Tiểu luận Protein tái tổ hợp và virus cúm gia cầm

Nội dung text: Tiểu luận Protein tái tổ hợp và virus cúm gia cầm

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN Protein tái tổ hợp và virus cúm gia cầm Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Ngọc Quỳnh Ngày 31 tháng 10 năm 2009
2. MỤC LỤC I. Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined. II. Tổng quan Error! Bookmark not defined. 1.Căn bệnh: Error! Bookmark not defined. a.Hình thái, cấu trúc: Error! Bookmark not defined. b.Quá trình tái sản của virus Error! Bookmark not defined. c Những loài cảm nhiễm: những loài dã cầm, gia cầm, heo, chuột, mèo, loài linh trưởng Error! Bookmark not defined. d.Triệu chứng: Error! Bookmark not defined. e.Đường lây truyền Error! Bookmark not defined. 2.Các phương pháp chẩn đoán Error! Bookmark not defined. a.Chẩn đoán lâm sàng và phân biệt với một số bệnh khác: Error! Bookmark not defined. b.Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm: Error! Bookmark not defined. 3.Phòng chống bệnh cúm gia cầm Error! Bookmark not defined. a.Biện pháp an toàn sinh học Error! Bookmark not defined. b.Phòng bệnh bằng vaccine Error! Bookmark not defined. 4.Kỹ thuật tạo dòng (cloning) Error! Bookmark not defined. 5.Chủng virus vaccine NIBRG-14 Error! Bookmark not defined. 6.Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 Error! Bookmark not defined. III. Kết luận Error! Bookmark not defined. 1.Chủng virus vaccine NIBRG-14 Error! Bookmark not defined. 2.Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 Error! Bookmark not defined. IV. Tài liệu tham khảo Error! Bookmark not defined.
3. I. Đặt vấn đề Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm do virus gây chết rất cao trên gia cầm ( tỷ lệ chết có thể lên đến 100%) với những biểu hiện về hô hấp, tiêu hóa hay thần kinh. Những loài chim, chim nước hoang dã, chim biển được xem như nguồn tàng trữ virus gây nhiễm quan trọng. Bệnh cúm gia cầm được ghi nhận đầu tiên vào năm 1878 tại Ý và được gọi là “dịch tả gà” (fowl plague). Sau đó, người ta thấy bệnh xuất hiện ở các nước như Áo, Đức, Bỉ và Pháp. Hiện nay bệnh hầu như ở các nước trên thế giới với các subtype khác nhau đã được xác định. Một số ổ dịch gần đây ở các nước khác nhau đã được thông báo: Năm Subtype Nước 1991 H5N1 Gà tây tại Anh 1992-1995 H7N3 Úc 1994 H5N2 Mê-xi-cô 1995 H7N3 Pakistan 1997 H5N1 Hồng- Kong 1997 H5N2 Ý 1997 H7N4 Úc 1999 H7N1 Ý 2001 H5N1 Hồng- Kong ( Swayne & Halvorson, 2003) Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm subtype H5N1 đã xuất hiện ở một số nước Châu Á, trong đó có Việt Nam, sau đó lan sang các nước Châu Á, Trung Đông. Bệnh có nguy cơ lan rộng gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và đe dọa sức khỏe cộng đồng. 1
4. Tại Việt Nam từ tháng 12/2003 đến 12/2005 đã có ba đợt dịch cúm gia cầm xảy ra trên cả nước. Bệnh đã xảy ra ở 57/64 tỉnh thành vào năm 2004 và 35/64 tỉnh thành vào các tháng đầu năm 2005, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế của nước ta. II. Tổng quan 1. Căn bệnh: a. Hình thái, cấu trúc: Virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenza virus type A, có dạng đa hình thái, kích thước 80- 120 nm. Virus có vỏ bọc lipid, bề mặt được bao bọc bởi hai loại gai có bản chất glycoprotein ( dài 10-14 nm, đường kính 4-6 nm ) là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Bộ gen là RNA sợi đơn, chuỗi âm. Cấu trúc bộ gen của virus bao gồm tám phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS ( Cox và ctv, 2000). Dựa vào phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (AGID) trên cơ sở xác định các protein của virus, chủ yếu là protein NP và M1 người ta xếp virus cúm gia cầm vào chi (genus) Influenza virus type A. Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA. Đến nay người ta xác định 2
5. có tất cả 16 subtype HA và 9 subtype NA được phân lập trên các loại dã cầm và gia cầm khắp nơi trên thế giới qua nhiều giai đoạn khác nhau ( OIE, 2005, Capua và Maragon 2007 ). Haemegglutinin (HA) Protein HA đóng vai trò quan trọng liên quan đến khả năng gây bệnh và kích thích sinh kháng thể do những đặc điểm và chức năng của protein này quyết định, bao gồm: i) một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa acid sialic, giúp virus nhân lên và gây bệnh, ii) khả năng gây ngưng kết hồng cầu, iii) là kháng nguyên bề mặt, kích thích sinh kháng thể bảo hộ HI có tính đặc hiệu cao và giúp định subtype, iv) thường xuyên biến đổi tạo nên tính đa dạng của kháng nguyên. Khi so sánh trình tự gene của các chủng virus cúm độc lực khác nhau người ta nhận thấy rằng các phân lập virus độc lực cao thường có trình tự gene ở vị trí cắt của HA bởi protease tương ứng với các acid amin lặp lại nhiều lần như sau RRRKK (AGAAGAAGAAAAAAG). Sự gia tăng độc lực của các acid amin arginine (R) hoặc (và) lysine (K) biểu thị sự gia tăng độc lực của phân lập virus. Neuraminidase (NA) Là protein bề mặt, ngoài những đặc điểm như kháng nguyên NI có tính đặc hiệu cao, giúp qui định subtype, thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng kháng nguyên thì protein này còn có đặc điểm rất quan trọng trong yếu tố nhân lên của virus đó là có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng, xâm nhập vào bên trong tế bào, phóng thích ra khỏi tế bào sau khi đâm chồi trong quá trình nhân lên của virus. Nucleoprotein (NP) Là protein bên trong có tính đặc hiệu của virus cúm type A giúp phân biệt với virus cúm type B và C. Nucleoprotein tạo nên khung cấu trúc xoắn bên trong của virus và gắn kết với chuỗi RNA và ba polymerase khác nhau. 3
6. Protein matrix (M) Bao gồm M1 và M2, trong đó M1 là protein bên trong, nằm ngay dưới lớp vỏ bọc lipid, gắn kết với những ribonucleoprotein, qui định hình dạng của virus và có tính đặc hiệu cho virus type A, trong khi M2 là protein bề mặt, giữ vai trò là kênh trao đổi ion của virus và khơi mào cho hoạt tính gắn kết HA. Protein không cấu trúc (NS) Nằm rải rác ngay dưới M1. Các polymerase: PB1, PB2 (polymerase kiềm), PA (polymerase acid) Những polymerase này gắn kết với NP và RNA của virus, giúp cho quá trình sao chép của RNA virus (rRNA). PB1 và PB2 tham gia vào giai đoạn tổng hợp RNA trung gian của virus nhân lên trong tế bào, trong khi PA và NP tham gia quá trình tổng hợp RNA của virus. b. Quá trình tái sản của virus 4
7. • Giai đoạn bám của virus lên bề mặt tế bào Nhờ HA của virus gắn trên các thụ thể cuả tế bào ký chủ có chứa acid sialic. • Giai đoạn xâm nhập vào tế bào Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid ra khỏi HA và màng tế bào, giúp virus có thể xâm nhập tiếp vào bên trong tế bào tạo nên các thế hệ nội bào (endosan) • Giai đoạn phá màng Khi vùng bên trong nguyên sinh chất của tế bào, gặp điều kiện acid, các protein M2 có hoạt tính của kênh trao đổi ion sẽ được hoạt hóa, cho phép sự trao đổi ion từ thể nội bào vào bên trong hạt virus làm phá vỡ các mối liên kết giữa các protein với nhau dẫn đến phá vỡ màng và giải phóng các ribonucleoprotein. Tiếp theo là giai đoạn phân cắt HA bằng enzyme phân hủy protein của tế bào kí chủ tạo thành hai tiểu đơn vị HA1, HA2. Đây là hai điều kiện tiên quyết để virus có khả năng gắn kết và lây nhiễm. • Tổng hợp mRNA Xảy ra trong nhân của tế bào, ban đầu nhờ một đoạn mồi bao gồm từ 10-13 nucleotide của tế bào ký chủ. Quá trình này cần sự xúc tác bởi các enzyme hoạt hóa của PB1 và PB2. • Quá trình tái bản RNA của virus Xảy ra trong nhân của tế bào theo kiểu sao chép khác. Từ RNA chuỗi âm của virus tạo ra một phiên bản đầy đủ, chuỗi dương gọi là cRNA và đây sẽ là chuỗi khuôn mẫu để tổng hợp các RNA chuỗi âm, tạo nên bộ genome của thế hệ virus mới. • Tổng hợp protein 5
8. Sau khi phân tử RNA được tổng hợp trong nhân sẽ đi ra tế bào chất tổng hợp 6 protein ( HA, NA, NP, PB1, PB2 và PA ). Còn mRNA của gen NS và M trải qua quá trình gắn kết, sửa chữa để mỗi gen sẽ tạo ra hai gen mới, dịch mã tổng hợp các protein NS1, NS2, M1, M2. Các protein HA và NA sẽ được đường hóa ( glycosylation ) tại lưới nội mô có ribosome, gắn kết hình thành tam phân ( trimer) và tứ phân ( tetra) tại bộ máy golgi, sau đó chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ của hạt virus mới. • Đóng gói hạt virus Tám phân tử RNA của thế hệ virus mới sẽ gắn kết với các protein ( NP, PB1, PB2, PA và M2) và di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi các protein HA, NA, M2 đang tập kết để đóng gói hình thành hạt virus mới. • Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào NA đóng vai trò quan trọng trong việc phóng thích virus ra khỏi màng tế bào. Protein M1 làm gia tăng sự gắn kết của màng nguyên sinh chất và sự đâm chồi của hạt virus. c. Những loài cảm nhiễm: những loài dã cầm, gia cầm, heo, chuột, mèo, loài linh trưởng. d. Triệu chứng Các triệu chứng cúm trên gà thường là biến đổi và không đặc trưng. Các triệu chứng theo sau sự nhiễm bệnh với cúm gà độc tính thấp có thể nhẹ như là xù lông, hơi giảm đẻ trứng, hoặc mất cân kết hợp với giảm nhẹ khả năng hô hấp. Kể từ khi các triệu chứng này làm cho chẩn đoán trên đồng trở nên khó khăn, xác định sự lây lan của cúm gà cần phải có thí nghiệm trong phòng thí nghiệm với các mẫu từ gà bị nhiễm. Một số chủng của cúm Châu Á H9N2 có độc tính rất cao cho gia cầm và có thể gây ra triệu chứng nặng và chết nhiều. Ở trạng thái độc nhất, cúm gà và gà Tây tạo ra triệu chứng nặng ngay lập tức và hầu như 100% chết trong vòng 2 ngày. Vì virus lan nhanh trong điều kiện chật chội của 6
9. các trại nuôi gà và gà Tây, các dịch này xảy ra có thể gây ra thiệt hại kinh tế nặng cho nông dân nuôi gia cầm. Các triệu chứng của gà bị nhiễm cúm. e. Đường lây truyền Virus bài thải ra ngoài môi trường thông qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc và phân. Virus được truyền lây do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe hay gián tiếp qua không khí hay tiếp xúc những vật dụng vấy nhiễm virus. Các loài dã cầm đóng vai trò chủ yếu truyền lây virus đầu tiên, sau đó do truyền lây cơ học thông qua các vật dụng bị vấy nhiễm hay sự vận chuyển thú bệnh hay do con người. 7
10. 2. Các phương pháp chẩn đoán Các phương pháp chẩn đoán virus cúm hiện tại thường sử dụng bao gồm: a. Chẩn đoán lâm sàng và phân biệt với một số bệnh khác: Dựa vào triệu chứng, bệnh tích và tính chất dịch tễ để xác định bệnh cúm gia cầm với các bệnh khác. b. Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm: Có khả năng hỗ trợ và kết luận nguyên nhân gây bệnh chính xác Phát hiện virus i) Phát hiện protein hay RNA của virus trực tiếp từ mẫu mô. Miễn dịch mô gắn kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) trên mẫu vết phết kính, ELISA, RT-PCR, real time PCR. ii) Phân lập virus có khả năng thực hiện từ mẫu ngoáy hầu, họng hay hậu môn của gia cầm sống và các tổ chức mô của gia cầm chết. Mẫu được phân lập trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi bằng cách tiêm xoang niệu mô, trên tế bào thường trực (cell line) như MDCK, Vero hay tế bào sơ cấp như CEF và thận gà. Để khẳng định virus phân lập là cúm gia cầm, đầu tiên làm phản ứng HA ( cần phân biệt với virus khác có HA như virus Newcastle, Reovirus ) nếu dương tính thì tiếp tục định danh bằng phản ứng HI và NI với kháng huyết thanh chuẩn hoặc bằng RT-PCR hay real time PCR. Phát hiện kháng thể Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như ELISA, AGID, HI và miễn dịch huỳnh quang (Swayne và Halvarsone, 2003; OIE, 2005 và Cục thú y, 2004). 8
11. 3. Phòng chống bệnh cúm gia cầm a. Biện pháp an toàn sinh học Chủ động thực hiện các biện pháp vệ sinh thú y định kỳ như sát trùng chuồng trại, trang thiết bị chăn nuôi. Tăng cường kiểm soát phương tiện vận chuyển và người chăn nuôi ra vào khu chăn nuôi. Cách ly theo dõi đàn gia cầm mới nhập, không buôn bán gia cầm. Thực hiện các chính sách kiểm soát bệnh, giám sát dịch bệnh. b. Phòng bệnh bằng vaccine Sử dụng vacine là một trong những biện pháp hỗ trợ trong chiến lược tổng thể phòng chống bệnh cúm gia cầm. Phòng chống bệnh cúm gia cầm chủ yếu liên quan đến đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên HA và một phần NA. Trong thực tế, khả năng bảo hộ của vacine là nhờ subtype HA trong vaccine. Các loại vaccine thông thường: - Vaccine vô hoạt đồng nhất hoàn toàn (inactivated homogeneous vaccines) - Vaccine vô hoạt không đồng nhất hoàn toàn (inactivated heterologous vaccines) Các loại vaccine tái tổ hợp: - Vaccine với vector là virus đậu gà mang kháng nguyên H5. - Vaccine với vector là virus viêm thanh khí quản tùy nhiễm (ILT) Các loại vaccine hiện đang được sử dụng tại Việt Nam: - Vaccine vô hoạt H5N1, Harbin Weike, Trung Quốc - Vaccine vô hoạt H5N2, Harbin Weike, Trung Quốc - Vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5N2, Intervert, Hà Lan. 9
12. - Vaccine vô hoạt Bioflu H5N9 của Merial, Ý. - Chủng virus vaccine NIBRG-14. - Vaccine Trovac AIVH5, Meiral, Pháp. Vaccine sống tái tổ hợp sử dụng gen H5 của virus cúm gia cầm chủng A (turkey/ Ireland/ 1378/ 83H5N8) gắn vào virus đậu. 4. Kỹ thuật tạo dòng (cloning) Nguyên lý chung Kỹ thuật tạo dòng là quá trình tái tổ hợp một gene hoặc một đoạn DNA với một yếu tố mang (vector: plasmid, phage, cosmid ) có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào chủ ( tế bào chứa yếu tố mang tái tổ hợp: vi khuẩn E.coli, nấm men ). Việc nuôi cấy tế bào chủ trong điều kiện nhân tạo sẽ cho phép thu được một lượng lớn, ở trạng thái tinh khiết, gen hoặc đoạn DNA chèn vào trong yếu tố mang. Kỹ thuật tạo dòng được ứng dụng rộng rãi trong việc giải trình tự, sản xuất protein dùng trong nhân y và thú y (hormon insuline dùng điều trị bệnh tiểu đường ở người, hormon tăng trưởng ), sản xuất vaccine ( các loại protein tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên, các loại vaccine DNA ), sản xuất kháng thể đơn dòng Kỹ thuật tạo dòng về cơ bản được thực hiện qua 3 giai đoạn chính: - Xác định đoạn gene (hoặc DNA) cần thiết và lựa chọn yếu tố mang thích hợp. - Nhân đoạn gene (hoặc DNA) thích hợp với số lượng lớn để đưa vào yếu tố mang. - Thu nhận dòng tái tổ hợp và kiểm tra chất lượng dòng thu được. 5. Chủng virus vaccine NIBRG-14 Chủng virus A/Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1) được phân lập trên bệnh nhân nhiễm cúm gia cầm, giống với những chủng phân lập trên các loại gia cầm trong khu vực bề mặt 10
13. kháng nguyên và kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) mang một chuỗi các acid amin kiềm đặc trưng các chủng gia cầm độc lực cao. Thực tế, rất khó tìm kiếm một chủng virus cúm gia cầm không độc lực nhưng tương đồng về mặt kháng nguyên như trên để sử dụng như một chủng vaccine. Nhờ kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetices), các nhà khoa học thuộc Viện kiểm soát và tiêu chuẩn sinh học quốc gia (NIBSC), liên hiệp Anh (UK) đã nghiên cứu phát triển một chủng không có độc lực như thế nhờ sử dụng hệ thống 12 plasmid, gồm: • Hai plasmid mang đoạn gen HA và NA của virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1). • Sáu plasmid mang sáu đoạn gen còn lại của virus cúm PR8. • Bốn plasmid biểu hiện chức năng hỗ trợ của virus PR8. Chuyển nạp các plasmid này trên tế bào dòng thận khỉ (Vero) để phát triển thành chủng vaccine virus được tái tổ hợp sẽ phóng thích vào môi trường tế bào trong quá trình nuôi cấy, sau đó được cấy chuyển liên tiếp hai đời trên phôi gà. Nước trứng thu hoạch ở lần tiêm truyền thứ hai. Trứng này được sử dụng làm chủng vaccine được đặt tên là chủng NIBRG-14. 11
14. Sơ đồ phát triển chủng virus vaccine bằng kỹ thuật di truyền ngược từ chủng virus A/Vietnam/ 1194/ 2004. Trình tự vị trí cắt HA của chủng virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GCA TTA Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg ↑ Gly Leu Vị trí lặp lại các acid amin kiềm Vị trí cắt HA thành HA1, HA2 12
15. Trình tự vị trí phân cắt HA của chủng virus vaccine NIBRG-14 CCT CCA CGA GAG loại bỏ ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg ↑ Gly Leu Vị trí cắt HA thành HA1, HA2 Trong quá trình dòng hóa, loại bỏ 15 nucleotide mã hóa cho 5 acid amin kiềm tại vị trí phân cắt HA nhờ kỹ thuật di truyền. Trong khi đoạn gene NA được dòng hóa bình thường mà không có sự thay thế. Sự thay thế các gốc kiềm cũng nhằm hạn chế khả năng hình thành trở lại của các chuỗi acid amin kiềm tại vị trí cắt HA. Những nucleotide gạch cuối là những vị trí có sự thay thế nhân tạo. Quá trình đồng hóa giúp giảm khả năng đảo nghịch của các acid amin. 6. Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 Người ta biểu hiện trong tế bào côn trùng các tiểu phần của virus bao gồm 3 protein cấu trúc của virus cúm A H9N2 A/Hong Kong/1073/99. Với việc nhiễm vào tế bào Sf9 baculovirus tái tổ hợp, các protein hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), và matrix (M1) đồng thể hiện trên tế bào được nhiễm, tự tập hợp và giải phóng ra ngoài môi trường nuôi cấy VLPs of 80–120 nm trong diameter. Các tiểu phần của virus biểu hiện đặc điểm chức năng của virus cúm bao gồm sự gắn và hoạt động neuraminidase. Trong BALB/c chuột, các tiểu phần của virus cúm đã tạo ra trong huyết thanh kháng thể chuyên biệt cho virus cúm A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) và ức chế sự nhân lên của virus sau khi thử thách. Vì vậy, các tiểu phần của virus hiện tại là chiến lược tiềm năng cho việc phát triển vaccine cho người chống lại virus cúm A H9N2 và sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Tạo dòng các gene HA, NA, and M1 Virus cúm A/Hong Kong/1073/99 được cung cấp bởi Dr. K. Subbarao và Dr. N. Cox (Influenza Branch, CDC, Atlanta, GA). RNA của virus được tách chiết được bằng Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) dưới điều kiện chứa BSL-3. Sự phiên mã ngược và 13
16. PCR đã được sử dụng cho việc thu RNA virus sử dụng hệ thống RT-PCR một bước (Invitrogen) với những primer oligonucleotide chuyên biệt cho gene này. Những cặp primer được sử dụng cho việc tổng hợp gene HA, NA, và M1, tương ứng: 5’-AGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3’ và 5’-AGGTACCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3; 5’-AGAATTCATGAATCCAAATCAAAAGATAATA-3’ và 5’-CTTATATAGACATGAAATTGATATTC-3’; 5’ -AGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3’ và 5’ -AGGTACCTCACTTGAATCTCTGCATTTGC-3’; Theo RT-PCR, những đoạn cDNA chứa gen HA, NA, and M1 được dòng hóa trong vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Những trình tự của các gen HA, NA, và M1 được xác định bằng giải trình tự DNA và đã tìm đúng với trình tự được thành lập trước (GenBank AJ404626, AJ404629, và AJ278647, tương ứng). Sự tạo thành baculovirus tái tổ hợp Gene HA được tạo dòng như một đoạn DNA BamHI-KpnI (1.7 kb) dưới sự điều khiển của promotor AcMNPV polyhedrin trong vector chuyển bacmid pFastBac1 (Invitrogen) được cắt với 2 enzyme BamHI và KpnI. Cũng tương tự vậy, gene NA và M1 được tạo dòng như những đoạn EcoRI-EcoRI DNA (1.4 và 0.8 kb, tương ứng) được cắt bởi EcoRI trong plasmid pFastBac1. Ba kết quả của những plasmid chuyển baculovirus chứa những gene của virus đã được thiết kế là pHA, pNA, và pM1. Hình 1. (a) Thể hiện sự biểu hiện chuyên biệt của những protein cúm. (b) mô tả sự đồng biểu hiện của các protein cúm. Đã chỉ ra là promoter polyhedrin (Polh), vùng tín hiệu polyadenilation, vùng Tn7, gene kháng gentamicin (Gm), và những gene của virus 14
17. cúm A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Protein HA, hemagglutinin; NA, neuraminidase; M1, protein chất nền. Sự biểu hiện của vector chuyển bacmid cả 2 gene HA và M1 đã được chuẩn bị bởi sự tạo dòng một đoạn DNA SnaBI-HpaI từ plasmid pM1 trong vùng HpaI pHA. Kết quả này trong một plasmid mã hóa cho cả hai gene HA và M1 từ những promotor phân tách polyhedrin và được thiết kế pHAM. Cuối cùng, vector chuyển bacmid đã cho phép biểu hiện các gene của virus cúm được mô tả bởi tạo dòng đoạn DNA SnaBI-AvrII từ pHAM mà mang sự biểu hiện cả hai HA và M1 trong plasmid pNA được cắt bởi HpaI-AvrII. Kết quả trong một plasmid pNAHAM, mà đã mã hóa các gene HA, NA, và M1, mỗi đoạn gene đó được biểu hiện trong hộp bao gồm promotor polyhedrin và trình tự kết thúc phiên mã. Nuôi cấy tế bào nhiễm baculovirus Tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda Sf9 (ATCC CRL-1711) đã được duy trì trong dịch nuôi cấy huyền phù trong môi trường không huyết thanh côn trùng HyQ- SFX (HyClone, Logan, UT) ở 28oC. Những đĩa phân lập những protein biểu hiện của virus cúm đã được khuếch đại bởi tế bào Sf9 được nuôi trong flask lắc với mật độ 2 × 106 tế bào/ml với multiplicity of infection (MOI) = 0.05. Sau 72 nuôi cấy, phần nổi trên bề mặt nuôi cấy chứa các protein tái tổ hợp baculovirus được thu hoạch, tách bằng li tâm, và trữ ở 4oC. Độ chuẩn của hỗn hợp baculovirus tái tổ hợp được xác định bằng thí nghiệm trên đĩa agarose. 15
18. Sự biểu hiện protein Để biểu hiện protein, tế bào Sf9 đã được nhiễm trong thể tích 200ml trong 72h với mật độ tế bào 2×106tế bào/ml với những baculovirus tái tổ hợp ở MOI = 3. Sự biểu hiện đã được xác định bằng điện di SDS–PAGE sử dụng gel polyacrylamide 4-12% (Invitrogen) và thuốc nhuộm Coomassie và kỹ thuật lai Western blotting sử dụng huyết thanh kháng thể chuyên biệt (không chỉ cho những protein chuyên biệt). Sự biểu hiện của protein HA và M1tái tổ hợp M1 cũng được xác định bằng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) sử dụng hỗn hợp tế bào được nhiễm với acetone. III. Kết luận 1. Chủng virus vaccine NIBRG-14 Virus NIBRG-14 có khả năng nhân lên trong xoang niệu mô trứng gà có phôi 10 ngày tuổi và không gây chết phôi trứng. Virus không có khả năng nhân lên khi nghiên cứu trên tế bào xơ phôi gà CEF một lớp không bổ sung trypsin. Virus không gây chết và biểu hiện bệnh cho gà và vịt khi tiêm tĩnh mạch cánh trong vòng 10 ngày theo dõi. Virus vô hoạt có thể đáp ứng miễn dịch tốt và có tính hiệu quả cao đối với virus H5N1 độc lực cao gây bệnh tại Việt Nam. Virus vô hoạt có khả năng bảo hộ cho cả đàn gà và vịt 4 tuần tuổi sau khi tiêm 3 tuần. Như vậy chủng virus NIBRG-14 đạt các tiêu chuẩn của chủng vaccine và khả năng chọn để nghiên cứu sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm subtype H5N1 độc lực cao trong tương lai. 16
19. 2. Sản xuất các tiểu đơn vị của virus cúm H9N2 Sự tinh sạch các tiểu phần của virus cúm từ phần nổi nuôi cấy tế bào Sf9 bằng li tâm trong gradient tỉ trọng sucrose. (a) phân tích những tiểu phần từ 1 tới 9 bằng Western blot sử dụng huyết thanh gà C99-26 chuyên biệt cho H9 (bảng trên) và kháng thể đơn dòng chuột MCA401 tới M1 (bảng dưới). Những vị trí của các protein HA và M1 được chỉ ra bên phải. Virus cúm A/Sydney/5/97 (H3N2) đã được sử dụng như đối chứng (không được mô tả). (b) Phân tích những tiểu phần bởi thử nghiệm sự hemagglutination (bảng trên) và neuraminidase (bảng dưới). Trong sự hemagglutination, những tế bào máu heo guinea đã được sử dụng. Thí nghiệm neuraminidase được thực hiện bằng sử dụng fetuin như cơ chất. Dữ liệu chỉ ra mức trung bình tiêu biểu của hai thí nghiệm, những đường kẻ chỉ ra giá trị độ lệch chuẩn. Những kết quả thu được chứng minh những tiểu đơn vị của virus cúm thu được từ tế bào côn trùng có chứa các protein HA, NA, and M1 có thể hứa hẹn một vaccine ứng viên cho cúm H9N2 influenza. 17
20. Trong chuột, các tiểu phần của virus cúm độ chuẩn của kháng thể tạo ra giống với độ chuẩn kháng thể tạo ra được tinh sạch từ tiêm chủng vaccine chứa toàn bộ virus H9N2 và có thể xem là có khả năng bảo vệ cho người. IV. Tài liệu tham khảo Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông nghiệp. Phan Xuân Thảo, 2005. Khảo sát đặc điểm dịch tễ bệnh cúm gia cầm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và kiểm nghiệm vaccine TROVAC AIV H5 để phòng bệnh. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Dung, 2007. Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng cúm gia cầm NIBRG-14. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trần Xuân Hạnh, 2004. Một vài vấn đề phòng bệnh cúm gia cầm bằng vaccine. Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3) 2004, 84-85. Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Không, 2004. Một số hoạt động nghiên cứu khoa học của viện thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong thời gian tới. Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3), 2004, 62-65. Tô Long Thành, 2005. Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm. Tạp chí KHKT thú y, tập XI (1) 2005. 84-91. 18