Khóa luận Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý (Asclepiadaceae))

pdf 48 trang thiennha21 18/04/2022 170
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý (Asclepiadaceae))", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_xay_dung_tieu_chuan_co_so_cua_duoc_lieu.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý (Asclepiadaceae))

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý( Asclepiadaceae)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC    NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA DƯỢC LIỆU BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý Asclepiadaceae)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2015Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS ĐỖ THỊ HÀ 2. TS. VŨ ĐỨC LỢI HÀ NỘI - 2020
  3. LỜI CẢM ƠN Em là Nguyễn Thị Ngọc Liên, sinh viên K4 Dược học. Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS. Đỗ Thị Hà, TS. Vũ Đức Lợi, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS. Phạm Thị Thúy, DS. Vũ Thị Diệp, những người chị, người thầy đã đồng hành và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu cùng các anh chị, các bạn ở Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Em xin gửi lời cám ơn Nghị định thư Việt - Hàn "Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam" đã hỗ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Liên
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ DĐVN V Dược điển Việt Nam V EtOH Ethanol SD Độ lệch chuẩn Rf Hệ số di chuyển TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TT Thuốc thử TLC Thin layer chromatography UV Ánh sáng tử ngoại v/v Tỉ lệ thể tích/thể tích
  5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Bù ốc leo 5 Bảng 3. 1. Kết quả định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phản ứng ống nghiệm 23 Bảng 3. 2. Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo 26 Bảng 3. 3. Tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo 26 Bảng 3. 4. Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo 27 Bảng 3. 5. Hàm lượng chất chiết được trong nước 27 Bảng 3. 6. Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% 27 Bảng 3. 7. Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo 28
  6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. 1. Hình ảnh loài Dregea volubilis (L. f) Benth. ex Hook.f. [6] 4 Hình 1. 2. Các hợp chất polyhydroxy pregnanes phân lập được từ Bù ốc leo 8 Hình 1. 3. Các hợp chất polyoxypregnan glycoside phân lập được từ Bù ốc leo. 9 Hình 1. 4. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ Bù ốc leo [12, 16, 23,29] 9 Hình 1. 5. Các hợp chất phenolic phân lập được từ Bù ốc leo [12] 10 Hình 1. 6. Hợp chất pentacyclic triterpenoid phân lập được từ Bù ốc leo [14] 10 Hình 1. 7. Các hợp chất sterol và carbohydrate phân lập được từ Bù ốc leo[14] 10 Hình 3. 1. Hình ảnh dược liệu Bù ốc leo 20 Hình 3. 2. Hình ảnh vi phẫu thân Bù ốc leo 21 Hình 3. 3. Hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo 22 Hình 3. 4. Đặc điểm bột dược liệu Bù ốc leo 23 Hình 3. 5. Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Bù ốc leo 25
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về chi Dregea 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.1.3. Phân bố 2 1.2. Tổng quan về loài Dregea volubilis (L.f.) Benth. ex Hook.f. 3 1.2.1. Danh pháp 3 1.2.2. Đặc điểm thực vật 3 1.2.3. Phân bố và sinh thái 4 1.2.4. Tính vị, công năng, tác dụng 4 1.2.5. Thành phần hóa học 5 1.2.6. Tác dụng dược lý 11 1.3. Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở 11 1.3.1. Tình hình sử dụng dược liệu 11 1.3.2. Xây dựng TCCS 11 1.3.3. Phương thức xây dựng TCCS 11 1.3.4. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu 12 1.3.5. Tiêu chuẩn đã công bố về dược liệu Bù ốc leo 12 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc, thiết bị 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Dung môi, hóa chất, thiết bị 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Mô tả 15 2.2.2. Vi phẫu 15 2.2.3. Soi bột 15
  8. 2.2.4. Định tính 15 2.2.5. Độ ẩm 17 2.2.6. Tro toàn phần 17 2.2.7. Tro không tan trong acid 17 2.2.8. Xác định hàm lượng chất chiết được 18 2.2.9. Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 20 3.1. Kết quả khảo sát xác định các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốcleo 20 3.1.1. Kết quả mô tả đặc điểm dược liệu 20 3.1.2. Kết quả xác định đặc điểm vi phẫu 20 3.1.3. Kết quả xác định đặc điểm bột dược liệu 22 3.1.4. Kết quả định tính 23 3.1.5. Kết quả xác định độ ẩm 26 3.1.6. Kết quả xác định tro toàn phần 26 3.1.7. Kết quả xác định tro không tan trong acid 26 3.1.8. Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu 27 3.1.9. Kết quả định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân 28 3.2. Kết quả xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo 28 3.2.1. Yêu cầu kỹ thuật 28 3.2.2. Phương pháp thử 29 3.2.3. Đóng gói và bảo quản 31 3.3. Bàn luận 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  9. MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu của con người về các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng càng cao. Bên cạnh đó, xu hướng nghiên cứu các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ nguồn động thực vật cũng rất được quan tâm. Các nhà khoa học ở Việt Nam cũng tham gia vào tìm kiếm, phát triển lĩnh vực này. Là một đất nước có nguồn thực vật phong phú, chúng ta có tiềm năng rất lớn về tài nguyên cây thuốc. Đây là tiền đề tốt để nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu. Cây Bù ốc leo là cây thuốc phổ biến ở Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây có mặt ở vùng Lai Châu, Ninh Bình, Ninh Thuận, TP Hồ Chí Minh, Toàn cây có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, chỉ thống, chỉ thổ. Dân gian vẫn dùng các bộ phận trên mặt đất của cây để trị mụn nhọt, rắn cắn, đau dạ dày, các bệnh về mắt [6]. Cũng có tài liệu cho thấy, nhân dân còn dùng rễ, thân mềm như một vị thuốc gây nôn, long đờm [16]. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Bù ốc leo, đáng chú ý là: chống ung thư [21], chống viêm [23]. Cũng có nhiều nghiên cứu khác chỉ ra các tác dụng như chống đái tháo đường [16], trị giun sán [22], chống mất trí nhớ [35]. Ở Việt Nam, cây Bù ốc leo chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, tác dụng sinh học cũng như tiêu chuẩn đánh giá chất lượng. Do đó, các nghiên cứu về cây sẽ là tiền đề để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Bù ốc leo, tạo nền tảng cho việc dần đưa cây thuốc vào thực tế sử dụng một cách khoa học. Xuất phát từ những thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Bù ốcleo (Dregea volubilis (L.f.) Benth. ex Hook.f., họ Thiên lý Asclepiadaceae)” được thực hiện với những mục tiêu: 1. Xác định được các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốcleo 2. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Bù ốc leo 1
  10. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Dregea 1.1.1. Vị trí phân loại Theo Thực vật học [10], [9], vị trí phân loại của chi Bù ốc (Dregea) trong giới thực vật như sau: Giới (Kingdom) Thực vật (Planta) Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) Hai lá mầm (Magnoliopsida) Phân lớp (Subclass) Bạc hà (Lamiidae) Bộ (Order) Long đởm (Gentianales) Họ (Family) Thiên lý (Asclepiadaceae) Chi (Genus) Bù ốc (Dregea) 1.1.2. Đặc điểm thực vật Chi Dregea gồm các loài thường là cây bụi trườn, leo hay cỏ bò, không có rễ phụ phát triển trên thân. Lá mọc đối. Cụm hoa xim hình tán. Thùy đài nhỏ, hình trứng nhọn đầu đôi khi tù; gốc đài không có hoặc có 5 tuyến. Tràng hình bánh xe; tràng không dính nhau thành ống đứng, cánh hoa vặn, phủ nhau bên phải. Tràng phụ đơn, gồm 5 vảy nạc, hình cầu, dính với cột nhị-nhụy. Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô; trung đới kéo dài thành phần phụ; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy hình nón hay gồ ghề; đỉnh bầu không thót lại thành hình vòi nhụy. Quả nang dày, có các khía lồi dạng cánh [6]. Hạt có mào lông [26]. 1.1.3. Phân bố Trên thế giới: chi Dregea có khoảng 12 loài, phân bố ở châu Á và châu Phi [6, 26, 42]. Ở Việt Nam: chi Dregea là một chi nhỏ của họ Thiên lý. Theo thống kê trong Thực vật chí Việt Nam tập 15 - Họ Thiên lý (Asclepiadaceae), tính đến năm 2017, chi Dregea ở Việt Nam có 2 loài là Bù ốc leo (Dregea volubilis (L. f.) Benth. & Hook.) và Bù ốc Đà Lạt (Dregea cuneifolia Tsiang & P. T. Li) [6]. Tuy nhiên, năm 2011, 2
  11. Trần Thế Bách và cộng sự đã phát hiện một loài Dregea chưa xác định khi nghiên cứu thực địa tại khu vực Tây Nguyên, Vườn quốc gia Kon Ka Kinh. Đến năm 2018, khi so sánh với tiêu bản của các loài Dregea đã biết, loài này được xác định là loài mới, có tên khoa học là Dregea taynguyenensis T.B. Tran & Rodda [19]. 1.2. Tổng quan về loài Dregea volubilis (L.f.) Benth. ex Hook.f. 1.2.1. Danh pháp Tên tiếng Việt: Bù ốc leo Tên khoa học: Dregea volubilis (L.f.) Benth. ex Hook.f. Họ thực vật: Asclepiadaceae Tên nước ngoài: Green wax flower (tiếng Anh) Harandodi (tiếng Hindi) Nan shan teng (tiếng Trung Quốc) 1.2.2. Đặc điểm thực vật Cây leo dài đến 12 m. Cành màu xám tái, vỏ có bì khổng, cành non xanh, nhẵn. Lá mọc đối; phiến lá hình trứng rộng, cỡ 7-18 x 4-17 cm, nhẵn hay có lông mềm; đỉnh nhọn hay có mũi ngắn; gốc hình tim nông; gân bên 4 cặp [6, 26]. Gân lá dạng mạng lưới, mặt trên của lá có màu xanh đậm và mặt dưới có màu xanh nhạt. Cuống lá dài 3- 5 cm. Mùi hăng đặc biệt và vị đắng [13]. Cụm hoa rũ xuống, nhiều hoa, xếp thành xim, dạng tán; cuống cụm hoa dài 2-6 cm, có lông. Cuống hoa dài 2-2,5 cm. Hoa màu xanh hay màu xanh-vàng nhạt, thơm. Thùy đài hình trứng-thuôn, dài 2,5-3 mm, có lông, tràng hoa hình bánh xe, nhẵn; thùy tràng hình trứng rộng, vặn, phủ nhau bên phải, cỡ 6-12 x 5-12 mm, có lông. Tràng phụ đơn, gồm 5 vảy nạc, màu xanh-màu vàng nhạt, đường kính 4-4,5 mm. Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô; trung đới kéo dài thành phần phụ màu trắng; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, thuôn; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Bầu có lông. Quả đại, hình trứng hẹp, cỡ 10-15 x 3-4 cm. Hạt hình trứng dẹt cỡ 1,2 x 0,6 cm; mào lông dài 4,5 cm [6, 7, 26]. 3
  12. Hình 1. 1. Hình ảnh loài Dregea volubilis (L. f) Benth. ex Hook.f. [6] 1. cành mang hoa; 2. hoa; 3. đài (mở ra); 4. tràng (mở ra); 5. tràng phụ, cột nhị nhụy; 6. cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium); 7. nhụy; 8. quả; 9. hạt; 1.2.3. Phân bố và sinh thái Bù ốc leo có tên là Jukti trong tiếng Bengal, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Sri Lanka, Bangladesh, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Philippines [21]. Ở Việt Nam, Bù ốc leo thường phân bố ở Lạng Sơn (Hữu Lũng - Hữu Liên), Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương), Nghệ An (Tương Dương: Tam Đình), Ninh Thuận (Phan Rang-Tháp Chàm, Ninh Hải, Vườn quốc gia Núi Chúa), Hồ Chí Minh, một số tỉnh Trung và Nam Bộ và một số nơi khác [6, 7]. 1.2.4. Tính vị, công năng, tác dụng Bộ phận dùng: Toàn cây và thân dạng rễ Tính vị, công năng: Dây, rễ bù ốc leo có vị đắng, cay, tính mát, công năng thanh nhiệt, tiêu viêm, trừ thấp chỉ thống, chỉ thổ, chỉ lỵ[11]. Tác dụng: 4
  13. Lá ăn được, thường dùng luộc ăn. Ở Sri Lanka lá được dùng làm rau ăn và dễ dàng tìm thấy ở các chợ địa phương [27]. Lá cây ngâm trong dầu dùng trị bệnh mụn nhọt ở giai đoạn đầu và làm cho chóng mưng mủ ở các giai đoạn sau. Lá và thân cây được ứng dụng nhiều trong dân gian, nhưng ở mức độ phổ biến còn thấp. Ở nước ta, người ta sử dụng lớp bột màu nâu trên quả làm thuốc trị bệnh gia súc. Ở Ấn độ, lá dùng điều trị thấp khớp, ho, sốt, cảm lạnh [33]. Ngoài ra, lá còn được dùng cùng với hạt tiêu để điều trị chứng khó tiêu [24]. Vỏ thân được dùng cùng sữa để trị nhiễm trùng đường tiết niệu [38]. Rễ và thân mềm xem như chất gây nôn và long đờm. Toàn thân cây dùng trị cảm lạnh và bệnh tật về mắt, làm hắt hơi; còn dùng trị rắn cắn [25]. Ngoài ra lá còn được dùng trị viêm khí quản, đau dạ dày [40]. 1.2.5. Thành phần hóa học Nghiên cứu định tính các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học cho thấy lá Bù ốc leo có chứa amino acid, protein, lipid, anthraquinon, flavonoid, coumarin, saponin, glycosid tim, tannin, catechin, phytosterol, alcaloid, gum, chất nhầy [37], steroid, carbohydrat, chất béo, triterpenoid, đường khử [23]; vỏ thân chứa polyphenol, flavonoid, alcaloid, proanthocyanidin [18]; hoa chứa carbohydrat, protein, amino acid, steroid, glycosid, alcaloid, tanin, flavonoid, polyhydroxy pregnan [17]; quả chứa anthocyanidin, flavonoid, các hợp chất phenolic, amino acid [12]; rễ chứa glycosid [36]. Purushoth Prabhu T. và cộng sự tiến hành định tính các dịch chiết từ Bù ốc leo bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Kết quả thấy rằng sắc ký đồ của cao chiết n- hexan xuất hiện 5 vết với các giá trị Rf là 0,92; 0,85; 0,79; 0,64; 0,52. Sắc ký đồ của cao chiết chloroform xuất hiện 4 vết với các giá trị Rf 0,88; 0,77; 0,74; 0,66 [32]. Các nghiên cứu chiết xuất, phân lập cho thấy thành phần hóa học của Bù ốc leo gồm các hợp chất polyhydroxy pregnan [30, 37], polyoxypregnan glycosid [14, 16, 23, 34], flavonoid [12, 16, 23, 29], triterpenoid, sterol, carbohydrat [14] và các hợp chất phenolic [12]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Bù ốc leo Nhóm chất Tên chất TLTK TT 1 Polyhydroxy Dregealol (1); volubilogenon (2); volubilol (3); [30, 37] pregnan iso-drevogenin P (4); 17α-marsdenin (5); drevogenin D (6), drevogenin A (7), drevogenin P 5
  14. (8) 2 Polyoxypregnan Volubilosid A (9); volubilosid B (10); volubilosid [14, 16, glycosid C (11) 23, 34] 12-0-benzoyl-8, 11-ditigloyl-3β, 8β, 11α, 12β, [36] 14β-pentahydroxy-pregn-14-ol, 20-on,-3-O- methyl-β-D-allopyranosyl (1→4)-β-D- thevetopyranosid (12) Drevogenin A 3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D- [41] allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranosid (13) Drevogenin A 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3- O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (14) Drevogenin A 3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D- allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosid (15) Drevogenin A 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3- O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (16) Drevogenin C 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-3- O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β- D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (17) Drebyssogenin K2 3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D- allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranosid (18) 6
  15. drebyssogenin K2 3-O-3-O-methyl-6-deoxy-β-D- allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl- (1→4)-β-D-cymaropyranosid (19) 3 Flavonoid Vitexin (20), rutin, quercetin (21), luteolin (22), [12, 16, kaempferol (23), isovitexin, isoorientin, apigenin 23, 29] (24), delphinidin (25), petunidin (26) 4 Hợpchất Acid isochlorogenic (27), acid caffeic(28), acid [12] phenolic gentisic (29), acid vanillic (30), acid cinnamic (31), acid β-resorcyclic (32), acid cis-p-coumaric (33) Pentacyclic Taraxeron (34), dregeanin (35) [14] 5 triterpenoid 6 Sterol β- sitosterol (36) [14] 7 Carbohydrat D–cymarose (37), L-olendrose (38) [14] (1) R1 = H, R2 = tigloyl (3) R1 = OH, R2 = H (6) R1 = R2 = H (2) R1 = OH, R2 = H (4) R1 = R2 =H (5) R1 = H, R2 = OH 7
  16. (7) (8) Hình 1. 2. Các hợp chất polyhydroxy pregnanes phân lập được từ Bù ốc leo (12) 8
  17. Hình 1. 3. Các hợp chất polyoxypregnan glycoside phân lập được từ Bù ốcleo. (21) R1 = OH, R2= OH (22) R1 = OH, R2 = H (23) R1 = H, R2 = OH (24) R1 = H, R2 = H (20) (25) R = OH (26) R = OCH3 Hình 1. 4. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ Bù ốc leo[12, 16, 23, 29] 9
  18. (27) (28) (29) (30) (31) Hình 1. 5. Các hợp chất phenolic phân lập được từ Bù ốc leo[12] (34) (35) Hình 1. 6. Hợp chất pentacyclic triterpenoid phân lập được từ Bù ốc leo[14] (36) (37) Hình 1. 7. Các hợp chất sterol và carbohydrate phân lập được từ Bù ốcleo[14] 10
  19. 1.2.6. Tác dụng dược lý Theo các nghiên cứu, Bù ốc leo có các tác dụng chống ung thư [21], trị đái tháo đường [16], chống oxy hóa [15], chống viêm [23], trị ký sinh trùng [22] và hạ sốt, giảm đau [28]. 1.3. Tổng quan về tiêu chuẩn cơ sở 1.3.1. Tình hình sử dụng dược liệu Dược liệu là nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật, động vật, khoáng vật và đạt tiêu chuẩn làm thuốc [5]. Tại hội thảo “Nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và thuốc từ dược liệu trong thời kỳ hội nhập”, ngày 7-8/7/2016 tại Cần Thơ, ông Nguyễn Thanh Long – thứ trưởng Bộ Y tế - cho biết mỗi năm ngành dược trong nước tiêu thụ khoảng 60 tấn dược liệu, nhưng dược liệu trong nước chiếm khoảng 10%, còn lại chủ yếu nhập từ Trung Quốc qua đường tiểu ngạch với chất lượng không được kiểm soát hoàn toàn. Bên cạnh đó còn vấn nạn dược liệu giả. Dược liệu giả là dược liệu thuộc một trong các trường hợp sau đây: Không đúng loài, bộ phận hoặc nguồn gốc được cơ sở kinh doanh cố ý ghi trên nhãn hoặc ghi trong tài liệu kèm theo; Bị cố ý trộn lẫn hoặc thay thế bằng thành phần không phải là dược liệu ghi trên nhãn; dược liệu bị cố ý chiết xuất hoạt chất; Được sản xuất, trình bày hoặc dán nhãn nhằm mạo danh nhà sản xuất, nước sản xuất hoặc nước xuất xứ [5] Dược liệu trước khi đưa vào sử dụng đều phải được kiểm tra chất lượng và phải đạt yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn đã đăng ký như tiêu chuẩn Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở. Vấn đề được đặt ra lúc này là làm sao để biết được dược liệusử dụng có đạt chất lượng, vì có nhiều dược liệu chưa có chuyên luận trong Dược điển hoặc chưa được nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở. 1.3.2. Xây dựng TCCS Tiêu chuẩn cơ sở là tiêu chuẩn do tổ chức kinh tế, tổ chức xã hội – nghề nghiệp, cơ quan nhà nước, đơn vị sự nghiệp và các cơ quan, tổ chức khác công bố để áp dụng trong các hoạt động của tổ chức đó Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực tiễn của cơ sở. Các tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, khu vực hoặc nước ngoài tương ứng được khuyến khích sử dụng để xây dựng hoặc chấp nhận thành tiêu chuẩn cơ sở [1] 1.3.3. Phương thức xây dựng TCCS Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau: 11
  20. – Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở. Khi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu, ta phải tham khảo các chuyên luận về tiêu chuẩn cơ sở của dược điển nước ngoài, như Dược điển Hoa Kỳ, dược điển Anh, Dược điển Trung Quốc, trên cơ sở các chuyên luận về tiêu chuẩn cơ sở dược liệu quy định trong DĐVN V. – Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở trên cơ sở sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm. Thực hiện các nghiên cứu về xây dựng tiêu chuẩn, đánh giá trên nhiều mẫu của dược liệu đó được thu hái ở những địa điểm khác nhau, để phân tích, tổng hợp thành một tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu. – Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành. Có những chuyên luận về dược liệu khi đưa ra xem xét có chỉ tiêu nào đó không đạt hoặc cần bổ sung thêm các chỉ tiêu khác, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm để bổ sung, hoàn thiện để chuyên luận đã có đánh giá tốt nhất về chất lượng dược liệu được sử dụng[1]. 1.3.4. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu có thể khái quát các phương pháp như sau, được quy định trong phụ lục 12.2, DĐVN V[4] - Phương pháp cảm quan: bao gồm những mô tả về hình thái kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của dược liệu. - Phương pháp định tính: bao gồm những phương pháp dùng để nhậnbiết dược liệu, bao gồm phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa. - Thử tinh khiết và cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu: mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6), tro toàn phần và tro không tan trong acid (Phụ lục 9.7 và 9.8), các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối (Phụ lục 12.11), . - Phương pháp định lượng: là việc xác định hàm lượng của một hay mộtsố chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. 1.3.5. Tiêu chuẩn đã công bố về dược liệu Bù ốc leo Hiện nay, các nghiên cứu đánh giá chất lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Bù ốc leo còn rất hạn chế. Dược liệu này chưa có chuyên luận riêng trong các Dược điển. Theo nghiên cứu của Sudhakar P. và cộng sự, vi phẫu thân và lá bù ốc leo có các đặc điểm: biểu bì gồm một lớp tế bào hình trụ, hình bầu dục đến hình tròn, dưới lớp biểu bì có dày đặc các tế bào calci oxalat trong các tế bào, mô xốp gồm 6-8 lớp tế bào dày, hình trụ, các tế bào hình tròn, hình bầu dục đến thuôn, tế bào nội bào hẹp, 12
  21. bao quanh bởi nhiều lục lạp. Bột dược liệu có các đặc điểm: màu nâu vàng, vị đắng, quan sát dưới kính hiển vi thấy các mảnh biểu bì hình đa giác hoặc có cấu trúc song song và tinh thể calci oxalat dày đặc [39]. Biswas M. và cộng sự đã tiến hành định lượng phenolic tổng số Bù ốc leo bằng phương pháp đo quang. Kết quả thấy rằng, hàm lượng phenolic tổng số trong cao chiết quả bù ốc leo là 95,03 μg pyrocatechol/mg cao chiết [15, 20]. Das B. và cộng sự đã định lượng hàm lượng phenolic tổng số và hàm lượng flavonoid tổng số trong hoa Bù ốc leo bằng phương pháp đo quang. Kết quả thấy rằng hàm lượng phenolic tổng số trong cao chiết hoa khô Bù ốc leo là 39,82 ± 1,22 μg acid gallic/mg cao chiết. Hàm lượng flavonoid tổng số trong cao chiết hoa khô Bù ốc leo là 27,50 ± 0,87 μg quercetin/mg cao chiết [16, 31]. Nghiên cứu của Purushoth Prabhu T. và cộng sự đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của Bù ốc leo, gồm độ ẩm (11,25%), tro toàn phần (18%), tro không tan trong acid (0,75%), hao tổn khi làm khô (6,27%) [32]. 13
  22. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc, thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, thân, cụm hoa, quả) được thu hái tại bản Vàng Pheo, xã Mường So, huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu vào ngày 25/4/2018. Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Dregea volubilis (L.f.) Benth. ex Hook.f. (Phụ lục 1). Tiêu bản thực vật khô có cành mang lá, cuống lá, phiến lá, cụm hoa và đang được lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản HNU 024062 (Phụ lục 2). Sau khi thu hái, một phần thân và lá được được bảo quản trong EtOH 60% để nghiên cứu đặc điểm vi phẫu. Phần thân và lá còn lại được làm nhỏ, sấy khô ở 50ºC, bảo quản trong túi nilon sạch làm nguyên liệu nghiên cứu các chỉ tiêu chất lượng. 2.1.2. Dung môi, hóa chất, thiết bị Dung môi, hóa chất dùng trong định tính: Magie bột kim loại, HCl đậm đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 10%, anhydrid acetic, chloroform, H2SO4 đậm đặc. Máy móc, thiết bị - Kính hiển vi Axioskop 40 - Máy siêu âm Ultrasonic JPS – 100A - Máy cất quay Rotavapor R-210 - Tủ sấy Binder FD115 - Cân phân tích Mettler toledo MS204 - Cân xác định độ ẩm AND MF-50 - Bản mỏng: DC-Alufolien 60 GF254 (Merck) và RP18 (Merck). - Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (vải lọc, bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pitpet ), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình khai triển sắc ký ). 14
  23. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo dựa trên các chỉ tiêu chung được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN V [4] gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng, 2.2.1. Mô tả Tiến hành trên mẫu dược liệu là bộ phận trên mặt đất của cây Bù ốc leo đãsấy khô. Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan. Kiểm tra kích thước bằng cách đo. 2.2.2. Vi phẫu Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18 Mẫu dược liệu Bù ốc leo tươi gồm 2 phần lá, thân được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch javel trong ít nhất 30 phút, rửa sạch bằng nước 3 lần, tẩy bằng acid acetic khoảng 15 phút, rửa sạch bằng nước 3 lần, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với xanh methylen trong 5-30 giây và đỏ carmin trong khoảng 30 phút, sau mỗi thao tác đều phải rửa sạch bằng nước [8]. Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để quan sát các đặc điểm vi phẫu của dược liệu. 2.2.3. Soi bột Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.18. Phần trên mặt đất của dược liệu Bù ốc leo được làm khô rồi nghiền thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch glycerin, quan sát các đặc điểm của bột bằng kính hiển vi [8]. 2.2.4. Định tính 2.2.4.1. Định tính bằng phản ứng ống nghiệm Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [2, 3].  Định tính flavonoid: 15
  24. Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng n-hexan đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Bã dược liệu sau khi chiết bằng n- hexan để bay hơi dung môi đến khô. Chiết hồi lưu với 50 ml cồn 90º trong 30 phút. Lọc thu dịch chiết để làm các phản ứng sau: - Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm 3 – 5 giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh đen thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với kiềm: cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, cho thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%,àu m vàng đậm hơn thì phản ứng dương tính.  Định tính saponin: - Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90% đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách. 2.2.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Chuẩn bị mẫu: Lấy 1g bột thân, thêm 10 ml EtOH 70%, đun cách thủy 15 phút, lọc. Dịch lọc được dùng chấm sắc ký.Lặp lại quá trình chiết 3 lần thu được 3 mẫu dung dịch thử. Khai triển 3 mẫu trên cùng một bản mỏng với điều kiện sắc ký như sau: Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), bản mỏng silical gel 60 RP – 18 F254S (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng. Pha động: tiến hành với các hệ dung môi sau: + Hệ 1: dicloromethan - methanol (9:1, v/v); + Hệ 2: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) + Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v). Phát hiện vết: quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm, phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong EtOH và quan sát dưới ánh sáng thường. Tiến hành: chấm riêng biệt 10 µl mỗi mẫu thử lên bản mỏng đã hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi triển khai hệ 16
  25. dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, sấy bay hơi hết dung môi. Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm, UV 366nm. Phun thuốc thử. Sấy bản mỏng ở 105°C đến khi hiện vết. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường. 2.2.5. Độ ẩm Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.6 Độ ẩm của dược liệu được xác định theo Dược điển Việt Nam V, phụ lục 9.6. Phương pháp: cân chính xác khoảng 1,000 g bột dược liệu, sấy trong tủ sấy ở 105℃, áp suất thường đến khối lượng không đổi. Độ ẩm X (%) của dược liệu được xác định dựa trên công thức sau: − (%) = × 100% Trong đó: X: độ ẩm của dược liệu (%) m: khối lượng dược liệu trước khi sấy (g) a: khối lượng dược liệu sau khi sấy (g) 2.2.6. Tro toàn phần Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.8. Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy khoảng 1,000 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 - 105ºC rồi đem nung trong lò nung ở 600ºC ± 25ºC đến khối lượng không đổi (nung trong 4 giờ). Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Tỷ lệ % tro toàn phần (X%) của dược liệu được tính theo công thức: (%) = ∗ 100 Trong đó: m: khối lượng tro (g); M: khối lượng mẫu thử (g). 2.2.7. Tro không tan trong acid Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.7. Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 600ºC ± 25ºC đến khối lượng không đổi (nung trong 4 giờ). Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần. 17
  26. 2.2.8. Xác định hàm lượng chất chiết được Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 12.10, phương pháp chiết nóng, sử dụng dung môi là EtOH 70% và nước. Cân chính xác khoảng 2,000 g bột dược liệu, cho vào bình nón 250 ml. Thêm chính xác 50,0 ml dung môi, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu cách thủy sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105ºC trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính hàm lượng chất chiết được bằng ethanol 70% và bằng nước trong dược liệu khô theo công thức sau: 2 × × 100 (%) = × 100% × (100 − ) Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% hoặc trong nước (%) a: khối lượng cắn (g) b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%) 2.2.9. Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân Cân chính xác khoảng 1,000 g bột dược liệu, chiết hồi lưu ở 70oC 3 lần, mỗi lần 50 ml EtOH 70% trong 1 giờ. Lọc thu dịch chiết. Cất thu hồi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với 50 ml nước cất. Sau đó chiết lỏng - lỏng với khoảng n-hexan 3 lần, mỗi lần 50 ml để loại chất béo. Dịch chiết nước sau khi chiết với n–hexan tiếp tục chiết lỏng – lỏng với n-butanol 3 lần, mỗi lần 50 ml. Gộp các dịch chiết n-butanol, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn bằng 20 ml EtOH 70% rồi chuyển sang cốc có mỏ đã xác định khối lượng. Cô cách thủy thu được cắn. Sấy khô cắn ở 105oC đến khối lượng không đổi. Tính hàm lượng saponin tổng theo dược liệu khô kiệt theo công thức sau: × 100 (%) = × 100 푡 × (100 − ) Trong đó: X: hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%); Mc: khối lượng cắn saponin thu được (g); Mt: khối lượng dược liệu đã dùng (g); A: độ ẩm dược liệu (%). 18
  27. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. 19
  28. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả khảo sát xác định các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo 3.1.1. Kết quả mô tả đặc điểm dược liệu Dược liệu Bù ốc leo có mùi hăng. Phần thân khô có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp. Phần lá khô có màu xám. Lá tươi của Bù ốc leo có hình trứng hơi tròn, mũi ngọn, gốc hình tim nông. Hình 3. 1. Hình ảnh dược liệu Bù ốc leo 3.1.2. Kết quả xác định đặc điểm vi phẫu 3.1.2.1. Vi phẫu thân Vi phẫu thân có thiết diện tròn, quan sát trên kính hiển vi (Hình 3.2) thấy từ ngoài vào trong có các đặc điểm: biểu bì (2) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc hình đa giác 5 - 6 cạnh có kích thước khá đều nhau, cutin mỏng. Vỏ ngoài có lông che chở đơn bào (1). Mô mềm vỏ (3) gồm 10 - 12 lớp là những tế bào hình đa giác kích thước khác nhau, xếp xít nhau, không đều. Nằm rải rác trong phần vỏ và mô mềm ruột là tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4). Phần trụ bì nằm phía trong phần vỏ có các đám sợi tập trung bắt sáng (5), xếp thành vòng tròn trên thiết diện cắt ngang vi phẫu thân. Tiếp đến là bó libe gỗ (6) và mạch gỗ rất phát triển (7). Trong cùng là mô mềm ruột (8), gồm những tế bào hình gần tròn có vách mỏng. 20
  29. Hình 3. 2. Hình ảnh vi phẫu thân Bù ốc leo 1. Lông che chở; 2. Biểu bì; 3. Mô mềm vỏ; 4. Đám sợi; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Mô mềm ruột; 8. Tinh thể calci oxalat. 3.1.2.1. Vi phẫu lá Quan sát trên kính hiển vi thấy (Hình 3.3), hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo có tính đối xứng, từ trên xuống dưới gồm các phần: lông che chở đơn bào (1), lớp tế bào biểu bì trên gân chính (2), mô mềm trên và dưới (3,6), bó libe (4) và mạch gỗ (5) phát triển . Rải rác trong phần mô mềm là các tinh thể calci oxalat (7), dưới cùng là lớp tế bào biểu bì dưới gân chính (8). 21
  30. Hình 3. 3. Hình ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo 1. Lông che chở; 2. Tế bào biểu bì trên gân chính; 3, 6. Mô mềm; 4. Libe; 5. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat; 8. Tế bào biểu bì dưới gân chính. 3.1.3. Kết quả xác định đặc điểm bột dược liệu Bột dược liệu Bù ốc leo có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị hơi đắng. Quan sát trên kính hiển vi (Hình 3.4) thấy có các đặc điểm sau: Bó sợi (1,2), sợi dài (5); các mảnh mạch: mạch điểm chứa tinh thể calci oxalat (3), mạch điểm (4), mảnh mạch (9), mảnh bần (10,11) và tế bào bần (6); khối nhựa có màu đỏ nâu (12); tinh thể calci oxalat (7,8). 22
  31. Hình 3. 4. Đặc điểm bột dược liệu Bù ốc leo 1,2. Bó sợi; 3. Mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat; 4. Mạch điểm; 5. Sợi; 6. Tế bào bần; 7,8. Tinh thể calci oxalat; 9. Mảnh mạch; 10,11. Mảnh bần; 12. Khối nhựa 3.1.4. Kết quả định tính 3.1.4.1. Định tính bằng phản ứng hóa học Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.4.4.1, thu được kết quả như trình bày ở bảng 3.1: Bảng 3. 1. Kết quả định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phản ứng ống nghiệm Kết quả Kết luận Phản ứng Phản ứng của saponin Phản ứng Salkowski Xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách Phản ứng dương tính Phản ứng của flavonoid Phản ứng với kiềm Dung dịch chuyển màu vàng đậm hơn Phản ứng dương tính 23
  32. Phản ứng Cyanidin Dung dịch chuyển màu hơi đỏ Phản ứng dương tính Phản ứng với FeCl3 Dung dịch chuyển màu xanh đen Phản ứng dương tính 3.1.4.2. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Tiến hành như mô tả ở mục 2.4.4.2, thu được các sắc ký đồ như hình 3.5: 24
  33. Hệ 1: diclomethan : methanol (9:1, v/v) Hệ 2: cloroform : ethyl acetat : methanol : nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v) Hình 3. 5. Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Bù ốc leo 25
  34. 1, 2, 3: các mẫu dược liệu Bù ốc leo; A: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm; B: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm; C: Phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, quan sát dưới ánh sáng thường. 3.1.5. Kết quả xác định độ ẩm Tiến hành như mô tả ở mục 2.5, thu được kết quả như tình bày ở bảng 3.2: Bảng 3. 2. Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo Khối lượng dược liệu Khối lượng dược Độ ẩm M ± SD Lần thí trước khi sấy (g) liệu sau khi sấy (g) (%) (%) nghiệm 1 1,014 0,8841 12,81 2 1,023 0,8922 12,79 12,81 ± 0,02 3 1,007 0,8778 12,83 Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 12.79% đến 12.83%. Như vậy, dự kiến độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo không quá 13%. 3.1.6. Kết quả xác định tro toàn phần Tiến hành như mô tả ở mục 2.6., kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.3: Bảng 3. 3. Tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo Khối lượng Khối lượng tro Tỷ lệ tro toàn phần M ± SD Lần thí dược liệu (g) (g) (%) (%) nghiệm 1 1,011 0,0583 5,77 2 1,013 0,0594 5,86 5,79 ± 0,07 3 1,004 0,0576 5,74 Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 5,74% đến 5,86%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro toàn phần không quá 6%. 3.1.7. Kết quả xác định tro không tan trong acid Tiến hành theo mô tả ở mục 2.7., kết quả thu được như bảng 3.4: 26
  35. Bảng 3. 4. Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo Khối lượng Khối lượng tro không Tỷ lệ tro không M ± SD Lần thí dược liệu (g) tan trong acid (g) tan trong acid (%) (%) nghiệm 1 1,011 0,0214 2,12 2 1,013 0,0223 2,20 2,14 ± 0,05 3 1,004 0,0211 2,10 Tỉ lệ tro không tan trong acid của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 2,10% đến 2,20%. Như vậy, dự kiến giới hạn tro không tan trong acid không quá 2,5%. 3.1.8. Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.8., kết quả xác định hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% và trong nước của Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.5 và 3.6: Bảng 3. 5. Hàm lượng chất chiết được trong nước Độ ẩm Khối lượng Khối lượng Chất chiết được M ± SD Lần thí (%) dược liệu (g) cắn (g) trong nước (%) (%) nghiệm 1 12,81 1,999 0,1425 16,35 16,29 2 12,79 2,003 0,1404 16,07 ± 0,15 3 12,83 2,002 0,1434 16,43 Hàm lượng chất chiết được trong nước của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,07% đến 16,43%. Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được trong nước của dược liệu Bù ốc leo không ít hơn 16%. Bảng 3. 6. Hàm lượng chất chiết được bằng EtOH 70% Độ ẩm Khối lượng Khối lượng Chất chiết được M ± SD Lần thí (%) dược liệu (g) cắn (g) trong EtOH 70% (%) (%) nghiệm 1 12,81 2,000 0,1463 16,78 16,80 2 12,79 2,000 0,1470 16,86 ± 0,04 3 12,83 1,999 0,1461 16,77 Hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo khoảng từ 16,77% đến 16,86%. Như vậy, dự kiến hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo không ít hơn 16%. 27
  36. 3.1.9. Kết quả định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.9., kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số của dược liệu Bù ốc leo được trình bày ở bảng 3.7: Bảng 3. 7. Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo Độ ẩm Khối lượng Khối lượng cắn Hàm lượng saponin M ± SD Lần thí (%) dược liệu (g) saponin (g) toàn phần (%) (%) nghiệm 1 12,81 1,000 0,0524 6,01 6,03 2 12,79 0,997 0,0521 5,99 ± 0,05 3 12,83 1,001 0,0532 6,10 Hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo xác định bằng phương pháp cân khoảng từ 5,99% đến 6,10%. Như vậy, dự kiến hàm lượng saponin trong dược liệu không ít hơn 6,0% 3.2. Kết quả xây dựng TCCS của dược liệu Bù ốc leo 3.2.1. Yêu cầu kỹ thuật 3.2.1.1. Mô tả Dược liệu có mùi hăng, phần thân khô có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp. Phần lá có màu xám. Lá tươi Bù ốc leo có hình trứng hơi tròn, mũ nhọn, gốc hình tim nông. 3.2.1.2. Vi phẫu Vi phẫu thân: Vi phẫu dược liệu có thiết diện hình tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm: vỏ ngoài có lông che chở; libe gỗ và mạch gỗ rất phát triển; mô mềm ruột và vỏ chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Vi phẫu lá: Vi phẫu lá đối xứng, gân phía trên và gân phía dưới đều lồi, gân phía dưới lồi nhiều hơn, vỏ ngoài có lông che chở. 3.2.1.3. Soi bột Bột dược liệu có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị đắng. Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat, bó sợi, tế bào sợi, tinh thể calci oxalat nằm rải rác. 3.2.1.4. Độ ẩm Không quá 13,0%. 3.2.1.5. Tro toàn phần Không quá 6,0%. 28
  37. 3.2.1.6. Tro không tan trong acid Không quá 2,5%. 3.2.1.7. Chất chiết được trong dược liệu Chất chiết được trong dược liệu trong nước không ít hơn 16%. Chất chiết được trong dược liệu trong ethanol 70% không ít hơn 16%. 3.2.1.8. Định tính: Dược liệu phải thể hiện phép thử định tính của saponin và flavonoid 3.2.1.9. Định lượng: Hàm lượng saponin tổng số xác định bằng phương pháp cân không được dưới 6,0% tính theo dược liệu khô kiệt. 3.2.2. Phương pháp thử 3.3.2.1. Mô tả: Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo trực tiếp, dược liệu phải đạt các yêu cầu đã nêu ở trên. 3.2.2.2. Vi phẫu: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và các chế phẩm bằng kính hiển vi. Dược liệu được cắt thành lát cắt ngang, nhuộm kép và quan sát dưới kính hiển vi, phải thấy các đặc điểm như đã mô tả. 3.2.2.3. Bột: Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.18 – Định tính dược liệu và các chế phẩm bằng kính hiển vi. Nghiền dược liệu khô thành bột mịn rồi quan sát dưới kính hiển vi trong 1 giọt dung dịch soi, phải thấy các đặc điểm như đã mô tả. 3.2.2.4. Độ ẩm: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105oC, 4 giờ. 3.2.2.5. Tro toàn phần: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8. 3.2.2.6. Tro không tan trong acid: Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.7. 3.2.2.7. Chất chiết được trong dược liệu Cân chính xác khoảng 2,000 g bột dược liệu, cho vào bình nón 250 ml. Thêm chính xác 50,0 ml dung môi, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu cách thủy sôi nhẹ 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng dung môi để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc cho vào một cốc thuỷ tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 105ºC trong 3 29
  38. giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy 2 × × 100 (%) = × 100% × (100 − ) Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% hoặc trong nước (%) a: khối lượng cắn (g) b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%) 3.2.2.8. Định tính a. Định tính bằng phản ứng ống nghiệm Định tính saponin: - Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90% đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách. Định tính flavonoid: - Phản ứng với kiềm cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, cho thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, màu vàng đậm hơn thì phản ứng dương tính. - Phản ứng Cyanidin cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm 3 – 5 giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính. - Phản ứng với FeCl3 cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh đen thì phản ứng dương tính. b. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V, phụ lục 5.4).  Thuốc thử, dụng cụ: Bản mỏng: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), bản mỏng silical gel 60 RP – 18 F254S (Merck), hoạt hóa ở 105℃ trong 30 phút. Hệ dung môi khai triển: + Hệ 1: dicloromethan - methanol (9:1, v/v); + Hệ 2: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (2:4:2:1, v/v/v/v, lớp dưới) + Hệ 3: aceton – nước (3:1, v/v). Thuốc thử hiện vết: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol.  Cách thử: 30
  39. Dung dịch thử: 3 mẫu dịch chiết dược liệu Bù ốc leo bằng EtOH 70% trong 1 giờ. Cách tiến hành: chấm riêng biệt 10 l mỗi dung dịch mẫu thử lên bản mỏng, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi khai triển hệ dung môi được 8 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng rồi phun thuốc thử hiện vết. Sấy bản mỏng ở 105℃ cho đến khi hiện rõ vết, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm. 3.2.2.9. Định lượng saponin tổng số bằng phương pháp cân Cân chính xác khoảng 1,000 g bột dược liệu, chiết hồi lưu ở 70oC 3 lần, mỗi lần 50 ml EtOH 70% trong 1 giờ. Lọc thu dịch chiết. Cất thu hồi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn với 50 ml nước cất. Sau đó chiết lỏng - lỏng với khoảng n-hexan 3 lần, mỗi lần 50 ml để loại chất béo. Dịch chiết nước sau khi chiết với n–hexan tiếp tục chiết lỏng – lỏng với n-butanol 3 lần, mỗi lần 50 ml. Gộp các dịch chiết n-butanol, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn bằng 20 ml EtOH 70% rồi chuyển sang cốc có mỏ đã xác định khối lượng. Cô cách thủy thu được cắn. Sấy khô cắn ở 105oC đến khối lượng không đổi. 2 × × 100 (%) = × 100% × (100 − ) Trong đó: X: hàm lượng chất chiết được trong EtOH 70% hoặc trong nước (%) a: khối lượng cắn (g) b: khối lượng dược liệu (g) x: độ ẩm của dược liệu (%) 3.2.3. Đóng gói và bảo quản - Dược liệu được bảo quản trong túi nilong kín, có nhãn rõ ràng, đúng quy chế. - Bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát. 3.3. Bàn luận  Về khảo sát các chỉ tiêu chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo Nghiên cứu này tiến hành khảo sát các chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu Bù ốc leo theo các tiêu chí chung được quy định trong DĐVN V, bao gồm: mô tả, vi phẫu, soi bột, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong EtOH 70%, chất chiết được trong nước, định tính nhóm chất flavonoid và saponin bằng phản ứng ống nghiệm, định tính bằng TLC, hàm lượng saponin tổng số. Dược liệu Bù ốc leo chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá chất lượng, cũng chưa có chuyên luận riêng 31
  40. trong Dược điển. Do đó, kết quả của nghiên cứu này góp phần tạo cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu này. Độ ẩm là hàm lượng ẩm trong dược liệu sau khi đã phơi hoặc sấy khô. Độ ẩm của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 12,81%. Kết quả này khá tương đồng với kết quả xác định của Purushoth Prabhu T. và cộng sự thực hiện, độ ẩm của dược liệu này là 11,25%. Tro toàn phần dùng để đánh giá các tạp chất lẫn trong dược liệu. Tạp chất này có thể có nguồn gốc là chất vô cơ có sẵn trong tế bào thực vật hoặc các tạp chất ngoại lai như đất, cát trên bề mặt dược liệu bị lẫn vào. Tỉ lệ tro toàn phần của dược liệu Bù ốc leo theo thực nghiệm là 5,79%. Dược điển Việt Nam V không quy định về giới hạn cho chỉ tiêu này. Đối chiếu với nghiên cứu về tiêu chuẩn Bù ốc leo đã được Purushoth Prabhu T. và cộng sự thực hiện, tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo thu hái ở Tamil Nadu, Ấn Độ là 18%. Có thể thấy tỉ lệ tro toàn phần của mẫu dược liệu Bù ốc leo sử dụng trong nghiên cứu này thấp hơn, chứng tỏ thành phần tạp chất vô cơ trong dược liệu được lấy ở Lai Châu, Việt Nam thấp hơn mẫu dược liệu được lấy ở Tamil Nadu, Ấn Độ. Tạp chất trong dược liệu gồm chất vô cơ có sẵn trong tế bào thực vật, hoặc những tạp đất cát dính trên dược liệu trước khi được xay nhỏ. Chỉ tiêu tro không tan trong acid đánh giá các tạp Silic và đất cát dính trên dược liệu. Tỉ lệ tro không tan trong acid của mẫu dược liệu Bù ốc leo sử dụng trong nghiên cứu này là 2,14%. Đối chiếu với đánh giá do Purushoth Prabhu T. và cộng sự thực hiện, kết quả xác định tỉ lệ tro không tan trong acid của mẫu dược liệu Bù ốc leo thu hái ở Tamil Nadu, Ấn Độ là 0,75%. Có thể thấy mẫu Bù ốc leo được lấy ở Lai Châu, Việt Nam có nhiều tạp Silic và đất cát hơn mẫu ở Tamil Nadu, Ấn Độ. Tuy nhiên, nhiều dược liệu khác cũng có tỉ lệ tro không tan trong acid khoảng 2%. Hàm lượng chất chiết được trong dược liệu Bù ốc leo được tiến hành với hai dung môi là nước và EtOH 70%. Kết quả cho thấy hàm lượng chất chiết được trong nước là 16,29% và trong EtOH 70% là 16,80%. Có thể thấy hàm lượng chất chiết được trong nước và trong EtOH 70% của dược liệu Bù ốc leo không có sự khác biệt đáng kể. Nghiên cứu này cũng đã xác định được các đặc điểm đặc trưng của vi phẫu thân, vi phẫu lá và đặc điểm bột của dược liệu Bù ốc leo, góp phần tạo cơ sở dữ liệu phục vụ công tác kiểm nghiệm, giúp phân biệt và xác định tính đúng của dược liệu này. Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, đề tài đã xác định được các nhóm chất saponin và flavonoid trong dược liệu. 32
  41. Về kết quả định tính dược liệu Bù ốc leo bằng phương pháp TLC, nghiên cứu này tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau và xác định được các hệ cho hiệu quả phân tách tốt. Với hệ pha động diclomethan – methanol (9:1, v/v), khi phun thuốc thử thấy trên sắc ký đồ xuất hiện 9 vết, với sự tách nhau khá rõ ràng. Với hệ pha động cloroform : ethyl acetat : methanol : nước (2:4:2:1, v/v/v/v), sau khi phun thuốc thử sắc ký đồ xuất hiện 10 vết. Với hệ pha động aceton – nước (3:1, v/v), sau khi phun thuốc thử thấy sắc ký đồ có 9 vết. Có thể thấy, khi triển khai sắc ký bằng các hệ dung môi này, các vết chất xuất hiện trên sắc ký đồ dịch chiết dược liệu Bù ốc leo đều gọn và phân tách nhau rõ ràng. Như vậy, nghiên cứu này đã khảo sát và xác định được các hệ dung môi phù hợp, hiệu quả trong việc định tính và xác định dấu vân tay hóa học của dược liệu Bù ốc leo. Về định lượng, nghiên cứu này đã xác định được hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo bằng phương pháp cân. Kết quả thấy rằng hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu Bù ốc leo khoảng 6,03%.  Về hạn chế của khóa luận Do một số nguyên nhân chủ quan và khách quan, đề tài vẫn còn những hạn chế. Trong nghiên cứu này, các chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bù ốc leo chưa được khảo sát trên nhiều mẫu nghiên cứu. Các mẫu nguyên liệu chưa lấy được ở nhiều vùng để đảm bảo tính đại diện, chưa cùng thời điểm để loại bỏ ảnh hưởng của thời điểm thu hái và thời gian bảo quản đến chất lượng của dược liệu. Nghiên cứu cũng chưa đưa ra được một số chỉ tiêu chưa thực hiện được như tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, Những nghiên cứu tiếp theo cần khắc phục những hạn chế này để tạo được cơ sở dữ liệu đầy đủ, góp phần xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng cho dược liệu Bù ốc leo. 33
  42. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Bù ốc leo như sau: 1. Mô tả Dược liệu có mùi hăng, phần thân khô có màu nâu hoặc xám xanh, giòn, xốp. Phần lá có màu xám. Lá tươi Bù ốc leo có hình trứng hơi tròn, mũ nhọn, gốc hình tim nông. 2. Vi phẫu Vi phẫu thân: Vi phẫu dược liệu có thiết diện hình tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm: vỏ ngoài có lông che chở; libe gỗ và mạch gỗ rất phát triển; mô mềm ruột và vỏ chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Vi phẫu lá: Vi phẫu lá đối xứng, gân phía trên và gân phía dưới đều lồi, gân phía dưới lồi nhiều hơn, vỏ ngoài có lông che chở. 3. Soi bột Bột dược liệu có màu lục vàng nhạt, mùi đặc trưng, vị đắng. Quan sát bằng kính hiển vi thấy các đặc điểm: mảnh điểm chứa tinh thể calci oxalat, bó sợi, tế bào sợi, tinh thể calci oxalat nằm rải rác. 4. Độ ẩm Không quá 13,0%. 5. Tro toàn phần Không quá 6,0%. 6. Tro không tan trong acid Không quá 2,5%. 7. Chất chiết được trong dược liệu Chất chiết được trong dược liệu trong nước không ít hơn 16,0%. Chất chiết được trong dược liệu trong ethanol 70% không ít hơn 16,0%. 8. Định tính Dược liệu phải thể hiện phép thử định tính của saponin và flavonoid 9. Định lượng Hàm lượng saponin tổng số xác định bằng phương pháp cân không được dưới 6,0% tính theo dược liệu khô kiệt. Kiến nghị 34
  43. - Do thời gian có hạn, đề tài mới chỉ xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở với một mẫu thu hái tại Lai Châu. Do đó, cần tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn để việc kết luận các chỉ tiêu mới có thể mang tính đại diện cho dược liệu Bù ốc leo. - Đề xuất xác định tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng, định lượng tổngàm h lượng flavonoid cho dược liệu Bù ốc leo. - Đề xuất nghiên cứu thiết lập dược liệu chuẩn đối chiếu và chất chuẩn đối chiếu. - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Bù ốc leo để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu Bù ốc leo trong Dược điển Việt Nam. 35
  44. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), "Thông tư 21/2007/TT-BKHCN, Hướng dẫn về xây dựng và áp dụng tiêu chuẩn". [2] Bộ môn Dược liệu (2012), "Phương pháp nghiên cứu dược liệu", Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tr.26-42. [3] Bộ môn Dược liệu (2010), "Thực tập Dược liệu", Hà Nội, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 59-78. [4] Bộ Y tế (2017), "Dược điển Việt Nam, tập V", NXB Y học. [5] Quốc Hội (2016), "Luật Dược". [6] Trần Thế Bách (2017), "Thực vật chí Việt Nam, tập 15", Hà Nội, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 25-32, 203-207. [7] Võ Văn Chi (2012), "Từ điển Cây thuốc Việt Nam", NXB Y Học, tr. 253-254. [8] Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hường (2017), "Giáo trình thực hành: Thực vật - Dược liệu - Dược học cổ truyền", Hà Nội, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 11-14. [9] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2005), "Thực vật học", Hà Nội, Trường Đại học Dược Hà Nội, 304-305. [10] Trần Thế Bách (2017), "Thực vật chí Việt Nam," Hà Nội, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 25-32. [11] Võ Văn Chi (2012), "Từ điển Cây thuốc Việt Nam", Hà Nội, Nhà xuất bản Y Học, 253-254. Tài liệu Tiếng Anh [12] Bharathamma G., Sudarsanam G. (2015), "Phytochemical investigation of aqueous fruit extracts of Dregea volubilis (Linn.) Benth," Indian. J Plant Sci, vol. 4, pp. 11-15. [13] Biswas Moulisha, Bhattacharya Sanjib, Mukhopadhyay R., Haldar PK. (2018), "Dregea volubilis (L. f.) Benth.(Asclepiadaceae): an appraisal on pharmacognostic, phytochemical and pharmacological studies," Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, vol. 18, (no). 1, pp. 1-8. [14] Biswas Moulisha, Bikash Mandal Nirup, Partha Palit, Kumar Ghosh Ashoke, Sukdeb Bannerjee, Kanti Haldar Pallab (2009), "In vitro anti-leishmanial and anti-tumour activities of a pentacyclic triterpenoid compound isolated from the fruits of Dregea volubilis Benth Asclepiadaceae," Tropical Journal of Pharmaceutical Research, vol. 8, (no). 2. [15] Biswas Moulisha, Haldar Pallab Kanti, Ghosh Ashoke Kumar (2010), "Antioxidant and free-radical-scavenging effects of fruits of Dregea volubilis," Journal of natural science, biology, and medicine, vol. 1, (no). 1, p. 29. [16] Das B., De A., Das M., Das S., Samanta A. (2017), "A new exploration of Dregea volubilis flowers: Focusing on antioxidant and antidiabetic properties," South African Journal of Botany, vol. 109, pp. 16-24. [17] Das Bhaskar, De Arnab, Das Piu, Nanda Amalesh, Samanta Amalessh (2019), "Pharmacognostic studies on flower of Dregea volubilis: Evaluation for 36
  45. authentication and standardization," Asian J Pharm Clin Res, vol. 12, (no). 5, pp. 79-89. [18] Chaudhuri S Dev, Chakraborty U. (2017), "Phytochemical constituents and radical scavenging activities of stem bark extracts of Dregea volubilis (Linn. F.) Benth ex. Hook. F," International J Pharm Sciences Res, vol. 8, pp. 4675- 4681. [19] Do Van Hai, Bui Ha Thu, Choi Sangho, Eum Sangmi, Rodda Michele (2018), "Dregea taynguyenensis (Apocynaceae, Asclepiadoideae), a new species from Vietnam," Phytotaxa, vol. 333, (no). 2, pp. 267-273. [20] Fatimah ZI., Zaiton Z., Jamaludin M., Gapor MT., Nafeeza MI., Khairul O. (1998), "Effect of estrogen and palm vitamin E on malondialdehyde levels toward the development of arteriosclerosis in the New Zealand white rabbit," Biological Oxidants and Antioxidants: Molecular Mechanism and Health Effects. AOCS Press, Champaign, IL, USA, p. 22. [21] Hossain Emdad, Chakroborty Saikat, Milan Ahmed, Chattopadhyay Pronobesh, Mandal Subhash C., Gupta JK (2012), "In vitro and in vivo antitumor activity of a methanol extract of Dregea volubilis leaves with its antioxidant effect," Pharmaceutical biology, vol. 50, (no). 3, pp. 338-343. [22] Hossain Emdad, Chandra Goutam, Nandy Anadi P., Gupta Jayanta Kumar, Mandal Subhash C. (2013), "Possible fasciocidal activity of methanol extract of Dregea volubilis leaves," Experimental parasitology, vol. 135, (no). 2, pp. 183-187. [23] Hossain Emdad, Sarkar Debjani, Maiti Anup, Chatterjee Mitali, Mandal Subhash C., Gupta Jayanta Kumar (2010), "Anti-inflammatory effect of a methanolic extract of leaves of Dregea volubilis," Journal of ethnopharmacology, vol. 132, (no). 2, pp. 525-528. [24] Kumar P., Ayyanar M., Ignacimuthu S. (2007), "Medicinal plants used by Malasar tribes of Coimbatore district, Tamil Nadu." [25] Shukla Amit Kumar, "Pharmacognostical, phytochemical and antipyretic activity studies," RGUHS, 2010. [26] Li Ping-tao, Michael G. Gilbert, W. Douglas Stevens (1995), "Flora of China," vol. 16, pp. 250. [27] Mathiventhan U., Sivakaneshan R. (2015), "Vitamin C content of commonly eaten green leafy vegetables in fresh and under different storage conditions," Tropical Plant Research, vol. 2, (no). 3, pp. 240-245. [28] Nandi Debkumar et al. (2009), "Anti-inflammatory and analgesic activities of leaf extract of Wattakaka volubilis (Dreagea volubilis)," International Journal of Green Pharmacy (IJGP), vol. 3, (no). 3. [29] Panda Nilendu, Mandal Debayan, Mandal Nirup B., Sahu Niranjan P., Banerjee Sukdeb (2006), "Flavonoid and flavone C-glycosides from Dregea volubilis," Natural Product Communications, vol. 1, (no). 9. [30] Panda Nilendu et al. (2003), "Polyhydroxy pregnanes from Dregea volubilis," Tetrahedron, vol. 59, (no). 42, pp. 8399-8403. [31] Pothitirat Werayut, Chomnawang Mullika Traidej, Supabphol Roongtawan, Gritsanapan Wandee (2009), "Comparison of bioactive compounds content, free radical scavenging and anti-acne inducing bacteria activities of extracts 37
  46. from the mangosteen fruit rind at two stages of maturity," Fitoterapia, vol. 80, (no). 7, pp. 442-447. [32] Purushoth Prabhu T., Selvakumari S., Thirumal P., Susmitha Deepthi (2012), "Preliminary phytochemical and standardization of the plant Dregea vobulilis., Benth," International Journal of Bioassays (IJB), vol. 01, pp. 15-17. [33] Rajadurai M., Vidhya VG., Ramya M., Bhaskar Anusha (2009), "Ethno- medicinal plants used by the traditional healers of pachamalai hills, Tamilnadu, India," Studies on Ethno-Medicine, vol. 3, (no). 1, pp. 39-41. [34] Sahu Niranjan P., Panda Nilendu, Mandal Nirup B., Banerjee Sukdeb, Koike Kazuo, Nikaido Tamotsu (2002), "Polyoxypregnane glycosides from the flowers of Dregea volubilis," Phytochemistry, vol. 61, (no). 4, pp. 383-388. [35] Sandhya Ch., Divya mohana K., Sasmitha S., Mounika P.V.N.S., Sampath kumar G.V. (2013), "Evaluation of Dregea volubilis leaf extract for its potential against stress induced amnesia in experimental rats," BioMedRx, vol. 1, (no). 3, pp. 304-307. [36] Sanyacharernkul S., Itghiarbha A., Kongtawelert P., Meepowpan P., Nuntasaen N., Pompimon W. (2009), "A new polyoxypregnane glycoside from the roots of Dregea volubilis (Lf) Benth. ex Hook. f and its chondroprotective effect," American Journal of Biochemistry and Biotechnology, vol. 5, (no). 4, pp. 202- 209. [37] Shankar K Ravi, Das Sanjoy, Bujala Pavani (2016), "Phytochemical screening and in vitro antibacterial activity of ethanol and aqueous extracts of Dregea volubilis leaves," Biosciences Biotechnology Research Asia, vol. 7, (no). 2, pp. 975-979. [38] Silja VP., Varma K Samitha, Mohanan KV (2008), "Ethnomedicinal plant knowledge of the Mullu kuruma tribe of Wayanad district, Kerala." [39] Sudhakar P., Kavitha D., Reddy P Ramachandra "A preliminary pharmacognostical report on the leaf of Dregea volubilis (l.f.) Benth. ex Hook.f." [40] Yogananth N., Palanivel S., Parvathy S., Chanthuru A., Bhakyaraj R. (2012), "Effect of different plant hormones on callus induction in Leaf explant of Dregea volubilis Benth. (Asclepiadaceae)," Journal of biosciences research, vol. 3, (no). 3, pp. 198-202. [41] Yoshimura Shinichi, Narita Hiromi, Hayashi Kojo, Mitsuhashi Hiroshi (1983), "Studies on the constituents of asclepiadaceae plants. LVI. Isolation of new antitumor-active glycosides from Dregea volubilis (L.) Benth," Chemical and pharmaceutical bulletin, vol. 31, (no). 11, pp. 3971-3983. Trang web [42] 38
  47. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
  48. PHỤ LỤC 2: TIÊU BẢN THỰC VẬT CỦA MẪU NGHIÊN CỨU