›

Khóa luận Nghiên cứu bào chế nano berberin

pdf 51 trang thiennha21 18/04/2022 4540
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu bào chế nano berberin", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_nghien_cuu_bao_che_nano_berberin.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu bào chế nano berberin

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y-DƯỢC TRỊNH THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO BERBERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y-DƯỢC TRỊNH THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO BERBERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2014 Y Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN THANH HẢI ThS. NGUYỄN VĂN KHANH Hà Nội - 2019 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn tới thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải (giảng viên bộ môn Bào chế và Công nghiệp Dược, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội), người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn và khơi gợi niềm đam mê nghiên cứu khoa học trong tôi. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Văn Khanh (cán bộ bộ môn Bào chế và Công nghiệp Dược, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội), người thầy nhiệt tình và tận tâm, đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy giáo, cô giáo, các anh, chị làm việc và công tác tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại khoa. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân – những người đã luôn đồng hành cùng tôi. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trịnh Thị Duyên @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  4. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BBR Berberin DĐVN Dược điển Việt Nam DSC Phân tích nhiệt vi sai HPMC Hydroxypropyl methylcellulose KTTP Kích thước tiểu phân NaLS Natri lauryl sulfat NSX Nhà sản xuất PVP Polyvinyl pyrrolidon PDI Chỉ số phân bố kích thước tiểu phân TKHH Tinh khiết hóa học TT Thuốc thử w/v Khối lượng / thể tích @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên Nội dung Trang Hình 1.1 Công thức hóa học của berberin clorid 2 Hình 1.2 Thiết bị nghiền bi 10 Điều kiện và quy trình bào chế nano berberin bằng phương Hình 2.1 17 pháp nghiền bi Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang của berberin theo nồng độ Hình 3.1 20 tại bước sóng 348 nm Hình 3.2 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo loại polyme 21 Hình 3.3 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo nồng độ polyme 23 Hình 3.4 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo loại chất diện hoạt 24 Hình 3.5 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo nồng độ chất diện hoạt 26 Hình 3.6 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo kích cỡ bi 27 Hình 3.7 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo tốc độ nghiền 28 Hình 3.8 KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo thời gian nghiền 30 Hình 3.9 Sơ đồ bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi. 31 Hình 3.10 Berberin nguyên liệu (bên trái) và bột nano berberin (bên phải) 32 Hình 3.11 KTTP, PDI của hỗn dịch nano berberin và bột nano berberin 33 Hình 3.12 Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin 34 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên Nội dung Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa berberin trên thị trường 5 Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất 15 Độ hấp thụ quang theo nồng độ của berberin tại bước sóng Bảng 3.1 20 348 nm Bảng 3.2 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo loại polyme 21 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo nồng độ Bảng 3.3 22 polyme KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo loại chất diện Bảng 3.4 24 hoạt KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo nồng độ chất Bảng 3.5 25 diện hoạt Bảng 3.6 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo kích cỡ bi 27 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch nano berberin theo tốc độ Bảng 3.7 28 nghiền KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo thời gian Bảng 3.8 29 nghiền KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch nano berberin và bột nano Bảng 3.9 32 berberin Bảng 3.10 Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin 33 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  7. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1 Vài nét về berberin 2 1.1.1 Công thức hóa học và tên gọi 2 1.1.2 Tính chất lý, hóa 2 1.1.3 Định tính 3 1.1.4 Định lượng 3 1.1.5 Tác dụng dược lý 3 1.1.6 Dược động học 4 1.1.7 Một số chế phẩm chứa berberin trên thị trường 5 1.2 Tổng quan về hạt nano thuốc 5 1.2.1 Vài nét về công nghệ nano 5 1.2.2 Ảnh hưởng của kích thước nano đến sinh khả dụng của một thuốc 6 1.2.3 Các phương pháp bào chế hạt nano thuốc 8 1.2.4 Kỹ thuật nghiền bi 8 1.2.5 Đông khô 11 1.3 Một số nghiên cứu về nano berberin 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 15 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  8. 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 16 2.3.2 Bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi 16 2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của nano berberin 18 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Định lượng berberin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 20 3.2 Bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi 21 3.2.1 Ảnh hưởng của loại polyme tới kích thước tiểu phân 21 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ polyme tới kích thước tiểu phân 22 3.2.3 Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân 24 3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân 25 3.2.5 Ảnh hưởng của kích cỡ bi tới kích thước tiểu phân 26 3.2.6 Ảnh hưởng của tốc độ nghiền tới kích thước tiểu phân 28 3.2.7 Ảnh hưởng của thời gian nghiền tới kích thước tiểu phân 29 3.3 Đánh giá một số đặc tính của bột nano berberin 32 3.3.1 Hình thức 32 3.3.2 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta 32 3.3.3 Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin 33 3.3.4 Kết quả phân tích nhiệt vi sai 34 3.4 Bàn luận 34 3.4.1 Về phương pháp bào chế nano bererin 34 3.4.2 Về xây dựng quy trình bào chế nano berberin 35 3.4.3 Về các đặc tính của bột nano berberin thu được 35 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  9. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  10. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng các dược chất có nguồn gốc hóa tổng hợp thì việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Berberin là một alcaloid thuộc nhóm isoquinolin, có trong rễ, thân rễ, vỏ của những cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis [4]. Các nghiên cứu đã chứng tỏ berberin có nhiều tác dụng dược lý tốt như chống viêm [32], chống nhiễm khuẩn [10], chống tiêu chảy và có ảnh hưởng đáng kể đến bệnh đái tháo đường [16]. Nó cũng cho thấy các tác dụng khác trên hệ thần kinh, tim mạch và có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị ung thư [12], [26], [28], [31]. Mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng berberin lại bị những hạn chế trong sử dụng lâm sàng. Nguyên nhân chủ yếu do berberin ít tan trong nước, khó hấp thu qua ruột, sinh khả dụng rất thấp chỉ khoảng 5% [25], [27]. Bào chế berberin ở kích thước nano có thể cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan, từ đó giúp nâng cao sinh khả dụng. Có hai phương pháp chính để tạo ra hạt nano thuốc là: phương pháp từ dưới lên (bottom-up) và từ trên xuống (top-down). Trong đó, phương pháp bottom-up ít được sử dụng hơn vì thường phải hòa tan dược chất trong dung môi hữu cơ độc hại và khó có được phân bố kích thước hẹp [23]. Với phương pháp top-down có thể sử dụng một số kỹ thuật như nghiền bi, đồng nhất hóa, đồng nhất hóa áp suất cao. Kỹ thuật nghiền bi có nhiều ưu điểm như có thể nghiền được hạt có kích thước tiểu phân bé và duy trì trạng thái vô khuẩn của nguyên liệu. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu bào chế nano berberin” với hai mục tiêu sau: 1. Bào chế được nano berberin bằng phương pháp nghiền bi. 2. Đánh giá được một số đặc tính của bột nano berberin. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 1
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về berberin Berberin là một loại isoquinolin alcaloid, màu vàng [28]. Berberin có thể dễ dàng chiết xuất từ thực vật hoặc tổng hợp hóa học, thường có trong rễ, thân rễ, vỏ của những cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis với hàm lượng khoảng 1,5 – 3% và chiếm ít nhất 82% so với alcaloid toàn phần [4]. Berberin thường được sử dụng trong lâm sàng ở dạng berberin clorid, berberin sulfat [28]. 1.1.1 Công thức hóa học và tên gọi Công thức hóa học: Hình 1.1. Công thức hóa học của berberin clorid Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O Tên khoa học: 5,6-dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno(5,6-a)anthracen clorid dihydrat [6]. 1.1.2 Tính chất lý, hóa Lý tính: - Cảm quan: tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. - Độ chảy khi ở dạng base là 1450C (bị phân hủy) [6]. - Độ tan: Dạng base tan chậm trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở tỉ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong chloroform và ether. Dạng muối sulfat dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol [6]. Độ tan trong nước của berberin phụ thuộc vào pH, độ tan cao nhất khi pH xấp xỉ 7 [9]. - Berberin không có C bất đối nên không có đồng phân quang học [6]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 2
  12. Hóa tính: - Hóa tính của N: berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử nước [6]. - Hóa tính của oxy: berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N không vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biễn mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal [6]. - Hóa tính mạch kép: berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho các hydro alkaloid không màu [6]. 1.1.3 Định tính Theo Dược điển Việt Nam V, các phương pháp định tính berberin clorid [3]: - Phương pháp A: so sánh phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm với phổ hấp thụ hồng ngoại của berberin clorid chuẩn. - Phương pháp B: hòa tan 0,1 g chế phẩm trong 20 ml nước bằng cách đun nóng. Thêm 0,5 ml acid nitric đậm đặc (TT), làm lạnh, để yên 10 min, lọc. Lấy 3 ml dịch lọc và thêm 1 ml dung dịch bạc nitrat 2 % (TT), sẽ xuất hiện tủa trắng. Tủa này không tan trong acid nitric loãng (TT), nhưng tan được trong dung dịch amoniac (TT) quá thừa. - Phương pháp C: hòa tan 5 mg chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 10% (TT). Lắc đều, thêm một ít bột cloramin B (TT) sẽ có màu đỏ anh đào. 1.1.4 Định lượng Để định lượng berberin clorid dùng các phương pháp sau: - Phương pháp sắc kí lỏng [3]. - Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS [2]. - Phương pháp cân [1]. - Phương pháp thể tích [1]. 1.1.5 Tác dụng dược lý Berberin có nhiều tác dụng dược lý như kháng khuẩn [10], kháng virut [14], hạ sốt, chống tiêu chảy và chống viêm [32]. Tác dụng chống viêm của berberin thông qua sự ức chế protein hoạt hóa 1 (AP-1), một yếu tố phiên mã quan trọng trong quá trình @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 3
  13. viêm [31]. Berberin có tác dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột bằng cách ức chế sự tăng sinh của vi khuẩn Helicobacter pylori [18]. Gần đây, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng berberin có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường type 2 thông qua kích thích hoạt hóa adenosine monophosphate - activated protein kinase [16]. Berberin cũng được báo cáo là một tác nhân giảm cholesterol mới, cơ chế hoạt động khác biệt so với nhóm statins [15]. Berberin đã được chứng minh là có tác dụng tốt trên nhiều bệnh tim mạch như huyết áp, chống loạn nhịp, tăng co bóp tim, giảm sức cản ngoại vi và huyết áp, phòng ngừa huyết khối tĩnh mạch [12]. Ngoài ra, berberin cũng cho thấy tác dụng tốt trên hệ thần kinh. Trong quá trình thiếu máu não, berberin chống apoptosis, bảo vệ chống lại tổn thương tế bào thần kinh, cải thiện tuần hoàn máu não [28]. Berberin là một chất ức chế thuận nghịch acetylcholinesterase, giúp cải thiện việc học và trí nhớ đối với bệnh Alzheimer [28]. Hoạt tính chống trầm cảm của berberin thông qua điều khiển các amin sinh học của não như: norepinephrin, serotonin, và dopamin, các thụ thể oxyd, và/hoặc thụ thể sigma [20]. Berberin còn có thể sử dụng để điều trị nhiều bệnh ung thư khác nhau như ung thư biểu mô tế bào gan [25], ung thư ruột kết ở người [31]. 1.1.6 Dược động học Berberin được đưa vào cơ thể qua đường uống là thích hợp nhất đặc biệt là điều trị các bệnh mãn tính. Sinh khả dụng đường uống của thuốc phụ thuộc vào tỷ lệ và mức độ hòa tan của thuốc trong dịch tiêu hóa, tính thẩm thấu của nó. Quá trình hấp thu thuốc xảy ra chủ yếu ở ruột non [9]. Một số nghiên cứu cho thấy sinh khả dụng của berberin dùng đường uống ở người tình nguyện khỏe mạnh là tương đối thấp (<5%), với Cmax = 0,44 ± 0,42 ng/ml, Tmax = 9,8 ± 6,6 h [4], [9]. Sự chuyển hóa của berberin trong cơ thể có liên quan đến cấu tạo hóa học của nó. Berberin là một alcaloid amin bậc bốn liên kết dễ dàng với protein huyết tương, nên ảnh hưởng đến phân bố và mức độ hoạt động [28]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 4
  14. Một số nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng berberin được chuyển hóa qua gan và bài tiết qua mật. Đồng thời, một số nghiên cứu khác lại cho thấy thuốc có thể bị bài tiết ở thận [9]. 1.1.7 Một số chế phẩm chứa berberin trên thị trường Berberin được dùng phổ biến dưới dạng viên nén, viên nang, viên nén bao phim, viên nén bao đường với hàm lượng là 10 mg, 25 mg, 50 mg/ viên. Berberin thường dùng đơn độc hoặc có thể thêm một số thành phần khác như mộc hương, ba chẽ, Bảng 1.1. Một số chế phẩm chứa berberin trên thị trường Tên biệt Hàm Dạng bào chế Nhà sản xuất dược lượng Berberin Công ty Cổ phần Hóa - Dược phẩm 100 mg Viên nang 100mg Mekophar Berberin 50 mg Viên nén Công ty cổ phần Dược trung ương 3 50mg Viên nén bao Loberin 25 mg Công ty cổ phần Dược phẩm Nam Hà phim Công ty Cổ phần Dược phẩm Cửu Berberin 10 10 mg Viên bao đường Long 1.2 Tổng quan về hạt nano thuốc 1.2.1 Vài nét về công nghệ nano Công nghệ nano có lịch sử phát triển lâu dài, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực hóa học, sinh học, vật lý, khoa học vật liệu, y học, . Công nghệ nano được định nghĩa là các công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet, nhỏ hơn 1µm [8], [23]. Hệ thống dựa trên công nghệ nano được phân chia thành vật liệu nano và thiết bị nano. Trong đó, vật liệu nano lại được chia nhỏ thành tinh thể nano và vật liệu có cấu trúc nano (gồm vật liệu dựa vào polyme như dendrimer, hạt nano, micell và không dựa vào polyme như ống nano cacbon, hạt nano kim loại, dấu chấm lượng tử) [21]. Trong y học, công nghệ nano dùng để chẩn đoán sớm và chính xác, điều trị hiệu quả với ít tác dụng phụ, đánh giá hiệu quả điều trị không xâm lấn [11]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 5
  15. 1.2.2 Ảnh hưởng của kích thước nano đến sinh khả dụng của một thuốc Một thuốc có sinh khả dụng kém là thuốc có độ tan trong nước kém và, hoặc tốc độ hòa tan chậm trong dịch sinh học, khả năng thấm kém qua màng sinh học, hoặc bị chuyển hóa mạnh [21]. Công nghệ nano tạo ra các hạt nano thuốc với kích thước nhỏ có thể tăng độ tan, tốc độ hòa tan, tăng khả năng bám dính lên bề mặt, màng tế bào từ đó tăng sinh khả dụng của thuốc, đem lại hiệu quả điều trị cao hơn. a) Kích thước nano làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan: Tăng độ tan bão hòa Cs Với các dược chất có kích thước trong phạm vi micromet, độ tan là hằng số chỉ phụ thuộc vào tính chất lý hóa, môi trường hòa tan, nhiệt độ. Nhưng khi tiểu phân có kích thước nanomet (< 1µm), độ tan bị ảnh hưởng nhiều bởi kích thước hạt. Điều này được giải thích thông qua phương trình Kelvin và phương trình Ostwalde – Freundlich. Phương trình Kelvin: 푃 2훾 푙푛 = 푃∞ 푅 휌 Trong đó: P r là áp lực hòa tan một hạt có bán kính r, P ∞ là áp lực hòa tan một hạt vô cùng lớn, Ɣ là sức căng bề mặt, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, r là bán kính của hạt, M r là khối lượng phân tử, ρ là mật độ hạt. Phương trình Kelvin ban đầu được sử dụng để mô tả áp suất hơi trên bề mặt cong của một giọt chất lỏng trong khí, sau được mở rộng với các tiểu phân chất rắn. Theo đó, áp lực hòa tan tăng lên khi kích thước tiểu phân giảm. Ở trạng thái bão hòa, xảy ra cân bằng động giữa các phân tử hòa tan và các phân tử đang kết tinh. Khi áp lực hòa tan tăng có thể làm chuyển dịch cân bằng và do đó làm tăng khả năng hòa tan của dược chất. Phương trình Ostwalde – Freundlich: C 2σV log s = Cα 2.303푅 ρr Trong đó: Cs là độ tan bão hòa, Cα là độ hòa tan chất rắn, σ là lực căng liên kết của chất, V là thể tích của vật liệu hạt, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, ρ là mật độ của vật rắn, r là bán kính của hạt. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 6
  16. Từ phương trình Ostwalde - Freundlich, cho thấy độ hòa tan bão hòa (Cs) của thuốc tăng khi giảm kích thước hạt r. Mặc dù vậy, hiệu ứng này là không đáng kể cho các hạt lớn hơn nhưng sẽ được áp dụng cho các vật liệu có kích thước hạt trung bình dưới 1 - 2 µm, đặc biệt là dưới 200nm [30]. b) Tăng tốc độ hòa tan Theo mô tả của Nernst–Brunner và Levich biến đổi từ mô hình của Noyes – Whitney, tốc độ hòa tan của dược chất được biểu diễn theo phương trình sau [5], [23], [30]: = S. ( - C) 푡 ℎ 푠 Trong đó: dM/dt là tốc độ hòa tan của dược chất, D là hệ số khuếch tán, S là diện tích bề mặt tiểu phân, Cs là độ tan bão hòa của dược chất, C là nồng độ dược chất tại thời điểm t, h là bề dày lớp khuếch tán. Tốc độ hòa tan của các hạt nano tăng lên có thể do các nguyên nhân: tăng diện tích bề mặt, giảm bề dày lớp khuếch tán, tăng độ tan bão hòa. Diện tích bề mặt: Giảm kích thước tiểu phân đến nanomet sẽ làm tăng độ hòa tan do tăng đáng kể diện tích bề mặt. Ví dụ, khi kích thước hạt của thuốc giảm từ 8 µm xuống 200nm, diện tích bề mặt tăng lên gấp 40 lần [23]. Bề dày lớp khuếch tán: Theo phương trình Prandtl, bề dày lớp khuếch tán [5]: 퐿 h = k (√ ) 푣 Với: k là hằng số, L là độ dài quãng đường dòng chảy, v là vận tốc chuyển động tương đối của dòng chất lỏng so với bề mặt tiểu phân chất rắn. Như vậy, h giảm khi v tăng, nên bề dày lớp khuếch tán giảm khi tăng độ cong bề mặt của tiểu phân. Do đó, tiểu phân dược chất có kích thước càng nhỏ thì bề dày lớp khuếch tán càng nhỏ. Ngoài ra, trong quá trình sản xuất tạo ra các hạt nano, có thể có sự chuyển đổi từ trạng thái kết tinh sang trạng thái vô định hình (trạng thái có độ hòa tan bão hòa cao hơn), nên góp phần làm tăng độ tan và t ố@c độ School hòa tan [30] of. Medicine and Pharmacy, VNU 7
  17. b) Kích thước nano làm tăng khả năng bám dính lên bề mặt, màng tế bào Kích thước nano thường làm tăng độ bám dính do diện tích tiếp xúc tăng so với các hạt có kích thước lớn (khi khối lượng như nhau) [30]. 1.2.3 Các phương pháp bào chế hạt nano thuốc Ngày nay, các phương pháp sản xuất hạt nano thuốc được phân ra làm hai nhóm lớn: bottom-up (từ dưới lên) và top-down (từ trên xuống). a) Bottom-up Phương pháp này thường được áp dụng trong quá trình sản xuất nguyên liệu, đặc biệt là các nguyên liệu siêu mịn (micro, nano). Trong phương pháp này, dược chất được hòa tan hoàn toàn vào một dung môi thích hợp, sau đó thêm một dung môi khác có thể hòa lẫn với dung môi trên nhưng không hòa tan dược chất, dược chất sẽ kết tủa lại [7]. Phương pháp này có ưu điểm như: đơn giản, có thể triển khai quy mô lớn, thiết bị không phức tạp như top-down, kết tủa tạo thành có thể ở dạng vô định hình [5], [15]. Tuy nhiên nó cũng bộc lộ nhiều hạn chế: - Dung môi hòa tan thường là dung môi hữu cơ, độc hại [5], [23] . - Rất khó kiểm soát quá trình tạo mầm và tăng trưởng tinh thể để có được phân bố kích thước hẹp [23]. Chính vì các hạn chế trên, phương pháp này hiện nay ít được dùng trong sản xuất hạt nano, chủ yếu dùng phương pháp top-down. c) Top-down Top-down là phương pháp làm giảm kích thước các hạt có kích thước lớn thành các hạt nhỏ hơn bằng cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau: nghiền, đồng nhất hóa tốc độ cao, đồng nhất hóa áp lực cao Trong đó, phương pháp nghiền bi sử dụng năng lượng thấp hơn so với phương pháp đồng nhất hóa [23]. Các phương pháp này không sử dụng dung môi độc hại, tuy nhiên chúng cần năng lượng đầu vào cao và hiệu quả của phương pháp thấp [5]. 1.2.4 Kỹ thuật nghiền bi a) Giới thiệt về kĩ thuật nghiền bi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 8
  18. Nghiền là một kĩ thuật thường được sử dụng để làm giảm kích thước tiểu phân trong lĩnh vực dược phẩm. Trong quá trình nghiền, năng lượng cơ học tạo ra ứng suất làm các hạt bị căng và biến dạng. Gãy vỡ xảy ra thông qua sự hình thành vết nứt và lan truyền vết nứt [19]. Các loại lực tác động để nghiền mịn nguyên liệu khác nhau khi tốc độ quay của thùng chứa khác nhau như: - Tại tốc độ thấp, các bi lăn trên nhau và mài mòn sẽ là cơ chế chính làm giảm kích thước tiểu phân. - Khi tốc đô quay cao hơn, các viên bi sẽ bị đổ rơi xuống khi bị đưa lên vị trí tới hạn, khi đó lực va chạm do bi rơi tự do, trở thành một cơ chế nữa làm gẫy vỡ tiểu phân. - Tại tốc độ quá cao, các viên bi sẽ bị lực ly tâm ép vào thành, vì thế không có các quá trình mài mòn hay va đập xảy ra, và hiệu suất quá trình sẽ giảm nhanh chóng [7]. Nghiền làm giảm kích thước và thay đổi sự phân bố kích thước của các hạt thuốc. Các tính chất này có thể được đo bằng các kỹ thuật tán xạ ánh sáng như quang phổ tương quan photon và nhiễu xạ laser. Nhờ kích thước nhỏ hơn, các hạt này có thể tăng độ tan và tốc độ hòa tan [33] . Nghiền còn làm thay đổi độ nhám bề mặt và hình dạng hạt. Hình dạng hạt liên quan chặt chẽ đến đặc tính và độ hòa tan. Hình dạng hạt có thể được xác định bằng các kỹ thuật phân tích hình ảnh, nhiễu xạ laser, kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi điện tử truyền qua và kính hiển vi lực nguyên tử [33]. Khi nghiền, việc giảm kích thước hạt dừng lại ở một giới hạn (khi mà giảm kích thước vật liệu nghiền trở nên khó khăn hơn dù kéo dài thời gian nghiền). Lúc này, việc tiếp tục chuyển năng lượng cơ học từ máy nghiền sang thuốc dẫn đến sự tích tụ các khuyết tật trên tinh thể thuốc và làm rối loạn cấu trúc tinh thể, cuối cùng dẫn đến sự biến mất của trật tự vị trí của các nguyên tử hoặc phân tử trong tinh thể. Những khiếm khuyết này có thể biểu hiện trên toàn bộ tinh thể dẫn đến sự vô định hình hoàn toàn của thuốc hoặc bị giới hạn ở các bề mặt tinh thể trong trường hợp một lớp mỏng, vô định hình có thể được hình thành xung quanh lõi tinh thể (có trật tự). Trong những trường hợp này, sự vô định hình của thuốc là kết quả của quá trình nghiền giúp cải thiện khả năng hòa tan và đặc tính hòa tan của thuốc [33]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 9
  19. Nghiền bi có một số ưu điểm như: - Nghiền được bột rất mịn. - Là thiết bị nghiền kín nên có thể sử dụng để nghiền cả khô và ướt, nghiền trong môi trường khí trơ. - Có thể duy trì được trạng thái vô khuẩn của nguyên liệu [7] Tuy nhiên, thiết bị này có nhược điểm là thời gian nghiền kéo dài và vì thế dễ làm tăng tạp trong nguyên liệu [7]. b) Thiết bị nghiền bi Nghiền bi có cấu tạo gồm một thùng chứa hình trụ quay, một nửa được nạp các viên bi có kích thước khác khau (bi nhỏ cho hiệu suất nghiền cao do diện tích bề mặt tiếp xúc lớn) được chế tạo từ kim loại hoặc sứ. Hoạt chất cần nghiền được thêm vào đến khoảng 60% thể tích của thùng [7]. Tốc độ quay của buồng bằng 50 – 80 % tốc độ tới hạn (tốc độ tới hạn được định nghĩa là tốc độ mà tại đó các viên bi ngừng chảy do lực ly tâm) [33]. Hình 1.2. Thiết bị nghiền bi Thiết bị nghiền bi là thiết bị nghiền gián đoạn, tuy nhiên cũng có các thiết bị nghiền liên tục . c) Phân loại Kỹ thuật nghiền bi được chia làm 2 loại: nghiền khô và nghiền ướt. - Nghiền khô: Hợp chất được nghiền khô với polyme hòa tan và các đồng polyme sau dó phân tán trong nước. Các polyme hòa tan và đồng polyme thường được sử dụng là PVP, HPMC và các dẫn xuất của cyclodextrin [5]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 10
  20. Mức độ giảm kích thước có thể đạt được trong các kỹ thuật xay khô này được giới hạn trong một vài micromet, khi độ hòa tan của thuốc rất thấp, việc giảm kích thước của nó xuống phạm vi micromet là không đủ để tăng tốc độ hòa tan và hấp thu qua đường ruột [33]. - Nghiền ướt: Hạt nano thường được sản xuất bằng phương pháp nghiền ướt. Hỗn dịch thô được đưa vào máy nghiền có chứa các bi nghiền nhỏ, siêu cứng làm bằng thủy tinh, muối zirconium, gốm sứ, nhựa (ví dụ: polystyrene liên kết ngang) hoặc các polyme đặc biệt như các dẫn xuất polystyrene cứng [5]. Nồng độ thuốc trong hỗn dịch có thể dao động từ 5 - 40% w / v. Các chất ổn định như polyme và, hoặc chất diện hoạt được sử dụng để hỗ trợ sự phân tán của các hạt. Trong trường hợp không có chất ổn định thích hợp, năng lượng bề mặt cao của các hạt nano sẽ dẫn đến sự kết tụ các tinh thể thuốc. Nồng độ các chất ổn định polymer có thể dao động từ 1 - 10% w / v và nồng độ chất hoạt động bề mặt nói chung nhỏ hơn 1% w / v. Nếu cần có thể thêm các tá dược khác như chất đệm, muối và chất pha loãng như đường vào hệ phân tán để tăng cường sự ổn định [23]. Hiệu quả của quá trình phụ thuộc vào: loại và nồng độ polyme, loại và nồng độ chất diện hoạt, thời gian nghiền, tốc độ nghiền, môi trường nghiền (kích cỡ và khối lượng bi), khối lượng thuốc và thiết kế nghiền [34]. Sau khi nghiền ướt, thu được hỗn dịch nano thuốc, để chuyển đổi từ hỗn dịch nano thành dạng rắn, nước phải được loại bỏ để thu được bột khô ổn định về mặt vật lý và hóa học hơn [29]. Mục tiêu của bột nano rắn là phải giải phóng hạt nano và có độ ổn định vật lý khi lưu trữ lâu dài. Dung môi từ hỗn dịch nano có thể loại bỏ bằng các quá trình làm khô như chất lỏng giường máy sấy (fluid bed coating / granulation), phun sấy, đông khô [23]. 1.2.5 Đông khô a) Nguyên lý hệ thống đông khô Hệ thống này bao gồm đóng băng một thực phẩm hoặc dược phẩm, trước khi xử lý sản phẩm lạnh dưới chân không cao. Nước ngưng tụ trong sản phẩm được chuyển thành hơi và được loại bỏ bằng bơm chân không, do đó làm khô sản phẩm [13]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 11
  21. b) Chu trình đông khô Chia làm ba bước [29]: - Đóng băng (hóa rắn): Vào cuối giai đoạn đóng băng ban đầu, nước có mặt ở hai dạng: + Nước đá tinh khiết, ở dạng tinh thể. + Phần còn lại, ở dạng hỗn hợp không đặc (tốt nhất giống như bột nhão). Pha này là dung dịch đậm đặc trong đó nước đóng vai trò là dung môi. - Sấy sơ cấp (thăng hoa băng): Khi nước trong sản phẩm bước vào pha khí, nước đá và nước dung môi hoạt động khác nhau. + Nước dung môi bốc hơi với entanpi hóa hơi tương ứng với sự chuyển từ pha lỏng sang pha hơi, với điều kiện rằng nhiệt hòa tan của chất rắn trong nước dung môi bằng không. + Băng được thăng hoa. Entanpi của sự thăng hoa là tổng của entanpi của phản ứng nóng chảy và entanpi của sự hóa hơi. Do đó, đông khô đòi hỏi một lượng nhiệt đáng kể. Trong suốt quá trình, nước đá trong sản phẩm phải được ngăn chặn tan chảy. Nhiệt có thể được cung cấp theo ba cách sau: sưởi lò vi sóng nội bộ, gia nhiệt tiếp xúc, sưởi hồng ngoại [13]. - Sấy thứ cấp (giải hấp nước không đóng băng): cuối cùng, sự hóa hơi dung môi nước còn lại có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn [13]. c) Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô: Ưu điểm: - Sấy khô ở nhiệt độ rất thấp, sản phẩm không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. - Hiệu suất thu hồi chất rắn cao [7]. Nhược điểm: - Quá trình chậm, cần có thiết bị đặc biệt [7]. 1.3 Một số nghiên cứu về nano berberin Để cải thiện nhược điểm độ hòa tan kém, hấp thu kém của berberin, rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tạo ra nano berberin (BBR). Khóa luận này chỉ giới thiệu tóm tắt một số nghiên cứu. Năm 2018, Sahibzada và các cộng sự đã bào chế nano BBR bằng 2 phương pháp kết tủa bay hơi dung môi (EPN) và kết tủa bằng thay đổi dung môi (APSP). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 12
  22. - Phương pháp EPN: đầu tiên thêm nhanh hexan (dung môi không hòa tan BBR) vào dung dịch BBR bão hòa (dung môi ethanol), hỗn dịch nano được hình thành. Hạt thuốc nano thu được bằng cách bay hơi nhanh dung môi trong chân không. - Phương pháp APSP: chuẩn bị dung dịch BBR bão hòa (dung môi ethanol), rồi bơm nhanh vào một lượng nước khử ion (dung môi không hòa tan BBR), dùng bơm tiêm, tốc độ dòng chảy cố định 1mL/phút, đồng thời khuấy cơ học 3000 vòng/ phút. Sau đó hỗn dịch nano được bay hơi chân không để loại bỏ dung môi, thu được hạt thuốc có kích thước nano. Kết quả: KTTP nano BBR trung bình bằng phương pháp EPN là 71,53nm, bằng APSP là 102,62 nm. Khi phân tích DSC không có sự chuyển đổi từ dạng kết tinh sang vô định hình ở cả hai mẫu nano BBR. Sau 15 phút, cả 2 mẫu nano BBR đều hòa tan trên 70%, BBR nguyên liệu hòa tan thấp dưới 20% ở pH 6,8. Hạt nano BBR bào chế được cho thấy khả năng kháng một số vi khuẩn Gram âm, Gram dương và kháng nấm [22]. Nano berberin còn được bào chế bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao (HPH). Đầu tiên, bột BBR clorid phân tán trong dung dịch nước chứa chất diện hoạt, nồng độ khoảng 0,5% sử dụng máy đồng nhất hóa tốc độ cao 5000 vòng/10 phút, sau đó hỗn hợp được chuyển qua máy đồng nhất hóa áp suất cao phòng thí nghiệm, 5 chu kì ở 500 bar và 15 chu kì ở 1500 bar. Kết quả: nano BBR có KTTP trung bình 72,4 nm với PDI = 0,302, thế zeta 6,95 mV. Kết quả phân tích DSC chỉ ra đã hình thành chất rắn vô định hình nano BBR. Hỗn dịch nano BBR cũng cho thấy tác dụng chống tiểu đường trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường [26]. Lin và cộng sự đã tạo ra hạt nano liên hợp fucose nạp BBR bằng cách: Tổng hợp chitosan liên hợp fucose (fucose-chitosan), sau đó tạo hạt nano liên hợp fucose gồm fucose- chitosan và heparin được điều chế bằng phương pháp ion hóa đơn giản với khuấy từ nhiệt độ phòng. Cuối cùng, BBR được nạp vào hạt nano liên hợp fucose bằng phương pháp đông khô. Kết quả: hạt nano liên hợp fucose nạp BBR có KTTP 198,8 ± 6,9 nm, thế zeta 30,1 ± 0,9 mV. Nano liên hợp fucose nạp BBR có thể kiểm soát giải phóng tại vùng nhiễm H.pylori và ức chế tăng trưởng của H.pylori [18]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 13
  23. Năm 2017, Wang và các cộng sự đã bào chế được hạt nano Janus Fe3O4-mSiO2 bao gồm một đầu Fe3O4 để nhắm mục tiêu từ tính và thân SiO2 để cung cấp berberine. Đầu từ với đường kính khoảng 100nm và một thân silica có chiều dài khoảng 200nm. Các hạt nano này giải phóng thuốc chọn lọc tại tế bào ung thư, có hiệu quả mạnh hơn, ít độc tính hơn BBR tự do [25]. BBR còn được phân phối dưới dạng các hạt micell ngược khan có kích thước nano. Hạt micell này có cấu tạo gồm pha dầu ngoài là hỗn hợp của cyclohexan / dichloromethan/ dietyl ete (4: 1: 1, v / v / v) có chứa phosphatidylcholin đậu nành, pha nước bên trong là berberin đã hòa tan trong nước, nồng độ thuốc ban đầu là 2 mg / ml. Đầu tiên dùng siêu âm (có làm lạnh) để tạo nhũ tương, sau đó nhũ tương được đông khô. Hạt micell ngược khan chứa BBR có kích thước là là 36 ± 2,1nm, chúng an toàn, có khả năng tăng cường sinh khả dụng, tăng hiệu quả chống tiểu đường so với BBR [24]. Liposome berberin cũng đã được Lin và các cộng sự bào chế vào năm 2013, bằng quy trình sử dụng một bộ phương pháp khác nhau, bao gồm phương pháp hydrat hóa màng mỏng (TF), phương pháp bay hơi ngược pha (RE), phương pháp ép đùn (E), hương pháp đồng nhất áp suất cao(H), phương pháp lọc gel (G) và phương pháp thẩm tích (D). Các phương pháp TF và RE đã được sử dụng để tạo thành liposome berberine; các phương pháp E và H đã được áp dụng để giảm kích thước và chỉ số phân bố kích thước (PDI) của liposome. Liposome BBR được phân lập bằng phương pháp G hoặc D. Ba quy trình này được kí hiệu là TF-E-G, TF-H-G, and RE-E-D, dựa trên trình tự các phương pháp đã được đề cập ở trên. Kết quả của các nghiên cứu in vivo chỉ ra rằng liposome làm giảm tỉ lệ loại bỏ BBR trong cả huyết tương và mô. Liposome BBR cho thấy tác dụng ức chế sự phát triển khối u trong chuột mang khối u HepG2 [17]. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 14
  24. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Berberin clorid Trung Quốc NSX 2 HPMC E6 Trung Quốc NSX 3 Natri lauryl sulfat Trung Quốc NSX 4 Tween 80 Mỹ NSX 5 Poloxamer 407 Mỹ NSX 6 HPMC E15 Trung Quốc NSX 7 PVP K30 Trung QUốc NSX 8 Ethanol Trung Quốc TKHH 9 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN V 10 Berberin clorid chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành DĐVN V (87,1%) phố Hồ Chí Minh 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị 1. Cân kĩ thuật Sartorius practum 612-1S (Đức) 2. Máy siêu âm Elmasonic S100H (Đức) 3. Tủ sấy Binder (Đức) 4. Máy nghiền bi hành tinh (planetary ball mill) SFM-1 (Mỹ) 5. Hệ thống thiết bị phân tích kích thước, thế zeta Horiba SZ100 (Nhật Bản) 6. Cân phân tích AY 129, Shimadzu (Nhật Bản) 7. Máy đo quang UV- 2600 Shimadu (Nhật Bản) 8. Hệ thống đo độ hòa tan DRS - 14 (Ấn Độ) 9. Máy phân tích quét nhiệt vi sai DSC LINSEIS (Đức) 10. Máy đông khô EYELA (Nhật Bản) Dụng cụ Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, phễu, ống nghiệm, bình định mức. Pipet, micro pipet, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 15
  25. 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: nano berberin 2.2 Nội dung nghiên cứu - Bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi: Khảo sát ảnh hưởng của loại và nồng độ polyme, loại và nồng độ chất diện hoạt, cỡ bi, tốc độ nghiền, thời gian nghiền. - Đánh giá một số đặc tính của bột nano berberin: hình thức, KTTP, phân bố KTTP, thế zeta, phân tích nhiệt vi sai, độ hòa tan. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Cân chính xác khoảng 0,0015 g berberin cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 80 ml ethanol tuyệt đối, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm ethanol vừa đủ đến vạch 100ml. Pha loãng thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 5; 7,5; 10; 12,5 µg/ml trong ethanol. Đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 348 nm. Mẫu trắng là môi trường tương ứng. Từ kết quả thu được, xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu thị sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ berberin. 2.3.2 Bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi Bào chế nano berberin theo quy trình sau: Cho bi zirconium oxid, berberin nguyên liệu, polyme, chất diện hoạt, nước vào bình chứa hình trụ rồi nghiền với cỡ bi, tần số và thời gian nhất định. Sau đó, đưa hỗn dịch nano berberin về dạng bột bằng phương pháp đông khô. Điều kiện và quy trình bào chế được biểu diễn trong Hình 2.1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 16
  26. Berberin nguyên liệu, polyme, Nghiền ướt: chất diện hoạt, nước, - Tần số: 25-35 Hz bi zirconium oxid - Thời gian nghiền: 30-60 phút - 400 g bi loại 25g; 400 g bi loại 2g; 400 g bi các loại gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10g, 20 bi loại 5g, 50 bi loại 2g . Đông khô ở: - Nhiệt độ: 0 0 -85 C -80 C - Thời gian: 24 giờ Bảo quản bột nano berberin trong bình tránh ẩm ở nhiệt độ phòng Hình 2.1. Điều kiện và quy trình bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 17
  27. 2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của nano berberin a) Hình thức Đánh giá bằng cảm quan: màu sắc. b) Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta Sử dụng hỗn dịch nano berberin để đo KTTP và chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta bằng thiết bị phân tích kích thước, thế zeta Horiba SZ 100. Kích thước trung bình của tiểu phân và chỉ số đa phân tán PDI được đo bằng nhiễu xạ tia laser. Bằng cách cho hỗn dịch pha loãng chạy qua một chùm tia laser và đo các chùm tia khúc xạ và phản xạ, kích thước hạt trung bình của hệ sẽ được tính toán dựa theo định luật xấp xỉ Fraunhofer hoặc lý thuyết Mie. Thế zeta được xác định khi đo tốc độ di chuyển của tiểu phân trong vùng điện trường bằng phép đo gió bởi Doppler laser. c) Độ hòa tan của bột nano berberin ở pH= 6,8 Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và nano berberin được xác định bằng phép thử độ hòa tan với các điều kiện cụ thể như sau: - Thiết bị: máy cánh khuấy, tốc độ quay 100 vòng/phút. - Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm pH=6,8 (pha theo Dược điển Việt Nam V). - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 0C ± 0,5 0C. - Khối lượng mẫu thử: tương ứng với 250 mg berberin. Tiến hành: Cho các mẫu thử vào cốc có chứa môi trường hòa tan, cho máy hoạt động. Hút 10 ml dịch sau 5,10,15, 30, 60 phút, bổ sung 10ml môi trường pH = 6,8. Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm. Pha loãng dịch thử với môi trường hòa tan đến nồng độ phù hợp, sau đó đem đo hấp thụ quang ở bước sóng 348 nm. Cách tính kết quả: - Nồng độ berberin trong môi trường hòa tan tại thời điểm t (kí hiệu Ct , đơn vị µg/ml) tính dựa vào đường chuẩn đã xây dựng ở mục 2.3.1 (đã nhân với hệ số pha loãng). - Lượng berberin đã hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức: 푛 Qt = Ct .V+ 0 ∑𝑖=1 𝑖 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 18
  28. Trong đó: Qt : lượng berberin đã hòa tan tại thời điểm t (µg) Ct : nồng độ berberin trong môi trường hòa tan tại thời điểm t (µg/ml) Ci : nồng độ berberin trong môi trường hòa tan tại thời điểm trước đó (µg/ml) V : thể tích môi trường thử hòa tan (V=900ml) V0 : thể tích mẫu dung dịch thử lấy ra mỗi lần (V0 = 10ml) - Độ hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức: Q Độ hòa tan = t . 100 (%) M Qt : lượng berberin đã hòa tan tại thời điểm t (µg) M : hàm lượng berberin trong mẫu thử (µg) Mỗi mẫu thử 3 lần lấy kết quả trung bình. d) Phân tích nhiệt vi sai (DSC - Differential scanning calorimetry) Để nghiên cứu sự thay đổi trạng thái tinh thể trước và sau nghiền bi, điểm nóng chảy của nano berberin được so sánh với điểm nóng chảy của berberin nguyên liệu. Các điểm nóng chảy này được xác định bằng phương pháp đo nhiệt quét vi sai DSC. Cách tiến hành: Sử dụng đĩa nhôm chứa mẫu 40 µl, đục thủng nắp, khối lượng mẫu khoảng từ 3–7 mg. Nhiệt độ quét từ 50 – 300 0C, tốc độ gia nhiệt 10 0C/phút. Trong quá trình thử, thổi khí nitrogen với lưu lượng 50 ml/phút. 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel 2013. Kết quả được trình bày dưới dạng: X ± SD Trong đó: X là giá trị trung bình SD là độ lệch chuẩn (cỡ mẫu n=3) @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 19
  29. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định lượng berberin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn berberin clorid có nồng độ lần lượt là 5; 7,5; 10; 12,5; 15 µg/ml và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 348 nm, kết quả thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.1. Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang theo nồng độ của Berberin tại bước sóng 348 nm Nồng độ (µg/ml) 5 7,5 10 12,5 15 Độ hấp thụ quang (Abs) 0,334 0,461 0,609 0,744 0,909 1 0.9 y = 0.0573x + 0.0382 R² = 0.9982 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Độ hấp thụ quang (Abs) quang thụ hấp Độ 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Nồng độ berberin (µg/ml) Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang của berberin theo nồng độ tại bước sóng 348 nm Nhận xét: R2 = 0,9982 (>0,995), cho thấy có sự tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ dung dịch berberin trong khoảng 5 µg/ml đến 15 µg/ml. Phương trình biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ quang với nồng độ là: y = 0,0573 x + 0,0382 Trong đó, y là độ hấp thụ quang (đơn vị Abs), x là nồng độ berberin (đơn vị µg/ml). @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20
  30. 3.2 Bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi 3.2.1 Ảnh hưởng của loại polyme tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20 % berberin (1 g), 1 % NaLS (0.05g), polyme dùng với nồng độ 5 % (0,25g) một trong ba loại HPMC E6; HPMC E15; PVP K30. Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: tổng khối lượng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.2. Bảng 3.2. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo loại polyme Loại polyme KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) HPMC E6 545,7 ± 15,3 0,589 ± 0,020 -27,4 ± 1,2 HPMC E15 936,1 ± 26,2 0,748 ± 0,026 -26,9 ± 1,5 PVP K30 1041,3 ± 21,9 0,724 ± 0,034 -26,6 ± 1,4 1200 0.8 0.7 1000 0.6 800 0.5 600 0.4 PDI 0.3 400 KTTP (nm) KTTP 0.2 200 0.1 0 0 HPMC E6 HPMC E15 PVP K30 Loại polyme KTTP (nm) PDI Hình 3.2. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo loại polyme @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21
  31. Nhận xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 545,7 nm khi sử dụng polyme HPMC E6. - PDI: Phân bố KTTP của hỗn dịch dùng polyme HPMC E6; HPMC E15; PVP K30 lần lượt là 0,589; 0,748; 0,724 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng, mẫu dùng HPMC E6 có PDI nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta khi sử dụng HPMC E6; HPMC E15; PVP K30 đều lớn hơn 25 cho thấy hỗn dịch berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Công thức nghiền sử dụng polyme HPMC E6 cho KTTP và PDI nhỏ nhất, nên chúng tôi lựa chọn polyme HPMC E6 cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ polyme tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20% berberin (1 g), 1 % NaLS (0.05 g), polyme HPMC E6 dùng với nồng độ 0,5; 1; 3; 5 %. Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.3 Bảng 3.3. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo nồng độ polyme Nồng độ polyme (%) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) 0,5 906,3 ± 20,5 0,643 ± 0,026 -25,7 ± 1,2 1 550,6 ± 14,3 0,524 ± 0,037 -26,3 ± 0,9 3 546,4 ± 16,7 0,573 ± 0,021 -27,2 ± 1,5 5 548,8 ± 20,3 0,539 ± 0,024 -28,6 ± 0,6 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 22
  32. 1000 0.7 900 0.6 800 700 0.5 600 0.4 500 PDI 400 0.3 KTTP (nm) KTTP 300 0.2 200 0.1 100 0 0 0,5 1 3 5 Nồng độ polyme (%) KTTP (nm) PDI Hình 3.3. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo nồng độ polyme Nhận xét: • KTTP: Hỗn dịch dùng polyme HPMC E6 với nồng độ 3 % thì cho KTTP nhỏ nhất là 546,4 nm, với nồng độ 0,5 % thì KTTP lớn nhất (906,3 nm), KTTP ít chênh lệch giữa các công thức sử dụng HPMC E6 nồng độ 1%, 3% và 5%. Điều này có thể giải thích khi tăng nồng độ HPMC E6 từ 0,5 đến 1% thì KTTP giảm dần do khi đó polyme đủ để tạo lớp áo ngăn không cho các các tiểu phân kết tập lại với nhau. • PDI: Phân bố KTTP khi dùng HPMC E6 với nồng độ 0,5; 1; 3; 5 % lần lượt là 0,643; 0,524; 0,573; 0,539 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng. Hỗn dịch sử dụng HPMC E6 với nồng độ 1% có khoảng phân bố nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta của các mẫu đều lớn hơn 25 cho thấy hỗn dịch berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Sử dụng HPMC E6 với nồng độ 3% thì thu được KTTP nhỏ nhất và kích thước ít chênh lệch giữa các công thức dùng HPMC E6 1%, 3% và 5%. Vì hỗn dịch sử dụng càng ít tá dược càng tốt nên HPMC E6 1% được chúng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 23
  33. 3.2.3 Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20 % berberin (1 g), 1 % HPMC E6 (0,05 g), 1 % (0,05 g) chất diện hoạt là một trong ba loại NaLS; Tween 80; Poloxamer 407. Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.4 và Hình 3.4 Bảng 3.4. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo loại chất diện hoạt Chất diện hoạt KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) NaLS 560,6 ± 15,4 0,561 ± 0,034 -28,7 ± 0,9 Poloxamer 407 754,3 ± 17,5 0,673 ± 0,083 -26,5 ± 1,3 Tween 80 1024,3 ± 26,7 0,650 ± 0,067 -30,1 ± 1,4 1200 0.7 0.68 1000 0.66 0.64 800 0.62 600 0.6 PDI 0.58 400 KTTP (nm) KTTP 0.56 200 0.54 0.52 0 0.5 NaLS Poloxamer 407 Tween 80 Loại chất diện hoạt KTTP (nm) PDI Hình 3.4. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo loại chất diện hoạt @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 24
  34. Nhận xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 560,6 nm khi sử dụng chất diện hoạt NaLS. - PDI: Phân bố KTTP của hỗn dịch sử dụng NaLS, poloxamer 407, Tween 80 lần lượt là 0,561; 0,673 ; 0,650 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng. Hỗn dịch dùng NaLS có khoảng phân bố nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta khi dùng NaLS; Poloxamer 407 và Tween 80 đều lớn cho thấy hỗn dịch berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Công thức nghiền sử dụng chất diện hoạt NaLS thì thu được KTTP và PDI nhỏ nhất nên chúng tôi lựa chọn NaLS cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20% berberin (1 g), 1% (0,05g) HPMC E6, chất diện hoạt NaLS dùng với nồng độ lần lượt là 0,4 ; 0,6; 1%. Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.5 và Hình 3.5 Bảng 3.5. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo nồng độ chất diện hoạt Nồng độ chất KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) diện hoạt (%) 0,4 550,4 ± 16,2 0,546 ± 0,029 -28,6 ± 1,2 0,6 548,7 ± 15,3 0,523 ± 0,012 -27,1 ± 0,8 1 547,1 ± 12,1 0,512 ± 0,034 -28,7 ± 1,6 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 25
  35. 1000 1 0.9 900 0.8 800 0.7 0.6 700 0.5 PDI 600 0.4 KTTP (nm) KTTP 500 0.3 0.2 400 0.1 300 0 0,4 0,6 1 Nồng độ chất diện hoạt (%) KTTP (nm) PDI Hình 3.5. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo nồng độ chất diện hoạt Nhật xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 547,1 nm khi hỗn dịch sử dụng NaLS với nồng độ 1%. KTTP không thay đổi nhiều khi giảm nồng độ NaLS xuống 0,6; 0,4 %. - PDI: Phân bố KTTP khi hỗn dịch sử dụng NaLS với nồng độ 0,4; 0,6; 1% lần lượt là 0,546; 0,523; 0,512 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng. Hỗn dịch dùng NaLS với nồng độ 1% có khoảng phân bố nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta của hỗn dịch dùng NaLS với nồng độ 0,4; 0,6; 1% đều lớn cho thấy hỗn dịch berberin có thể có thể có độ ổn định cao. Kết luận: KTTP không khác nhau nhiều khi dùng chất diện hoạt NaLS với nồng độ 0,4; 0,6; 1%. Vì NaLS là một chất diện hoạt anion nên chúng tôi chọn nồng độ 0,4% để đảm bảo ít tá dược nhất và an toàn khi sử dụng lâm sàng. 3.2.5 Ảnh hưởng của kích cỡ bi tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20% Berberin (1 g), 1% HPMC E6 (0,05 g), 0,4 % NaLS (0.02 g). Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: (Mẫu 1) Khoảng 400 g gồm 16 bi loại 25g; (Mẫu 2) Khoảng 400g gồm 200 bi loại 2g; @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 26
  36. (Mẫu 3) Khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.6 và Hình 3.6. Bảng 3.6. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo kích cỡ bi Mẫu Cỡ bi KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) 1 Bi to loại 25g 576,4 ± 20,8 0,563 ± 0,023 -28,4 ± 1,2 2 Bi nhỏ loại 2g 554,8 ± 22,1 0,589 ± 0,014 -25,1 ± 1,3 3 Bi các loại 25; 10; 5; 2g 548,5 ± 20,4 0,542 ± 0,018 -28,7 ± 0,4 900 1 800 0.9 700 0.8 600 500 0.7 400 0.6 PDI 300 KTTP (nm) KTTP 0.5 200 0.4 100 0 0.3 Bi to Bi nhỏ Nhiều cỡ bi Kích cỡ bi KTTP (nm) PDI Hình 3.6. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo kích cỡ bi Nhận xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 548,5 nm khi sử dụng đồng thời bốn cỡ bi loại 25; 10; 5; 2g. Mẫu 1 sử dụng bi to cho KTTP lớn nhất 576,4 nm. KTTP khác biệt không đáng kể giữa ba mẫu. - PDI: Phân bố KTTP của công thức dùng bi to, bi nhỏ, bi các loại có PDI tương ứng là 0,563; 0,589; 0,542 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng, mẫu 3 có khoảng phân bố nhỏ nhất. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 27
  37. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta của các mẫu đều lớn cho thấy hỗn dịch nano berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Sử dụng 400g bi gồm: 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g thì thu được KTTP nhỏ nhất, nên chúng tôi lựa chọn dùng đồng thời nhiều cỡ bi để áp dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.6 Ảnh hưởng của tốc độ nghiền tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20% berberin (1 g), 1% (0,05g) HPMC E6, 0,4% NaLS (0,02g). Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 25;30;35 Hz. - Thời gian nghiền: 40 phút. Hỗn dịch berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.7 và Hình 3.7. Bảng 3.7. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch berberin theo tốc độ nghiền Tần số (Hz) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) 25 648,5 ± 19,4 0,441 ± 0,009 29,4 ± 1,2 30 538,7 ± 20,6 0,543 ± 0,011 28,7 ± 0,8 35 846,1 ± 12,9 0,612 ± 0,015 25,3 ± 1,1 900 0.7 800 0.6 700 0.5 600 500 0.4 400 0.3 PDI KTTP (nm) KTTP 300 0.2 200 100 0.1 0 0 25 30 35 Tần số (Hz) KTTP (nm) PDI Hình 3.7. KTTP, PDI của hỗn dịch berberin theo tốc độ nghiền @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 28
  38. Nhận xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 538,7 nm khi nghiền ở tần số 30Hz. Điều này có thể được giải thích là do ở tốc độ thấp hơn (tần số 25 Hz) lực mài mòn là cơ chế chính gây gãy vỡ tiểu phân nên KTTP chưa giảm nhiều còn khi tốc độ quá cao (tần số 35 Hz) các viên bi sẽ bị lực ly tâm ép vào thành, vì thế không có các quá trình mài mòn hay va đập xảy ra và hiệu suất quá trình sẽ giảm hay kích thước tiểu phân sẽ lớn. - PDI: Phân bố KTTP khi nghiền ở tần số 25; 30; 35 Hz lần lượt có PDI là 0,441; 0,543; 0,612 đều lớn hơn 0,3 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng. Công thức nghiền ở tần số 25 Hz là có khoảng phân bố nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta của các mẫu đều lớn cho thấy hỗn dịch nano berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Khi nghiền ở tần số 30 Hz thì thu được KTTP nhỏ nhất nên tần số 30 Hz được chúng tôi lựa chọn. 3.2.7 Ảnh hưởng của thời gian nghiền tới kích thước tiểu phân Nano berberin được bào chế theo quy trình như mô tả trong mục 2.3.2 với các thông số: - Công thức hỗn dịch: 20% berberin (1 g), 1% (0,05g) HPMC E6, 0,4% NaLS (0,02g).Thể tích nước khoảng 5ml. - Bi zirconium oxid: khoảng 400 g gồm 04 bi loại 25g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5 g, 50 bi loại 2g. - Tần số: 30Hz. - Thời gian nghiền: 30; 40; 50; 60 phút. Hỗn dịch nano berberin thu được sau khi nghiền được đánh giá KTTP, chỉ số đa phân tán PDI, thế zeta. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.8 và Hình 3.8. Bảng 3.8. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch nano berberin theo thời gian nghiền Thời gian (phút) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) 30 925,8 ± 19,4 0,823 ± 0,019 -29,4 ± 1,2 40 563,6 ± 10,9 0,518 ± 0,012 -28,6 ± 0,7 50 618,5 ± 24,7 0,707 ± 0,026 -30,4 ± 1,3 60 625,3 ± 9,3 0,713 ± 0,021 -32,5 ± 0,8 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 29
  39. 1000 0.9 900 0.8 800 0.7 700 ) 0.6 600 0.5 500 0.4 PDI 400 KTTP (nm KTTP 0.3 300 200 0.2 100 0.1 0 0 30 40 50 60 Thời gian nghiền (phút) KTTP (nm) PDI Hình 3.8. KTTP, PDI của hỗn dịch nano berberin theo thời gian nghiền Nhận xét: - KTTP: KTTP nhỏ nhất là 563,6 nm khi thời gian nghiền là 40 phút. Điều này có thể giải thích thời gian nghiền dài hơn sẽ phân chia các hạt tốt hơn nhưng khi thời gian nghiền quá dài (50; 60 phút) thì các tiểu phân nano có xu hướng kết tập lại với nhau làm tăng kích thước. - PDI: Phân bố KTTP khi nghiền trong 30;40;50;60 phút lần lượt là 0,823; 0,518; 0,707; 0,713 đều lớn hơn 0,3, chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng. Trong đó, nghiền ở thời gian 40 phút có khoảng phân bố nhỏ nhất. - Thế zeta: Giá trị tuyệt đối của thế zeta của các mẫu đều lớn cho thấy hỗn dịch nano berberin có thể có độ ổn định cao. Kết luận: Thời gian nghiền 40 phút cho KTTP và PDI nhỏ nhất, nên thời gian nghiền 40 phút được chúng tôi lựa chọn. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 30
  40. Từ kết quả khảo sát, chúng tôi đề xuất quy trình bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi như sau: - 20% Berberin nguyên liệu (1 g) - 1% HPMC E6 (0,05 g) - 0,4% NaLS (0,02 g) Nghiền ướt: - 400 g bi zirconium oxid gồm 04 bi loại 25 g, 10 bi loại 10 g, 20 bi loại 5g, 50 bi loại 2 g - Tần số: 30Hz - Thời gian: 40 phút Đông khô: - Nhiệt độ: -850 C đến -800C. - Thời gian: 24 giờ Bảo quản bột nano berberin trong bình tránh ẩm ở nhiệt độ phòng Hình 3.9. Sơ đồ bào chế nano berberin bằng phương pháp nghiền bi. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 31
  41. 3.3. Đánh giá một số đặc tính của bột nano berberin 3.3.1 Hình thức Màu sắc: bột nano berberin có màu vàng giống nguyên liệu. Hình 3.10. Berberin nguyên liệu (bên trái) và bột nano berberin (bên phải) 3.3.2 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta Bột nano berberin (thu được sau khi đông khô) được đo kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân, rồi so sánh với hỗn dịch nano berberin (thu được sau khi nghiền bi), thu được kết quả Bảng 3.9 và Hình 3.11 Bảng 3.9. KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch nano berberin và bột nano berberin Loại KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) Hỗn dịch nano berberin 563,4 ± 10,9 0,548 ± 0,029 -28,1 ± 1,5 Bột nano berberin 570,7 ± 13,6 0, 576 ± 0,034 -28,6 ± 1,1 @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 32
  42. 1000 1 900 0.9 800 0.8 700 0.7 600 0.6 500 0.5 PDI 400 0.4 KTTP (nm) KTTP 300 0.3 200 0.2 100 0.1 0 0 Hỗn dịch nano berberin Bột nano berberin KTTP (nm) PDI Hình 3.11. KTTP, PDI của hỗn dịch nano berberin và bột nano berberin Nhật xét: Sau khi đông khô, bột nano berberin có KTTP là 570,7 nm và PDI là 0,576 (> 0,3), chứng tỏ có phân bố KTTP rộng. KTTP và PDI của bột nano berberin tăng lên không nhiều so với hỗn dịch nano berberin. Cả hai mẫu đều có giá trị tuyệt đối của thế zeta cao chứng tỏ có thể có độ ổn định cao. 3.3.3 Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin tại môi trường pH=6,8 được thể hiện như trong bảng. Bảng 3.10. Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin Thời gian (phút) 5 10 15 30 60 Berberin 16,22 19,17 19,98 20,76 20,87 Độ hòa nguyên liệu tan (%) Bột nano 26,31 29,57 29,86 30,39 30,92 berberin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 33
  43. 100 90 80 70 60 50 40 30 Độ hòa tan (%) tan Độ hòa 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Berberin nguyên liệu Bột nano berberin Hình 3.12. Độ hòa tan của berberin nguyên liệu và bột nano berberin Nhận xét: Độ hòa tan của bột nano berberin tốt hơn so với berberin nguyên liệu. Sau 5 phút, nano berberin hòa tan được 26,31% cao gấp 1,6 lần so với berberin nguyên liệu. Sau 60 phút, độ hòa tan của nano berberin gấp khoảng 1,5 lần nguyên liệu. Từ phút thứ 5 đến phút 60, độ hòa tan tăng lên không nhiều, nano berberin (từ 26,31% lên 30,92%) và berberin nguyên liệu (từ 16,22% lên 20,87%). 3.3.4 Kết quả phân tích nhiệt vi sai Phổ DSC cho thấy berberin nguyên liệu có các điểm chảy ở 72,4; 105,9; 206,2; 215,0 0C (phụ lục 1), còn mẫu nano berberin có điểm chảy 69,2; 101,4; 205,4; 221,4 0C (phụ lục 2) thay đổi không nhiều so với berberin nguyên liệu. Điều này chứng tỏ nghiền bi không làm thay đổi trạng thái kết tinh của nguyên liệu berberin ban đầu, sự thay đổi nhỏ về điểm chảy có thể là do sự có mặt của HPMC E6 và NaLS có trong công thức. 3.4. Bàn luận 3.4.1 Về phương pháp bào chế nano bererin Nghiên cứu sử dụng kĩ thuật nghiền bi để bào chế nano berberin, đây là một kĩ thuật đơn giản, nhanh, có thể mở rộng ra quy mô công nghiệp. Phương pháp này không phải sử dụng hexan độc hại như phương pháp kết tủa bay hơi dung môi được @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 34
  44. Sahibzada và các cộng sự áp dụng năm 2018 [22]. Sau khi nghiền bi, hỗn dịch nano tiếp tục được xử lý đông khô để loại bỏ dung môi do đó có thể thu chất rắn với hiệu suất cao. 3.4.2 Về xây dựng quy trình bào chế nano berberin Qua tham khảo một số tài liệu về bào chế hạt nano bằng phương pháp nghiền ướt, nồng độ polyme thường dùng là 1-10% (w/v) [23], hay tỉ lệ dược chất/ polyme nằm trong khoảng 10:1 đến 1:0.8 (w/w) [34], nồng độ chất diện hoạt thường dùng nhỏ hơn 1% [23], hay tỉ lệ dược chất/ chất diện hoạt 20/1 đến 1/0,5 [25]. Nghiên cứu này lựa chọn polyme HPMC E6 và chất diện hoạt NaLS với nồng độ lần lượt là 1% và 0,4%, khi nghiền bi cho nano berberin có KTTP bé. Nồng độ này chứng tỏ sử dụng ít tá dược, đặc biệt là ít NaLS (một chất diện hoạt ion hóa khi dùng với nồng độ cao gây độc tính cho cơ thể) vì vậy tăng tính an toàn. Một nghiên cứu đã chỉ ra khi sử dụng các bi nhỏ thường có xu hướng dẫn đến các hạt nano nhỏ hơn do tăng diện tích tiếp xúc[34] . Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, sử dụng đồng thời cả bốn 4 loại bi 25; 10; 5; 2 g thì cho KTTP không khác nhiều so với dùng bi nhỏ (thậm chí thu được KTTP nhỏ hơn). 3.4.3 Về các đặc tính của bột nano berberin thu được a) Về KTTP: Với quy trình bào chế đã đưa ra ở hình 3.2.8, sau khi đông khô thu được bột nano berberin có KTTP là 570,7 ± 13,7 nm. Nhận thấy, KTTP khi bào chế bằng phương pháp nghiền bi có kích thước lớn hơn nhiều so với nano berberin bào chế bằng các phương pháp khác, ví dụ phương pháp kết tủa bay hơi (71,53 nm) [22], phương pháp kết tủa bằng thay đổi dung môi (102,62 nm) [22], đồng nhất hóa áp suất cao là (72,4 nm) [26]. Phân bố KTTP khi điều chế bằng phương pháp nghiền bi PDI= 0,576 chứng tỏ KTTP có khoảng phân bố rộng, còn phương pháp đồng nhất hóa có PDI= 0,3 chứng tỏ có khoảng phân bố hẹp hơn. b)Về độ hòa tan Bột nano berberin được điều chế bằng phương pháp nghiền bi sau 5 phút có % hòa tan khoảng 26, 31% cao gấp khoảng 1,6 lần berberin nguyên liệu. Sau 60 phút, độ hòa tan của nano berberin là 30,92%. So sánh với nano berberin điều chế bằng phương @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 35
  45. pháp kết tủa bay hơi và phương pháp kết tủa bằng thay đổi dung môi (có độ hòa sau 15 phút là 70%, và hòa tan hết sau 60 phút), nhận thấy phương pháp nghiền bi đã giúp cải thiện độ hòa tan của berberin, nhưng mức độ cải thiện còn chưa quá cao. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 36
  46. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi rút ra được các kết luận sau: 1) Nghiên cứu đã bào chế được nano berberin bằng phương pháp nghiền bi. Công thức hỗn dịch gồm 20% berberin, 1% HPMC E6, 0,4% NaLS và nước. Quy trình nghiền bi sử dụng bi zirconium oxid đồng thời cả bốn cỡ bi 25; 10; 5 và 2g, thời gian nghiền 40 phút, tần số nghiền 30 Hz. Hỗn dịch nano berberin có KTTP trung bình 563,4 nm, PDI = 0,548, giá trị tuyệt đối thế zeta 28,1 mV. Hỗn dịch được đông khô ở nhiệt độ -85 0 C đến -80 0 C, trong 24 giờ để thu được bột nano berberin. 2) Nghiên cứu đã đánh giá được một số đặc tính của bột nano berberin như hình thức, KTTP (570,7 nm), phân bố KTTP (0, 576), giá trị tuyệt đối thế zeta (28,6 mV), phân tích nhiệt vi sai, tốc độ hòa tan (khoảng 30,92% sau 60 phút). 4.2 Đề xuất 1) Thử tác dụng sinh học của bột nano berberin đã bào chế được như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, 2) Ứng dụng bột nano berberin vào một số dạng bào chế như viên nén, viên nang cứng, viên nang mềm, @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 37
  47. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: [1]. Bộ Y tế (1994), Dược điển Việt Nam II, Nhà xuất bản Y học tr. 71-74. [2]. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội tr. 178- 179. [3]. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản y học. [4]. Nguyễn Văn Dương (2017), "Nghiên cứu đánh giá viên bao bồi chứa berberin clorid", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội. [5]. Phạm Văn Giang (2013), "Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcurmin", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội. [6]. Đồng Quang Huy (2014), "Nghiên cứu chiết xuất berberin từ vàng đắng bằng dung dịch kiểm", Luận văn thạc sĩ dược học. [7]. Từ Minh Koóng (2009), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất bản y học tr. 25. [8]. La Vũ Thùy Linh (2010), Công nghệ nano – cuộc cách mạng trong khoa học kỹ thuật thế kỷ 21, Đại học Tôn Đức Thắng. [9]. Nguyễn Thị Thơi (2018), "Nghiên cứu tạo vi nang alginat chứa berberin", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội. Tài liệu tiếng nước ngoài: [10]. Amin A H, Subbaiah T V, Abbasi K M (1969), "Berberine sulfate: antimicrobial activity, bioassay, and mode of action", Canadian journal of microbiology, 15 9 pp. 1067-1076. [11]. Caruthers S D, Wickline S A, Lanza G M (2007), "Nanotechnological applications in medicine", Current opinion in Biotechnology, 18 (1), pp. 26-30. [12]. Chun Y T, Yip T T, Lau K L, Kong Y C, et al (1979), "A biochemical study on the hypotensive effect of berberine in rats", Gen Pharmacol, 10 (3), pp. 177- 182. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  48. [13]. Duroudier J (2016), Freeze-drying. Heat Transfer in the Chemical, Food and Pharmaceutical Industries, pp. 359–377. [14]. Hayashi K, Minoda K, Nagaoka Y, Hayashi T, et al (2007), "Antiviral activity of berberine and related compounds against human cytomegalovirus", Bioorg Med Chem Lett, 17 (6), pp. 1562-1564. [15]. Kong W, Wei J, Abidi P, Lin M, et al (2004), "Berberine is a novel cholesterol- lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins", Nat Med, 10 (12), pp. 1344-1351. [16]. Lee Y S, Kim W S, Kim K H, Yoon M J, et al (2006), "Berberine, a natural plant product, activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin-resistant states", Diabetes, 55 (8), pp. 2256-2264. [17]. Lin Y C, Kuo J Y, Hsu C C, Tsai W C, et al (2013), "Optimizing manufacture of liposomal berberine with evaluation of its antihepatoma effects in a murine xenograft model", Int J Pharm, 441 (1-2), pp. 381-388. [18]. Lin Y H, Lin J H, Chou S C, Chang S J, et al (2015), "Berberine-loaded targeted nanoparticles as specific Helicobacter pylori eradication therapy: in vitro and in vivo study", Nanomedicine (Lond), 10 (1), pp. 57-71. [19]. Malamatari M, Taylor K M G, Malamataris S, Douroumis D, et al (2018), "Pharmaceutical nanocrystals: production by wet milling and applications", Drug Discov Today, 23 (3), pp. 534-547. [20]. Peng W H, Lo K L, Lee Y H, Hung T H, et al (2007), "Berberine produces antidepressant-like effects in the forced swim test and in the tail suspension test in mice", Life Sci, 81 (11), pp. 933-938. [21]. Pragasam Viswanathan, Yuvashree Muralidaran, Ragavan G (2017), Challenges in oral drug delivery: a nano-based strategy to overcome. Nanostructures for oral medicine, pp. 173-201. [22]. Sahibzada M U K, Sadiq A, Faidah H S, Khurram M, et al (2018), "Berberine nanoparticles with enhanced in vitro bioavailability: characterization and antimicrobial activity", Drug Des Devel Ther, 12 pp. 303-312. [23]. Vijaykumar Nekkanti, Vabalaboina V, Pillai R (2009), The Delivery of Nanoparticles pp. 111-132. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  49. [24]. Wang T, Wang N, Song H, Xi X, et al (2011), "Preparation of an anhydrous reverse micelle delivery system to enhance oral bioavailability and anti- diabetic efficacy of berberine", Eur J Pharm Sci, 44 (1-2), pp. 127-135. [25]. Wang Z, Wang Y S, Chang Z M, Li L, et al (2017), "Berberine-loaded Janus nanocarriers for magnetic field-enhanced therapy against hepatocellular carcinoma", Chem Biol Drug Des, 89 (3), pp. 464-469. [26]. Wang Z, Wu J, Zhou Q, Wang Y, et al (2015), "Berberine nanosuspension enhances hypoglycemic efficacy on streptozotocin induced diabetic C57BL/6 mice", Evid Based Complement Alternat Med, 2015 pp. 239749. [27]. Xue M, Zhang L, Yang M X, Zhang W, et al (2015), "Berberine-loaded solid lipid nanoparticles are concentrated in the liver and ameliorate hepatosteatosis in db/db mice", Int J Nanomedicine, 10 pp. 5049-5057. [28]. Ye M, Fu S, Pi R, He F (2009), "Neuropharmacological and pharmacokinetic properties of berberine: a review of recent research", J Pharm Pharmacol, 61 (7), pp. 831-837. [29]. Abdelwahed W, Degobert G, Stainmesse S, Fessi H (2006), "Freeze-drying of nanoparticles: formulation, process and storage considerations", Advanced drug delivery reviews, 58 (15), pp. 1688-1713. [30]. Junyaprasert V B, Morakul B (2015), "Nanocrystals for enhancement of oral bioavailability of poorly water-soluble drugs", asian journal of pharmaceutical sciences, 10 (1), pp. 13-23. [31]. Khemani M, Sharon M, Sharon M (2012), "Encapsulation of berberine in nano- sized PLGA synthesized by emulsification method", ISRN Nanotechnology, 2012 . [32]. Kuo C-L, Chi C-W, Liu T-Y (2004), "The anti-inflammatory potential of berberine in vitro and in vivo", Cancer letters, 203 (2), pp. 127-137. [33]. Loh Z H, Samanta A K, Heng P W S (2015), "Overview of milling techniques for improving the solubility of poorly water-soluble drugs", Asian journal of pharmaceutical sciences, 10 (4), pp. 255-274. [34]. Peltonen L (2018), "Design space and QbD approach for production of drug nanocrystals by wet media milling techniques", Pharmaceutics, 10 (3), pp. 104. @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  50. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phân tích DSC của berberin nguyên liệu @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
  51. Phụ lục 2: Phân tích DSC của bột nano berberin @ School of Medicine and Pharmacy, VNU