›

Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen trong dược phẩm

pdf 46 trang thiennha21 18/04/2022 3820
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen trong dược phẩm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_xay_dung_phuong_phap_dinh_luong_flurbiprofen_trong.pdf

Nội dung text: Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen trong dược phẩm

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐẶNG NGỌC ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN TRONG DƯỢC PHẨM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2017
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐẶNG NGỌC ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN TRONG DƯỢC PHẨM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2012 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2017
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2017 Sinh viên Đặng Ngọc Anh
  4. CHỮ VIẾT TẮT LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid HPLC chromatography) MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia) EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia) USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia) EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency) LD50 Liều gây chết trung bình (Lethal dose, 50%) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) ACN Acetonitril ATC Phân loại thuốc theo hệ thống Giải phẫu – Điều trị – Hoá học (Anatomical – Therapeutic – Chemical Code) NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid
  5. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen 3 1.1.1. Cấu trúc, tính chất 3 1.1.2. Tác dụng dược lý 4 1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen 4 1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ 4 1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử 5 1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 6 1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí 11 1.3. Thẩm định quy trình phân tích 11 1.3.1. Tính đặc hiệu 11 1.3.2. Miền giá trị 12 1.3.3. Tính tuyến tính 12 1.3.4. Giới hạn phát hiện 13 1.3.5. Giới hạn định lượng 14 1.3.6. Độ đúng 15 1.3.7. Độ chính xác 15 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị 17 2.1.1. Dung môi, hoá chất 17 2.1.2. Trang thiết bị 17
  6. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 18 2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích 18 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 20 3.2. Tính đặc hiệu 23 3.2.1. Khả năng phân tách 23 3.2.2. Thời gian lưu 25 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị 27 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 29 3.5. Độ đúng 29 3.6. Độ chính xác 30 3.6.1. Độ lặp lại 30 3.6.2. Độ chính xác trung gian 30 3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén 32 3.8. Bàn luận 32 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN 35 4.1. Kết luận 35 4.2. Kiến nghị .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Số trang Bảng 1 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI 10 Bảng 2 Chương trình pha động gradient 11 Bảng 3 Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỉ 21 lệ pha động khảo sát Bảng 4 Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi 22 thêm 7,5% AcOH trong pha động Bảng 5 Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu 26 phân tích và mẫu chuẩn Bảng 6 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan 27 giữa nồng độ lý thuyết và diện tích pic của flurbiprofen Bảng 7 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương 29 pháp Bảng 8 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 30 Bảng 9 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của 31 phương pháp Bảng 10 So sánh kết quả độ chính xác của các phương 32 pháp định lượng
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Số trang Hình 1 Công thức cấu tạo của flurbiprofen 3 Hình 2 Minh hoạ các thông số sắc ký 6 Hình 3 Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng 20 Hình 4 Hiện tượng kéo đuôi pic trên sắc ký đồ 21 Hình 5 Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá 23 Hình 6 Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid 24 Hình 7 Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời 25 gian xuất hiện các pic Hình 8 Đổ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ 28 chất phân tích và diện tích pic
  9. MỞ ĐẦU Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAID) với tác dụng giảm đau, hạ sốt. Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và làm giảm co đồng tử trong lúc mổ. Flurbiprofen được sử dụng bằng đường uống để điều trị tấn công trong các bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng. Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng của bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp [7,11,17,26,29]. Flurbiprofen hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ dưới nhiều tên thương mại khác nhau như Antadys, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen, Tuy nhiên các thuốc này lại chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng không có chuyên luận về Flurbiprofen. Phát triển các nghiên cứu về Flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm một lựa chọn thuốc trong điều trị. Một điểm đáng chú ý là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano, đang là hướng nghiên cứu được quan tâm trên thế giới [4,12,16,24]. Xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen theo tiêu chuẩn quốc tế là cơ sở ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu tương đương sinh học và dược động học của chúng. Trên thế giới, một số phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất chuyển hóa trong huyết tương, huyết thanh, nước tiểu và trong dịch nước mắt. Một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được công bố bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép đầu dò UV (DAD), đầu dò huỳnh quang hoặc đầu dò khối phổ (MS). USP 35 và EP 2010 quy định sử dụng phương pháp HPLC để phân tích flurbiprofen trong nguyên liệu dùng làm thuốc và trong các dạng thuốc như viên nén, thuốc nhỏ mắt và cao dán [20,22] 1
  10. Mục tiêu của đề tài này nhằm tiến hành xây dựng và thẩm định quy trình định lượng flurbiprofen trong dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency- EMA) [9] và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) [21]. 2
  11. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen 1.1.1. Cấu trúc, tính chất Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2-(3-flouro-4- phenylphenyl)propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid phenylalkanoic, có công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử 244,26 g/mol [27]. Cấu trúc phân tử flurbiprofen được mô tả trong hình 1. Flurbiprofen có các mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04 [28], mã Pubchem là 3394 [27] và mã Drugbank là DB00712 [29]. Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học (+) S và (-) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [6]. Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như trắng và nóng chảy ở 110 – 111oC. Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC là 8 mg/L (22oC) ,các chỉ số LogP và logS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [27,29]. 3
  12. 1.1.2. Tác dụng dược lý Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và cảm nhận đau. Enzym cyclooxygenase (COX) có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic. Flurbiprofen có tác dụng chất ức chế cyclooxygenase (COX) không chọn lọc và ức chế sự hoạt động của cả hai COX-1 và COX-2. Từ đó, flurbiprofen ngăn cản việc chuyển hoá axit arachidonic thành PGG2, PGH2 là nguyên liệu trong quá trình tổng hợp các prostaglandin. Từ đó, làm giảm nồng độ prostaglandin và cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt. Flurbiprofen cũng là một trong những NSAIDs mạnh nhất về hoạt động ức chế prostaglandin. Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của hai đồng phân quang học (+) S và (-) R. Đồng phân S-enantiomer thể hiện hầu hết trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm đau. Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối với bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính khớp. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm). Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ. [7,11,16,26,29] 1.2. Các phương pháp định lượng flurbiprofen 1.2.1 Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp chuẩn độ Theo dược điển châu Âu (EP) 2010 [20] và dược điển Hoa Kỳ (USP) 35 [22], phương pháp định lượng dựa vào phản ứng acid - base của gốc acid trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein, dừng lại khi dung dịch có màu hồng bền hơn 30 giây [22]. Có thể thay thế chỉ thị phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện thế [20]. 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2. 4
  13. Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và người phân tích. 1.2.2. Định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử Trong nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới thiệu hai phương pháp định lượng flurbiprofen bằng phương pháp quang phổ phân tử. Phương pháp được hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH và EMA [5]. Quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang đã được thẩm định. Trong đó, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV- Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet 1 cm, tốc độ quét 600 nm/phút, dải quét 190 - 320 nm, độ rộng khe 2 nm. Tín hiệu được xử lý trên phần mềm Statistical Product and Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 1-14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml. Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU RF-5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm, λex= 248 nm, λem= 308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product and Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 cho hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có giá trị là 0,03 μg/ml. Các phương pháp này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các nồng độ rất nhỏ. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu. 5
  14. 1.2.3. Định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,5,13,18]. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - Thời gian lưu tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký ’ ’ tR (Thời gian lưu thực): tR = tR – t0 W: là chiều rộng đáy pic. W1/2: là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic. Hình 2. Minh hoạ các thông số sắc ký - Hệ số dung lượng k 6
  15. Trong đó: Vs : thể tích pha tĩnh Vm: thể tích pha động Qs: lượng chất trong pha tĩnh Qm: lượng chất trong pha động Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0 - Hệ số bất đối xứng As Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ. Trong đó: W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2. Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối. - Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột 7
  16. Trong đó W: Chiều rộng đo ở đáy pic, W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. - Độ phân giải Rs Trong đó: tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A). WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic. W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5. Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [3,5,13,18] - Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiên hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử - Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội.Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác. - Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu 8
  17. thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng của diện tích hoặc chiều cao pic. - Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Định lượng bằng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ thống HPLC - DAD [20]. Trong đó, dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp acetonitril : nước 45:55. Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung môi trên để được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silicagel kích thước 5 µm trong cột thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic : acetonitrile : nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là 10 µl. Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm. Phương pháp có những ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy tốt tách được các thành phần riêng biệt ra khỏi mẫu và có thể áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC - MS/MS). [8,14,15,18] Ví dụ như nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng, Hui Chen thực hiện (2015) [8]. Trong đó hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu UFLC LC-30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ 9
  18. thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI liệt kê trong bảng 1. Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI Thông số Giá trị Áp suất khí phun 30 psi Thế phun điện tử -4,5 kV Nhiệt độ mao quản 400 oC Nguồn ion 40 psi Detector với các thông số năng lượng va chạm (CE) = - 12 V, thế phân nhóm (DP) = - 26 V, Thế đầu vào (EP) = - 8 V, Năng lượng (CXP) = - 8 V. Ion có dạng 242,9 → 198,7. Pha tĩnh: cột silicagel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex. Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 2. Bảng 2. Chương trình pha động gradient Kênh B Kênh A Tốc độ dòng (Acetonitril : Thời gian (phút) (Acid formic : (ml/phút) Acid formic Nước 99,9 : 0,1) 99,9 : 0,1) 0,1 0,4 60 40 0,6 0,4 15 85 1 0,4 5 95 2 0,4 5 95 2,5 0,4 60 40 Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl. Phương pháp đã xác định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml. Độ chính xác đạt 2,2 - 3,4%. Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng biệt của các ion, thời phân tích nhanh, có thể định lượng các chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao. Nhược điểm của 10
  19. phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi, phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền. 1.2.4. Định lương flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký khí Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal, and Emrah Alkan (2015), các tác giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ [25]. Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Cột HP-5 MS có độ dày 0,25 μm (30 m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách. Tiêm mẫu không chia dòng, khí mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút. Nhiệt độ đầu phun và máy dò là 250°C. Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV. Miền giá trị được xây dựng trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml. Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt 99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml. Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất, độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao tính phân mảnh riêng biệt của các ion. Phương pháp có nhược điểm là giá thành cao, không áp dụng được cho những chất không bền nhiệt và chất dễ khó hơi. 1.3. Thẩm định quy trình phân tích Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [21], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định. 1.3.1. Tính đặc hiệu Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: 11
  20. - Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. - Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn. [1,2,9,21] Phương pháp xác định Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên. Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm phân huỷ. 1.3.2. Miền giá trị Khái niệm Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [1,2,9,21]. Phương pháp xác định - Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định. - Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không. Yêu cầu Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,9,21]. 1.3.3. Tính tuyến tính Khái niệm Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả 12
  21. của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,9,21]. Phương pháp xác định - Khảo sát ở ít nhất 5 [21] hoặc 6 [9] mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp. - Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. - Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình. Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2]. 1.3.4. Giới hạn phát hiện Khái niệm Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [1,2,9,21]. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện. - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3. 13
  22. - Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng. 1.3.5. Giới hạn định lượng Khái niệm Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [1,2,9,21]. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp nhận. - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10. - Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc 14
  23. dựa vào đường cong chuẩn độ 1.3.6. Độ đúng Khái niệm Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định [1,2,8,20]. Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau: ỷ ệ ụ ồ Trong đó: là giá trị mẫu đo được µ là giá trị mẫu theo lý thuyết. Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao. 1.3.7. Độ chính xác Khái niệm Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,9,21]. 15
  24. Phương pháp xác định Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi. Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2]. 16
  25. CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị 2.1.1. Dung môi, hoá chất Flurbiprofen, natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn HPLC. Nước được tinh chế bằng máy Thermo Scientific GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m. Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Anadys 100mg Theramex, Pháp số lô 2M653 05 2015. 2.1.2. Trang thiết bị Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự động. Đầu dò DAD Diode Array Detector Model: DAD - 3000 Dionex sử dụng đèn Deuterium (D2) cho khoảng UV và tungsten (W) cho khoảng VIS, khoảng bước sóng đo được 190 - 800 nm. Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150 mm và cột C18 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150 mm. Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478. Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ. Bình định mức, ống đong, cối chày, 17
  26. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký Dùng phương pháp HPLC pha đảo để nghiên cứu định lượng flurbiprofen trong mẫu thử, thực hiện khảo sát các điều kiện phân tích như sau. - Cột sắc ký: tiến hành khảo sát trên các cột C18 và C8. - Pha động: tiến hành sắc ký ở chế độ gradient và isocratic với các tỷ lệ ACN, nước và acid acetic băng để lựa chọn pha động thích hợp. - Detector: sử dụng đầu dò DAD quét phổ trong dải sóng 190 - 800 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại. - Thể tích tiêm mẫu: khảo sát các thể thích tiêm là 5, 10, 15, 20 µl để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất. 2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích Tính đặc hiệu Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý với các yếu tố khác nhau như acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm phân huỷ mẫu và xác định xem flurbiprofen có tách hoàn toàn ra khỏi sản phẩm phân huỷ hay không. Tính tuyến tính và miền giá trị Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn gồm 6 nồng độ là 20, 16, 12, 8, 4, 2 µg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác định giá trị R2 Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD) được xác định bằng phương pháp pha loãng mẫu. LOD là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 2 - 3 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần. 18
  27. Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng (LOQ) được xác định bằng phương pháp pha loãng mẫu. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 3 lần. Độ đúng Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng tuyến tính đã phân tích. Độ chính xác Độ lặp lại: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong cùng một ngày. Độ chính xác trung gian: phân tích 3 mẫu có nồng độ là 20, 8, 2 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần. Thực hiện phân tích trong ba ngày khác nhau. Xác định giá trị RSD của các lần đo. Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel. 2.2.3. Ứng dụng Áp dụng phương pháp đã thẩm định trên để định lượng flurbiprofen trong viên nén viên nén Anadys 100 mg Theramex, Pháp. Chuẩn bị mẫu dược phẩm để định lượng lấy viên nén flurbiprofen trong vỉ, cạo lớp bao film và nghiền mịn trong cối sứ. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 5 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 5 ml, thêm acetonitril đến vạch, siêu âm khoảng 15 phút và lọc qua giấy lọc giấy lọc Whatman 40. Pha loãng dung dịch trên 100 lần trong pha động sắc ký, thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10 μg/ml, lọc qua màng lọc màng lọc ptfe 0,2 μm. Tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. 19
  28. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện sắc ký được thực hiện với dung dịch flurbiprofen có nồng độ 20 μg/ml. Tốc độ dòng là 1 ml/phút. Sử dụng đầu dò DAD để quét phổ trong dải bước sóng 190 - 800 nm, kết quả cho thấy mẫu có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 247 nm. 247nm Hình 3. Khảo sát độ hấp thụ quang theo bước sóng Tiến hành sắc ký với cột silicagel C18 ở chế độ gradient với pha động nước : acetonitril thay đổi từ 90 : 10 đến 10 : 90, trên sắc ký đồ xuất hiện pic chính ở thời gian lưu tương ứng với tỷ lệ nước : acetonitril là 20 : 80; 25 : 75; 30 : 70, 35 : 65; 40 : 60. 20
  29. Tiếp tục sắc ký ở chế độ isocratic với pha động nước : acetonitril lần lượt là các tỷ lệ 20 : 80; 25 : 75; 30 : 70, 35 : 65; 40 : 60. Thời gian lưu và hệ số bất đối As của mỗi tỉ lệ nước : acetonitril được ghi trong bảng 3. Bảng 3. Thời gian lưu và hệ số bất đối As trong các tỷ lệ pha động khảo sát. Tỷ lệ nước : acetonitril Thời gian lưu (phút) As 20 : 80 2,65 2,02 25 : 75 2,97 0,85 30 : 70 3,45 0,81 35 : 65 4,03 0,80 40 : 60 5,13 0,69 Các pic hình thành có hiện tương kéo đuôi. Trong các trường hợp đã khảo sát, ở tỷ lệ nước : acetonitril 35 : 65 cho pic có chiều cao và diện tích lớn nhất. Hình 4. Hiện tượng kéo đuôi của pic trên sắc ký đồ Hiện tượng kéo đuôi của pic có thể là do flurbiprofen trong mẫu tồn tại cả dạng ion hoá flurbiprofen. Sử dụng hệ dung môi nước : acetonitril 35 : 65, thêm acid acetic băng vào pha nước để đạt nồng độ 7,5% nhằm chuyển hoàn 21
  30. toàn lượng flurbiprofen ion hoá về dạng không ion hoá. Kết quả cho thấy hiện tượng kéo đuôi được cải thiện nhưng không hoàn toàn biến mất, cả chiều cao, diện tích pic đều tăng, thời gian lưu giảm từ 3,92 phút xuống còn 3,68 phút. Kết quả được thể hiện trong bảng 4. Bảng 4. Sự thay đổi diện tích pic và chiều cao pic khi thêm 7,5% AcOH trong pha động Thời gian Diện tích pic Chiều cao pic %C As AcOH lưu (phút) (mAU.min) (mAU) 0 3,92 13,26 161,944 1,16 7,5 3,683 14,667 188,982 1,13 Hiện tượng kéo đuôi vẫn còn có thể là do thể tích tiêm mẫu quá lớn nên chưa phù hợp. Giảm thể tích tiêm mẫu từ 20, 15, 10 và 5 µl. Kết quả cho thấy, ở thể tích tiêm mẫu 10 µl, pic cân xứng hơn và tỉ lệ diện tích pic/nồng độ cũng như tỷ lệ chiều cao/nồng độ cao nhất. Hiện tượng kéo đuôi chưa mất hẳn có thể là do pha tĩnh chưa phù hợp. Tiến hành sắc ký với cột C8 thay cột C18 ở các điều kiện đã khảo sát được: pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm mẫu 10 µl, pic flurbiprofen gần như không còn hiện tượng kéo đuôi (As=1,08), mẫu có thời gian lưu 3,73 phút. Thời gian sắc ký được điều chỉnh thành 8 phút (bằng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen). Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu là pha tĩnh cột silicagel C8, pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian tiêm 8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, dectector ghi tại bước sóng 247 nm. Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 5. 22
  31. Hình 5. Sắc ký đồ tại điều kiện tối ưu hoá 3.2 . Tính đặc hiệu 3.2.1. Khả năng phân tách Để thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp, flurbiprofen được xử lý với các yếu tố khác nhau acid, base, oxy hoá, nhiệt độ và ánh sáng nhằm làm phân huỷ mẫu. Điều kiện cụ thể như sau: Acid và base Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch HCl 5 M hoặc 2 ml NaOH 5 M vào ống, đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ, để nguội về nhiệt độ phòng, rồi trung hoà hỗn hợp bằng lượng acid hoặc base tương ứng. Oxi hoá Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml o dung dịch H2O2 6% và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5 C trong 3 giờ. Nhiệt độ Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm. Thêm vào 2 ml dung dịch pha động và đun nóng ở nhiệt độ khoảng 80 ± 5oC trong 3 giờ. 23
  32. Ánh sáng Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch 1000 µl vào ống nghiệm, cho tiếp xúc với ánh nắng mặt trời trong 5 giờ. Sau khi xử lý, các mẫu trên được pha loãng đến nồng độ khoảng 20 µg/ml trong pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Tiến hành sắc ký rồi xác định xem trong điều kiện phân tích flurbiprofen có tác được hoàn toàn khỏi các sản phẩm phân huỷ hay không. Kết quả cho thấy flurbiprofen chỉ bị phân huỷ khi xử lý với hydrogen peroxide. Trên sắc ký đồ xuất hiện pic mới có thời gian lưu 1,68 phút, tách ra hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic (peak purity) cho thấy pic flurbiprofen tinh khiết với độ tương xứng đạt hơn 999. Hình 6. Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydroperoxid 24
  33. t = 1,68 phút t = 3,69 phút Hình 7. Độ trùng phổ hấp thụ theo bước sóng tại thời gian lưu của các pic 3.2.2. Thời gian lưu Phân tích thống kê thời gian lưu của pic flurbiprofen trong các mẫu phân huỷ và thời gian lưu của flurbiprofen trong mẫu chuẩn. Thời gian lưu 25
  34. của flurbiprofen trong 3,73 phút. Các giá trị thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu phân tích và mẫu chuẩn được liệt kê trong bảng 5. Bảng 5. Thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu phân tích và mẫu chuẩn Thời gian lưu trong Thời gian lưu trong Yếu tố tác động mẫu thử (phút) mẫu chuẩn (phút) 3,59 3,71 Acid 3,60 3,65 3,68 3,66 3,61 3,67 Base 3,62 3,67 3,69 3,67 3,63 3,68 Oxy hoá 3,63 3,69 3,69 3,69 3,64 3,70 Nhiệt độ 3,64 3,69 4,00 3,66 3,65 3,66 Ánh sáng 3,65 3,67 3,70 3,67 26
  35. Qua trắc nghiệm thống kê cho thấy có thời gian lưu của pic ở các mẫu thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048). Từ các kết quả trên cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao. 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị Chuẩn bị 6 mẫu có nồng độ lần lượt là 20, 16, 12, 8, 4, 2 µg/ml bằng cách pha loãng từ dung dịch mẹ có nồng độ 1000 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần với điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày trong bảng 6 và hình 8. Bảng 6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ lý thuyết và diện tích pic của flurbiprofen STT Nồng độ lý thuyết (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) 1 20 13,76 2 16 10,68 3 12 8,24 4 8 5,53 5 4 2,73 6 2 1,38 Khoảng định lượng 2-20 µg/ml Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,08853 R2 0,9993 27
  36. 16.00 14.00 y = 0.6804x + 0.0221 R² = 0.9993 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 Diện tíchpic (mAU.min) Diện 2.00 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 Nồng độ mẫu phân tích (µg/ml) Hình 8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic Từ phân tích thống kê thu được phương trình y = 0,68x + 0,022 Trong đó, y (mAU.min) là diện tích pic, x (µg/ml) là nồng độ mẫu phân tích. Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là có tính tương thích (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (t = 76,86 > t0,05 = 2,132), hệ số b không có ý nghĩa về mặt thống kê nên bị loại (t = 0,85 0,99 đạt yêu cầu. Vậy phương trình hồi quy có dạng y = 0,68x. Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát 2 - 20 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ flurbiprofen và diện tích pic. Hệ số tương quan là R2 = 0,999. Mức độ tương quan tốt, độ tuyến tính chặt chẽ. Độ lệch của các giá trị thực nghiêm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp. 28
  37. 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt khoảng 2-3. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất. Giới hạn định lượng: tiến hành pha loãng mẫu phân tích flurbiprofen đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N đạt khoảng 10. Tiến hành sắc ký 3 lần. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOQ) của phương pháp ứng với từng chất. Kết quả phân tích cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0,05 µg/ml và giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0,15 µg/ml. 3.5. Độ đúng Được thẩm định bằng cách đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng tuyến tính đã phân tích. Bảng 7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp. Nồng độ lý thuyết Nồng độ thực Tỷ lệ phục hồi STT (µg/ml) nghiệm (µg/ml) (%) 1 20,00 20,22 101,12 2 16,00 15,70 98,10 3 12,00 12,11 100,92 4 8,00 8,13 101,59 5 4,00 4,01 100,31 6 2,00 2,03 101,41 29
  38. Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng với các giá trị của độ phục hồi đều nằm trong khoảng 100±2%. 3.6. Độ chính xác 3.6.1. Độ lặp lại - Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong pha động. - Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần. Bảng 8. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp Nồng độ lý Diện tích pic Diện tích pic RSD thuyết trung bình SD (mAU.min) (%) (µg/ml) (mAU.min) 13,78 14,00 20,00 14,22 0,22 1,57 13,99 5,55 5,53 0,03 8,00 5,53 0,46 5,50 1,34 2,00 1,40 1,38 3,93 2,34 1,39 Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ lặp lại đều nhỏ hơn 2,34%. 3.6.2. Độ chính xác trung gian - Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ lần lượt là: 20, 8, 2 µg/ml pha trong dung dịch pha động. 30
  39. - Tiến hành sắc ký với các điều kiện trên, mỗi mẫu ba lần. - Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau. Bảng 9. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp Diện tích Nồng độ lý Diện tích pic trung RSD thuyết Ngày pic SD bình (µg/ml) (mAU.min) (%) (mAU.min) 1 14,00 20,00 2 13,72 13,89 0,15 1,06 3 13,94 1 5,53 8,00 2 5,46 5,55 0,10 1,73 3 5,65 1 1,38 2,00 2 1,34 1,35 0,02 1,71 3 1,34 Kết quả cho thấy giá trị RSD trong thí nghiệm thẩm định độ chính xác trung gian đều nhỏ hơn 1,73%. Nhận xét: So sánh giá trị RSD của phương pháp được xây dựng với một số phương pháp định lượng flurbiprofen đã được báo cáo. 31
  40. Bảng 10. So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp định lượng RSD (%) của độ chính Tên phương pháp RSD (%) của độ lặp lại xác trung gian Đo độ hấp thu quang [5] ≤ 3,10 ≤ 3,20 Đo độ phát xạ huỷnh ≤ 2,05 ≤ 3,80 quang [5] LC-MS/MS [8] ≤ 2,20 ≤ 3,40 GC-MS [25] ≤ 2,65 ≤ 3,64 Phương pháp xây dựng ≤ 2,34 ≤ 1,73 RSD của độ lặp có giá trị trong khoảng trung gian so với phương pháp trên. RSD độ lặp lại của phương pháp xây dựng nhỏ hơn kết quả trong nghiên cứu sử dụng phương pháp đo độ hấp thu quang và GC-MS. RSD độ chính xác trung gian của phương pháp xây dựng đạt được thấp hơn giá trị trong cả bốn nghiên cứu đã được giới thiệu. Từ đó khẳng định phương pháp có độ chính xác cao. 3.7. Ứng dụng đinh lượng flurbiprofen trong viên nén Áp dụng phương pháp được xây dựng thẩm định để định lượng flurbiprofen có trong viên nén Anadys 100mg Theramex, Pháp. Theo USP 35, hàm lượng flurbiprofen phải đạt từ 90 - 110%. [22] Kết quả thu được diện tích pic trung bình là 5,96 mAU.min. Nồng độ dung dịch định lượng là 9,31 µg/ml. Như vậy, hàm lương flurbiprofen trong viên nén là bằng 93,10% hàm lượng lí thuyết, đạt tiêu chuẩn của USP 35. 3.8. Bàn luận Hiện nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đang được ứng dụng dụng rộng rãi trong các quy trình định tính, thử độ tinh khiết và định lượng các chất. HPLC có các ưu điểm là độ chính xác cao, ổn định, dễ thực hiện, nhạy với các nồng độ nhỏ. Phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC - DAD có những ưu điểm nổi bật của cả phương pháp HPLC và 32
  41. phương pháp đo độ hấp thụ UV-Vis đem lại: có khả năng tách các chất ra hoàn toàn nên tính đặc hiệu cao, có khả năng kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ. Bên cạnh đó, phương pháp cũng có một số nhược điểm như hệ dung môi đắt tiền, cần một hệ thống máy móc hiện đại. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thì một số đại lượng sau cần lưu ý. Thời gian lưu tR là thời gian tính từ khi chất được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi phát hiện ở nồng độ cực đại. Thông thường thời gian sắc ký thường gấp đôi thời gian lưu. Hệ số dung lượng k’ cần nằm trong khoảng tối ưu 1< k’ < 8 căn cứ vào pha tĩnh, pha động, Hệ số As cho biết mức độ cân đối của pic và thường nằm trong khoảng 0,9 - 2,5 pic càng cân đối thì hiệu lực tách của cột càng tốt. Phương pháp sử dụng cột sắc ký pha đảo. Pha động sử dụng dung môi có độ phân cực cao là hỗn hợp acetonitril, acid acetic và nước. Flurbiprofen tan trong acetonirtil tốt hơn với nước nên khi tăng tỷ lệ acetonitril thì thời gian lưu của flurbiprofen cũng giảm dần. Khi tỷ lệ nước : acetonitril là 35 : 65, diện tích pic và chiều cao pic được tối ưu hoá. Acid acetic được thêm có tác dụng chuyển flurbiprofen dạng ion hoá về dạng không bị ion hoá nhằm giảm hiện tượng kéo đuôi ở pic. Về thành phần cấu tạo, silicagel C8 có độ phân cực cao hơn silicagel C18. Khi độ phân cực pha tĩnh tăng thì tương tác với chất phân tích sẽ lớn hơn. Vì vậy, khi thay cột C18 bằng cột C8, thời gian lưu của flurbiprofen tăng từ 3,14 – 3,73 phút. Các thể tích tiêm mẫu đã khảo sát là 20, 15, 10 và 5 μl. Kết quả cho thấy ở nhưng thể tích như 15 và 20 μl, pic có hiện tượng kéo đuôi có thể là do thể tích tiêm quá lớn nên lượng flurbiprofen đi qua đầu dò không ổn định theo thời gian. Ở thể tích tiêm 5 μl, chiều cao và diện tích pic nhỏ nên sai số ở những nồng độ thấp sẽ cao và LOD, LOQ của phương pháp sẽ thấp. Kết quả cho thấy, tại thể tích tiêm mẫu 10 μl, hệ số bất đối, diện tích pic và chiều cao pic là tối ưu nhất. Lựa chọn cài đặt đầu dò DAD tại bước sóng có độ hấp thụ cực đại 247 nm. Tại bước sóng đó, độ hấp thụ có giá trị lớn nhất, đường chuẩn định lượng có độ dốc a cao sẽ làm cho phương pháp độ chính xác cao hơn. 33
  42. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy trong điều kiện khảo sát, flurbiprofen khá bền trong acid, base, nhiệt độ và ánh sáng nhưng dễ bị phân huỷ bởi tác nhân oxi hoá. Vì vậy trong bảo quản cần tránh để flurbiprofen tiếp xúc với các tác nhân oxi hoá làm giảm chất lượng thuốc. 34
  43. CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN 4.1. Kết luận Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH và EMA, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng flurbiprofen bằng hệ thống HPLC - DAD với các thông số: pha tĩnh là silicagel C8 trong cột 5 μm, 4,6×150 mm, pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 27,5 : 7,5, thể tích tiêm mẫu là 10 µl, thời gian sắc ký là 8 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò DAD tại bước sóng 247 nm. Bằng các quá trình thực nghiệm đã chứng tỏ được quy trình định lượng flurbiprofen đạt các yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác theo hướng dẫn chung của ICH và EMA. Kết quả cho thấy phương pháp có đặc hiệu với flubiprofen. Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ flurbiprofen trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml với hệ số tương quan R2 = 0,999. Phương pháp có độ đúng tốt (100±2%), độ lặp lại đảm bảo (RSD ≤ 2,34%). Phương pháp đã được ứng dụng để định lượng một dược phẩm chứa flurbiprofen dạng viên nén. 4.2. Kiến nghị Ứng dụng phương pháp để định lượng flurbiprofen trong các dạng bào chế khác như thuốc nhỏ mắt, viên nang, cao dán. Phương pháp cũng là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế các thuốc giảm đau, chống viêm chứa flurbiprofen có cấu trúc nano cũng như nghiên cứu tương đương sinh học và dược động học của chúng. 35
  44. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt [1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184. [2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật,pp.10-59. [3] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, pp.68-84. Tiếng anh [4] Bhaskar, Kesavan, et al (2009), “Lipid nanoparticles for transdermal delivery of flurbiprofen: formulation, in vitro, ex vivo and in vivo studies”, Lipids in health and disease, 8(1), 6. [5] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4). [6] Brittain, H. G. (Ed.) (2013), Profiles of drug substances, excipients and related methodology (Vol. 38), Academic Press, pp.115-154. [7] Calapai, G., et al (2013), "Fatal hypersensitivity reaction to an oral spray of flurbiprofen: a case report" Journal of clinical pharmacy and therapeutics, 38(4), 337-338. [8] Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, pp.69-74. [9] European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, pp.9-10.
  45. [10] FDA (2013), “Guidance for industry: bioanalytical method validation” ,US Food and Drug Administration, pp.4-9. [11] Geerts H: Drug evaluation (2007), “(R)-flurbiprofen-an enantiomer of flurbiprofen for the treatment of Alzheimer's disease”, Idrugs,10(2), pp.121-33. [12] Gonzalez-Mira, E., et al (2010), “Optimizing flurbiprofen-loaded NLC by central composite factorial design for ocular delivery”, Nanotechnology, 22(4), 045101. [13] Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9),pp. 654-663. [14] Lee, Hye-In, et al (2014), "Simultaneous determination of flurbiprofen and its hydroxy metabolite in human plasma by liquid chromatography- tandem mass spectrometry for clinical application", Journal of chromatography B, 971, pp. 58-63. [15] Mano N, Narui T, Nikaido A, Goto J (2002), “Separation and determination of diastereomeric flurbiprofen acyl glucuronides in human urine by LC/ESI-MS with a simple column-switching technique”, Drug Metabol Pharmacokin, 17, pp.142-149. [16] Meister, Sabrina, et al (2013), “Nanoparticulate flurbiprofen reduces amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain barrier model”, Alzheimer's research & therapy, 5(6), 51. [17] Mironov, Gleb G., et al (2012), “Comparative study of three methods for affinity measurements: capillary electrophoresis coupled with UV detection and mass spectrometry, and direct infusion mass spectrometry”, J Am Soc Mass Spectrom, 23(7), pp.1232-40. [18] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7),1515-1609.
  46. [19] Pradhan PK, Rajput PN (2014), “Simultaneous Estimation of Flurbiprofen and Gatifloxacin by Dual Wavelength UV Spectroscopy Method in an Eye Drops”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 27(2),pp.96-99. [20] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, pp.2056-2057. [21] The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), pp.6-13. [22] United States Pharmacopoeial Convention (2010), United States Pharmacopoeia 35th Edition, pp.3258. [23] Vega, E , et al (2006), “Flurbiprofen loaded biodegradable nanoparticles for ophtalmic administration”, Journal of pharmaceutical sciences, 95(11), 2393-2405. [24] Wang, G. J., et al. (2003), "European journal of drug metabolism and pharmacokinetics", Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 28(4), pp.265-272. [25] Yilmaz, Bilal, Emrah Alkan (2015), "Determination of flurbiprofen in pharmaceutical preparations by GC–MS", Arabian Journal of Chemistry. [26] Zhou, S-F., et al (2009),”Substrates, inducers, inhibitors and structure-activity relationships of human Cytochrome P4502C9 and implications in drug development”, Curr Med Chem, 16(27), pp.3480- 675. Trang web [27] Pubchem [28] WHO [29] Drugbank