc có trong mẫu thử, kháng thể sẽ cạnh tranh với cộng hợp. Mẫu thử đ−ợc coi là d−ơng tính đối với anti-HBc khi OD mẫu thử giảm mạnh hơn 60% so với chứng âm. 3.3.7. Pháp lý và y đức của nghiên cứu - Tính pháp lý: Vắcxin viêm gan tái tổ hợp (RecomBvax) do công ty VABIOTECH sản xuất đã đ−ợc cấp giấy phép l−u hành và Trung tâm Kiểm định Quốc gia cho phép xuất x−ởng. Đã đ−ợc Bộ Y Tế cho phép thử nghiệm. Đ−ợc bố mẹ đối t−ợng tham gia nghiên cứu đồng ý. 43
49. - Về đạo đức: Các đối t−ợng trẻ em tham gia nghiên cứu đ−ợc bố mẹ chấp thuận và đ−ợc thông tin đầy đủ các mặt lợi và hại (nếu có ) của cuộc thử nghiệm. Nghiên cứu đ−ợc tiến hành d−ới sự giám sát và chỉ đạo của các chuyên gia có kinh nghiệm. Các đối t−ợng tham gia đ−ợc thông tin đầy đủ về kết quả nghiên cứu đối với bản thân và đ−ợc h−ởng các khoản bồi d−õng tham gia nghiên cứu khoa học theo qui định. 3.3.8. Ph−ơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập đ−ợc xử lý theo ph−ơng pháp thống kê y học, có sử dụng phần mềm EPiINFO 6.0 trong phân tích số liệu. Tính hiệu giá kháng thể trung bình nhân GMT bằng ch−ơng trình phần mềm Excel. Sơ đồ thiết kế nguyên cứu 1. Đánh giá tính an toàn 549 trẻ Tiêm vắcxin Phác đồ tháng 0-1-2 Theo dõi phản ứng - Tại chỗ 15 phút và 15 ngày sau - Toàn thân tiêm 44
50. 2. Đánh giá hiệu lực đáp ứng miễn dịch 549 trẻ Đạt tiêu chuẩn lựa chọn, không mang các dấu ấn viêm gan B (HBsAg, anti-HBs, anti-HBc âm tính) Phân nhóm 319 trẻ → tiêm vắcxin tái tổ hợp RecomBvax 230 trẻ → tiêm vắcxin tái tổ hợp r-HBvax Tiêm vắcxin tháng : 0 - 1 - 2 mũi : 1 - 2 - 3 Vắcxin tháng: 0 1 2 3 Lấy máu nền Mũi 2 Mũi 1 Mũi 3 Lấy máu - Xét nghiệm hiệu giá kháng thể → tỷ lệ đáp ứng miễn dịch bảo vệ, đáp ứng cao, rất cao, tính hiệu giá trung bình nhân GMT. 45
51. Ch−ơng III Kết quả và bàn luận 1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 1.1. Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 Chủng tr−ớc khi đ−a vào sản xuất đ−ợc kiểm tra ADN (HBsAg) bằng phản ứng PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN mã hóa sinh tổng hợp HBsAg (hình 8) 1. Chuẩn trọng l−ợng phân tử 2. Chủng KM71-47-1 3. Chứng d−ơng ADN-HBsAg 4. Chứng âm Plasmid Hình 8. Kết quả kiểm tra ADN-HBsAg của chủng KM71-47-1 Trên điện tr−ờng, vị trí vạch ADN ở cột 2 (chủng) t−ơng đ−ơng với chứng d−ơng ADN-HBsAg và so với chuẩn trọng l−ợng phân tử ≈ 700 đôi bazơ. 1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 1.2.1. Mật độ nuôi cấy Đ−ợc xác định bằng cách đo OD ở b−ớc sóng λ= 600 nm. Kết quả kiểm tra 33 loạt nuôi cấy, ở các thời điểm khác nhau đ−ợc thể hiện trong bảng 2. ở cùng một thời điểm, với điều kiện nuôi cấy tối −u về pH = 6,3, tốc độ khuấy 300 v/p, oxygen DO = 35, nhiệt độ 30oC, 33 loạt nuôi cấy liên tiếp có mật độ nuôi cấy ổn định. ở 40 h trong bình tam giác, 48 h trong nồi lên men 2 lít, 30 h trong nồi lên men 10 lít cho hiệu suất nuôi cấy cao nhất. Nếu tiếp tục nhân chủng, tế bào sẽ già và kém hiệu quả khi biến nạp. 46
52. Bảng 2 : Mật độ nuôi cấy của chủng KM71-47-1 trong môi tr−ờng BMGY Mật độ nuôi cấy (OD600) Loạt Bình tam Nồi lên men 2 lít Nồi lên men 10 lít giác 40 h 0 h 24 h 48 h 0 h 7 h 24 h 28 h 30 h 0402 24,2 1,55 29,539,5 9,8 18,9 63,7 67,267,5 0502 20,1 1,49 29,444,5 9,5 19,6 59,2 69,170,0 0602 28,1 1,5 30,3 48,1 9,5 24,8 62,2 63,063,7 0702 17,5 1,5 32,2 48,3 10,3 23,3 64,5 67,0 67,2 0802 22,45 1,58 24,3 42,5 8,9 23,3 59.6 68,0 69,1 0103 23,53 1,62 22,4 50,2 9,1 18,3 56,8 68,9 70,2 0203 26,65 1,58 26,4 45,8 9,8 18,7 64.7 69,7 68,4 0303 19,6 1,48 26,446,9 9,82 18 50,9 61,161,6 0403 18,6 1,42 20,946,7 6,9 19,2 61,6 66,366,6 0503 17,5 1,5 32,2 48,8 10,2 23,4 67,2 69,1 69,2 0603 16,5 1,3 29,5 48 9,8 23,9 60,1 63,363,5 0703 18 1,7 20,345,2 8,2 18,163,6 66,267 0803 17 1,4 28,148,1 8,4 20,553,5 61,469,2 0903 18,1 1,51 31,548,7 10,1 25,1 63,2 69,5 70,3 1003 17,55 1,6 21,4 35,8 8,6 17,7 56,8 65,9 67,2 1103 17,5 1,47 30,447,5 9,3 21,7 64,0 71,867,8 1203 18,55 1,71 30,0 41,9 9,7 17,8 64,2 72,3 67,0 1303 17,25 1,3 29,8 55,7 9,8 25,1 70,2 69,5 69,9 1403 17,45 1,4 29,4 65,6 10,2 28,1 63,3 68,7 69,3 1503 16,75 2,1 38,4 65,3 11,4 28,3 71,8 72,3 71,4 1603 17,0 1,71 28,751,1 7,3 21,3 69,5 66,368,5 1703 14 1,4 29,147,6 9,8 15,771,3 68,068,2 1803 17,75 1,4 34,4 65,4 10,8 28,5 71,2 67,2 67,4 1903 18,5 2,3 32,1 65,6 9,2 34,1 69,8 70,672,8 2003 18,0 2,3 27,4 45,1 9,3 20,8 73,8 70,271,8 2103 17,25 2,0 28,6 48,3 8,9 21,3 69,9 70,2 70,6 2203 18,5 2,6 27,8 48,2 7,4 20,6 72,1 70,872,7 2303 15,2 2,3 40,3 78,4 9,1 26,4 68,7 72,171,8 0104 16,2 1,53 26,768,1 9,2 26,7 73,4 69,869,7 0204 17,6 1,9 28,6 47,1 10,3 24,3 65,6 68,2 68,0 0304 16,7 1,8 26,7 44,0 8,2 23,2 62,9 65,966,4 0404 18,25 2,31 27,8 44,9 9,7 21,8 73,4 68,3 69,7 0504 17,0 1,57 23,244,1 9,3 21,4 64,1 68,066,1 47