›

Khóa luận Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)

pdf 54 trang thiennha21 18/04/2022 5321
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_tiep_tuc_nghien_cuu_chiet_xuat_phan_lap_mot_so_hop.pdf

Nội dung text: Khóa luận Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HOÀI THU TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN ETHYLACETAT CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HOÀI THU TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN ETHYLACETAT CỦA LÁ CÂY KHÔI ĐỐM (Sanchezia nobilis Hook.f) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2014.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. VŨ ĐỨC LỢI THS. BÙI THỊ XUÂN HÀ NỘI - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Đức Lợi- Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu- Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và ThS. Bùi Thị Xuân, Giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tại Khoa. Những kiến thức được tiếp thu là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận và là hành trang qúy báu giúp em tự tin bước vào đời. Em xin chân thành cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số: QG.18.20 đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược đã cho phép và tạo điều kiện cho em được tham gia nghiên cứu học hỏi tại Khoa. Trong quá trình em làm khóa luận và nghiên cứu tại Khoa không tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện hơn. Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 24 tháng 04 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Hoài Thu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÍ HIỆU STT Ký hiệu, chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 CC Sắc ký cột Dicloromethan 2 CH2Cl2 Chloroform 3 CHCl3 Distortionless Enhancement byPolarization 4 DEPT Transfer 5 d Doublet 6 dt doublet of triplets 7 ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử 8 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 9 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation 10 MeOH Methanol 11 m/z Khối lượng/ điện tích 12 NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 pTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế 14 q Quarlet 15 s Singlet 16 TLC Sắc ký lớp mỏng 17 t Triplet 18 v/v Thể tích/ thể tích @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây Khôi đốm 6 2 Hình 1.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản cây Khôi đốm 7 3 Hình 1.3: Đặc điểm vi phẫu thân 8 4 Hình 1.4: Đặc điểm vi phẫu lá 9 5 Hình 1.5: Đặc điểm vi phẫu bột thân 10 6 Hình 1.6: Đặc điểm vi phẫu bột lá 11 7 Hình 2.1: Hình ảnh cây Khôi đốm 21 8 Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Khôi đốm 28 9 Hình 3.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất X6 31 10 Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất X9 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập 1 15 được từ cây Khôi Đốm Bảng 3.1: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của X6 2 29 và chất tham khảo Bảng 3.2: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của X9 3 32 và chất tham khảo @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, KÍ HIỆU DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Thực vật học 2 1.1.1. Chi Sanchezia 2 1.1.2. Cây Sanchezia nobilis 5 1.2. Thành phần hóa học 12 1.2.1. Chi Sanchezia 12 1.2.2. Cây Sanchezia nobilis 13 1.3. Tác dụng sinh học 18 1.3.1. Chi Sanchezia 18 1.3.2. Cây Sanchezia nobilis 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 23 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất 26 3.1.1. Hợp chất X6: Rutin 29 3.1.2. Hợp chất X9: Epicatechin 32 3.2. Bàn luận 34 3.2.1. Về phương pháp chiết xuất phân lập 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 3.2.2. Về hai hợp chất đã phân lập được 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày càng phát triển, lối sống của con người cũng theo đó mà thay đổi. Theo bác sĩ Nguyễn Thúy Oanh - Trưởng khoa Nội Tiêu hóa - Nội soi - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Central Park, việc sinh hoạt cá nhân không điều độ như thức khuya, bỏ bữa ăn sáng hay là việc ăn uống không đúng giờ giấc, thói quen ăn khuya, lười vận động, thường xuyên hút thuốc lá, uống rượu bia không những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe mà còn là yếu tố thuận lợi dẫn đến bệnh viêm loét dạ dày-tá tràng. Ngoài ra, tại Hội nghị khoa học tiêu hóa gan mật do Bệnh viện Bạch Mai phối hợp với Đại học Nagoya (Nhật Bản) tổ chức ngày 16/9/2017, các chuyên gia cho biết, khoảng 70% dân số nước ta nhiễm vi khuẩn HP (nguyên nhân chính gây viêm, loét dạ dày-tá tràng và dẫn đến ung thư dạ dày). Có thể thấy viêm loét dạ dày tá tràng là một vấn đề không mới nhưng đáng được quan tâm[40, 42]. Từ xưa, dân gian vẫn thường ttruyền miệng các bài thuốc chữa trị viêm loét dạ dày, tá tràng sử dụng cây Khôi đốm. Lá khô dùng để sắc uống thay trà hằng ngày như hãm trà xanh. Lá tươi nhai sống cùng với chút muối [43]. Ở Việt Nam, cây Khôi đốm có tên khoa học là Sanchezia nobilis lần đầu tiên được mô tả bởi GS. Phạm Hoàng Hộ trong Danh lục các loài thực vật ở Việt Nam vào năm 2005[1]. Sau đó, trong một khoảng thời gian dài, không có thêm một công bố nào tại Việt Nam nghiên cứu về cây Sanchezia nobilis. Cho đến năm 2016, TS. Vũ Đức Lợi và cộng sự công bố Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống viêm của dịch chiết từ lá cây Xăng sê phát triển tại Việt Nam. Tiếp theo đó, vào năm 2017, trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học của dược sĩ Nguyễn Thị Mai đã tiến hành “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của Xăng sê (Sanchezia nobilis Hook.f.)”. Năm 2018, dược sĩ Vũ Thị Mây đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  10. Hook.f)”. Để tiếp nối chuỗi nghiên cứu về cây Sanchezia nobilis Hook.f, khóa luận được tiến hành thực hiện đề tài: ”Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f)” với mục tiêu: 1. Chiết xuất, phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi Đốm. 2. Xác định được cấu trúc các hợp chất đã phân lập. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Thực vật học 1.1.1. Chi Sanchezia 1.1.1.1. Vị trí phân loại @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  11. Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” của tác giả A.Takhtajan, chi Sanchezia có vị trí phân loại như sau[12]: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C. Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht Bộ Hoa môi: Lamiales Họ Ô rô: Acanthaceae Chi: Sanchezia 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây bụi hay cây cỏ xanh nửa mùa. Rễ cây không có lông. Thân cây trơn màu xanh lá cây tươi sáng với màu tím. Lá hình mác, dài, lớn đến 26cm, màu xanh đậm có vân trắng kem hoặc vàng. Hoa mọc đơn hoặc hợp lại thành chùm, hình ống có màu vàng, cam, đỏ, tím mọc ở ngọn, lá bắc có màu đỏ dài khoảng 5cm, đài 5 thùy, tràng 5, dính nhau thành hình ống, nhị 4, 2 nhị lép 2 nhị thò ra, bao phấn 2 ô. Qủa nang, 6-8 hạt. Hạt hình cầu[17, 5]. 1.1.1.3. Phân bố Chi Sanchezia chủ yếu phân bố ở phía Tây Nam Mỹ. Trung tâm của sự đa dạng loài thuộc chi nằm ở Peru và Ecuador. Một số ít loài phân bố ở vùng phía bắc và phía đông của Bắc Mỹ, Trung Mỹ và vùng biển Caribbean. Chi Sanchezia được mô tả lần đầu tiên bởi Ruiz và Pavón vào năm 1794 với hai loài thuộc chi. Đến năm 1964, chi này được sửa đổi bởi Leonard và Smith, với 59 loài trong đó 26 loài được mô tả lần đầu tiên đối với khoa học, đồng thời công bố khóa phân loại cho 59 loài này. Năm 2015, Tripp và Koenemann @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  12. đã thống kê lại lịch sử phát triển của chi Sanchezia, và lập danh lục 55 loài thuộc chi[18]. Ở Việt Nam, chi này chỉ có một loài, là Khôi đốm Sanchezia nobilis Hook.f, được Phạm Hoàng Hộ mô tả, và liệt kê trong Danh lục các loài thực vật ở Việt Nam[1]. 1.1.1.4. Một số cây thuộc họ Sanchezia Năm 2015 Erin A. Tripp và Daniel M. Koenemann đã công bố “Bản tóm tắt danh pháp của chi Sanchezia, 50 năm kể từ lần nghiên cứu cuối cùng”. Theo đó, chi sanchezia gồm 55 loài: Sanchezia arborea, Sanchezia lambra, Sanchezia nobilis, Sanchezia oblonga, Sanchezia ovata, Sanchezia parviflora, Sanchezia peruviana, Sanchezia putumayensis, Sanchezia woytkowskii, [18]. Cây Sanchezia woytkowskii Cây thẳng, nhẵn. Phiến lá to hình elip dài đến 25cm và rộng 14,5cm. Lá ngắn và đầu nhọn, mép lá có khía răng cưa nhẹ, bề mặt có gai, gân lá nổi rõ. Cuống lá nhẵn, dài đến 6cm. Hoa mọc thành chùm, 3 bông hợp thành một cụm nhỏ, các cụm nhỏ lại hợp lại với nhau thành chum, cánh hoa to và nhọn, đài hoa to, dài 15 mm, rộng 2 – 2,5 mm và có nhiều lông. Tràng hoa đỏ dài 3 – 3,3 cm[17]. Cây Sanchezia arborea Cây cao 4m, thân trơn, nhẵn, ; lá hình lưỡi mác hoặc hình elip thuôn dài, đỉnh nhọn, cong và thu hẹp, dài đến 16cm, rộng 4cm ở cả 2 bề mặt , ; cuống lá dài 0,5-2cm, mịn; Cụm hoa dạng chuỗi, phân nhánh thưa thớt, nhẵn, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  13. hoa đơn, kép, chùm, lỏng lẻo, dài 8cm. lá hình trứng, dài và rộng 3 mm, đỉnh tròn, rực rỡ, nhưng các cạnh của ciliolate; lá hình elip dài 4,5 mm; Nhũ hoa nhẵn, hình thuôn, dài 1-1,5 cm, rộng 2,4 mm, đỉnh, rìa radiifera phút hyaline; tràng hoa rubroviolaceus, dài 3,5-4cm, gốc rộng 2 mm, rộng tổng cộng 5- 7mm, thùy tròn dài 3 mm, rộng 2 mm; nhị hoa nhô ra 5-8mm, Ataminodia dài 8 mm, đỉnh dậy thì, bao phấn dài 1,5 mm, cấp tính ở gốc thúc đẩy bụng dậy thì, buồng trứng nhẵn[17]. Cây Sanchezia pedicellata Cây bụi cao tới 2 m. Lá nhẵn, thuôn dài hình elip, dài 24 cm và rộng 10 cm, tù hoặc nhọn. Trên cả hai mặt lá, gân lá cứng và có 14 gân bên, cuống lá nhú sẫm màu dài 6 cm, dày, nhẵn. Cụm hoa thưa thớt nằm trong các bẹ lá, màu nâu đỏ, hình mác, tù, nhẵn, dài 1 cm và rộng 2 mm, bao phấn dài 4mm, xù xì [17]. 1.1.2. Cây Sanchezia nobilis 1.1.2.1. Tên gọi khác Cây Sanchezia nobilis thuộc ngành Ngọc lan (Magnolipphyta) lớp Cỏ tháp bút (Equisetopsida C. Agardh) phân lớp Mộc lan (Magnoliidae Novák ex Takht) bộ Hoa môi (Lamiales) họ Ô rô (Acanthaceae) chi Sanchezia[12]. Trong dân gian, cây Sanchezia nobilis thường được gọi là cây Xăng sê, khôi đốm hay cây ngũ sắc, tùy thuộc vào từng vùng miền[1]. 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật a. Cơ quan sinh dưỡng Cây bụi, cao 0,5-1,5 m, thân và gân chính của lá có màu lục, đỏ hoặc vàng, gân bên màu trắng [5]. Thân non tiết diện 4 cạnh. Lá đơn mọc đối hình @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  14. chữ thập; cuống lá dài khoảng 2-3 cm, hơi lõm, màu hơi đỏ tím, hình trụ; phiến lá hình mũi mác, dài 10-25 cm, rộng 3-7 cm, nhẵn, mép lá hơi lượn sóng, mặt trên có màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt; hệ gân lông chim, có 9-12 đôi gân bên, các gân nổi rõ ở mặt dưới lá và có màu, gân giữa có gốc màu đỏ tím, gân bên màu trắng vàng [9, 6, 33]. Hình 1.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây Khôi đốm 1. Cành mang lá, hoa; 2. Tiết diện thân; 3. Cách mọc của lá; 4. Hình thái lá; 5. Cuống lá; 6. Mép lá; 7. Mặt sau lá; 8. Mặt trước lá.[6] b. Cơ quan sinh sản Hoa mọc thành cụm hoa gồm 6-10 bông nhỏ ở ngọn; cuống ngắn; có lá 2 bắc mọc đối diện, hơi nhọn, màu lục hay đỏ, hình trứng, đỉnh tù, nhẵn, ôm lấy 1 cụm hoa[9, 6, 5, 33]. Hoa lưỡng tính, màu xanh lục mờ hoặc vàng, mùi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  15. nhạt đặc trưng[9, 6]. Đài nhiều, hình vảy, dài 1,5-1,8 cm, rộng 3-5 mm, tròn ở đỉnh[31]. Tràng hình ống tròn, màu vàng có sáp, cao 4-5 cm, rộng 7-8 cm ở phía trên, thu hẹp dần xuống dưới đến 3 mm, nhẵn, các thùy dài3-4 mm, tròn, có khía; chỉ nhị dài, nhị 4 trong đó có 2 nhị phát triển dài 4-4,5 cm, có lông và 2 nhị tiêu giảm [5, 33]. Quả nang có nơ hình trụ, có 8 hạt[5]. Cây thường ra hoa, quả vào khoảng từ tháng 5 đến 7 hàng năm[6]. Hình 1.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản cây Khôi đốm 1. Cụm hoa; 2. Hoa nguyên vẹn; 3. Các bộ phận của hoa; 4. Đài; 5. Tràng; 6,7. Bộ nhị; 8. Bầu cắt ngang; 9. Bầu cắt dọc.[6] 1.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu a. Thân Thân non vi phẫu hình tròn. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: ngoài cùng là lớp biểu bì cấu tạo bởi một hàng @ t ếSchool bào, có lông of che Medicine chở đơn bào; and tiếp Pharmacy, VNU 7
  16. theo là mô dày gồm 6-8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín; mô mềm gồm 5-7 lớp tế bào, bên trong có chứa có tinh thể calcioxalat hình kim và các hạt tinh bột đơn; libe gần như hình tròn khép kín, libe ở ngoài, gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị gián đoạn bởi một số tế bào mô mềm; mô mềm ruột cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào, các tế bào thành mỏng, to, hình đa giác xếp lộn với nhau[9]. Thân già vi phẫu hình vuông, Cấu tạo tương tự thân non, ngoài cùng có thêm lớp bần[9]. Vi phẫu thân được thể hiện ở hình 1.3 [9]: Hình 1.3: Đặc điểm vi phẫu thân b. Lá Vi phẫu gân lá lồi lên ở 2 mặt trên và dưới. Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác xếp đều đặn nhau. Mô dày trên và mô dày dưới cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành @ dày School lên ở các of góc. Medicine Mô mềm cấ andu tạo Pharmacy, VNU 8
  17. bởi các tế bào thành mỏng, gần tròn bên trong có chứa các tinh thể canxi oxalat và các hạt tinh bột, rải rác có các bó mạch phụ. Libe gỗ xếp thành hình vòng cung gồm libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong. Một số tế bào biểu bì thành lông che chở, lông tiết.[9] Vi phẫu phiến lá: Gồm biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau. Mô giậu ngay dưới biểu bì trên cấu tạo bởi 2 hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau. Mô khuyết cấu tạo bởi các tế bào hình gần tròn xếp lộn xộn.[9] Vi phẫu cuống lá hình chén, có các đặc điểm tương tự gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì.[9] Vi phẫu lá được thể hiện ở hình 1.4 [9]: Hình 1.4: Đặc điểm vi phẫu lá 1.1.2.4. Đặc điểm bột dược liệu a. Bột thân @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  18. Bột thân cây Khôi đốm: Bột có màu xanh lá hơi vàng hoặc màu nâu, vị đắng. Soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau: Mảnh mô mềm, mảnh mô mềm mang tinh bột, mảnh mô dày, mảnh mạch xoắn và mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, hạt tinh bột đơn, mảnh bần màu nâu, mảnh biểu bì mang lông che chở [9, 2, 6]. Hình 1.5: Đặc điểm vi phẫu bột thân [6] Chú thích: 1- Mảnh mô mềm; 2- Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột; 3- Mô dày 4- Mạch xoắn; 5,6- Mạch điểm; 7- Tinh thể calci oxalat hình kim; 8- Sợi; 9- Hạt tinh bột; 10- Lông che chở b. Bột lá @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  19. Bột lá có màu xanh lục, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm: mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lỗ khí, mảnh biểu bì mang lông tiết, lông che chở, mảnh mô mềm, mảnh mô dày, mảnh mạch xoắn, mảnh mạch điểm, mảnh mô khuyết, mảnh mô giậu, tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, lông che chở, lông tiết, tinh bột [9, 2, 6]. Hình 1.6: Đặc điểm vi phẫu bột lá [6] Chú thích:1- Lỗ khí; 2-Mảnh mô mềm; 3- Mảnh mô dày; 4- Mảnh mạch xoắn; 5,6-Mảnh mạch điểm; 7-Tinh thể calci oxalat hình kim; 1.1.2.5. Phân bố @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  20. Cây Khôi đốm được phân bố ở các huyện miền núi cao như Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, huyện Hòa Vang thành phố Đà Nẵng, và ở một số huyện miền núi Chiêm Hóa tỉnh Tuyên Quang. Cây được trồng ở Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nội, Thừa Thiên Huế Cây có nguồn gốc từ Peru, Ecuador [1, 4]. 1.2. Thành phần hóa học 1.2.1. Chi Sanchezia Trên thế giới, vẫn chưa có một nghiên cứu tổng quát nào về thành phần hóa học của chi Sanchezia. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài khác ngoài Sanchezia nobilis cũng vô cùng ít ỏi. Trong nghiên cứu “Sapogenin Steroid: XLIII. Khảo sát thực vật về Sapogenin Steroid và các thành phần khác” năm 1957, Monroe E. Wall cùng cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học trong 1000 mẫu đại diện cho 101 họ thực vật ở Cuba và Quần đảo Virgin, Chile và Peru, Thổ Nhĩ Kỳ, Nam Phi và Đông Nam Hoa Kỳ. Theo đó, mẫu sapogenin thô thu được bằng cách thủy phân bằng axit và tinh chế bằng kiềm như đã được mô tả tích cực trước đây[29]. Tổng mẫu thô được hòa tan trong cloroform. Lấy một phần tương đương với khoảng 0,1 gram, bay hơi đến khô trong cốc có mỏ và phần dư được cân chính xác Từ giá trị thu được, có thể thu được tổng trọng lượng khô của sapogenin thô. Phần dư sau đó được acetyl hóa, sấy khô và trọng lượng của acetate thô thu được. Sau đó, thực hiện xác định hồng ngoại và tỷ lệ sapogenin steroid được tính như mô tả trước đây [29, 28]. Các sapogenin riêng lẻ được tách ra và phát hiện bằng sắc ký giấy. Vì mục đích này, hai hệ thống đã được sử dụng. Trong cả hai hệ thống, khoảng 500 microgam sapogenin thô (dạng hydroxyl tự do) được đặt trên giấy Whatman số 4 bão hòa với pha bất động. Đối với monohydroxy, sapogenin không tăng cường, pha tĩnh là phenylcellosolve và pha động là hỗn hợp gồm 98 phần benzen và 2 phần metanol. Trong trường hợp ketonic hoặc dihydroxy sapogenin, pha tĩnh là @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  21. propylen glycol và pha động là 80 phần benzen, 15 phần cyclohexan và 5 phần metanol. Các thuốc thử hiện màu là dung dịch etanolic của axit phosphomolybdic. Bằng cách sử dụng kết hợp các kỹ thuật hồng ngoại và sắc ký giấy, các sapogenin có thể được tách ra, xác định và liệt kê thành thành phần chính hoặc phụ. Kết quả cho thấy, trong dịch chiết thân và lá cây Sanchezia pennellii từ Tingo Maria, Peru có chứa flavonoid và sterol [30]. 1.2.2. Cây Sanchezia nobilis Năm 2012, Nghiên cứu rễ và vỏ cây cho thấy sự hiện diện của alkaloid, glycosid, steroid, terpenoid và tannin[14]. Năm 2015, Md. Abu Shuaib Rafshanjani và cộng sự khác đã nghiên cứu và chỉ ra rằng: trong dịch chiết của lá cây Khôi đốm có sự hiện diện của các alkaloid, glycoside,flavonoid, triterpenoid,carbohydrat, steroid, hợp chất phenolic, saponin và tannin. Phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ lá cây là dương tính đối với tất cả các chất hoá học được thử nghiệm trong khi phân đoạn n-hexan là âm tính đối với flavonoid và các hợp chất phenolic [34]. Năm 2013, Ahmed E.Abd Ellah và những thành viên khác đã phân lập được 5 chất trong đó có 1 hợp chất matsutake alcohol và 4 hợp chất alcohol glycosid[10]. ✓ 1-Octen-3-ol (1) ✓ 3-O-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (2) ✓ 3-O-β-glucopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (3) ✓ 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-1-octen-3-ol (4) ✓ 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  22. Năm 2014, từ dịch chiết methanol của lá và rễ cây Khôi đốm, Ahmed E đã phân lập được 6 hợp chất khác nhau: Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: Một hợp chất neolignan glucosid [11]: ✓ 9-O-β -glucopyranosyl trans-cinnamyl alcohol (6) ✓ 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- glucopyranosyltrans-cinnamyl alcohol (7) ✓ Syringin (8) ✓ 4-O-β -glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9) ✓ 7-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (10) ✓ 7-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (11) Năm 2014, từ dịch chiết methanol lấy từ hoa của cây Khôi đốm, nhóm nghiên cứu cũng phân lập được 3 hợp chất flavonoid [11]: ✓ apigenin-7-O-β–glucopyranoside (12) ✓ apigenin-7-Ogentiobioside (13) ✓ apigenin-7-O- β–glucuronopyranoside (14) Năm 2016, theo nghiên cứu về chiết xuất từ lá Khôi đốm của tiến sĩ Vũ Đức Lợi và cộng sự khác đã cô lập được 4 hợp chất [23]: ✓ Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin) (15) ✓ Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid) (16) ✓ Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol) (17) ✓ 3-Metyl-1H-benz [f] indolo-4,9-dion (18) Năm 2018, trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học của Vũ Thị Mây đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất [7]: ✓ 9-methoxycanthin-6-on (19) ✓ 9-hydroxyheterogorgiolid (20) ✓ O-methyl furodysinin lacton (21) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  23. Như vậy, trên thế giới đã nghiên cứu và phân lập được 21 hợp chất từ các dịch chiết khác nhau của các bộ phận trên cây Khôi Đốm. Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Khôi Đốm Hợp chất Cấu trúc hóa học 1: R= -H 2: R= -Glc 3: R= -Glc-(6→1)-Glc 4: R= -Glc-(6→1)-Ara OR 5: R= -Glc-(6→1)-Glc- (6→1)-Ara 6: R= -Glc OR 7: R= -Glc-(6→1)-Glc- (6→1)-Xyl HO 8 O O OGlc HO H OH 9 H O GlcO OCH3 OCH3 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  24. 10: R= -Glc OR 11: R= -Glc-(6→1)-Api OH 12: R= -Glc RO O 13: R= -Glc-(1→6)-Glc 14: R= -Glr OH O OH HO O OH O OH O OH 15 O OH OH OH HO O OH O OH O OH 16 O HO OH OH @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  25. OH 17 H HO OH H H HO O O O 18 N H O N 19 O N O OH OMe O O 20 H H OMe Me O O 21 H Me Me @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  26. 1.3. Tác dụng sinh học 1.3.1. Chi Sanchezia Cũng như các nghiên cứu về thành phần hóa học, ngoài Sanchezia nobilis các nghiên cứu về tác dụng sinh học của các loài khác thuộc chi Sanchezia đều rất hiếm. Năm 2012, tác giả Jin Hye-Young và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu “Kiểm soát sinh học chống lại rệp sử dụng kẻ thù tự nhiên trong Trung tâm nghiên cứu tài nguyên thực vật nhiệt đới Vườn ươm quốc gia Hàn Quốc “. Kết quả cho thấy, trong trường hợp của Sanchezia parvibracteata, mật độ trung bình của 626 con trên mỗi lá đã giảm dần ở lần khảo sát đầu tiên, và mật độ giảm dần. Nói chung, rệp và động vật ký sinh, Collemani jadebell, có hiệu quả nhất trong việc triệt tiêu mật độ khi được chiếu xạ ở tỷ lệ thích hợp, với tỷ lệ 6: 1 (rệp: Collemani jadebell) có hiệu quả ngay lập tức, với tỉ lệ 10: 1 và 25: 1 phải mất khoảng 15-20 ngày để ngăn chặn[35]. Khái niệm kiểm soát sinh học là duy trì mật độ dịch hại tối thiểu mà tại đó kẻ thù tự nhiên có thể duy trì ở một ngưỡng chấp nhận được, và trong trường hợp Sanchezia parvibracteata, một mô hình trong đó mật độ kẻ thù tự nhiên được kiểm soát bởi thiên địch[21]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  27. 1.3.2. Cây Sanchezia nobilis 1.3.2.1. Tác dụng chống oxi hóa và chống viêm loét dạ dày Cây Khôi đốm được chứng minh là có chất chống oxy hóa và chất chống tăng sinh tế bào invitro. Ngoài ra, loài cây này còn có công dụng diệt khuẩn HP, thủ phạm chính gây ra bệnh viêm loét dạ dày và hàng loạt các bệnh ở đường tiêu hóa. Chính nhờ tính chất này mà cây Khôi đốm giúp chữa viêm đại tràng, viêm loét dạ dày tá tràng rất hiệu quả. Một số kết quả thử nghiệm của các nhà khoa học cho thấy cây Khôi đốm giúp chống oxy hóa rất tốt và dịch chiết từ cây có khả năng chống oxy hóa tương tự như quercetin. Trong y học cổ truyền cây Khôi đốm là một trong những dược liệu quý từ thiên nhiên giúp điều trị nhiều bệnh Một trong những tác dụng lớn đó là lá cây Khôi đốm chữa đau dạ dày, loại thảo dược này còn được coi là vị cứu tinh cho những ai mắc viêm loét dạ dày mãn tính. Ngoài ra, ở Thái Lan rễ cây Khôi đốm được dùng để điều trị chứng bất lực và tăng cường ham muốn tình dục[41]. 1.3.2.2. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Bên cạnh đó tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết cây Khôi Đốm cũng được quan tâm nghiên cứu. Cụ thể, năm 2014, một nghiên cứu của Rafshanjani M. và các cộng sự đã cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng kháng khuẩn mạnh trên các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella paratyphi, Bacillus megaterium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa Shigella shiga và một số chủng nấm Candida albicans, Rizopus oryzae, Aspergillus niger, Trycophyton rubrum; phân đoạn ethyl acetate có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn Shigella sonnei, Shigella dysenteriae và các chủng nấm Rizopus oryzae, Trycophytonrubrumtrong; trong khi đó phân đoạn ether hầu như không có tác dụng[8]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  28. 1.3.2.3. Tác dụng diệt côn trùng Thí nghiệm diệt côn trùng Tribolium Castaleum (Herbst) cho thấy tỷ lệ tử vong của côn trùng là 60%, 40%, 20% tương ứng với phân đoạn chloroform, ethyl acetate và ether ở liều lượng 50 mg/ml trong 48h [8]. 1.3.2.4. Tác dụng chống ung thư Trong nhiều năm, các nhà khoa học đã công bố nhiều nghiên cứu liên quan tới tác dụng chống ung thư của cây Khôi Đốm. Theo kết quả của các nghiên cứu đã được công bố cho thấy dịch chiết methanol từ lá cây cho thấy hoạt tính gây độc tế bào cao nhất trên MCF-7, trung bình với SK-MEL-5, và thấp nhất trên HUVEC; Quercetin được phân lập từ lá cây Khôi đốm có khả năng chống lại sự hình thành các gốc tự do và cải thiện sức khỏe của hệ tuần hoàn đã được chứng minh là có thể ức chế sự phát triển của các tế bào khối u, ngăn ngừa ung thư di căn và ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư[26, 27]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  29. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Lá cây Khôi đốm được thu hái vào tháng 15/01/2018 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín. Mẫu cây này được ThS.Nguyễn Quỳnh Nga, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là: Sanchezia nobilis Hook.f. họ Acanthaceae (họ Ô rô). Mẫu cây được lưu tại: Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Cây Thuốc, Viện Dược liệu (số hiệu tiêu bản: DL-150118). Hình 2.1: Hình ảnh cây Khôi đốm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  30. 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.2.1. Hóa chất và dung môi Chiết xuất và phân lập sử dụng các dung môi: (EtOH 80%, n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton (Ac) Tất cả các dung môi này đều đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết. Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) 2.1.2.2. Trang thiết bị Sắc ký cột: sắc ký các loại cột thủy tinh có kích cỡ khác nhau. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, máy ảnh kỹ thuật số @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  31. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất Mẫu lá cây Khôi đốm sau khi thu hái đã rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín. Mẫu dược liệu được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L), ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol. Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan và ethyl acetat (3 lần). Thu được các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat và nước. Các phân đoạn này được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng. Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat. Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế. Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm và RP-18F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ. Sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  32. nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên bếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp. 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố 2.2.2.1. Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác[3]. 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C ) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  33. lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay. Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton[3]. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY). Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học củaproton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba tới đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  34. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer). Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)[3]. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất Lá Khôi đốm được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ. Cân 2,5 kg lá cây Khôi đốm đã làm nhỏ và ngâm chiết bằng 8L dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần m @ột. BSchoolổ sung thêm of dungMedicine môi ngập anddược Pharmacy, VNU 26
  35. liệu 2-3cm (8L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba. Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 150 g cao chiết tổng ethanol. Hòa tan 100g cao đặc trong nước nóng, tỷ lệ thể tích cao đặc: nước cất nóng (1 :1) thu được dịch chiết nước. Dịch chiết nước đem lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các phân đoạn dịch chiết được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 600C đến cắn thu được các cắn tương ứng n-hexan (9,2g), ethyl acetat (28,8g) và dịch nước còn lại (26,6g). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  36. Dược liệu Chiết ethanol (8,0 lít x 3 lần) Dịch chiết ethanol Thu hồi dung môi Cao tổng ethanol (150 g) Phân tán trong nước cất Lắc với n-hexan Thu hồi n-hexan Cắn n-hexan Dịch chiết nước (9,2 g) Lắc với ethyl acetat Thu hồi ethyl acetat Dịch chiết nước Cắn ethylacetat(28,8 g) Cô cạn Cắn nước (26,6g) Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Khôi đốm @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  37. Tiến hành phân tích cắn EtOAc (25,0 g) trên cột sắc ký silicagel với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan- EtOAc (5:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3- MeOH (10:1→ 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500mL) thu được 6 phân đoạn ký hiệu là E1~E6. Từ phân đoạn E2 (7,2g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động EtOAc - MeOH (5:1, v/v, 2,5L) thu được 6 phân đoạn nhỏ hơn là E2.1~ E2.6. Từ phân đoạn E2.2 (1,2g) tiến hành sắc ký cột silicagel pha thường với hệ dung môi etylacetat:methanol (2/1,v/v) thu được hợp chất X6(18mg). Từ phân đoạn E2.5 (1.6g) tiến hành sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1/1,v/v) thu được hợp chất X9 (24mg). Sau đó X6 và X9 được đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV-VIS, phổ khối lượng(MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) và so sánh với hợp chất tham khảo. Từ đó xác định cấu trúc hóa học của hợp chất đã phân lập được. 3.1.1. Hợp chất X6: Rutin Chất bột màu vàng Nhiệt độ nóng chảy tnc = 214 ÷ 216°C Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất X6 và chất tham khảo được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của X6 và chất tham khảo [25] X6 Ga,b X6 Ga,c Vị trí C DEPT δC δC δH (ppm) δH (ppm) ppm ppm (mult, J=Hz) (mult, J=Hz) 2 C 156,6 156,30 3 C 133,3 133,40 4 C 177,5 177,40 5 C-OH 161,2 161,20 12,58 (s) 12,70 ( s) 6 CH 98,7 98,50 6,19 (d; 1,8) 5,90 (d; 2,11) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  38. 7 C-OH 164,4 164,10 8 CH 93,8 93,50 6,39 (d; 2,2) 6,20 (d; 1,98) 9 C 156,8 156,30 10 C 104,1 104,00 1' C 121,4 121,20 2' CH 115,5 115,20 7,54 (d; 1,8) 7,30 (dd; 2,26; 10,00) 3' C-OH 144,9 144,80 4' C-OH 148,6 148,40 5' CH 116,5 115,20 6,87 (d; 8,0) 6,80 (d; 8,59) 6' CH 121,7 121,50 7,54 (dd; 8,0;1,8) 7,30 (dd; 2,26; 10,00) 1'' CH 101,4 100,58 5,31 (d; 7,8) 5,32 (d; 7,60) 2'' CH 74,4 73,92 3,25 ÷ 3,48 (m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 3'' CH 76,6 75,74 3,25 ÷ 3,48 (m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 4'' CH 70,2 70,44 3,25 ÷3,48 (m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 5'' CH 76,1 76,32 3,25 ÷3,48 ( m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 6'' CH2 67,2 66,84 3,83 (m) 3,70 (br; d; 9,17) 1''' CH 100,7 101,02 4,49 ( d; 1,8) 4,43 (d; 1,26) 2''' CH 70,6 70,21 3,63 (dd;1,5; 3,39 ÷ 3,04 (m) 3,5) 3''' CH 70,8 69,86 3,53 (dd; 3,5; 3,39 ÷ 3,04 (m) 9,5) 4''' CH 71,8 71,74 3,28 (m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 5''' CH 68,4 68,14 3,45 (m) 3,39 ÷ 3,04 (m) 6''' CH3 17,9 17,61 1,03 (d; 6,0) 0,98 (d; 6,2) a ) b ) c ) G) đo trong DMSO-d6 , 125 MHz, 500 MHz, của Rutin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  39. 1 Phổ H-NMR cho tín hiệu singlet tại δH 12,58 ppm của nhóm OH tại C-5 liên hợp với nhóm carbonyl. Có năm tín hiệu proton thơm, hai proton ghép cặp kiểu ortho của H-5' tại δH 6,87 (1H, d, J=8,0Hz) với H-6' tại δH 7,54 (1H, dd, J=8,0; 2,0Hz), hai proton ghép cặp kiểu meta của H-6 tại δH 6,19 (1H, d, J=2,0Hz) với H-8 tại δH 6,39 (1H, d, J=2,0 Hz), một tín hiệu proton thơm singlet của H-2' tại δH 7,56 (1H, s). Tín hiệu proton anomeric của gốc rhamnose tại δH 4,49 (1H, d, J=1,8Hz), tín hiệu proton anomeric của gốc glucose tại δH 5,31 (1H, d, J=7,8Hz). Các proton còn lại nằm trong vùng δH 3,83 đến δH 3,25ppm. Tín hiệu nhóm methyl của gốc rhamnose tại δH 1,03 (3H, d, J=6,0Hz). Phổ 1 H-NMR của hợp chất 4 cho thấy tín hiệu của vòng nhân thơm thế 3 vị trí ở 7,54 (2H, m, H-2',6'), và 6,87 (1H, d, J=8,0Hz; H- 5') và 2 proton anomeric tại 5,31 (1H, d, J=7,8Hz; glcH-1'') và 4,49 (1H, d, J=1,8Hz; rhamH-1'''). Tuy nhiên, phổ 1H-NMR của hợp chất X6 cho thấy tín 13 hiệu proton của nhóm methyl ở 1,03 (3H, d, J=6,0Hz; rham-CH3). Phổ C- NMR và DEPT của hợp chất X6 cho thấy tín hiệu của 27 cacbon, bao gồm 15 cacbon của khung flavonoid và 12 cacbon của 6 tín hiệu carbon thuộc gốc đường glucose, 6 tín hiệu carbon thuộc gốc đường rhamnose, 1 gốc đường của rutin (β-D-glucose: δ101,4; 74,4; 76,6; 70,2; 76,1; 67,2 và α-L- rhamnose:δ 100,7; 70,6; 70,8; 71,8; 68,4; 17,9). Kết hợp so sánh dữ liệu phổ của hợp chất X6 và tài liệu ta khẳng định hợp chất X6 là rutin (quercetin-3- O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside). Hình 3.2: Cấu trúc hóa @ h ọSchoolc của hợp ofchấ tMedicine X6 and Pharmacy, VNU 31
  40. 3.1.2. Hợp chất X9: Epicatechin Dạng kết tinh màu vàng o Nhiệt độ nóng chảy tnc = 217-219 C Phổ ESI-MS m/z 291,1[M+H]+ Công thức phân tử: C15H14O6 (M=290). Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của chất X9 và chất tham khảo được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ DEPT, 1H- và 13C-NMR của X9 và hợp chất tham khảo [36] X9 Ka,b X9 Ka,c Vị trí C DEPT δC δC δH (ppm) δH (ppm) (Mult, ppm ppm (Mult, J=Hz) J=Hz) 2 CH 79,7 79,9 4,84 (d; 7,5) 4,83(br,s) 3 CH 67,3 67,5 4,21 ( m) 4,19(m) 4 CH 2 29,1 29,3 2,87(dd;12,0;2,5) 2,73(dd; 16,8;2,7) 2,74(dd;12,0;4,5) 2,86(dd; 16,8;4,8) 5 C 157,8 157,4 6 CH 96,5 96,4 5,94 (d; 1,5) 5,93(d; 2,3) 7 C 157,6 157,9 8 CH 95,8 95,9 9 C 157,4 157,7 10 C 100,0 100,1 1' C 132,1 132,3 2' CH 115,2 115,3 6,98 (d;1,5) 6,99(d; 1,7) 3' C 145,6 145,9 4' C 145,8 145,8 5' CH 115,8 115,9 6,76 (d; 8,5) 6,77(d; 8,2) 6' CH 119,5 119,4 6,80 (dd; 8,0; 1,5) 6,81(dd; 8,2;1,7) a ) b ) c ) G) đo trong CDCl3, 125 MHz, 500 MHz, của epicatechin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  41. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 291,1[M+H]+ cho phép xác định công thức phân tử là C15H14O6 (M=290). 13 Phổ C-NMR của X9 xuất hiện tín hiệ u của 15 carbon của một hợp chất flavonoid. Tuy nh iên không có tín hiệu của nhóm carbonyl ở vùng trường thấp, đồng thời lại xuất hiện tín hiệu CH2 tại δC 29,1 và hai tín hiệu carbon nối với nguyên tử oxy tại δC79,7 và δC 67,3. Dữ liệu phổ nêu trên cho thấy đây là m ộ t hợp chất flavan có nhóm hydroxy tại C-3 không có nhóm C=O tại C-4. Điều n ày được làm sáng tỏ hơn bởi các tương tác spin-spin của các proton H-2/H-3 và H-3/H-4 trên phổ 1H- 1 NMR. Trên phổ H-NMR proton H-2 xuất hiện là một doublet tại (pp m) 4,84 (J=7,5Hz), proton H-3 xuất hiện là một multiplet tại δ4 ,21 và hai proton H-4 xuất hiện dưới dạng hai tín hiệu doublet của một doubl et tại δ2,74 (dd, J=16,0; 2,0Hz) và 2,87 (dd, J=16,0; 4,5Hz) chứng tỏ nhóm OH tại C-3 và có cấu hình α-OH. Ba tín hiệu tại δH (ppm) 6,98 (d, J=1,5Hz); 6,76 (d, J=8,5Hz) và 6,80 (dd, J=8,0; 1,5Hz) chứng tỏ vòng B đã bị thế tại các vị trí 1',3',4'. Ngoài ra, tín hiệu doublet tại δH (ppm) 5,94 (2H, d, J=1,5Hz) chứng tỏ hai proton này nằm ở vị trí meta với nhau và phù hợp với H-6 và H-8 của vòng A. Những dữ liệu phổ trên cùng với sự phân tích so sánh các giá trị hằng số tương tác J với các giá trị tương ứng của epicatechin cho thấy hợp chất X9 là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavan (epicatechin) với công thức phân tử là C15H14O6. Kết quả so sánh các dữ kiện phổ 13C-NMR của X9 với epicatechin cũng hoàn toàn phù hợp. Phổ HMBC cũng được thực hiện và các tương tác HMBC nhận được hoàn toàn khẳng định cấu trúc của X9 là epicatechin như mô tả trên hình. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  42. Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất X9 3.2. Bàn luận 3.2.1. Về phương pháp chiết xuất phân lập Phương pháp chiết xuất bằng EtOH và phân lập các chất bằng sắc ký cột được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó. Đề tài đã chiết xuất cao toàn phần từ lá cây Khôi đốm bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ phòng với dung môi cồn 80%. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, chi phí thấp thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, ethyl acetat và chạy qua cột sắc ký Diaion, thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt lần lượt 0,368% (phân đoạn n-hexan); 1,152% (phân đoạn ethyl acetat); 1,064% (phân đoạn nước) so với nguyên liệu khô ban đầu. Kết quả phân lập được 2 thành phần từ phần lá của cây lá Khôi đốm thu tại tỉnh Nam Định. Cấu trúc các hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Hai hợp chất được xác định là Rutin (X6), Epicatechin (X9). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  43. 3.2.2. Về hai hợp chất đã phân lập được 3.2.2.1. Hợp chất X6 Hợp chất X6 được xác định là Rutin (quercetin-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside). Chất này cũng được phân lập từ Salvia leucantha, Fagopyrum esculentum, Carpobrotus edulis, [16, 25, 32]. Rutin cũng được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm thông thường như: olive đen, mận, cà chua bi, nho khô, mơ, trà xanh, táo, [39]. Trong nghiên cứu “Tinh chế và xác định các thành phần kháng khuẩn hoạt động trong Carpobrotus edulis L.” của Elmarie van der Watt và Johan C Pretorius, ban đầu chiết xuất methanolic thô của cây được thử nghiệm và cho kết quả có tác dụng chống vi khuẩn mạnh. Sau đó, dịch chiết thô được phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng, tannin được loại bỏ bằng phương pháp sắc ký cột LH20 và phân đoạn có hoạt tính sinh học với đặc tính kháng khuẩn được phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Năm hợp chất có hoạt tính sinh học, có hoạt tính đơn lẻ hoặc kết hợp đối với đặc tính kháng khuẩn C. edulis, được tinh chế từ phân đoạn ethyl acetate hoạt động. Các hợp chất này ban đầu được xác định là flavanoids bằng phương pháp standard fingerprinting và cuối cùng được xác định là rutin, neohesperidin, hyperoside, cactichin và axit ferulic [16]. Rutin có hoạt tính chữa lành vết thương đáng kể và cũng là loại thuốc được tìm thấy có hoạt tính kháng khuẩn cho cả vi khuẩn gram dương và gram âm[16, 25]. Trong nghiên cứu “Hoạt động kháng khuẩn và làm lành vết thương của Quercetin-3-O L-Rhamnopyranosyl-(1-6) -β-D-Glucopyranoside phân lập từ Salvia leucantha” của Manivannan Rajamanickam và cộng sự, Quercetin- 3-O L-Rhamnopyranosyl-(1-6) -β-D-Glucopyranoside, sau khi được phân lập từ Salvia leucantha, đã được thử t@ác d Schoolụng kháng ofkhu ẩMedicinen trên các vi khu andẩn Pharmacy, VNU 35
  44. gram dương Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Sarcina lutea và các vi khuẩn gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans và so sánh với một số kháng sinh thương mại. Kết quả cho thấy: tại vùng ức chế tối đa, quercetin glycosides chống lại tất cả các vi sinh vật thử nghiệm và quercetin glycosides ức chế Staphylococcus aureus và Escherichia coli tốt hơn so với các loại vi sinh vật còn lại[25]. 3.2.2.2. Hợp chất X9 Trước khi được phân lập từ Sanchezia nobilis, hợp chất X9 (Epicatechin) cũng đã từng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: lá cây Amaranthus cruentus L. (Amaranthaceae), trà hoa vàng Camellia chrysantha, Azadirachta indica, Bulnesia sarmienti, lá loquat Eriobotrya japonica, ca cao, [13, 15, 19, 36, 37]. Cùng với đó, epicatechin cũng được nghiên cứu và phát hiện ra nhiều tác dụng dược lý khác nhau như: chống oxi hóa, kháng khuẩn, giúp cải thiện chức năng mạch máu, chống ung thư, giúp làm giảm hội chứng tắc nghẽn xoang gan, [13, 15, 20, 22, 24, 38]. Cụ thể, tác dụng chống oxy hóa của (-) - epicatechin, (-) - epicatechin gallate và quercetin đã được kiểm tra bằng cách đo sự ức chế peroxid hóa lipid trong liposome unilamellar lớn bao gồm phosphatidyicholine trong lòng đỏ trứng. Từ kết quả quan sát được, các nhà khoa học kết luận rằng catechin và quercetin đóng vai trò là chất chống oxy hóa mạnh mẽ chống lại quá trình peroxy hóa lipid khi hai loại phospholipid tiếp xúc với các gốc oxy tự do trong nước[22]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  45. Năm 2011, nghiên cứu “Chế độ ăn uống Epicatechin thúc đẩy sự sống sót của chuột bị tiểu đường béo phì và Drosophila melanogaster” của Hongwei Si và các cộng sự đã chỉ ra được nhiều tác dụng của Epicatechin: - Bổ sung epicatechin vào chế độ ăn uống thúc đẩy sự sống sót của chuột mắc bệnh tiểu đường. - Epicatechin cải thiện sự thay đổi bệnh lý ở động mạch chủ và gan. - Epicatechin cải thiện dấu ấn sinh học liên quan đến tuổi ở chuột mắc bệnh tiểu đường. - Epicatechin cải thiện chức năng cơ xương ở chuột mắc bệnh tiểu đường. - Epicatechin cải thiện hoạt động AMPKα ở gan và cơ xương của chuột mắc bệnh tiểu đường. - Epicatechin làm tăng tuổi thọ của Drosophila. [20] @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  46. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau : + Chiết xuất, phân lập: Đã sử dụng phương pháp chiết ngâm với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 2 hợp chất từ lá của cây Khôi đốm + Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ tử ngoại- khả kiến, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất là: Rutin (quercetin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside(X6), và epicatechin(X9). Đây là lần đầu tiên 2 hợp chất này được phân lập từ dịch chiết phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm. Kiến nghị + Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ loài Sanchezia nobilis Hook.f. + Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết phân đoạn ethylacetat và các hợp chất phân lập được từ cao phân đoạn ethylacetat. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 38
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Tập III, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Bộ Môn Dược Liệu Đại Học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu. 3. Bộ Y Tế (2011), Dược liệu học I, Nhà xuất bản Y học. 4. Phan Văn Chiêu (2011), Đông nam dược nghiệm phương, Nhà xuất bản Thuận Hóa. 5. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nhà xuất bản Trẻ. 6. Nguyễn Thị Mai (2017), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học lá cây Xăng sê, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. 7. Vũ Thị Mây (2018), Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tiếng Anh 8. Abu Shuaib Rafshanjani, Shumaia Parvin, Abdul Kader, Monika Rani Saha, and Most.Afia Akhtar (2014), "In vitro antibacterial, antifungal and insecticidal activities of ethanolic extract and its fractionates of Sanchezia speciosa Hook. f", International Research Journal of Pharmacy, 5(9), 717-720. 9. Ahmed E. Abd-Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2006), "Macro-and micromorphology of Sanchezia nobilis Hook. cultivated in Egypt: leaf, stem and flower", Bulletin of Pharmaceutical Sciences, 29(2), 300-327. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. 10. Ahmed E. Abd Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2013), "Matsutake alcohol glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 48(6), 930-933. 11. Ahmed E. Abd Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2014), "Cinnamyl Alcohol, Benzyl Alcohol, and Flavonoid Glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 50(5), 715-717. 12. Armen Leonovich Takhtadzh͡iAn (1997), Diversity and classification of flowering plants, Columbia University Press, New York, USA. 13. Young-Il Jeong Bae, Chang-Ho Shim, Ki-Hwan, (2005), "Antioxidative and Antimicrobial Activity of Epicatechin Isolated from Leaves of Loquat (Eriobotrya japonica)", Preventive Nutrition and Food Science, 10(2), 118-121. 14. Cristiane Pereira, Cleber Bomfim Barreto Júnior, Ricardo Machado Kuster, Naomi Kato Simas, Cassia Mônica Sakuragui, Andrea Porzel, and Ludger Wessjohann (2012), "Flavonoids and a neolignan glucoside from Guarea macrophylla (Meliaceae)", Química Nova, 35(6), 1123- 1126. 15. Daeik Kim, Mohammad Lalmoddin Mollah, and Kilsoo Kim (2012), "Induction of Apoptosis of SW480 Human Colon Cancer Cells by (−)- Epicatechin Isolated from Bulnesia sarmienti", Anticancer Research, 32 (12 ), 5353-5361. 16. Elmarie Van Der Watt and Johan C Pretorius (2001), "Purification and identification of active antibacterial components in Carpobrotusedulis L.", Journal of Ethnopharmacology, 76 (1), 87-91. 17. Emery C. Leonard and Lyman B. Smith (1964), "Sanchezia and related American Acanthaceae", Rhodora, 66(768), 313-343. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. 18. Erin A. Tripp and Daniel M. Koenemann (2015), "Nomenclatural Synopsis of Sanchezia (Acanthaceae), Fifty Years Since Last Treated", Novon: A Journal for Botanical Nomenclature, 24(2), 213-221. 19. Francisco Cen-Pacheco, Araceli Ortiz-Celiseo, Alvaro Peniche- Cardeña, Omar Bravo-Ruiz, Fernando C. López-Fentanes, Gerardo Valerio-Alfaro, and José J.Fernández (2019), "Studies on the bioactive flavonoids isolated from Azadirachta indica", Natural Product Research, Published online. 20. Hongwei Si, Zhuo Fu, Pon Velayutham Anandh Babu, Wei Zhen, Tanya Leroith, Mary Pat Meaney, Kevin A. Voelker, Zhenquan Jia, Robert W. Grange, and Dongmin Liu (2011), "Dietary Epicatechin Promotes Survival of Obese Diabetic Mice and Drosophila melanogaster ", The Journal of Nutrition, 141(6), 1095–1100. 21. Jin Hye-Young, Ahn Tai-Hyeon, Song Jeong Hwa, Lee Junseok, and Choi Ha Yong (2012), "Biological Control Against Aphids Using Natural Enemies in Tropical Plants Resources Research Center of Korea National Arboretum", Journal of the Korea Society of Environmental Restoration Technology, 15(1), 27-33. 22. Junji Terao, Mariusz Piskula, and Qing Yao (1994), "Protective Effect of Epicatechin, Epicatechin Gallate, and Quercetin on Lipid Peroxidation in Phospholipid Bilayers", Archives of Biochemistry and Biophysics, 308(1), 278-284. 23. Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, Ha Vu Hoang, and Tuyen Nguyen Manh (2016), "Phytochemical and anti-inflammatory effect from the leaf of Sanchezia speciosa Leonard growing in Vietnam", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 8(7), 309-315. 24. M.E.Alañón, S.M.Castle, G.Serra, A.Lévèques, L.Poquet, L.Actis- Goretta, and J.P.E.Spencer (2019), "Acute study of dose-dependent @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. effects of (−)-epicatechin on vascular function in healthy male volunteers: A randomized controlled trial", Clinical Nutrition, Published online. 25. Manivannan Rajamanickam, Prabakaran Kalaivanan, and Ilayaraja Sivagnanam (2013), "Antibacterial and Wound Healing Activities of Quercetin-3-O-Α-L-Rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside Isolated from Salvia leucantha", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 22(1), 264-268. 26. Ming Xin Ren, Xiao Hui, Deng Fang Ai, Guo Yan Yuan, and Hai Yan Song (2015), "Effect of quercetin on the proliferation of the human ovarian cancer cell line SKOV-3 in vitro", Experimental and therapeutic medicine, 10(2), 579-583. 27. Mohammadjavad Paydar, Yi Li Wong, Bushra Abdulkarim Moharam, Won Fen Wong, and Chung Yeng Looi (2013), "In vitro anti-oxidant and anti-cancer activity of methanolic extract from Sanchezia speciosa leaves", Pakistan Journal of Biological Sciences, 16(20), 1212-1215. 28. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S. Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1954), "Steroidal sapogenins: XII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 43(8), 503-505. 29. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S. Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1954), "Steroidal sapogenins: VII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 43(1), 1-7. 30. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S. Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1957), "Steroidal sapogenins @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. XLIII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 46(11), 653-684. 31. Sciences W. A. O. And Sciences. W. A. O. (1922), Journal of the Washington Academy of Sciences. 32. Samo Kreft, Mark Knapp, and Ivan Kreft (1999), "Extraction of rutin from buckwheat (Fagopyrum esculentumMoench) seeds and determination by capillary electrophoresis", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(11), 46-52. 33. And Sciences. W. A. O. Sciences W. A. O (1926), Journal of the Washington Academy of Sciences. 34. Shumaia Parvin, Abu Shuaib Rafshanjani, Abdul Kader, and Tahmida Sharmin (2015), "Preliminary phytochemical screening and cytotoxic potentials from leaves of Sanchezia speciosa Hook. f", International Journal of Advances in Scientific Research, 1(3), 145-150. 35. Steenis. M. Van and Joop Van Lenteren (1995), Evaluation and application of parasitoids for biological control of Aphis gossypii in glasshouse cucumber crops, Agricultural University. 36. Touré Abdoulaye, Kablan Ahmont Landry Claude, Kabran Aka Faustin, Adiko N’dri Marcelline, Kablan Richmond Jean-François, Akoubet Ouayogodé Aminata, Konan Dibi Jacques, Gnaoré Dohouré Toussaint, Attioua Koffi Barthélémy, and Coulibaly Adama (2018), "Isolation of (+)-catechin and (-)-epicatechin from the leaves of Amaranthus cruentus L. (Amaranthaceae)", International Journal of Chemical Studies, 6(2), 3697-3700. 37. Van Nguyen Thi Hong, Bach Pham Cao, Inh Cam Thi, Phuong Doan Lan, Thanh Le Tat, Toan Tran Quoc, and Long Pham Quoc (2019), @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  52. "Flavonoids isolated from the flowers of Camellia Chrysantha", Vietnam journal of science and technology, 57(3). 38. Zhenlin Huanga, Xiaoqi Jingab, Yuchen Shengb, Jiaqi Zhanga, Zhanxia Haoa, Zhengtao Wanga, and Lili Jia (2019), "(-)-Epicatechin attenuates hepatic sinusoidal obstruction syndrome by inhibiting liver oxidative and inflammatory injury", Redox Biology, 22. Website 39. Foods in which the polyphenol Quercetin 3-O-rutinoside is found, accessed, from 40. Nguyễn Thúy Oanh (2019), Tìm hiểu về bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, accessed, from khoe/tim-hieu-ve-benh-viem-loet-da-day-ta-trang/. 41. Sanchezia, accessed, from 42. Web Site Bộ Y Tế (2017), Khoảng 70 phần trăm người Việt Nam nhiễm loại vi khuẩn có thể gây ung thư dạ dày, accessed, from loai-vi-khuan-co-the-gay-ung-thu-da-day. 43. Xăng xê chữa đau dạ dày, accessed, from n4266.html. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  53. PHỤ LỤC Phiếu kết quả giám định mẫu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  54. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU